CN109071636A - 用于选择特异性结合糖基化免疫检查点蛋白的抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了产生和筛选相对于非糖基化ICP而特异性地与糖基化免疫检查点蛋白(ICP)结合的抗体的方法。此类抗体识别糖基化ICP的特定表位，并且可阻止或阻断糖基化ICP与其配体(诸如另一种ICP)的结合，并且可抑制这两种蛋白质之间的可导致免疫抑制的相互作用，如例如人PD‑L1/PD‑1相互作用。作为具体实例，提供了在其细胞外结构域内包含糖基化氨基酸残基的人PD‑L1和PD‑1多肽，用于产生分别特异性结合PD‑L1或PD并抑制PD‑L1/PD‑1相互作用的抗糖基化PD‑L1抗体或抗糖基化PD‑1抗体。通过该方法产生和选择的抗体尤其可用作用于破坏、阻断或中和ICP系统和其中的特定ICP相互作用的癌症治疗剂。

Description

用于选择特异性结合糖基化免疫检查点蛋白的抗体的方法
序列表
本申请包含以ASCII格式以电子方式提交了序列表，其由此通过引用整体并入本文。所述ASCII拷贝(于2017年3月23日创健的)被命名为24258_105006PCT_SL.txt，并且大小为31,652字节。
相关领域
本文所述方法总体上涉及分子生物学、医学和肿瘤学领域。更特别地，提供了用于制备、选择和筛选特异性以及优先结合糖基化的免疫检查点蛋白的抗体的方法。
背景
免疫检查点途径涉及携带免疫检查点分子(多肽和肽)的免疫细胞之间的相互作用，并且在正常条件下，在抗菌免疫反应期间维持自身耐受性和限制附属组织损伤。这些途径可被癌症和肿瘤细胞用于逃避免疫破坏。试图中断免疫检查点(诸如抗CTLA-4、抗-PD-1、抗-PD-L1抗体)以阻止肿瘤细胞与免疫T细胞的相互作用，提供抗肿瘤免疫和介导持续的癌症消退疗法的药物正在开发和测试中。免疫检查点途径的生物学是复杂的，检查点阻断药物(单独使用或组合使用)的全活性谱是目前被深入研究的主题。(S.Topalian等，2015,Cancer Cell,27(4):450-461)。
癌症病因中的混淆事件是肿瘤能够任用某些免疫检查点途径作为免疫抗性，特别是抗对肿瘤抗原特异的T细胞的主要机制。因为许多免疫检查点由配体-受体相互作用引发，因此它们可以容易地被抗体阻断或受重组形式的配体或受体调节。例如，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)抗体属于由美国食品和药物管理局(FDA)批准的第一免疫治疗剂。关于另外的免疫检查点蛋白诸如程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)的阻断剂的发现，表明利用产生持久临床反应的潜能增强抗肿瘤免疫力的广泛和多样化的机会。(D.Pardol l,2012,NatureReviews Cancer,12:252-264)。针对PD-1的治疗性抗体帕博利珠单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)已由US FDA批准。
在医学领域中需要产生和选择特异性识别并结合免疫检查点分子(特别是在肿瘤细胞上稳定表达并结合免疫T细胞上的配体，从而促进对T细胞抗肿瘤细胞的活性的免疫抑制的免疫检查点分子)的抗体的方法。还需要通过此类方法产生的新的和特异性的抗体，以阻断和抑制肿瘤细胞上的免疫检查点分子与效应T细胞上的同源配体的相互作用，从而防止或抑制对破坏肿瘤细胞并最终治疗癌症所需的T细胞反应的免疫抑制。
概述
本发明人已发现，本文中缩写为"ICP"的免疫检查点蛋白(诸如，例如肿瘤细胞上表达的PD-L1)的糖基化会促进或增强与免疫效应细胞上的同源配体例如PD-1的结合，从而增强对T细胞抗肿瘤细胞的活性的抑制，以及ICP诸如PD-L1的糖基化也可以稳定此类免疫检查点蛋白在细胞表面上的表达。本发明人已经开发了产生和鉴定抗体的方法，相对于与未糖基化的人ICP，所述抗体优先与糖基化人ICP，诸如PD-L1多肽(也称为CD274、PDCD1L1或B7-H1))或PD-1多肽(也称为CD279)结合(即，以比对所述未糖基化的形式更高的亲和力与所述ICP的糖基化形式结合)，并且通过这样的特异性结合，预防或抑制例如肿瘤细胞上的ICP与例如免疫效应细胞诸如T细胞或天然杀伤细胞(NK细胞)上的其同源配体的相互作用或反之亦然。本文中的方法提供了抗体，所述抗体对糖基化ICP具有选择性并优先与其结合，并可用作有效的ICP抑制剂以防止、减少、阻断或抑制由这样的肿瘤细胞与T细胞的相互作用(通过ICP相互作用途径)产生的免疫抑制效应。应理解，术语"免疫检查点蛋白"和"免疫检查点多肽"(也称为"免疫检查点分子")在本文中简称为"ICP"。术语"糖基化ICP"在本文中简称为"glycICP"。
本文提供了用于产生和筛选或选择分离的抗体的方法，相对于与所述ICP靶抗原的非糖基化形式或糖基化变体形式，所述分离的抗体(本文中的抗glycICP抗体)选择性地识别糖基化ICP靶抗原并优先与其结合，所述糖基化ICP靶抗原可存在于免疫系统的细胞上和/或肿瘤细胞上。在一些情况下，糖基化ICP可以是ICP的野生型或天然存在的形式(即，ICP WT)；因此，ICP WT用作用于抗体生产和筛选的靶抗原。在一些实施方案中，可对通过本领域已知的方法(例如杂交瘤技术、抗体库的噬菌体展示文库、亲和力成熟的抗体等)产生的克隆性抗体群筛选和选择相对于ICP靶抗原的未糖基化的形式而结合ICP靶抗原的糖基化形式的那些抗体。
在一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的PD-L1多肽(也称为CD274、PDCD1L1或B7-H1)。在另一特定实施方案中，糖基化的蛋白抗原是人糖基化的PD-1多肽(也称为CD279)。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的PD-L2多肽。在本文中使用的范畴内，"PD-L1"是指PD-L1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-L1(其氨基酸序列为SEQ IDNO:1)；"PD-1"是指PD-1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-1(其氨基酸序列为SEQ ID NO:2)。
在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的"T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3"(TEVI-3)，也称为CD366、FLJ14428、TEVID3和HAVCR2(氨基酸序列为SEQ ID NO:4)。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的"淋巴细胞活化基因-3"(LAG-3)，也称为CD223(氨基酸序列为SEQ ID NO:5)。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的"B和T淋巴细胞衰减因子(Lymphocyte Attenuator)"(BTLA)，也称为CD272(氨基酸序列为SEQ ID NO:3)。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原为人糖基化的CD47，也称为IAP、MER6和OA3。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的CD96，也称为CD96分子或CD96抗原。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的"癌胚抗原相关细胞粘附分子1(胆道糖蛋白2(biliary glycoprotein))(CEACAM1)，也称为BGP或BGP1(氨基酸序列为SEQ ID NO:7)。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的"嗜乳脂蛋白亚家族1成员A1"(BTN1A1)，也称为BTN或BTN1(氨基酸序列为SEQ ID NO:6)。在另一特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的脑信号蛋白4D(Semaphorin 4D)，也称为SEMAJ、CD100、coll-4和FLJ39737(氨基酸序列为SEQ ID NO:8)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的"嗜乳脂蛋白-样2"(Butyrophilin-like 2,BTNL2)，也称为BTL-II、BTN7、HSBLMHCI和SS2。在本文中使用的范畴内，实施方案的ICP抗原是指蛋白质、多肽或肽，特别是人ICP蛋白质、多肽或肽。一方面，通过实施本文所述的方法，产生制备的抗体，并筛选其与前述ICP中的任一种的优先结合，所述ICP包括下文表1中所示的糖基化的氨基酸。简言之，糖基化ICP多肽或其糖基化部分可用作免疫原以产生优先与相应的糖基化ICP蛋白或其部分结合的抗glycICP抗体。
所产生的并针对其对结合糖基化ICP的特异性(相对于未糖基化ICP抗原)选择的抗体可用作特异结合糖基化ICP抗原并阻断ICP与其同源配体的相互作用的ICP抑制剂，所述ICP的同源配体通常是在另一种细胞(例如，免疫细胞或肿瘤细胞)上表达的蛋白受体。例如，抗体可结合ICP抗原的糖基化形式，其亲和力为针对ICP的未糖基化形式的结合亲和力的2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍或10倍，但在某些实施方案中，所述结合亲力不大于针对ICP抗原的未糖基化形式的结合亲和力的20倍、50倍、100倍、1000倍或10000倍。
或者，所述抗体可与糖基化ICP结合，其中Kd小于由所述抗体与相应的未糖基化ICP的结合所展示的Kd的一半。在另一个实施方案中，所述抗体与糖基化ICP结合，其中Kd小于相对于未糖基化的ICP所展示的Kd的85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％、小于45％、小于30％、小于20％或小于10％。在另一个实施方案中，所述抗体与糖基化ICP结合，其中Kd比相对于未糖基化的ICP所展示的Kd小不超过1/10、不超过1/100或不超过1/1000。
本发明提供了用于筛选和鉴定特异性且优先与糖基化ICP抗原结合的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：筛选一组克隆抗体(诸如，但不限于，一组杂交瘤、表达抗体库的噬菌体展示文库等)中特异性识别并结合糖基化ICP抗原的一种或多种抗体，然后进一步筛选与糖基化ICP抗原特异性结合的抗体，所述抗体以比所述抗体与ICP的糖基化形式结合的亲和力低的亲和力与ICP抗原的未糖基化形式结合。或者，在一个步骤中筛选抗体群中与未糖基化ICP相比与糖基化ICP的特异性结合以及抗体与糖基化ICP的优先结合。
可使用本领域已知的任何方法进行筛选，所述方法包括利用标记的糖基化ICP抗原的淘选，或通过western印迹或通过FACS或已知用于检测抗体对抗原的特异性结合的任何其它方法测试杂交瘤培养基或文库成员与糖基化ICP抗原或表达糖基化ICP的培养细胞(其中抗原在固体载体上)的结合。与ICP的未糖基化形式相比与ICP的糖基化形式的优先结合的测定，可通过将抗体对糖基化ICP抗原的结合与对未糖基化ICP抗原(所述ICP抗原的糖基化和未糖基化的形式各自被涂覆在固体表面上)的结合相比较，或者通过FACS或流式细胞术来进行。
在一个优选实施方案中，使用流式细胞术对表达糖基化和未糖基化的形式的ICP的细胞进行优先结合的筛选。例如，可将重组表达WTICP(其被糖基化)的细胞在培养物中与相同的宿主细胞混合，所述宿主细胞重组表达不被糖基化的突变型ICP(例如，其中糖基化位点内的天冬酰胺被谷氨酰胺取代)，其中可检测地或可选择地标记一组或两组细胞。例如，可用生物素标记一组细胞，所述生物素可通过对链霉抗生物素蛋白(其连接于可检测或可选择的标记物)的结合来检测和/或分选。可使细胞混合物与待测抗体(其可用可检测或可选择的标记物直接或间接标记，诸如用识别所述待测抗体的第二抗体)接触，然后测定对两种类型的细胞的结合，例如通过FACS或例如实施例2中所述的其他抗体结合测定。在某些实施方案中，鉴定了抗体，所述抗体在如本文所述的流式细胞术中优先结合表达糖基化ICP的细胞，其频率为针对表达未糖基化的ICP的细胞的频率的至少1.5倍，2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍，并测量结合，例如，当用荧光标记物直接或间接(例如用标记的第二抗体)标记抗体时，通过两组细胞的测量的荧光强度(MFI)来测量。
糖基化形式通常是野生型ICP或其肽。ICP的未糖基化的形式可通过用酶处理ICP(例如但不限于用PNG酶F消化)产生，该酶从蛋白质除去糖基化，特别是N-连接的糖基化。或者，可突变ICP以去除蛋白质内的一个或多个糖基化位点。N-连接的糖基化通常发生在共有序列Asn-X-Ser/Thr(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)的天冬酰胺处，使得另一个氨基酸(优选谷氨酰胺)对天冬酰胺的取代导致在该位点未被糖基化的蛋白质。
在一个实施方案中，该方法还涉及筛选抗-glycICP抗体，以鉴定特异性地阻断糖基化ICP抗原与其同源ICP结合伴侣(配体或受体，例如，PD-1是PD-L1的同源ICP结合伴侣)之间的相互作用或结合的抗-glycICP抗体。在一个实施方案中，糖基化ICP抗原或其肽在肿瘤或癌细胞上表达，并且ICP配体在免疫细胞上表达。在一个实施方案中，糖基化ICP抗原或其肽在免疫细胞上表达，并且ICP配体在肿瘤或癌细胞上表达。在一个实施方案中，免疫细胞是效应T细胞或天然杀伤细胞(NK细胞)。通过测定抗体与ICP结合伴侣对ICP的竞争性结合，可筛选抑制或阻断ICP与其ICP结合伴侣的结合的抗体，所述ICP结合伴侣是被标记(包括被修饰)的可溶形式的结合伴侣，诸如至ICP结合伴侣的细胞外结构域融合的Fc融合蛋白。或者，可在细胞测定中测定抗体阻断ICP-ICP结合伴侣结合的能力，在所述细胞测定中，检测ICP-ICP结合伴侣结合的生物学后果(例如，免疫抑制、某些细胞因子产生水平的变化，等等)。
提供了产生抗体(优选表达针对糖基化ICP的抗体的克隆群)的方法，所述方法包括以在动物中有效引发抗糖基化ICP免疫反应的量向接受者动物施用人糖基化ICP或其肽，所述人糖基化ICP或其肽包含人ICP的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个通过与聚糖连接而被修饰的糖基化的天冬酰胺(N)氨基酸；然后从动物中制备杂交瘤以用于筛选。在一个实施方案中，所述动物是小鼠、大鼠或兔、山羊、驴或非人灵长类动物。或者，抗体文库，例如抗体的噬菌体文库，可从经免疫的动物产生，或者可使用抗体的天然文库。在某些实施方案中，所述动物对于人免疫球蛋白而言是转基因的。在其它实施方案中，所述文库是代表人抗体库的合成文库。抗体文库可以是表达任何形式的抗体(包括四聚体免疫球蛋白、F(ab)片段、scFv或单结构域抗体)的克隆。
在一个实施方案中，用于制备和选择抗体的方法中的糖基化ICP抗原选自PD-L1、PD-L2、PD-1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CEACAM1、BTN1A1、BTNL2、SEMA4D、CD47、CD96、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、VISTA或KIR。优选地，所述ICP为人ICP。在其它实施方案中，糖基化ICP抗原是以下物质中的一种：AGER、ALCAM、AMIGO1、AMIGO2、AMIGO3、AXL、B2M、BCAM、BCAN、BOC、BSG、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A3、BTNL1、BTNL6、BTNL7、BTNL9、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CD101、CD160、CD19、CD1D2、CD2、CD200、CD22、CD226、CD244、CD274、CD276、CD28、CD300A、CD300E、CD300LB、CD300LD、CD300LF、CD300LG、CD33、CD3E、CD3G、CD4、CD48、CD7、CD79A、CD79B、CD80、CD83、CD84、CD86、CD8A、CD8B、CD8B1、CDON、CEACAM3、CEACAM5、CHL1、CILP、CNTFR、CNTN1、CNTN2、CNTN6、CRL、CRTAM、CSF1R、CSF3R、CXADR、EMBF、ERMAP、ESAM、F11R、FAIM3、FCER1A、FCGR2B、FCGRT、FCRL1、FCRL5、FCRLA、FCRLB、FGFR1、FGFR2、FGFR4、FLT1、FLT3、GP6、GPA33、HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAVCR1、HEPACAM、HEPACAM2、ICAM1、ICAM2、ICAM4、ICAM5、ICOS、IFNGR1、KIT、L1CAM、LAIR1、LEPR、LILRA5、LILRB4、LINGO1、LINGO2、LINGO4、LRFN1、LRFN2、LRFN3、LRFN4、LRFN5、LRIG1、LRIG2、LRIG3、LRIT1、LRRC4、LRRN1、LRRN2、LRRN3、LSAMP、LSR、LY6G6F、LY9、MADCAM1、MAG、MALT1、MCAM、MERTK、MFAP3、MOG、MPZ、MPZL1、MPZL2、MPZL3、MR1、MUSK、MXRA8、NCAM1、NCAM2、NCR1、NEGR1、NEO1、NFAM1、NPTN、NRCAM、NRG1、NTM、NTRK1、NTRK2、NTRK3、OPCML、OSCAR、PAPLN、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PIGR、PRTG、PTGFRN、PTK7、PTPRD、PTPRK、PTPRS、PTPRT、PTPRU、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PXDN、ROBO1、ROBO2、ROBO3、ROBO4、ROR1、ROR2、SCN1B、SCN2B、SCN3B、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3F、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4F、SEMA4G、SEMA7A、SIGGIR、SIGLEC1、SIGLEC5、SIRPA、SIRPB1、SLAMF1、SLAMF6、SLAMF7、SLAMF8、SLAMF9、TAPBP、TAPBPL、TEK、THY1、TIE1、TIGIT、TIMD4、TMEM25、TMEM81、TMIGD1、TREM1、TREM2、TREML1、TREML2、TREML4、TYRO3、UNC5A、UNC5B、UNC5C、VCAM1、VPREB1、VPREB3、VSIG1、VSIG2、VSIG4、VSIG8、VTCN1、WFIKKN2。
在一个实施方案中，人糖基化ICP抗原是包含人PD-L1的至少7个连续氨基酸的片段的分离的多肽，其中所述多肽包含至少一个对应于人PD-L1的位置N35、N192、N200或N219(如SEQ ID NO:1中所编号的)的氨基酸，并且其中对应于PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的氨基酸中的至少一个被糖基化。在一个实施方案中，所述分离的多肽包含人PD-L1的至少8-20个连续氨基酸。在一个实施方案中，所述分离的多肽包含对应于人PD-L1的位置N35,N192,N200和/或N219的糖基化氨基酸。在另一个实施方案中，所述人糖基化ICP抗原是包含人PD-1的至少7个连续氨基酸的片段的分离的多肽，所述多肽包含至少一个对应于人PD-1的位置N49、N58、N74和/或N116(如SEQ ID NO:2中所编号的)的氨基酸，其中对应于PD-1的位置N49、N58、N74和/或N116的氨基酸中的至少一个被糖基化。在一个实施方案中，所述分离的多肽包含人PD-1的至少8-20个连续氨基酸。在一个实施方案中，所述分离的多肽包含对应于人PD-1的位置N49、N58、N74和/或N116的糖基化的氨基酸。在一个实施方案中，所述分离的多肽在其氨基或羧基末端融合或缀合于不是ICP多肽的免疫原性多肽。
在其中所分离的抗体不是人抗体(例如，其为鼠单克隆抗体)的其它实施方案中，所述方法还涉及鉴定包含抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸和对CDR周围的氨基酸序列进行人源化，以产生重组表达的人源化抗体。在一个实施方案中，所述方法涉及重组表达人源化抗体。或者，可用人恒定区取代抗体的非人恒定结构域以产生嵌合抗体。
在另一方面，提供了由上述方法生产的分离的抗体，其中相对于未糖基化的ICP，所述抗体选择性地并优先与糖基化ICP抗原结合。在一个实施方案中，所述分离的抗体为抗糖基化的PD-L1抗体。在一个实施方案中，所述分离的抗体是抗糖基化的PD-1抗体。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆人源化抗体、嵌合抗体或人抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是同种型IgM、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗体选自Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。在另一个实施方案中，将所述抗体缀合于成像剂、化疗剂、毒素或放射性核素。
在一个特定方面，本文所述的方法适用于筛选和选择抗糖基化的PD-L1抗体(本文中称为抗glycPD-L1抗体)，相对于未糖基化的PD-L1蛋白，所述抗糖基化的PD-L1抗体特异性且优先地与糖基化的PD-L1蛋白结合。在一个实施方案中，相对于未糖基化的PD-L1蛋白，所述抗glycPD-L1抗体特异性与在PD-L1蛋白的氨基酸位置N35、N192、N200和/或N219(例如，如SEQ ID NO:1中所示的，特别是在PD-L1蛋白的胞外域(ECD)中)处被糖基化的PD-L1蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与PD-L1糖肽或其肽中的一个或多个糖基化基序特异性结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与包含糖基化基序和相邻肽的PD-L1糖肽结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与在三维上位于一个或多个糖基化基序附近的肽序列结合。因此，在一些实施方案中，抗glycPD-L1抗体识别并选择性地结合糖基化的PD-L1的构象表位。作为实例，在某些实施方案中，抗glycPD-L1抗体与糖基化的PD-L1结合，其中Kd小于由抗体与未糖基化PD-l的结合所展示的Kd的一半。在一个实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与糖基化的PD-L1蛋白结合，其中Kd为该抗体与未糖基化的PD-L1的结合所展示的Kd的至多1/5。在一个实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体与糖基化的PD-L1蛋白结合，其中Kd为所述抗体与未糖基化的PD-L1的结合所展示的Kd的至多1/10。在一个实施方案中，在如实施例2中描述的细胞流式细胞术结合测定中，所述抗glycPD-L1抗体表现出以MFI表示的与表达WT PD-L1的细胞的结合为以MFI表示的与表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合的1.5倍、2倍、3倍、4倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一个实施方案中，所述抗glycPD-L1抗体以5-20nM、5-10nM或10-20nM的亲和力选择性结合糖基化的PD-L1蛋白。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或重组抗体。
在另一个特定方面中，提供了用于筛选和选择抗糖基化的PD-1抗体(本文中称为抗glycPD-1抗体)或其结合片段的方法，所述抗体或其结合片段相对于未糖基化的PD-1蛋白而言与糖基化的PD-1蛋白特异性地和优先地结合。在一个实施方案中，相对于未糖基化的PD-1蛋白，所述抗glycPD-1抗体特异性地与在人PD-1蛋白的氨基酸位置N49、N58、N74和/或N116处(例如，如SEQ ID NO:2中所示的，特别是在PD-1蛋白的胞外域(ECD)中)被糖基化的PD-1蛋白结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-1抗体与PD-1糖肽或其肽中的一个或多个糖基化基序特异性地结合。在一些实施方案中，所述抗glycPD-1抗体与PD-1糖肽结合，所述PD-1糖肽包含糖基化基序和相邻肽。在一些实施方案中，所述抗glycPD-1抗体与在三维上位于一个或多个所述糖基化基序附近的肽序列结合。因此，在一些实施方案中，抗glycPD-1抗体识别糖基化的PD-1的非线性构象表位并与其选择性结合。例如，在某些实施方案中，所述抗glycPD-1抗体与糖基化的PD-1结合，其中Kd小于由所述抗体与未糖基化的PD-1的结合展示的Kd的1/2。在一个实施方案中，所述抗glycPD-1抗体与糖基化的PD-1蛋白结合，其中Kd为由所述抗体与未糖基化的PD-1的结合展示的Kd的不到1/5。在一个实施方案中，所述抗glycPD-1抗体与糖基化的PD-1蛋白结合，其中Kd低于相对于未糖基化的PD-1蛋白所展示的Kd的1/10。在一个实施方案中，在如实施例2中描述的细胞流式细胞术结合测定中，所述抗glycPD-1抗体表现出以MFI表示的与表达WT PD-L1的细胞的结合为以MFI表示的与表达未糖基化的PD-L1的细胞的结合的1.5倍、2倍、3倍、4倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一个实施方案中，所述抗glycPD-1抗体以5-20nM、5-10nM或10-20nM的亲和力选择性结合糖基化的PD-1蛋白。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体、人源化抗体或重组抗体。
在又一方面，提供了用于评估生物样品中ICP的糖基化、N-连接的糖基化或N-糖基化的方法，其中该方法包括使含ICP的样品与通过本文所述方法产生的抗体(例如，相对于未糖基化ICP而选择性地与糖基化ICP结合的抗体)接触。在一些方面，该方法是体外方法或测定。在某些方面，所述生物样品是细胞样品、组织样品、体液(例如血浆、血清、血液、尿液、痰、淋巴液、腹水、腹腔积液、脑液或脊髓液等)。在一些特定实施方案中，所述样品是细胞样品或来自获自患有癌症或肿瘤的受试者的肿瘤或癌症的细胞样品。可使用抗糖基化蛋白质抗体测定此类癌症或肿瘤细胞样品中在癌症或肿瘤细胞表面上的糖基化ICP，以便特别地确定，如果糖基化ICP存在于受试者的癌症或肿瘤细胞上，则所述细胞很可能是用一种或多种抗糖基化ICP抗体治疗的适当靶标。举例来说，通过分离的抗体(所述抗体与此类糖基化的蛋白特异性结合并阻止或阻断它们与其同源结合伴侣相互作用)可检测的糖基化ICP包括PD-L1、PD-L2、PD-1、TIM-3、LAG-3、BTLA、CEACAM1、BTN1A1、BTNL2、SEMA4D、CD47、CD96、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、VISTA或KIR等。
在其它实施方案中，所述抗体阻断以下物质与其同源结合伴侣的相互作用：AGER、ALCAM、AMIGO1、AMIGO2、AMIGO3、AXL、B2M、BCAM、BCAN、BOC、BSG、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A3、BTNL1、BTNL6、BTNL7、BTNL9、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CD101、CD160、CD19、CD1D2、CD2、CD200、CD22、CD226、CD244、CD274、CD276、CD28、CD300A、CD300E、CD300LB、CD300LD、CD300LF、CD300LG、CD33、CD3E、CD3G、CD4、CD48、CD7、CD79A、CD79B、CD80、CD83、CD84、CD86、CD8A、CD8B、CD8B1、CDON、CEACAM3、CEACAM5、CHL1、CILP、CNTFR、CNTN1、CNTN2、CNTN6、CRL、CRTAM、CSF1R、CSF3R、CXADR、EMBF、ERMAP、ESAM、F11R、FAIM3、FCER1A、FCGR2B、FCGRT、FCRL1、FCRL5、FCRLA、FCRLB、FGFR1、FGFR2、FGFR4、FLT1、FLT3、GP6、GPA33、HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAVCR1、HEPACAM、HEPACAM2、ICAM1、ICAM2、ICAM4、ICAM5、ICOS、IFNGR1、KIT、L1CAM、LAIR1、LEPR、LILRA5、LILRB4、LINGO1、LINGO2、LINGO4、LRFN1、LRFN2、LRFN3、LRFN4、LRFN5、LRIG1、LRIG2、LRIG3、LRIT1、LRRC4、LRRN1、LRRN2、LRRN3、LSAMP、LSR、LY6G6F、LY9、MADCAM1、MAG、MALT1、MCAM、MERTK、MFAP3、MOG、MPZ、MPZL1、MPZL2、MPZL3、MR1、MUSK、MXRA8、NCAM1、NCAM2、NCR1、NEGR1、NEO1、NFAM1、NPTN、NRCAM、NRG1、NTM、NTRK1、NTRK2、NTRK3、OPCML、OSCAR、PAPLN、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PIGR、PRTG、PTGFRN、PTK7、PTPRD、PTPRK、PTPRS、PTPRT、PTPRU、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PXDN、ROBO1、ROBO2、ROBO3、ROBO4、ROR1、ROR2、SCN1B、SCN2B、SCN3B、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3F、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4F、SEMA4G、SEMA7A、SIGGIR、SIGLEC1、SIGLEC5、SIRPA、SIRPB1、SLAMF1、SLAMF6、SLAMF7、SLAMF8、SLAMF9、TAPBP、TAPBPL、TEK、THY1、TIE1、TIGIT、TIMD4、TMEM25、TMEM81、TMIGD1、TREM1、TREM2、TREML1、TREML2、TREML4、TYRO3、UNC5A、UNC5B、UNC5C、VCAM1、VPREB1、VPREB3、VSIG1、VSIG2、VSIG4、VSIG8、VTCN1或WFIKKN2。
在一个方面，通过本文公开的方法的实践，提供了分离的抗体，相对于ICP的非糖基化形式，所述分离的抗体选择性地与糖基化ICP的表位，诸如构象表位结合，所述糖基化ICP包含具有至少一个糖基化氨基酸(例如，通过与聚糖部分连接而被修饰的氨基酸(N或天冬酰胺))的至少7个连续氨基酸的片段。在一个特定的实施方案中，提供了分离的抗体，其与PD-L1的表位(诸如构象表位)选择性结合，所述PD-L1包含至少一个对应于人PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的氨基酸，其中对应于PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的氨基酸中的至少一个氨基酸是被糖基化的。在一个特定的实施方案中，提供了分离的抗体，其与PD-1的表位(诸如构象表位)选择性结合，所述PD-1包含至少一个对应于人PD-1的位置N49、N58、N74或N116的氨基酸，其中对应于PD-1的位置N49、N58、N74或N116的氨基酸中的至少一个氨基酸是被糖基化的。
在具体的实施方案中，本发明提供了制备具有两个不同抗原结合结构域的双互补位抗体的方法，所述两个抗原结合结构域各自结合不与糖基化ICP的另一抗原结合结构域的表位重叠的表位，并且至少一个结合结构域(在某些实施方案中，两个结合结构域)优先结合ICP的糖基化形式，例如通过结合含有本文所列的一个或多个糖基化位点的表位。这些抗体可以交联细胞表面蛋白，促进内化、溶酶体运输和降解。通过使用本文所述的筛选方法筛选相对于ICP的未糖基化形式优先与糖基化ICP结合的抗体，鉴定结合糖基化ICP的非重叠表位的两种抗体(其中与ICP的非糖基化形式相比，两种抗体之一或二者优先与ICP的糖基化形式结合)，可产生此类双互补位抗体。可以使用针对本文所述的任何含有糖基化的表位的抗体，其中抗体优先与糖基化ICP结合。两个抗原结合结构域可以排列在一个抗体分子中，例如，如Dimasi等，J.Mol.Biol.,393:672-692(2009)中所述。在一些具体的实施方案中，将所述抗原结合结构域之一工程化为单链Fv形式，然后，例如，通过肽接头将其连接到具有另一个抗原结合结构域的抗体的重链和/或轻链的N末端或连接到CH3结构域的C末端。
在一个特定方面，所述抗-glycICP抗体在与细胞表面上的靶抗原结合后促进其靶glycICP抗原的内化和降解。如果靶glycICP抗原在肿瘤细胞上表达或高表达，那么在通过本文提供的抗glycICP抗体结合后在肿瘤细胞上表达的糖基化靶抗原的内化导致肿瘤细胞上可用于与例如免疫细胞(诸如T细胞)上的同源结合分子相互作用的糖基化ICP减少，从而增强针对肿瘤细胞的T细胞细胞毒性效应子功能并降低由glycICP/同源结合分子相互作用产生的T细胞无反应性。在一个具体的实施方案中，所述抗体是抗-glycPD-L1抗体，其抑制PD-1与PD-L1的相互作用，并且特别地抑制效应T细胞表达的PD-1与PD-L1(特别是由肿瘤细胞表达的糖基化的PD-L1)的相互作用，并且还降低肿瘤细胞表面上的PD-L1(特别是糖基化的PD-L1)的水平，特别地通过增加PD-L1的内化和细胞内降解。通过本文提供的抗糖基化PD-L1抗体结合后在肿瘤细胞上表达的PD-L1的内化是抗-glycPD-L1抗体的一个有益特征，因为肿瘤细胞上较少的糖基化的PD-L1可用于与T细胞上的PD-1相互作用，从而增强针对肿瘤细胞的T细胞细胞毒性效应子功能并降低由PD-L1/PD-1相互作用产生的T细胞无反应性。
在另一方面，提供了抗体-药物缀合物(ADC)，其中如本文所述的抗glycICP抗体，特别是在与糖基化靶抗原结合后显示有效内化活性的抗体与抗肿瘤药物和药剂化学连接，以产生抗-glycICP抗体-药物缀合物(抗-glycICP抗体或MAb ADC)，如本文所述和示例的。在某些实施方案中，抗-glycICP抗体-ADC在杀死肿瘤或癌细胞方面以及在用于治疗患有癌症的受试者的抗肿瘤疗法中非常有效。在一些实施方案中，ADC的抗glycICP抗体组分是双特异性、多特异性、双互补位或多互补位抗体，或其抗原结合部分。在其他实施方案中，抗glycICP抗体与抗有丝分裂剂(诸如美登素衍生物，例如美登木素生物碱诸如DM1或DM4)，或与微管蛋白聚合性奥瑞斯他汀(auristatin)例如单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)或单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)化学连接，如本文中进一步描述的。在一个实施方案中，抗-glycICP抗体的接头在细胞外流中是稳定的，但一旦ADC进入肿瘤或癌细胞就被组织蛋白酶切割，从而激活MMAE或其他毒素药物的抗有丝分裂机制。在一个具体实施方案中，ADC的抗体组分是如本文所述的STM073 MAb或STM108 MAb。在一个实施方案中，含有抗glycICP抗体的ADC(抗-glycICP抗体-ADC)，例如含有STM108 MAb的ADC(STM108-ADC)，通过可切割的接头与MMAE化学连接。在一个特定的实施方案中，所述抗glycICP抗体-ADC(例如，STM108-ADC)包含其中所述抗-glycICP抗体(例如，STM108 MAb)通过其C-区中的半胱氨酸残基与马来酰亚胺和己酸(MC)连接基团化学连接的结构，所述连接基团化学连接至组织蛋白酶可切割的接头，诸如由缬氨酸(Val)和瓜氨酸(Cit)组成的“vc”，其化学连接至间隔子“PAB”(即对氨基苯甲酸)，所述间隔子化学连接至MMAE细胞毒素，从而产生ADC，根据其组分结构命名为抗-glycICP抗体-MC-vc-PAB-MMAE，例如STM108-MC-vc-PAB-MMAE。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步证明本文所述方法和抗体的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的实施方案的详细描述，可以更好地理解它们，尽管它们无意是限制性的。本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
图1.在PNG酶F处理存在或不存在的情况下体外人PD-L1与抗人PD-L1抗体的结合。将His标记的PD-L1在天然条件下用或不用PNG酶F处理，然后固定在Ni-NTA包被的平板上。将荧光标记的抗PD-L1抗体与固定化的配体一起孵育，并定量抗体对于配体的结合亲和力。
图2.抗人PD-L1抗体对PD-L1与PD-1的结合的阻断。将表达PD-L1的BT549细胞与抗人PD-L1抗体和荧光标记的PD-1-Fc-融合蛋白一起孵育。每小时通过IncuCyteTMZoom量化配体与受体的结合。红色标记表示抗体显示对PD-L1/PD-1结合的完全阻断。
图3A-3C.抗糖基化的PD-L1单克隆抗体的表征。A.PD-L1 WT和通过突变PD-L1氨基酸序列内的糖基化位点(PD-L1 4NQ表示4个谷氨酰胺(Q)对天冬酰胺(N)的取代)产生的非糖基化PD-L1的示意性描绘。B.5种抗-glycPD-L1抗体的western印迹分析。左图显示使用抗Flag抗体的等量的PD-L1 WT和4NQ表达。C.5种抗-glycPD-L1抗体的流式细胞术分析。
图4A-4D.抗糖基化的PD-L1抗体的表征。A.PD-L1 WT和非糖基化PD-L1变体的示意性描绘。B.表达WT、N35/3NQ、N192/3NQ、N200/3NQ和N219/3NQ PD-L1的BT 549的稳定克隆的western印迹分析。C.6种抗-glycPD-L1抗体的western印迹分析。D.肝癌细胞系中5种抗-glycPD-L1抗体的western印迹分析。
图5.通过免疫组织化学(IHC)表征抗糖基化的PD-L1单克隆抗体。对于细胞离心涂片(cytospin)分析，将表达PD-L1 WT或PD-L1 4NQ蛋白的BT-549细胞铺开并用5种抗-glycPD-L1抗体染色。对于IHC染色，乳腺癌患者样品用抗-glycPD-L1抗体染色。
图6A-6D.结合测定。图6A-6C显示如实施例5中所述的结合测定的结果。相对于测定对照无PD-1/Fc；无Ab；mIgG Ab(图6D)，抗-glycPD-L1抗体以剂量依赖性方式阻断PD-1与表达WT PD-L1的BT549靶细胞的结合(图6A显示STM004结合，图6B显示STM073结合，图6C显示STM108结合)。
图7A和7B.抗-glycPD-L1抗体增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。在如实施例6中所述的细胞细胞毒性测定中测试使用本文所述方法产生的两种不同的抗糖基化PD-L1抗体，以评估PBMC来源的T细胞对肿瘤细胞(BT 549)的细胞毒性。图7A(STM004)和7B(STM073)分别实时显示用两种不同抗体处理的表达PD-L1 WT的BT549细胞的死亡(凋亡)。在图7A和7B中，底部图(实心蓝色方块)表示对照(来自PBMC，无T细胞)；实心红色圆圈表示无抗体对照；实心黑色方块表示测定中使用的20μg/ml抗糖基化PD-L1抗体；实心棕色圆圈表示测定中使用的40μg/ml抗糖基化PD-L1抗体。如图7A和7B所示，荷有PD-L1的肿瘤细胞随时间的杀伤是剂量依赖性的。
图8A-8C.抗glycPD-L1抗体结合后PD-L1的内化和降解。图8A-8C显示用双功能抗-glycPD-L1抗体孵育的表达PD-L1的细胞的活细胞成像结果。在图8A-8C中，抗PD-L1抗体是缀合有红色荧光染料pHrodoTM Red(琥珀酰亚胺酯(pHrodoTM Red,SE),(ThermoFisherScientific,Waltham,MA)的STM108 MAb。pHrodoTM Red染料缀合物在细胞外是无荧光的，但在吞噬体中发出明亮的红色荧光，这使得它们成为用于从生物颗粒的吞噬作用到受体内化的研究的有用试剂。绿色染色反映了用Green DND-26染色的细胞，所述染料是可透过细胞的绿色染料，其对活细胞(通过活细胞成像技术成像的)中的酸性区室(溶酶体)进行染色。图8A显示在第一时间点(时间0)，STM108被内化到细胞中，如通过箭头指示的细胞的强烈红色细胞内染色所描绘的。图8B显示在图8A中的时间点之后2分钟时图8A中描绘的相同细胞中的弱细胞内红色染色。图8C显示在图8A中的时间点后4分钟缺乏红色细胞内染色，这反映了细胞内STM108抗体和/或抗体-抗原复合物的降解。
图9A-9L.肿瘤细胞对比总T细胞中抗PD-L1抗体结合的PD-L1的内化。图9A-9L显示细胞的图像，其显示双功能抗-glycPD-L1抗体内化到PD-L1阳性肿瘤细胞中，但不能内化到活化或非活化的T细胞中。图9A-9D显示在与以下抗体孵育后来自外周血的非活化的总T细胞的图像：小鼠IgG抗体对照(图9A)；非内化抗-glycPD-L1 MAb STM004(图9B)；双功能抗-glycPD-L1 MAb STM073(图9C)；和双功能抗-glycPD-L1抗体STM108(图9D)。图9A-9D显示所测试的抗体均未内化到非活化的总T细胞中。图9E-9H显示在与以下抗体孵育后来自外周血的活化的总T细胞的图像：小鼠IgG抗体对照(图9E)；非内化STM004(图9F)；双功能STM073(图9G)；和双功能STM108(图9H)。对于T细胞活化，将总T细胞与珠粒(例如，惰性超顺磁性珠粒)混合，所述珠粒以1:1的比例与抗CD3和抗CD28抗体(例如，ThermoFisher Scientific，Rochester，NY)共价偶联。图9E-9H显示，对于任何测试的抗体，实际上未观察到至活化的总T细胞中的内化。图9I-9L显示在与以下抗体一起孵育后NCI-H226细胞(人肺癌细胞系，鳞状细胞间皮瘤)的图像：小鼠IgG抗体对照(图9I)；非内化的抗-glycPD-L1抗体STM004(图9J)；双功能抗-glycPD-L1 MAb STM073(图9K)；和双功能抗-glycPD-L1 MAb STM108(图9L)。图9I-9L显示，与对照抗体mIgG(图9I)和非内化的STM004 MAb相比，如通过红色细胞内染色所证明的，在与这些细胞一起孵育后,双重功能内化STM073和STM108 MAb被内化到NCI-H226细胞中。
图10A-10D.抗-glycPD-L1抗体-ADC的抗肿瘤功效。图10A-10D呈现评估与注射对照(单独的IgG和STM108 MAb)的带有肿瘤的动物相比，在用STM108 ADC注射带肿瘤的动物后，包含与MMAE偶联(以产生如本文所述的抗体-药物缀合物(STM108-ADC))的双功能抗-glycPD-L1 MAb STM108的ADC在杀死表达PD-L1的肿瘤细胞和非表达PD-L1的肿瘤细胞方面以及在减小肿瘤移植小鼠的肿瘤体积方面的功效的实验结果。图10A显示与暴露于不同浓度的STM108-ADC(即，“ADC108”)后的经分子工程改造以敲除其PD-L1表达的MB231细胞(“MB231 PDL1 KO”)的存活率％(实心黑色方块)相比，暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后的表达PD-L1的MDA-MB231(人乳腺癌细胞系)肿瘤细胞(“MB231”)的存活率％(实心黑色圆圈)。在图10B中，使用MDA-MB231乳腺癌小鼠模型，其中用IgG-MMAE对照(100μg)，或用50μg、100μg或150μg的STM108 ADC(“ADC”)或用100μg的STM108 MAb处理用来源于MB231细胞的肿瘤移植的动物，如图10B中的图表上所指示的。在施以100μg STM108-ADC的5只小鼠中的3只和施以150μg STM108-ADC的5只小鼠中的4只中观察到完全反应(“CR”)。图10C显示与暴露于不同浓度的STM108-ADC(即，“ADC108”)后的天然不表达PD-L1(“4T1”)的4T1细胞的存活率％(空心红色方块)相比，暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后的经分子工程改造以在细胞表面上表达人PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1 hPDL1”)的存活率％(空心红色圆圈)。在图10D中，使用4T1同基因乳腺癌小鼠模型，其中动物(Balb/c小鼠)用来源于经分子工程改造以在细胞表面上表达PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1hPD-L1”)的肿瘤移植，或者其中Balb/c小鼠用来源于不在细胞表面上天然表达PD-L1的未转染的4T1乳腺癌细胞(“4T1”)的肿瘤移植。荷有来源于两种类型的4T1细胞的肿瘤的动物用IgG-MMAE对照(100μg)进行处理，或用STM108 MAb(100μg)进行处理，或用STM108 ADC(100μg)进行处理，如图10D的图表上所指示的。参见实施例8。
根据以下详细描述和说明性示例，所描述的实施方案的其他方面、特征和有利方面将变得显而易见。
具体实施方式
本文提供了用于产生、筛选和选择抗体(诸如单克隆抗体(MAb))的方法，相对于非糖基化ICP或其非糖基化肽，所述抗体特异性地且优先地识别并结合糖基化的免疫检查点蛋白(ICP)或其糖基化肽。ICP的非限制性实例包括PD-L1,PD-L2,PD-1,TIM-3,LAG-3,BTLA,CEACAM1,BTN1A1,BTNL2,SEMA4D,CD47,CD96,B7-H3,B7-H4,CTLA-4,VISTA或KIR等，其中一些或全部是包含一个或多个聚糖结构的糖蛋白。首字母缩略词“MAb”在本文中用于表示“单克隆抗体”。
如本领域技术人员所理解的，ICP之间，诸如在肿瘤细胞上表达的程序化死亡配体-1蛋白(PD-L1)与在免疫效应细胞例如T细胞上表达的程序化死亡-1蛋白(PD-1)之间的细胞外相互作用对肿瘤相关的免疫逃逸具有显著影响。(参见，例如，Pardoll,D.M.,2012,Nature Reviews,12:252-264)。尽管使用抗PD-1或抗PD-L1抗体进行的免疫检查点阻断获得了临床成功，但PD-L1与PD-1相互作用背后的调节机制和结构特征仍然在很大程度上是未知的。发现PD-L1的N-连接的糖基化能够稳定PD-L1蛋白配体并且还促进和增强其与PD-1的结合，这促进T细胞介导的免疫反应的抑制。通过本文所述的方法产生的抗-glycPD-L1抗体用于预防、阻断或抑制PD-L1/PD-1相互作用，从而可用作用于癌症治疗的有效ICP抑制剂。
在一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的PD-L1多肽(也称为CD274、PDCD1L1或B7-H1)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的PD-1多肽(也称为CD279)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的PD-L2多肽。就本文所用的范畴而言，“PD-L1”是指PD-L1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-L1(其氨基酸序列是SEQ IDNO:1)；并且“PD-1”是指PD-1蛋白、多肽或肽，特别是人PD-1(其氨基酸序列是SEQ ID NO:2)。
在一些特定实施方案中，本文所述的方法中使用的糖基化ICP抗原是PD-L1蛋白的至少7个氨基酸的多肽，其在PD-L1蛋白的位置N35、N192、N200和/或N219处含有一个或多个糖基化位点，例如，如SEQ ID NO:1中所示的。在另一个实施方案中，本文所述的方法中使用的糖基化ICP抗原是PD-1蛋白的至少7个氨基酸的多肽，其在例如如SEQ ID NO:2中所示的人PD-1蛋白的氨基酸位置N49、N58、N74和/或N116处含有一个或多个糖基化位点。
在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的“T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3”(TIM-3)，也称为CD366、FLJ14428、TIMD3和HAVCR2(SEQ ID NO:4)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的“淋巴细胞活化基因-3”(LAG-3)，也称为CD223(SEQ ID NO:5)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的“B和T淋巴细胞衰减子”(BTLA)，也称为CD272(SEQ ID NO:3)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的CD47，也称为IAP、MER6和OA3。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的CD96，也称为CD96分子或CD96抗原。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的“癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(胆汁糖蛋白)”(CEACAM1)，也称为BGP或BGP1(SEQ ID NO:7)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的“嗜乳脂蛋白亚家族1成员A1”(BTN1A1)，也称为BTN或BTN1(SEQ ID NO:6)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的脑信号蛋白4D，也称为SEMAJ、CD100、coll-4和FLJ39737(SEQ IDNO:8)。在另一个特定实施方案中，糖基化ICP抗原是人糖基化的“嗜乳脂蛋白-样2”(BTNL2)，也称为BTL-II、BTN7、HSBLMHCI和SS2。就本文所用的范畴而言，各实施方案的ICP抗原是指蛋白质、多肽或肽，特别是人ICP蛋白、多肽或肽。
表1：ICP氨基酸序列的糖基化位点
在表1中，糖基化的氨基酸(N)以粗体标示并加下划线。具体地，对于BTLA，3个糖基化位点示于SEQ ID NO:3的BTLA ICP蛋白序列的氨基酸位置N75、N94和N110处。对于TIM-3，两个糖基化位点示于SEQ ID NO:4的TIM-3 ICP蛋白序列的氨基酸位置N78和N151处。对于LAG-3，4个糖基化位点示于SEQ ID NO:5的LAG-3 ICP蛋白序列的氨基酸位置N166、N228、N234和N321处。对于BTN1A1，3个糖基化位点示于SEQ ID NO:6的BTN1A1 ICP蛋白序列的氨基酸位置N55、N215和N449处。对于CEACAM1，3个糖基化位点示于SEQ ID NO:7的BTLA ICP蛋白序列的氨基酸位置N104、N111和N115处。对于脑信号蛋白4D，6个糖基化位点示于SEQ IDNO:8的脑信号蛋白4D氨基酸序列的氨基酸位置N139、N191、N204、N254、N613和N632处。
在某些实施方案中，所述方法中使用的糖基化ICP抗原可以是人BTLA的至少7个氨基酸的多肽，其在SEQ ID NO:3的BTLA ICP蛋白序列的氨基酸位置N75、N94和N110处含有一个或多个糖基化位点。在某些实施方案中，糖基化ICP抗原是人TIM-3的至少7个氨基酸的多肽，其在SEQ ID NO:4的TIM-3ICP蛋白序列的氨基酸位置N78和N151处含有一个或两个糖基化位点。在某些实施方案中，糖基化ICP抗原是人LAG-3的至少7个氨基酸的多肽，其在SEQID NO:5的LAG-3ICP蛋白序列的氨基酸位置N166、N228、N234和N321处含有一个或多个糖基化位点。在某些实施方案中，糖基化ICP抗原是人BTN1A1的至少7个氨基酸的多肽，其在SEQID NO:6的BTN1A1 ICP蛋白序列的氨基酸位置N55、N215和N449处含有一个或多个糖基化位点。在某些实施方案中，糖基化ICP抗原是人CEACAM1的至少7个氨基酸的多肽，其在SEQ IDNO:7的BTLA ICP蛋白序列的氨基酸位置N104、N111和N115处含有一个或多个糖基化位点。在某些实施方案中，糖基化ICP抗原是人脑信号蛋白4D的至少7个氨基酸的多肽，其在SEQID NO:8的脑信号蛋白4D氨基酸序列的氨基酸位置N139、N191、N204、N254、N613和N632处含有一个或多个糖基化位点。抗glycICP抗体可以结合含有这些糖基化位点中的一个或多个糖基化位点的表位。
在其他实施方案中，制备和选择抗体的方法中使用的糖基化的人ICP抗原选自PD-L2,BTNL2,B7-H3,B7-H4,CTLA-4,VISTA或KIR。优选地，ICP是人ICP。在其他实施方案中，糖基化ICP抗原(优选人)是以下之一：AGER、ALCAM、AMIGO1、AMIGO2、AMIGO3、AXL、B2M、BCAM、BCAN、BOC、BSG、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A3、BTNL1、BTNL6、BTNL7、BTNL9、CADM1、CADM2、CADM3、CADM4、CD101、CD160、CD19、CD1D2、CD2、CD200、CD22、CD226、CD244、CD274、CD276、CD28、CD300A、CD300E、CD300LB、CD300LD、CD300LF、CD300LG、CD33、CD3E、CD3G、CD4、CD48、CD7、CD79A、CD79B、CD80、CD83、CD84、CD86、CD8A、CD8B、CD8B1、CDON、CEACAM3、CEACAM5、CHL1、CILP、CNTFR、CNTN1、CNTN2、CNTN6、CRL、CRTAM、CSF1R、CSF3R、CXADR、EMBF、ERMAP、ESAM、F11R、FAIM3、FCER1A、FCGR2B、FCGRT、FCRL1、FCRL5、FCRLA、FCRLB、FGFR1、FGFR2、FGFR4、FLT1、FLT3、GP6、GPA33、HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAVCR1、HEPACAM、HEPACAM2、ICAM1、ICAM2、ICAM4、ICAM5、ICOS、IFNGR1、KIT、L1CAM、LAIR1、LEPR、LILRA5、LILRB4、LINGO1、LINGO2、LINGO4、LRFN1、LRFN2、LRFN3、LRFN4、LRFN5、LRIG1、LRIG2、LRIG3、LRIT1、LRRC4、LRRN1、LRRN2、LRRN3、LSAMP、LSR、LY6G6F、LY9、MADCAM1、MAG、MALT1、MCAM、MERTK、MFAP3、MOG、MPZ、MPZL1、MPZL2、MPZL3、MR1、MUSK、MXRA8、NCAM1、NCAM2、NCR1、NEGR1、NEO1、NFAM1、NPTN、NRCAM、NRG1、NTM、NTRK1、NTRK2、NTRK3、OPCML、OSCAR、PAPLN、PDCD1、PDCD1LG2、PDGFRA、PDGFRB、PECAM1、PIGR、PRTG、PTGFRN、PTK7、PTPRD、PTPRK、PTPRS、PTPRT、PTPRU、PVR、PVRL1、PVRL2、PVRL3、PVRL4、PXDN、ROBO1、ROBO2、ROBO3、ROBO4、ROR1、ROR2、SCN1B、SCN2B、SCN3B、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3F、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4F、SEMA4G、SEMA7A、SIGGIR、SIGLEC1、SIGLEC5、SIRPA、SIRPB1、SLAMF1、SLAMF6、SLAMF7、SLAMF8、SLAMF9、TAPBP、TAPBPL、TEK、THY1、TIE1、TIGIT、TIMD4、TMEM25、TMEM81、TMIGD1、TREM1、TREM2、TREML1、TREML2、TREML4、TYRO3、UNC5A、UNC5B、UNC5C、VCAM1、VPREB1、VPREB3、VSIG1、VSIG2、VSIG4、VSIG8、VTCN1或WFIKKN2。
产生用于筛选对比于非糖基化ICP而选择性和优先结合糖基化ICP的抗glycICP抗体的方法并非意图限制。在一个特定实施方案中，采用杂交瘤方法产生针对糖基化ICP抗原的单克隆抗体(MAb)，针对与糖基化ICP或其糖基化肽的特异性结合而筛选所述抗体。根据本方法，糖基化ICP或其糖基化肽被用作抗原或免疫原以免疫非人动物来引发免疫反应，并生成产生针对糖基化ICP的抗体的B细胞。然后对抗体筛选对比于ICP的未糖基化形式而特异性结合以及与糖基化ICP的优先结合。还可针对阻断或抑制糖基化ICP与其ICP结合伴侣的结合而筛选所述抗体。在一个实例中，所述抗体选择性地且优先地与糖基化的PD-L1结合并阻断或抑制PD-L1与PD-1的结合。或者，所述抗体选择性地和优先地与糖基化的PD-1结合并阻断或抑制PD-1与PD-1的结合伴侣(包括PD-L1或PD-L2)的结合。通过本文提供的方法选择和鉴定的抗体可用作治疗剂，其可调节由ICP介导的免疫抑制活性或用作用于检测和表征生物样品中的糖基化ICP的试剂。
单克隆抗体是对给定的靶抗原单特异性的抗体。MAb由相同的免疫B细胞合成和产生，所述免疫B细胞是独特的亲本B细胞的所有克隆，与针对靶抗原但由不同B细胞产生的多克隆抗体相反。单克隆抗体具有单价亲和力并与相同的表位结合。通常，可以产生特异性结合用作免疫原产生抗体的靶抗原的单克隆抗体。然后，此类MAb可用于检测或纯化靶抗原或调节靶抗原的生物活性。另外，MAb，特别是对给定的靶抗原具有特异性的分离和纯化的MAb可用于治疗疾病和病状，诸如癌症、肿瘤等。在一些实施方案中，靶抗原是糖基化ICP或其糖基化的肽部分。在一些实施方案中，相对于非糖基化ICP，针对糖基化ICP或其糖基化的肽部分产生的MAb特异性地和选择性地识别并结合糖基化ICP。
定义
如本文中所用，术语“一个/种(a)”可意指一个/种或多个/种。
如本文中所用，除非明确指出仅指代替代物或替代物是相互排斥的，否则术语“或”意指“和/或”，尽管本公开支持仅指代替代物以及“和/或”的定义。
如本文中所用，术语“另一个”意指至少第二个或更多个。
如本文中所用，术语“约”用于表示值包括采用来测定所述值的装置、方法的固有误差变化，或研究对象之间存在的变化。
如本文中所用，术语“程序化死亡配体-1”或“PD-L1”是指多肽(术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用)或来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PD-L1，除非另有说明，否则在某些实施方案中，包括各种PD-L1同种型、相关的PD-L1多肽，包括其SNP变体。类似地，术语“程序化死亡-1”或“PD-1”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人、食蟹猴(cyno))、狗和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的PD-1。除非另有说明，否则PD-1还包括各种PD-1同种型、相关的PD-1多肽，包括其SNP变体，以及PD-1的不同修饰形式，包括但不限于磷酸化的PD-1、糖基化的PD-1、遍在蛋白化PD-1。
下文中提供人PD-L1的示例性氨基酸序列(UniProtKB/Swiss-Prot:Q9NZQ7.1；GI:83287884)：
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFT VTVPKDLYVV EYGSNMTIEC KFPVEKQLDL AALIVYWEME DKNIIQFVHG EEDLKVQHSS YRQRARLLKD QLSLGNAALQ ITDVKLQDAG VYRCMISYGG ADYKRITVKVNAPYNKINQR ILVVDPVTSE HELTCQAEGY PKAEVIWTSS DHQVLSGKTT TTNSKREEKL FNVTSTLRINTTTNEIFYCT FRRLDPEENH TAELVIPELP LAHPPNERTH LVILGAILLC LGVALTFIFR LRKGRMMDVKKCGIQDTNSK KQSDTHLEET(SEQ ID NO:1)。在SEQ ID NO:1中，氨基末端氨基酸1-18构成人PD-L1蛋白的信号序列。因此，成熟的人PD-L1蛋白由SEQ ID NO:1的氨基酸19-290组成。
下文中提供人PD-1的示例性氨基酸序列(UniProtKB:；Q15116.3GI:145559515)：
MQIPQAPWPV VWAVLQLGWR PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTSESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAPKAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTIGARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADGPRSAQPLRPE DGHCSWPL(SEQ ID NO:2)。在SEQ ID NO:2中，糖基化的氨基酸残基加下划线并以粗体显示。同样在SEQ ID NO:2中，氨基末端氨基酸1-20构成人PD-1蛋白的信号序列。因此，成熟的人PD-1蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸21-288组成。
包含本文所述的多肽和肽的氨基酸残基的缩写以及这些氨基酸残基的保守取代显示于下表2中。含有一个或多个保守氨基酸取代的多肽或本文所述的多肽的保守修饰的变体是指其中原始或天然存在的氨基酸被具有相似特征的其他氨基酸取代的多肽，所述特征是例如相似的电荷、疏水性/亲水性、侧链大小、主链构象、结构和刚性等。因此，通常可以在不改变多肽的生物活性、功能或其他所需性质(例如其对抗原的亲和力或特异性)的情况下进行这些氨基酸改变。通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性。此外，在结构或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏多肽的生物活性。
表2.氨基酸残基和保守氨基酸取代的实例
术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“Ig”在本文中被广义地可互换使用，并且特别涵盖例如单独的抗糖基化ICP抗体，诸如本文所述的单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、中和抗体、全长或完整单克隆抗体、维持抗原结合活性的抗体的肽片段)、抗非糖基化ICP抗体和抗糖基化ICP抗体；具有多表位或单表位特异性的抗ICP抗体组合物、多克隆或单价抗体、多价抗体、由至少两个完整抗体或其抗原结合片段形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体或双互补位抗体，只要它们表现出所需的生物学活性)、单链抗ICP抗体和抗ICP抗体的片段，如下所述的。抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和/或亲和力成熟的抗体。抗体可来自其他物种，例如小鼠、大鼠、兔等。术语“抗体”旨在包括能够与特定分子抗原结合的免疫球蛋白类多肽中的B细胞的多肽产物。抗体通常由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)；并且其中重链和轻链的氨基末端部分包括约100个至约130个或更多个氨基酸的可变区，每条链的羧基末端部分包括恒定区(参见Borrebaeck(编辑),1995,Antibody Engineering，第2版，Oxford University Press.；Kuby,1997,Immunology，第3版，W.H.Freeman and Company,New York)。在一些具体的实施方案中，由本文提供的抗体结合的特定分子抗原包括ICP抗原多肽、ICP肽片段或ICP表位。ICP多肽、ICP肽片段或ICP表位可以是未糖基化的或糖基化的。在一个特定实施方案中，ICP多肽、ICP肽片段或ICP表位是糖基化的。与ICP抗原结合的抗体或其肽片段可以例如通过免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的以及如本文实施例中描述的其他技术鉴定。当抗体或其片段以高于任何交叉反应抗原的亲和力(如使用实验技术诸如放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)所测定的)结合ICP抗原时，所述抗体或其片段与ICP抗原特异性结合。通常，特异性或选择性结合反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更通常地是背景信号或噪声的5-10倍。关于抗体特异性的讨论，参见例如Paul，编辑，1989,Fundamental Immunology第2版，Raven Press,New York，第332-336页。
本文提供的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、内抗体(intrabody)、抗独特型(抗-Id)抗体以及上述任一种的功能性片段(例如，抗原结合片段，诸如糖基化ICP结合片段)。结合片段是指抗体重链或轻链多肽的一部分，诸如肽部分，其保留了从其衍生该片段的抗体的部分或全部结合活性。功能性片段(例如，抗原结合片段，诸如ICP结合片段)的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性、双互补位、单价的(例如，具有单个VH或VL结构域)或二价的，等等)、Fab片段、F(ab')片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，抗原结合结构域或含有结合ICP抗原特别是糖基化ICP抗原的抗原结合部位(例如，抗糖基化ICP抗体的一个或多个互补决定区(CDR))的分子。此类抗体片段的描述可见于，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；Myers(编辑),Molec.Biology and Biotechnology:A ComprehensiveDesk Reference,New York:VCH Publisher,Inc.；Huston等，Cell Biophysics,22:189-224(1993)；Plückthun和Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)中以及Day,E.D.,Advanced Immunochemistry，第2版，Wiley-Liss,Inc.,New York,NY(1990)中。本文提供的抗体可以是任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、任何类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子。抗PD-L1抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗ICP抗体是完全人的，诸如完全人单克隆抗ICP抗体。在某些实施方案中，抗ICP抗体是人源化的，诸如人源化的单克隆抗-glycICP抗体。在某些实施方案中，本文提供的抗体是IgG抗体，或其一类(例如，人IgG1或IgG4)或亚类，特别是IgG1亚类抗体。
四链抗体单元是异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。在IgG的情况下，四链(未还原的)抗体单元的分子量通常为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个二硫键相互连接，这取决于H链同种型。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。在N末端，每个H链具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链中的每一个的三个恒定结构域(CH)以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每个L链在N-末端具有可变结构域(VL)，随后在其羧基末端具有恒定结构域(CL)。VL结构域与VH结构域对齐，并且CL结构域与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。有人认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合部位。本领域技术人员理解免疫球蛋白分子的基本结构。例如，不同类别抗体的结构和性质可见于Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr和TristramG.Parslow(编辑),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994，第71页和第6章。
如本文中所用，术语“抗原”或“靶抗原”是抗体可选择性结合的预定分子。靶抗原可以是多肽、肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是小分子。在某些实施方案中，靶抗原是多肽或肽，优选糖基化ICP。
如本文中所用，术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区”和类似术语是指抗体的这样的部分(例如，抗体的CDR是抗原结合区)，该部分包括与抗原相互作用并赋予抗体作为结合剂的其对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基。抗原结合区可以源自任何动物物种，诸如啮齿类动物(例如兔、大鼠或仓鼠)和人。在一些具体的实施方案中，抗原结合区可以是人源的。
“分离的”抗体基本上不含来自细胞或组织来源的细胞物质或其他污染性蛋白质和/或抗体所源自的其他污染物成分，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括抗体制剂，其中抗体与从中分离或重组产生其的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括具有少于约30％,25％,20％,15％,10％,5％或1％(按干重计)的异源蛋白质(在本文中也称为“污染性蛋白质”)的抗体制剂。在某些实施方案中，当重组产生抗体时，其基本上不含培养基，例如，培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、15％、10％、5％或1％。在某些实施方案中，当通过化学合成产生抗体时，其基本上不含化学前体或其他化学物质，例如，其与化学前体或参与蛋白质合成的其他化学物质分离。因此，此类抗体制剂具有少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(按干重计)的除目标抗体外的化学前体或化合物。污染组分还可包括但不限于会干扰抗体治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质溶质。在某些实施方案中，将抗体纯化(1)至大于或等于95重量％(诸如95重量％、96重量％、97重量％、98重量％或99重量％)的抗体,如通过Lowry方法(Lowry等J.Bio.Chem.193:265-275,1951)测定的，(2)至足以通过使用旋转杯式测序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)至使用考马斯蓝或银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE检测的均一性。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。在一些实施方案中，分离本文提供的抗体。
如本文所用，术语“结合(binds)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用，包括例如形成复合物。说明性地，此类相互作用包括非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价键或非共价键、相互作用或力结合在一起的两个或更多个分子的结合。抗体的单个抗原结合部位与其靶标(抗原)分子(诸如PD-L1或PD-1)上的表位之间的总的非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。抗体与单价抗原的结合(kon)对解离(koff)的比率(kon/koff)是结合常数K，其是亲和力的量度。K的值因抗体与抗原的不同复合物而异，并且取决于kon和koff两者。本文提供的抗体的结合常数K可使用本文提供的任何方法或本领域技术人员已知的任何其他方法确定。一个结合部位处的亲和力并不总是反映抗体与抗原之间相互作用的真实强度。当含有多个重复抗原决定簇的复合抗原与含有多个结合部位的抗体接触时，抗体与抗原在一个部位的相互作用将增加在第二结合部位处相互作用的可能性。多价抗体与抗原之间的这种多重相互作用的强度称为亲合力。与其各个结合部位的亲和力相比，抗体的亲合力可以是其结合能力的更好量度。例如，高亲合力可以补偿低亲和力，如有时对于五聚体IgM抗体所发现的，所述五聚体IgM抗体可具有比IgG低的亲和力，但由其多价性导致的IgM的高亲合力使其能够有效地与抗原结合。
“结合亲和力”通常是指分子(例如结合蛋白诸如抗体)的单个结合部位与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。结合分子X对其结合伴侣Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些)测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持与抗原结合更长时间。用于测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何方法都可用于本公开的目的。一些具体的说明性实施方案包括以下：在一个实施方案中，“Kd”或“Kd值”通过本领域已知的测定法测量，例如通过结合测定法。Kd可以在放射性标记的抗原结合测定(RIA)中测量，例如，用目标抗体的Fab部分及其抗原进行测定(Chen等，(1999)J.Mol Biol 293:865-881)。Kd或Kd值也可通过使用表面等离子体共振测定(通过BIAcore)，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)或通过生物层干涉测量法测(使用例如OctetQK384系统(ForteBio,Menlo Park,CA))来测量。“结合速率(on-rate)”或“缔合速率(rate of association)”或“缔合速率(association rate)”或“kon”也可使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)或OctetQK384系统(ForteBio,Menlo Park,CA)，通过上述相同的表面等离子体共振或生物层干涉测量技术来测定。
术语“抗-glycICP抗体”、“与糖基化ICP特异性结合的抗体”或“对糖基化ICP特异的抗体”、“与糖基化ICP表位特异性结合的抗体”、“与糖基化ICP选择性结合的抗体”、“与糖基化ICP表位选择性结合的抗体”、“与糖基化ICP表位优先结合的抗体”和类似术语在本文中可互换使用，指能够以足够的亲和力和特异性结合ICP的抗体(即，糖基化的或WT ICP)的抗体。抗糖基化ICP抗体与糖基化ICP多肽，诸如糖基化ICP抗原、肽片段或表位(例如人PD-L1，诸如人PD-L1多肽、抗原或表位)特异性结合。本文提供的抗glycICP抗体的“优先结合”可以基于抗体与细胞上表达的糖基化ICP的结合对比适当的对照(诸如与表达ICP的非糖基化形式的细胞的结合)的荧光强度的定量来测定，如本文实施例2中针对优先结合糖基化的PD-L1的抗体所描述的。所描述的抗ICP抗体与糖基化ICP多肽或表达糖基化ICP的细胞的优先结合由使用实施例2中所述的测定法测量的荧光结合强度(MFI)值表示，该MFI值为针对所述抗体与非糖基化ICP多肽或表达非糖基化ICP的细胞的结合的MFI值的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或更多。在一些实施方案中，优先或选择性地结合糖基化ICP的抗glycICP抗体表现出的对于结合表达ICP的糖基化形式的细胞的MFI值为同一抗体对于结合表达ICP的非糖基化形式或未被完全糖基化ICP糖基化变体的细胞的MFI值的1.5倍至25倍、或2倍至20倍、或3倍至15倍、或4倍至8倍、或2倍至10倍、或2倍至5倍，如例如根据实施例2中的流式细胞术测定所测定的。所有前述值之间的和等于所有前述值的荧光强度倍数值意欲被包括在内。
在一些实施方案中，与人糖基化ICP(例如，人PD-L1)特异性结合的抗体可与包含至少一个N-连接的糖基化的氨基酸的胞外域(ECD)或衍生自糖基化ICP的ECD的肽结合。与人糖基化ICP抗原(例如，人PD-L1)特异性结合的抗体可以与相关抗原(例如，食蟹猴(cyno)ICP抗原)交叉反应。在一个优选实施方案中，与人糖基化ICP抗原特异性结合的抗体不与其他ICP抗原交叉反应。可以例如通过免疫测定法、Biacore或本领域技术人员已知的其他技术鉴定与人糖基化ICP抗原特异性结合的抗体。在某些实施方案中，如本文中所述，与人糖基化ICP结合的抗体具有小于或等于20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM或0.1nM和/或大于或等于0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，与糖基化ICP结合的抗体与该蛋白质的在来自不同物种的ICP之间(例如，人与食蟹猴PD-L1之间)保守的表位结合。当抗体以比针对任何交叉反应性抗原的亲和力高(如使用实验技术(诸如放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定的)的亲和力与糖基化ICP抗原结合时，所述抗体与糖基化ICP抗原特异性结合。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且可以是背景的10倍以上。关于抗体特异性的讨论，参见例如Paul，编辑，1989,Fundamental Immunology Second Edition,Raven Press,New York，第332-336页。在此类实施方案中，抗体与“非靶标”蛋白质的结合程度将小于抗体与其特定靶蛋白的结合的约10％，例如，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定的。
在一些实施方案中，抗糖基化ICP抗体包括对糖基化ICP特异的抗体，例如，抗糖基化ICP抗体或抗野生型ICP(ICP WT)抗体(其中野生型ICP蛋白被糖基化)，包括对糖基化ICP特异的抗体。在一些优选实施方案中，相对于非糖基化ICP，所述抗糖基化ICP抗体特异性地且优先与糖基化ICP结合。在一些实施方案中，抗糖基化ICP抗体与ICP的线性糖基化基序结合。在一些实施方案中，抗糖基化ICP抗体与三维中位于一个或多个糖基化基序附近的肽序列结合。在一些实施方案中，相对于未糖基化ICP，抗糖基化ICP抗体选择性地与ICP的一个或多个糖基化基序或其具有糖基化基序的肽结合。在其他实施方案中，抗糖基化ICP抗体与包含ICP氨基酸序列的连续氨基酸的线性表位结合。在其他实施方案中，抗糖基化ICP抗体与包含糖基化ICP的非连续氨基酸的构象(非线性)表位结合。在一些实施方案中，抗糖基化ICP抗体或其结合部分与糖基化ICP结合的Kd小于相对于未糖基化ICP所展示的Kd的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，抗糖基化ICP抗体或其结合部分与糖基化ICP结合的Kd相对于未糖基化ICP所展示的Kd的小于50％。在一些实施方案中，抗糖基化ICP抗体或其结合部分与糖基化ICP结合的Kd小于相对于未糖基化ICP所展示的Kd的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％。在另外的方面，抗糖基化ICP抗体或其结合部分与糖基化ICP结合的Kd为相对于未糖基化ICP表现出来的Kd的至多1/10-1/5。在一个实施方案中，抗ICP抗体或其结合部分与糖基化ICP结合的Kd为相对于未糖基化ICP所展示的Kd的至多1/10。在某些实施方案中，抗体与糖基化ICP结合的Kd不超过与ICP的未糖基化形式的结合所展示的Kd的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。在一个实施方案中，抗ICP抗体或其结合部分以纳摩尔浓度亲和力(诸如5-20nM或10-20nM(包括下限值和上限值)的亲和力)与糖基化ICP结合。
如本文中所用，关于抗体，术语“重(H)链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约115个至130个或更多个氨基酸的可变(V)区(也称为V结构域)和包括恒定(C)区域的羧基末端部分。恒定区(或恒定结构域)可以是五种不同类型(例如，同种型)(基于重链恒定区的氨基酸序列称为阿尔法(α)、德尔塔(δ)、伊普西隆(ε)、伽马(γ)和缪(μ))之一。不同的重链相异在于大小：α、δ和γ含有约450个氨基酸，而μ和ε含有约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同类型的重链产生五种众所周知的抗体类别(例如，同种型)，即分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。抗体重链可以是人抗体重链。
如本文中所用，关于抗体，术语“轻(L)链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包含约100个至约110个或更多个氨基酸的可变结构域，以及包含恒定区的羧基末端部分。轻链(V和C结构域两者)的近似长度为211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同类型的轻链，称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。轻链氨基酸序列是本领域熟知的。抗体轻链可以是人抗体轻链。
如本文中所用，术语“可变(V)区”或“可变(V)结构域”是指抗体多肽的轻(L)或重(H)链的一部分，其通常位于L或H链的氨基末端。H链V结构域的长度为约115至130个氨基酸，而L链V结构域的长度为约100至110个氨基酸。H和L链的V结构域用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。H链的V结构域可以称为“VH”。L链的V区可以称为“VL”。术语“可变”是指V结构域的某些区段在不同抗体间在序列上广泛不同的事实。虽然V结构域介导抗原结合并且定义特定抗体对其特定抗原的特异性，但变化性不是均匀地分布在抗体V结构域的110个氨基酸跨度上。相反，V结构域由被称为“高变区”或“互补决定区”(CDR)的具有更大可变性(例如，极端变化性)的更短区域(各自长度为约9-12个氨基酸)隔开的被称为框架区(FR)的约15-30个氨基酸的不太可变(例如，相对不变的)的区段组成。抗体H和L链的V结构域各自包含四个FR，主要采取β折叠片构型，所述β折叠片构型通过三个高变区(其形成环形)连接，并在一些情况下形成β折叠片结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interes t，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991))。C结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。V结构域在不同抗体类别或类型之间在序列上差异很大。序列的可变性集中在CDR中，CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。在一些具体的实施方案中，抗体的可变结构域是人或人源化可变结构域。
如本文中所用，术语“互补决定区”、“CDR”、“高变区”、“HVR”和“HV”可互换使用。“CDR”是指抗体VHβ-折叠片框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或者是指抗体VLβ-折叠片框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。当在本文中使用时，该术语是指在序列上是高变的和/或形成结构上限定的环的抗体V结构域的区域。通常，抗体包含六个高变区：VH结构域中的三个(H1、H2、H3)和VL结构域中的三个(L1、L2、L3)。因此，CDR通常是散布在V结构域的框架区序列内的高度可变序列。“框架”或“FR”残基是存在于CDR两侧的那些可变区残基。FR残基存在于例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、结构域抗体、双抗体、线性抗体、双特异性或双互补位抗体中。
许多高变区描绘正在使用中并且包含在本文中。CDR区是本领域技术人员公知的，并且已被例如Kabat定义为抗体V结构域内最具高变性的区域(Kabat等，J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978))。Kabat CDR基于序列可变性并且是最常用的(参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。CDR区序列也已被Chothia在结构上定义为不属于保守β-折叠框架的部分的那些残基，因此能够采用不同的构象(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。Chothia相反地指的是结构环的位置。当使用Kabat编号体系编号时，Chothia CDR-H1环的末端在H32与H34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入放置在H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环在32处终止；如果仅存在35A，则环在33处终止；如果35A和35B都存在，则环在34处终止)。编号系统和术语在本领域中都是公认的。
最近，通用编号系统已被开发并被广泛采用，ImMunoGeneTics(IMGT)Information(Lafranc等，Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77(2003))。IMGT是一个综合信息系统，专门研究免疫球蛋白(Ig)、T细胞受体(TR)和人及其他脊椎动物的主要组织相容性复合体(MHC)。在本文中，CDR按照轻链或重链内的氨基酸序列和位置进行标示。由于免疫球蛋白V结构域的结构内CDR的“位置”在物种之间是保守的并且存在于称为环的结构中，因此通过使用根据结构特征、CDR和框架残基对齐可变结构域序列的编号系统，其易于鉴定。该信息可用于移植和将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基替换到通常来自人抗体的受体框架中。Honegger和Plückthun，J.Mol.Biol.309:657-670(2001)已开发了另一种编号系统(AHon)。编号系统(包括例如Kabat编号和IMGT独特编号系统)之间的对应关系是本领域技术人员公知的(参见，例如，Kabat，同上；Chothia和Lesk，同上；Martin，同上；以及Lefranc等，1999,Nuc.Acids Res.,27:209-212)。
CDR区序列也已由AbM、Contact和IMGT定义。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且由Oxford Molecular’s AbM抗体建模软件使用(参见例如Martin，于Antibody Engineering，第2卷，第3章，Springer Verlag中)。“接触”高变区基于对可用的复杂晶体结构的分析。来自这些高变区或CDR中的每一个的残基如下所述。
CDR区序列的示例性描绘在下表3中说明。通过比较多种结构确定了标准抗体可变区内CDR的位置(Al-Lazikani等，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；Morea等，Methods 20:267-279(2000))。因为高变区内残基的数量在不同的抗体中不同，所以相对于规范位置的额外残基通常用a、b、c等相邻于标准可变区编号方案中的残基编号来进行编号(Al-Lazikani等，同上(1997))。这种命名法同样为本领域技术人员所熟知。
表3.CDR区序列的示例性描述
IMGT Kabat AbM Chothia Contact
V<sub>H</sub> CDR1 27-38 31-35 26-35 26-32 30-35
V<sub>H</sub> CDR2 56-65 50-65 50-58 53-55 47-58
V<sub>H</sub> CDR3 105-117 95-102 95-102 96-101 93-101
V<sub>L</sub> CDR1 27-38 24-34 24-34 26-32 30-36
V<sub>L</sub> CDR2 56-65 50-56 50-56 50-52 46-55
V<sub>L</sub> CDR3 105-117 89-97 89-97 91-96 89-96
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变(例如，氨基酸序列变化，包括改变、添加和/或缺失)的抗体，所述改变导致与不具有这些改变的亲本抗体相比，所述抗体对抗原的亲和力改善。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原诸如糖基化的PD-L1具有纳摩尔浓度或甚至皮摩尔浓度的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。关于综述，参见Hudson和Souriau，Nature Medicine 9:129-134(2003)；Hoogenboom,Nature Biotechnol.23:1105-1116(2005)；Quiroz和Sinclair,Revista Ingeneria Biomedia 4:39-51(2010)。
“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中，H和/或L链的一部分(例如V结构域)与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应氨基酸序列相同或同源，而一个或多个链的其余部分(例如，C结构域)与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这种抗体的片段，只要其展示出所需的生物活性即可(参见，例如，美国专利第4,816,567号；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
“人源化”非人(例如鼠)抗体是抗体的嵌合形式，其是指其中天然CDR残基被来自非人物种(例如，供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有所需特异性、亲和力和对抗原结合和相互作用的能力的相应CDR的残基取代的人免疫球蛋白序列(例如，受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基也可以被相应的非人残基取代。另外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改善人源化抗体的性能。人源化抗体H或L链可包含基本上全部的至少一个或多个可变区，其中全部或基本上全部的CDR对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的CDR，并且全部或基本上全部FR为人免疫球蛋白序列的那些FR。在某些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的恒定区的一部分。虽然本领域技术人员已知，但如果需要，可在例如以下文献中找到进一步的细节：Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature,332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)；Carter等，Proc.Natl.Acd.Sci.USA,89:4285-4289(1992)；以及美国专利第6,800,738号(2004年10月5日授权),6,719,971(2005年9月27日授权)、第6,639,055号(2003年10月28日授权)、第6,407,213号(2002年6月18日授权)和第6,054,297号(2000年4月25日授权)。
术语“人抗体”和“完全人抗体”在本文中可互换使用，并且是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用以下用于制备人抗体的技术(如由本领域技术人员实践的)中的任一种技术制备的抗体。人抗体的这种定义明确地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581(1991))和酵母展示文库(Chao等，Nature Protocols 1:755-768(2006))。也可用于制备人单克隆抗体的方法是Cole等，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等，J.Immunol.,147(1):86-95(1991)中描述的方法。另见van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过向转基因动物(例如，小鼠)施用抗原来制备人抗体，所述转基因动物的内源Ig基因座已经被废除，并且所述动物已被遗传修饰以携带编码人抗体的人免疫球蛋白基因，使得人抗体响应于抗原攻击而产生(关于XENOMOUSETM技术，参见，例如，Jakobovits,A.,Curr.Opin.Biotechnol.1995,6(5):561-6；Brüggemann和Taussing,Curr.Opin.Biotechnol.1997,8(4):455-8；以及美国专利第6,075,181号和第6,150,584号)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，另见例如Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。在一些具体的实施方案中，人抗体包含人源的可变区和恒定区。在某些实施方案中，“完全人”抗糖基化ICP抗体还可包括结合免疫检查点多肽，并且由核酸序列编码的抗体，所述核酸序列是人种系免疫球蛋白核酸序列的天然存在的体细胞变体。在一个具体实施方案中，本文提供的抗糖基化ICP抗体是完全人抗体。术语“完全人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体，如Kabat等所述。(参见Kabat等，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。短语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组、组合人抗体文库中分离的抗体；从动物(例如小鼠或牛)分离的抗体，所述动物是人免疫球蛋白基因的转基因和/或转染色体动物(参见，例如Taylor，L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体可具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见，Kabat,E.A.等，1991,Id)。然而，在某些实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然源自人种系VH和VL序列并与之相关、但在体内可能不天然存在于人抗体种系库中的序列。
如本文中所用，术语“表位”是单个抗体分子所结合的抗原分子表面上的一个或多个部位或一个或多个区域，诸如抗原(例如，ICP多肽或糖基化ICP多肽)表面上的局部区域，其能够被抗ICP或抗glycICP抗体的一个或多个抗原结合区结合。表位可以是免疫原性的并且能够在动物中引发免疫反应。表位不一定是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面基团诸如氨基酸或糖侧链组成，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是线性表位和构象表位。促成表位的多肽区域可以是多肽的连续氨基酸，形成线性表位，或者表位可以由多肽的两个或更多个非连续氨基酸或区域形成，通常称为构象表位。表位可以是或可以不是抗原的三维表面特征。在某些实施方案中，糖基化免疫检查点多肽表位是糖基化免疫检查点多肽的三维表面特征。在其他实施方案中，糖基化免疫检查点多肽表位是糖基化免疫检查点多肽的线性表面特征。在一些实施方案中，免疫检查点多肽表位是未糖基化的免疫检查点多肽。在一些实施方案中，糖基化免疫检查点多肽表位在一个或多个位点被糖基化。通常，抗原具有几个或许多不同的表位，并且可以与许多不同的抗体反应。在一个特定实施方案中，抗糖基化免疫检查点多肽抗体结合糖基化免疫检查点多肽例如糖基化的PD-L1的表位，所述表位是构象表位。
当两种抗体在三维空间中识别相同、重叠或相邻的表位时，抗体与参考抗体结合“表位”或“基本上相同的表位”或“相同的表位”。用于确定两种抗体是否与在三维空间上相同、重叠或相邻的表位结合的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，其可以以多种不同形式配置，例如，使用标记的抗原或标记的抗体。在一些测定中，将抗原固定在96孔板上或在细胞表面上表达，并且使用可检测的信号(例如，放射性、荧光或酶标记)测量未标记抗体阻断标记的抗体与抗原结合的能力。
当在抗糖基化免疫检查点多肽抗体(所述抗体竞争糖基化免疫检查点多肽靶蛋白或其肽上的相同表位或结合位点)的背景下使用的术语“竞争”意指如通过测定法测定的竞争，其中所研究的抗体或其结合片段阻止、阻断或抑制参考分子(例如，参考配体或参考抗原结合蛋白，诸如参考抗体)与共同抗原(例如，ICP或其片段)的特异性结合。许多类型的竞争性结合测定可用于确定测试抗体是否与参考抗体竞争结合糖基化免疫检查点多肽或其表位(例如，人PD-L1或人糖基化的PD-L1)。可使用的测定的实例包括固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心竞争测定(参见，例如，Stahli等，(1983)Methods in Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Kirkland等，(1986)J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定；固相直接标记夹心测定(参见，例如，Har low和Lane，(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press)；使用标记的碘(I125标记)的固相直接标记RIA(参见，例如，Morel等，(1988)Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Cheung等，(1990)Virology 176:546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等，(1990)Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，此类测定涉及使用与固体表面结合的纯化的糖基化ICP抗原(例如，人PD-L1或糖基化的PD-L1)，或具有未标记的测试抗原结合蛋白(例如，测试抗-PD-L1抗体)或标记的参考抗原结合蛋白(例如，参考抗PD-L1抗体)的细胞。竞争性抑制可以通过测定在已知量的测试抗原结合蛋白存在的情况下与固体表面或细胞结合的标记物的量来测量。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定法鉴定的抗体(竞争性抗体)包括与参考抗体结合相同表位的抗体和/或与与参考抗体结合的表位充分接近的相邻表位结合的抗体，从而引起空间位阻发生。本文描述了用于确定竞争性结合的方法的其他细节。通常，当竞争性抗体蛋白过量存在时，其将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合至少15％，或至少23％，例如但不限于40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％或更高，以及所述量之间的百分比数量。在一些情况下，结合被抑制至少80％、85％、90％、95％、96％或97％、98％、99％或更多。
如本文中所用，术语“阻断性”抗体或“拮抗剂”抗体是指阻止、抑制、阻断或降低与其结合的抗原的生物活性或功能活性的抗体。阻断性抗体或拮抗剂抗体可以基本上或完全阻止、抑制、阻断或降低抗原的生物活性或功能。例如，阻断性抗糖基化免疫检查点多肽抗体可以阻止、抑制、阻断或减小两个相互作用的ICP例如PD-L1和PD-1之间的结合相互作用，从而阻止、抑制、阻断或减小与相互作用相关的免疫抑制功能。术语阻断、抑制和中和在本文中可互换使用，并且是指抗糖基化免疫检查点多肽抗体阻止或以其他方式破坏ICP-ICP相互作用的能力。
如本文中所用，术语“多肽”或“肽”是指通过肽键连接的串联排列的三个或更多个氨基酸的氨基酸聚合物。“多肽”可以是蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽等。包含多肽的氨基酸可以是天然来源的或合成的。可以从生物样品中纯化多肽。例如，ICP多肽或肽可由ICP的氨基酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，所述多肽具有人免疫检查点多肽或糖基化的免疫检查点多肽的至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或285个连续氨基酸。在某些实施方案中，糖基化或未糖基化的免疫检查点多肽包含免疫检查点多肽或糖基化的免疫检查点的多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少连续的100个氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个连续氨基酸残基。
如本文中所用，术语“类似物”是指具有与参考多肽相似或相同的功能，但不一定包含参考多肽的相似或相同氨基酸序列或者具有参考多肽的相似或相同结构的多肽。参考多肽可以是ICP，例如PD-L1多肽、ICP的片段、抗ICP抗体或抗糖基化ICP抗体。与参考多肽具有相似氨基酸序列的多肽是指具有与参考多肽的氨基酸序列具有至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列的多肽，所述参考多肽可以是如本文所述的ICP或抗糖基化ICP抗体。具有与参考多肽相似的结构的多肽是指具有与参考多肽相似的二级、三级或四级结构的多肽，所述参考多肽可以是ICP或抗糖基化ICP抗体。多肽的结构可通过本领域技术人员已知的方法测定，包括但不限于X射线晶体学、核磁共振(NMR)和晶体电子显微镜术(crystallographic electron microscopy)。
如本文中所用，术语“变体”当与ICP或抗糖基化ICP抗体结合使用时，是指与天然的或未修饰的ICP序列或抗ICP抗体序列相比，具有一个或多个(诸如，例如，约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的多肽或抗糖基化ICP抗体。例如，ICP变体可由对ICP的氨基酸序列的一个或多个(诸如例如约1至约25个，约1至约20个，约1至约15个，约1至约10个或约1至约5个)改变产生。再例如，抗ICP抗体的变体可由对天然或先前未修饰的抗ICP抗体的氨基酸序列的一个或多个(诸如，例如，约1至约25个、约1至约20个、约1至约15个、约1至约10个或约1至约5个)改变产生。变体可以是天然存在的，例如等位基因或剪接变体，或可以人工构建。可从编码变体的相应核酸分子制备多肽变体。
如本文中所用，术语“衍生物”是指包含已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的参考多肽的氨基酸序列的多肽。参考多肽可以是ICP或抗糖基化ICP抗体。如本文中所用，术语“衍生物”还指已被化学修饰(例如，通过将任何类型的分子与多肽共价连接)的ICP或抗糖基化ICP抗体。例如，ICP或抗糖基化ICP抗体可以被化学修饰，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体的键联、与肽或蛋白质标签分子或其它蛋白质的键联等。以在所连接的分子的类型或位置方面与天然存在的或起始的肽或多肽不同的方式修饰衍生物。衍生物还可包括天然存在于肽或多肽上的一个或多个化学基团的缺失。ICP或抗糖基化ICP抗体的衍生物可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰进行化学修饰，包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、配制(formulation)、衣霉素的代谢合成等。另外，ICP或抗糖基化ICP抗体的衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。多肽衍生物具有与参考多肽相似或相同的功能，所述参考多肽可以是本文所述的ICP或抗糖基化ICP抗体。
如本文中所用，术语“组合物”是指任选地以指定的或有效的量含有指定组成成分(例如，本文提供的多肽或抗体)的产品，以及由以任选地指定的或有效的量的特定组成成分组合或相互作用而直接或间接产生的任何所需产品。
如本文中所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指向有此需要的受试者施予或施用治疗剂，或对受试者实施程序或用药方式，目的是为了获得至少一种阳性治疗效果或益处，诸如治疗疾病或健康相关的病况。例如，治疗可包括施用药学有效量的抗体或其组合物或制剂以治疗各种类型的癌症，所述抗体与糖基化ICP特异性结合。术语“治疗方案”、“给药方案”或“给药治疗方案(dosing protocol)”可互换使用，并且指治疗剂(诸如通过本文所述的方法产生的抗糖基化ICP抗体)的时间安排和剂量。如本文中所用，术语“受试者”是指患有癌症或被诊断为患有癌症的人或非人动物，诸如灵长类动物、哺乳动物和脊椎动物。在一些优选实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是癌症患者。在一个实施方案中，有需要的受试者将受益于或预期将受益于抗糖基化ICP抗体，例如抗-glycPD-L1抗体治疗。
如本文中所用，术语“治疗益处”或“治疗有效性”是指促进或增强(特别是作为使用抗糖基化ICP抗体和使用这些抗体的方法的性能的结果)在病况的医学治疗、疗法、剂量给药方面有需要的受试者(例如，患有癌症或被诊断为患有癌症的受试者)的健康状况。这包括但不限于降低疾病体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可包括，例如，肿瘤尺寸的减小、肿瘤的侵袭性或严重性的降低、癌细胞向外周组织或器官的浸润的减少；肿瘤或癌症的生长速度的减小，或转移的阻止或减少。癌症的治疗还可指在受试者中实现持续反应或延长患有癌症的受试者的存活时间。
产生优先结合糖基化免疫检查点蛋白的抗体的方法
对于抗体产生，用抗原，诸如糖基化ICP或肽接种受体动物，以产生免疫反应，并产生对糖基化ICP或肽例如PD-L1特异的抗体。通常，将抗原与另一分子结合或缀合以增强免疫反应。如本文中所用，缀合物是与抗原结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质，所述抗原用于在动物中引发免疫反应。响应于抗原接种在动物中产生的抗体包含多种不同的分子(多克隆抗体)，其由多种单独的抗体产生性B淋巴细胞产生。多克隆抗体是抗体种类的混合群体，其中每个抗体种类可以识别相同抗原上的不同表位。给予动物中多克隆抗体产生的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别已对动物进行免疫的抗原性化合物上的表位集合。通过亲和纯化进一步增强该特异性，以仅选择识别目标抗原或表位的抗体。
用于产生单克隆抗体(MAb)的方法通常以与制备多克隆抗体相同的方式开始。在一些实施方案中，将啮齿类动物诸如小鼠和大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，将兔、绵羊或青蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是公知的并且可以提供某些有利方面。常规使用小鼠(例如，BALB/c小鼠)并且所述小鼠通常产生高百分比的稳定融合物。用于单克隆抗体生产的杂交瘤技术涉及将从先前用糖基化ICP抗原免疫的小鼠分离的单个抗体产生性B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞(例如，小鼠骨髓瘤细胞系)融合。该技术提供了将单个抗体产生性细胞繁殖无限数代的方法，使得可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体，即单克隆抗体。可以对杂交瘤或表达来源于免疫动物的单克隆抗体群的其他细胞的群体筛选如本文所述的抗糖基化ICP抗体。
在一个特定实施方案中，按照给药方案，通过注射途径向受体动物，例如小鼠或大鼠施用如本文所述的糖基化ICP或其糖基化肽部分，例如糖基化的PD-L1或其肽。通常，给予初始免疫；使动物休息一段时间，例如但不限于7-15天；然后给予加强免疫，持续确定的时间段，诸如2-3周，或甚至数月。在加强免疫期间，可以通过本领域常规使用的方法测试动物血浆或血清中的抗体滴度。为此，在免疫数周后，从动物获得血样用于测量血清抗体。已经开发了几种用于从小鼠收集少量血液的人道技术，如Clinical Chemistry of LaboratoryAnimals，编辑，W.F.Loeb和F.W.Quimby,Taylor&Francis,1999中所示的。用各种技术诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞术测定血清抗体滴度。如果抗体滴度高，则可进行细胞融合。如果滴度太低，可以加强小鼠直至达到足够的反应，如通过重复采血所确定的。当抗体滴度足够高时，通常，例如在融合前3天但在先前免疫后2周，通过腹膜内或静脉内(通过尾静脉)注射无佐剂抗原来加强小鼠。
当如本领域技术人员所确定的，抗体滴度足够时，使小鼠安乐死并取出其脾脏。将脾细胞分散到单细胞悬浮液中，并在适于细胞融合和体外杂交瘤产生的条件下与永生化骨髓瘤细胞系(例如，但不限于Sp/02)混合。将具有有限寿命的产生抗体的脾细胞与源自永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，产生能够无限生长的杂交瘤。骨髓瘤细胞是永生化细胞，将其与8-氮杂鸟嘌呤一起培养以确保它们对细胞融合后使用的次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择培养基的敏感性。在细胞融合前约一周，将骨髓瘤细胞在8-氮杂鸟嘌呤中生长；细胞必须具有高活力和快速生长。HAT选择培养基仅允许融合细胞在培养中存活。在HAT选择技术中，选择生长培养基含有抑制剂氨基喋呤，其阻断了产生核苷酸的合成途径。因此，细胞必须使用旁路途径来合成核酸--该途径在与正常抗体产生性细胞融合的骨髓瘤细胞系中是有缺陷的。因为骨髓瘤和抗体产生性细胞都不能依靠自己生长，所以只有杂交细胞“杂交瘤”经历细胞分裂并在培养中持续存在和增殖。(Monoclonal Antibody Production,1999,Inst.For Laboratory Animal Research and National Research Council,NationalAcademy Press)。
通过将新鲜收获的脾细胞和骨髓瘤细胞在聚乙二醇(一种细胞膜融合增强剂)中共离心来进行细胞融合。然后将细胞分配到具有或不具有饲养细胞的多孔板中，所述饲养细胞可源自小鼠的盐水腹膜洗涤。据信饲养细胞提供促进杂交瘤细胞生长的生长因子；然而，可使用由支持培养细胞生长并含有生长因子的培养基收集产生的商业制剂代替小鼠来源的饲养细胞。小鼠骨髓来源的巨噬细胞也可用作饲养细胞。可将来自多孔板的小簇杂交瘤细胞在组织培养中生长，然后通过本文所述的方法选择其抗原结合。还可将杂交瘤在小鼠腹水中生长，随后进行克隆。杂交瘤细胞的有限稀释'克隆'确保了大多数孔中每个最多包含单个克隆。本领域技术人员可以选择能够扩增和进一步生长的杂交瘤。筛选杂交瘤以产生具有合适结合特异性的单克隆抗体。
虽然可以通过本领域已知的各种方法(例如在其中抗体呈现于噬菌体表面上(“噬菌体展示”方法)的细菌系统中)完成单克隆抗体的筛选，但也可以设想其他筛选技术。可从人组合抗体文库中鉴定和分离人抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在动物免疫不存在的情况下产生特异性抗体，如美国专利第6,946,546号(其通过引用并入本文)中所述的。在Marks等，1992,Bio/Technol.,10:779-783；Stemmer,1994,Nature,370:389-391；Gram等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580；Barbas等，1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3809-3813和Schier等，1996,Gene,169(2):147-155中进一步描述了这些技术。
例如，可使用杂交瘤文库技术，其中选择和鉴定产生与糖基化ICP或其肽特异性地和优先地结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。可在克隆之前确定杂交瘤文库的抗体结合活性。这种方法包括通过流式细胞术克隆单细胞，这使得能够分析真正的克隆并且不需要多轮亚克隆(参见例如Antibody Solutions,Sunnyvale,CA)。可重复使用FACS分选来选择在其表面上展示特别大量的抗糖基化ICP抗体的杂交瘤细胞变体。杂交瘤文库可具有高度灵敏和特异的诱导型系统，其可在多个物种中与体内亲和力成熟结合使用；用于自身抗原结合的负选择；重链和轻链的自然配对；通过杂交瘤直接分泌抗体；不为表达而克隆；和抗体的哺乳动物翻译后修饰。(Antibody Solutions,Sunnyvale,CA)。一旦使用本文所述的方法筛选和鉴定产生所需抗糖基化ICP抗体的杂交瘤，就可扩增克隆并分离抗体用于进一步使用。
可使用已知用于选择和鉴定与特定抗原特异性结合的抗体的方案和技术，对通过杂交瘤技术或其他抗体表达细胞群体(诸如噬菌体展示文库)产生的单克隆抗体选择结合特异性。如本领域技术人员已知的，可使用多种直接、间接和竞争性结合测定来测定特异性结合靶抗原的抗体。说明性地，但不限于此，可将糖基化ICP抗原连接于固体基质，并将适当的可检测标记的报告分子(例如标记的第二抗体)用于确定已结合于固体基质上的糖基化IP抗原的抗-glycICP抗体的特异性结合。另外，当筛选其中抗体展示在细胞表面上的抗体文库(例如噬菌体展示文库)时，可对文库“淘选”结合糖基化ICP抗原的抗体。可用可检测或可选择的标记物标记针对待选择的抗体的抗原或配体，可将抗体表达细胞群与可检测或可选择的标记物接触，然后选择表达与标记抗原结合的抗体的细胞。例如，如果标记物是生物素，则可使用生物素与链霉抗生物素蛋白的结合来分离表达与生物素标记的抗原结合的抗体的细胞，所述链霉抗生物素蛋白可以在固体载体、珠粒等上。
在一些特定的实施方案中，可对待筛选的抗体群测定与ICP的非糖基化形式相比优先与ICP的糖基化形式结合的抗体。例如，表达、优先重组表达糖基化ICP的细胞例如用生物素进行标记，并将其与表达ICP的非糖基化形式但未被标记或具有不同标记的细胞混合。例如，可对ICP上的一个或多个糖基化位点进行突变(例如，用谷氨酰胺取代糖基化共有位点中的天冬酰胺)，使得ICP不被糖基化。将细胞混合物与待测抗体以及与标记细胞(表达糖基化形式的细胞)结合但不与未标记细胞结合的分子一起孵育。例如，如果标记物是生物素，则将细胞混合物与待测抗体和标记的链霉抗生物素蛋白一起孵育。然后将细胞与标记的第二抗体一起孵育以检测与细胞结合的任何抗体。可使用本领域已知的任何方法比较抗体与表达糖基化ICP的细胞和表达未糖基化ICP的细胞的结合。例如，可分离表达糖基化ICP的细胞和表达未糖基化ICP的细胞，并且可通过FACS/流式细胞术分析测量二抗结合的水平，以评估抗体与糖基化ICP和未糖基化ICP的相对结合。实施例2中描述了一种示例性方法，其中与未糖基化ICP的结合相比较而言与糖基化ICP的结合是其2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的抗体可被选择为优先结合糖基化ICP。
如果首先鉴定了与糖基化ICP特异性结合的抗体，则可通过本领域已知的任何其他方法进一步筛选和分析那些抗体，以比较与非糖基化形式的结合。例如，可将抗体在任何结合测定诸如ELISA、放射免疫测定、BIACORE等中用于抗原结合。在一个特定实施方案中，将糖基化ICP和未糖基化ICP涂覆在固体表面(例如，测定板的孔)上。未糖基化ICP可通过用除去糖基化的酶(如，去除N-连接的糖基化的PNG酶)处理糖基化ICP以除去糖基化，或通过重组表达具有突变的糖基化位点(使得其不被表达细胞糖基化)的ICP来产生。然后在不同的抗体浓度下对抗体测定其与糖基化和未糖基化形式的结合，以检测与未糖基化ICP相比对糖基化ICP的结合亲和力的差异。
另外，还可通过western印迹或FACS流式细胞术分析来测试优先结合。如本领域技术人员所熟知的，western印迹是用于分离和鉴定含有被抗体特异性结合的表位的蛋白质的实验室研究技术。通常，该技术涉及通过凝胶电泳按尺寸/分子量分离蛋白质抗原(通常在细胞裂解物中)。将在凝胶上分离的蛋白质转移到固体膜载体诸如尼龙、聚偏二氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素上，然后将可检测地标记的抗体在其中抗体可与固体载体上的蛋白质结合的条件下孵育，所述蛋白质包含被所述抗体特异性识别的表位。然后可对结合的蛋白质进行可视化和定量。还可能使用与第一抗原特异性抗体结合的标记的第二抗体进行结合检测。参见，以非限制性实例为例，Mahmood和Yang,2012,NAM J Med Sci,4(9):429-434。此外，如本领域技术人员所知，使用自动流式细胞仪器(FC或FCM)进行流式细胞术以快速定量单个细胞的多个特征和性质，当细胞流过激光束时，一次测定一个细胞。FC可以测量细胞大小、细胞粒度、特定表面受体蛋白的量、细胞内蛋白质的量、细胞组分诸如总DNA、新合成的DNA的量、基因表达(如特定基因的信使RNA的量)或活细胞中的瞬时信号传导事件。数量通常是相对的，但当需要绝对值时，可以是每个细胞的分子数。通常，可在单个样品中逐个细胞地定量3至6个性质或组分，在不到一分钟内对约1x104-1x105个细胞进行定量。(Brown,M.和Wittwer,C.,2000,Clin.Chem.,46(8):1221-1229；以及Martz,E.,2003,Microbiology542,U.Massachusetts,Amherst,MA)。
另外，可对抗体测定特异性阻断抗体所针对的糖基化靶配体(例如，糖基化的PD-L1)与其同源(ICP)结合分子(例如PD-1)之间的相互作用的能力。例如，可将糖基化ICP在细胞表面上表达或粘附到固体载体，然后与待测抗体和具有可检测标记物的同源ICP结合伴侣一起孵育。然后，与不存在待测抗体的对照相比，可定量标记的ICP结合伴侣与ICP的结合水平。ICP结合伴侣结合的减少表明该抗体可抑制或阻断ICP与ICP结合伴侣的相互作用。缺乏ICP结合分子的结合表明该抗体已阻断了ICP与ICP结合伴侣的结合。一些示例性方法描述于实施例2和5中。
适合用作ICP抑制剂的抗体形式
一旦鉴定和分离了优先地和特异性地结合糖基化ICP的抗体，就可进一步对它们工程化，例如，使其更适合作为治疗剂。在非人单克隆抗体的情况下，抗体应该被制成“嵌合的”或“人源化的”。已经开发了用人源的类似结构域取代单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，使外源抗体的可变区保持完整的方法。还开发了通过重组构建具有啮齿类动物和人氨基酸序列的抗体可变结构域来将单克隆抗体的可变结构域转化为更多人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR来源于非人(例如，小鼠、大鼠、鸡、美洲驼等)单克隆抗体，并且框架区来源于人抗体氨基酸序列。用在人抗体的相应位置中发现的氨基酸序列替换抗体中具有啮齿类动物特征的氨基酸序列，降低了在人治疗使用期间对外源蛋白的不利免疫反应的可能性。还可将产生抗体的杂交瘤或其他细胞经历遗传突变或其他变化，其可以改变或可以不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
可使用单克隆和其他抗体以及重组DNA技术产生工程化抗体，以产生保留原始抗体的抗原或表位结合特异性的其他抗体或嵌合分子，即该分子具有特异性结合结构域。此类技术可涉及将编码免疫球蛋白可变区或抗体的CDR的DNA引入遗传物质中，以用于不同抗体的框架区、恒定区或恒定区加框架区。参见，例如，美国专利第5,091,513号和第6,881,557号，其通过引用并入本文。
通过本文所述的已知方法，可以产生多克隆或单克隆抗体、具有结合活性的抗体片段、结合结构域和CDR(包括前述任何一种的工程化形式)，所述抗体或其片段、结合结构域和CDR与糖基化ICP、其各自的表位中的一个或多个表位或前述任何一种的缀合物特异性结合，无论此类抗原或表位是从天然来源分离的，还是天然化合物的合成衍生物或变体。
某些动物物种可能不太适合用于产生治疗性抗体，因为它们更可能由于通过抗体的“Fc”部分激活补体系统而引起免疫或过敏反应。然而，可将完整抗体酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，并消化成具有结合结构域或CDR的肽片段。去除Fc部分降低了该抗体片段引发不希望的免疫反应的可能性，因此，没有Fc部分的抗体可优先用于预防性或治疗性治疗。如上所述，还可将抗体构建成嵌合抗体、人源化抗体，或者部分或完全人抗体，以减少或消除由于向动物施用已在另一物种中产生的或具有来自另一物种的氨基酸序列的抗体而导致的潜在不利免疫作用。
取代变体通常在蛋白质内的一个或多个位点含有一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可被设计来调节多肽的一种或多种性质，具有或不具有其他功能或性质的丧失。取代可以是保守的，即，一个氨基酸被替换为具有相似形状和电荷的氨基酸。保守取代是如上表1(同上)中所述的。或者，取代可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守变化通常涉及用化学上不相似的残基取代残基，诸如极性或带电的氨基酸对非极性或不带电荷的氨基酸的取代，反之亦然。
抗体蛋白可以是重组的，或在体外合成的。或者，可从细菌中分离非重组或重组抗体蛋白。还预期可将含有抗体蛋白质变体的细菌用于本文的组合物和方法，以分离具有改善的结合或其他参数的抗体。预期在本文所述的组合物中，每ml存在约0.001mg至约10mg的总抗体多肽。因此，组合物中抗体蛋白质的浓度可以是约，至少约或至多约或等于0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更高(或可从其推出的任何范围)。其中，约、至少约、至多约或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可以是结合糖基化ICP的抗体。
可将保留对ICP的结合活性的抗体或抗体的免疫部分与其他蛋白质化学缀合，或重组表达为与其它蛋白质的融合蛋白。所有此类融合蛋白都包括在抗体或抗体的免疫部分的定义中。在一些实施方案中，涵盖了针对糖基化免疫检查点多肽或其肽产生的抗体和抗体样分子与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物或有效负载。为了增加抗体分子作为诊断剂或治疗剂的功效，通常将至少一种所需分子或部分与抗体连接或共价结合或复合。此类连接的分子或部分可以是，但不限于，至少一种效应分子或报告分子。效应分子包含具有所需活性(例如，细胞毒活性)的分子。可被附着于抗体的效应分子的非限制性实例包括毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相反，报告分子定义为可以使用测定法检测的任何部分。可与抗体缀合的报告分子的非限制性实例包括酶、放射性标记物、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体，诸如生物素等。本领域已知几种将抗体与缀合物分子或部分附接或缀合的方法。一些附接方法涉及使用金属螯合复合物，作为非限制性实例，采用有机螯合剂诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)、亚乙三胺四乙酸、N-氯-对-甲苯磺酰胺和/或附接于抗体的四氯-3-6α-二苯基甘脲-3。抗体也可在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐存在的情况下与酶反应。在这些偶联剂存在的情况下或通过与异硫氰酸酯反应来常规地制备具有荧光素标记物的缀合物。在另一个实施方案中，可将抗糖基化ICP抗体与化合物或物质(诸如聚乙二醇(PEG))偶联或连接，以增加其在施用后在血浆、血清或血液中的体内半衰期。
在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含来自非人供体的抗原结合序列(例如，V结构域和/或CDR)的抗体，所述非人供体的抗原结合序列被移植到异源的非人、人或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)。在一个实施方案中，非人供体序列来自小鼠或大鼠。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变(例如，人噬菌体文库的噬菌体展示筛选等)获得的。在一个实施方案中，嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个实施方案中，鼠轻链V区与人κ轻链C区融合。在一个实施方案中，鼠重链V区与人IgG1C区融合。
在一个实施方案中，抗体是源自骆驼科动物抗体，优选来自缺乏轻链的重链骆驼科动物抗体的免疫球蛋白单可变结构域，其被称为VHH结构域序列或NanobodiesTM。NanobodyTM(Nb)是天然存在的单链抗体的最小功能片段或单可变结构域(VHH)，并且是本领域技术人员已知的。它们来源于骆驼科动物中看到的仅有重链的抗体(Hamers-Casterman等，1993,Nature,363:446-448；和Desmyter等，1996,Nat.Struct.Biol.,第803-811页)。在“骆驼科动物”家族中，发现缺乏多肽轻链的免疫球蛋白。“骆驼科动物”包括旧世界骆驼科动物(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰驼(Camelus dromedarius))和新世界骆驼科动物(例如，羊驼(Lama paccos)、驼羊(Lama glama)、Lama guanicoe及骆马(Lamavicugna))。单可变结构域重链抗体在本文中称为NanobodyTM或VHH抗体。Nb的小尺寸和独特的生物物理特性在识别不常见或隐藏的表位以及结合到蛋白质靶标的空腔或活性部位方面优于常规抗体片段。另外，Nb可被设计为多特异性和多价抗体，与报告分子连接，或被人源化。Nbs是稳定的，在胃肠系统中具有活性并且可以容易地制造。
在另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。通过将具有不同特异性的两种抗原结合部位统一到单一构建体中，双特异性抗体具有将具有精确特异性的两种分开的抗原结合在一起，因此具有作为治疗剂的巨大潜力。双特异性抗体最初通过融合两个杂交瘤来制备，每个杂交瘤能够产生不同的免疫球蛋白。还通过连接两个scFv抗体片段同时省略完整免疫球蛋白中存在的Fc部分来产生双特异性抗体。此类构建体中的每个scFv单元可含有通过合成多肽接头彼此连接的来自重(VH)和轻(VL)抗体链中的每一个的一个可变结构域，其中合成多肽接头通常经基因工程改造以具有最低免疫原性，同时保持最大程度的抗蛋白水解抗性。各个scFv单元可通过许多已知技术连接，包括掺入桥连两个scFv单元从而产生双特异性单链抗体的短(通常少于10个氨基酸)多肽间隔子。因此，所得双特异性单链抗体是在单个多肽链上含有具有不同特异性的两个VH/VL对的种类，其中各自scFv单元中的VH和VL结构域被多肽接头分开足够长以允许这两个结构域之间的分子内缔合，使得如此形成的scFv单元通过多肽间隔子彼此连续地系连，保持足够短以防止例如一个scFv单元的VH结构域与另一个scFv单元的VL之间的不希望的缔合。
在另一个实施方案中，抗体是双互补位抗体。如本文中所用，术语“双互补位抗体”是指包含两个抗原结合结构域的双特异性结合分子，所述两个抗原结合结构域识别并结合相同蛋白质靶标(例如，如本文所述的肿瘤相关的ICP靶抗原或糖基化ICP靶抗原)上的两个不同的非重叠表位、抗原决定簇或结构域。在一个实施方案中，如本文所述，针对glycICP或其一个或多个肽部分的双互补位抗体包含第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域，其中所述两个结合结构域与同一靶glycICP蛋白的两个不同的非重叠表位结合。被第一和第二免疫球蛋白结合结构域识别的表位之一或两者可以是糖基化的或含有糖基化残基。优选地，相对于未糖基化的形式，至少一种免疫球蛋白优先与glycICP蛋白的糖基化形式结合。
在另一个实施方案中，双互补位抗体包含与glycICP靶分子上的表位结合的免疫球蛋白(优选四价IgG)和与同一glycICP靶分子上的不同且非重叠的表位结合的scFv，其中免疫球蛋白和scFv通过接头连接，以允许免疫球蛋白和scFv与glycICP靶分子上的不同和非重叠的表位结合。因此，双互补位抗体由通过本文所述方法鉴定的两种抗-glycICP抗体产生，所述两种抗体结合同一glycICP靶标上的不同表位(或结构域)(即，双互补位结合)以增强结合亲和力/亲合力，增加肿瘤细胞上的抗体负荷以增强效应功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，和/或改善或增加肿瘤停留时间。另外，靶向肿瘤相关的glyICP抗原上的两个非重叠表位的二价双互补位抗体具有诱导细胞膜中的glycICP靶分子簇聚的潜力，这反过来可促进内化、溶酶体运输和降解增加。可使用本领域已知的技术产生针对靶蛋白/抗原上的两个不同的非重叠表位的双互补位抗体。参见，例如，B.Roberts等，1999,Int.J.Cancer，第81卷：285-291(癌胚抗原，EA)；D.Lu等，1999,J.Immunol.Methods，第230卷：159–71(血管内皮生长因子受体2,VEGF2)；WO 2009/068627,Ablynx NV,于2009年6月4日公布的；WO 2010/142534和Ablynx NV，于2010年12月16日公布的。
在一个实施方案中，二价双互补位抗体可通过使用来自如本文所述鉴定的两种不同抗-glycICP抗体的可变结构域序列来产生，所述两种不同抗体识别并结合给定的glycICP靶蛋白上的不同的非重叠表位，其中该抗体含有附接于第二抗ICP抗体的H链和/或L链的N末端，或者可选地CH3结构域的C末端的抗-glycICP抗体之一的单链可变片段(scFv)，所述第二抗ICP抗体识别glycICP上的不同的非重叠表位。scFv可通过肽接头(例如，诸如用于连接scFv中的结合结构域的那些接头)与第二抗ICP抗体连接。参见，例如，Dimasi等，J.Mol.Biol.,393:672-692(2009)。所得的结合分子产物或双互补位抗体在分子的每个臂上含有四个抗-glycICP结合单元或两个结合单元，所述结合单元能够与glycICP上的两个不同表位相互作用并结合。根据该实施方案，靶向在肿瘤细胞表面上表达的glycICP上的两个非重叠表位的二价双互补位抗体可通过表位结合而有效地交联glycICP，以诱导细胞表面上的glycICP聚集，从而导致形成引发和促进增强的内化和溶酶体降解的大型复合物。在一个实施方案中，将双互补位抗体与毒素或抗癌药物连接以产生如本文进一步描述的抗体-药物缀合物(ADC)。此类抗ICP双互补位抗体和溶酶体运输的增强的内化和内吞作用最终导致向靶细胞内递送更大量的毒素以及更大的肿瘤细胞杀伤或消退。如针对双互补位抗HER2ADC所述(J.Y.Li等，2016,Cancer Cell，第29卷：117-129)，在体外和体内均观察到此类效应。说明性地，可以产生双互补位抗-glycICP抗体或抗-glycICP ADC，其与以下糖基化ICP之一的两个非重叠表位特异性结合：PD-L1,PD-L2,PD-1,TIM-3,LAG-3,BTLA,CEACAM1,BTN1A1,BTNL2,SEMA4D,CD47,CD96,B7-H3,B7-H4,CTLA-4,VISTA或KIR等(如本文中所述的)，以阻止或阻断它们与其同源结合伴侣的相互作用和促进其内化和降解，以及如果使用抗-glycICP ADC的话，杀死肿瘤细胞。
在其他实施方案中，本发明所涵盖的抗-glycICP结合分子或抗体可以是多互补位的，即含有识别并结合同一glycICP靶分子上的三个、四个或更多个不同的、优选非重叠的表位或抗原决定簇的抗原结合结构域。在其他实施方案中，抗-glycICP抗体是双-或多互补位且多价的，即还包含识别并结合不同靶glycICP分子上的一个或多个不同表位或抗原决定簇的抗原结合部位或“互补位”。
抗体片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，其由VL、VH、CL和CH1结构域组成；(ii)“Fd”片段，其由VH和CH1结构域组成；(iii)“Fv”片段，其由单一抗体的VL和VH结构域组成；(iv)“dAb”片段，其由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合以形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利第5,091,513号)；(ix)通过基因融合构建的双抗体、多价或多特异性片段(美国专利申请公开号20050214860)。可通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定Fv、scFv或双抗体分子。包含与CH3结构域连接的scFv的微型抗体(Hu等，Cancer Res.,56:3055-3061)也是有用的。另外，在一些实施方案中还设想了抗体样结合性肽模拟物。Liu等，2003,CellMol.Biol.,49:209-216)报导了“抗体样结合性肽模拟物”(ABiP)，其是用作简化抗体(pared-down antibody)并且具有更长的血清半衰期以及较少麻烦的合成方法的某些有利方面的肽。
抗糖基化的PD-L1抗体(抗-glycPD-L1抗体)
在一个特定实施方案中，提供了分离和鉴定抗体(抗-glycPD-L1抗体)的方法，相对于非糖基化的PD-L1，所述抗体特异性地与糖基化ICP蛋白PD-L1(例如，具有特定N-聚糖结构的PD-L1蛋白；PD-L1的特定糖肽)或糖基化的PD-L1肽结合，并且抑制糖基化的PD-L1/PD-1相互作用的免疫抑制功能。此类抗-glycPD-L1抗体可用于治疗疾病，特别是癌症。抗-glycPD-L1抗体可属于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE Ig类别，以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。说明性地，抗-glycPD-L1抗体可以是嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、人源化抗体或人抗体。在一个优选实施方案中，抗-glycPD-L1抗体是单克隆抗体。在另一个优选实施方案中，单克隆抗-glycPD-L1抗体是人源化抗体或人抗体。通过已知的方法和如本文中所述，可以产生多克隆或单克隆抗体、抗体片段、结合结构域和CDR(包括前述任何一种的工程化形式)，其对糖基化的PD-L1抗原、其各自表位中的一个或多个表位或前述任何一种的缀合物具有特异性，无论此类抗原或表位是从天然来源分离的还是天然化合物的合成衍生物或变体。抗体可以是双特异性的或双互补位性的。
利用通过该方法获得的特异性抗glycICP抗体进行疾病治疗
在某些方面，通过所述方法获得的抗体或其抗原结合片段(例如，与糖基化ICP、例如PD-L1特异性结合的抗体)可用于治疗方法和施用以治疗癌症。因此，本文提供了通过向需要的受试者施用治疗有效量的至少一种抗糖基化ICP抗体或其结合片段(例如抗-glycPD-L1抗体)来治疗癌症的方法。如本文所述，治疗或治疗性治疗涉及减少、阻止、抑制或阻断癌细胞的生长、增殖、迁移等。所述方法为受试者(例如，正在接受治疗的人患者)，特别对于表达ICP细胞表面蛋白的受试者的肿瘤细胞提供益处，所述ICP细胞表面蛋白可以与在免疫效应细胞(诸如T细胞，特别是杀伤细胞或细胞毒性T细胞)表面上表达的ICP同源配体结合/相互作用。用有效量的至少一种抗糖基化ICP抗体治疗这些受试者预期会导致一种或多种抗体与肿瘤细胞上的糖基化ICP结合，并阻止、阻断或抑制表达ICP的肿瘤细胞与表达同源ICP配体的T细胞的相互作用，从而预防或避免T细胞活性的免疫抑制并允许T细胞被激活以杀死表达ICP诸如PD-L1的肿瘤细胞。因此，使用通过所述方法产生和获得的抗糖基化ICP抗体的方法对于需要通过本方法的实践实现的抗癌结果，能够从中受益或希望获得所述抗癌结果的益处的受试者是有利的。受试者寻求治疗有益量的至少一种抗糖基化ICP抗体或其结合片段(例如，抗-glycPD-L1抗体或其结合片段)的方法的治疗益处，或接受此类治疗益处为本领域提供了有利方面。另外，与其他治疗方法和治疗方式相比，本方法提供了消除或避免副作用、不良后果、禁忌症等的进一步有利方面，或降低了发生此类问题的风险或可能性。
本发明治疗方法对其有用的癌症包括任何恶性细胞类型，诸如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那些，特别是具有在其表面上表达糖基化ICP诸如糖基化PD-L1的细胞的肿瘤。通常，肿瘤是指任何大小的恶性或潜在恶性肿瘤或组织块，并且包括原发性肿瘤和继发性肿瘤。实体瘤是异常的组织块或生长，通常不包含囊肿或液体。示例性实体瘤可包括但不限于选自胰腺、胆囊、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、睾丸、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳腺的器官的肿瘤。示例性血液肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤等。可使用本文提供的方法治疗的癌症的其他实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer)或胃癌(stomach cancer)(包括胃肠癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌、黑色素瘤、浅表性扩散黑色素瘤、雀斑痣恶性黑色素瘤(lentigomalignant melanoma)、肢端雀斑痣样黑色素瘤、结节性黑色素瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴细胞NHL；高级小无核裂细胞NHL(high grade smallnon-cleaved cell NHL)；肿块性疾病NHL(bulky disease NHL)；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤和斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞性白血病、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)和慢性成髓细胞白血病(chronic myeloblastic leukemia)。
癌症可能具体地属于以下组织学类型，但不必限于这些类型：赘生物，恶性；癌；癌，未分化的；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管上皮癌(cholangiocarcinoma)；肝细胞癌；结合性肝细胞癌和胆管癌(combined hepatocellularcarcinoma and cholangiocarcinoma)；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌(Chromophobe carcinoma)；嗜酸性粒细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性细胞癌(Basophilcarcinoma)；透明细胞腺癌(Clear cell adenocarcinoma)；粒细胞癌(Granular cellcarcinoma)；滤泡性腺癌(Follicular adenocarcinoma)；乳头状和滤泡性腺癌；无包膜形成的硬化性癌(Nonencapsulat ing sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌(Adrenalcortical carcinoma)；子宫内膜癌(Endometroid carcinoma)；皮肤附件癌(Skinappendage carcinoma)；大汗腺腺癌(Apocrine adenocarcinoma)；皮脂性腺癌(Sebaceousadenocarcinoma)；盯聍腺腺癌(Ceruminous adenocarcinoma)；粘液表皮样癌(Mucoepidermoid carcinoma)；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌(Papillaryserous cystadenocarcinoma)；粘液囊腺癌(Mucinous cystadenocarcinoma)；粘液腺癌(Mucinous adenocarcinoma)；印戒细胞癌(Signet ring cell carcinoma)；浸润性导管癌；髓样癌(Medullary carcinoma)；小叶癌(Lobular carcinoma)；炎性癌；佩吉特病(Paget’s disease)，乳腺；腺泡细胞癌(Acinar cellcarcinoma)；腺鳞状癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢基质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤(Thecoma)，恶性；粒层细胞瘤，恶性；卵巢男性细胞瘤(Androblastoma)，恶性；Sertoli细胞癌；Leydig细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤(Extra-mammary paraganglioma)，恶性；嗜络细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素黑色素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤(Malig melanoma in giant pigmented nevus)；上皮样细胞黑素瘤；蓝癒，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合肿瘤，恶性；苗勒混合瘤(Mul Ierianmixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；勃勒纳瘤(Brennertumor)，恶性；叶状瘤(Phyllodes tumor)，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节成神经细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其它规定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤和毛细胞白血病。
待用通过所述方法获得的抗glycICP抗体治疗的癌症优选对肿瘤或癌细胞上表达的ICP，例如PD-L1，特别是糖基化PD-L1呈阳性。具体地，待治疗的癌症对于抗-glycICP抗体结合的ICP呈阳性。在某些实施方案中，肿瘤细胞对肿瘤细胞标志物诸如EGFR或HER2/neu表达(例如在乳腺癌细胞上表达)也呈阳性。这些标志物的存在与否可表明利用靶向治疗剂诸如酪氨酸激酶抑制剂(例如用于EGFR阳性癌症的吉非替尼，或用于HER2/neu阳性癌症的赫赛汀)与抗-glycICP抗体的组合的联合治疗将为有需要的受试者提供治疗益处。在某些实施方案中，癌症是BLBC。
可用于表征癌症以指导疗法的选择或用抗glycICP抗体监测疗法的其他标志物包括非小细胞肺癌和间变性大细胞淋巴瘤中的ALK基因重排和过表达；用于肝癌和生殖细胞肿瘤的甲胎蛋白(AFP)；用于多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病和一些淋巴瘤的β-2-微球蛋白(B2M)；用于绒毛膜癌和生殖细胞肿瘤的β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)；用于卵巢癌和乳腺癌的BRCA1和BRCA2基因突变；用于慢性粒细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病和急性髓性白血病的BCR-ABL融合基因(费城染色体)；用皮肤黑色素瘤和结直肠癌的BRAFV600突变；用于胃肠道间质瘤和粘膜黑色素瘤的C-kit/CD117；用于乳腺癌的CA15-3/CA27.29；用于胰腺癌、胆囊癌、胆管癌和胃癌的CA19-9；用于卵巢癌的CA-125；用于甲状腺髓样癌的降钙素；用于结直肠癌和一些其他癌症的癌胚抗原(CEA)；用于非霍奇金淋巴瘤的CD20；用于神经内分泌肿瘤的嗜铬粒蛋白A(CgA)；用于膀胱癌的染色体3、7、17和9p21；用于肺癌的细胞角蛋白片段21-1；用于非小细胞肺癌的EGFR基因突变分析；用于乳腺癌的雌激素受体(ER)/孕酮受体(PR)；用于膀胱癌的纤维蛋白/纤维蛋白原；用于卵巢癌的HE4；用于乳腺癌、胃癌和胃食管连接腺癌的HER2/neu基因扩增或蛋白质过度表达；用于多发性骨髓瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症的免疫球蛋白；用于结直肠癌和非小细胞肺癌的KRAS基因突变分析；用于生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤和神经母细胞瘤的乳酸脱氢酶；用于小细胞肺癌和神经母细胞瘤的神经元特异性烯醇化酶(NSE)；用于膀胱癌的核基质蛋白22；用于前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)；用于甲状腺癌的甲状腺球蛋白；和用于乳腺癌的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)。
抗糖基化ICP抗体，例如抗-glycPD-L1抗体，可以多种形式用作抗肿瘤剂。在一个特定实施方案中，设想了使用抗体作为抗肿瘤剂的方法，因此，其包括使肿瘤细胞群与治疗有效量的抗体或含有该抗体的组合物接触足以阻断或抑制肿瘤细胞生长的时间。在一个实施方案中，如所描述的，体内接触肿瘤细胞是通过向有需要的患者施用(例如通过静脉内、皮下、腹膜内或瘤内注射)治疗有效量的包含抗糖基化ICP抗体、或其结合片段，例如抗-glycPD-L1抗体或其结合片段的生理上可耐受的组合物来实现的。抗体可通过注射或通过在一段时间内逐渐输注而经胃肠外施用。有用的给药和递送方案包括静脉内、腹膜内、口服、肌内、皮下、腔内、透皮、皮肤、蠕动方式或直接注射到含有肿瘤细胞的组织中。
例如，通常静脉内施用(诸如通过注射单位剂量)包含抗体的治疗组合物。当用于治疗组合物时，术语“单位剂量”是指适合作为用于受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有与所需稀释剂(即载体或媒介物)结合的经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性物质。以与剂量制剂相容的方式以及以治疗有效量施用含有抗糖基化ICP抗体，例如抗-glycPD-L1抗体的组合物。待施用的量取决于待治疗的受试者、受试者系统利用活性成分的能力和所需治疗效果的程度。需要施用的活性成分的精确量取决于从业者的判断，并且是每个个体特有的。然而，本文公开了用于全身应用的合适剂量范围，并且其取决于施用途径。还设想了用于初始和加强施用的合适方案，并且其通常可包括初始施用，然后通过随后的注射或其他施用以一个或多个间隔(小时)重复施用。示例性的多次施用适合于维持连续高的抗体血清和组织水平。或者，设想了足以将血液中的浓度维持在用于体内治疗的指定范围内的连续静脉内输注。
预期可以全身性或局部施用通过所述方法产生的抗glycICP抗体以治疗疾病，诸如抑制患有局部晚期或转移性癌症的癌症患者中的肿瘤细胞生长或杀死癌细胞。抗体可以单独施用或与抗增殖药物或抗癌药物联合施用。在一个实施方案中，施用抗糖基化ICP抗体以在手术或其他程序之前减少患者的癌症负荷。或者，可在手术后以周期性间隔施用其，以确保任何剩余的癌症(例如，手术未能消除的癌症)的大小或生长能力降低和/或不能存活。如上所述，抗体的治疗有效量是经计算以达到所需效果的预定量。因此，用于抗-glycICP抗体施用的剂量范围是大到足以产生所需效果(其中肿瘤细胞分裂和细胞周期的症状减少)的剂量范围。最佳地，剂量不应大到引起不良副作用，诸如高粘度综合征、肺水肿、充血性心力衰竭、神经学作用等。通常，剂量将随着患者的年龄、病况、大小和性别以及疾病程度而变化，并且可由本领域技术人员诸如医师或临床医生确定。当然，在任何并发症的情况下，剂量可以由个体医师调整。
治疗方法
在某些实施方案中，所述组合物和方法涉及单独地或与第二或额外的药物或疗法组合地施用抗糖基化ICP抗体或其结合部分，例如抗-g lycPD-L1抗体，所述抗体特异性地且优先地与糖基化ICP蛋白(例如PD-L1)结合。此类药物或疗法可用于治疗与人糖基化ICP与其配体相互作用(例如，与人PD-L1或糖基化人PD-L1与人PD-1的相互作用)相关的任何疾病。例如，该疾病可以是癌症。在一个特定和示例性实施方案中，包含至少一种与糖基化PD-L1蛋白结合的抗PD-L1抗体或其结合部分的组合物和方法在治疗癌症或其他疾病方面具有治疗或保护作用，特别是通过阻止、减少、阻断或抑制PD-1/PD-L1相互作用，从而提供治疗效果和治疗。
所述组合物和方法，包括联合疗法，具有治疗或保护作用，并且可以增强治疗或保护作用，和/或增强另一种抗癌或抗过度增殖疗法的治疗效果。治疗性和预防性方法和组合物可以以有效实现所需效果(诸如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供。该方法可涉及施用抗糖基化ICP抗体或其结合片段和第二疗法。第二疗法可以具有或可以不具有直接的细胞毒性作用。例如，第二疗法可以是上调免疫系统而不具有直接细胞毒性作用的药剂。可将组织、肿瘤和/或细胞暴露于包含一种或多种药剂(例如，抗体或抗癌剂)的一种或多种组合物或药物制剂，或通过将组织、肿瘤和/或细胞暴露于两种或更多种不同组合物或制剂，其中一种组合物提供例如1)抗体，2)抗癌剂，3)抗体和抗癌剂，或4)两种或多种抗体。此外，预期此类联合治疗可以与化学疗法、放射疗法、手术疗法或免疫疗法结合使用。
举例来说，当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗性多肽，优选抗-glycPD-L1抗体递送至靶细胞或置于直接与靶细胞并置，特别地与肿瘤或癌细胞表面上的靶抗原，例如PD-L1，特别是糖基化PD-L1特异性结合的方法。通过治疗性抗-glyPD-L1抗体的此类结合阻止、阻断、抑制或减少肿瘤或癌细胞表达的PD-L1与效应T细胞上的PD-1的相互作用，从而阻止与PD-L1/PD-1相互作用相关的免疫抑制。在一些实施方案中，还将化学治疗剂或放射治疗剂与抗-glycPD-L1抗体或其结合片段结合施用或递送至受试者。为了实现细胞杀伤，例如，将一种或多种药剂以有效杀死细胞或防止其分裂的组合量递送至细胞。
如本文所述的抗糖基化ICP抗体，例如抗-glyPD-L1抗体，可以在相对于另一种抗癌治疗之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可以以从同时到在彼此之前或之后数分钟到数天到数周的间隔进行。在将抗体与抗癌剂分开提供给患者的实施方案中，通常确保在每次递送的时间之间的间隔没有超出有效时段，使得给药的化合物仍然能够对患者施加有利的组合效果。说明性地，在此类情况下，预期可以在彼此约12至24小时或72小时内，更特别地，在彼此约6-12小时内为患者提供抗体和抗癌疗法。在某些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中在各个施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在某些实施方案中，治疗过程或治疗周期将持续1-90天或更长时间(这样的范围包括居间天和最后一天)。设想了可以在第1天至第90天中的任何一天(这样的范围包括居间天和最后一天)或其任意组合施用一种药剂，并且在第1天至第90天中的任何一天(这个范围包括居间天和最后一天)或其任意组合施用另一种药剂。在一天(24小时)内，可一次或多次向患者施用药剂。此外，在治疗过程之后，设想了可存在不施用抗癌治疗的一段时间。该时间段可以持续例如1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更长(这样的范围包括居间天和上限时间点)，这取决于患者的状况，诸如预后、强度、健康等。必要时可重复治疗周期。可采用各种治疗组合。在下面显示的组合治疗方案的代表性实例中，抗体，诸如抗糖基化ICP抗体，例如抗-glycPD-L1抗体或其结合片段由“A”表示，并且抗癌疗法用“B”表示：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，将本实施方案的任何抗体或疗法向患者的施用将遵循此类化合物的一般给药方案。因此，在一些实施方案中，存在监测不良事件和毒性，特别是可归因于联合治疗的不良事件和毒性的步骤。
在一个实施方案中，治疗性方法或治疗方法涉及将抗糖基化ICP抗体单独地或与另一种抗药剂组合地施用于有此需要的患者，即癌症或肿瘤患者。在施用抗糖基化ICP抗体之前，可以评估患者肿瘤或癌症的样品中ICP的存在。如果这样的评估结果显示患者的肿瘤或癌症对糖基化ICP呈阳性，则可根据患者的糖基化-ICP+肿瘤或癌症更适合于抗糖基化ICP抗体治疗以及治疗继续进行更有可能获得有益效果的可能性，选择患者进行治疗。医学专业人员或医生可建议患者继续进行抗糖基化ICP抗体治疗方法，并且患者可根据医学专业人员或医生的建议决定进行治疗。另外，在治疗过程中，可测定患者的肿瘤或癌细胞中糖基化ICP的存在，作为监测治疗进展或有效性的方法。如果测定显示例如患者肿瘤或癌细胞上的糖基化ICP的变化、丢失或减少，则医学专业人员可以与患者一起决定是否应该继续或以某种方式(例如，更高的剂量，添加另一种抗癌剂或疗法等)改变治疗。
免疫疗法
在所述方法的一些实施方案中，免疫疗法可以与抗-glycICP抗体的施用组合或联合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗就是这样一个实例。检查点抑制剂，例如伊匹单抗(ipilimumab)，是另一个这样的实例。免疫效应物可以是，例如，对肿瘤细胞表面上的标志物(细胞表面蛋白质或受体)特异的抗体。单独的抗体可作为疗法的效应物，或者其可以募集其他细胞以实际实现细胞杀伤。还可将抗体缀合于药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)，以及仅用作靶向剂。或者，效应子可以是携带表面分子的淋巴细胞，所述表面分子直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用，例如T细胞上的PD-1/肿瘤细胞上的PD-L1相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向的标志物(蛋白质/受体)。最佳地，肿瘤标志物蛋白/受体不存在于大多数其他细胞诸如非癌细胞或正常细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些标志物中的任何一种在本实施方案的背景中都适合于用另一种药物或施用抗glycICP抗体的疗法进行靶向。常见的肿瘤标志物包括例如CD20、癌胚抗原(CEA)、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erbB和p155。免疫疗法的另一方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，其包括细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-12，GM-CSF，γ-IFN；趋化因子诸如MIP-1、MCP-1、IL-8；和生长因子诸如FLT3配体。
目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利第5,801,005号和第5,739,169号；Hui和Hashimoto,1998,Infection Immun.,66(11):5329-5336；Christodoulides等，1998,Microbiology,144(Pt 11):3027-3037)；细胞因子疗法，例如，α、β和γ干扰素；IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等，1998，1998,ClinicalCancer Res.,4(10):2337-2347；Davidson等，1998,J.Immunother.,21(5):389-398；Hellstrand等，1998,Acta Oncologica,37(4):347-353))；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等，1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(24):14411-14416；Austin-Ward等，1998,Revista Medica de Chile,126(7):838-845；美国专利第5,830,880号和第5,846,945号)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012,Front.Immun.,3:3；Hanibuchi等，1998,Int.J.Cancer,78(4):480-485；美国专利第5,824,311号)。设想了一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。
蛋白质纯化
蛋白质(包括抗糖基化ICP抗体)纯化技术是本领域技术人员熟知的。这些技术在一个层面上涉及将细胞、组织或器官的匀浆和粗分级成多肽和非多肽级分。除非另有说明，否则可使用色谱和电泳技术进一步纯化目标蛋白质或多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至同质)。特别适用于制备纯蛋白质或肽的分析方法是离子交换色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、羟基磷灰石色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和色谱、免疫亲和色谱和等电聚焦。纯化肽的一种特别高效的方法是快速液相色谱(FPLC)或甚至高效液相色谱(HPLC)。如本领域通常已知的，可以改变进行各种纯化步骤的顺序，和/或可以省略某些步骤，并且仍然得到用于制备基本上纯化的多肽的合适方法。
纯化的多肽(诸如抗糖基化的ICP，例如抗-glycPD-L1抗体)是指可从其他组分中分离或从其他组分中分离并相对于其天然可获得的状态纯化至任何程度的多肽。因此，分离的或纯化的多肽也指不含其天然存在于其中的环境(例如细胞、组织、器官、生物样品等)的多肽。通常，“纯化的”是指已经过分级分离以除去各种其他组分的多肽组合物，并且该组合物基本上保留其表达的生物活性。“基本上纯化的”组合物是指其中多肽形成组合物的主要组分，并因此构成组合物的蛋白质组分的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的组合物。
根据本公开，本领域技术人员已知用于定量多肽(诸如抗体蛋白质)的纯化程度的各种方法。这些方法包括，例如，确定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的量。用于评估级分纯度的一种优选方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行比较，从而计算其中的纯度(通过“倍数纯化数”评估的)。“用于表示活性量的实际单位当然取决于选择用于纯化的特定测定技术，以及表达的多肽是否表现出可检测的活性。
一般不要求多肽总是以其最纯化的状态提供。实际上，设想了不太纯的产物在某些实施方案中可具有实用性。部分纯化可通过组合使用较少的纯化步骤，或通过使用相同的一般纯化方案的不同形式来完成。例如，应当理解，利用HPLC装置进行的阳离子交换柱色谱通常比使用低压色谱系统的同一技术产生更大的“倍数”纯化。表现出较低程度的相对纯化的方法可在蛋白质产物的总回收率或维持表达的蛋白质的活性方面具有优势。
亲和色谱是一种色谱方法，其依赖于待分离的物质(蛋白质)与其可特异性结合的分子之间的特异性亲和力(例如，受体-配体类型的相互作用)。通过将结合伴侣之一共价偶联到不溶性基质上来合成柱材料(树脂)。然后，柱材料能够特异性地从通过柱树脂的溶液中吸附物质。通过将条件改变为其中将破坏结合/不会发生结合的条件(例如，改变的pH、离子强度、温度等)来进行洗脱。基质应该是不会在很大程度上吸附分子，并且具有广泛的化学、物理和热稳定性的物质。配体应以不影响其结合特性的方式偶联。配体也应提供相对紧密的结合；然而，应该在不破坏所需样品蛋白质或配体的情况下洗脱结合的物质。
尺寸排阻色谱(SEC)是一种色谱方法，其中溶液中的分子基于其尺寸(或以更专业的术语来说，其流体力学体积)而分离。其通常应用于大分子或大分子复合物，诸如蛋白质和工业聚合物。通常，当使用水溶液将样品输送通过柱时，该技术称为凝胶过滤色谱，与之相对比的名称是凝胶渗透色谱，当将有机溶剂用作流动相时使用该名称。SEC的基本原理是不同尺寸的颗粒将以不同的速率通过固定相洗脱(过滤)，导致基于尺寸分离颗粒溶液。如果同时或几乎同时加载所有颗粒，则相同尺寸的颗粒应一起洗脱。
高效(又名高压)液相色谱(HPLC)是常用于在生物化学和分析化学中分离、鉴定和定量化合物的一种柱色谱形式。HPLC使用保持色谱填料(固定相)的柱子、使一个或多个流动相移动通过柱子的泵以及显示分子的保留时间的检测器。保留时间根据固定相、被分析的分子和所用溶剂之间的相互作用而变化。
作为受益于抗糖基化ICP抗体治疗的患者的生物标志物的糖基化ICP。
在一个实施方案中，提供了涉及使用如所述的至少一种抗糖基化ICP抗体的方法。此类方法可用于从患有癌症或肿瘤的受试者获得的肿瘤或癌细胞的生物标志物评估。提供了确定患有癌症的受试者是否具有肿瘤或癌细胞，所述肿瘤或癌细胞在此类细胞的细胞表面上表达作为携带ICP的肿瘤或癌细胞的生物标志物的糖基化ICP，诸如糖基化PD-L1，特别是可检测水平的糖基化PD-L1。例如，如果测试受试者的癌症或肿瘤细胞并确定其在细胞表面上表达糖基化ICP，例如PD-L1，那么单独地或与另一种抗癌剂组合地使用抗糖基化ICP抗体(例如上述抗glycPD-L1抗体)治疗的受试者例如更可能会受益于该治疗。此类方法包括从患有癌症或肿瘤的受试者获得样品，使用本领域已知和使用的结合方法，在来源于受试者的癌症或肿瘤的细胞上对样品测试糖基化ICP(例如PD-L1)的存在，或如上所述，如果发现受试者的癌症或肿瘤对糖基化ICP例如PD-L1蛋白的细胞表面表达呈阳性，则向受试者单独地或与另一种抗癌剂组合地施用有效量的抗糖基化ICP抗体，例如抗-glycPD-L1抗体。在治疗之前将受试者诊断为具有表达糖基化ICP例如PD-L1的癌症或肿瘤将允许更有效地治疗受试者并且对受试者有益，因为施用的抗糖基化ICP抗体，例如抗-glyPD-L1抗体，更可能阻断或抑制受试者的糖基化ICP(例如，表达glycPD-L1的癌症或肿瘤细胞)与受试者的表达ICP的T细胞(例如，表达PD-1的T细胞)的相互作用，从而阻止T细胞活性的免疫抑制并通过活化的T细胞杀伤促进肿瘤或癌细胞的杀伤。在一个实施方案中，该方法可涉及首先选择其癌症或肿瘤可适合于测试表达的糖基化ICP例如糖基化的PD-L1蛋白的存在的受试者。
类似的方法可用于在癌症治疗或疗法(包括利用抗糖基化ICP抗体例如抗-glyPD-L1抗体和另一种抗癌药物或治疗的联合治疗)的过程中随时间推移以及在治疗停止后，监测糖基化ICP(例如糖基化PD-L1)在患者肿瘤细胞上的存在。此类方法还可用于伴随诊断方法，其中抗癌治疗方案或联合治疗涉及在治疗之前和治疗过程(例如，监测)中，测试或测定患者的肿瘤或癌症样品中表达糖基化ICP的肿瘤或癌细胞，例如表达糖基化PD-L1的肿瘤或癌细胞，以确定成功的结果或其可能性。
其他药剂
设想了可将其他药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的治疗功效。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞抑制和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导可以增加对邻近的过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，可将细胞抑制剂或分化剂与本发明实施方案的某些方面组合使用，以改善治疗的抗过度增殖功效。设想了细胞粘附的抑制剂可改善本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还设想了增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他药剂诸如抗体c225可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗功效。
融合体和缀合物
还可将本文提供的抗糖基化ICP抗体表达为与其他蛋白质的融合蛋白质或与另一部分化学缀合的蛋白质。在一些实施方案中，抗体或多肽具有可通过同种型或亚类改变的Fc部分，可以是嵌合的或杂合的，和/或可被修饰，例如以改善效应子功能、控制半衰期或组织可及性、增强生物物理特性，诸如稳定性，并提高生产效率，这可与成本降低相关。可用于构建融合蛋白的许多修饰及其制备方法是本领域已知的，例如，如Mueller,J.P.等，1997,Mol.Immun.34(6):441-452；Swann,P.G.,2008,Curr.Opin.Immunol.,20:493-499和Presta,L.G.,2008,Curr.Opin.Immunol.,20:460-470所报道的。在一些实施方案中，Fc区是抗体的天然IgG1、IgG2或IgG4Fc区。在一些实施方案中，Fc区是杂合体，例如含有IgG2/IgG4Fc恒定区的嵌合体。对Fc区的修饰包括但不限于经修饰以防止与Fcγ受体和补体的结合的IgG4；经修饰以改善与一种或多种Fcγ受体的结合的IgG1；经修饰以使效应子功能(氨基酸变化)最小化的IgG1；具有改变的聚糖/无聚糖(通常通过改变表达宿主)的IgG1；和具有改变的对FcRn的pH依赖性结合的IgG1。Fc区可包括抗体整个铰链区，或小于整个铰链区。
另一个实施方案包括IgG2-4杂合体和IgG4突变体，其与FcR的结合降低，这增加了其半衰期。代表性IG2-4杂合体和IgG4突变体描述于例如Angal等，1993,Molec.Immunol.,30(1):105-108；Mueller等，1997,Mol.Immun.,34(6):441-452；和美国专利第6,982,323号(其全部通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，缺失了IgG1和/或IgG2结构域。例如，Angal等(同上)描述了其中IgG1和IgG2结构域的丝氨酸241被脯氨酸取代的蛋白质。在一些实施方案中，涵盖了具有至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的融合蛋白或多肽。
在一些实施方案中，将抗糖基化ICP抗体与至少一个部分连接或共价结合或形成复合物。这种部分可以是，但不限于，增加抗体作为诊断剂或治疗剂的功效的部分。在一些实施方案中，该部分可以是成像剂、毒素、治疗性酶、抗生素、放射性标记的核苷酸、化学治疗剂等。
在一些实施方案中，与抗-glycICP抗体缀合或融合的部分可以是酶，激素，细胞表面受体，毒素诸如但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)、白喉毒素、蓖麻毒素、白树毒素或商陆抗病毒蛋白)、蛋白质(诸如肿瘤坏死因子、干扰素(例如α-干扰素、β-干扰素)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、组织纤溶酶原激活物(TPA)或凋亡剂(例如，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β))、生物反应调节剂(诸如，例如，淋巴因子(例如，白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”))，或生长因子(例如生长激素(“GH”))、细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂，诸如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、基于微管溶素的微管抑制剂例如美登木素生物碱(Maytansinoid)，诸如美登木素生物碱DM1(N2'-脱乙酰-n2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-mayansans；mertansine或emtansine，这取决于所用的接头；和美登木素生物碱DM4(N2'-脱乙酰基-n2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-6-甲基麦角新碱；拉夫坦辛)，ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)，以及嘌呤霉素及其类似物或同源物)、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、噻替苯丁酸氮芥、美法仑、(卡莫司汀；BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))、抗有丝分裂剂和/或微管蛋白抑制剂，例如长春新碱和长春碱、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)、单甲基奥瑞斯他汀E(或去甲基-奥瑞斯他汀E)(MMAE)，例如，维多汀(vedotin)；或其组合。
抗体-药物缀合物(ADC)
抗体药物缀合物(ADC)是其中强效细胞毒性药物通过化学接头或偶联剂共价连接到抗体的生物治疗剂，所述抗体通常是单克隆抗体，其针对特定的靶抗原，特别是在肿瘤或癌细胞的表面上表达或过表达的靶抗原。此类“加载的”抗体被设计来向肿瘤或癌细胞递送致死性细胞毒性货物。ADC提供了将药物有效负载靶向肿瘤细胞同时减小副作用和最小化全身毒性的手段。ADC凭借其抗体组分与其靶抗原的特异性相互作用而与细胞表面表达的靶抗原结合。在与靶抗原结合后，ADC可被内化到细胞中，特别是当抗体具有提高的内化活性时。具有内化功能的抗glycICP抗体的实例是本文所述实施方案的抗-glycPD-L1抗体，诸如STM108和STM073。因此，当此类ADC被内化到细胞中时，它们直接作用以杀死细胞或靶向细胞内的分子，这导致细胞凋亡或细胞死亡。包含本文所述的抗glycICP抗体例如抗-glycPD-L1抗体(例如，STM108和STM073)，特别是单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体或人抗体的此类ADC，将抗体针对肿瘤和癌细胞上的糖基化ICP的特异性靶向与细胞毒性药物或化合物的癌症杀伤能力组合，从而为利用抗glycICP抗体的治疗和疗法提供进一步有利方面。用于制备和使用ADC的技术是本领域已知的，并不意图限制于本文描述的抗-glycPD-L1抗体。(参见，例如，Valliere Douglass,J.F.等，2015,Mol.Pharm.,12(6):1774-1783；Leal,M.等，2014,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1321:41-54；Panowski,S.等，2014,mAbs,6(1):34-45；Beck,A.2014,mAbs,6(1):30-33；Behrens,C.R.等，2014,mAbs,6(1):46-53和Flygare,J.A.等，2013,Chem.Biol.Drug Des.,81(1):113-121)。在一些实施方案中，可将上述部分的一些或全部(特别是毒素和细胞毒素)与抗-glycPD-L1抗体缀合，以产生用于治疗癌症的有效ADC。在一些实施方案中，ADC的抗-glycICP抗体组分可以是双特异性、多特异性、双互补位或多互补位抗体。
用于将治疗剂或细胞毒性部分与抗体缀合的技术是公知的；参见，例如，Amon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”,inMONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Reisfeld等(编辑),1985，第243-56页，Alan R.Liss,Inc.)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”,in CONTROLLEDDRUG DELIVERY(第2版),Robinson等，(编辑),1987，第623-53页，Marcel Dekker,Inc.)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”,inMONOCLONAL ANTIBODIES'84:BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS,Pinchera等(编辑),1985，第475-506页)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”,in MONOCLONALANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY,Baldwin等(编辑),1985，第303-16页，Academic Press；Thorpe et al.,Immunol.Rev.62:119-158(1982)；Carter等，CancerJ.14(3):154-169(2008)；Al ley等，Curr.Opin.Chem.Biol.14(4):529-537(2010)；Carter等，Amer.Assoc.Cancer Res.Educ.Book.2005(1):147-154(2005)；Carter等，Cancer J.14(3):154-169(2008)；Chari,Acc.Chem Res.41(1):98-107(2008)；Doronina等，Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003)；Ducry等，Bioconjug Chem.21(1):5-13(2010)；Senter,Curr.Opin.Chem.Biol.13(3):235-244(2009)和Teicher,Curr Cancer DrugTargets.9(8):982-1004(2009)。关于ADC和ADC肿瘤学产品的综述见于Lambert,BritishJ.Clin.Pharmacol.,76(2):248-262(2013)和Bouchard等，Bioorganic&MedicinalChemistry Letters,24:5357-5363(2014)中。
在一些具体的实施方案中，通常通过具有不稳定键的化学接头将促进glycICP(例如PD-L1)内化到肿瘤细胞中的抗glycICP抗体(例如抗-glyPD-L1抗体)与高效生物活性药物或药剂(诸如细胞毒素和/或化学治疗剂，如上所述的毒素或细胞毒素，或放射性核素)缀合，以产生抗glycICP抗体-药物缀合物(ADC)(在本文中称为抗glycICP抗体-ADC)。例如，生物活性药物或细胞毒性剂用作“细胞毒性有效负载”，其被递送到细胞中，特别是表达由抗glycICP抗体-ADC结合的细胞表面靶受体或分子的肿瘤或癌细胞。此类与其靶分子结合的抗glycICP抗体-ADC被内化到细胞中，在所述细胞中释放细胞毒性药物有效负载。通过与高效细胞毒性有效载荷缀合增强本文所述的内化性抗-glycICP抗体(例如抗-glyPD-L1抗体)的癌细胞杀伤活性提供了具有高抗肿瘤活性和被良好耐受的通常轻微的不利效应的抗癌ADC生物制剂。
如本文实施方案中所述的抗glycICP抗体可以与本领域已知和使用的或有待商业化的各种类型的细胞毒性或DNA作用性有效负载连接。例如，美坦辛是最早从埃塞俄比亚灌木卵叶美登木(Maytenus ovatus)的树皮中分离出来的benzoansamacrolide。该细胞毒性剂及其衍生物(例如美登木素生物碱)在长春花生物碱结合部位附近与微管蛋白结合。它们被认为对位于微管末端的微管蛋白具有高亲和力，对分布在整个微管中的位点具有较低的亲和力。抑制微管动力学导致细胞停滞在细胞周期的G2/M期，最终导致细胞凋亡引起的细胞死亡。(Oroudjev等，Mol.Cancer Ther.,10L2700-2713(2010))。两种美坦辛衍生物(含巯基的美登木素生物碱)包括DM1和DM4(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)已广泛用于与不可逆和可逆的接头组合。特别地，通过硫醚接头与抗体连接的DM1称为“emtansine”；通过SPP接头与抗体连接的DM1称为“mertansine”；通过SPDB接头连接的DM4称为“ravtansine”；通过sSPDB接头连接的DM4称为“soravtansine”(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)。在一个实施方案中，抗glycICP抗体-ADC包含微管蛋白作用性美登木素生物碱有效负载DM1。在一个特定实施方案中，抗glycICP抗体-ADC是抗-glycPD-L1抗体-DM1。在一个实施方案中，抗glycICP抗体-ADC包含微管蛋白作用性美登木素生物碱有效负载DM4。在一个具体实施方案中，抗glycICP抗体-ADC是抗-glycPD-L1抗体-DM4。在一个实施方案中，抗glycICP抗体-ADC包含DNA作用性有效负载，例如DGN462(ImmunoGen,Inc.,Waltham,MA)。在一个特定实施方案中，抗glycICP抗体-ADC是抗-glycPD-L1抗体-DGN462。在一个实施方案中，抗-glycPD-L1抗体-ADC的抗-glycPD-L1抗体组分是STM073，或其结合部分。在一个实施方案中，抗-glycPD-L1抗体-ADC的抗-glycPD-L1抗体组分是STM108或其结合部分。
在一个特定实施方案中，与抗-glycICP抗体缀合的细胞毒性剂是MMAE(单甲基奥瑞斯他汀E(或去甲基-奥瑞斯他汀E))，一种高毒性的抗肿瘤剂，其抗有丝分裂活性涉及通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞分裂。维多汀(一种国际非专利名称)是指MMAE加上其与MMAE-抗体缀合物中抗体的连接结构。在更特定的实施方案中，ADC是抗-glycPD-L1抗体-MMAE，例如STM073-MMAE或STM108-MMAE。
许多化学接头是已知的并被用于将细胞毒性或DNA作用性药物有效负载与抗体缀合以产生ADC。包含来单独地或组合地用于产生包含抗glycICP抗体(特别是如本文所述的在结合其靶标后内化的那些抗体)的ADC的某些接头，包括SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)；SPDB(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯)；SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶二硫基)戊酸酯)；磺基-SPDB或sSPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2--吡啶二硫基)-2-磺基丁酯)；硫醚接头琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)和vc(缬氨酸-瓜氨酸二肽接头)。举例来说，工程化接头(例如，SMCC、SPDB、S-SPDB)(Immunogen,Inc.)已被设计成在ADC与肿瘤结合之前是稳定的，然后一旦ACD被内化至癌细胞内后就优化有效负载效力。其他接头，诸如二肽vc接头(其是组织蛋白酶可切割的接头)可用于将抗体缀合于细胞毒性剂，诸如奥瑞斯他汀，其是源自多拉司他汀10的有丝分裂抑制剂，例如单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)，例如，维多汀。可将细胞毒素与抗体缀合，使得不止一个毒素分子附接于每个抗体分子，例如，每个抗体平均可以有2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个毒素分子。
在一个特定实施方案中，MMAE通过马来酰亚胺己酰基(MC)附接基团与抗体半胱氨酸间接连接，所述附接基团与缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基-MMAE偶联(MC-vc-PAB-MMAE)。在“MC-vc-PAB-MMAE”线性结构中，“MC”由马来酰亚胺和己酸组成，并且是通常通过H链上的半胱氨酸基团附接于抗体的部分。反过来，“MC”附接于“vc”接头，该接头由缬氨酸(Val)和瓜氨酸(Ci t)组成，并且是组织蛋白酶可切割的接头，其被肿瘤或癌细胞内的组织蛋白酶切割。“vc”附接于间隔子“PAB”(即对氨基苯甲酸)，其与MMAE细胞毒素连接。MC-vc-PAB-MMAE ADC在被蛋白酶诸如组织蛋白酶B切割时释放游离的膜可渗透性MMAE。在一个实施方案中，抗体的接头在细胞外流体中是稳定的，但一旦ADC进入肿瘤或癌细胞，就被组织蛋白酶切割，从而激活MMAE或其他毒素药物的抗有丝分裂机制。在另一个实施方案中，单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)通过马来酰亚胺己酰基(MC-MMAF)与抗体半胱氨酸连接。与MC-vc-PAB-MMAE ADC相反，MC-MMAF ADC是不可切割的，如MCC-DM1ADC一样，必须被内化并在细胞内降解，在细胞内释放半胱氨酸-MC-MMAF作为活性药物。
在一个实施方案中，在将ADC内化到细胞中后，细胞毒性有效负载在溶酶体中释放。在溶酶体中，溶酶体酶消化ADC的抗体组分。在溶酶体降解后，药物(和药物-接头)有效负载被释放到细胞质中，在所述细胞质中药物结合细胞内靶标，最终导致细胞死亡。最佳地，释放的有效负载具有完全活性，仍然与接头附接。在与ADC结合的靶标导致至溶酶体的运输不佳的其他实施方案中，在靶细胞外稳定、但一旦在细胞内部就从抗体组分切割有效负载的接头提供了用于在细胞内但在溶酶体外释放有效负载的替代模式。在其他实施方案中，接头在细胞外流体中是稳定的，但一旦ADC已进入肿瘤或癌细胞就被组织蛋白酶切割，从而激活毒素药物的抗有丝分裂或其他细胞毒性机制。在其他实施方案中，通过可切割接头的作用释放的有效负载能够进入邻近的癌细胞并通过旁观者效应杀死它们，从而增强ADC的靶向和肿瘤杀伤活性。
作为特定的实例，抗-glyICP抗体(如由促进细胞表面PD-L1的内化的抗PD-L1MAbs STM073或STM108所代表的)通过接头SMCC(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯)偶联至DM1。在另一个特定实例中，由STM073或STM108代表的抗glycICP抗体通过接头SPDB(N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯)或sSPDB(N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶二硫基)-2-磺基丁酸酯)偶联至DM4。在另一个特定实例中，奥瑞斯他汀单甲基奥瑞斯他汀E通过马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(MC-vc-PAB-MMAE)与抗-glycICP抗体(例如STM073或STM108)的半胱氨酸残基连接。在特定实例中，ADC是STM108-MC-vc-PAB-MMAE或STM073-MC-vc-PAB-MMAE。
在一个实施方案中，抗glycICP抗体-ADC每分子包含多个单位的药物(诸如MMAE)，诸如每分子包含1-10个、1-5个、2-5个、3-5个或2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个(以及其间的值)单位的药物，诸如MMAE。在其他实施方案中，抗体-药物比率可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，以及2与10之间的范围和其间的值。在一些实施方案中，抗glycICP抗体，例如STM108或STM073，是双特异性、多特异性、双互补位或多互补位抗体，或其抗原结合部分。包含如本文所述的具有内化功能的抗glycICP抗体的此类ADC，例如上述STM108-MC-vc-PAB-MMAE，在杀死肿瘤和癌细胞以进行癌症治疗方面提供了已证实的和多方面的抗肿瘤作用。仅作为几个说明性的有利方面，抗人glycICP MAb-ADC，例如STM108-ADC，可阻断PD-1/PD-L1相互作用，从而增强针对肿瘤细胞的T细胞免疫力和效应子功能；其可以选择性地靶向肿瘤和癌细胞上表达的糖基化PD-L1；其可以在结合后内化肿瘤或癌细胞上的PD-L1，从而减少肿瘤或癌细胞上表面表达的PD-L1，并进一步降低PD-L1的致癌潜力；其可引起抗体已被内化于其中的肿瘤或癌细胞的细胞凋亡，并且毒性药物被释放以破坏并最终杀死细胞；并且其可通过从凋亡的肿瘤或细胞中释放毒性药物来杀死附近或邻近的肿瘤或癌细胞，从而促进旁观者效应。
在一些实施方案中，可将如本文所述的抗体与标记物(诸如肽)缀合，以促进纯化。在一些实施方案中，标记物是六组氨酸肽，即血凝素“HA”标签，其对应于源自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson,I.A.等，Cell,37:767-778(1984))或“flag”标签(Knappik,A.等，Biotechniques 17(4):754-761(1994))。
在其他实施方案中，与本文所述的抗glycICP抗体缀合的部分可以是可在测定中被检测到的成像剂。此类成像剂可以是酶、辅基、放射性标记物、非放射性顺磁性金属离子、半抗原、荧光标记物、磷光分子、化学发光分子、发色团、发光分子、生物发光分子、光亲和分子，或有色颗粒或配体诸如生物素。在一些实施方案中，合适的酶包括但不限于辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基复合物包括但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料包括但不限于伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料包括但不限于鲁米诺；生物发光材料包括但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性物质包括但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、111In)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属，以及非放射性顺磁金属离子。
可使用本领域已知的技术将成像剂直接地或通过中间体(诸如，例如，本领域已知的接头)间接地与本文所述的抗体或多肽缀合。参见，例如，美国专利第4,741,900号，其报道了可以与本文所述的抗体和其他分子缀合以用作诊断剂的金属离子。一些缀合方法涉及使用附接于抗体的金属螯合络合物，所述金属螯合络合物采用例如有机螯合剂，诸如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；亚乙三胺四乙酸；N-氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3,6α-二苯基甘脲-3。单克隆抗体也可以在偶联剂诸如戊二醛或高碘酸盐/酯存在的情况下与酶反应。可在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备具有荧光素标记物的缀合物。
在一些实施方案中，可将如本文所述的抗glycICP抗体与第二抗体缀合以形成抗体异源缀合物，例如，如美国专利第4,676,980号中所述的。此类异源缀合物抗体可以另外地与半抗原(例如，荧光素)结合，或与细胞标志物、细胞因子或趋化因子结合。
在一些实施方案中，还可将本文所述的抗糖基化ICP抗体附着于固体支持物，其可用于进行靶抗原或其它分子的免疫测定或纯化，所述其它分子能够与已被固定于所述支持物的靶抗原(通过与本文所述的抗体或抗原结合片段的结合)结合。此类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
实施例
本文的实施例涉及由本发明人发现以糖基化形式在肿瘤和癌细胞上表达的特定的代表性ICP，即PD-L1，以及针对PD-L1的糖基化形式及其肽产生的抗体。通过所述方法分离并在本文中举例说明的代表性抗-glycPD-L1抗体包括STM004、STM115、STM073和STM108。抗体STM004和STM115公开于2016年10月6日公开的PCT公开WO2016/160792中；抗体STM073和STM108公开于2016年7月12日提交的美国临时申请系列第62/361,312号中。本领域技术人员将理解，除了PD-L1以外，实施例还可包括在肿瘤细胞上表达的其他糖基化ICP，以及在免疫细胞诸如效应T细胞上表达的其配体ICP。
实施例1材料和方法
细胞培养、稳定转染子和转染。所有细胞均获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。将这些细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12或RPMI 1640培养基中生长。使用嘌呤霉素(InvivoGen,San Diego,CA,USA)选择MDA-MB-468、BT549和293T细胞中的PD-L1稳定转染子。对于瞬时转染，使用SN脂质体(Hu,M.C.等，2004,Cell,117:225-237)和lipofectamineTM 2000(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)用DNA(诸如编码PD-L1的DNA)瞬时转染细胞。
使用慢病毒感染产生稳定细胞。用于敲低细胞中PD-L1表达(Shen,J.等，2013,Nature,497:383-387)的基于慢病毒的shRNA(pGIPZ质粒)购自shRNA/ORF Core Facility(UT MD Anderson Cancer Center)。基于MDA-MB-231或A431细胞中PD-L1蛋白表达的敲低效率，本发明人选择了两个shPD-L1克隆用于该研究。成熟反义序列如下：TCAATTGTCATATTGCTAC(shPD-L1#1,SEQ ID NO:9),TTGACTCCATCTTTCTTCA(shPD-L1#5,SEQID NO:10)。通过使用pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1双重表达构建体敲低内源性PD-L1并同时重建Flag-PD-L1，本发明人建立了内源性PD-L1敲低和Flag-PD-L1 WT或4NQ突变体表达细胞系。为了产生表达针对PD-L1和Flag-PD-L1的shRNA的慢病毒，本发明人用pGIPZ-非沉默(用于载体对照病毒)、pGIPZ-shPD-L1或pGIPZ-shPD-L1/PD-L1WT或pGIPZ-shPD-L1/PD-L14NQ突变体使用FuGENE 6转染剂转染了293T细胞。转染后24小时，更换培养基，然后以24小时的间隔收集培养基。将收集的含有慢病毒的培养基离心以消除细胞碎片，并通过0.45-μm过滤器过滤。在感染前12小时以50％汇合接种细胞，并用含有慢病毒的培养基替换培养基。感染24小时后，用新鲜培养基替换培养基，用1μg/ml嘌呤霉素(InvivoGen)选择感染细胞。
质粒。从shRNA/OR Core Facility(UT MD Anderson Cancer Center,Houston,TX,USA)获得人PD-L1克隆，并使用已知的分子生物学技术将其克隆到pCDH慢病毒表达载体中以建立PD-L1-Flag或PD-L1-Myc表达细胞系。另外，还将人PD-L1核酸克隆到pEGFP-N1和pCMV-HA哺乳动物细胞表达载体中以用于瞬时转染。使用pCDH/PD-L1-Flag表达载体作为模板，通过使用下表4中所示的引物进行定点诱变，产生PD-L1-Flag NQ突变体N35Q、N192Q、N200Q、N219Q和4NQ(N35Q/N192Q/N200Q/N219Q)。为了产生pGIPZ-shPD-L1/Flag-PD-L1双重表达构建体以敲低内源性PD-L1并同时重建Flag-PD-L1，选择靶向PD-L1mRNA的3’-UTR区的shPD-L1构建体(shPD-L1#5)。将Flag-PD-L1野生型(WT)或4NQ突变体DNA克隆到pGIPZ-shPD-L1(Thermo Scientific,Pittsburgh,PA,USA)中，其表达对内源性PD-L1特异的shRNA。使用酶消化和DNA测序确认所有构建体。
表4.用于定点诱变的引物
抗体和化学品。以下抗体用于实施例中描述的实验：Flag(F3165；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)；PD-L1(13684；Cell Signaling Technology,Danvers,MA,USA)；PD-L1(329702；BioLegend,San Diego,CA,USA,)；PD-L1(GTX117446；GeneTex,Irvine,CA,USA)；PD-L1(AF156；R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)；PD-1(ab52587；Abcam,Cambridge,MA,USA)。
免疫印迹分析和免疫细胞化学。如前所述(Lim等，2008,Gastroenterology,135:2128-2140和Lee等，2007,Cell,130:440-455)进行免疫印迹分析。使用红外成像系统(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE,USA)进行条带强度的图像获取和定量。对于免疫细胞化学，将细胞在室温下在4％低聚甲醛中固定15分钟，在5％Triton X-100中透化5分钟，然后用一抗染色。使用的二抗是抗小鼠Alexa Fluor 488或594染料缀合物和/或抗兔Alexa Fluor 488或594染料缀合物(Life Technologies)。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI蓝)(Life Technologies)染色。固定后，使用多光子共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss,Thornwood,NY,USA)使细胞可视化。
PD-L1和PD-1相互作用测定。为了测量PD-1蛋白与PD-L1蛋白的相互作用，将细胞在室温下于4％低聚甲醛中固定15分钟，然后用重组人PD-1Fc嵌合蛋白(R&D Systems)孵育1小时。使用的二抗是抗人Alexa Fluor 488染料缀合物(Life Technologies)。细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI蓝)(Life Technologies)染色。然后使用微量板读数器Synergy Neo(BioTeK,Winooski,VT,USA)测量Alexa Fluor 488染料的荧光强度并将其针对总蛋白质量的强度进行标准化。为了拍摄图像，在固定后，使用共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss)使细胞可视化。
统计分析。柱状图中的数据表示3个独立实验中相对于未处理组或对照组的平均倍数变化和标准偏差。使用SPSS(Ver.20,SPSS,Chicago,IL)进行统计学分析。使用Spearman相关和Mann-Whitney检验分析蛋白质表达与BLBC亚群之间的相关性。对实验数据进行学生t检验。P值&lt;0.05被认为具有统计学显著性。
实施例2：糖基化PD-L1结合抗体的产生和筛选
该代表性实施例提供了获得特异性结合糖基化ICP即糖基化PD-L1的单克隆抗体的描述；然而，本文描述的方法适用于产生特异性结合其他糖基化免疫检查点分子，以通过阻止糖基化ICP与其相互作用配体的缔合来抑制免疫抑制的抗体。
通过按照标准方案将SP2/0鼠骨髓瘤细胞与分离自经人PD-L1免疫的BALB/c小鼠(n＝6)(Antibody Solution,Inc.)的脾细胞融合，获得产生针对糖基化人PD-L1产生的单克隆抗体的杂交瘤。在融合之前，使用FACS分析验证来自免疫小鼠的血清与PD-L1免疫原的结合。产生产生单克隆抗体(MAb)的杂交瘤。所有MAb的同种型是IgG1。再次测试产生抗体的杂交瘤对糖基化PD-L1的特异性。为此，选择42个产生MAb的候选杂交瘤，在ADCF培养基中生长，并将其含有单克隆抗体的上清液浓缩并纯化。
为了鉴定相较于非糖基化PD-L1而对糖基化PD-L1抗原特异并且优先与其结合的抗-glycPD-L1 MAb，进行了不同类型的测定。在检测MAb与糖基化PD-L1的优先结合的一个筛选测试中，基于二抗的荧光强度的测量来确定抗体结合，所述二抗识别通过FACS分析(使用膜结合蛋白)测试的抗体。举例来说，使用BT549人乳腺癌细胞系进行测定。说明性地，根据常规方法用生物素标记过表达PD-L1 WT(完全糖基化的)的BT549细胞，然后与未用生物素标记的过表达PD-L1 4NQ(完全未糖基化的PD-L1变体)的BT549细胞混合。将混合细胞与待测抗体和缀合有PE的重组链霉抗生物素蛋白(rSA-PE)一起孵育。将细胞与缀合有FITC的二抗(SA-FITC)进一步孵育。洗涤后，对细胞进行门控以分离生物素-rSA-PE标记的细胞(糖基化的PD-L1)和未用生物素-rSA-PE标记的细胞(未糖基化的PD-L1 4NQ细胞)。通过缀合有FITC的二抗(SA-FITC)测量平均荧光强度(MFI)以评估抗-PD-L1抗体与膜结合的WT或4NQPD-L1的相对结合。选择相对于4NQ PD-L1而言在WT PD-L1上表现出显著更高的MFI的抗体用于进一步评估。STM004、STM073、STM108和STM115抗-glycPD-L1 MAb的荧光结合分析的结果显示在下表5中，该表显示抗体与表达野生型(糖基化的)PD-L1的BT549细胞(BT549PD-L1WT细胞)的结合对比抗体与表达变体(非糖基化的4NQ)PD-L1的BT549细胞(BT549PD-L14NQ细胞)的结合的MFI值。
表5.抗glycPD-L1 MAb的平均荧光强度值
在另一个测定中，将糖基化人PD-L1蛋白和非糖基化PD-L1(即用PNG酶F处理的PD-L1蛋白)涂覆在固相上并测试MAb对PD-L1抗原的结合亲和力。应理解，“PD-L1抗原”与“PD-L1蛋白”同义。与非糖基化PD-L1蛋白(PNG酶F处理的蛋白质)相比，十二(12)个MAb显示出较高的与糖基化PD-L1蛋白的亲和力相互作用。为了进一步的特异性分析，通过Western印迹和FACS流式细胞术分析法分析选定的MAb。从各种分析中，发现与PD-L的非糖基化形式相比，MAb诸如STM004、STM073、STM108和STM115特异性地与PD-L1的糖基化形式结合，这进一步证实了这些MAb对糖基化PD-L1抗原的特异性。参见图1。
在某些情况下，使用活细胞成像测定IncuCyteTM(Essen Bioscience)对纯化的MAb进一步测试其中和或抑制PD-L1与PD-1之间相互作用(PD-L1/PD-1相互作用)的能力。对于该测定，将表达PD-L1的BT-549细胞与抗人PD-L1抗体和荧光标记的PD-1-Fc融合蛋白一起孵育。按照制造商的说明，每小时通过IncyCyteTMZoom定量配体与受体的结合。基于该测定并如图2所示，在测试的42种MAb中，15种MAb完全阻断PD-L1与PD-1的结合。
通过western印迹和流式细胞术分析证实与糖基化PD-L1的优先结合。图3B证明通过本文所述的筛选方法鉴定的5种抗-glycPD-L1抗体与糖基化PD-L1(“WT”)结合但不与未糖基化的PD-L1 4NQ结合。图3C还通过流式细胞术证实了相对于未糖基化的PD-L1 4NQ突变体而言，这5种抗体优先与糖基化或WT PD-L1结合。
实施例3特异性糖基化PD-L1结合抗体的结合区域的鉴定
为了鉴定与糖基化PD-L1结合的单克隆抗-glycPD-L1抗体的区域，野生型(糖基化的)PD-L1(PD-L1 WT)和糖基化变体蛋白N35/3NQ、N192/3NQ、N200/3NQ和N219/3NQ(图4A-4C)在PD-L1敲低BT549细胞中过表达。如通过图4C中的Western印迹所测定的，一些MAb以比其他PD-L1突变体更高的结合水平识别特定PD-L1突变体，证明了此类MAb对于识别的糖基化是位点特异性的。另外，使用肝癌细胞裂解物的Western印迹分析还揭示了不同的抗-glycPD-L1抗体识别不同的PD-L1糖基化模式(图4D)。
实施例4使用抗-glyPD-L1抗体的免疫组织化学染色
通过如图5所示的免疫组织化学(IHC)染色进一步证实了这些MAb的组织病理学相关性，在细胞离心涂片染色分析(cytospin staining analysis)中，抗-glyPD-L1单克隆抗体始终识别并结合糖基化PD-L1蛋白，但不结合未糖基化的PD-L1蛋白。在人三阴性乳腺癌患者样品中，抗-glyPD-L1单克隆抗体还以1:30的比例显示膜和细胞质染色。这些数据证明抗-glycPD-L1单克隆抗体可用于生物标志物分析，以检测作为生物标志物的糖基化PD-L1。
实施例5结合测定
为了确定如本文所述的抗-glycPD-L1单克隆抗体是否特异性抑制PD-1与PD-L1的相互作用，进行以下结合测定。在测定的第0天，从表达PD-L1的BT549靶细胞培养物中除去含有血清的培养基，并用D-PBS轻轻漂洗两次。收获细胞并计数。将细胞悬浮液离心(1000RPM，5分钟)，将细胞沉淀以50,000个细胞/mL重悬于培养基中。使用手动多通道移液管将细胞(100μL/孔，即5000个细胞/孔)接种到平底微量板的每个孔中。将板在环境温度下静置30分钟。此后，将含有细胞的平板在5％CO2培养箱中孵育过夜。
在测定的第1天(即第二天早晨)，制备含有1μg/mL PD-1/Fc和1:400稀释的AlexFluor 488-山羊抗人IgG的培养基并在培养箱中加热至37℃。从培养箱中取出细胞板并吸出培养基，注意不要破坏细胞层。以剂量依赖性方式向每个孔中加入50μL测试抗体。向每个孔中加入50μL含有PD-1/Fc和Alex Fluor 488-山羊抗人IgG的培养基。将细胞板置于IncuCyte仪中，并在第一次扫描前平衡20分钟。24小时自动重复扫描(10x)计划每1-2小时扫描一次，进行长达24小时。物镜：10x；器皿类型：Corning 3596；扫描模式：标准；扫描方式(Scan Pattern)：每孔4张图像；信道：相位(Phase)+“绿色”。相对于对照(图6D)，不同浓度的代表性单克隆抗-glycPD-L1抗体的结合显示于图6A-6C。图6A显示STM004的结果，图6B显示STM073的结果，图6C显示STM108的结果。PD-1的结合随着抗-glycPD-L1抗体浓度增加而减少，表明抗-glyPD-L1抗体抑制PD-L1与PD-1的结合。
实施例6 T细胞杀伤测定
利用T细胞杀伤测定来测定抗-glycPD-L1单克隆抗体对肿瘤细胞的细胞毒活性。遵循的方案如下：在第0天，从表达糖基化野生型PD-L1-(PD-L1 WT)的BT549 RFP靶细胞培养物中除去含血清的培养基，并用PBS轻轻冲洗两次。收获细胞并计数。将细胞悬浮液离心(1000RPM，4分钟)，将细胞沉淀以50,000个细胞/mL重悬于培养基中。使用手动多通道移液管，将细胞(100μL/孔，即5000个细胞/孔)接种到平底微量板的每个孔中。将板在环境温度下静置30分钟，然后将其置于IncuCyte活细胞成像仪中，在安排第一次扫描之前使其平衡20分钟。安排二十四小时(24小时)重复扫描(10倍物镜)，每3小时一次，第一次扫描立即开始。在接下来的18小时(过夜)中监测细胞汇合，直至达到所需的汇合(例如，20％)。
第二天早上，即测定当天(即，第1天)，在测定培养基中制备10μM IncuCyteTMCaspase 3/7凋亡绿色荧光检测试剂(Essen BioScience 4440)溶液(2.5μM的最终测定浓度的4倍)并在培养箱中温热至37℃。在测定培养基中以4x最终测定浓度制备抗CD3抗体(100ng/mL)+IL-2(10ng/mL)T细胞活化剂处理并温热至37℃。还制备了测试MAb。从培养箱中取出靶细胞板并吸出培养基，注意不要破坏细胞层。使用多通道移液管，将25μL温热的半胱天冬酶3/7溶液转移到每个孔中。此后，将25μL温热的抗CD3抗体+IL-2和抗体置于细胞板的适当孔中。添加含有效应细胞(PBMC或总T细胞)的另外50μL培养基以形成100μL的总测定体积。将去泡的细胞板置于IncuCyte仪中，并在第一次扫描之前使其平衡20分钟。安排24小时重复扫描，每2-3小时一次，持续长达5天。(目镜10x；器皿类型：Corning 3596；扫描模式：标准；扫描方式：每孔2个图像；信道：相位+“绿色”(如果使用NucLightTM Red靶细胞，则+“红色”)。
为了分析，通过计算视野中“大”绿色荧光物体(细胞核)随时间的总数，在IncuCyteTM软件中定量靶细胞凋亡。从红色物体计数(对应于红细胞核的数量)测量靶细胞的增殖。数据表示为每mm2荧光物体的数量。数据显示通过添加测试的抗体增强了肿瘤细胞杀伤。图7A显示STM004的结果，图7B显示STM073的结果。
实施例7抗-glycPD-L1抗体对PD-L1的结合促进PD-L1内化和降解
为了确定抗glycICP抗体在与其同源ICP结合分子结合后是否促进内化和降解，进行细胞染色测定。在本实施例中，使用的抗glycICP抗体是抗PD-L1 MAb，STM108。对于测定，将A431细胞在无血清培养基中孵育过夜，然后与10μg抗-glycPD-L1抗体一起孵育两天。然后收获细胞，通过Western印迹评估细胞中的PD-L1。与对照(IgG)相比，用抗-glycPD-L1MAb孵育细胞显示细胞中的PD-L1水平降低。
按照制造商的说明使用pHrodoTM Red Microscale Labeling试剂盒(ThermoFischer Scientific,Rochester,NY)，通过用pHrodoTM Red染料标记抗体来可视化STM108 MAb的细胞内化。简言之，对于分析，在0时刻接种细胞；接种后24小时，将细胞与标记的STM108 MAb(5μg/mL)一起孵育。1小时后，使用IncuCyte仪开始细胞的图像扫描，安排24小时重复扫描(10x)，每1小时一次。物镜：10x；器皿类型：Corning 356407；扫描模式：标准；扫描方式：每孔3张图片；信道：相位+“红色”。
图8A-8C提供了在抗-glycPD-L1 MAb STM108与在BT549-PD-L1细胞上表达的PD-L1结合后通过活细胞成像分析PD-L1内化和降解的实例。在图8A-8C中，如上所述，使用pHrodoTM Red Microscale Labeling试剂盒(ThermoFisher Scientific,Rochester,NY)将STM108与红色荧光染料pHrodoTM Red(succinimidyl ester(pHrodoTM Red,SE)缀合。绿色染料反映用Green DND-26(其是一种可透过细胞的绿色染料)染色的细胞，所述染料对通过活细胞成像法成像的活细胞中的酸性区室(溶酶体)染色。图8A显示在第一时间点(时间0)，如通过箭头指示的细胞的强烈红色细胞内染色所观察到的，STM108抗体被内化到细胞中。图8B显示在图8A中的时间0之后2分钟时，图8A中描述的同一细胞中的弱化细胞内红色染色。图8C显示在图8A中的时间0后4分钟缺乏红色细胞内染色，这反映了细胞内STM108抗体和/或抗体-抗原复合物的降解。这些图像反映了抗糖蛋白抗体(即抗-glycPD-L1抗体诸如STM108 MAb)在与细胞表面上表达的PD-L1结合后实现PD-L1的内化和降解。
实施例8：肿瘤细胞对比总T细胞中被抗-glycPD-L1抗体结合的PD-L1的内化
对抗-glycPD-L1抗体测试在结合细胞表面表达的PD-L1后内化到PD-L1阳性肿瘤细胞中的能力(与活化或非活化的T细胞相比)。将抗-glycPD-L1抗体STM004、STM073和STM108以及作为对照的小鼠IgG与来自外周血的非活化的总T细胞、来自外周血的活化的总T细胞和表达PD-L1的NCI-H226细胞一起孵育。对于T细胞活化，将总T细胞以1:1的比例与用抗CD3抗体和抗CD28抗体(例如，ThermoFisher Scientific,Rochester,NY)共价偶联的珠粒(例如，惰性、超顺磁珠粒)混合，以模拟通过抗原呈递细胞刺激的方式刺激T细胞(参见，例如，A.Trickett等，2003,J.Immunol.Methods,275，1-2期：251-255)。用pHrodoTM Red标记所有抗体，并如上所述显现内化。图9A-9D和图9E-9H显示所测试的抗体均未内化到未活化的总T细胞或活化的总T细胞中。图9I-9L显示相较于未显示红色细胞内染色的标记的对照抗体mIgG(图9I)和标记的非内化STM004 MAb(图9J)，STM073和STM108 MAb在与这些细胞一起孵育后内化到NCI-H226细胞中，如通过红色细胞内染色所证明的。该实施例证明抗-glycPD-L1抗体STM073和STM108是选择性内化到表达PD-L1的肿瘤细胞中，但不内化到活化或非活化的T细胞中的抗-glycICP抗体的实例。
实施例9PD-L1 ADC在肿瘤细胞杀伤和肿瘤体积减小方面的功效
进行体外和体内实验以评估包含抗人ICP抗体的ADC，特别是与细胞毒素MMAE偶联的抗人glycPD-L1 MAb(即，STM108 MAb)在肿瘤杀伤和减小肿瘤体积方面的功效。如上所述，STM108-ADC包含通过半胱氨酸与MC-vc-PAB-MMAE化学连接的STM108 MAb，用于将MMAE细胞毒素有效负载特异性地递送至表达PD-L1的肿瘤或癌细胞。STM108-ADC(STM108-MC-vc-PAB-MMAE)的测量的物理特性如下：
ADC的A<sub>248nm</sub> 2.548
ADC的A<sub>280nm</sub> 3.635
A<sub>248nm</sub>/A<sub>280nm</sub>比率 0.70
药物抗体比率 4.13
结合本实施例，图10A-10D显示了评估STM108-ADC相较于对照(仅IgG和STM108MAb)而言在杀伤表达PD-L1以及不表达PD-L1的肿瘤细胞方面以及在减小肿瘤移植小鼠中的肿瘤体积方面的功效的实验结果。图10A显示，与经分子工程化而敲除其PD-L1表达的MB231细胞在暴露于不同浓度的STM108-ADC(即“ADC108”)后的存活率％(实心黑色方块)相比，表达PD-L1的MDA-MB231(人乳腺癌细胞系)肿瘤细胞(“MB231”)在暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后的存活率％(实心黑色圆圈)。如所观察到的，即使在最高浓度下，STM108-ADC对在其表面上不表达PD-L1的MB231细胞的存活率也没有显著影响，而表达PD-L1的MB231细胞的存活率显著降低，特别是在1nM至100nM的STM108浓度下。在图10B中，使用MDA-MB231乳腺癌小鼠模型，其中用IgG-MMAE对照(100μg)、用50μg、100μg或150μg的STM108-ADC或用单独的STM108 MAb(100μg)处理移植有来自MB231细胞的肿瘤的动物。结果表明，与用IgG-MMAE对照处理的动物相比，在所有剂量水平用STM108-ADC处理的荷瘤动物中的肿瘤体积有效减小，并且在一定程度上，利用STM108 MAb(100μg)处理的荷瘤动物中的肿瘤体积也有一定程度的减小。另外，令人惊讶地发现，在约第18天时，利用STM108-ADC(100μg)处理的5只动物中有3只(3/5)和利用STM108-ADC(150μg)处理的5只动物中有4只(4/5)中发生发生完全缓解(“CR”)。
图10C显示与天然不表达PD-L1的4T1细胞(“4T1”)在暴露于不同浓度的STM108-ADC(即，“ADC108”)后的存活率％(空心红色方块)相比，经分子工程化而在细胞表面上表达人PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1hPDL1”)在暴露于不同浓度(nM)的STM108-ADC后的存活率％(空心红色圆圈)。如所观察到的，即使在最高浓度下，STM108-ADC对在其表面上不表达PD-L1的4T1细胞的存活率也没有显著影响，而表达PD-L1的4T1细胞的存活率在大于10nM至100nM的STM108-ADC浓度下降低。
使用其中用来源于已被分子工程化以在细胞表面上表达PD-L1的4T1乳腺癌细胞(“4T1hPD-L1”)的肿瘤移植动物(Balb/c小鼠)的4T1同基因乳腺癌小鼠模型，或其中用来源于不在细胞表面上天然表达PD-L1的未转染的4T1乳腺癌细胞(“4T1”)的肿瘤移植Balb/c小鼠的4T1同基因乳腺癌小鼠模型。在MD Anderson的动物使用与关爱委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准的指南下进行所有使用BALB/c小鼠(6至8周龄雌性；Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine,USA)的操作。根据每组中的平均肿瘤体积划分小鼠。将4T1细胞(与25μL基质胶基底膜基质(Matrixgel Basement Membrane Matrix)[BD Biosciences,San Jose,CA,USA]混合的25μL培养基中的1x 105个细胞)注射到乳腺脂肪垫中。在小鼠的肿瘤细胞接种后第3天、第5天、第7天、第9天、第11天和第13天腹膜内注射IgG-MMAE对照(100μg)、STM108 MAb(100μg)或STM108-ADC(150μg)。用卡尺每3天测量肿瘤，并使用以下公式计算肿瘤体积：π/6x长度x宽度2。
如图10D中所观察到的，在荷有几乎没有或没有细胞表面PD-L1表达的4T1来源的肿瘤的动物中(空心圆/虚线)，结果显示对所有治疗类型，即IgG-MMAE对照、STM108 MAb或STM108-ADC，肿瘤体积随时间增加。在荷有来源于表达PD-L1的4T1细胞的肿瘤并用IgG-MMAE对照处理的动物中，经处理的动物中的肿瘤体积也随时间增加(实心黑色圆圈)。相反，在荷有源自表达PD-L1的4T1细胞的肿瘤并用STM108 MAb(实心蓝色圆圈)或STM108-ADC(实心红色圆圈)处理的动物中，肿瘤体积有效减小。另外，令人惊讶地发现，到约第21天，用STM108-ADC处理的7只动物中有5只(5/7)发生完全缓解(“CR”)。
体内研究强调与包含如上所述的抗-glycICP抗体，例如抗-glycPD-L1 MAb(诸如STM108)的ADC在治疗癌症(例如两种类型的乳腺癌)中的用途相关的有益和有效的抗肿瘤和治疗方面，所述体内研究显示在治疗后25天内，例如到约第15-23天时，已用抗-glycPD-L1 MAb ADC治疗的动物中肿瘤体积显著减少以及肿瘤完全缓解。
根据本公开，可以在没有过度实验的情况下产生和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然已经根据优选实施方案描述了组合物和方法，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可对本文所述的方法以及所述方法的步骤或步骤顺序进行变化而不背离其概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可替代本文所述的试剂，同时可以获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改被认为是在由所附权利要求限定的所述实施方案的精神、范围和概念内。
本文引用的所有专利、公开的专利申请和其他出版物在此通过引用并入本申请中。
序列表
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&lt;150&gt; 62/361,298
&lt;151&gt; 2016-07-12
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Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
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Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
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Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
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Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
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Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
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Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
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Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
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Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
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Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
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Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
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Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
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Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
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Glu Thr
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Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
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Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
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Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
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Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
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Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
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Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
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Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
1 5 10 15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
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Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
35 40 45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
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Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65 70 75 80
Lys Tyr Leu Glu Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
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Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
100 105 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
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Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
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210 215 220
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225 230 235 240
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Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala
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Ser
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Ser Glu Val Glu Tyr Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ala Tyr Leu Pro
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Cys Phe Tyr Thr Pro Ala Ala Pro Gly Asn Leu Val Pro Val Cys Trp
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Gly Lys Gly Ala Cys Pro Val Phe Glu Cys Gly Asn Val Val Leu Arg
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Gly Asp Phe Arg Lys Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Val Thr
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Leu Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Cys Cys Arg Ile Gln Ile Pro Gly Ile
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Arg Met Leu Thr Thr Arg Gly His Gly Pro Ala Glu Thr Gln Thr Leu
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Gly Ser Leu Pro Asp Ile Asn Leu Thr Gln Ile Ser Thr Leu Ala Asn
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Glu Leu Arg Asp Ser Arg Leu Ala Asn Asp Leu Arg Asp Ser Gly Ala
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Thr Ile Arg Val Asp His His His His His His
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&lt;213&gt; 人
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Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala
1 5 10 15
Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly
35 40 45
Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro
85 90 95
Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu
100 105 110
Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala
115 120 125
Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu
130 135 140
Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser
145 150 155 160
Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala
165 170 175
Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg
180 185 190
Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln
195 200 205
Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg
210 215 220
Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu
225 230 235 240
Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val
245 250 255
Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu
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Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr
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Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala
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Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val
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Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly
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Met Ala Val Phe Pro Ser Ser Gly Leu Pro Arg Cys Leu Leu Thr Leu
1 5 10 15
Ile Leu Leu Gln Leu Pro Lys Leu Asp Ser Ala Pro Phe Asp Val Ile
20 25 30
Gly Pro Pro Glu Pro Ile Leu Ala Val Val Gly Glu Asp Ala Lys Leu
35 40 45
Pro Cys Arg Leu Ser Pro Asn Ala Ser Ala Glu His Leu Glu Leu Arg
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Glu Gln Glu Ala Glu Gln Met Pro Glu Tyr Arg Gly Arg Ala Thr
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Leu Val Gln Asp Gly Ile Ala Lys Gly Arg Val Ala Leu Arg Ile Arg
100 105 110
Gly Val Arg Val Ser Asp Asp Gly Glu Tyr Thr Cys Phe Phe Arg Glu
115 120 125
Asp Gly Ser Tyr Glu Glu Ala Leu Val His Leu Lys Val Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Ser Asp Pro His Ile Ser Met Gln Val Gln Glu Asn Gly Glu Ile
145 150 155 160
Cys Leu Glu Cys Thr Ser Val Gly Trp Tyr Pro Glu Pro Gln Val Gln
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Trp Arg Thr Ser Lys Gly Glu Lys Phe Pro Ser Thr Ser Glu Ser Arg
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Asn Pro Asp Glu Glu Gly Leu Phe Thr Val Ala Ala Ser Val Ile Ile
195 200 205
Arg Asp Thr Ser Ala Lys Asn Val Ser Cys Tyr Ile Gln Asn Leu Leu
210 215 220
Leu Gly Gln Glu Lys Lys Val Glu Ile Ser Ile Pro Ala Ser Ser Leu
225 230 235 240
Pro Arg Leu Thr Pro Trp Ile Val Ala Val Ala Val Ile Leu Met Val
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Leu Gly Leu Leu Thr Ile Gly Ser Ile Phe Phe Thr Trp Arg Leu Tyr
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Leu Leu Glu Glu Leu Lys Trp Lys Lys Ala Thr Leu His Ala Val Asp
290 295 300
Val Thr Leu Asp Pro Asp Thr Ala His Pro His Leu Phe Leu Tyr Glu
305 310 315 320
Asp Ser Lys Ser Val Arg Leu Glu Asp Ser Arg Gln Lys Leu Pro Glu
325 330 335
Lys Thr Glu Arg Phe Asp Ser Trp Pro Cys Val Leu Gly Arg Glu Thr
340 345 350
Phe Thr Ser Gly Arg His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly Asp Arg Thr
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Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
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Thr Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu Gln Val Ile Lys Ser Asp
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Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Lys
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325 330 335
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Met Phe Gly Thr Ala Met Ala Phe Ala Pro Ile Pro Arg Ile Thr Trp
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Ile Cys Ser Arg Pro Asp Ser Gly Leu Val Phe Asn Val Leu Arg Asp
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Val Phe Val Leu Arg Pro Arg Ile Ala Arg Val Cys Lys Gly Asp Gln
325 330 335
Gly Gly Leu Arg Thr Leu Gln Lys Lys Trp Thr Ser Phe Leu Gly Glu
340 345 350
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Asp Val Asn Tyr Thr Gln Ile Val Val Asp Arg Thr Gln Ala Leu Asp
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Gly Thr Val Tyr Asp Val Met Phe Val Ser Thr Asp Arg Gly Ala Leu
435 440 445
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850 855 860
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 19
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成寡核苷酸
&lt;400&gt; 9
tcaattgtca tattgctac 19
&lt;210&gt; 10
&lt;211&gt; 19
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成寡核苷酸
&lt;400&gt; 10
ttgactccat ctttcttca 19
&lt;210&gt; 11
&lt;211&gt; 39
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
&lt;400&gt; 11
gtggtagagt atggtagcca aatgacaatt gaatgcaaa 39
&lt;210&gt; 12
&lt;211&gt; 39
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
&lt;400&gt; 12
tttgcattca attgtcattt ggctaccata ctctaccac 39
&lt;210&gt; 13
&lt;211&gt; 37
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
&lt;400&gt; 13
gagaggagaa gcttttccag gtgaccagca cactgag 37
&lt;210&gt; 14
&lt;211&gt; 37
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
&lt;400&gt; 14
ctcagtgtgc tggtcacctg gaaaagcttc tcctctc 37
&lt;210&gt; 15
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&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
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gaccagcaca ctgagaatcc agacaacaac taatgagat 39
&lt;210&gt; 16
&lt;211&gt; 39
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
&lt;400&gt; 16
atctcattag ttgttgtctg gattctcagt gtgctggtc 39
&lt;210&gt; 17
&lt;211&gt; 40
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
&lt;400&gt; 17
gagagaggag aagcttttcc aagtgaccag cacactgaga 40
&lt;210&gt; 18
&lt;211&gt; 40
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成引物
&lt;400&gt; 18
tctcagtgtg ctggtcactt ggaaaagctt ctcctctctc 40
&lt;210&gt; 19
&lt;211&gt; 6
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列
&lt;220&gt;
&lt;223&gt; 人工序列的描述：合成6xHis标签
&lt;400&gt; 19
His His His His His His
1 5

Claims (65)

1.一种鉴定和分离优先结合糖基化免疫检查点蛋白(ICP)抗原的抗体的方法，所述方法包括：
a)筛选与糖基化ICP抗原特异性结合的抗体群；
b)筛选与所述ICP的未糖基化形式的结合比与所述糖基化ICP抗原的结合更弱的特异性结合所述糖基化ICP抗原的抗体；和
c)分离以比对所述ICP的未糖基化形式的亲和力更大的亲和力与所述糖基化ICP结合的抗体。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体群是获自用糖基化ICP抗原或其肽免疫的动物的单克隆抗体，所述肽包含ICP的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个通过附接于聚糖部分而被修饰的糖基化天冬酰胺(N)氨基酸。
3.权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括在所述筛选步骤之前：
a)以在受体动物中引发特异性抗糖基化ICP抗体免疫反应的有效量向所述动物施用糖基化ICP抗原或其肽，所述肽包含ICP的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个通过附接于聚糖部分而修饰的糖基化天冬酰胺(N)氨基酸；
b)从所述动物产生分泌抗体群的杂交瘤群。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述动物是小鼠或大鼠。
5.权利要求2至4中任一项的方法，其中所述动物是针对表达人免疫球蛋白的基因的转基因动物。
6.权利要求1的方法，其中所述抗体群是噬菌体展示抗体文库。
7.权利要求6的方法，其中所述噬菌体抗体文库是人抗体所有组成成分的文库。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中测试所述抗体与所述糖基化ICP抗原的结合，其Kd小于由所述抗体与所述ICP抗原的非糖基化形式的结合所展示的Kd的一半。
9.权利要求8的方法，其中测试所述抗体与所述糖基化ICP抗原的结合，其中结合的Kd为由所述抗体与所述ICP抗原的非糖基化形式的结合所展示的Kd的至多1/5。
10.权利要求9的方法，其中测试所述抗体与所述糖基化ICP抗原的结合，其中Kd小于由所述抗体与所述ICP抗原的非糖基化形式的结合所展示的Kd的一半。
11.权利要求1至7中任一项的方法，其中测试所述抗体与所述糖基化ICP抗原的结合，其中表达所述糖基化ICP抗原的结合细胞的测量的荧光强度(MFI)值为由所述抗体与表达所述ICP抗原的未糖基化形式的细胞的结合所展示的MFI值的至少2倍至20倍，其中所述抗体直接或间接用荧光标记物标记。
12.权利要求11的方法，其中测试所述抗体与所述糖基化ICP抗原的结合，其中结合糖基化ICP抗原的MFI值为由所述抗体与所述ICP抗原的未糖基化形式的结合所展示的MFI值的至少3倍至至少5倍。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述糖基化ICP抗原或其肽在肿瘤或癌细胞上表达，并且所述ICP配体在免疫细胞上表达。
14.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述糖基化ICP抗原或其肽在免疫细胞上表达，并且所述ICP配体在肿瘤或癌细胞上表达。
15.权利要求13或14所述的方法，其中所述免疫细胞是效应T细胞或天然杀伤细胞(NK细胞)。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述ICP是人ICP。
17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中所述糖基化ICP抗原选自由以下组成的组：CD47、CD96、TIM-3、LAG-3、CEACAM1、BTN1A1、脑信号蛋白4D、嗜乳脂蛋白样2(BTNL2)、BTLA、PD-1和PD-L1。
18.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是PD-L1。
19.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是PD-1。
20.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是CD47。
21.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是CD96。
22.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是TIM-3。
23.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是LAG-3。
24.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是CEACAM1。
25.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是BTN1A1。
26.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是脑信号蛋白4D。
27.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是BTNL2。
28.权利要求17的方法，其中所述糖基化ICP是BTLA。
29.权利要求1至28中任一项的方法，其中步骤(a)和/或步骤(b)中的筛选是通过流式细胞术分析。
30.权利要求1至29中任一项的方法，其还包括测试所述抗体抑制所述ICP与其同源ICP结合伴侣的结合。
31.权利要求1至30中任一项的方法，其还包括鉴定包含所述抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸和将所述CDR周围的氨基酸序列人源化以产生人源化抗体。
32.根据权利要求31所述的方法，其还包括重组表达所述人源化抗体。
33.权利要求2至32中任一项的方法，其中所述人糖基化ICP抗原是包含人PD-L1的至少7个连续氨基酸的片段的分离的多肽，所述多肽包含对应于人PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的至少一个氨基酸，其中对应于PD-L1的位置N35、N192、N200或N219的氨基酸中的至少一个被糖基化。
34.权利要求13的方法，其中所述分离的多肽包含人PD-L1的至少8-20个连续氨基酸。
35.权利要求33或34的方法，其中所述分离的多肽在其氨基或羧基末端与免疫原性多肽融合或缀合。
36.权利要求2至32中任一项的方法，其中所述人糖基化ICP抗原是包含人PD-1的至少7个连续氨基酸的片段的分离的多肽，所述多肽包含对应于人PD-1的位置N49、N58、N74和/或N116的至少一个氨基酸，其中对应于PD-1的位置N49、N58、N74和/或N116的氨基酸中的至少一个被糖基化。
37.权利要求36的方法，其中所述分离的多肽包含人PD-1的至少8-20个连续氨基酸。
38.权利要求36或37的方法，其中所述分离的多肽在其氨基或羧基末端与免疫原性多肽融合或缀合。
39.权利要求1至38中任一项的方法，其还包括将含有第二抗体的抗原结合结构域的scFv连接于所述抗体的重链和/或轻链的N末端，所述第二抗体结合不与所述抗体的表位重叠的所述人糖基化ICP的表位。
40.根据权利要求1至39中任一项的方法分离的分离的抗体。
41.权利要求40的分离的抗体，其是抗糖基化PD-L1抗体。
42.权利要求40的分离的抗体，其是抗糖基化PD-1抗体。
43.权利要求40-42中任一项的分离的抗体，其中所述抗体是人源化抗体或人抗体。
44.权利要求40-43中任一项的分离的抗体，其是重组抗体。
45.权利要求40-44中任一项的分离的抗体，其是选自IgM、IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4的同种型。
46.权利要求39-45中任一项的分离的抗体，其中所述抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv、双互补位或单结构域抗体。
47.权利要求40-46中任一项的分离的抗体，其是双特异性或双互补位抗体。
48.权利要求40-47中任一项的分离的抗体，其中所述抗体与成像剂、化学治疗剂、毒素、抗肿瘤剂或放射性核素缀合。
49.权利要求48的分离的抗体，其中所述抗体与抗肿瘤剂缀合以产生抗体-药物缀合物(ADC)。
50.权利要求49的分离的抗体，其中所述抗肿瘤剂是抑制微管蛋白聚合的药剂。
51.权利要求50的分离的抗体，其中所述药是美登木素生物碱或奥瑞斯他汀。
52.权利要求51的分离的抗体，其中美登木素生物碱是DM1(N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美坦辛)或DM4(N2'-脱乙酰基-n2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-6-甲基美坦辛。
53.权利要求50的分离的抗体，其中所述奥瑞斯他汀是单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)或单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)。
54.权利要求53的分离的抗体，其中所述奥瑞斯他汀是MMAE。
55.权利要求54的分离的抗体，其中所述抗体与马来酰亚胺和己酸(MC)附接基团化学缀合，所述附接基团与组织蛋白酶可切割的接头化学缀合，所述接头与对氨基苯甲酸(PAB)间隔子化学缀合，所述对氨基苯甲酸间隔子与MMAE化学缀合，从而形成所述ADC。
56.权利要求55的分离的抗体，其中所述组织蛋白酶可切割的接头是缬氨酸-瓜氨酸(vc)。
57.一种包含内化到细胞中的抗glycICP抗体的ADC，所述抗体与细胞毒性药物化学偶联。
58.权利要求57的ADC，其中所述细胞毒性药物是抑制微管蛋白聚合的药剂。
59.权利要求58的ADC，其中所述药剂是美登木素生物碱或奥瑞斯他汀。
60.权利要求59的ADC，其中所述美登木素生物碱是DM1或DM4。
61.权利要求59的ADC，其中所述奥瑞斯他汀是MMAE或MMAF。
62.权利要求61的ADC，其中所述奥瑞斯他汀是MMAE。
63.权利要求57的ADC，其中所述抗体与MC附接基团化学缀合，所述MC附接基团与组织蛋白酶可切割的接头化学缀合，所述接头与PAB间隔子化学缀合，所述PAB间隔子与MMAE化学缀合，从而形成所述ADC。
64.权利要求63的ADC，其中所述组织蛋白酶可切割的接头是缬氨酸-瓜氨酸(vc)。
65.一种包含通过可切割的接头与MMAE化学偶联的抗glycICP抗体的ADC。
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