CN102321923A

CN102321923A - 肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法

Info

Publication number: CN102321923A
Application number: CN201110143174A
Authority: CN
Inventors: 周大鹏; 卡特亚.迈克尔; 努哈得.依布拉海穆; 许化溪; 依戈尔.阿尔梅达; 李云森
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-05-30
Also published as: CN102321923B

Abstract

本发明涉及一种肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法。该方法是先根据粘蛋白的氨基酸序列，推测可能出现的所有肿瘤糖肽序列；然后用粘蛋白基因转染肿瘤细胞，得到用于免疫小鼠制备单克隆抗体的免疫原；再用化学合成的方法合成上述推测出的所有糖肽，并分别用生物素标记，得到筛选单克隆抗体的生物素标记的糖肽；最后用上述的免疫原免疫小鼠，制备杂交瘤，然后用上述生物素标记的糖肽筛选杂交瘤，挑选出针对各个特定糖肽结构的单克隆抗体。本发明首次提出用免疫糖组学方法，推测了高度糖基化的串联重复多肽片段在癌变时所有可能产生的抗原决定部位。用化学合成的方法得到这些糖肽抗原；然后用合成的糖肽来“钓取”单克隆抗体。

Description

肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程和免疫学领域，具体涉及一种肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法。

背景技术

粘蛋白（ＭＵＣＩＮ）是上皮细胞表达的1型糖蛋白，在细胞表面高表达，并且高度分泌。粘蛋白家族有MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, 和 MUC20 十九个成员。它们的功能是保护消化道，呼吸道，生殖道的上皮细胞，并调控上皮细胞的细胞通讯和信号传导。

粘蛋白的结构由细胞内区域，跨细胞膜区域，细胞外区域构成。细胞外区域可以被蛋白酶水解而分泌到血液循环中。细胞外区域包括高度糖基化的串联重复多肽片段。每个多肽片段包括10 到 80 个氨基酸。每个多肽含5个以上Ｏ－糖基化位点。在正常细胞中，这些Ｏ－糖基化位点被一系列糖基转移酶依次修饰，形成复杂的糖复合物结构。在细胞癌变时，Ｏ－糖基化发生障碍，形成Ｔn 抗原，即Ｏ－糖基化位点只有一个糖修饰（图 1）。这个糖是 N-乙酰半乳糖。 N-乙酰半乳糖就是Ｔn 抗原。它有很弱的抗原性, 但是Ｔn 抗原和它所连接的多肽却能形成非常强的抗原性。针对癌变细胞异常糖化的抗体已在临床上广泛使用，如ＣＡ15.3 (1), 和 CA125 (2)。这些抗体是单克隆抗体，通过用癌细胞粘蛋白免疫动物而制备。但是这些单克隆抗体具体的识别位点并不清楚。这是已有方法的第一个不足之处。

已有抗体的第二个不足之处是一个单克隆抗体只能识别一个带有Ｔn 抗原的糖肽，而粘蛋白的每一个串联重复多肽，可以有数十种带有Ｔn 抗原的糖肽抗原。如图 2 所示，ＭＵＣ1 蛋白的串联重复多肽，可能有31 种糖肽抗原。单一的单克隆抗体，在识别癌变的粘蛋白时，会有零敏度的限制，而且可能遗漏一些重要糖肽抗原。

针对上述缺陷，我们发明了根据免疫糖组学原理的针对肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是：1）怎样才能对粘蛋白的复杂的糖肽序列，进行系统学的糖组学研究，2）怎样才能制备一套完整的抗体库，达到对癌变粘蛋白糖肽的识别。

本发明的技术方案，针对肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1：根据粘蛋白的氨基酸序列，推测可能出现的所有肿瘤糖肽序列；

步骤2：免疫原的制备：用粘蛋白基因转染肿瘤细胞Jurkat，得到用于免疫小鼠制备单克隆抗体的免疫原；

步骤3：用化学合成的方法合成步骤1中推测出的所有糖肽，并分别用生物素标记，得到筛选单克隆抗体的生物素标记的糖肽；

步骤4：单克隆抗体库的制备，用步骤2的免疫原免疫小鼠，制备杂交瘤，然后用步骤3中生物素标记的糖肽筛选杂交瘤，挑选出针对各个特定糖肽结构的单克隆抗体。

上述方案中的所述的粘蛋白是MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19或（和） MUC20。

当所述的粘蛋白是MUC1时，具体步骤为：

步骤1：根据MUC1的氨基酸序列，推测出可能出现的31个肿瘤糖肽序列；

步骤2：免疫原的制备：用MUC1基因转染肿瘤细胞Jurkat，得到用于免疫小鼠制备单克隆抗体的免疫原；

步骤3：用化学合成的方法合成步骤1中推测出的31个糖肽，并分别用生物素标记，得到31个筛选单克隆抗体的生物素标记的糖肽；

步骤4：单克隆抗体库的制备，用步骤2的免疫原免疫小鼠，制备杂交瘤，然后分别用步骤3中的31个生物素标记的糖肽筛选杂交瘤，挑选出针对各个特定糖肽结构的单克隆抗体。

本发明的优点：

1）在免疫原的设计上，本发明建立了表达ＭＵＣＩＮ的肿瘤细胞系，直接用肿瘤细胞表面表达的ＭＵＣＩＮ免疫动物。这一设计优于用ＭＵＣＩＮ蛋白或合成ＭＵＣＩＮ糖肽作为免疫原，因为蛋白和多肽在三维构象上会有别于细胞表面的天然构象。

2）在探索癌变粘蛋白的抗原决定部位的历史上，本发明首次提出用免疫糖组学方法，推测了高度糖基化的串联重复多肽片段在癌变时所有可能产生的抗原决定部位。采用化学合成的方法，得到这些糖肽抗原。然后用合成的糖肽作为“鱼饵“来“钓取“单克隆抗体。

附图说明

图1为肿瘤细胞表达癌变的粘蛋白。Ａ，正常细胞表达的粘蛋白有完整的糖复合物修饰；Ｂ，癌变细胞糖链合成障碍，在加上一个糖（Ｎ－乙酰氨基半乳糖）后中止。这一个糖称为Ｔn 抗原。

图2为用免疫糖组学方法推测的ＭＵＣ1的可能出现的所有糖肽的类型。

图3为化学合成的ＭＵＣ1的 31 个糖肽序列中的15个，以及未糖化的2 个对照肽。

图4为化学合成的ＭＵＣ1的 31 个糖肽序列中的另16个。

图5为化学合成ＭＵＣ1的糖肽（以糖肽3为代表）的工艺路线图。

图6为单克隆抗体 Clone 16对糖肽的特异性亲和力的检测： 2 μg/ml 糖肽 (以图4中糖肽2 u为代表) 经生物素偶联后，结合到铺有链菌素（1.5 μg/ml) 的 96 孔板上。将系列稀释的 Clone 16 抗体蛋白（蛋白浓度如图6所示）与糖肽结合后，用羊抗小鼠的二抗检测。二抗带有辣根过氧化物酶，用ＤＡＢ试剂盒检测。结果显示，该抗体（Clone 16) 对糖肽2 有高度的特异性亲和力，在10 ng/ml 的抗体浓度下，仍有OD为2.0的吸收。而对照肽 (肽1, n）的抗体的特异性亲和力很低，在10 ng/ml 的抗体浓度下，没有OD吸收。肽1 与肽2 的唯一差别是肽1没有糖基。

图7为抗体与表达ＭＵＣ1 的癌变糖蛋白的结合：用Western 印迹法检测了单克隆抗体与细胞膜表面 (MUC1 转染的Jurkat 细胞)，以及乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ的分泌液中的ＭＵＣ1 (文献4)。 Western 印迹法表明，该抗体不但与转染ＭＵＣ1的细胞膜蛋白反应，而且能识别乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ的分泌液中的ＭＵＣ1 (图7)。MUC1 转染的Jurkat 细胞表达的ＭＵＣ1的分子量在120 kDa 左右，而乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ的分泌液中的ＭＵＣ1 的分子量在240 kDa 左右。这可能与两个不同的肿瘤细胞系的其他翻译后修饰加工的不同有关。或着我们用 RT-PCR 技术克隆到的ＭＵＣ1是乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ表达的ＭＵＣ1 的一个基因剪切变异体（splicing variant)。

具体实施方式

实施例一：肿瘤粘蛋白ＭＵＣ1糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备

（1）根据ＭＵＣ1 的氨基酸序列（图2），用排列组合的数学方法，推断出在肿瘤发生时所有可能出现的ＭＵＣ1 的糖肽序列。每个ＭＵＣ1串联重复序列包括20个氨基酸。每个重复序列有5个可以被糖基化修饰的位点。这样，从理论上我们可以推断出可能存在的糖肽结构。带有1个糖的有5种，2个糖的10种，3个糖的10种，4个糖的5种，5个糖的1种。共计31种糖肽可以被31个不同的抗体识别。

（2）免疫原的制备：为了研究肿瘤细胞表面的粘蛋白，我们设计了一个独特的免疫原。我们选用了一个表达Ｔn 抗原的肿瘤细胞Jurkat (A Mutant Chaperone Converts a Wild-Type Protein into a Tumor-Specific Antigen ，Andrea Schietinger, et al. Science 314, 304 (2006)，来源于美国安得森癌症研究中心周大鹏研究组)，在这个细胞的基础上，我们转染了ＭＵＣＩＮ基因，以ＭＵＣ1 为例。

我们转染了一个含有ＭＵＣ1 的串联重复多肽片段的cＤＮＡ（SEQ ID NO：1）。首先根据文献4 （A transcribed gene, containing a variable number of tandem repeats,codes for a human epithelial tumor antigen cDNA cloning, expression of the transfected gene and over-expression in breast cancer tissue，Eur. J. Biochem. 189, 475-486 (1990)）用ＰＣＲ克隆了含有ＭＵＣ1 的串联重复多肽片段的cＤＮＡ。根据文献4 发表的基因 X52228 (GenBank: X52228.1) 设计引物，5’atgacaccgggcacccagtctcct3’和 5’tcaggggagcatggggaaggaaaag’, 以文献4 中介绍的乳腺癌细胞株 T47D 的 cDNA 为模版进行PCR 扩增。T47D 由美国安得森癌症研究中心周大鹏研究组提供。cDNA 的制备和PCR 用RT-PCR试剂盒完成 (Invitrogen)。PCR 的条件是，95°C, 2 minutes, (95°C, 30 seconds, 55°C 30 seconds, 72°C, 45 seconds) x 35 cylces。基因用ＰＣＲ技术克隆后，构建于pcDNA-IRES-eGFP （Invitrogen）质粒中，用于转染 Jurkat 细胞系，并通过Ｇ418 筛选达到稳定表达，经细胞分拣技术得到 eＧＦＰ高表达，ＭＵＣＩＮ高表达的细胞株。这一步骤得到了用于免疫小鼠制备单克隆抗体的一个独特的免疫原，即稳定表达 MUC1 串联重复多肽片段的 Jurkat 细胞。这个细胞的表面表达了只有肿瘤细胞才表达的，被 GalNAc 糖基（即 Tn 抗原）修饰的，MUC1 抗原决定部位。

（3）靶糖肽的制备：为了筛选单克隆抗体，我们采用化学合成的方法，制备了ＭＵＣ1 串联重复多肽的31个糖肽2 个对照不含糖基的多肽，图3-4 是含1个Ｔn 抗原， 2 个Ｔn 抗原，3 个Ｔn 抗原， 4 个Ｔn 抗原，5 个Ｔn 抗原的全部糖肽的序列，共31 个糖肽和 2 个对照不含糖基的多肽。图5是制备生物素标记的糖肽（以糖肽3为代表）的实验路线。按照同样试验路线，可制备31个生物素标记的糖肽。

（4）单克隆抗体的制备

小鼠免疫：用表达异常糖基化的（带GalNAc糖基，即 Tn 抗原的ＭＵＣ1的Jurkat 癌细胞免疫了Ｃ57Ｂ6系小鼠。10⁷ 癌细胞经放射杀伤（3000 Ｇy，20 分钟）后，悬浮于 200 μl 的ＰＢＳ中，从尾静脉注射。第一次注射后，每隔 2 星期用同样方法加强免疫。

抗糖肽抗体的ＥＬＩＳＡ检测：糖肽 (以图3中糖肽2 为代表)经生物素偶联后，结合到铺有链菌素96 孔板上。小鼠经免疫后，采尾静脉血。血清与糖肽结合后，用羊抗小鼠的二抗检测。二抗带有辣根过氧化物酶，用ＤＡＢ试剂盒检测。结果显示有的小鼠产生了高滴度的抗糖肽2 的ＩgＧ抗体，而同个小鼠抗对照肽（肽1）的抗体的滴度很低。这些小鼠被选用制备单克隆抗体。

单克隆抗体的制备：小鼠免疫4次后，血清抗小鼠抗糖肽2 的滴度达到1：4000 以上。采取小鼠脾细胞，与 Sp2/0-Ag14 细胞（来源于美国安得森癌症研究中心， Nature 276: 269-270, 1978. ）融合。杂交瘤分为10块96孔培养板。杂交瘤的上清液用ＥＬＩＳＡ筛选。筛选发现一个克隆高度阳性，ＥＬＩＳＡ检测的滴度大于 1：2000，命名为(克隆16（Clone 16）。

实施例二：

单克隆抗体 Clone 16 的纯化制备：杂交瘤接种于裸鼠腹腔，10天后搜集腹水，用 Protein A sepharose (Sigma, 2 ml) 亲和层析柱进行纯化。纯化后的抗体经 SDS-PAGE 验证除IgG 的重链和轻链外，无其他蛋白条带。

为单克隆抗体 Clone 16对糖肽的特异性亲和力的检测： 2 μg/ml 糖肽 (以图3中糖肽2 u为代表) 经生物素偶联后，结合到铺有链菌素（1.5 μg/ml) 的 96 孔板上。将系列稀释的 Clone 16 抗体蛋白（蛋白浓度如图6所示）与糖肽结合后，用羊抗小鼠的二抗检测。二抗带有辣根过氧化物酶，用ＤＡＢ试剂盒检测。结果显示，该抗体（Clone 16) 对糖肽2 有高度的特异性亲和力，在10 ng/ml 的抗体浓度下，仍有OD为2.0的吸收。而对照肽 (肽1, n）的抗体的特异性亲和力很低，在10 ng/ml 的抗体浓度下，没有OD吸收。肽1 与肽2 的唯一差别是肽1没有糖基。

抗体与表达ＭＵＣ1 的癌变糖蛋白的结合：用Western 印迹法检测了单克隆抗体与细胞膜表面 (MUC1 转染的Jurkat 细胞)，以及乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ的分泌液中的ＭＵＣ1 (文献4)。 Western 印迹法表明，该抗体不但与转染ＭＵＣ1的细胞膜蛋白反应，而且能识别乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ的分泌液中的ＭＵＣ1 (图7)。MUC1 转染的Jurkat 细胞表达的ＭＵＣ1的分子量在120 kDa 左右，而乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ的分泌液中的ＭＵＣ1 的分子量在240 kDa 左右。这可能与两个不同的肿瘤细胞系的其他翻译后修饰加工的不同有关。或着我们用 RT-PCR 技术克隆到的ＭＵＣ1是乳腺癌细胞Ｔ47Ｄ表达的ＭＵＣ1 的一个基因剪切变异体（splicing variant)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏大学

大鹏, 周

<120> 肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1044

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacaccgg gcacccagtc tcctttcttc ctgctgctgc tcctcacagt gcttacagtt 60

gttacaggtt ctggtcatgc aagctctacc ccaggtggag aaaaggagac ttcggctacc 120

cagagaagtt cagtgcccag ctctactgag aagaatgctg tgagtatgac cagcagcgta 180

ctctccagcc acagccccgg ttcaggctcc tccaccactc agggacagga tgtcactctg 240

gccccggcca cggaaccagc ttcaggttca gctgccacct ggggacagga tgtcacctcg 300

gtcccagtca ccaggccagc cctgggctcc accaccccgc cagcccacga tgtcacctca 360

gccccggaca acaagccagc cccgggctcc accgcccccc cagcccacgg tgtcacctcg 420

gccccggaca ccaggccgcc cccgggctcc accgcccccc cagcccacgg tgtcacctcg 480

gccccggaca ccaggccgcc cccgggctcc accgcgcccg cagcccacgg tgtcacctcg 540

gccccggaca ccaggccggc cccgggctcc accgcccccc cagcccatgg tgtcacctcg 600

gccccggaca acaggcccgc cttgggctcc accgcccctc cagtccacaa tgtcacctcg 660

gcctcaggct ctgcatcagg ctcagcttct actctggtgc acaacggcac ctctgccagg 720

gctaccacaa ccccagccag caagagcact ccattctcaa ttcccagcca ccactctgat 780

actcctacca cccttgccag ccatagcacc aagactgatg ccagtagcac tcaccatagc 840

acggtacctc ctctcacctc ctccaatcac agcacttctc cccagttgtc tactggggtc 900

tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca aacctccagt ttaattcctc tctggaagat 960

cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgaaatggt gagtatcggc 1020

ctttccttcc ccatgctccc ctga 1044

Claims

1.一种肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法，其特征在于，所述的粘蛋白是MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19或/和 MUC20。

3.根据权利要求2所述的肿瘤粘蛋白糖肽抗原决定部位的单克隆抗体库的制备方法，其特征在于，所述的粘蛋白是MUC1。