JPWO2018021301A1 - 抗b7−h4抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
実際、がん患者Fc受容体の多型解析から、非ホジキンリンパ腫治療薬抗CD20抗体Rituxan(R)(リツキシマブ)や乳がん治療薬抗Her2抗体Herceptin(R)(トラスツズマブ)の主な抗腫瘍メカニズムの一つはADCC活性であることが明らかにされており(非特許文献3−7)、医薬開発に応用可能なADCC活性増強技術の開発が次世代抗体技術として注目されている。
モノクローナル抗体の作製と評価に用いるために、(1)B7−H4可溶型組換えタンパク質、及び(2)B7−H4膜発現型遺伝子導入細胞を作製した。
(1)B7−H4可溶型組換えタンパク質(遊離型抗原)
ヒトB7−H4アイソフォーム1タンパク質(NCBIアクセッション番号;NP_078902、配列番号33)の細胞外ドメインは、第25番目のロイシン(Leu25)から第259番目のセリン(Ser259)までの領域により構成される。本研究では、この細胞外ドメイン(Leu25からSer259までの領域)のアミノ酸配列をコードする核酸配列のN末端相当側にイムノグロブリン由来のシグナルペプチドをコードする核酸配列を、C末端相当側に6連ヒスチジンタグをコードする核酸配列および終止コドンをそれぞれ付加した核酸断片を作製し、該核酸断片をpcDNA3.3発現ベクターに組み込んでB7−H4可溶型タンパク質発現ベクターを作製した。該発現ベクターを293F細胞(ライフテクノロジー社)に遺伝子導入して培養し、培養上清を回収した。ヒスチジンタグ親和性カラムを用いた一般的な方法によって、得られた培養上清からヒトB7−H4可溶型組換えタンパク質を精製した。
また、陰性コントロールとして使用するために、ヒトB7−H1タンパク質(NCBIアクセッション番号;AAF25807、配列番号34)、及びヒトB7−DCタンパク質(NCBIアクセッション番号;NP_079515、配列番号35)についても、上記同様の方法での細胞外ドメインに対応するタンパク質の作製及び精製を行った(なお、ヒトB7−H1では第19番目のフェニルアラニン〜第238番目のアルギニン、ヒトB7−DCでは第20番目のロイシン〜第220番目のトレオニンの領域が細胞外ドメインである)。
以下、ここで作製したヒトB7−H4、ヒトB7−H1、及びヒトB7−DCタンパク質の細胞外ドメイン領域を含む組換えタンパク質を、それぞれ「遊離型B7−H4」、「遊離型B7−H1」、及び「遊離型B7−DC」と称する場合がある。
(2)B7−H4膜発現型遺伝子導入細胞
ヒトB7−H4アイソフォーム1タンパク質の全長(Met1からLys282;配列番号33)をコードする核酸配列をpcDNA3.3発現ベクターに組み込んで、B7−H4全長タンパク質発現ベクターを作製した。該発現ベクターを293F細胞に遺伝子導入して48時間培養し、細胞膜上にヒトB7−H4を一過性に発現するヒトB7−H4膜発現型遺伝子導入細胞を作製した(以下、かかる細胞を「B7−H4発現293F細胞」と称する場合がある)。また、B7−H4遺伝子の入っていないpcDNA3.3ベクターを293F細胞に導入して48時間培養し、ヒトB7−H4を発現していない「コントロール293F細胞」を作製した。
実施例1で作製した遊離型B7−H4とフロイントアジュバントとを混合してBALB/cAマウスの背部に接種し、B7−H4特異的抗体産生細胞を誘導した。抗原(B7−H4)感作後のマウスから採取した脾臓細胞と、ミエローマ細胞株P3X63ag8.653(ATCC;アメリカ培養細胞系統保存機関より入手)とを、慣用的な方法を用いて融合させてハイブリドーマを作製し単離した。
実施例2により得られた複数のハイブリドーマ株の抗体産生能を、ELISA法により調べた。
具体的には、96穴インモビライザーアミノプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)に遊離型B7−H4を添加して室温で2時間インキュベートし、プレート表面に遊離型B7−H4を固定化した。同時に、遊離型B7−H4を固定化していないウェルを陰性コントロールとして設けた。インキュベート後に、固定されていない抗原を取り除き、3%のBSAを含むPBSでウェルを満たして4℃で一晩インキュベートした。この工程によりプレート表面の非特異的結合能をブロックし、ELISA用プレートを作製した。
実施例2により得られた複数のハイブリドーマ株の培養上清を、それぞれ0.05%のTween20を含むPBSで2倍に希釈して上清サンプルを調製した。上記ELISA用プレートのウェルからバッファーを取り除いた後に、上清サンプルを添加し、室温で二時間インキュベートした。プレートを洗浄して非結合の抗体を取り除いた後に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスイムノグロブリン抗体(GEヘルスケア社)を添加して1時間インキュベートした。ウェルを洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質(BDバイオサイエンス社)を添加して30分間インキュベートし、さらに、0.1M以上の濃度の硫酸溶液を加え発色反応を停止させた。各ウェル内の溶液の450nm波長の吸収を測定することにより、上清サンプル中にB7−H4を認識する抗体が含まれるかどうかを調べた。
上記ELISA法の結果を表1に示す。本研究では、上清サンプル中の抗B7−H4抗体が含まれていると判断する指標として、B7−H4固定化ウェルにおける吸光度が1.0以上であり、且つ、陰性コントロールウェルにおける吸光度が0.1以下であるという条件を設けた。実験結果を表1に示す。ハイブリドーマクローン#18、#21、#25、#51、#77、#79、#113、#121、#140、#160、#167、及び#209由来の上清サンプルは上記条件を満たしていたことから、抗B7−H4抗体が含まれていると判断した。すなわち、以上の結果から、抗B7−H4抗体産生能を有する12株のハイブリドーマが得られたことが明らかとなった(表1)。これらのハイブリドーマクローンは引き続き二次単離を行い、同様の方法(ELISA法)で抗体産生能を再度確認した後に、−150℃環境下で保存した。
なお、本発明者らは、ハイブリドーマクローン#18、#21、#25、#51、#77、#79、#113、#121、#140、#160、#167、及び#209のから産生される抗B7−H4モノクローナル抗体を、それぞれH4.018、H4.021、H4.025、H4.051、H4.077、H4.079、H4.113、H4.121、H4.140、H4.160、H4.167、H4.209と命名した。また、以下、これらの抗体を「本発明の抗B7−H4抗体」と称する場合がある。
上記本発明の抗B7−H4抗体のうち、十分な量の精製ができた8種の抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160、及びH4.209)について、サンドイッチELISA法により特異性及び結合能を調べた。
具体的には、H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160、及びH4.209をそれぞれ5μg/mlの濃度となるようにPBSで希釈して、96穴インモビライザーアミノプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)のウェルに添加し、室温で1時間インキュベートすることにより固定化した。非固定の抗体を取り除いた後、3%BSAを含むPBSでウェルを満たして室温で2時間インキュベートすることによりプレート表面の非特異的結合能をブロックし、サンドイッチELISA用プレートを作製した。
次に、実施例1で作製した遊離型抗原タンパク質(遊離型B7−H4、遊離型B7−H1、又は遊離型B7−DC)を、0.05%Tween20を含むPBSで希釈し、各抗原タンパク質を0.01〜10μg/mlの濃度で含む希釈溶液を作製した。サンドイッチELISA用プレートからバッファーを取り除いた後に、各抗原タンパク質の希釈溶液をウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。非結合の抗原を取り除いた後、全てのウェルにビオチン化したH4.025(2μg/ml)を添加し、室温で30分インキュベートした。非結合のビオチン化H4.025を取り除いた後に、希釈したストレプトアビジン結合HRP(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)をウェルに入れビオチン化抗体と結合させた。ウェルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質(BDバイオサイエンス)をウェルに入れ30分インキュベートし、0.1M以上の硫酸用液を加え発色反応を停止させた後、450nm波長の吸収を測定した。
上記サンドイッチELISA法の結果を図1及び2に示す。B7−H4、B7−H1、及びB7−DCに対する本発明の抗体の結合能を調べた結果、実験に用いた8種の抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.140、H4.160、及びH4.209)はいずれもB7−H4と特異的に結合し、B7−H1又はB7−DCには結合しないことが明らかとなった(図1)。また、異なる濃度のB7−H4に対する本発明の抗体の結合能を調べた結果、実験に用いた6種の抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.140、及びH4.209)はいずれもB7−H4濃度依存的に結合が増加することが明らかとなった(図2)。
実施例4により、本発明の抗B7−H4抗体が遊離型B7−H4を特異的に認識できることが明らかとなった。そこで次の実験では、細胞表面上に発現するB7−H4に対する本発明の抗B7−H4抗体の結合能を、免疫染色により調べた。
具体的には、本発明の抗B7−H4抗体のうち、9種の抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.079、H4.113、H4.121、H4.140、H4.160、及びH4.209)を、それぞれ8μg/mlの濃度に調製して一次抗体溶液を作製し、実施例1で作製した「B7−H4発現293F細胞」又は「コントロール293F細胞」と混合した。また、ポジティブコントロールとして、市販の抗B7−H4抗体(H74クローン、LifeSpan BioSciences, Inc.)を同様に「B7−H4発現293F細胞」又は「コントロール293F細胞」と混合した。4℃で30分間インキュベートした後に、R−フィコエリスリン(PE)標識ポリクローナル抗マウスイムノグロブリン抗体(4μg/ml)を加え、さらに4℃で30分間インキュベートし、各細胞の染色強度をフローサイトメーターFACSTMCanto(BD Biosciences)を用いて測定した。
図3に結果を示すように、H4.018、H4.025、H4.113、H4.121、及びH4.209により、B7−H4発現293F細胞が染色されることが明らかとなった。特に、H4.018及びH4.025を用いた場合には、強いシグナルが得られることが明らかとなった。
次に、本発明の抗B7−H4抗体が、B7−H4を発現するがん細胞への結合能を有するかを調べた。
複数のがん細胞株におけるB7−H4の発現を、市販の抗B7−H4抗体(H74クローン)を用いて確認した(なお、この実験に用いたがん細胞株は、全てアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)、又は国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンクより購入した)。具体的には、MDA−MB−468細胞(乳がん細胞株)、NCI−H2170細胞(肺扁平上皮がん細胞株)CAL27細胞(頭頚がん細胞株)、MKN74細胞(胃がん細胞株)、及びCOLO201細胞(大腸がん細胞株)を、10%FBSを含むRPMI1640培養液を用いて36時間以上の培養した後、市販のフィコエリスリン(PE)標識抗B7−H4抗体(H74クローン、eBioscienceInc.)を添加して4℃で30分間インキュベートした。細胞の染色強度は、フローサイトメーターFACSCantoTM(BD Biosciences)を用いて測定した。
図4に結果を示すように、MDA−MB−468細胞は抗B7−H4抗体(H74クローン)により染色されたが、NCI−H2170細胞、CAL27細胞、MKN74細胞、及びCOLO201細胞では抗B7−H4抗体(H74クローン)による染色は認められなかった。以上の結果から、MDA−MB−468細胞は細胞表面上にB7−H4を発現することが明らかとなった。また、この結果は、定量PCRの結果とも一致していた。
次に、MDA−MB−468細胞と本発明の抗B7−H4抗体との結合を調べた。具体的には、本発明の抗B7−H4抗体のうち、4種の抗体(H4.018、H4.025、H4.113、H4.209)を10μg/mlの濃度でMDA−MB−468細胞に添加し、次のi)〜iv)の条件でインキュベートした。
i)4℃で30分間、0.1%アジ化ナトリウムを添加した条件;
ii)室温で30分間、0.1%アジ化ナトリウムを添加した条件;
iii)室温で30分間、アジ化ナトリウムを添加しない条件;
iv)37度で18時間、5%CO2培養条件;
インキュベート後に、二次抗体としてPE標識ポリクローナル抗マウスイムノグロブリン抗体を4μg/mlの濃度で添加して、4℃で30分間インキュベートし、フローサイトメーターFACSTMCanto(BD Biosciences)を用いて細胞の染色強度を測定した。
結果を図5に示す。H4.113及びH4.209を用いた場合、上記i)〜iv)のいずれのインキュベート条件でも、染色シグナルは得られなかった。一方、H4.018及びH4.025を用いた場合、上記i)及びii)のインキュベート条件では染色シグナルが認められたが、上記iii)及びiv)のインキュベート条件では染色シグナルはほとんど認められなかった。以上の結果から、本発明の抗B7−H4抗体(H4.018及びH4.025)は、がん細胞の膜表面上に発現するB7−H4とは結合するものの、その結合は不安定であることが示唆された。特に生体内に近い条件である、インキュベート条件iv)では、H4.018及びH4.025のいずれの抗体でも結合が認められなかった。
以上の実施例3〜6の結果により、本発明の抗B7−H4抗体のなかでも、特にH4.025は遊離型B7−H4に対して優れた結合能を有するが、がん細胞の膜表面上に発現するB7−H4に対しては安定した結合を維持することが困難である可能性が示唆された。これらの結果から、本発明の抗B7−H4抗体は、単独では、十分な抗体依存性細胞傷害(ADCC;Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity)活性を有さない可能性が考えられた。
そこで本発明者らは、本発明の抗B7−H4抗体と、エフェクター細胞とを予め結合させることにより、抗体依存性の細胞傷害(ADCC)を誘導できるのではないかと考え、抗B7−H4抗体を纏ったエフェクター細胞を作製した(以下、かかる細胞を「抗B7−H4抗体−エフェクター細胞複合体」と称する場合がある)。
具体的には、Ficoll−Paque PLUS(GE Healthcare UK Ltd)を用いて、常法に従って、ヒト末梢血より単核球画分を比重分離した。次に、抗CD14マイクロビーズ及び抗CD19マイクロビーズ(Miltenyi Biotec K.K.)を用いたネガティブセレクションを行い、上記単核球画分からT細胞を濃縮して、エフェクター細胞を調製した。なお、上記ネガティブセレクションは、使用したビーズに添付の説明書に記載の手法に従って行った。
得られたエフェクター細胞と、高濃度(0.2mg/ml)の抗CD3抗体(OKT3クローン;ATCCより購入した)とを氷水中で10分間反応させた後に、未結合の抗体を洗浄し、0.5mg/mlのラビット抗マウスイムノグロブリンポリクローナル抗体(DakoCytomation)をさらに加えて氷水中で10分間反応させた。反応後に未結合の抗体を洗浄し、0.5mg/mlの抗B7−H4抗体(H4.018、H4.025、H4.113、又はH4.209)を加えて氷水中で10分間反応させた。最後に、未結合の抗体を洗浄することにより、抗B7−H4抗体を纏ったエフェクター細胞を作製した。すなわち、図6(a)に示すように、ここで作製された「抗B7−H4抗体−エフェクター細胞複合体」は、抗CD3抗体及び抗マウスIgG抗体を介して、エフェクター細胞と抗B7−H4抗体とを間接的に結合させた細胞である。
なお、以下、H4.018、H4.025、H4.113、又はH4.209を用いて作製した「抗B7−H4抗体−エフェクター細胞複合体」を、それぞれ「H4.018−エフェクター細胞複合体」、「H4.025−エフェクター細胞複合体」、「H4.113−エフェクター細胞複合体」、「H4.209−エフェクター細胞複合体」と称する場合がある。
実施例7により作製した「抗B7−H4抗体−エフェクター細胞複合体」の間接的な抗体依存性細胞傷害(indirect ADCC:iADCC)活性を調べた。
具体的には、DELFIA EuTDA非放射性細胞毒性検出キット(パーキンエルマー社製、製造番号AD0116)を用いて、MDA−MB−468細胞(B7−H4を発現するがん細胞)を蛍光キレート剤(TDA)で標識した(以下、かかる細胞を「TDA標識がん細胞」と記載する場合がある)。TDA標識がん細胞の細胞内に存在するTDAは、細胞溶解によって上清中に放出される。この上清にユーロピウム(Eu)溶液を反応させると強い蛍光を示す安定なキレート(EuTDA)が形成されるので、蛍光強度を測定することにより、細胞傷害性の程度を評価することができる。
4℃条件下で、TDA標識がん細胞を96ウェルU底プレートに播種し(10000細胞/ウェル)、さらに、実施例7で作製した抗B7−H4抗体−エフェクター細胞複合体を加えて混合した。プレートを4℃、200Gで1分間遠心することにより細胞を沈殿させ、その後、37℃、5%CO2環境下で3時間反応させた。反応後の上清を回収して、プレートリーダー(Wallac 1420 ARVOsxマルチラベルカウンター;PerkinElmer社製)を用いて蛍光強度を測定した。なお、測定はプレートリーダーに添付された指示書に従って、通常の手法により行った。得られたシグナルから、TDA標識がん細胞の傷害の程度(溶解の起こった細胞の割合)を算出した。
結果を図6(b)に示す。アッセイに用いた抗B7−H4抗体−エフェクター細胞複合体のうち、H4.025−エフェクター細胞複合体では、標的細胞(TDA標識がん細胞)に対するその割合が増加するのに依存して、上清中の蛍光発光が有意に増加することが明らかとなった。一方、H4.018−エフェクター細胞複合体、H4.113−エフェクター細胞複合体、及びH4.209−エフェクター細胞複合体では、標的細胞に対するその割合が増加しても、蛍光発光の有意な増加は認められなかった。以上の結果から、少なくともH4.025−エフェクター細胞複合体は、標的がん細胞に対して細胞傷害活性を有することが明らかとなった。
本発明の抗B7−H4抗体のうち、実施例3〜5の結果から優れた親和性及び特異性が認められた7種の抗体(H4.018、H4.025、H4.051、H4.113、H4.121、H4.140、H4.209)について、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の核酸配列及びアミノ酸配列を解析した。
(1)H4.018
H4.018の重鎖可変領域の核酸配列(配列番号1)及びアミノ酸配列(配列番号2)を図7に示す。なお、図中の網掛け部分はCDR3領域を示す。
(2)H4.025
H4.025の重鎖可変領域の核酸配列(配列番号3)及びアミノ酸配列(配列番号4)を図8に示す。また、H4.025の軽鎖はκ鎖とλ鎖の2種類が存在していた。H4.025の軽鎖可変領域(κ鎖)の核酸配列(配列番号5)及びアミノ酸配列(配列番号6)を図9に、H4.025の軽鎖可変領域(λ鎖)の核酸配列(配列番号7)及びアミノ酸配列(配列番号8)を図10にそれぞれ示す。なお、図中の網掛け部分はCDR3領域を示す。
(3)H4.051
H4.051の重鎖可変領域の核酸配列(配列番号9)及びアミノ酸配列(配列番号10)を図11に示す。また、H4.051の軽鎖可変領域の核酸配列(配列番号11)及びアミノ酸配列(配列番号12)を図12に示す。なお、図中の網掛け部分はCDR3領域を示す。
(4)H4.113
H4.113の重鎖可変領域の核酸配列(配列番号13)及びアミノ酸配列(配列番号14)を図13に示す。また、H4.113の軽鎖はκ鎖とλ鎖の2種類が存在していた。H4.113の軽鎖可変領域(κ鎖)の核酸配列(配列番号15)及びアミノ酸配列(配列番号16)を図14に、H4.113の軽鎖可変領域(λ鎖)の核酸配列(配列番号17)及びアミノ酸配列(配列番号18)を図15にそれぞれ示す。なお、図中の網掛け部分はCDR3領域を示す。
(5)H4.121
H4.121の重鎖可変領域の核酸配列(配列番号19)及びアミノ酸配列(配列番号20)を図16に示す。また、H4.121の軽鎖可変領域の核酸配列(配列番号21)及びアミノ酸配列(配列番号22)を図17に示す。なお、図中の網掛け部分はCDR3領域を示す。
(6)H4.140
H4.140の重鎖可変領域の核酸配列(配列番号23)及びアミノ酸配列(配列番号24)を図18に示す。また、H4.140の軽鎖可変領域の核酸配列(配列番号25)及びアミノ酸配列(配列番号26)を図19に示す。なお、図中の網掛け部分はCDR3領域を示す。
(7)H4.209
H4.209の重鎖可変領域の核酸配列(配列番号27)及びアミノ酸配列(配列番号28)を図20に示す。また、H4.209の軽鎖可変領域の核酸配列(配列番号29)及びアミノ酸配列(配列番号30)を図21に示す。なお、図中の網掛け部分はCDR3領域を示す。
本発明の抗B7−H4抗体のアミノ酸配列情報を基に、B7−H4抗原とT細胞のCD3抗原の両方に結合する二重特異性抗体(BsAb)を作製することができる(以下、かかる抗体を「本発明のBsAb」と称する場合がある)。
本発明のBsAbは、例えば、本発明の抗B7−H4抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、本発明の抗B7−H4抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、抗CD3抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及び抗CD3抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれリンカーを挟んで、或は直接連結させることにより作製できる。図22に、H4.025の軽鎖λ鎖可変領域及びH4.025の重鎖可変領域を用いたBsAbの構造を示す。また、かかるBsAbの核酸配列(配列番号31)及びアミノ酸配列(配列番号32)を、図23−1〜図23−3に示す。本発明者らが作製した2種類の本発明のBsAbについて、以下の実施例12及び13において詳細に述べる。
本発明のBsAbとエフェクター細胞とを結合させ、BsAb−エフェクター細胞複合体を作製する。具体的には、実施例7と同様の方法によりエフェクター細胞を調製し、本発明のBsAbを4℃又は室温又は37℃の環境下で結合させることにより、BsAb−エフェクター細胞複合体を形成させる。さらに、BsAb−エフェクター細胞複合体を用いてADCCの誘導を試みる。
発明者らは、本発明の抗B7−H4抗体のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体と、抗CD3抗体のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体とを連結させたBsAb(single chain fragment variable-single chain fragment variable抗体;scFv−scFv)を作製した(以下、かかる抗体を「本発明のscFv−scFv」と称する場合がある)。
具体的には、本発明のscFv−scFvは、本発明の抗B7−H4抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、本発明の抗B7−H4抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、抗CD3抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び抗CD3抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれリンカーを挟んで連結させることにより作製した。図24に、H4.025の軽鎖可変領域及びH4.025の重鎖可変領域を用いた本発明のscFv−scFvの構造を示す。また、かかるscFv−scFvの核酸配列(配列番号36)及びアミノ酸配列(配列番号37)を、図25に示す。なお、配列番号36は、H4.025の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むが、かかる塩基配列は大腸菌発現系を用いることを想定してコドン最適化を行っているため、配列番号3、5、及び7とは異なっている。配列番号36及び37において、H4.025の軽鎖及び重鎖可変領域に対応する領域は次の通りである(表2)。
<軽鎖可変領域>
配列番号36の第76番目(a)から第378番目(t)までの領域は、配列番号5の第10番目(a)から第312番目(t)までの領域に対応する。
配列番号37の第26番目(Met)から第126番目(Gly)までの領域は、配列番号6の第4番目(Met)から第104番目(Gly)までの領域に対応する。
<重鎖可変領域>
配列番号36の第448番目(g)から第780番目(t)までの領域は、配列番号3の全長に対応する。
配列番号37の第150番目(Glu)から第260番目(Gly)までの領域は、配列番号4の全長に対応する。
さらに、発明者らは、本発明の抗B7−H4抗体のアミノ酸配列を含むFab抗体と、抗CD3抗体のアミノ酸配列を含む一本鎖抗体と組み合わせたBsAb(fraction antigen binding-single chain fragment variable;Fab−scFv)を作製した(以下、かかる抗体を「本発明のFab−scFv」と称する場合がある)。
具体的には、本発明のFab−scFvは、本発明の抗B7−H4抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列、及びヒトイムノグロブリンの定常領域(CL)のアミノ酸配列を含む短鎖と、抗CD3抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、ヒトイムノグロブリンの定常領域(CH1)のアミノ酸配列、抗CD3抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列、及び抗CD3抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む長鎖とを、ジスルフィド結合によって結合させることによって作製した。図26に、H4.025の軽鎖可変領域及びH4.025の重鎖可変領域を用いたFab−scFvの構造を示す。また、図27〜28に、かかるFab−scFvの長鎖の核酸配列及びアミノ酸配列(それぞれ配列番号38及び39)と、短鎖の核酸配列及びアミノ酸配列(それぞれ配列番号40及び41)とを示す。なお、配列番号38及び40は、H4.025の軽鎖及び重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むが、かかる塩基配列は大腸菌発現系を用いることを想定してコドン最適化を行っているため、配列番号3、5、及び7とは異なっている。配列番号38〜41において、H4.025の軽鎖及び重鎖可変領域に対応する領域は次の通りである(表3)。
<軽鎖可変領域>
配列番号40の第76番目(a)から第378番目(t)までの領域は、配列番号5の第10番目(a)から第312番目(t)までの領域に対応する。
配列番号41の第26番目(Met)から第126番目(Gly)までの領域は、配列番号6の第4番目(Met)から第104番目(Gly)までの領域に対応する。
<重鎖可変領域>
配列番号38の第64番目(c)から第390番目(t)までの領域は、配列番号3の第7番目(c)から第333番目(t)までの領域に対応する。
配列番号39の第22番目(Gln)から第130番目(Gly)までの領域は、配列番号4の第3番目(Gln)から第111番目(Gly)までの領域に対応する。
次に、本発明のFab−scFvが、B7−H4を発現するがん細胞への結合能を有するかを実施例6と同様の方法で調べた。
具体的には、4種の乳がん細胞株(MDA−MB−468細胞、MDA−MB−231細胞、SKBR3細胞、ZR75細胞)を、10%FBSを含むRPMI1640培養液を用いて36時間以上培養した。続いて、蛍光色素Cy5.5で標識した本発明のFab−scFv、又は無標識抗B7−H4抗体(H4.025)を上記培養細胞に添加して、4℃で30分間インキュベートした。抗B7−H4抗体(H4.025)を添加した細胞は、インキュベート後に洗浄して抗R−フィコエリスリン(PE)標識ポリクローナル抗マウスイムノグロブリン抗体(4μg/ml)を加え、さらに、4℃で30分間インキュベートした。細胞の染色強度は、フローサイトメーターFACSCantoTM(BD Biosciences)を用いて測定した。図29に示すように、MDA−MB−468細胞及びZR75細胞は、抗B7−H4抗体(H4.025)及び本発明のFab−scFvにより染色されたが、MDA−MB−231細胞及びSKBR3細胞はどちらの抗体でも染色されなかった。以上の結果から、MDA−MB−468細胞及びZR75細胞はB7−H4を発現するが、MDA−MB−231細胞はB7−H4を発現しないことが明らかとなった。
がん細胞株に対する、本発明のBsAb(本発明のscFv−scFv及びFab−scFv)の抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を調べた。
具体的には、実施例7に記載の方法によって調製したヒト末梢血単核球画分に、がん細胞(MDA−MB−468細胞)と本発明のBsAbとを加え、37℃、5%CO2環境下で16時間反応させた。培養上清を回収し、TAKARA LDH Cytotoxicity Detection Kit(タカラバイオ株式会社)を用いて死細胞数を測定し、がん細胞に対する傷害能(%Lysis)及び50%最大作用濃度(EC50)を算出した。図30に示すように、MDA−MB−468細胞に対する50%最大作用濃度(EC50)は、本発明のscFv−scFvでは68ng/mlであり、本発明のFab−scFvでは13ng/mlであった。また、図31に示すように、ZR−75細胞(B7−H4発現陽性;図29参照のこと)に対しては、本発明のBsAb依存性の細胞傷害が認められたが、MDA−MB−231細胞(B7−H4発現陰性;図29参照のこと)、SKBR3細胞(B7−H4発現陰性;図29参照のこと)、及びNCI−H2170細胞(肺扁平上皮がん細胞)に対しては、本発明のBsAb依存性の細胞傷害活性は認められなかった。
次に、マウスに移植したヒト腫瘍に対して、本発明のFab−scFvが抗腫瘍効果を示すことが出来るかどうかを検討した。
具体的には、MHCノックアウトNOGマウス(NOD/Shi−scid,IL−2RγKO,IaβKO,β2mKO、実験動物中央研究所)にヒト末梢血単核球を移植し、翌日、乳がん細胞株(MDA−MB−468細胞株)又は肺がん細胞株(NCI−H2170細胞株)を移植した。がん細胞株の移植から2週間目以降に、本発明のFab−scFvをマウス1匹あたり0.2μgから200μgの範囲で投与した。具体的には、腫瘍サイズの確認実験に用いたマウス(図32)には、本発明のFab−scFvを1回当り5μg/20g体重で投与し、染色実験に用いたマウス(図33及び34)には、0.2μg、2μg、20μg、及び200μgの本発明のFab−scFvを3〜4日の間隔で、4回の漸増投与を行った。
図32に示すように、MDA−MB−468細胞の移植により形成された腫瘍のサイズは、本発明のFab−scFvの投与により縮小することが明らかとなった。一方、NCI−H2170細胞の移植により形成された腫瘍のサイズは、本発明のFab−scFvの投与による影響を受けなかった。また、図33に示すように、腫瘍組織切片のヘマトキシリンエオジン染色を行った結果、本発明のFab−scFvを投与した担がんマウスにおいては、腫瘍内のがん細胞が消滅することが明らかとなった。さらに、図34に示すように、腫瘍組織切片の免疫組織染色の結果、本発明のFab−scFvを投与した担がんマウスにおいては、腫瘍内へのCD8陽性キラーT細胞の浸潤が確認できるとともに、B7−H4陽性のがん細胞の消滅も確認できた。
マウスに投与した本発明のFab−scFvがマウス異種移植腫瘍に集積するかどうかを確認した。
具体的には、MHCノックアウトNOGマウス(実験動物中央研究所)に、がん細胞株(MDA−MB−468)を移植し、2週間目以降に、蛍光色素Cy5.5でラベルした本発明のFab−scFvをマウス1匹あたり0.5マイクログラムから200マイクログラムの範囲で投与した。図35に示すように、本発明のFab−scFvは、投与後28日目までの間、移植腫瘍組織に集積することが確認された。
Claims (33)
- 以下の(a)〜(g)のいずれかの領域を含む、ヒトB7−H4タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列又は配列番号4の第3番目〜第111番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6の第4番目〜第104番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(c)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(d)配列番号14に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号16又は18に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(e)配列番号20に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(f)配列番号24に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(g)配列番号28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号30に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域; - 以下の(A’)〜(G’)のいずれかの核酸配列を含む、ヒトB7−H4タンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体をコードする核酸。
(A’)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列;(B’)配列番号4に示されるアミノ酸配列又は配列番号4の第3番目〜第111番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6の第4番目〜第104番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列;
(C’)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列;
(D’)配列番号14に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号16又は18に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列;
(E’)配列番号20に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列;
(F’)配列番号24に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列;
(G’)配列番号28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号30に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列; - 以下の(A)〜(G)のいずれかの核酸配列を含む、請求項2記載の核酸。
(A)配列番号1に示される核酸配列;
(B)配列番号3に示される核酸配列又は配列番号38の第64番目〜第390番目に示される核酸配列、及び配列番号5に示される核酸配列、若しくは配列番号36の第76番目〜第378番目に示される核酸配列、又は配列番号7に示される核酸配列;
(C)配列番号9に示される核酸配列、及び配列番号11に示される核酸配列;
(D)配列番号13に示される核酸配列、及び配列番号15又は17に示される核酸配列;
(E)配列番号19に示される核酸配列、及び配列番号21に示される核酸配列;
(F)配列番号23に示される核酸配列、及び配列番号25に示される核酸配列;
(G)配列番号27に示される核酸配列、及び配列番号29に示される核酸配列; - 請求項2又は3記載の核酸を含有するベクター。
- 請求項4記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 請求項6記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- 請求項1又は6記載の抗体を備えた、がん細胞検出用キット。
- 請求項1又は6記載の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合した、抗体連結体。
- 第二抗体がCD3抗原を認識する抗体である、請求項9記載の抗体連結体。
- 請求項9又は10記載の抗体連結体を含むがん治療用組成物であって、前記抗体連結体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達される、がん治療用組成物。
- 請求項1又は6記載の抗体からなる第一抗体と、エフェクター細胞抗原を認識する第二抗体とが結合した抗体連結体に、エフェクター細胞が結合した連結抗体−細胞複合体。
- 第一抗体と第二抗体とが、前記第一抗体及び前記第二抗体の双方を認識する第三抗体を介して結合した、請求項12記載の連結抗体−細胞複合体。
- 第一抗体及び第二抗体が同一の動物種由来のIgG抗体であり、且つ、第三抗体が前記動物種のIgG抗体を認識する抗体である、請求項12又は13記載の連結抗体−細胞複合体。
- 第一抗体及び第二抗体がマウス由来のIgG抗体であり、且つ、第三抗体がマウス由来のIgG抗体を認識する抗体である、請求項12〜14のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体。
- エフェクター細胞が、治療対象となるがん患者から採取されたエフェクター細胞である、請求項12〜15のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体。
- 請求項12〜16のいずれかに記載の連結抗体−細胞複合体を有効成分として含有するがん治療用組成物。
- 以下の(a)〜(g)のいずれかの領域と、エフェクター細胞抗原を認識する領域とを含む、二重特異性抗体。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列又は配列番号4の第3番目〜第111番目に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号6に示されるアミノ酸配列若しくは配列番号6の第4番目〜第104番目に示されるアミノ酸配列、又は配列番号8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(c)配列番号10に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号12に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(d)配列番号14に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号16又は18に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(e)配列番号20に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号22に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(f)配列番号24に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
(g)配列番号28に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号30に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域; - エフェクター細胞抗原を認識する領域が、CD3抗原を認識する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域である、請求項18記載の二重特異性抗体。
- 一本鎖抗体である請求項18又は19記載の二重特異性抗体。
- 配列番号32又は37に示されるアミノ酸配列を含む、請求項18〜20のいずれかに記載の二重特異性抗体。
- Fab−scFv融合体である請求項18又は19記載の二重特異性抗体。
- 配列番号39に示されるアミノ酸配列を含む長鎖と、配列番号41に示されるアミノ酸配列を含む短鎖とを含む、請求項18、19、及び22のいずれかに記載の二重特異性抗体。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の二重特異性抗体をコードする核酸。
- 以下の(A)〜(G)のいずれかの配列を含む、請求項24記載の核酸。
(A)配列番号1に示される核酸配列;
(B)配列番号3に示される核酸配列又は配列番号38の第64番目〜第390番目に示される核酸配列、及び配列番号5に示される核酸配列、若しくは配列番号36の第76番目〜第378番目に示される核酸配列、又は配列番号7に示される核酸配列;
(C)配列番号9に示される核酸配列、及び配列番号11に示される核酸配列;
(D)配列番号13に示される核酸配列、及び配列番号15又は17に示される核酸配列;
(E)配列番号19に示される核酸配列、及び配列番号21に示される核酸配列;
(F)配列番号23に示される核酸配列、及び配列番号25に示される核酸配列;
(G)配列番号27に示される核酸配列、及び配列番号29に示される核酸配列; - 配列番号31又は36に示される核酸配列を含む、請求項24又は25記載の核酸。
- 配列番号38に示される核酸配列を含む核酸と、配列番号40に示される核酸配列を含む核酸とを含む、請求項24又は25記載の核酸。
- 請求項24〜27のいずれかに記載の核酸を含有するベクター。
- 請求項28記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の二重特異性抗体を含むがん治療用組成物であって、前記二重特異性抗体によってエフェクター細胞ががん細胞に送達される、がん治療用組成物。
- 請求項18〜23のいずれかに記載の二重特異性抗体と、エフェクター細胞とが結合した、二重特異性抗体−細胞複合体。
- エフェクター細胞が、治療対象となるがん患者から採取されたエフェクター細胞である、請求項31記載の二重特異性抗体−細胞複合体。
- 請求項31又は32記載の二重特異性抗体−細胞複合体を有効成分として含有するがん治療用組成物。
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