CN111741772A - 靶向muc16的癌症疫苗和其用途 - Google Patents

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Abstract

本文公开了包含一种或多种核酸序列的核酸分子，所述核酸序列编码经修饰的共同MUC16抗原。公开了包含一种或多种核酸序列的载体、组合物和疫苗，所述核酸序列编码经修饰的共同MUC16抗原。公开了治疗患有表达MUC16的肿瘤的受试者的方法和预防表达MUC16的肿瘤的方法。公开了经修饰的共同MUC16抗原。

Description

靶向MUC16的癌症疫苗和其用途
相关申请的交叉参照
本申请要求2017年12月13日所提交的美国临时专利申请第62/598,314号和2017年12月15日所提交的美国临时专利申请第62/599,513号的优先权和权益，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式以电子方式提交且以全文引用的方式并入本文。所述ASCII副本于2018年12月12日创建，命名为104409_000446_sequence_listing.txt并且大小为54,027个字节。
技术领域
本发明涉及MUC16抗原和编码所述抗原的核酸分子。本发明还涉及包含MUC16抗原和/或核酸分子的疫苗。本发明进一步涉及使用疫苗来诱导免疫响应和预防和/或治疗患有表达MUC16的癌细胞的受试者的方法。
背景技术
癌症在美国和全世界仍然是死亡的主要原因。癌症疫苗市场正在快速增长。有效的肿瘤疫苗可以适用于预防肿瘤生长和/或可以适用作晚期癌症患者的更有效、毒性更小的标准疗法替代方案。与癌症有关的抗原是MUC16，且因此，抗肿瘤疫苗的靶标是MUC16。
MUC16是高分子量糖蛋白的粘蛋
白家族成员。粘蛋白由呼吸道、胃肠道和生殖道各种器官的内腔表面周围的特殊化上皮细胞表达。MUC16在上皮完整性的维持和上皮表面的润滑和保护方面具有直接和间接的作用。
MUC16的串联重复域含有重复的肽抗原决定基CA125，其已经变成在卵巢癌的整个诊断和治疗期间出现的多种临床情形的金标准生物标志物，所述临床情形包括：1)根据早期检测进行筛选；2)对出现盆腔肿块的绝经前和绝经后女性的良性和恶性疾病进行区分；以及3)监测对治疗的响应。另外，功能研究已经表明MUC16造成卵巢瘤的转化和转移。
MUC16由于在大部分卵巢癌中高度表达以及其增强肿瘤发生的推定作用，因此是一种诱人的癌症治疗疫苗靶标。然而，抗原设计受到以下影响：其大尺寸、复杂糖基化谱和健康上皮组织中的表达。
用于治疗和预防癌症的疫苗受到很大关注。靶向肿瘤细胞抗原的现有疫苗通常受到体内抗原表达不良的限制。因此，所属领域中仍需要研发出适用于表达MUC16的肿瘤的安全有效疫苗，借此治疗罹患此类癌症的受试者以及促进其存活。
发明内容
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQID NO:1的核苷酸55-4470；(b)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:2的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:1；(b)在SEQ ID NO:1的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:1至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:1至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQID NO:3的核苷酸55-1926；(b)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:4的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:4的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:3；(b)在SEQ ID NO:3的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:3至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:3至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:3中所示的核酸序列。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQID NO:5的核苷酸55-2130；(b)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:6的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:6的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:5；(b)在SEQ ID NO:5的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:5至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:5至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023；(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQID NO:7的核苷酸55-4023；(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:8的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:8的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:7；(b)在SEQ ID NO:7的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:7至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:7中所示的核酸序列。
可以将本文所述的一种或多种核酸分子并入载体中，例如质粒或病毒载体。可以将本文所述的一种或多种核酸分子并入载体中，例如质粒或病毒载体。在一些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ IDNO:2的氨基酸19-1490的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ IDNO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在某些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470；(b)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在其它实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQID NO:2的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:2的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在仍另外的实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:1；(b)在SEQ ID NO:1的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:1至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:1至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。
在其它实施例中，所述载体包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在某些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQ IDNO:3的核苷酸55-1926；(b)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQID NO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:4的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:4的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在其它实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:3；(b)在SEQ ID NO:3的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:3至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:3至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:3中所示的核酸序列。
在一些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在某些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130；(b)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在其它实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:6的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:6的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在仍另外的实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:5；(b)在SEQ ID NO:5的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:5至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:5至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
在其它实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在某些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023；(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在其它实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质非核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在某些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023；(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO:8的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:8的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，所述载体包含含有一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列的核酸分子：(a)SEQ ID NO:7；(b)在SEQ ID NO:7的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:7至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQID NO:7中所示的核酸序列。
在一些实施例中，本文所述的核酸可操作地连接到调控元件。在一些实施例中，调控元件是启动子和/或聚腺苷酸化信号。在其它实施例中，启动子是人细胞巨大病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)。在仍另外的实施例中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。
本文还提供了包含一种或多种如本文所述的核酸分子的组合物。在一些实施例中，所述组合物包含药学上可接受的载体。
另外提供了MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:2的氨基酸19-1490；(b)在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
另外提供MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:2；(b)在SEQ ID NO:2的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
另外提供了MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:4的氨基酸19-642；(b)在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
另外提供MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:4；(b)在SEQ ID NO:4的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:4至少95％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:4至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
另外提供了MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:6的氨基酸19-710；(b)在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
另外提供MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:6；(b)在SEQ ID NO:6的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:6至少95％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:6至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
另外提供了MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:8的氨基酸19-642和650-1341；(b)在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
另外提供了MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:8的氨基酸19-1341；(b)在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
另外提供MUC16抗原蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQID NO:8；(b)在SEQ ID NO:8的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:8至少95％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:8至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:1编码。
还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:3编码。
还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:5编码。
还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:7编码。
另外提供包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。本文另外公开了包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码MUC16抗原，所述抗原包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性。
另外提供包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。本文另外公开了包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码MUC16抗原，所述抗原包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性。
另外提供包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:5中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。本文另外公开了包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码MUC16抗原，所述抗原包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性。
另外提供包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:7中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。本文另外公开了包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码MUC16抗原，所述抗原包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性。
在一些实施例中，核酸分子可以包含表达载体。疫苗可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，疫苗可以进一步包含佐剂。在某些实施例中，佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
本文还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:1编码。
另外提供包含肽的疫苗，其中所述肽包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性。
本文还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:3编码。
另外提供包含肽的疫苗，其中所述肽包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:4中所示氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性。
本文还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:5编码。
另外提供包含肽的疫苗，其中所述肽包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:6中所示氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性。
本文还提供了包含MUC16抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原由SEQ ID NO:7编码。
另外提供包含肽的疫苗，其中所述肽包含的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性。
另外提供了治疗患有表达MUC16的癌细胞的受试者的方法，包含施用治疗有效量的本文所述疫苗。在一些实施例中，施用包括电穿孔步骤。在其它实施例中，施用发生于受试者的一个或多个部位。
还提供了向受试者接种针对表达MUC16的癌细胞的疫苗的方法。在一些实施例中，施用包括电穿孔步骤。在其它实施例中，施用发生于受试者的一个或多个部位。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ IDNO:2的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:4的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ IDNO:4的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:6的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ IDNO:6的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:8核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:8的全长中占至少90％；(c)编码与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
在一些实施例中，本文所述的核酸分子用作治疗癌症的药剂。在一些实施例中，本文所述的核酸分子用于制备药剂。在一些实施例中，本文所述的核酸分子用于制备供治疗癌症用的药剂。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:1；(b)在SEQ ID NO:1的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ IDNO:1至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:1至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:3；(b)在SEQ ID NO:3的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ IDNO:3至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:3至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:5；(b)在SEQ ID NO:5的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ IDNO:5至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:5至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
本文还提供了用作药剂的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:7；(b)在SEQ ID NO:7的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ IDNO:7至少95％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，本文所述的核酸分子用作治疗癌症的药剂。在一些实施例中，本文所述的核酸分子用于制备药剂。在一些实施例中，本文所述的核酸分子用于制备供治疗癌症用的药剂。
附图说明
图1说明人原生MUC16结构。MUC16疫苗构建体所靶向的区域被指出。
图2描绘了人原生MUC16中心串联重复的谱系学分析。
图3说明衍生出各MUC16重复微共同序列(RMC)的个别原生MUC16重复序列以及其彼此间的序列一致性百分比(基因库：AAL65133.2)。
图4显示了MUC16羧基端域的氨基酸序列。加有下划线的区域(NFSPLARRVDR)是潜在的裂解位点，粗体加下划线的区域是跨膜域，并且细胞质尾区用双下划线指示。跨膜域上游未说明的序列是细胞外胞外域。方框表示潜在的S/T/Y磷酸化位点。N-糖基化位点和O-糖基化位点分别用X和O指示。
图5说明经修饰的共同MUC16胞外域和跨膜域与人原生MUC16胞外域和跨膜域的比对。共同变化加有灰色阴影。
图6A-6B说明了用于组装RMC、原生重复序列以及合成共同MUC16胞外域和跨膜域以减小脱靶抗原决定基的可能性的策略。图6A显示了如何通过合并中心串联重复和羧基端域设计策略来产生初步合成的MUC16免疫原。然而，当将RMC4-R61接合点(RMC4的最后11个氨基酸和原生R61的前11个氨基酸)与所有原生MUC16重复接合点(相邻原生重复序列的最后11个氨基酸和起始11个氨基酸)对准时，最高序列一致性仅仅是76.2％，表明这个接合点可能引入了非所需的抗原决定基。图6B显示了用于避免RMC4-R61接合点的一种策略是将原生R59添加于RMC4与R61之间。
图7是由质粒pGX1435、pGX1436、pGX1437、pGX1438和pGX1439编码的四种合成共同MUC16免疫原的示意图。
图8A-8C描绘了人原生和合成共同MUC16 IRC中心串联重复域的尺寸评估和比较性建模。图8A是原生MUC16(基于基因库AAL65133.2)和合成共同MUC16 IRC的示意图。图8B显示了比较性建模以说明原生MUC16(左)与合成共同MUC16 IRC设计(右)之间的尺寸差异。图8C是以cpk格式所示的合成共同MUC16 IRC重复区域的比较模型。重复微共同序列RMC1到RMC4以浅灰色指示，所设计的弗林蛋白酶(furin)裂解位点和原生重复序列R61到R63为深灰色。
图9是经修饰的pVAX1主链(pGX0001)的图形表示。
图10是pGX0003主链的图形表示。
图11是质粒pGX1435和合成共同MUC16 IRC+R59的图形表示。
图12是质粒pGX1436和合成共同MUC16 RMC的图形表示。
图13是质粒pGX1437和合成共同MUC16 NRC的图形表示。
图14是质粒pGX1438和合成共同MUC16 RMC和合成共同MUC16 NRC的图形表示。
图15是质粒pGX1439和合成共同MUC16 IRC的图形表示。
图16通过免疫印迹法说明合成共同MUC16构建体的表达。
图17是与本公开的实施例中所用的合成共同MUC16抗原蛋白质对应的肽中所含的肽池的图形表示。
图18A-18D说明了雌性CB6F1隔3周免疫接种指定剂量的合成共同MUC16(pGX1435(图18A)、pGX1438(图18B)和pGX1439(图18C)，n＝8/组)或pGX0001(空白载体，n＝8)3次的IFNγ响应(根据ELISpot)。还指出了对pGX1435所诱导的独特R59(肽池6)抗原决定基的可检测的响应(图18D)。
图19A-19D说明了雌性CB6F1隔3周免疫接种指定剂量的合成共同MUC16(pGX1436(图19A)和pGX1437(图19C)，n＝8/组)或pGX0001(空白载体，n＝8)3次的结果。在指定剂量的pGX1436和pGX1437的情况下，合成共同MUC16特异性IFNγ响应(根据ELISpot)，以及对全长构建体的免疫响应的比较(图19B和图19D)。
图20说明了本公开的实施例中所用的流式细胞术设门策略。
图21A-21C说明了合成共同MUC16全长构建体pGX1435(图21A)、pGX1438(图21B)和pGX1439(图21C)所诱导的CD4+T细胞的相对频率。
图22A-22C说明了合成共同MUC16特异性CD4+T细胞的溶胞潜力以及pGX1435(图22A)、pGX1438(图22B)和pGX1439(图22C)所诱导的细胞因子谱。
图23A-23C说明了pGX1435(图23A)、pGX1438(图23B)和pGX1439(图23C)在CD8+T细胞代谢区中所诱导的细胞免疫响应。
图24A-24C说明了pGX1435(图24A)、pGX1438(图24B)和pGX1439(图24C)在CD8+T细胞代谢区中所诱导的溶胞免疫响应和细胞因子谱。
图25A-25B说明了pGX1436在CD4+T细胞代谢区中所诱导的细胞免疫响应(图25A)以及部分长度的构建体pGX1436的溶胞免疫响应和特异性CD4+T细胞响应谱(图25B)。
图26A-26B说明了pGX1437在CD4+T细胞代谢区中诱导的细胞免疫响应(图26A)以及部分长度的构建体pGX1437的溶胞免疫响应和特异性CD4+T细胞响应谱(图26B)。
图27A-27B说明了pGX1436在CD8+T细胞代谢区中诱导的细胞免疫响应(图27A)以及部分长度构建体的溶胞免疫响应和特异性CD8+T细胞响应谱(图27B)。
图28A-28B说明了pGX1437在CD8+T细胞代谢区中诱导的细胞免疫响应(图28A)以及部分长度构建体的溶胞免疫响应和特异性CD8+T细胞响应谱(图28B)。
图29A-29B说明了pGX1436(图29A)和pGX1437(图29B)在CD4+和CD8+T细胞代谢区中诱导的细胞免疫响应与全长构建体的比较情况以及特异性CD4+和CD8+T细胞响应的细胞因子谱。
图30A-30C提供了本文所公开的全长构建体的IFNγ(图30A)、CD4+(图30B)和CD8+T(图30C)细胞数据的概述。
具体实施方式
本发明涉及包含MUC16抗原的疫苗。MUC16在许多肿瘤中受到表达。因此，所述疫苗对表达MUC16的癌症或肿瘤提供治疗。本发明的疫苗能够针对需要治疗的受试者的癌症的特定预防或治疗来提供特定癌症抗原的任何组合。
一种用于设计重组癌症抗原的核酸和其编码的氨基酸序列的方式是引入突变，从而改变原生癌症抗原的整体氨基酸序列中的特定氨基酸。突变的引入不是使癌症抗原发生太多的改变以致其无法普遍地在哺乳动物受试者(优选人或犬受试者)中施用，而是其变化足以使得所得氨基酸序列中断耐受性或被视为外来抗原以便产生免疫响应。另一种方式可以是产生一种共同重组癌症抗原，其与其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。原生癌症抗原是通常与特定癌症或癌症肿瘤相关的抗原。视癌症抗原而定，癌症抗原的共同序列能够是跨哺乳动物物种的或属于物种亚型内或是跨病毒株或血清型的。一些癌症抗原相对于癌症抗原的野生型氨基酸序列并无太大变化。一些癌症抗原的核酸/氨基酸序列所跨物种如此趋异，以致无法产生共同序列。在这些情况下，产生了将中断耐受性并且产生免疫响应的重组癌症抗原，所述重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有至少85％并且至多99％氨基酸序列一致性；优选至少90％并且至多98％序列一致性；更优选至少93％并且至多98％序列一致性；或甚至更优选至少95％并且至多98％序列一致性。在一些情况下，重组癌症抗原与其对应的原生癌症抗原具有95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性。前述方案能够组合，以便最终重组癌症抗原与原生癌症抗原氨基酸序列具有一定百分比的相似性，如上文所论述。
粘蛋白-16(“MUC16”)抗原可以是部分地来源于不同物种的MUC16序列或一个物种内的不同同功异型物的共同MUC16抗原，并且因此，共同MUC16抗原是非原生的。
MUC16抗原还可以包含一系列重复微共同(RMC)或来源于原生RMC或R序列的原生重复(R)序列。在一些实施例中，提供了核酸构建体，其中两种或更多种RMC和/或R序列彼此通过蛋白分解裂解位点连接。弗林蛋白酶蛋白分解裂解位点是蛋白分解裂解位点的一个实例，其可以使构建体所表达的融合蛋白中的RMC和/或R域连接。
对MUC16抗原的其它修饰可以包括胞外域和跨膜域中的天冬酰胺残基突变以及MUC16抗原N端上游的Kozak和/或IgE前导序列添加。
重组MUC16能够诱导抗原特异性T细胞和/或高效价抗体响应，借此诱导或诱发针对表达所述抗原的癌症或肿瘤的免疫响应或对所述癌症或肿瘤具有反应性的免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫响应可以是细胞、体液免疫响应，或细胞与体液免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫响应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫响应能够减少或抑制一种或多种促进表达所述抗原的肿瘤或癌症生长的免疫抑制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、细胞因子(例如IL-10和TFG-β)、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关纤维母细胞、由免疫抑制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSCs、MCP-1和免疫检查点分子。
所述疫苗可以进一步与抗体组合，直至与检查点抑制剂(例如PD-1和PDL-1)组合，以增加细胞与体液免疫响应的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞响应。总的来说，设计被免疫系统识别的癌症抗原有助于克服肿瘤细胞的其它免疫抑制形式，并且这些疫苗能够与抑制或遏制疗法(例如抗PD-1和抗PDL-1抗体疗法)组合使用以进一步增加T细胞和/或B细胞响应。
定义
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术和科学术语具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有冲突的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入。本文所公开的材料、方法和实例仅具说明性而非旨在限制。本文所用的术语仅为了描述特定实施例的目的，而非旨在限制。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“能够”、“含有”以及其变化形式旨在是开放端过渡短语、术语或词语，其不排除其它行为或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”、“和”以及“所述”包括多个提及物。本公开还涵盖其它实施例，“包含”、“组成为”和“基本上组成为”本文中所展示的实施例或元件，不论是否明确阐述。
本文中叙述数值范围时，明确涵盖每个中间值，所述中间值的精确度与所述范围(最小值和最大值)相同。举例来说，当范围为6-9时，除了6和9外，还涵盖数字7和8；并且当范围为6.0-7.0时，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用，“佐剂”是指为了增强MUC16抗原和/或编码所述抗原的核酸分子的免疫原性而添加到本文所述的疫苗中的任何分子，如本文所述。
如本文所用，“抗体”是指如下类别的抗体：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，或片段，或其衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体和其衍生物。抗体可以是从哺乳动物血清样品中分离出来的抗体、多克隆抗体、亲和力提纯的抗体，或其任何混合物，其对所期望的抗原决定基或由其衍生的序列展现充分的结合特异性。
“MUC16抗原”是指包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490；SEQ ID NO:4的氨基酸19-642；SEQ ID NO:6的氨基酸19-710；SEQ IDNO:8的氨基酸19-642和650-1341；SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；本文所示长度的其片段、变异体，即序列与如本文所示的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6或SEQ ID NO:8具有一致性的蛋白质、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的具有本文所示长度的变异体的片段；本文所示长度的其片段、变异体，即序列与如本文所示的SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8具有一致性的蛋白质、具有本文所示长度的变异体的片段，和其组合。抗原可以任选地包括信号肽，例如来自其它蛋白质的那些肽。
如本文所用，“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸所施用的受试者或哺乳动物的细胞表达。
如本文所用，“补体”或“互补”是指核酸能够可以指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对(例如A-T/U和C G)或胡斯廷(Hoogsteen)碱基对。
如本文所用，“共同”或“共同序列”是指一种多肽序列，其基于不同生物体的相同基因的多个序列的比对分析。能够制备编码共同多肽序列的核酸序列。包含含有共同序列的蛋白质和/或编码此类蛋白质的核酸分子的疫苗能够用于诱导针对抗原的广泛免疫性。
如本文所用，“恒定电流”描述组织或界定所述组织的细胞在电脉冲持续递送到同一组织期间所接收或经历的电流。电脉冲是从本文所述的电穿孔装置中递送。由于本文提供的电穿孔装置具有反馈元件(优选具有瞬时反馈)，因此这种电流在所述组织中以恒定安培数、在电脉冲的寿命期保持。反馈元件能够在脉冲的整个持续期间测量组织(或细胞)的电阻并且促使电穿孔装置改变其电能输出(例如增加电压)，因此，同一组织中的电流在整个电脉冲期间(微秒数量级)以及脉冲间保持恒定。在一些实施例中，反馈元件包括控制器。
如本文所用，“电流反馈”或“反馈”可以互换使用并且可以指所提供的电穿孔装置的主动响应，包含测量电极之间的组织中的电流以及相应地改变EP装置所递送的能量输出以便将电流维持在恒定水平。这种恒定水平是由用户在起始脉冲序列或电治疗之前预设。反馈可以利用电穿孔装置的电穿孔组件(例如控制器)完成，因为其中的电路能够连续地监测电极之间的组织中的电流并且将监测到的那个电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较并且连续地进行能量输出调节以将所监测的电流维持在预设水平。反馈回路因其是模拟闭环反馈而可以是瞬时的。
如本文所用，“分散电流”可以指本文所述的电穿孔装置的多个针电极阵列所递送的电流模式，其中所述模式使正被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关热应激的发生最小化或优选消除。
如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)是指利用跨膜电场脉冲诱导生物膜中产生微观路径(孔隙)；其存在允许生物分子(例如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水)从细胞膜的一侧传送到另一侧。
如本文关于核酸序列所用的“片段”是指编码多肽的核酸序列或其一部分，所述多肽能够在哺乳动物中诱发与本文公开的抗原交叉反应的免疫响应。所述片段可以是选自编码下述蛋白质片段的多种核苷酸序列中的至少一种的核酸分子片段。片段在本文所述的一种或多种核酸序列的全长(不包括所添加的任何异源信号肽)中能够占至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，片段在下述一种或多种核酸序列的全长(不包括所添加的任何异源信号肽)中能够占至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在一些实施例中，片段可以与本文所述的一种或多种核酸序列(不包括任何异源信号肽)至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％一致。在一些实施例中，片段可以与下述一种或多种核酸序列(不包括所添加的任何异源信号肽)至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致。
在其它实施例中，片段可以另外任选地包含编码异源信号肽的序列，当计算一致性百分比时，不包括所述异源信号肽。片段还可以包含信号肽(例如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽)的编码序列。编码N端甲硫氨酸和/或信号肽的编码序列可以连接到编码序列的片段。
在一些实施例中，片段能够包含下述至少一种核酸序列中的至少1700个核苷酸或更多、1750个核苷酸或更多、1800个核苷酸或更多、1850个核苷酸或更多、1900个核苷酸或更多、1950个核苷酸或更多、2000个核苷酸或更多、2050个核苷酸或更多、2100个核苷酸或更多、2150个核苷酸或更多、2200个核苷酸或更多、2250个核苷酸或更多、2300个核苷酸或更多、2350个核苷酸或更多、2400个核苷酸或更多、2450个核苷酸或更多、2500个核苷酸或更多、2550个核苷酸或更多、2600个核苷酸或更多、2650个核苷酸或更多、2700个核苷酸或更多、2750个核苷酸或更多、2800个核苷酸或更多、2850个核苷酸或更多、2900个核苷酸或更多、2950个核苷酸或更多、3000个核苷酸或更多、3050个核苷酸或更多、3100个核苷酸或更多、3150个核苷酸或更多、3200个核苷酸或更多、3250个核苷酸或更多、3300个核苷酸或更多、3350个核苷酸或更多、3400个核苷酸或更多、3450个核苷酸或更多、3500个核苷酸或更多、3550个核苷酸或更多、3600个核苷酸或更多、3650个核苷酸或更多、3700个核苷酸或更多、3750个核苷酸或更多、3800个核苷酸或更多、3850个核苷酸或更多、3900个核苷酸或更多、3950个核苷酸或更多、4000个核苷酸或更多、4050个核苷酸或更多、4100个核苷酸或更多、4150个核苷酸或更多、4200个核苷酸或更多、4250个核苷酸或更多、4300个核苷酸或更多、4350个核苷酸或更多、4400个核苷酸或更多、4450个核苷酸或更多、4500个核苷酸。
关于多肽序列的“片段”或“免疫原性片段”是指一种多肽，其能够在哺乳动物中诱发与本文公开的抗原交叉反应的免疫响应。所述片段可以是选自本文所述的多种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。共同蛋白质的片段在共同蛋白质的全长(不包括所添加的任何异源信号肽)中能够占至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施例中，所述片段在下述一种或多种氨基序列的长度(不包括所添加的任何异源信号肽)中可以占至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在一些实施例中，所述片段可以与本文所述的一种或多种氨基酸序列(不包括任何异源信号肽)至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％一致。在一些实施例中，所述片段可以与下述一种或多种氨基酸序列(不包括所添加的任何异源信号肽)至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致。
在其它实施例中，片段可以另外任选地包含编码异源信号肽的序列，当计算一致性百分比时，不包括所述异源信号肽。片段可以进一步包含信号肽，例如免疫球蛋白信号肽，例如IgE或IgG信号肽。
在一些实施例中，共同蛋白质的片段能够包含本文所公开的蛋白质序列中的550个氨基酸或更多、600个氨基酸或更多、650个氨基酸或更多、700个氨基酸或更多、750个氨基酸或更多、800个氨基酸或更多、850个氨基酸或更多、900个氨基酸或更多、950个氨基酸或更多、1000个氨基酸或更多、1050个氨基酸或更多、1100个氨基酸或更多、1150个氨基酸或更多、1200个氨基酸或更多、1250个氨基酸或更多、1300个氨基酸或更多、1350个氨基酸。
如本文所用，术语“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，所述调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号，能够引导核酸分子所施用的受试者的细胞表达。如本文所用，术语“可表达形式”是指一种基因构建体，其含有可操作地连接到编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于受试者的细胞时，编码序列受到表达。
如本文所用，术语“同源性”是指互补程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，一致性)。使用功能术语“基本上同源”提及部分互补序列，其至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸杂交。当结合双链核酸序列(例如cDNA或基因组克隆)使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针能够与双链核酸序列的链在低严格度的条件下杂交。当结合单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针能够与单链核酸模板序列在低严格度的条件下杂交(即，补体)。
如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的上下文中所用，“一致”或“一致性”是指序列中的指定百分比的残基在指定区域内相同。所述百分比能够如下计算：将两个序列最优地对齐，在指定区域内比较两个序列，测定两个序列中存在相同残基的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且将结果乘以100而产生序列一致性百分比。在两个序列具有不同长度或对齐产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，将单个序列的残基纳入计算的分母而非分子中。比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)与尿嘧啶(U)能视为等效的。一致性能够以人工方式或通过使用计算机序列算法(例如BLAST或BLAST 2.0)执行。
当论述反馈机理时，可以使用如本文所用的“阻抗”并且能够根据欧姆定律(Ohm'slaw)换算成电流值，从而能够与预设电流比较。
如本文所用，“免疫响应”是指宿主免疫系统(例如哺乳动物的免疫系统)响应于抗原的引入而激活。免疫响应可以呈细胞或体液响应的形式，或两者。
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“聚核苷酸”是指至少两个核苷酸共价连接在一起。单链的描绘还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘单链的互补链。核酸的许多变异体能够用于与指定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖基本上一致的核酸和其补体。单链提供了能够与靶序列在严格杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链或双链的，或能够含有双链和单链序列的一部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂合体，其中核酸能够含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸能够通过化学合成方法或重组方法获得。
如本文所用的“可操作地连接”是指基因在与其空间连接的启动子控制下表达。启动子能够定位于处于其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子和基因之间的距离能够与所述启动子和产生启动子的基因中由其控制的基因之间的距离大致相同。如所属领域中已知，能够适应这个距离的变化而不损失启动子功能。
如本文所用的“肽”、“蛋白质”或“多肽”可以指所连接的氨基酸序列并且可以是天然的、合成的，或天然的与合成的变型或组合。
如本文所用的“启动子”是指一种合成或天然来源的分子，其能够赋予、激活或增强细胞中的核酸表达。启动子能够包含一个或多个特定转录调控序列以进一步增强表达和/或改变核酸在细胞中的空间表达和/或暂时表达。启动子还能够包含远端增强或抑制元件，其定位相对于转录起始位点多达数千个碱基对。启动子能够来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。就其中发生表达的细胞、组织或器官而言，或就表达发生的发育阶段而言，或响应于外部刺激(例如生理性应激、病原体、金属离子或诱导剂)，启动子能够在组成上或以不同方式调控基因组件的表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子、CMVIE启动子和人细胞巨大病毒即刻早期启动子(hCMV)。在某些实施例中，启动子是hCMV启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换地使用并且是指能够在本文所述蛋白质的氨基端连接的氨基酸序列。信号肽/前导序列典型地引导蛋白质定域。本文所用的信号肽/前导序列优先促进蛋白质从产生其的细胞中分泌出来。所述蛋白质(通常称为成熟蛋白质)从细胞中分泌出来后，信号肽/前导序列通常与蛋白质的其余部分裂解。信号肽/前导序列连接于蛋白质的氨基端(即，N端)。
如本文所用，“严格杂交条件”是指第一核酸序列(例如探针)与第二核酸序列(例如靶标)杂交的条件，例如在核酸的复杂混合物中。严格条件与序列相关且在不同情况下是不同的。可以选择比特定序列在所限定的离子强度pH下的热熔点(Tm)低约5-10℃的严格条件。Tm可以是50％的与靶标互补的探针与靶序列杂交处于平衡(当靶序列过量存在时，在Tm下，50％探针在平衡时被占据)时的温度(在限定的离子强度、pH和核浓度下)。严格条件可以是如下条件，其中盐浓度小于约1.0M钠离子，例如在pH 7.0到8.3时为约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度就短探针(例如约10-50个核苷酸)而言是至少约30℃并且就长探针(例如超过约50个核苷酸)而言为至少约60℃。严格条件还能够通过添加去稳定化剂(例如甲酰胺)来实现。就选择性或特异性杂交而言，正信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示例性的严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC和1％SDS、在42℃培育，或5xSSC、1％SDS、在65℃培育，在65℃、在0.2x SSC和0.1％SDS中洗涤。
如本文所用，“受试者”可以指想要或需要用本文所述的疫苗免疫的哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物，例如黑猩猩、犬、猫、马、奶牛、小鼠或大鼠。
如本文所用，“基本上互补”是指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或所述两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本文所用，“基本上一致”是指第一序列与第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或就核酸而言，第一序列与第二序列的补体基本上互补。
如本文所用，“治疗(Treat/treatment/treating)”可以指通过预防、抑制、遏制或完全消除疾病的方式保护动物以免患病。预防疾病涉及在疾病发作之前将本发明的疫苗施用于动物。抑制疾病涉及在诱发疾病之后但在其临床表现之前将本发明的疫苗施用于动物。遏制疾病涉及在疾病存在临床表现后将本发明的疫苗施用于动物。
如本文关于核酸使用的“变异体”是指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其一部分的补体；(iii)与参考核酸或其补体基本上一致的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上一致的序列杂交的核酸。
如本文关于肽或多肽所用的“变异体”是指氨基酸序列因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而不同、但保持至少一种生物活性的肽或多肽。变异体还能指氨基酸序列与参考蛋白质基本上一致、但氨基酸序列保持至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守取代(即，氨基酸被具有类似特性(例如带电荷区域的亲水性、程度和分布)的不同氨基酸置换)在所属领域中被认为是典型地涉及微小变化。这些微小变化能够部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如所属领域中所了解。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。所属领域中已知亲水指数类似的氨基酸能够被取代并且仍保持蛋白质功能。在一个方面中，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还能用于揭露使蛋白质保持生物功能的取代。在肽的情况下考虑氨基酸的亲水性容许计算所述肽的最大局部平均亲水性，这是一种有用的量度，据报道与抗原性和免疫原性紧密相关。美国专利第4,554,101号，其以引用的方式完整并入本文中。亲水值类似的氨基酸的取代能够使肽保持生物活性，例如免疫原性，如所属领域中所了解。取代能够用亲水值在彼此±2内的氨基酸进行。氨基酸的疏水性指数和亲水值受所述氨基酸的特定侧链影响。与观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代应理解为依赖于氨基酸的相对相似性，具体地说，那些氨基酸的侧链的相对相似性，如根据疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其它特性所揭露。
变异体可以是相对于全基因序列或其片段的全长基本上一致的核酸序列。核酸序列相对于基因序列或其片段的全长可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。变异体可以是相对于氨基酸序列或其片段的全长基本上一致的氨基酸序列。氨基酸序列相对于氨基酸序列或其片段的全长可以80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。
如本文所用，“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自复制染色体外载体，并且优选DNA质粒。载体能够含有或包括一种或多种异源核酸序列。
疫苗
本文提供了包含MUC16抗原或编码MUC16抗原的核酸分子的疫苗，如本文所述。在一些实施例中，疫苗包含编码MUC16抗原的一种或多种核酸分子，如本文所述。在一些实施例中，疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％；编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％；编码与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％；编码与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％；编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％；编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ IDNO:1的核苷酸55-4470；在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470的核酸分子的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926；在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926的核酸分子的全长中占至少90％的片段；与SEQ IDNO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130；在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130的核酸分子的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023；在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023；在包含SEQ IDNO:7的核苷酸55-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQID NO:2的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO.2的长度中占至少90％；编码与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:4的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO.4的长度中占至少90％；编码与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:6的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO.6的长度中占至少90％；编码与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:8的核酸序列；编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO.8的长度中占至少90％；编码与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的核酸序列；和/或编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ IDNO:1；在SEQ ID NO:1的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:1至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:1至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:3；在SEQ ID NO:3的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:3至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:3至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:5；在SEQ ID NO:5的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:5至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:5至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述疫苗包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含SEQ ID NO:7；在SEQ ID NO:7的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:7至少95％一致的片段；和/或在与SEQ ID NO:7至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490；在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质；和/或在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2；在SEQ ID NO:2的长度中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列；和/或在与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642；在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质；和/或在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4；在SEQ ID NO.4的长度中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:4至少95％一致的氨基酸序列；和/或在与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710；在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质；和/或在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:6；在SEQ ID NO.6的长度中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:6至少95％一致的氨基酸序列；和/或在与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341；在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的氨基酸序列；和/或在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341；在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的氨基酸序列；和/或在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
在一些实施例中，所述疫苗包含MUC16抗原，其中所述抗原包含SEQ ID NO:8；在SEQ ID NO.8的长度中占至少90％的片段；与SEQ ID NO:8至少95％一致的氨基酸序列；和/或在与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％的片段。
疫苗能够在受试者中产生针对抗原的免疫响应。免疫响应可以是治疗性或预防性免疫响应。所述疫苗能够用于预防癌症，例如表达MUC16的癌症或肿瘤。所述疫苗能够用于预防和/或治疗有需要的受试者的表达MUC16的肿瘤。所述疫苗能够诱导针对MUC16和针对表达MUC16的肿瘤的细胞和/或抗体响应。在一个实施例中，所述疫苗能够用于防止、预防和/或治疗表达MUC16的卵巢癌细胞(具体地说，表达MUC16的上皮卵巢癌细胞，更具体地说，表达MUC16的浆液卵巢癌细胞)或诱导针对其的细胞和/或抗体响应。
如本文所述的癌症疫苗的研发包含鉴定癌症抗原，例如MUC16，其不被免疫系统识别并且是异常表达的自身抗原。为了被免疫系统识别，将所鉴定的癌症抗原从自身抗原变为外来抗原。重组癌症抗原的核酸和氨基酸序列从自身抗原到外来抗原的再设计破坏了免疫系统对抗原的耐受性。为了破坏耐受性，能够将若干种再设计措施应用于癌症抗原，如下文所述。
疫苗中的重组癌症抗原不能作为自身抗原被识别，借此破坏耐受性。破坏耐受性能够诱导抗原特异性T细胞和/或高效价抗体响应，借此诱导或诱发针对表达抗原的癌症或肿瘤或对表达抗原的癌症或肿瘤具有反应性的免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的免疫响应可以是细胞、体液免疫响应，或细胞与体液免疫响应。在一些实施例中，诱导或诱发的细胞免疫响应可以包括诱导或分泌干扰素-γ(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在其它实施例中，诱导或诱发的免疫响应能够减少或抑制促进表达所述抗原的肿瘤或癌症生长的一种或多种免疫抑制因子，例如(但不限于)下调MHC呈递的因子、上调抗原特异性调控T细胞(Treg)的因子、PD-L1、FasL、例如IL-10和TFG-β等细胞因子、肿瘤相关巨噬细胞、肿瘤相关纤维母细胞、免疫抑制细胞产生的可溶因子、CTLA-4、PD-1、MDSC、MCP-1和免疫检查点分子。
所述疫苗可以是DNA疫苗。美国专利第5,593,972号、第5,739,118号、第5,817,637号、第5,830,876号、第5,962,428号、第5,981,505号、第5,580,859号、第5,703,055号和第5,676,594号公开了DNA疫苗，所述美国专利以引用的方式完整并入本文中。在一些实施例中，核酸分子可以包含表达载体。DNA疫苗可以进一步包含抑制其整合到染色体中的元件或试剂。
所述疫苗能够包括编码癌症抗原的RNA。RNA疫苗能够引入细胞中。
所述疫苗可以是减毒的活疫苗、使用重组载体递送抗原的疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗，例如(但不限于)以下美国专利号中所述的疫苗：4,510,245、4,797,368、4,722,848、4,790,987、4,920,209、5,017,487、5,077,044、5,110,587、5,112,749、5,174,993、5,223,424、5,225,336、5,240,703、5,242,829、5,294,441、5,294,548、5,310,668、5,387,744、5,389,368、5,424,065、5,451,499、5,453,3 64、5,462,734、5,470,734、5,474,935、5,482,713、5,591,439、5,643,579、5,650,309、5,698,202、5,955,088、6,034,298、6,042,836、6,156,319和6,589,529，所述美国专利各自以引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，核酸疫苗可以进一步包含分子佐剂；在一些情况下，所述分子佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES，并且在一些情况下，所述分子佐剂是检查点抑制剂，包括抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、抗程序性死亡受体-1(PD-1)和抗淋巴细胞激活基因(LAG-3)。IL-12、IL-15、IL-28和/或RANTES的编码序列可以包括于一种或多种核酸分子上，所述一种或多种核酸分子包含一种或多种抗原的编码序列。IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33和/或RANTES的编码序列可以由核酸疫苗(例如相同质粒上)编码，或它们可以包括于单独的核酸分子上，例如单独的质粒。
本发明的疫苗能够具有有效疫苗所需的特征，例如安全，使得疫苗自身不引起疾病或死亡；预防疾病；诱导中和抗体；诱导保护T细胞响应；以及易施用、几乎没有副作用、生物学稳定性和单位剂量成本低。疫苗通过含有如下文所论述的癌症抗原而能够完成这些特征中的一些或全部。
疫苗能够进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(例如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被抑制的任何核酸或蛋白质。还如下文更详细地描述，疫苗可以进一步与抗体组合，直至与检查点抑制剂(例如PD-1和PDL-1)组合，以增加细胞与体液免疫响应的刺激。使用抗PD-1或抗PDL-1抗体阻止PD-1或PDL-1抑制T细胞和/或B细胞响应。
抗原
如上文所述，疫苗能够包含抗原或编码抗原的核酸分子。抗原可以是MUC16、其片段、其变异体或其组合。MUC16是高分子量糖蛋白的粘蛋白家族成员。粘蛋白由呼吸道、胃肠道和生殖道各种器官的内腔表面周围的特殊化上皮细胞表达。粘蛋白在上皮完整性的维持和上皮表面的润滑和保护方面具有直接和间接的作用。
MUC16已与肿瘤或癌症形成有关。MUC16的串联重复域含有重复的肽抗原决定基CA125，其已经变成在卵巢癌的整个诊断和治疗期间出现的多种临床情形的金标准生物标志物，所述临床情形包括：1)根据早期检测进行筛选；2)对出现盆腔肿块的绝经前和绝经后女性的良性和恶性疾病进行区分；以及3)监测对治疗的响应。另外，功能研究已经表明MUC16造成卵巢瘤的转化和转移。
因此，所述疫苗能够用于治疗罹患表达MUC16的癌症或肿瘤的受试者。在一些实施例中，所述癌症是卵巢癌。MUC16抗原可以不同于原生的“正常”MUC16，且从而针对表达MUC16抗原的肿瘤提供治疗或预防。因此，本文提供了不同于原生MUC16序列的MUC16抗原序列，以及编码此类MUC16抗原序列(即，重组或突变的MUC16基因或序列)的核酸分子。
提供了包含上述异源序列的核酸分子。提供了由上述异源序列组成的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ IDNO:1的核苷酸55-4470；(b)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470的核酸分子的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:1；(b)在SEQ ID NO:1的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQID NO:1至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。
在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926；(b)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926的核酸分子的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQID NO:3的核苷酸55-1926至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQID NO:3的核苷酸55-1926至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:3；(b)在SEQ IDNO:3的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:3至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:3至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:3中所示的核酸序列。
在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130；(b)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130的核酸分子的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQID NO:5的核苷酸55-2130至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQID NO:5的核苷酸55-2130至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:5；(b)在SEQ IDNO:5的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:5至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:5至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023；(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023的核酸分子的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023；(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023的核酸分子的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)SEQ ID NO:7；(b)在SEQ ID NO:7的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:7至少95％、96％、97％、98％或99％一致的片段；以及(d)在与SEQ ID NO:7至少95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，核酸分子包含SEQ ID NO:7中所示的核酸序列。
本文提供了编码MUC16抗原的核酸序列。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ IDNO:2的氨基酸19-1490至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，提供了核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:2的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ IDNO:4的氨基酸19-642至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，提供了核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:4的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:4的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ IDNO:4至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ IDNO:6的氨基酸19-710至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，提供了核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:6的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:6的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:6至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ IDNO:6至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，核酸分子包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施例中，提供了核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：(a)编码SEQ ID NO:8的核酸序列；(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:8的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；(c)编码与SEQ ID NO:8至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的核酸序列；以及(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8至少95％、96％、97％、98％或99％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
可以将包含上述异源序列的经分离的核酸分子并入载体中，例如质粒、病毒载体和如下文所述的其它形式的核酸分子中。
提供了包含上述异源氨基酸序列的蛋白质分子。提供了由上述异源氨基酸序列组成的蛋白质分子。本文提供了具有上述序列的蛋白质和多肽。蛋白质和多肽可以称为MUC16抗原和MUC16免疫原。MUC16抗原能够诱发针对表达MUC16抗原的肿瘤的免疫响应。在一些实施例中，蛋白质包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490；(b)在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，提供了包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO:2；(b)在SEQ ID NO:2的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，蛋白质包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:4的氨基酸19-642；(b)在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，提供了包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO:4；(b)在SEQ ID NO:4的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:4至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，蛋白质包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:6的氨基酸19-710；(b)在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，提供了包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO:6；(b)在SEQ ID NO:6的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:6至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:6至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，蛋白质包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341；(b)在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，蛋白质包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341；(b)在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段；(c)与SEQ IDNO:8的氨基酸19-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(d)在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的片段。在一些实施例中，提供了包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：(a)SEQ ID NO:8；(b)在SEQID NO:8的全长中占至少90％的片段；(c)与SEQ ID NO:8至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列；以及(c)在与SEQ ID NO:8至少95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。在一些实施例中，所述蛋白质包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
在一个方面中，希望共同抗原提供改善的转录和翻译，包括具有以下中的一种或多种：低GC含量前导序列以增加转录；mRNA稳定性和密码子优化；以及尽可能地排除顺式作用序列基序(即，内部TATA盒)。
MUC16抗原可以是来源于两个或更多个物种的共同抗原(或免疫原)序列。在一些实施例中，共同抗原可以包含MUC16胞外域和跨膜域。MUC16共同抗原能够在胞外域和/或跨膜域中包含一个或多个突变。所述一个或多个突变能够包括一个或多个涉及N-糖基化的氨基酸的取代。一个或多个突变可以包含天冬酰胺被丙氨酸取代。因此，在一些实施例中，一个或多个突变能够置换MUC16胞外域和/或跨膜域中的1、2或3个氨基酸。
在一些实施例中，MUC16抗原能够进一步包含来源于原生RMC序列的一种或多种重复微共同(RMC)序列的任何组合，例如RMC1、RMC2、RMC3和/或RMC4。在一些实施例中，MUC16抗原能够包含一种或多种原生重复(R)序列的任何组合，例如R59、R61、R62和/或R63。在一些实施例中，MUC16抗原包含RMC1、RMC2、RMC3、RMC4、R61、R62和R63序列。在一些实施例中，MUC16抗原包含RMC1、RMC2、RMC3、RMC4、R59、R61、R62和R63序列。在一些实施例中，MUC16抗原包含RMC1、RMC2、RMC3和RMC4序列。在一些实施例中，MUC16抗原包含R61、R62和R63序列。
MUC16抗原能够包含用于改善表达的修饰。修饰能够包括密码子优化、RNA优化、添加Kozak序列(例如GCC ACC)以便增加翻译起始，和/或添加免疫球蛋白前导序列以增加MUC16抗原的免疫原性。MUC16抗原能够包含信号肽，例如免疫球蛋白信号肽，例如(但不限于)免疫球蛋白E(IgE)或免疫球蛋白G(IgG)信号肽。
MUC16抗原能够包含用于抗原决定基优化的修饰。在一些实施例中，此类裂解位点可以插入RMC序列之间、R序列之间，或RMC或R序列的界面处。裂解位点可以是弗林蛋白酶裂解位点。在某些实施例中，弗林蛋白酶裂解位点可以插入RMC4与R61之间。
疫苗与免疫检查点抑制剂的组合
疫苗能够进一步包含一种或多种免疫检查点分子的一种或多种抑制剂(即，免疫检查点抑制剂)。免疫检查点分子更详细地描述于下文。免疫检查点抑制剂是阻止免疫系统中的任何组分(例如MHC类呈递、T细胞呈递和/或分化、B细胞呈递和/或分化、任何细胞因子、趋化因子或用于免疫细胞增殖和/或分化的信号传导)被抑制的任何核酸或蛋白质。
此类抑制剂可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还能够包括编码接头或标签序列的其它序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其能够充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调节因子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段，或其组合。
在一些实施例中，免疫检查点抑制剂可以是一种或多种核酸序列，其编码抗体、其变异体、其片段或其组合。在其它实施例中，免疫检查点抑制剂可以是抗体、其变异体、其片段或其组合。
a.免疫检查点分子
免疫检查点分子可以是核酸序列、氨基酸序列、小分子或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变异体、其片段或其组合。核酸还能够包括编码接头或标签序列的其它序列，所述接头或标签序列通过肽键连接到免疫检查点抑制剂。小分子可以是低分子量(例如小于800道尔顿)有机或无机化合物，其能够充当酶底物、蛋白质或核酸所结合的配体(或其类似物)，或生物过程的调节因子。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变异体、其片段，或其组合。
(1)PD-1和PD-L1
免疫检查点分子可以是程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序化细胞死亡配体1(PD-L1)、其片段、其变异体，或其组合。PD-1是由PDCD1基因编码的细胞表面蛋白质。PD1是免疫球蛋白超家族的成员并且在T细胞和前B细胞上表达，并且因此影响这些细胞的命运和/或分化。确切地说，PD1是T细胞调控因子的CD28/CTLA-4家族的1型膜蛋白并且负向调控T细胞受体(TCR)信号，借此负向调控免疫响应。PD-1能够负向调控CD8+T细胞响应，并且从而抑制CD8介导的细胞毒性且增强肿瘤生长。
PD-1具有两种配体：PD-L1和PD-L2，其是B7家族成员。响应于LPS和GM-CSF治疗，PD-L1在巨噬细胞和树突状细胞(DC)上受到上调，并且在TCR和B细胞受体信号传导后，在T细胞和B细胞上受到上调。PD-L1由多种肿瘤细胞株表达，包括骨髓瘤、肥大细胞瘤和黑色素瘤。
b.抗免疫检查点分子抗体
如上文所述，免疫检查点抑制剂可以是抗体。抗体能够结合或与抗原(即，上述免疫检查点分子)反应。因此，抗体可以被视为抗免疫检查点分子抗体或免疫检查点分子抗体。抗体能够由所含的核酸序列编码。
抗体能够包括重链多肽和轻链多肽。重链多肽能够包括重链可变(VH)区和/或至少一个重链恒定(CH)区。至少一个重链恒定区能够包括重链恒定区1(CH1)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)和/或铰链区。
在一些实施例中，多肽重链能够包括VH区和CH1区。在其它实施例中，多肽重链能够包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。
多肽重链能够包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合能够含有VH区的三个高变区。从多肽重链的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。多肽重链的CDR1、CDR2和CDR3能够促成抗原的结合或识别。
多肽轻链能够包括轻链可变(VL)区和/或轻链恒定(CL)区。多肽轻链能够包括互补决定区(“CDR”)集合。CDR集合能够含有VL区的三个高变区。从多肽轻链的N端开始，这些CDR分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。多肽轻链的CDR1、CDR2和CDR3能够促成抗原的结合或识别。
抗体可以包含分别置入重链与轻链构架(“FR”)集合之间的重链和轻链互补决定区(“CDR”)集合，所述构架集合向CDR提供支撑并且界定CDR相对于彼此的空间关系。CDR集合可以含有重链或轻链V区的三个高变区。从重链或轻链的N端开始，这些区域分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点可以包括六个CDR，包含来自重链和轻链V区中的每一个的CDR集合。
抗体可以是免疫球蛋白(Ig)。Ig可以是例如IgA、IgM、IgD、IgE和IgG。免疫球蛋白能够包括多肽重链和多肽轻链。免疫球蛋白的多肽重链能够包括VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区。免疫球蛋白的多肽轻链能够包括VL区和CL区。
另外，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先使IgG分子裂解以产生若干片段，其中两者(F(ab)片段)各自包含包括完整抗原结合位点的共价异二聚体。酶胃蛋白酶能够使IgG分子裂解以提供若干片段，包括F(ab')2片段，其包含两个抗原结合位点。因此，抗体可以是Fab或F(ab')2。Fab能够包括多肽重链和多肽轻链。Fab的多肽重链能够包括VH区和CH1区。Fab的轻链能够包括VL区和CL区。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体。抗体可以是嵌合抗体、单链抗体、亲和力成熟抗体、人抗体、人源化抗体或全人抗体。人源化抗体可以是来自非人物种的抗体，其结合具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区的所期望抗原。
(1)PD-1抗体
抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-1抗体(在本文中也称为“PD-1抗体”)、其变异体、其片段，或其组合。PD-1抗体可以是尼沃单抗(Nivolumab)。抗PD-1抗体能够抑制PD-1活性，借此诱导、诱发或增强针对肿瘤或癌症的免疫响应和减少肿瘤生长。
(2)PD-L1抗体
抗免疫检查点分子抗体可以是抗PD-L1抗体(在本文中也称为“PD-L1抗体”)、其变异体、其片段，或其组合。抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1活性，借此诱导、诱发或增强针对肿瘤或癌症的免疫响应和减少肿瘤生长。
载体
疫苗能够包含一种或多种载体，所述载体包括编码MUC16抗原的异源核酸。一种或多种载体能够以有效诱发哺乳动物的免疫响应的数量表达抗原。载体可以包含编码抗原的异源核酸。载体能够具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自复制染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。
一种或多种载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体进入细胞内部，则通过细胞转录和翻译机制核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒频繁地被工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域并且使表达载体上所携带的基因有效转录。本发明的载体表达大量的稳定信使RNA，且因此表达大量的蛋白质。
载体可以具有表达信号，例如强启动子、强终止密码子，调整启动子与克隆基因之间的距离，以及插入转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)。
载体可以包含可操作地连接到调控元件的核酸序列，所述调控元件选自启动子和聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，启动子是人细胞巨大病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)。在一些实施例中，聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。
载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒或线性核酸能够引导特定核苷酸序列在适当的受试者细胞中的表达。载体能够具有可操作地连接到抗原编码核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接到终止信号。载体还能够含有核苷酸序列正确翻译所必需的序列以及用于克隆和亚克隆载体和其片段的序列。包含所关注核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着载体组分中的至少一种相对于载体其它组分中的至少一种组分是异源的。核苷酸序列在表达盒中的表达可以处于组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述组成型启动子或诱导型启动子仅当宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时起始转录。在多细胞生物体的情况下，启动子还能够对特定组织或器官或发育阶段具有特异性。
载体可以是质粒。质粒可以适用于与编码抗原的核酸一起转染细胞，将已转化的宿主细胞在发生抗原表达的条件下培养且维持。
质粒可以包含编码上文公开的多种抗原中的一种或多种的核酸序列，包括编码合成共同抗原的编码序列，所述共同抗原能够诱发针对抗原、此类蛋白质的片段、此类蛋白质的变异体、变异体片段或融合蛋白的免疫响应，所述融合蛋白由共同蛋白质和/或共同蛋白质的片段和/或共同蛋白质的变异体和/或共同蛋白质变异体的片段的组合构成。
在一些实施例中，质粒可以进一步包含单独或作为这些质粒之一的一部分的编码CCR20的编码序列。类似地，质粒可以进一步包含IL-12、IL-15和/或IL-28的编码序列。
质粒可以进一步包含可以位于编码序列上游的起始密码子，和可以位于编码序列下游的终止密码子。起始和终止密码子可以与编码序列同框。
质粒还可以包含可操作地连接到编码序列的启动子。可操作地连接到编码序列的启动子可以是猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、细胞巨大病毒(CMV)启动子(例如CMV即刻早期启动子(hCMV启动子))、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus，EBV)启动子，或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因(例如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白)的启动子。启动子还可以是天然或合成的组织特异性启动子，例如肌肉或皮肤特异性启动子。此类启动子的实例描述于美国专利申请公开号US20040175727中，所述美国专利申请公开的内容全部并入本文中。
质粒还可以包含可以位于编码序列下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可以是SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号、人β-球蛋白聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGHpolyA)。SV40聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4质粒的聚腺苷酸化信号(英杰公司(Invitrogen)，加州圣地亚哥(San Diego,CA))。
质粒还可以包含编码序列上游的增强子。增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，例如来自CMV、FMDV、RSV或EBV的增强子。聚核苷酸功能增强子描述于美国专利第5,593,972号、第5,962,428号和W094/016737中，其各自的内容以引用的方式完全并入。
质粒还可以包含哺乳动物复制起点，以便在染色体外维持质粒且在细胞中产生质粒的多个拷贝。质粒可以是得自英杰公司(加州圣地亚哥)的p V AXI、pCEP4或pREP4，其可以包含埃-巴二氏病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，从而可以在不整合的情况下产生高拷贝游离型复制。质粒的主链可以是pA V0242。质粒可以是复制缺陷型腺病毒5型(Ad5)质粒。
质粒还可以包含调控序列，其可以较好地适用于其中施用质粒的细胞中的基因表达。编码序列可以包含可以使得编码序列在宿主细胞中更有效转录的密码子。
编码序列还可以包含免疫球蛋白(Ig)前导序列。前导序列可以位于编码序列的5'。由这个序列编码的共同抗原可以包含N端Ig前导序列，继之为共同抗原蛋白质。N端Ig前导序列可以是IgE或IgG。
质粒可以是pSE420(英杰公司，加州圣地亚哥)，其可以用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。质粒还可以是pYES2(英杰公司，加州圣地亚哥)，其可以用于在酵母的酿酒酵母株中产生蛋白质。质粒还可以是MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(英杰公司，加州圣地亚哥)的质粒，其可以用于在昆虫细胞中产生蛋白质。质粒还可以是pcDNA I或pcDNA3(英杰公司，加州圣地亚哥)，其可以用于在哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中产生蛋白质。质粒还可以是pGX001(Inovio)，其由pVAX1(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)，马塞诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))
载体可以是环状质粒，其可以通过整合到细胞基因组中来转化靶细胞或在染色体外存在(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。
载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
本文还提供了一种线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)，其能够通过电穿孔有效递送到受试者中并且表达一种或多种所期望抗原。LEC可以是缺乏任何磷酸酯主链的任何线性DNA。DNA可以编码一种或多种抗原。LEC可以含有启动子、内含子、终止密码子和/或聚腺苷酸化信号。抗原表达可以通过启动子控制。LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸酯主链。LEC可以不含有与所期望的抗原基因表达无关的其它核酸序列。
LEC可以来源于能够线性化的任何质粒。质粒能够表达抗原。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能够将序列翻译成被免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别来源于pNP(PuertoRico/34)和pM2(New Caledonia/99)。
载体可以具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达和调控经分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是通过DNA依赖性RNA聚合酶转录所必需的顺式作用序列元件，其转录本文所述的抗原序列。用于引导异源核酸表达的启动子的选择视具体应用而定。启动子可以定位于载体中的距转录起点一定距离处，所述距离与其天然背景下距转录起点的距离大约距离。然而，在启动子功能无损失的情况下，可以允许这种距离的变化。
启动子可以可操作地连接到编码抗原的核酸序列以及转录物有效聚腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号。
启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或显示在真核细胞中有效表达的其它启动子。
载体可以包括具有功能剪接供体和受体位点的增强子和内含子。载体可以含有结构基因下游的转录终止区以实现有效终止。终止区可以获自与启动子序列相同的基因或可以获自不同基因。
制备载体的方法
本文提供了制备载体的方法，所述载体包含编码本文所论述的MUC16抗原的核酸分子。使用所属领域中已知的方法能够将最终亚克隆到哺乳动物表达质粒的步骤之后的载体接种到大型发酵槽的细胞培养液中。
使用已知装置和技术的组合能够配制或制造下文更详细所述的电穿孔装置所用的载体，但其优选使用美国公开第2009/004716号(2008年5月23日提交)中所述的优化质粒制造技术制造。在一些实例中，这些研究中所用的DNA质粒能够以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除U.S.第60/939792号所述的那些之外，制造技术还包括或合并所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括已许可的专利美国专利第7,238,522号(2007年7月3日授权)中所述的那些。以上提及的公开和专利、美国公开第2009/004716号和美国专利第7,238,522号分别完整并入本文中。
疫苗的赋形剂和其它组分
疫苗可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能分子，例如媒剂、载剂或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freunds incompleteadjuvant)、LPS模拟物(包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽)、醌类似物、囊泡(例如角鲨烯和角鲨烯)、玻糖醛酸、脂质、脂质粒、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂还可以包括表面活性剂，例如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS模拟物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰基肽、醌类似物和囊泡，例如角鲨烯和角鲨烯，并且玻糖醛酸也可以联合基因构建体施用。DNA质粒疫苗还可以包括转染促进剂，例如脂质、脂质粒，包括卵磷脂脂质粒或所属领域中已知的其它脂质粒作为DNA-脂质粒混合物(参见例如W09324640)；钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)，或脂质。转染剂在疫苗中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是一种或多种佐剂。佐剂可以是替代质粒中表达或作为蛋白质与上述质粒的组合在疫苗中递送的其它基因。一种或多种佐剂可以选自由以下组成的组：CCL20、α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、胸腺上皮表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、IL-28、IL-31、IL-33、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1～、IL-8、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、纤维母细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2、IL-15，其已缺失信号序列或编码信号序列的编码序列并且任选地包括不同信号肽，例如来自IgE的信号肽，或编码不同信号肽(例如来自IgE的信号肽)的编码序列，和其功能片段，或其组合。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
在一些实施例中，佐剂可以是一种或多种蛋白质和/或编码蛋白质的核酸分子，其选自由以下组成的组：CCL-20、IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、MEC或RANTES。IL-12构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1997/019502号和对应的美国申请第08/956,865号和美国临时申请第61/569600号(2011年12月12日提交)中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。IL-15构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US04/18962号和对应的美国申请第10/560,650号，以及PCT申请第PCT/US07/00886号和对应的美国申请第12/160,766号，以及PCT申请第PCT/USI0/048827号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。IL-28构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US09/039648号和对应的美国申请第12/936,192号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622452号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。RANTES和其它构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US1999/004332和对应的美国申请第09/622452号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。RANTES构建体和序列的其它实例公开于PCT申请第PCT/US11/024098号中，所述申请以引用的方式并入本文中。趋化因子CTACK、TECK和MEC构建体和序列的实例公开于PCT申请第PCT/US2005/042231号和对应的美国申请第11/719,646号中，所述文献各自以引用的方式并入本文中。OX40和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第10/560,653号中，所述申请以引用的方式并入本文中。DR5和其它免疫调节剂的实例公开于美国申请第09/622452号中，所述申请以引用的方式并入本文中。
能够适用作佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、纤维母细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、凋亡蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素响应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2和其功能片段。
疫苗可以进一步包含如U.S.第021,579号(1994年4月1日提交)中所述的基因疫苗促进剂，所述文献以引用的方式全部并入。
疫苗可以约1纳克到100毫克、约1微克到约10毫克或优选约0.1微克到约10毫克或更优选约1毫克到约2毫克的数量包含编码抗原的质粒。在一些优选实施例中，根据本发明的疫苗包含约5纳克到约1000微克核酸。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约10纳克到约800微克核酸。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约0.1到约500微克核酸。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约1到约350微克核酸。在一些优选实施例中，疫苗能够含有约25到约250微克、约100到约200微克、约1纳克到100毫克、约1微克到约10毫克、约0.1微克到约10毫克、约1毫克到约2毫克、约5纳克到约1000微克、约10纳克到约800微克、约0.1到约500微克、约1到约350微克、约25到约250微克、约100到约200微克的抗原或其质粒。
疫苗能够根据待使用的施药方式配制。可注射的疫苗医药组合物可以是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。能够使用等张性配制物或溶液。等张性添加剂能够包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。疫苗能够包含血管收缩剂。等张性溶液能够包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗能够进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂能使配制物在室温或环境温度下稳定延长的时间段，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。
疫苗的医药组合物
疫苗能够呈医药组合物的形式。医药组合物能够包含疫苗。医药组合物能够包含约5纳克(ng)到约10毫克(mg)的疫苗核酸分子。在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含约25ng到约5mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约50ng到约1mg的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约0.1到约500微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约1至约350微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约5到约250微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约10到约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约15到约150微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约20到约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约25到约75微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约30到约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约35到约40微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物含有约100到约200微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约10微克到约100微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约20微克到约80微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约25微克到约60微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约30ng到约50微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物包含约35ng到约45微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约0.1到约500微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约1到约350微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约25到约250微克的疫苗核酸分子。在一些优选实施例中，医药组合物含有约100到约200微克的疫苗核酸分子。
在一些实施例中，根据本发明的医药组合物包含至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物能够包含至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物能够包含至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或更多的疫苗核酸分子。
在其它实施例中，医药组合物能够包含至多且包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物能够包含至多且包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895、900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克的疫苗核酸分子。在一些实施例中，医药组合物能够包含至多且包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg的疫苗核酸分子。
根据待使用的施药方式，医药组合物能进一步包含用于配制目的的其它药剂。在医药组合物是可注射医药组合物的情况下，它们是无菌的、不含热原质的以及不含微粒的。优选使用等张性配制物。一般来说，等张性添加剂能够包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇以及乳糖。在一些情况下，优选等张溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施例中，将血管收缩剂添加到配制物中。
医药组合物能够进一步包含药学上可接受的赋形剂，如上文所提供。举例来说，药学上可接受的赋形剂可以包含功能分子、载剂、佐剂、载体、稀释剂或转染促进剂，如上文所提供。
疫苗接种方法
本文提供了使用上述医药配制物治疗和/或预防表达MUC16的癌症(例如(但不限于)卵巢癌)的方法。本文还描述使用上述医药配制物治疗和/或预防受试者的表达MUC16的癌症(例如(但不限于)卵巢癌)的方法。本文还描述了受试者接种疫苗的方法。本文还描述了向有需要的受试者施用本文所述的医药配制物的方法。本文所述的方法(统称为使用本文所述的医药配制物治疗的方法)能够包含向有需要的受试者施用一种或多种如本文所述的疫苗以诱导治疗性和/或预防性免疫响应。能够将疫苗施用于受试者以调节受试者免疫系统的活性且增强免疫响应。疫苗的施用可以是将如本文所公开的癌症抗原以核酸分子形式转染，使其在细胞中表达并且递送到细胞表面，之后，免疫系统识别且诱导细胞、体液响应，或细胞与体液响应。疫苗的施用通过将如本文所论述的疫苗施用于受试者而能够用于诱导或诱发受试者产生针对MUC16的免疫响应。
能够将疫苗施用于受试者以调节受试者免疫系统的活性，借此增强免疫响应。在一些实施例中，受试者是哺乳动物。疫苗施用于哺乳动物且借此将载体引入哺乳动物细胞内之后，经转染的细胞将表达且分泌如本文所公开的一种或多种癌症抗原。所分泌的这些蛋白质或合成抗原将作为外来物质被免疫系统识别，从而建立免疫响应，所述免疫响应能够包括：针对一种或多种癌症抗原所产生的抗体，和特异性针对一种或多种癌症抗原的T细胞响应。在一些实例中，接种本文所论述的疫苗的哺乳动物将具有预致敏的免疫系统并且当用一种或多种如本文所公开的癌症抗原攻击时，预致敏的免疫系统将允许随后快速清除如本文所公开的癌症抗原，不论通过体液、细胞免疫响应，或细胞与体液免疫响应。
施用疫苗的核酸分子的方法描述于美国专利第4,945,050号和第5,036,006号，所述两个专利均以全文引用的方式并入本文中。
疫苗能够施用于哺乳动物以诱发哺乳动物产生免疫响应。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、奶牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛科动物、鹿、刺猬、大象、大羊驼、羊驼、小鼠、大鼠，并且优选人、奶牛或猪。疫苗能够类似地施用于非哺乳动物受试者，例如鸡，以诱发免疫响应。
疫苗剂量可以在1微克与10mg活性组分/公斤(kg)体重/时间(组分/kg体重/时间)之间，并且可以是20微克到10mg组分/kg体重/时间。能够每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。疫苗剂量用于有效治疗的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次剂量。
通过疫苗产生免疫响应的方法
所述疫苗能够在哺乳动物或非哺乳动物受试者中用于产生免疫响应，包括治疗性或预防性免疫响应。免疫响应能够产生针对一种或多种如本文所公开的癌症抗原的抗体和/或杀手T细胞。此类抗体和T细胞能够分离出来。
一些实施例提供了产生针对一种或多种如本文所公开的癌症抗原的免疫响应的方法，所述实施例包含向受试者施用疫苗。一些实施例提供了向受试者预防性接种针对癌症或肿瘤的疫苗的方法，所述癌症或肿瘤表达一种或多种如上文所述的MUC16抗原，所述实施例包含施用疫苗。一些实施例提供了在治疗上向受试者接种疫苗的方法，所述受试者已经罹患表达MUC16的卵巢癌或肿瘤，所述实施例包含施用疫苗。在施用疫苗之前，能够常规地诊断表达一种或多种MUC16抗原的卵巢癌或肿瘤。
通过疫苗进行癌症治疗的方法
所述疫苗能够用于在哺乳动物中产生或诱发免疫响应，所述免疫响应对表达MUC16的癌症(例如(但不限于)卵巢癌，更确切地说，上皮卵巢癌，最确切地说，浆液卵巢癌)具有反应性或针对所述癌症。所诱发的免疫响应能够防止卵巢癌或肿瘤生长。
所诱发的免疫响应能够防止和/或减少患有卵巢癌的受试者中的癌症或肿瘤细胞的转移。因此，所述疫苗能够用于治疗和/或预防施用疫苗的患有癌症的哺乳动物或受试者的癌症或肿瘤的方法。
在一些实施例中，所施用的疫苗能够如下介导肿瘤细胞的清除或防止肿瘤细胞生长：(1)通过B细胞响应来诱导体液免疫性以产生阻断单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)产生的抗体，借此阻滞骨髓源抑制性细胞(MDSC)且抑制肿瘤生长；(2)增加细胞毒性T淋巴细胞(例如CD8+(CTL))攻击和杀死肿瘤细胞；(3)增加T辅助细胞响应；和(4)通过IFN-γ和TFN-α增加炎症响应，或优选全部前述内容。疫苗能够使无肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％和45％。疫苗在免疫接种之后，能够使肿瘤质量减少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。所述疫苗能够防止和阻断单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)(由骨髓源抑制性细胞分泌的细胞因子)增加。疫苗能够使肿瘤存活率增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％和60％。
在一些实施例中，免疫响应能够产生体液免疫响应和/或抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应，所述响应对施用疫苗的受试者中的各种组织或系统(例如脑或神经系统等)不产生损伤或发炎。
在一些实施例中，能够将疫苗施用于外周(如下文更详细地描述)以建立靶向癌症或肿瘤细胞或组织的抗原特异性免疫响应，从而清除或消除表达一种或多种癌症抗原的癌症或肿瘤而不损伤或引起施用疫苗的受试者出现疾病或死亡。
所施用的疫苗能够使受试者中的细胞免疫响应增强约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍，或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，相较于未施用疫苗的受试者中的细胞免疫响应，所施用的疫苗能够使受试者中的细胞免疫响应增强约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
所施用的疫苗能够使受试者中的干扰素γ(IFN-γ)水平增加约50倍到约6000倍、约50倍到约5500倍、约50倍到约5000倍、约50倍到约4500倍、约100倍到约6000倍、约150倍到约6000倍、约200倍到约6000倍、约250倍到约6000倍，或约300倍到约6000倍。在一些实施例中，相较于未施用疫苗的受试者中的IFN-γ水平，所施用的疫苗能够使受试者中的IFN-γ水平增加约50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。
疫苗剂量可以在1微克与10mg活性组分/公斤(kg)体重/时间(组分/kg体重/时间)之间，并且可以是20微克到10mg组分/kg体重/时间。能够每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用疫苗。疫苗剂量用于有效治疗的数量可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次剂量。
施药途径
疫苗或医药组合物能够通过不同途径施用，包括口服、肠胃外、舌下、透皮、直肠、经粘膜、体表、经由吸入、经由颊内施药、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内和/或关节内，或其组合。对于兽用而言，组合物能够根据正常兽医学实务、作为可接受的适合配制物施用。兽医能够容易地确定最适于特定动物的给药方案和施药途径。能够通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(例如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波)施用疫苗。
疫苗的载体能够通过众所周知的若干技术施用于哺乳动物，包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)联合和不联合体内电穿孔、脂质粒介导的转染、纳米粒子促进的转染，以及使用重组载体，例如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。疫苗的一种或多种癌症抗原能够通过DNA注射以及体内电穿孔施用。
电穿孔
疫苗或医药组合物能够通过电穿孔施用。通过电穿孔施用疫苗能够使用电穿孔装置完成，所述电穿孔装置能够被配置成向所期望的哺乳动物组织递送在细胞膜中有效引起可逆孔隙形成的能量脉冲，并且优选地，所述能量脉冲是类似于用户输入的预设电流的恒定电流。电穿孔装置能够包含电穿孔组件和电极组合件或手柄组合件。电穿孔组件能够包括且合并电穿孔装置的多个元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形产生器、阻抗测试仪、波形记录仪、输入元件、状态报告元件、通讯端口、存储器组件、电源和电源开关。电穿孔能够使用体内电穿孔装置完成，例如
Figure BDA0002616945040000501
EP系统(Inovio制药有限公司，宾夕法尼亚州蓝铃市(Blue Bell,PA))或Elgen电穿孔器(Inovio制药有限公司)，以促进质粒转染细胞。
能够促进本发明DNA疫苗施用的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号、Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630中所述的那些，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。能够用于促进DNA疫苗施用的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括同在申请中且共同拥有的美国专利申请第11/874072号(2007年10月17日提交)中所提供的那些，所述专利申请根据35USC 119(e)要求美国临时申请第60/852,149号(2006年10月17日提交)和第60/978,982号(2007年10月10日提交)的权益，所述美国申请都全部并入。
Draghia-Akli等人的美国专利第7,245,963号描述了模块化电极系统及其用于促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞的用途。所述模块化电极系统能够包含多个针电极；皮下注射针；电连接器，其提供从可编程恒流脉冲控制器到多个针电极的导电连接；和电源。操作人员能够握住安装在支撑结构上的多个针电极并且将其牢固地插入身体或植物中的选定组织中。然后通过皮下注射针将生物分子施用于选定的组织中。将可编程恒流脉冲控制器激活并且将恒流电脉冲施加到多个针电极。施加的恒流电脉冲有助于将生物分子引入多个电极之间的细胞中。美国专利第7,245,963号的完整内容以全文引用的方式并入本文。
Smith等人提交的美国专利公开2005/0052630描述了能够用于有效地促进将生物分子引入身体或植物中选定组织的细胞中的电穿孔装置。所述电穿孔装置包含电动装置(“EKD装置”)，其操作通过软件或固件来指定。所述EKD装置基于用户控制和脉冲参数的输入、在阵列中的电极之间产生一系列可编程恒流脉冲图案，并且能够存储和获取电流波形数据。电穿孔装置还包含具有针电极阵列的可更换电极盘、用于注射针的中心注射通道，以及可拆卸式导引盘。美国专利公开2005/0052630的完整内容以引用的方式完全并入本文。
美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/0052630中所述的电极阵列和方法不仅能够适于深度穿入组织(例如肌肉)，而且适于深度穿入其它组织或器官。由于电极阵列的配置，因此还将注射针(将所选生物分子递送到神经变性的系统中)完全插入靶器官中，并且在与电极预先界定的区域中垂直于靶组织施用注射。美国专利第7,245,963号和美国专利公开2005/005263中所述的电极优选20mm长和21号规格。
另外，合并电穿孔装置和其用途的一些实施例中涵盖作为以下专利中所述的那些电穿孔装置的电穿孔装置：1993年12月28日授权的美国专利5,273,525、2000年8月29日授权的美国专利6,110,161、2001年7月17日授权的美国专利6,261,281和2005年10月25日授权的美国专利6,958,060，以及2005年9月6日授权的美国专利6,939,862。另外，本文涵盖的专利覆盖2004年2月24日授权的美国专利6,697,669中所提供的标的，其涉及使用多种装置中的任一种施用DNA；以及2008年2月5日授权的美国专利7,328,064，其涉及DNA注射方法。以上专利以全文引用的方式并入。
制备疫苗的方法
本文提供了制备DNA质粒的方法，所述DNA质粒包含本文所论述的疫苗。使用所属领域中已知的方法能够将最终亚克隆到哺乳动物表达质粒的步骤之后的DNA质粒接种到大型发酵槽的细胞培养液中。
使用已知装置和技术的组合能够配制或制造结合本发明电穿孔装置使用的DNA质粒，但它们优选使用美国公开申请第20090004716号(2007年5月23日)中所述的优化质粒制造技术制造。在一些实例中，这些研究中所用的DNA质粒能够以大于或等于10mg/mL的浓度配制。除U.S.第60/939792号所述的那些之外，制造技术还包括或合并所属领域的技术人员通常已知的各种装置和方案，包括已许可的专利美国专利第7,238,522号(2007年7月3日授权)中所述的那些。以上提及的申请和专利、US第60/939,792号和美国专利第7,238,522号分别完整并入本文中。
本发明具有多个方面，通过以下非限制性实例说明。
实例
本发明在以下实例中进一步说明。应了解，这些实例虽然指出本发明的优选实施例，但是仅为了说明而提供。从以上论述和这些实例中，所属领域的技术人员能够确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，能够对本发明进行不同变更和修改以使其适于不同用途和条件。因此，所属领域的技术人员根据以上描述将显而易知除本文所示和所述之外的本发明的不同修改。也希望此类修改属于所附权利要求书的范围内。
实例1：MUC16中心串联重复域设计策略
人原生MUC16是长度为22,152个氨基酸的严重糖基化大型蛋白质。其由3个结构域构成：N端域、中心串联重复域，和羧基端域。由于人原生MUC16 N端域极大(12,068个氨基酸)并且缺乏重复序列，因此仅以中心串联重复域和羧基端域为目标(图1)。串联重复域和羧基端域应用不同的设计策略。
长度为9,799个氨基酸的人原生MUC16中心串联重复域是一系列63种同源重复域，除了最后一种重复域仅有127个氨基酸之外，其各自具有156个氨基酸。重复微共同(RMC)序列由于其长度和不同物种间的同源性缺乏，因此来源于多个人原生重复序列，以便潜在地诱发针对大部分人原生重复序列的交叉反应性T细胞。简单来说，在排除低品质的人原生重复序列之后，使用剩余的34种人原生重复序列进行谱系学分析(图2和图3)。结果表明这些序列可以聚类成四组重复序列，其彼此间共享>80％一致性。基于此前的基于T细胞的疫苗研发经历，每种微共同序列应该来源于彼此间共享>80％序列一致性的序列，以便诱发交叉反应性T细胞响应，所述T细胞响应针对用于产生这种微共同序列的原生重复。结果，产生四种RMC序列。
在未归入这些四个组中的任一组的那些重复序列中，只有三种其它原生重复序列(R61-63)与产生的所有四种重复微共同(RMC)序列(表1)共享＜80％序列一致性。表1显示了所有未分组的原生MUC16个别重复序列(R14、R1、R55、R56、R21、R58、R22、R59、R60、R61、R63和R62)与RMC1-4的序列一致性百分比。粗体表示除R61、R62和R63之外，剩余未分组的原生重复序列与至少一个RMC共享≥80％一致性百分比(基因库：AAL65133.2)。
表1
R14 R1 R55 R56 R21 R58 R22 R59 R60 R61 R63 R62
RMC#1 87.2 79.4 85.2 80.6 81.8 80.6 83.1 83.9 78.7 74.7 48.4 45.5
RMC#2 85.3 80.6 87.7 83.9 83.8 80.6 83.1 83.9 80.0 76 50 45.5
RMC#3 77.6 70.3 75.5 75.5 76.6 76.8 79.9 79.4 75.5 70.8 54.8 47
RMC#4 77.6 74.8 83.2 79.4 82.5 80.0 83.1 82.6 78.7 77.9 51.6 47.7
为了潜在地增加疫苗所诱导的T细胞响应的广度，MUC16中心串联重复域设计中包括这些三种重复序列作为个别元件。原生重复的其余部分(R1、R14、R55、R56、R21、R58、R22、R59和R60)与至少一个RMC共享≥80％序列一致性，并且应该被四种RMC序列中的至少一种覆盖。
总之，不使用以中心串联重复域为目标的合成共同设计方案。相反，依次产生来源于多种人原生重复序列的4种RMC序列，以潜在地诱发针对大部分人原生重复序列的交叉反应性T细胞。各RMC来源于彼此间共享>80％序列一致性的重复序列。MUC16中心串联重复域设计中还包括与所有4种RMC序列都共享<80％序列一致性的原生重复R61、R62和R63作为个别元件，以便潜在地增加疫苗所诱导的T细胞响应的广度。
实例2：MUC16羧基端域设计策略
人原生MUC16的羧基端域具有284个氨基酸的长度并且由细胞外胞外域、跨膜域和短细胞质尾区组成。不同于中心串联重复域，羧基端域在许多物种间具有良好的保守性。然而，MUC16的细胞质尾区含有多个潜在的S/T/Y磷酸化位点，表明MUC16涉及信号转导路径(图4)。在图4中，方框表示潜在的S/T/Y磷酸化位点。N-糖基化位点和O-糖基化位点分别用X和O指示。O'Brien,T.J.等人，肿瘤生物学：国际肿瘤发育生物学与医学会杂志(Tumourbiology:Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biologyand Medicine)22，348-366(2001)。为了防止非所需地触发下游信号传导，任一种MUC16免疫原中均不包含细胞质尾区(原生羧基端域的氨基酸254-284)。
共同MUC16胞外域和跨膜域的产生
使用21种来自基因库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)的MUC16胞外域和跨膜域序列构建缺乏细胞质尾区的人共同MUC16羧基端域。这些序列的基因库寄存编号是：AAL65133.2、XP_004059993.1、XP_014197952.1、XP_003914869.1、XP_007993338.1、XP_011739103.1、XP_011932759.1、XP_011810358.1、XP_015296314.1、XP_010387164.1、XP_008985417.1、XP_010347904.1、XP_012291241.1、XP_011287799.1、XP_003354138.3、XP_014410271.1、XP_015096370.1、XP_011373099.1、XP_011226599.1、XP_008703704.1和XP_012496675.1。
共同序列是使用
Figure BDA0002616945040000531
Lasergene套装软体(13.0.0.357版)产生。将MUC16胞外域和跨膜域序列输入MegAlign并且使用ClustalW多序列比对程序进行比对。所得MUC16胞外域和跨膜域序列经测定与人原生MUC16胞外域和跨膜域共享96.0％-96.4％一致性。
将突变引入羧基端域以消除MUC16生物功能的基本原理
产生共同MUC16胞外域和跨膜域之后，引入三个天冬酰胺(N)向丙氨酸(A)突变(N→A)以消除所得共同MUC16胞外域和跨膜域蛋白质的生物功能。由于MUC16的羧基端胞外域已经涉及促进肿瘤发生、肿瘤侵袭和转移，因此引入这些三个突变。Rao,T.D.等人，PloSone 10(2015)。Rao等人表明，为了消除N-糖基化而将这些三个N→A突变引入MUC16胞外域中使得移植已转染的3T3纤维母细胞的无胸腺裸小鼠中的ERK1/2和AKT磷酸化和体内肿瘤生长显著减少。对3个N→A突变引入合成共同MUC16构建体之后的生物功能的消除不进行试管内或体内评估。
MUC16羧基端域设计概述
产生共同MUC16胞外域和跨膜域并且引入三个突变(N→A)以消除N-糖基化(图5)。经修饰的共同MUC16胞外域和跨膜域与人原生MUC16胞外域和跨膜域共享95.3％一致性。表2显示了所产生的MUC16胞外域和跨膜域与人原生MUC16胞外域和跨膜域的序列同源百分比。
表2
Figure BDA0002616945040000541
1＝共同MUC16胞外域和跨膜域的产生
2＝人原生MUC16胞外域和跨膜域
实例3：组装RMC、原生重复序列和合成共同MUC16胞外域和跨膜域(CTD)以减少引入脱靶抗原决定基的可能性的策略
MUC16设计中欲包括的元件包括四个RMC、三个原生重复序列以及合成共同MUC16胞外域和跨膜域(CTD)。初始设计策略是通过如图6A-6B中所示合并元件来产生MUC16免疫原(初步合成MUC16免疫原)。然而，由于这种免疫原中的RMC1-RMC2、RMC2-RMC3、RMC3-RMC4、RMC4-R61和R63-合成共同MUC16胞外域和跨膜域接合点不存在于原生MUC16序列中，因此如果这些接合点与至少一个原生MUC16重复接合点不共享高度的序列一致性，则能够潜在地引入无关的脱靶抗原决定基。为了测定合成免疫原接合点与所有MUC16原生重复接合点的序列一致性，将所有相邻原生重复序列的最后11个氨基酸和起始11个氨基酸与所有相邻合成免疫原接合点(RMC1 RMC2、RMC2-RMC3、RMC3-RMC4、RMC4 R61，和R63-合成共同CTD)的最后11个氨基酸和起始11个氨基酸对准。分析结果表明，所有合成免疫原接合点与至少一个原生重复接合点共享>95.2％序列一致性，例外为RMC4-R61合成免疫原接合点，其与所有原生重复接合点仅共享至多76.2％序列一致性(图6A)。
为了减少RMC4-R61接合序列中引入脱靶抗原决定基的可能性，将原生MUC16重复序列59(R59)插入RMC4与R61之间(合成共同IRC+R59免疫原)(图6B)。序列分析表明，相较于RMC4-R61接合点，RMC4-R59和R59-R61接合点与原生重复接合点共享较高一致性(分别为85.7％和90.9％)。此外，使用免疫抗原决定基数据库资源分析资源(//tools.iedb.org/mhci/)进行的MHC I类抗原决定基预测不能预测出HLA-A*02:01单倍型在RMC4-R59和R59-R61接合点的强结合子。
还利用其它策略来避免引入RMC4-R61接合点，包括：使用两种质粒(一种表达RMC1-RMC4免疫原，而另一种表达R61、R62、R63和合成共同MUC16 CTD免疫原)，在初步合成免疫原的RMC4与原生R61之间添加弗林蛋白酶裂解位点，和使用双重启动子表达载体，其中一个启动子(hCMV)驱动RMC1-RMC4免疫原的表达，而另一个启动子(sCMV)驱动R61、R62、R63和合成共同MUC16 CTD免疫原的表达。结果产生了五种不同的合成共同MUC16 DNA质粒，如表3中所示。合成共同MUC16免疫原的示意图显示于图7中。
表3
Figure BDA0002616945040000551
为了达到较高表达水平，将上游Kozak和IgE前导序列添加到所有四种合成共同MUC16免疫原的N端。Yang,J.S.等人，《传染病杂志(The Journal of infectiousdiseases)》184，809-816(2001)。另外，编码这些免疫原的DNA序列的密码子使用适于智人基因的密码子偏好。Andre,S.等人，《病毒学杂志(Journal of virology)》72，1497-1503(1998)；Deml,L.等人，《病毒学杂志》75，10991-11001(2001)。
另外，还执行RNA优化：GC含量极高(>80％)或极低(<30％)的区域，并且避免顺式作用序列基序，例如内部TATA盒、χ位点和核糖体进入位点。Schneider,R.等人，《病毒学杂志》71,4892-4903(1997)；Muthumani,K.等人，《病毒学(Virology)》314,134-146(2003)。已合成的合成共同MUC16免疫原用BamHI和XhoI(pGX1435-pGX1438)或PmeI和XhoI或SalI和MluI(pGX1439)消化，并且克隆到Inovio的表达载体pGX0001(pGX1435-38)或Inovio的双重启动子表达载体pGX0003(pGX1439)中。对于所有合成共同MUC16质粒而言，进行全长测序，然后由两个分析员分析且证实为正确的。
合成共同MUC16免疫原的中心串联重复区域的代表性比较模型(基于合成共同MUC16 IRC序列)显示于图8A-8C中。图8A是原生MUC16(基于基因库AAL65133.2)和合成共同MUC16 IRC的示意图。两种分子之间在尺寸上存在显著差异，并且原生序列含有合成共同版本中不存在的其它结构域。原生MUC16与合成共同MUC16 IRC均含有一系列海胆精子蛋白质、肠激酶和集聚素(SEA)样重复序列和跨膜域。在合成共同MUC16 IRC中，所述重复序列是基于中心串联重复设计策略章节中所述的微共同序列方案。如图8B中所示，比较性建模说明了原生MUC16与合成共同MUC16 IRC设计之间的尺寸差异。对原生MUC16与合成共同MUC16IRC的SEA样重复模块进行建模。由于原生序列的尺寸，因此仅在低分辨率下执行建模并且供传递相对尺寸信息。图8C显示以cpk格式所示的合成共同MUC16 IRC重复区域的比较模型。MUC16的大N端区域以及C端区域不含有亲本模板可靠的序列，这是它们为何不能建模的原因。
合成共同MUC16 IRC+R59的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)分别存在于表21和表22中。合成共同MUC16 RMC的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)分别存在于表23和表24中。合成共同MUC16 NRC的核苷酸序列(SEQ IDNO:5)和氨基酸序列(SEQ ID NO:6)分别存在于表25和表26中。合成共同MUC16 IRC的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)和氨基酸序列(SEQ ID NO:8)分别存在于表27和表28中。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8和相应氨基酸位置的元件注释提供于表4中。
表4
Figure BDA0002616945040000561
Figure BDA0002616945040000571
合成共同MUC16免疫原与原生序列之间的差异概述于表5中。由于中心串联重复域的尺寸在物种间不同(人：63个重复域，恒河猴：4个重复域；小鼠：15个重复域)，且个别重复域的尺寸在物种间大大不同，因此将全长合成MUC16免疫原序列与物种特有的原生序列准确地对准是一种挑战。因此，对于中心串联重复域而言，仅将合成构建体的海胆精子蛋白质、肠激酶和集聚素(SEA)结构域区域与人、小鼠和恒河猴原生SEA域序列进行比较，原因是这个区域是重复序列的最保守区域。
表5
Figure BDA0002616945040000572
Figure BDA0002616945040000581
实例4：质粒构建和结构
pGX0001
载体主链pGX0001是经修饰的2998bp pVAX1表达载体，其处于人巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)的控制下。原始pVAX1获自赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)。pGX0001主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。经修饰的表达载体pVAX1(pGX0001)的图谱和描述分别显示于图9和表6中。
表6
元件： 碱基对：
CMV启动子： 137-724
T7启动子/预致敏位点 664-683
多克隆位点 696-811
牛聚腺苷酸化信号 829-1053
卡那霉素抗性基因 1226-2020
pUC起点 2319-2992
将修饰引入pVAX1中以建立pGX0001。这些修饰在表7中列出，并且未检测出关于质粒扩增和抗原转录和翻译的问题。在使用pGX0001作为主链的平台中，在任一种质粒产物中均未观察到pGX0001序列发生进一步变化。主链中位于CMV启动子上游的碱基对2、3和4从ACT变为CTG。
表7
修饰 碱基对 描述
C>G 241 在CMV启动子中
C>T 1158 主链，牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)下游
A>- 2092 主链，卡那霉素抗性基因下游
C>T 2493 在pUC复制起点(pUC ori)中
G>C 2969 在RNASeH位点上游的pUC Ori的最末端中
pGX0003
载体主链pGX0003是具有两个供插入的多克隆位点的4596个碱基对真核表达质粒，其处于两种启动子的控制下：具有SV40聚腺苷酸信号的hCMV启动子和具有bGH聚腺苷酸信号的sCMV启动子。这种主链还包含KanR和pUC ori。pGX0003的图谱和描述分别显示于图10和表8中。
表8
元件： 碱基对：
hCMV启动子： 3548-4373
猴病毒40聚腺苷酸化信号 4391-4596
Scmv启动子 2558-3060
牛聚腺苷酸化信号 2290-2528
卡那霉素抗性基因 298-1059
pUC起点 1227-1900
pGX1435
通过将合成共同MUC16(合成共同MUC16 IRC+R59)DNA序列克隆到pGX0001中的BamHI和XhoI位点来制备pGX1435。相关mRNA产生是由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。pGX0001主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。pGX1435和合成共同MUC16 IRC+R59的示意图呈现于图11中，并且质粒的元件和相应碱基对呈现于表9中。
表9
Figure BDA0002616945040000591
Figure BDA0002616945040000601
pGX1436
通过将合成微共同MUC16(合成共同MUC16 RMC)DNA序列克隆到pGX0001中的BamHI和XhoI位点来制备pGX1436。相关mRNA产生是由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。pGX0001主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。pGX1436和合成共同MUC16 RMC的示意图呈现于图12中，并且质粒的元件和相应碱基对呈现于表10中。
表10
元件： 碱基对：
hCMV启动子： 137-724
合成共同MUC16RMC编码序列： 742-2673
bGH PolyA： 2717-2941
卡那霉素抗性(KanR)： 3114-3908
pUC Ori： 4207-4880
pGX1437
通过将合成共同MUC16(合成共同MUC16 NRC)DNA序列克隆到pGX0001中的BamHI和XhoI位点来制备pGX1437。相关mRNA产生是由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。pGX0001主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。pGX1437和合成共同MUC16 NRC的示意图呈现于图13中，并且质粒的元件和相应碱基对呈现于表11中。
表11
元件： 碱基对：
hCMV启动子： 137-724
合成共同MUC16NRC编码序列： 742-2877
bGH PolyA： 2921-3145
卡那霉素抗性(KanR)： 3318-4112
pUC Ori： 4411-5084
pGX1438
通过将合成共同MUC16(合成共同MUC16 IRC)DNA序列克隆到pGX0001中的BamHI和XhoI位点来制备pGX1438。相关mRNA产生是由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素3'末端聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。pGX0001主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。pGX1438和合成共同MUC16 IRC的示意图呈现于图14中，并且质粒的元件和相应碱基对呈现于表12中。
表12
启动子： 碱基对：
hCMV启动子： 137-724
合成共同MUC16IRC编码序列： 742-4770
bGH PolyA： 4814-5038
卡那霉素抗性(KanR)： 5211-6005
pUC Ori： 6304-6977
pGX1439
通过将合成共同MUC16 RMC DNA序列克隆到pGX0003中的SalI和MluI位点且将合成共同MUC16 NRC DNA序列克隆到PmeI和XhoI位点来制备pGX1439。
pGX1439是一种双重启动子DNA质粒，其中合成共同MUC16 RMC相关mRNA产生是由人CMV启动子(hCMV启动子)驱动并且通过猴病毒40聚腺苷酸化信号(SV40polyA)终止，并且其中合成共同MUC16 NRC相关mRNA产生是由猿猴CMV启动子(sCMV启动子)驱动并且通过牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)终止。pGX0003主链包括卡那霉素抗性基因(KanR)和质粒复制起点(pUC ori)用于产生目的。那些元件在真核细胞中不具有功能。
pGX1439和合成共同MUC16 RMC和合成共同MUC16 NRC的示意图呈现于图15中，并且质粒的元件和相应碱基对呈现于表13中。
表13
元件： 碱基对：
hCMV启动子： 5682-6506
合成共同MUC16RMC编码序列： 6524-8455
SV40PolyA 8457-8662
卡那霉素抗性(KanR)： 298-1059
pUC Ori： 1227-1900
sCMV启动子 4703-5193
合成共同MUC16NRC编码序列： 2557-4692
bGH PolyA 2290-2528
实例5：试管内抗原表达
通过蛋白质印迹法证实pGX1435、pGX1436、pGX1437、pGX1438和pGX1439对抗原蛋白质的表达。使用Turbofectin 8(Origene)，用pGX1435、pGX1436、pGX1437、pGX1438、pGX1439或pGX0001(6μg/10cm2培养皿)转染人横纹肌肉瘤(RD)细胞(ATCC，CCL-136)，所述细胞在含有10％FBS的DMEM培养基(赛默飞世尔)中维持。转染之后的四十八小时，使用RIPA细胞溶解缓冲液(赛默飞世尔)溶解细胞且收集细胞溶解物。BCA分析(赛默飞世尔)测定总蛋白质浓度之后，使15μg细胞溶解物在4-12％SDS-PAGE凝胶(赛默飞世尔)上电泳并且用抗MUC16抗体(Abcam，克隆EPSISR23-96，ab168360)执行检测，然后使用ECL蛋白质印迹分析系统(GE Amersham)、使用辣根过氧化酶(HRP)偶联的抗兔IgG(Santa Cruz Biotech，#sc-2004)可视化。作为内参照，使用抗β-肌动蛋白单克隆抗体(Santa Cruz Biotech，克隆C4)再探测印迹中的肌动蛋白表达。
检测合成共同MUC16的预期分子量(～162.5kD)的蛋白质色带，以及区域1(～68.2kDa)和区域2(～77.2kDa)的蛋白质色带(图16)。pGX0001泳道中未检测到蛋白质色带，表明蛋白质色带是合成共同Muc16所特有的。检测到抗β-肌动蛋白色带的强度相似，表明每个泳道中装载的蛋白质的量相等。发现pGX1435和pGX1438表达其相应抗原蛋白质并且发现pGX1436、pGX1437和pGX1439表达其相应抗原蛋白质区域。
实例6：合成共同间皮素疫苗构建体的免疫原性
动物和免疫接种
8周龄雌性CB6F1小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)。所有动物圈养于BTS研究所(加州圣地亚哥)的温度可控的光循环机构中。根据美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)指导原则以及动物照护和使用提案(ACUP)(BTS ACUP#15-091)进行动物照护。将小鼠分成十六个组，如表14中所详述。
表14
Figure BDA0002616945040000621
Figure BDA0002616945040000631
免疫组小鼠根据SOP R20-003147
Figure BDA0002616945040000632
3P小鼠疗法接种指定剂量的pGX0001或pGX1435、pGX1436、pGX1437、pGX1438、pGX1439。简单地说，在无菌注射用水(VetOne)中配制质粒，以便以30μL注射体积通过肌肉内注射将指定的剂量递送到胫骨前肌肌肉中。每次肌肉内注射之后立即使用具有3P阵列的2000适应性恒定电流电穿孔装置(Inovio制药)进行电穿孔(EP)。装置被配置成递送两个0.1Amp脉冲，52ms脉冲宽度，间隔1秒延迟。由于小鼠和分组的数量大，因此每组一半小鼠隔3周接受3次免疫接种。最后一次免疫接种之后的一周处死这些小鼠且收获脾脏用于细胞免疫读数。每组中的另一半小鼠接受3次免疫接种(隔3周)。最后一次免疫接种之后的一周处死小鼠且收获脾脏用于细胞免疫读数。不收集其它组织。
脾脏淋巴细胞分离
以无菌方式分离出脾细胞并且置于5mL R10培养基(罗斯韦尔帕克纪念研究所(Rosewell Park Memorial Institute)，补充有10％胎牛血清和1％抗生素-抗霉菌素的培养基1640)中。通过使用Stomacher机器(Seward实验室系统有限公司)机械破碎脾脏来分离脾细胞，并且使用40μm细胞过滤器(BD Falcon)过滤所得产物。将所得产物离心并且集结粒使用ACK溶解缓冲液(Lonza)处理5分钟以便溶解RBC。然后将脾细胞离心，用PBS洗涤，并且然后再悬浮于R10培养基中且立即用于进一步的分析。
IFNγELISpot
使用MabTech的试剂盒(MabTech，#3321-4APW-10)执行小鼠IFNγELISpot分析以评估抗原特异性细胞响应。经抗小鼠IFNγ抗体(mAb AN18)预涂布的九十六孔板用PBS洗涤并且在室温下用R10培养基阻断2小时，并且然后以每孔2×105个细胞的输入细胞数量涂覆(一式三份)。合成一组肽(GenScript)，其各自含有15个氨基酸残基(有11个氨基酸重叠)，代表每种构建体的完整合成共同MUC16蛋白质序列。将这些组的肽再悬浮于DMSO(Sigma)中并且以约2μg/ml肽的浓度合并成六个肽池。肽池含有与合成共同MUC16抗原蛋白质对应的肽，如图17提供的示意图中所示。5μg/ml的刀豆蛋白A(Concavalin A)(Sigma)用作阳性对照并且完全培养基用作阴性对照。培养板在5％CO2气氛的培育箱中、在37℃下培育18小时。然后，添加生物素化抗小鼠IFNγ检测抗体(MabTech，mAb R4-6A2)，并且培养板在室温下培育2小时。洗涤培养板，并且添加抗生蛋白链菌素-ALP抗体(MabTech)并且培养板在室温下培育1小时。根据试剂盒制造商的说明书(MabTech)，使用BCIP/NBT底物完成斑点检测。培养板上的斑点使用自动化ELISPOT读取器(细胞技术(Cellular Technology))计数。将斑点形成单元(SFU)的平均数调整到1×106个脾细胞用于数据显示。
IFNγELISpot中的抗原特异性响应作为每1×106个脾细胞的IFNγ斑点形成单元(SFU)的数量报道，其大于单独培养基对照组中的SFU。
通过IFNγELISpot和流式细胞术(n＝8/组)评估合成共同MUC16构建体在三种剂量(10μg、30μg和50μg)下的免疫原性。使用空质粒主链(pGX0001)作为阴性对照(n＝4/组)将小鼠免疫。相较于接种阴性对照物的小鼠，接种合成共同MUC16全长构建体(pGX1435、pGX1438和pGX1439)诱导格外稳健的细胞免疫响应。
pGX1435诱导合成共同MUC16产生IFNγ的量级(如ELISpot所测定)具有剂量依赖性(图18A)。具体地说，合成共同MUC16 pGX1435 IFNγSFU在10μg、30μg和50μg剂量下分别是1564±661、3858±2767和5407±1959。pGX1435在10μg(p＝0.002)、30μg(p＝0.028)和50μg(p＝0.001)剂量的情况下，pGX1435诱导的合成共同MUC16IFNγ响应显著大于未处理组。图18D中还指出了对pGX1435所诱导的独特R59(肽池6)抗原决定基的可检测的响应。
pGX1438构建体诱导合成共同MUC16特异性IFNγ产生的量级(如ELISpot所测定)不具有依赖剂量性，其中较低剂量诱导的响应较稳健(图18B)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1438 IFNγSFU分别是5628±3144、7668±3371和6005±3472。pGX1435在10μg(p＝0.008)、30μg(p＝0.002)和50μg(p＝0.009)剂量的情况下，pGX1438诱导的合成共同MUC16 IFNγ响应显著大于未处理组。
pGX1439构建体诱导合成共同MUC16特异性IFNγ产生的量级(如ELISpot所测定)也不具有剂量依赖性，其中较低剂量诱导的响应较稳健(图18C)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，pGX1439合成共同MUC16 IFNγSFU分别是3180±1377、6138±2696和4862±2069。pGX1435在10μg(p＝0.002)、30μg(p＝0.002)和50μg(p＝0.002)剂量的情况下，合成共同MUC16 pGX1439 IFNγ响应显著大于未处理组。
全长构建体的IFNγ响应概述于表15中。
表15
Figure BDA0002616945040000641
Figure BDA0002616945040000651
相较于接种阴性对照物的小鼠，接种合成共同MUC16部分长度构建体(pGX1436和pGX1437)也诱导了格外稳健的细胞免疫响应。
pGX1436构建体诱导的针对区域1的合成共同MUC16特异性IFNγ产生的量级(如ELISpot所测定)具有剂量依赖性(图19A)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，pGX1436诱导的合成共同MUC16特异性IFNγSFU分别是3609±1377、4711±2365和5565±3496。pGX1436在10μg(p＝0.001)、30μg(p＝0.004)和50μg(p＝0.014)剂量的情况下，pGX1436诱发的合成共同MUC16 IFNγ响应显著大于未处理组。对所有MUC16构建体诱导的针对区域1的IFNγ响应进行比较时，pGX1435诱导的响应显著低于pGX1438(图19B)。
pGX1437构建体诱导的针对区域2的合成共同MUC16特异性IFNγ产生的量级(如ELISpot所测定)也具有剂量依赖性(图19C)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1437 IFNγSFU分别是835±428、1893±1291和2399±1245。pGX1437在10μg(p＝0.005)、30μg(p＝0.022)和50μg(p＝0.005)剂量的情况下，合成共同MUC16 pGX1437 IFNγ响应显著大于未处理组。对于pGX1438而言，存在更稳健的针对区域2的IFNγ产生的倾向(图19D)。
部分长度构建体的IFNγ响应概述于表16中。
表16
Figure BDA0002616945040000661
流式细胞术
合成共同MUC16诱导的细胞免疫响应通过流式细胞术进一步表征。来自接种疫苗和未处理小鼠的2×106个脾细胞在分离之后，立即在布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(BDBiosciences)、莫能菌素(Monensin)(BD Biosciences)和FITC抗小鼠CD107a抗体(BDBiosciences)的存在下用合成共同MUC16肽刺激6小时。肽刺激之后，将脾细胞离心并且再悬浮于每孔20μL的小鼠BD Fc阻断(BD Biosciences)溶液中。Fc阻断溶液在PBS中以1:40的初始稀释度使用并且在4℃下培育5分钟。
培育之后，每孔添加30μL剩余细胞外抗体(于PBS中)并且在4℃培育30分钟。添加细胞外染色剂之后，每个孔中的最终体积是50μL，由最终稀释度为1:100的Fc阻断溶液和其适当工作稀释度的细胞外抗体组成。细胞然后用活力染料(Vivid，赛默飞世尔)和以下细胞外抗体染色：PerCP-Cy5.5抗小鼠CD4(BD Biosciences，克隆RM4-5)和APC抗小鼠CD8a(BDBiosciences，克隆63-6,7)。细胞内细胞因子随后用以下抗体染色：BV605抗小鼠IFNγ、APC-R700抗小鼠IL-2，和PE抗小鼠TNF-α(BD Biosciences)。将细胞固定且在4℃下渗透(BDBiosciences，#554714)20分钟。细胞内染色随后使用以下抗体完成：APC-Cy7抗小鼠CD3e(BD Biosciences，克隆145-2C11)、BV605抗小鼠IFNγ(BD Biosciences，克隆XMG1.2)、APC-R700抗小鼠IL-2(BD Biosciences，克隆JEs6-5H4)，和PE抗小鼠TNF-α(BDBiosciences，克隆MP6-XT22)。
在10色FACS CANTO(BD Biosciences)上收集ICS数据且使用FlowJo软件完成分析。流式细胞术设门策略显示在图20中。对于称为抗原特异性(根据流式细胞术)的细胞而言，所报道参数的频率必须超过单独培养基对照的频率。对于经鉴定产生抗原特异性CD107a的细胞来说，必须还鉴定出细胞就IFNγ和/或IL-2和/或TNFα的抗原特异性产生而言呈阳性，如通过布尔设门(Boolean gating)所鉴定。
合成共同MUC16全长构建体诱发CD4+T细胞代谢区产生强烈的响应，其中pGX1438稳健性最强(图21A-21C)。在10μg、30μg和50μg pGX1435、pGX1438和pGX1439的剂量组中，合成共同MUC16诱导抗原特异性CD4+T细胞响应的频率比未处理组显著更稳健(0.29％±0.23％)(图21A-21C)。
合成共同MUC16 pGX1435构建体特异性CD4+T细胞的量级具有剂量依赖性(图21A)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1435 CD4+T细胞分别是1.34％±0.45％、2.27％±1.38％和3.12％±1.45％。pGX1435在10μg(p<0.001)、30μg(p＝0.020)和50μg(p＝0.004)剂量的情况下，合成共同MUC16 pGX1435CD4+T细胞显著大于未处理组。合成共同MUC16 pGX1435特异性CD4+T细胞响应主要由产生IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-的CD4+T细胞组成。
合成共同MUC16 pGX1438构建体特异性CD4+T细胞的量级也具有剂量依赖性(图21B)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1438 CD4+T细胞分别是3.12％±1.19％、3.73％±1.48％和4.06％±1.87％。pGX1438在10μg(p＝0.001)、30μg(p＝0.001)和50μg(p＝0.003)剂量的情况下，合成共同MUC16 pGX1438CD4+T细胞显著大于未处理组。合成共同MUC16 pGX1438特异性CD4+T细胞响应主要由产生IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-的CD4+T细胞组成。
合成共同MUC16 pGX1439构建体特异性CD4+T细胞的量级具有剂量依赖性(图21C)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1439 CD4+T细胞分别是1.99％±0.99％、2.71％±0.51％和3.25％±1.29％。pGX1439在10μg(p＝0.007)、30μg(p<0.001)和50μg(p＝0.001)剂量的情况下，合成共同MUC16 pGX1439CD4+T细胞显著大于未处理组。合成共同MUC16 pGX1439特异性CD4+T细胞响应主要由产生IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-的CD4+T细胞组成。抗原特异性CD4+T细胞的频率进一步详述于表17中。
所有剂量的合成共同MUC16全长构建体诱导CD4+CD107a+T细胞的频率大于未处理组(0.08％±0.04％)，但只有pGX1438构建体在所有剂量下都显著更稳健。
具体地说，在10μg(p＝0.011)、30μg(p＝0.297)和50μg(p＝0.008)剂量组中，pGX1435抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.27％±0.14％、0.32％±0.37％和0.64％±0.34％(图21A)。pGX1435特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图22A)。
在10μg(p＝0.004)、30μg(p＝0.029)和50μg(p＝0.004)剂量组中，pGX1438抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.40％±0.18％、0.54％±0.36％和0.53％±0.25％(图21B)。pGX1438特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似并且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图22B)。
在10μg(p＝0.069)、30μg(p＝0.008)和50μg(p＝0.006)剂量组中，pGX1439抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.26％±0.18％、0.36％±0.18％和0.50％±0.25％(图22C)。pGX1439特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似并且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图22C)。具有溶胞潜力的抗原特异性CD4+T细胞的频率进一步详述于表17中。
表17
Figure BDA0002616945040000681
Figure BDA0002616945040000691
在所有构建体的所有剂量组中，合成共同MUC16全长构建体诱导的抗原特异性CD8+T细胞的频率相对于对照组增加(0.13％±0.15％)(图23A-23C)。具体地说，10μg(0.65％±0.28％，p＝0.007)、30μg(0.82％±0.46％，p＝0.022)和50μg(1.60±1.08％，p＝0.034)pGX1435免疫组的抗原特异性CD8+T响应的频率比未处理组显著更稳健。合成共同MUC16pGX1435特异性CD8+T细胞响应具有剂量依赖性并且主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+的CD8+T细胞组成(图23A)。
10μg(1.30％±0.79％，p＝0.024)、30μg(1.33％±0.87％，p＝0.034)和50μg(1.36％±0.71％，p＝0.010)pGX1438免疫组的抗原特异性CD8+T响应的频率也比未处理组显著更稳健。合成共同MUC16 pGX1438特异性CD8+T细胞响应不具有剂量依赖性，各剂量之间的差异极小，并且主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+的CD8+T细胞组成(图23B)。
10μg(1.36％±0.62％，p＝0.004)、30μg(2.07％±1.77％，p＝0.089)和50μg(1.19％±0.69％，p＝0.020)pGX1439免疫组的抗原特异性CD8+T响应的频率比未处理组更稳健。合成共同MUC16 pGX1439特异性CD8+T细胞响应不具有剂量依赖性并且主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+的CD8+T细胞组成(图23C)。抗原特异性CD8+T细胞的频率进一步详述于表18中。
除了30μg剂量的pGX1439之外，类似于抗原特异性CD8+T细胞的模式，合成共同MUC16全长构建体诱导所有组的CD8+CD107a+T细胞的频率相较于未处理组发生了显著变化(0.05％±0.04％)(图24A-24C)。具体地说，在10μg(p＝0.005)、30μg(p＝0.013)和50μg(p＝0.043)pGX1435剂量组中，抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是0.47±0.23％、0.59±0.34％和1.19±0.90％(图24A)。pGX1435特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似且主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图23A)。
在10μg(p＝0.016)、30μg(p＝0.039)和50μg(p＝0.016)pGX1438剂量组中，抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是0.80％±0.48％、1.05％±0.77％和1.05％±0.65％(图23B)。pGX1438特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似并且主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图24B)。
在10μg(p＝0.018)、30μg(p＝0.094)和50μg(p＝0.038)pGX1439剂量组中，抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是1.04％±0.65％、1.68％±1.54％和0.93％±0.68％(图23C)。pGX1439特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似并且主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图24C)。具有溶胞潜力的抗原特异性CD8+T细胞的频率进一步详述于表18中。
表18
Figure BDA0002616945040000701
合成共同MUC16部分长度构建体诱发CD4+T细胞代谢区产生强烈的响应(图25A-25B和图26A-26B)。合成共同MUC16 pGX1436构建体特异性CD4+T细胞的量级不具有剂量依赖性(图25A)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1436 CD4+T细胞分别是1.74％±0.79％、2.18％±1.15％和1.32％±1.74％。在10μg(p＝0.003)和30μg(p＝0.007)剂量下，合成共同MUC16 pGX1436 CD4+T细胞显著大于未处理组(0.17％±0.10％)，但在50μg(p＝0.359)pGX1436剂量下则不然。合成共同的MUC16 pGX1436特异性CD4+T细胞响应主要由产生IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-的CD4+T细胞组成。在10μg(p＝0.020)、30μg(p＝0.080)和50μg(p＝0.369)剂量组中，pGX1436抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.45％±0.28％、0.31％±0.26％和0.23％±0.30％(图25B)。pGX1436特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图25B)。具有溶胞潜力的抗原特异性CD4+T细胞的频率进一步详述于表19中。
合成共同MUC16 pGX1437构建体特异性CD4+T细胞的量级具有剂量依赖性(图26A)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1437 CD4+T细胞分别是0.56％±0.38％、1.14％±0.36％和1.87％±1.05％。在30μg(p<0.001)和50μg(p＝0.011)下，合成共同MUC16 pGX1437 CD4+T细胞显著地大于未处理组(0.21％±0.14％)，但在10μg(p＝0.063)pGX1437剂量下则不然。合成共同MUC16 pGX1437特异性CD4+T细胞响应主要由IFNγ+IL-2+TNFα+、IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ-IL-2-TNFα+的CD4+T细胞组成。在10μg(p＝0.335)、30μg(p<0.001)和50μg(p＝0.016)剂量组中，pGX1437抗原特异性CD4+CD107a+T细胞的频率分别是0.09％±0.09％、0.21％±0.05％和0.36％±0.21％(图26B)。pGX1437特异性CD4+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似且主要包含IFNγ+IL-2+TNFα+和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图26B)。具有溶胞潜力的抗原特异性CD4+T细胞的频率进一步详述于表19中。
表19
Figure BDA0002616945040000711
Figure BDA0002616945040000721
合成共同MUC16部分长度构建体诱发CD8+T细胞代谢区产生稳健响应(图27A-27B和图28A-28B)。合成共同MUC16 pGX1436构建体特异性CD8+T细胞的量级不具有剂量依赖性(图27A)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1436 CD8+T细胞分别是1.76％±0.73％、2.17％±0.81％和1.92％±2.13％。在10μg(p＝0.002)和30μg(p＝0.001)下，合成共同MUC16 pGX1436 CD8+T细胞显著大于未处理组(0.06％±0.08％)，但在50μg(p＝0.192)的pGX1436剂量下则不然。合成共同MUC16 pGX1436特异性CD8+T细胞响应主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα-或IFNγ+IL-2-TNFα+的CD8+T细胞组成。在10μg(p＝0.001)、30μg(p＝0.001)和50μg(p＝0.193)剂量组中，pGX1436抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是1.55％±0.64％、1.86％±0.73％和1.72％±1.95％(图26B)。pGX1436特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似且主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(图27B)。总的来说，对pGX1435诱导的针对区域1的CD8+T细胞响应显著低于pGX1436(图29A)。具有溶胞潜力的抗原特异性CD8+T细胞的频率进一步详述于表20中。
合成共同MUC16 pGX1437构建体特异性CD8+T细胞的量级具有剂量依赖性(图28A)。具体地说，在10μg、30μg和50μg剂量下，合成共同MUC16 pGX1437 CD8+T细胞分别是0.26％±0.14％、0.77％±0.47％和0.89％±0.37％。在30μg(p＝0.025)和50μg(p＝0.001)下，合成共同MUC16 pGX1437 CD8+T细胞显著大于未处理组(0.07％±0.07％)，但在10μg(p＝0.069)pGX1437剂量下则不然。合成共同MUC16 pGX1437特异性CD8+T细胞响应主要由产生IFNγ+IL-2-TNFα+或IFNγ+IL-2-TNFα-的CD8+T细胞组成。在10μg(p＝0.022)、30μg(p＝0.030)和50μg(p＝0.002)剂量组中，pGX1437抗原特异性CD8+CD107a+T细胞的频率分别是0.16％±0.10％、0.58％±0.40％和0.89％±0.37％(图28B)。pGX1437特异性CD8+CD107a+T细胞的细胞因子谱跨剂量组相似且主要包含IFNγ+IL-2-TNFα-和IFNγ+IL-2-TNFα+细胞(28B)。总体上，pGX1435和pGX1438诱导的针对区域2的CD8+T细胞响应显著地低于pGX1437(图29B)。具有溶胞潜力的抗原特异性CD8+T细胞的频率进一步详述于表20中。
表20
Figure BDA0002616945040000722
Figure BDA0002616945040000731
统计分析
使用IBM SPSS Statistics 22(IBM公司)完成统计分析。使用ANOVA联合事后杜凯氏诚实显著差异(post-hoc Tukey's Honest Significant Difference，HSD)执行各组之间的分析，以针对多重比较进行调整。多重比较之前，使用F统计证实方差均一性。对于所有统计分析而言，0.050的p值被视为显著。
结论
总的来说，相较于pGX1435(融合体)，全长MUC16构建体pGX1438(弗林蛋白酶裂解)和pGX1439(双重启动子)诱导较稳健的免疫响应(图30A-C)。根据IFNγELISpot，相较于pGX1435，pGX1438在10μg和30μg剂量下诱导显著更稳健的响应。此外，在10μg剂量下，相较于pGX1435，pGX1438在CD4+T细胞代谢区中诱发显著更稳健的响应。三种全长MUC16构建体诱导的响应量级不存在其它显著性差异，然而，pGX1438和pGX1439诱导的CD8+T细胞响应倾向于更稳健。
另外，在CD4+T细胞代谢区中，pGX1438和pGX1439诱导的针对区域1的响应等效于pGX1436且诱导的针对区域2的响应等效于pGX1437，如IFNγELISpot所测定。只有pGX1439在CD8+T细胞代谢区中诱导的响应等效于pGX1437。
应了解，以上详细描述和随附实例仅具说明性而非视为对本发明范围的限制，本发明的范围仅由随附权利要求书以及其等效物限定。
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表21：合成共同MUC16 IRC+R59 DNA编码序列
Figure BDA0002616945040000741
Figure BDA0002616945040000751
Figure BDA0002616945040000761
表22：合成共同MUC16 IRC+R59蛋白质序列
Figure BDA0002616945040000762
Figure BDA0002616945040000771
表23：合成共同MUC16 RMC DNA编码序列
Figure BDA0002616945040000772
Figure BDA0002616945040000781
表24：合成共同MUC16 RMC蛋白质序列
Figure BDA0002616945040000782
表25：合成共同MUC16 NRC DNA编码序列
Figure BDA0002616945040000791
表26：合成共同MUC16 NRC蛋白质序列
Figure BDA0002616945040000792
Figure BDA0002616945040000801
表27：合成共同MUC16 IRC DNA编码序列
Figure BDA0002616945040000802
Figure BDA0002616945040000811
Figure BDA0002616945040000821
表28：合成共同MUC16 IRC蛋白质序列
Figure BDA0002616945040000822
序列表
<110> 艾诺奥医药品有限公司
严健
安娜·斯莱格
布拉德利·加曼
尼尔·库奇
<120> 靶向MUC16的癌症疫苗和其用途
<130> INO-1005WO / 104409.000446
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<150> US 62/599,613
<151> 2017-12-15
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4476
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有MUC16 IRC + R59 DNA编码序列
<400> 1
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgcgtgca ctccacagca 60
gcaggacctc tgctggtgcc attcaccctg aactttacca tcacaaatct gcagtacgag 120
gaggatatgc accacccagg cagcagaaag ttcaacacca cagagagggt gctgcagggc 180
ctgctgggac caatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgcaggctg 240
acactgctgc gctccgagaa ggacggagca gcaaccggcg tggatgccat ctgtacacac 300
aggctggacc ccaagagccc tggcctggat cgggagcagc tgtactggga gctgtcccag 360
ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accgcaacag cctgtatgtg 420
aatggcttta cccaccggag ctccgtgcca aataccagca cacccggcac ctccacagtg 480
gatctgggca cctccggcac accatctagc ctgccttctc caaccgcagc aggaccactg 540
ctggtgcctt tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgagg 600
catcctggca gcagaaagtt caacacgaca gagagagtgc tgcaaggcct gctgaagcca 660
ctgtttaaga atacctctgt gggccccctg tatagtggct gtagactgac actgctgcgc 720
cccgaaaaag atggcgccgc cactggagtc gacgccatct gtacacacag actggacccc 780
aagtctcccg gcctgaacag agaacagctg tattgggaac tgagcaagct gaccaatggc 840
atcacagagc tgggccctta caccctggac agaaactctc tgtatgtgaa tggcttcacc 900
cacaggacat ctgtgcctac cacaagcacc ccaggcacct ccaccgtcga tctgggcacc 960
agcggcacac cttttagcct gccatcccct accaccgccg gaccactgct ggtgcccttc 1020
accctgaact ttaccataac caatctgcag tatgaggagg acatgcaccg gcccggcagc 1080
agaaagttca acactacaga gagagtgctg cagggcctgt tatcccctat ctttaagaat 1140
tcctctgtgg gcccactgta cagcggatgc aggctgacct ctctgcggcc cgaaaaagac 1200
ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc caaaccccaa gaggccaggc 1260
ctggatcgcg agcagctgta ttgggagctg agccagctga cccacaatat cacagagctg 1320
ggcccctact ctctggacag ggatagcctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattcc 1380
gtgcccacca catctacacc tggcaccagc acagtgtact gggccaccac aggcacccct 1440
agctcctttc caggacacac agcacctgga ccactgctga tcccattcac cctgaacttt 1500
accattacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc ccggcagccg caagttcaat 1560
accacagagc gggtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga 1620
cctctgtact ctggctgtcg cctgacactg ctgcggcccg agaagcatgg cgcagcaacc 1680
ggcgtggacg ctatttgcac ccacagactg gaccctaagg gcccaggcct ggatagggag 1740
cgcctgtatt gggaactgtc tcagctgacc aattctatca cagagctggg accatacacc 1800
ctggacaggg attctctgta cgtgaacggc ttcaatccac ggtctagcgt gcccaccaca 1860
agcacccctg gcacctccac agtgcacctg gccacctctg gcacaccctc ctctctgcct 1920
ggacacaccg caagccccct gctggtgctg ttcacaatca actttaccat tactaatctg 1980
agatacgagg agaacatgca ccaccctggc tccagaaagt tcaatactac cgaaagggtg 2040
ctgcaaggcc tgctgcgccc agtgtttaag aacacttccg tgggccccct gtatagcggc 2100
tgtaggctga cactgctgcg ccccaagaag gatggcgcag caaccaaggt cgacgctatc 2160
tgtacataca ggcccgaccc taaatcccca ggcctggacc gggagcagct gtattgggag 2220
ctgtctcagc tgacccactc cattaccgaa ctgggaccct acaccctgga cagagattcc 2280
ctgtacgtga atggcttcac acagaggagc tccgtgccta ccacatccat cccaggaacc 2340
cctacagtgg acctgggcac ctccggaacc ccagtgtcta agccaggacc atctgccgca 2400
agccacctgc tgatcctgtt caccctgaac tttaccataa cgaatctgcg gtacgaggag 2460
aacatgtggc caggctcccg gaagttcaat actaccgaga gagtgctgca aggcctgctg 2520
aggcctctgt ttaagaacac tagcgtgggc ccactgtatt ccggctctcg gctgaccctg 2580
ctgcggcccg aaaaagatgg agaggccaca ggcgtggatg ccatctgcac ccacagacct 2640
gacccaacag gacctggcct ggacagggag cagctgtacc tggagctgtc acagctgact 2700
cactccatta ccgagctggg cccctatact ctggatagag actccctgta cgtcaacggc 2760
ttcacccacc ggtctagcgt gccaaccaca tctacaggcg tggtgagcga ggaacccttc 2820
accctgaact tcaccatcaa caatctgagg tacatggcag acatgggaca gccaggctct 2880
ctgaagttca acatcaccga taatgtgatg aagcacctgc tgagccctct gtttcagcgg 2940
agcagcctgg gagcaaggta caccggatgc cgcgtgatcg ccctgcggtc cgtgaagaac 3000
ggagcagaga cacgggtgga cctgctgtgc acatatctgc agcctctgag cggaccaggc 3060
ctgcccatca agcaggtgtt ccacgagctg tctcagcaga cccacggaat cacaaggctg 3120
ggaccctact ccctggacaa ggattctctg tacctgaacg gctataatga gcctggcctg 3180
gacgagcccc ctaccacacc caagcctgcc accacatttc tgccacccct gagcgaggca 3240
accacagcaa tgggatacca cctgaagacc ctgacactga acttcaccat cagcaatctg 3300
cagtattccc ccgatatggg caagggctct gccaccttta acagcacaga gggcgtgctg 3360
cagcacctgc tgcggcccct gttccagaag agctccatgg gcccttttta cctgggctgc 3420
cagctgatct ccctgaggcc tgaaaaagat ggagcagcaa ccggagtgga taccacatgt 3480
acataccacc cagaccccgt gggaccaggc ctggatatcc agcagctgta ctgggaactg 3540
tcccagctga ctcacggcgt gacacagctg ggcttctacg tgctggaccg cgattccctg 3600
tttatcaacg gctacgcccc tcagaatctg tctatccggg gcgagtatca gatcaacttc 3660
cacatcgtga actggaatct gagcaatcct gacccaacct ctagcgagta catcgccctg 3720
ctgcgcgaca tccaggataa ggtgaccaca ctgtataagg gctcccagct gcacgacacc 3780
ttccggtttt gcctggtgac caacctgaca atggattcta tgctggtgac agtgaaggcc 3840
ctgttctcct ctaacctgga ccccagcctg gtggagcagg tgtttctgga taagaccctg 3900
aatgccagct cccactggct gggctccacc taccagctgg tggacatcca cgtgacagag 3960
atggagccaa gcgtgtacca gcccacctct agctcctcta cacagcactt ctacctgaac 4020
tttaccataa ctaatctgcc ctatagccag gatatcgccc agcctggcac cacaaactac 4080
cagcggaaca agagaaatat cgaggacgcc ctgaaccagc tgttcagaaa tagctccatc 4140
aagtcctatt tctctgattg ccaggtgagc acctttaggt ccgtgcctaa ttctcaccac 4200
acaggcgtgg actccctgtg cgccttttct ccactggcaa ggagagtgga tagggtggca 4260
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<210> 2
<211> 1490
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有MUC16 IRC + R59蛋白质序列
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
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Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His His Pro Gly Ser
35 40 45
Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala
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Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu
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Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Ala
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195 200 205
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210 215 220
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Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
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Ser Ser Phe Pro Gly His Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Ile Pro Phe
485 490 495
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500 505 510
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Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Gly Ala Ala Thr
545 550 555 560
Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Gly Pro Gly
565 570 575
Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Ser
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Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp Asn Val Met Lys His Leu Leu Ser Pro
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Ser Ser Glu Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val
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Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser Met Leu Val Thr Val
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Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln
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Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Ser His Trp Leu Gly
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Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Pro
1310 1315 1320
Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr
1325 1330 1335
Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Ile Ala
1340 1345 1350
Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu
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Phe Ser Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Ser
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Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met
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Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser
1430 1435 1440
Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro Leu
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Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Ile Ile Leu Ile Cys
1460 1465 1470
Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Phe
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Leu Val
1490
<210> 3
<211> 1932
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有MUC16 RMC DNA编码序列
<400> 3
atggattgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgggtgca ttctactgct 60
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caccgcacat ctgtgcctac cacaagcacc ccaggcacct ccacagtgga tctgggcacc 960
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accctgaact ttaccattac taatctgcag tatgaagaag acatgcacag gcctggctct 1080
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accataacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc ctggcagcag gaagttcaat 1560
accacagagc gcgtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga 1620
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<210> 4
<211> 642
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有MUC16 RMC蛋白质序列
<400> 4
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<213> 人工序列
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<210> 6
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有MUC16 NRC蛋白质序列
<400> 6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
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His Ser Ala Ala Ser His Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr
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Thr His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
100 105 110
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro
115 120 125
Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg
130 135 140
Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu Glu Pro Phe
145 150 155 160
Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly
165 170 175
Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp Asn Val Met Lys His
180 185 190
Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr
195 200 205
Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr
210 215 220
Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly
225 230 235 240
Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly
245 250 255
Ile Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu
260 265 270
Asn Gly Tyr Asn Glu Pro Gly Leu Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys
275 280 285
Pro Ala Thr Thr Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met
290 295 300
Gly Tyr His Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu
305 310 315 320
Gln Tyr Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr
325 330 335
Glu Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
340 345 350
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro Glu
355 360 365
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr His Pro
370 375 380
Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu
385 390 395 400
Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr Val Leu Asp
405 410 415
Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn Leu Ser Ile
420 425 430
Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Trp Asn Leu Ser
435 440 445
Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Asp Ile
450 455 460
Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr
465 470 475 480
Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser Met Leu Val
485 490 495
Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu
500 505 510
Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Ser His Trp Leu Gly
515 520 525
Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Pro Ser
530 535 540
Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn
545 550 555 560
Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Ile Ala Gln Pro Gly
565 570 575
Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
580 585 590
Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys Gln
595 600 605
Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Ser His His Thr Gly Val Asp
610 615 620
Ser Leu Cys Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala
625 630 635 640
Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln
645 650 655
Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro
660 665 670
Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala
675 680 685
Ile Ile Leu Ile Cys Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu
690 695 700
Ile Cys Gly Phe Leu Val
705 710
<210> 7
<211> 4029
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有MUC16 IRC DNA编码序列
<400> 7
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa ccagggtgca ctccacagca 60
gcaggacctc tgctggtgcc attcaccctg aactttacca tcacaaatct gcagtacgag 120
gaggatatgc accaccccgg cagccgcaag ttcaacacca cagagcgggt gctgcagggc 180
ctgctgggac ctatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgcaggctg 240
acactgctgc gctccgagaa ggacggagca gcaaccggcg tggatgccat ctgtacacac 300
aggctggacc caaagtctcc cggcctggat cgcgagcagc tgtactggga gctgagccag 360
ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accggaacag cctgtatgtg 420
aatggcttca cccacagaag ctccgtgcca aatacctcca cacccggcac ctctacagtg 480
gatctgggca cctctggcac accctctagc ctgcctagcc caaccgcagc aggaccactg 540
ctggtgcctt tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgcgg 600
caccctggca gcagaaagtt caacactacc gagcgcgtgc tgcaaggcct gctgaagcca 660
ctgtttaaga atacctctgt gggccccctg tatagtggct gtagactgac actgctgcgc 720
cctgaaaaag atggcgccgc cactggagtc gacgctattt gcacccacag gctggacccc 780
aagtccccag gcctgaacag agaacagctg tattgggagc tgtctaagct gaccaatggc 840
atcacagagc tgggcccata caccctggac aggaactctc tgtacgtcaa tggcttcacc 900
caccgcacaa gcgtgcctac cacatccacc ccaggcacct ctaccgtcga tctgggcacc 960
agcggcacac cattttccct gccatctcct accaccgccg gaccactgct ggtgcccttc 1020
accctgaact ttaccataac caatctgcag tatgaggagg acatgcaccg gcccggctct 1080
agaaagttca acactactga acgggtgctg caaggcctgt taagccctat ctttaagaat 1140
tcctctgtgg gcccactgta cagcggatgc aggctgacct ctctgcggcc cgaaaaagac 1200
ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc caaaccccaa gaggcctggc 1260
ctggacagag agcagctgta ttgggaactg tcccagctga cccacaatat cacagagctg 1320
ggcccctaca gcctggacag agattccctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattct 1380
gtgcccacca caagcacacc tggcacctcc acagtgtact gggccaccac aggcacccct 1440
agctcctttc caggacacac agcacctgga ccactgctga tccctttcac cctgaacttt 1500
accattacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc caggcagcag aaagttcaat 1560
accacagaga gggtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga 1620
cctctgtact ctggctgtcg cctgacactg ctgcggcccg agaagcatgg cgcagcaacc 1680
ggcgtggacg ctatttgcac tcatagactg gaccccaagg gacctggcct ggatagggag 1740
agactgtact gggaactgtc tcagctgacc aattccatta cagagctggg cccttacacc 1800
ctggaccggg acagcctgta cgtcaacggc ttcaatccaa gatctagcgt gcccaccaca 1860
tccacccctg gcacctctac agtgcacctg gccaccagcg gaacaccctc ctctctgcct 1920
ggacacaggg gaaggaagcg gagaagcgcc gcatcccacc tgctgatcct gttcaccctg 1980
aactttacca taacgaatct gagatacgag gagaacatgt ggcctggctc ccgcaagttc 2040
aatactaccg aacgggtgct gcagggcctg ctgcggcccc tgtttaagaa cacttccgtg 2100
ggccccctgt attctggcag caggctgacc ctgctgcgcc cagagaagga cggagaggca 2160
acaggcgtgg atgccatctg cacccacagg cccgacccta caggaccagg cctggatagg 2220
gagcagctgt acctggagct gtcccagctg actcactcaa ttaccgaact gggaccttac 2280
accctggaca gggatagtct gtacgtgaat ggcttcaccc atcgcagctc cgtgccaacc 2340
acatctacag gcgtggtgag cgaggaaccc ttcaccctga acttcaccat caacaatctg 2400
aggtacatgg ccgacatggg ccagccaggc tccctgaagt tcaacatcac cgataatgtg 2460
atgaagcacc tgctgtctcc cctgtttcag aggtctagcc tgggagcaag gtacaccgga 2520
tgcagagtga tcgccctgag gtccgtgaag aacggagcag agacacgggt ggacctgctg 2580
tgcacatatc tgcagcctct gagcggacca ggcctgccca tcaagcaggt gttccacgag 2640
ctgtcccagc agacccacgg aatcacaagg ctgggacctt actccctgga caaggattct 2700
ctgtacctga acggctataa tgagccaggc ctggacgagc cccctaccac accaaagccc 2760
gccaccacat ttctgccacc cctgagcgag gcaaccacag caatgggata ccacctgaag 2820
accctgacac tgaacttcac catcagcaat ctgcagtatt cccccgatat gggcaagggc 2880
tctgccacct ttaacagcac agagggcgtg ctgcagcacc tgctgcggcc tctgttccag 2940
aagtcctcta tgggcccctt ctacctggga tgccagctga tctccctgcg gcccgaaaag 3000
gatggagcag caaccggagt ggataccaca tgtacatacc accctgaccc agtgggacca 3060
ggcctggata tccagcaatt atattgggaa ctgagtcagc tgacccacgg cgtgacacag 3120
ctgggcttct atgtgctgga cagggatagc ctgtttatca acggctacgc cccacagaat 3180
ctgtccatcc gcggcgagta tcagatcaac ttccacatcg tgaactggaa tctgagcaat 3240
cccgacccta ccagctccga gtacatcgcc ctgctgaggg acatccagga taaggtgacc 3300
acactgtata agggctccca gctgcacgac accttccgct tttgcctggt gaccaacctg 3360
acaatggatt ctatgctggt gacagtgaag gccctgttct ctagcaacct ggaccccagc 3420
ctggtggagc aggtgtttct ggataagacc ctgaatgcct cctctcactg gctgggcagc 3480
acctaccagc tggtggacat ccacgtgaca gagatggagc catccgtgta tcagcccacc 3540
agctcctcta gcacacagca cttctacctg aactttacca taactaatct gccctatagc 3600
caggatatcg cccagcctgg caccacaaac taccagcgga acaagagaaa tatcgaggac 3660
gccctgaacc agctgttccg gaattcctct atcaagtctt atttcagcga ttgccaggtg 3720
tccaccttta gatctgtgcc aaatagccac cacacaggcg tggactccct gtgcgccttt 3780
tctcccctgg caaggagggt ggatagggtg gcaatctacg aggagttcct gaggatgacc 3840
cgcgccggaa cacagctgca ggcctttacc ctggaccgga gctccgtgct ggtggatggc 3900
tattccccta acagaaatga gccactgaca ggcaactctg acctgccctt ctgggccatc 3960
atcctgatct gtctggcagg cctgctgggc ctgatcacct gcctgatctg tggctttctg 4020
gtgtgataa 4029
<210> 8
<211> 1341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成共有MUC16 IRC蛋白质序列
<400> 8
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Thr Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
20 25 30
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His His Pro Gly Ser
35 40 45
Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro
50 55 60
Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
65 70 75 80
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala
85 90 95
Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu
100 105 110
Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
115 120 125
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
130 135 140
His Arg Ser Ser Val Pro Asn Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
145 150 155 160
Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Ala
165 170 175
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn
180 185 190
Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn
195 200 205
Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn
210 215 220
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
225 230 235 240
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
245 250 255
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp
260 265 270
Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr
275 280 285
Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser
290 295 300
Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
305 310 315 320
Ser Gly Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
325 330 335
Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu
340 345 350
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
355 360 365
Val Leu Gln Gly Leu Leu Ser Pro Ile Phe Lys Asn Ser Ser Val Gly
370 375 380
Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp
385 390 395 400
Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Val Cys Leu Tyr His Pro Asn Pro
405 410 415
Lys Arg Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln
420 425 430
Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Arg Asp
435 440 445
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln Asn Ser Val Pro Thr Thr
450 455 460
Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Tyr Trp Ala Thr Thr Gly Thr Pro
465 470 475 480
Ser Ser Phe Pro Gly His Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Ile Pro Phe
485 490 495
Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gln
500 505 510
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly
515 520 525
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
530 535 540
Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Gly Ala Ala Thr
545 550 555 560
Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Gly Pro Gly
565 570 575
Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Ser
580 585 590
Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
595 600 605
Asn Gly Phe Asn Pro Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly
610 615 620
Thr Ser Thr Val His Leu Ala Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro
625 630 635 640
Gly His Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ala Ala Ser His Leu Leu Ile
645 650 655
Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn
660 665 670
Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
675 680 685
Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr
690 695 700
Ser Gly Ser Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala
705 710 715 720
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro
725 730 735
Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His
740 745 750
Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr
755 760 765
Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly
770 775 780
Val Val Ser Glu Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu
785 790 795 800
Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile
805 810 815
Thr Asp Asn Val Met Lys His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser
820 825 830
Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
835 840 845
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr Leu
850 855 860
Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe His Glu
865 870 875 880
Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Leu
885 890 895
Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu Pro Gly Leu Asp
900 905 910
Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr Phe Leu Pro Pro Leu
915 920 925
Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His Leu Lys Thr Leu Thr Leu
930 935 940
Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly
945 950 955 960
Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg
965 970 975
Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln
980 985 990
Leu Ile Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
995 1000 1005
Thr Thr Cys Thr Tyr His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp
1010 1015 1020
Ile Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val
1025 1030 1035
Thr Gln Leu Gly Phe Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile
1040 1045 1050
Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln
1055 1060 1065
Ile Asn Phe His Ile Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro
1070 1075 1080
Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys
1085 1090 1095
Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr Phe Arg
1100 1105 1110
Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser Met Leu Val Thr
1115 1120 1125
Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu
1130 1135 1140
Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Ser His Trp Leu
1145 1150 1155
Gly Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu
1160 1165 1170
Pro Ser Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe
1175 1180 1185
Tyr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Ile
1190 1195 1200
Ala Gln Pro Gly Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile
1205 1210 1215
Glu Asp Ala Leu Asn Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser
1220 1225 1230
Tyr Phe Ser Asp Cys Gln Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn
1235 1240 1245
Ser His His Thr Gly Val Asp Ser Leu Cys Ala Phe Ser Pro Leu
1250 1255 1260
Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg
1265 1270 1275
Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr Leu Asp Arg
1280 1285 1290
Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn Glu Pro
1295 1300 1305
Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Ile Ile Leu Ile
1310 1315 1320
Cys Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
1325 1330 1335
Phe Leu Val
1340

Claims (78)

1.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
2.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470；
(b)在包含SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470的核酸分子的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:1的核苷酸55-4470至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
3.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:2的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:2的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:2至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
4.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:1；
(b)在SEQ ID NO:1的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:1至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:1至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
5.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:1中所示的核酸序列。
6.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
7.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926；
(b)在包含SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926的核酸分子的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:3的核苷酸55-1926至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
8.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:4的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:4的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:4至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
9.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:3；
(b)在SEQ ID NO:3的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:3至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:3至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
10.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:3中所示的核酸序列。
11.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
12.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130；
(b)在包含SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130的核酸分子的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:5的核苷酸55-2130至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
13.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:6的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:6的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:6至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
14.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:5；
(b)在SEQ ID NO:5的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:5至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:5至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
15.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:5中所示的核酸序列。
16.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
17.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023；
(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-1926和1948-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
18.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
19.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023；
(b)在包含SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023的核酸分子的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:7的核苷酸55-4023至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
20.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)编码SEQ ID NO:8的核酸序列；
(b)编码片段的核酸序列，所述片段在SEQ ID NO:8的全长中占至少90％；
(c)编码与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的核酸序列；以及
(d)编码片段的核酸序列，所述片段在与SEQ ID NO:8至少95％一致的蛋白质的全长中占至少90％。
21.一种核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
(a)SEQ ID NO:7；
(b)在SEQ ID NO:7的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:7至少95％一致的片段；以及
(d)在与SEQ ID NO:7至少95％一致的核酸序列的全长中占至少90％的片段。
22.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO:7中所示的核酸序列。
23.一种载体，其包含根据权利要求1到22中任一项所述的核酸分子。
24.一种载体，其包含根据权利要求6到10中任一项所述的核酸分子和根据权利要求11到15中任一项所述的核酸分子。
25.根据权利要求23或24所述的载体，其中所述核酸分子可操作地连接到调控元件，所述调控元件选自启动子和聚腺苷酸化信号。
26.根据权利要求25所述的载体，其中所述启动子是人巨细胞病毒即刻早期启动子(hCMV启动子)。
27.根据权利要求25所述的载体，其中所述聚腺苷酸化信号是牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH polyA)。
28.根据权利要求23到27中任一项所述的载体，其中所述载体是质粒或病毒载体。
29.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求1到22中任一项所述的核酸分子。
30.根据权利要求29所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
31.一种组合物，其包含一种或多种根据权利要求23到28中任一项所述的载体。
32.根据权利要求31所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。
33.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490；
(b)在包含SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490的蛋白质的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:2的氨基酸19-1490至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
34.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:2；
(b)在SEQ ID NO:2的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:2至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
35.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
36.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:4的氨基酸19-642；
(b)在包含SEQ ID NO:4的氨基酸19-642的蛋白质的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:4的氨基酸19-642至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
37.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:2；
(b)在SEQ ID NO:4的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:4至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:4至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
38.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
39.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:6的氨基酸19-710；
(b)在包含SEQ ID NO:6的氨基酸19-710的蛋白质的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:6的氨基酸19-710至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
40.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:2；
(b)在SEQ ID NO:6的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:6至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:6至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
41.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
42.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341；
(b)在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341的蛋白质的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-642和650-1341至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
43.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341；
(b)在包含SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341的蛋白质的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:8的氨基酸19-1341至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
44.一种蛋白质，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:8；
(b)在SEQ ID NO:8的全长中占至少90％的片段；
(c)与SEQ ID NO:8至少95％一致的氨基酸序列；以及
(d)在与SEQ ID NO:8至少95％一致的氨基酸序列的全长中占至少90％的片段。
45.一种蛋白质，其包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
46.一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
47.根据权利要求46所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:1编码。
48.一种包含肽的疫苗，其中所述肽包含相对于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列。
49.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:1中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。
50.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码肽，所述肽包含相对于SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性的氨基酸序列。
51.一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列。
52.根据权利要求51所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:3编码。
53.一种包含肽的疫苗，其中所述肽包含相对于SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列。
54.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:3中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。
55.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码肽，所述肽包含相对于SEQ IDNO:4中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性的氨基酸序列。
56.一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。
57.根据权利要求56所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:5编码。
58.一种包含肽的疫苗，其中所述肽包含相对于SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列。
59.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:5中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。
60.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码肽，所述肽包含相对于SEQ IDNO:6中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性的氨基酸序列。
61.一种包含抗原的疫苗，其中所述抗原包含SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列。
62.根据权利要求61所述的疫苗，其中所述抗原由SEQ ID NO:7编码。
63.一种包含肽的疫苗，其中所述肽包含相对于SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的全长具有至少约90％一致性的氨基酸序列。
64.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子包含相对于SEQ ID NO:7中所示的核酸序列的全长具有至少约95％一致性的核酸序列。
65.一种包含核酸分子的疫苗，其中所述核酸分子编码肽，所述肽包含相对于SEQ IDNO:8中所示的氨基酸序列的全长具有至少约95％一致性的氨基酸序列。
66.根据权利要求49-50、54-55、59-60或64-65所述的疫苗，其中所述核酸分子包含表达载体。
67.根据权利要求49-50、54-55、59-60或64-65所述的疫苗，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
68.根据权利要求49-50、54-55、59-60或64-65所述的疫苗，其进一步包含佐剂。
69.根据权利要求68所述的疫苗，其中所述佐剂是IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。
70.一种治疗患有表达MUC16的癌细胞的受试者的方法，其包含施用治疗有效量的根据权利要求46-48、51-53、56-58或61-63中任一项所述的疫苗。
71.一种治疗患有表达MUC16的癌细胞的受试者的方法，其包含施用治疗有效量的根据权利要求49-50、54-55、59-60或64-69中任一项所述的疫苗。
72.根据权利要求71所述的方法，其中施用包括电穿孔步骤。
73.根据权利要求71所述的方法，其中施用发生于所述受试者的一个或多个部位。
74.一种向受试者接种针对表达MUC16的癌细胞的疫苗的方法，其包含施用有效诱导体液免疫响应的量的根据权利要求46到69中任一项所述的疫苗。
75.根据权利要求1到22中任一项所述的核酸分子，其用作药剂。
76.根据权利要求1到22中任一项所述的核酸分子，其用作治疗癌症的药剂。
77.根据权利要求1到22中任一项所述的核酸分子，其用于制备药剂。
78.根据权利要求1到22中任一项所述的核酸分子，其用于制备供治疗癌症用的药剂。
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