ES2622418T3 - Composición que comprende alta concentración de moléculas biológicamente activas y procesos para preparar la misma - Google Patents

Composición que comprende alta concentración de moléculas biológicamente activas y procesos para preparar la misma Download PDF

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Abstract

Un procedimiento a gran escala para producir muestras de alta pureza de plásmidos de bajo número de copias a partir de células bacterianas, que comprende las etapas de: a) producir una solución de lisado poniendo en contacto una suspensión celular de dichas células bacterianas que comprende dichos plásmidos de bajo número de copias con solución de lisis; b) neutralizar dicha solución de lisado con una solución neutralizante para producir una dispersión que comprende solución de lisado neutralizado y residuos y en donde el fluido de dispersión se mantiene durante menos de una hora para separar la solución de lisado neutralizado; c) filtrar la dispersión a través de al menos un filtro; d) realizar la separación de intercambio iónico sobre dicha solución de lisado neutralizado para producir un eluido de intercambio iónico; y e) realizar la separación de interacción hidrófoba sobre dicho eluido de intercambio iónico para producir una solución de interacción hidrófoba; en el que la etapa a) comprende mezclar dicha suspensión de células con una solución de lisis en un mezclador en línea de alto cizallamiento; en el que la etapa b) comprende mezclar dicha solución de lisado con dicha solución neutralizante en un mezclador de burbujas; y en el que la etapa e) comprende realizar la separación de interacción hidrófoba usando una columna de interacción hidrófoba o una membrana de interacción hidrófoba para formar una solución de interacción hidrófoba; en el que el método comprende la transición de una etapa a una etapa subsiguiente de forma sustancialmente continua.

Description

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DESCRIPCION
Composicion que comprende alta concentracion de moleculas biologicamente activas y procesos para preparar la misma
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a procedimientos para producir composiciones a granel que comprenden plasmidos de bajo numero de copias en altas concentraciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Existen numerosos usos de moleculas biologicamente activas producidas en y aisladas de celulas. La Publicacion de Estados Unidos serie No. 20050014245, describe dispositivos y metodos para la produccion de biomateriales. Las moleculas biologicamente activas incluyen protemas y moleculas de acido nucleico. La produccion de tales moleculas en celulas vivas ofrece numerosas ventajas sobre los metodos de produccion alternativos, pero surgen problemas de aislamiento y purificacion cuando se extraen moleculas biologicamente activas de las celulas. Existen varios componentes presentes en las celulas que impiden la realizacion de rendimientos elevados de moleculas biologicamente activas de interes, asf como la representacion de posibles contaminantes no deseados para un producto final.
La produccion de plasmidos es un campo de interes debido a la aparicion de los campos de terapia genica no viral y de vacuna de ADN. Los plasmidos son macromoleculas grandes y complejas, que se mantienen como estructuras de ADN superenrolladas a menos que se interrumpan. En lugar de usar medios sinteticos, en muchos casos es mas rentable producirlos en sistemas biologicos, y posteriormente aislarlos y purificarlos de esos sistemas. La produccion biologica de plasmidos asume comunmente la forma de celulas de Escherichia coli ("E. coli') que fermentan con el plasmido de interes.
La lisis celular y las etapas de tratamiento subsiguientes utilizadas para preparar una corriente de proceso para la purificacion, son los pasos mas diffciles, complejos e importantes en cualquier procedimiento de plasmido. Es en este proceso donde se definen el rendimiento y la calidad para cada ciclo de produccion del plasmido. La busqueda de un metodo optimo, que sea continuo, escalable y que produzca un producto de alta calidad que pueda formularse a alta concentracion independientemente del tamano del plasmido, ha sido un obstaculo para conseguir procesos aceptables a la capacidad comercial.
La lisis de bacterias para la purificacion de plasmidos usando alcali y detergentes es una tecnica comun. Desafortunadamente, este metodo presenta desaffos significativos para preparaciones a gran escala (o produccion ampliada). En primer lugar, la mezcla completa de las celulas suspendidas con la solucion de lisis se maneja facilmente a pequena escala simplemente agitando con vortice o invirtiendo el recipiente que contiene las celulas. Sin embargo, esto no es practico a gran escala, donde los volumenes pueden estar en el rango de decenas o cientos de litros. Las tecnicas comunes para mezclar grandes volumenes de lfquido, tales como la mezcla con impulsor, son problematicas porque a medida que algunas celulas comienzan a sufrir lisis despues de la mezcla inicial, liberan ADN genomico que aumenta drasticamente la viscosidad de la solucion. Este aumento en la viscosidad interfiere significativamente con la mezcla posterior. Otro desaffo es que una incubacion excesiva a pH alto despues de la adicion de una solucion de lisis alcalina puede conducir a una desnaturalizacion permanente del plasmido, haciendolo inadecuado para la mayona de los usos posteriores, especialmente con fines terapeuticos. Ademas, es bien sabido que la mezcla en esta etapa debe ser completa pero suficientemente suave (es decir, con baja cizalladura) para evitar cantidades sustanciales de material de precipitado floculante en la solucion que contiene el plasmido. Grandes cantidades de ADN genomico del huesped y endotoxinas estan presentes en el precipitado floculante y si se mezclan con el plasmido pueden ser diffciles de separar del plasmido durante la posterior purificacion. Por lo tanto, la produccion a gran escala de plasmidos expone grandes cantidades de celulas a la solucion de lisis, los mezcla y neutralizar el lisado de una manera que se optimice el rendimiento del plasmido, minimizar la degradacion del plasmido y maximizar la eliminacion de otros componentes celulares de modo que el material pueda ser purificado adicionalmente para producir un producto final de alta concentracion, alta calidad y alta pureza en volumenes relativamente grandes.
Hay una variedad de metodos existentes para purificar plasmidos; sin embargo, estos metodos no son adecuados para preparaciones a gran escala. Las tecnicas de purificacion a escala de laboratorio no pueden simplemente ampliarse para los volumenes implicados en la preparacion de plasmidos a gran escala. Las preparaciones a gran escala requieren la optimizacion del rendimiento y la integridad molecular al tiempo que maximicen la eliminacion de los contaminantes y la concentracion del plasmido. En la produccion de grandes cantidades de ADN plasmfdico a alta concentracion, existe un problema de mantenimiento del plasmido como forma relajada de cfrculo superenrollado y abierto. Las condiciones de almacenamiento requieren generalmente alta concentracion de sal y la degradacion molecular con el tiempo sigue siendo un problema incluso en presencia de sal. Muchos metodos de purificacion existentes dependen del uso de sustancias potencialmente peligrosas, toxicas, mutagenicas o contaminadas, y/o sustancias o equipos caros, que, de nuevo, no son deseables para preparaciones a gran escala.
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Algunos metodos de purificacion existentes utilizan el uso de la enzima para digerir la protema para su eliminacion final y tales enzimas son costosas para la produccion a gran escala y pueden causar un riesgo de contaminacion biologica.
Sigue existiendo la necesidad de metodos de produccion a gran escala de moleculas biologicamente activas de interes, tales como plasmidos, en los que el producto final pueda producirse de una manera rentable, tales como equipamiento mmimo y/o etapas mmimas de proceso, con alto rendimiento, alta concentracion y degradacion mmima y sin presencia de impurezas, contaminantes y sustancias no deseadas. Sigue existiendo la necesidad de grandes cantidades de soluciones de plasmidos que tengan alta concentracion y degradacion minima y presencia de impurezas, contaminantes y sustancias no deseadas y metodos para preparar tales soluciones. La necesidad de grandes cantidades de plasmidos es mayor para aquellos plasmidos que son plasmidos de bajo numero de copias, los cuales requieren cantidades mucho mayores de celulas para producir cantidades de plasmido en el intervalo de miligramos (“mg”) y superiores.
RESUMEN DE LA INVENCION
El objeto para el que se busca proteccion es como se define en las reivindicaciones.
Un aspecto de la presente invencion comprende procedimientos a gran escala para producir muestras de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias de celulas bacterianas. Los procesos a gran escala comprenden las etapas de:
a) producir una solucion de lisado poniendo en contacto una suspension celular de dichas celulas bacterianas que comprende dichos plasmidos de bajo numero de copias con solucion de lisis;
b) neutralizar dicha solucion de lisado con una solucion neutralizante para producir una dispersion que comprende solucion de lisado neutralizado y residuos y en donde el fluido de dispersion se mantiene durante menos de una hora para separar la solucion de lisado neutralizado;
c) filtrar la dispersion a traves de al menos un filtro;
d) realizar la separacion de intercambio ionico sobre dicha solucion de lisado neutralizado para producir un eluido de intercambio ionico; y
e) realizar la separacion de interaccion hidrofoba sobre dicho eluido de intercambio ionico para producir una solucion de interaccion hidrofoba;
en el que la etapa a) comprende mezclar dicha suspension de celulas con una solucion de lisis en un mezclador en lmea de alto cizallamiento;
en el que la etapa b) comprende mezclar dicha solucion de lisado con dicha solucion neutralizante en un mezclador de burbujas; y
en el que la etapa e) comprende realizar la separacion de interaccion hidrofoba usando una columna de interaccion hidrofoba o una membrana de interaccion hidrofoba para formar una solucion de interaccion hidrofoba;
en el que el metodo comprende la transicion de una etapa a una etapa subsiguiente sustancialmente continua.
En algunas realizaciones de este aspecto, los procedimientos a gran escala incluyen ademas la etapa de preparar una solucion de al menos una molecula biologicamente activa por ultrafiltracion de dicha solucion de interaccion hidrofoba.
Un aspecto adicional de la presente invencion comprende procedimientos a gran escala para producir muestras de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias de celulas bacterianas, que comprende las etapas de: poner en contacto las celulas bacterianas que comprenden dichos plasmidos de bajo numero de copias en una dispersion de celulas con solucion de lisis para formar una solucion de lisado; neutralizar la solucion de lisado mezclando una solucion de neutralizacion en la solucion de lisado con un mezclador de columna de burbujas para formar una mezcla neutralizada y en donde el fluido de dispersion se mantiene durante menos de una hora para separar la solucion de lisado neutralizado; filtrar la mezcla neutralizada a traves de un filtro primario y un filtro secundario para formar una solucion filtrada; pasar la solucion filtrada a traves de una columna de intercambio ionico para formar una solucion de intercambio ionico; pasar la solucion de intercambio ionico a traves de una columna de interaccion hidrofoba o una membrana de interaccion hidrofoba para formar una solucion de interaccion hidrofoba; y ultrafiltracion de la solucion de interaccion hidrofoba para formar una muestra de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias; en el que cada transicion de un paso a un paso subsiguiente en el proceso a gran escala desde el paso de contacto hasta el paso de la etapa de solucion filtrada se produce sustancialmente de manera continua.
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En un aspecto de la presente descripcion, se proporcionan composiciones que comprenden al menos una molecula biologicamente activa de interes preparada por el metodo descrito y divulgado en el presente documento, en el que al menos una molecula biologicamente activa de interes es un plasmido de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden al menos un plasmido de ADN en una cantidad de aproximadamente 10 mg o mas en solucion, en donde la alta pureza de dichos plasmidos son los plasmidos que estan presentes en mas del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Los numerosos objetos y ventajas de la presente invencion pueden ser mejor comprendidos por los expertos en la tecnica haciendo referencia a las figuras adjuntas, en las que:
La figura 1 muestra un esquema de una realizacion que se usa para aislar y purificar moleculas biologicamente activas de interes de celulas bacterianas en un proceso de flujo continuo.
La figura 2 muestra una imagen de un gel electroforetico que incluye muestras del Ejemplo 1, a continuacion. El carril 1 representa la escalera de plasmido superenrollada (Invitrogen); carril 2 el lisado celular; producto del carril 3 despues del intercambio de aniones Q; carril 4 el producto despues de la purificacion con interaccion hidrofoba; y el carril 5 el producto final mezclado despues de UF.
La figura 3 muestra una imagen de un gel electroforetico que incluye muestras del Ejemplo 3. El carril 1 representa la escalera de plasmido superenrollada (Invitrogen); el carril 2 representa el lisado despues de la filtracion primaria usando un cartucho de pliegue de 48 pm; el carril 3 representa el filtrado despues de la filtracion secundaria utilizando un cartucho de pliegue de 1 pm; el carril 4 representa el filtrado despues de una tercera filtracion usando un filtro C0HC Pod; el carril 5 representa la fraccion #1 de producto eluido despues de pasar por la etapa de intercambio de aniones Mustang Q; y el carril 6 representa la fraccion secundaria del eluido Q.
DESCRIPCION DE FORMAS DE REALIZACION PREFERIDAS
Se proporcionan metodos para purificar moleculas biologicamente activas de interes a partir de celulas de forma que purifiquen moleculas biologicamente activas de interes a altos niveles de pureza y concentraciones a partir de las celulas. Las moleculas biologicamente activas de interes son plasmidos de numero de copias bajos o plasmidos de ADN. Las celulas pueden ser cualesquiera celulas que contengan moleculas biologicamente activas de interes. En algunas realizaciones, las celulas son celulas microbianas tales como por ejemplo celulas procariotas tales como celulas bacterianas. En algunas realizaciones, son celulas de E. coli. Las celulas pueden ser producidas o generadas por cualquier medio, tal como por ejemplo por fermentacion. Los metodos para fermentar celulas son bien conocidos por los expertos en la tecnica. La presente invencion puede emplearse para extraer plasmidos de bajo numero de copias de celulas. Tambien se describen en el presente documento metodos para aislar cualquier molecula biologicamente activa de interes de las celulas. En algunas realizaciones de la descripcion, los procedimientos pueden emplearse para extraer mas de un tipo de molecula biologicamente activa de interes. Las moleculas biologicamente activas de interes pueden ser una macromolecula tal como una molecula o protema de acido nucleico.
El termino "plasmido" o "plasmido de ADN", utilizado indistintamente, se refiere a moleculas de ADN circulares que son moleculas de ADN extracromosomicas separadas del ADN cromosomico que son capaces de replicarse independientemente del ADN cromosomico. Una secuencia codificante o transgen se encuentra a menudo dentro del plasmido de ADN, y cuando esta presente, el plasmido de ADN se denomina plasmido de expresion o construccion de expresion. La secuencia codificante, o "secuencia de acido nucleico que codifica", puede incluir senales de iniciacion y terminacion operativamente ligadas a elementos reguladores que incluyen una senal promotora y de poliadenilacion capaz de dirigir la expresion en las celulas del individuo al que se administra la molecula de acido nucleico.
El termino "a gran escala", como se utiliza en referencia a los procedimientos descritos, se refiere a procedimientos de purificacion que producen, a partir de celulas bacterianas o una suspension de cantidades de celulas bacterianas de al menos una molecula biologicamente activa, en particular un plasmido de ADN, desde aproximadamente 1 gramo o mas y/o procedimientos de purificacion que requieren la lisis de cantidades de pasta de celulas bacterianas de aproximadamente 1 kilogramo o mas.
El termino "alta pureza", tal como se utiliza en referencia al nivel de pureza de las moleculas biologicamente activas, en particular el plasmido de ADN, se refiere a la purificacion de las moleculas de las celulas bacterianas huesped a un nivel de al menos aproximadamente 90%; y preferiblemente mayor o igual a aproximadamente 91%, mayor o igual que aproximadamente 92%, mayor o igual que aproximadamente 93%, mayor o igual que aproximadamente 94%, mayor o igual que aproximadamente 95%, mayor que o igual a aproximadamente 96%, mayor o igual que aproximadamente 97%, mayor o igual que aproximadamente 98%, o mayor o igual que aproximadamente 99%.
El termino "continuo" o "sustancialmente continuo", tal como se utiliza en referencia a los procedimientos aqrn
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descritos, se refiere a un flujo continuo de materiales (o solucion o dispersion) entre cada etapa del proceso de purificacion a cada paso subsiguiente, partiendo del comienzo del proceso de purificacion hasta la etapa de carga de la columna de cromatograffa de intercambio ionico. Por ejemplo, cuando las celulas bacterianas de una dispersion se ponen en contacto con la solucion de lisis en la etapa de contacto para formar una solucion de lisado, dicha solucion de lisado fluira directamente en la siguiente etapa de neutralizacion con la solucion de neutralizacion. Estas transiciones continuas entre etapas eliminan una etapa de mantenimiento o incubacion entre las etapas del proceso de purificacion.
El termino “molecula biologicamente activa” se refiere a una molecula o una biomolecula contenida dentro de la bacteria que esta en su estado funcional y, en algunas realizaciones, se refiere en particular a un plasmido de ADN. Tales plasmidos de ADN se pueden aislar y utilizar para transfectar celulas de interes. Las composiciones de la presente invencion comprenden al menos un tipo de molecula biologica activa. En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invencion comprenden mas de un tipo de moleculas biologicamente activas.
Los plasmidos vanan ampliamente en su numero de copias dependiendo del origen de replicacion que contienen, por ejemplo, pMB1 o pSC101, que determina si estan bajo control relajado o estricto; asf como el tamano del plasmido y sus secuencias insertadas asociadas. Algunos plasmidos, como la serie pUC y derivados, tienen mutaciones que les permiten alcanzar numeros de copias muy altos dentro de la celula bacteriana. Los plasmidos basados en pBR322 se mantienen generalmente con numeros de copias mas bajos. Los plasmidos muy grandes a menudo se mantienen a un numero de copias muy bajo por celula. Algunas realizaciones de la presente invencion se refieren a un procedimiento de purificacion de plasmidos que permite purificar plasmidos de celulas, preferiblemente celulas bacterianas, a gran escala para producir grandes cantidades de plasmido, tales como cantidades de gramo, en un proceso de fabricacion rentable y de mmimos pasos (con el fin mantener mayores rendimientos). Los procedimientos de la presente invencion producen muestras de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias. Para los propositos del proceso proporcionado y las moleculas biologicamente activas resultantes producidas, un plasmido de numero de copias bajo es un plasmido que logra un numero de copias menor o igual a aproximadamente 300, inferior o igual a aproximadamente 100, menor o igual a aproximadamente 50, inferior o igual a aproximadamente 20, inferior o igual a aproximadamente 10, o inferior o igual a aproximadamente 5.
Un aspecto de la presente invencion comprende procedimientos a gran escala para producir muestras de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias de celulas bacterianas. Los procesos comprenden las etapas de:
a) producir una solucion de lisado poniendo en contacto una suspension celular de dichas celulas bacterianas que comprende dichos plasmidos de bajo numero de copias con solucion de lisis;
b) neutralizar dicha solucion de lisado con una solucion neutralizante para producir una dispersion que comprende solucion de lisado neutralizado y residuos y en donde el fluido de dispersion se mantiene durante menos de una hora para separar la solucion de lisado neutralizado;
c) filtrar la dispersion a traves de al menos un filtro;
d) realizar la separacion de intercambio ionico sobre dicha solucion de lisado neutralizado para producir un eluido de intercambio ionico; y
e) realizar la separacion de interaccion hidrofoba sobre dicho eluido de intercambio ionico para producir una solucion de interaccion hidrofoba;
en el que la etapa a) comprende mezclar dicha suspension de celulas con una solucion de lisis en un mezclador en lmea de alto cizallamiento;
en el que la etapa b) comprende mezclar dicha solucion de lisado con dicha solucion neutralizante en un mezclador de burbujas; y
en el que la etapa e) comprende realizar la separacion de interaccion hidrofoba usando una columna de interaccion hidrofoba o una membrana de interaccion hidrofoba para formar una solucion de interaccion hidrofoba;
en el que el metodo comprende la transicion de una etapa a una etapa subsiguiente sustancialmente continua.
Los procedimientos a gran escala comprenden una etapa de produccion de solucion de lisado que comprende mezclar dicha suspension celular con solucion de lisis en un mezclador en lmea de alto cizallamiento.
En algunas realizaciones, la etapa de produccion comprende poner en contacto la suspension de celulas con la solucion de lisis en un mezclador durante una duracion de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 minutos, preferiblemente de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 8 minutos, y mas preferiblemente de aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, la etapa de separacion de interaccion hidrofoba de realizacion comprende realizar la separacion de interaccion hidrofoba usando una columna de interaccion hidrofoba
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o una membrana de interaccion hidrofoba para formar una solucion de interaccion hidrofoba. La etapa de separacion de interaccion hidrofoba puede ser la separacion de la molecula biologicamente activa de interes uniendose a una membrana o columna de interaccion hidrofoba, que permite que las impurezas fluyan o se eliminen por lavado. En algunas realizaciones, la molecula biologicamente activa de interes puede fluir a traves de una columna de interaccion hidrofoba mientras las impurezas se unen. En algunas realizaciones, las moleculas biologicamente activas de interes fluyen a traves de una membrana de interaccion hidrofoba (o membrana HIC) (denominada en el presente documento "Metodo I"). En algunas realizaciones, las moleculas biologicamente activas de interes se unen a una columna HIC, tal como una columna de butilo (denominada en el presente documento "Metodo II"). En algunas realizaciones, puede usarse una combinacion de membrana HIC y columna HIC, tal como una columna de butilo (denominada en el presente documento como "Metodo III") para producir a gran escala cantidades de moleculas biologicamente activas de interes con alta pureza, a nivel de gramos o cantidades mayores de plasmidos de ADN. En algunas realizaciones, la separacion de interaccion hidrofoba comprende separacion usando al menos cromatograffa de interaccion hidrofoba bufflica para producir una solucion de interaccion hidrofoba que es un eluido en solucion de cromatograffa de interaccion hidrofoba bufflica.
En algunas realizaciones, los procedimientos a gran escala descritos pueden incluir ademas una etapa de preparacion de una solucion de al menos una molecula biologicamente activa por ultrafiltracion de dicha solucion de interaccion hidrofoba. Ademas, puede realizarse una etapa de preparacion de una solucion esteril de moleculas biologicamente activas por filtracion esteril de dicha solucion de moleculas biologicamente activas.
Los procedimientos a gran escala incluyen una etapa de mantenimiento que requiere mantener la dispersion durante un periodo de tiempo para separar la solucion de lisado neutralizado de los desechos y, a continuacion, filtrar la solucion de lisado neutralizado a traves de al menos un filtro.
En algunas realizaciones, la ejecucion de la etapa de separacion de intercambio ionico se ejecuta utilizando una membrana de intercambio anionico. Preferiblemente, la etapa de separacion de intercambio ionico comprende el uso de una columna de intercambio ionico, y preferiblemente utilizando un cartucho Mustang® Q.
En algunas realizaciones, los procesos a gran escala incluyen procedimientos continuos o se hace referencia como un proceso continuo a gran escala para la produccion de plasmidos de numero de copias de alta pureza de bajo numero de copias de celulas bacterianas. El metodo comprende la transicion de una etapa a una etapa subsiguiente del proceso a gran escala de manera sustancialmente continua y comprende separar la solucion de lisado neutralizado de los desechos en la dispersion recogiendo el lisado en un recipiente y pasar la dispersion a traves de un filtro primario para producir una solucion de lisado bruto neutralizado. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden ademas el paso de la primera solucion de lisado bruto neutralizado a traves de un filtro secundario para producir una solucion de lisado neutra bruta subsiguiente.
En una realizacion, la presente invencion comprende procedimientos a gran escala para producir muestras de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias de celulas bacterianas, que comprende las etapas de: poner en contacto las celulas bacterianas que comprenden plasmidos de bajo numero de copias en una dispersion de celulas con solucion de lisis para formar una solucion de lisado; neutralizar la solucion de lisado mezclando una solucion de neutralizacion en la solucion de lisado con un mezclador de columna de burbujas para formar una mezcla neutralizada y en donde el fluido de dispersion se mantiene durante menos de una hora para separar la solucion de lisado neutralizado; filtrar la mezcla neutralizada a traves de un filtro primario y un filtro secundario para formar una solucion filtrada; pasar la solucion filtrada a traves de una columna de intercambio ionico para formar una solucion de intercambio ionico; pasar la solucion de intercambio ionico a traves de una columna de interaccion hidrofoba o una membrana de interaccion hidrofoba para formar una solucion de interaccion hidrofoba; y ultrafiltracion de la solucion de interaccion hidrofoba para formar una muestra de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias; en el que cada transicion de un paso a un paso subsiguiente en el proceso a gran escala desde el paso de contacto hasta el paso de la etapa de solucion filtrada se produce sustancialmente de manera continua.
En otro aspecto de la presente descripcion, se proporcionan composiciones que comprenden moleculas biologicamente activas de interes preparadas por los procedimientos a gran escala descritos aqrn, en donde las moleculas biologicamente activas de interes son plasmidos de ADN. En algunas realizaciones las composiciones comprenden plasmidos de ADN en una cantidad de aproximadamente 10 mg o mas en solucion, donde la alta pureza de dichos plasmidos son los plasmidos que estan presentes en mas del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. La concentracion de plasmido puede ser de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 mg/ml. Algunas composiciones incluyen plasmido a un nivel de mas del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o 95%, y preferiblemente un plasmido superenrollado superior al 80%. Algunas composiciones contienen menos de o igual a 10 endotoxinas EU por mg de plasmido, y algunas realizaciones, las composiciones, inferiores o iguales a aproximadamente 1 endotoxina Ue por mg de plasmido. Algunas realizaciones inferiores o iguales a aproximadamente 0.1 EU endotoxina por mg de plasmido. En algunas realizaciones, las composiciones incluyen solucion que contiene menos o igual a aproximadamente 1.0% de ARN o menor o igual que aproximadamente 0.4% de ARN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones incluyen solucion que contiene menos o igual a aproximadamente 1.0% de protema, preferiblemente menor o igual que aproximadamente 0.20% de protema. En algunas realizaciones, las
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composiciones incluyen solucion que contiene menos o igual a aproximadamente 1% de ADN genomico, preferiblemente menor o igual que aproximadamente 0.01% de ADN genomico.
Un ejemplo de una realizacion de la presente invencion que incluye muchas de las etapas de procedimiento proporcionadas en el presente documento, incluye las siguientes etapas: primera etapa, se producen y se recogen celulas de interes; segundo paso, las celulas se lisan para liberar sus contenidos, incluyendo las moleculas biologicamente activas de interes, en solucion; tercera etapa, se separan restos de celulas solidas y componentes de celulas precipitadas del fluido que contiene al menos una molecula biologicamente activa de interes; cuarta etapa, las soluciones que contienen las moleculas biologicamente activas de interes se someten a cromatograffa de intercambio ionico; quinto paso, el material parcialmente purificado resultante de la cromatograffa de intercambio ionico se somete a cromatograffa de interaccion hidrofoba; sexta etapa, el material resultante de la cromatograffa de interaccion hidrofoba se somete a ultrafiltracion y diafiltracion, para concentrar al menos un tipo de moleculas biologicamente activas de interes, y para eliminar el exceso de sales de la solucion; en el septimo paso, el producto concentrado y desalado se somete opcionalmente a filtracion esteril, para hacerla adecuada para usos farmaceuticos, incluyendo, por ejemplo, administracion intramuscular, administracion intravenosa, administracion intranasal, suministro intracardfaco, suministro de aerosol, administracion transdermica, la administracion al musculo, la electroporacion in vivo facilito la administracion al tejido subcutaneo o intradermico, asf como otros metodos conocidos de administracion farmaceutica.
Algunas realizaciones de la invencion incluyen las etapas del proceso descritas en el presente documento, incluyendo, pero sin limitarse a, el funcionamiento de una combinacion de etapas en un modo continuo que da como resultado la escala de produccion que no esta limitada por las etapas de mantenimiento del proceso. Tales procedimientos permiten la produccion de biomoleculas de grado farmaceutico a gran escala, por ejemplo produccion de aproximadamente 1 gramo o mas de plasmido. Algunas realizaciones de la invencion excluyen el uso de cualesquiera materiales o procedimientos que puedan resultar perjudiciales para la produccion a gran escala o productos farmaceuticos incluyen, por ejemplo, la inclusion de enzimas, desnaturalizacion por calor, separacion mecanica (maquinas que hacen tal separacion), por ejemplo aparatos de centrifugacion, o disolventes organicos o volatiles, por ejemplo, isopropanol.
Las celulas de interes pueden ser producidas y cosechadas tal como por medios rutinarios de fermentacion y recoleccion. Esta bien dentro de las capacidades de un experto en la tecnica preparar cantidades suficientes de las celulas de interes. Por ejemplo, las celulas pueden ser E. coli que contienen un plasmido de alto numero de copias de interes y las celulas que contienen plasmido pueden fermentarse a alta densidad usando tecnicas por lotes o lotes de alimentacion. Los metodos para preparar dichas celulas de E. coli que contienen plasmido y realizar tal fermentacion discontinua o alimentada por lotes son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Las celulas pueden recogerse mediante medios rutinarios tales como centrifugacion o filtracion para formar una pasta celular. Tales metodos de recoleccion son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Ademas, los expertos en la tecnica reconoceran que las celulas cosechadas o la pasta celular pueden ser procesadas inmediatamente o almacenadas en un estado congelado o refrigerado para su procesamiento en una fecha posterior.
Las celulas cosechadas pueden ser lisadas usando una solucion de lisis para liberar su contenido, incluyendo las moleculas biologicamente activas de interes, en una solucion de lisado.
Generalmente, antes de lisar las celulas, la pasta celular puede usarse para preparar una suspension de celulas que contienen la molecula biologicamente activa de interes. Las celulas pueden suspenderse en cualquier solucion adecuada. La suspension que contiene las celulas en solucion de suspension puede mantenerse en un tanque u otro recipiente de almacenamiento. Pueden utilizarse dos recipientes en los que el segundo recipiente se puede usar para resuspender cantidad adicional de celulas mientras que el primer recipiente se usa en el proceso de lisis. La solucion en suspension puede, en algunas realizaciones, contener una concentracion moderada de regulador, una concentracion moderada de un agente quelante, o ambos. En algunas realizaciones, la solucion en suspension puede comprender aproximadamente 25 mM Tris-hidrocloruro ("Tris-HCl") y aproximadamente 10 mM edetato disodico ("Na2EDTA"), a un pH de aproximadamente 8. En algunas realizaciones, la suspension celular puede ser preparada suspendiendo un peso conocido de pasta celular con un peso conocido de regulador de suspension. Por ejemplo, una parte de la pasta celular puede ser resuspendida en aproximadamente 4-10 partes de regulador, en algunas realizaciones con aproximadamente 6-8 partes de regulador. En algunas realizaciones, la densidad optica de la suspension celular resultante puede ser de aproximadamente 50-80 unidades OD600. En algunas realizaciones, puede ser de aproximadamente 60-70 unidades OD600.
Una solucion de lisis preferiblemente contiene uno o mas agentes de lisis, tales como un alcali, un acido, una enzima, un disolvente organico, un detergente o una mezcla de los mismos. Sin embargo, no se prefiere el uso de enzimas o disolventes organicos derivados de animales, ya que son perjudiciales para la produccion de productos farmaceuticos. En algunas realizaciones, la solucion de lisis comprende un alcali, un detergente o una mezcla de los mismos. Los alcalis adecuados incluyen, pero no se limitan a, hidroxido de sodio o hidroxido de potasio. Los detergentes pueden ser no ionicos, cationicos o anionicos. Los detergentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, dodecilsulfato de sodio (“SDS”), Triton, Tween o agentes de tipo pluronico (copolfmeros de bloques a base de etilenooxido y propilenoxido). La seleccion de un alcali o detergente adecuado estara dentro de los conocimientos
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normales de la tecnica. En algunas realizaciones, la solucion de lisis puede comprender hidroxido sodico ("NaOH") y SDS. En algunas realizaciones, la concentracion de NaOH puede ser de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.3 N, y en algunas realizaciones, aproximadamente 0.2 N. En algunas realizaciones, la concentracion de SDS puede ser de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5%, y en algunas realizaciones aproximadamente 1 %. En algunas realizaciones, la solucion de lisis puede mantenerse en un tanque u otro recipiente de almacenamiento.
La suspension celular y la solucion de lisis se pueden combinar para lisar las celulas y producir una solucion de lisado. En algunas realizaciones, se combinan, mezclan y mantienen como una mezcla durante un tiempo suficiente para facilitar altos niveles de lisis de celulas y liberacion de materiales biologicos, formando de esta manera la solucion de lisado.
En algunas realizaciones, la suspension celular y la solucion de lisis se mantienen en tanques separados y se recuperan desde dichos tanques usando una o mas bombas. La suspension celular y la solucion de lisis pueden ponerse en contacto entre sf usando un conector "Y". En algunas realizaciones, volumenes iguales de suspension celular y solucion de lisis pueden ser bombeados a velocidades de flujo iguales usando una bomba de cabeza doble. Sin embargo, los expertos en la tecnica reconoceran que la suspension celular y la solucion de lisis de diferentes volumenes pueden ser bombeadas a diferentes velocidades, usando bombas individuales, si se desea. En algunas realizaciones, la suspension de celulas y la solucion de lisis se bombean simultaneamente a traves de una bomba de cabeza doble frp, de aproximadamente 0.3 L/min a aproximadamente 2 L/min, con los fluidos de contacto que salen del conector "Y" a una velocidad de aproximadamente 0.6 L/min a aproximadamente 4 L/min. Los expertos en la tecnica reconoceran que estas velocidades de flujo pueden aumentarse o disminuirse facilmente, y el tamano del tubo aumentado o disminuido, para satisfacer cualquier requerimiento de rendimiento. Despues de salir del conector "Y", la suspension de celulas y la solucion de lisis contactadas pueden pasar a traves de un mezclador en lmea de alto cizallamiento. El mezclador puede ser cualquier dispositivo que proporcione un mezclado rapido y de alto cizallamiento en un modo de flujo continuo (en oposicion a un modo discontinuo). En algunas realizaciones, el mezclador es un mezclador rotor/estator o un emulsionante. Los expertos en la tecnica reconoceran que una variedad de tales mezcladores en lmea de alto cizallamiento estan disponibles comercialmente. El uso de cualquiera de tales mezcladores esta dentro del alcance de la presente invencion. En algunas realizaciones, el mezclador es un mezclador rotor/estator Silverson L4R equipado con una pantalla Emulsor estandar (Silverson Machines, Inc. East Longmeadow, MA) y un ensamblaje en lmea. El rotor puede ser operado a una velocidad tal como de aproximadamente 500 rpm a aproximadamente 900 rpm, 500-600 rpm, de aproximadamente 500 rpm a aproximadamente 700 rpm, de aproximadamente 500 rpm a aproximadamente 800 rpm, de aproximadamente 600 rpm a aproximadamente 700 rpm, de aproximadamente 600 rpm a aproximadamente 800 rpm, de aproximadamente 600 rpm a aproximadamente 900 rpm, de aproximadamente 700 rpm a aproximadamente 800 rpm o de aproximadamente 700 rpm a aproximadamente 900 rpm. Tal mezclador es adecuado para procesar suspensiones de celulas de aproximadamente 0.3 L/min a aproximadamente 2 L/min. Sin embargo, un experto en la tecnica reconocera que los mezcladores a gran escala pueden ser sustituidos para procesar volumenes sustancialmente mayores de suspension de celulas. Dicha sustitucion sera facilmente realizada por un experto en la tecnica sin mas que la experimentacion ordinaria. El uso de un mezclador en lmea de alto cizallamiento facilita la mezcla completa y rapida de la suspension celular y la solucion de lisis, poniendo las celulas en contacto mtimo con el agente o agentes de lisis para lograr una lisis eficaz. Ademas, los mezcladores pueden adaptarse facilmente a diferentes velocidades de flujo de fluido, y proporcionan la flexibilidad de la mezcla de velocidad ajustable para diferentes velocidades de flujo. Los materiales que salen del mezclador en lmea de alto cizallamiento pueden entonces pasar a traves de una bobina de retencion. Esta bobina puede comprender simplemente una longitud de tubo suficiente para proporcionar que el fluido pase a traves de la bobina durante un tiempo determinado. La funcion de la bobina es proporcionar un tiempo de contacto suficiente entre las celulas y el(los) agente(s) de lisis para asegurar una lisis sustancialmente completa. Al mismo tiempo, la bobina asegura que el tiempo de contacto no sea tan largo como para tener consecuencias negativas. En algunas realizaciones, tales como aquellas en las que las celulas son celulas que contienen plasmido y la solucion de lisis comprende un alcali, es deseable asegurar que la exposicion a alcali dura el tiempo suficiente para lograr una lisis celular sustancialmente completa asf como una desnaturalizacion sustancialmente completa de protemas, ADN genomico y otros componentes celulares. Sin embargo, tambien es deseable que la exposicion a alcali no se prolongue de tal manera que resulte en cantidades sustanciales de plasmido permanentemente desnaturalizado. La bobina puede ser una tubena completa, o segmentada en 2-10 tubos para permitir la flexibilidad de las ratas de flujo de fluido. La bobina de retencion permite controlar este tiempo de contacto. En algunas realizaciones, este tiempo de contacto puede ser de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 10 minutos. En algunas realizaciones, este tiempo de contacto puede ser de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 9 minutos, de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 8 minutos, de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 7 minutos, de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 6 minutos, de aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 9 minutos, de aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 8 minutos, de aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 7 minutos, de aproximadamente 3 minutos a aproximadamente 6 minutos, de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente de 4 minutos a 9 minutos, de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 8 minutos, de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 7 minutos, de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 6 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 9 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 8 minutos, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 7 minutos, o de
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aproximadamente 5 minutes a aproximadamente 6 minutos. Preferiblemente, el tiempo de contacto es de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 8 minutos o de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 6 minutos. En algunas realizaciones, el tiempo de contacto es de aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, la longitud y el diametro de la bobina de retencion son tales que el tiempo de exposicion deseado se alcanza cuando las celulas lisadas se fluyen a traves a la velocidad deseada. En algunas realizaciones, la bobina de retencion puede ser de aproximadamente 10 pies de longitud a aproximadamente 150 pies de longitud, de aproximadamente 25 pies de longitud a aproximadamente 100 pies de longitud, o de aproximadamente 40 pies de longitud a aproximadamente 60 pies de longitud. En algunas realizaciones, la bobina de retencion tiene aproximadamente 50 pies de longitud, y en algunas realizaciones la bobina de retencion es de aproximadamente 100 pies de longitud. La bobina de retencion puede tener un diametro interior de aproximadamente 0.5 pulgadas a aproximadamente 2 pulgadas, y en algunas realizaciones 0.625 pulgadas. Tambien en algunas realizaciones, las celulas lisadas pueden salir del mezclador en lmea de alto cizallamiento y pasar a traves de la bobina de retencion a una velocidad de aproximadamente 100 mL/min a aproximadamente 10 L/min, de aproximadamente 200 mL/min a aproximadamente 8 L/min, de aproximadamente 300 mL/min a aproximadamente 6 L/min, de aproximadamente 400 mL/min a aproximadamente 4 L/min, de aproximadamente 400 mL/min a aproximadamente 2 L/min, o de aproximadamente 600 mL/min a aproximadamente 1.2 L/min. Preferiblemente, la velocidad a traves de la bobina de retencion es de aproximadamente 0.6 L/min a aproximadamente 10 L/min. En algunas realizaciones preferidas, la velocidad de paso a traves de la bobina de retencion es de aproximadamente 600 mL/min y en algunas realizaciones es de aproximadamente 1200 mL/min. El ajuste de la longitud y el diametro de la bobina puede ser realizado por un experto en la tecnica para acomodar o ajustar el caudal mayor a medida que se aumenta la produccion de moleculas biologicamente activas. La solucion de lisado se recoge de la bobina de retencion.
La solucion de lisado se neutraliza combinandola con una solucion neutralizante (que tambien se denomina solucion de precipitacion neutralizante) para producir una dispersion que comprende solucion de lisado neutralizado y escombros. La dispersion resultante puede entonces mantenerse para facilitar la separacion de la solucion de lisado neutralizado de los desechos.
En algunas realizaciones, la solucion de lisado, que comprende las celulas lisadas, puede neutralizarse mezclandola con una solucion neutralizante en una camara de neutralizacion. Esta neutralizacion de la solucion de lisado se puede facilitar mezclando en la camara de neutralizacion. En algunas realizaciones, esta neutralizacion puede ser seguida por una mezcla de burbujas en un mezclador de columna de burbujas. Preferiblemente, la neutralizacion ocurre junto con la mezcla de burbujas en un mezclador de columna de burbujas. En algunas realizaciones, la solucion de lisado que sale de la bobina de retencion puede entrar en un mezclador de columna de burbujas mientras simultaneamente una bomba puede suministrar una solucion de neutralizacion/precipitacion desde otro tanque al mezclador de columna de burbujas. En algunos ejemplos, tambien simultaneamente, el gas comprimido de otro tanque puede ser rociado en el fondo del mezclador de columna de burbujas. En algunas realizaciones, la solucion de lisado puede entrar en la columna en el fondo desde un lado, mientras que la solucion de neutralizacion/precipitacion puede entrar en el fondo desde el lado opuesto. El gas comprimido puede ser inyectado a traves de un rociador sinterizado disenado para suministrar burbujas de gas sustancialmente uniforme a traves de la seccion transversal de la columna. La solucion de lisado, que comprende las celulas lisadas, y la solucion de neutralizacion fluyen verticalmente por la columna y salen a traves de un orificio de salida en el lado cerca de la parte superior. El paso de las burbujas de gas a traves de la columna vertical de lfquido sirve para mezclar la disolucion de lisado con la solucion de neutralizacion/precipitacion. La mezcla proporcionada por las burbujas de gas ascendentes es cuidadosa pero suave y de bajo cizallamiento. A medida que la solucion de neutralizacion/precipitacion se mezcla con las celulas lisadas de la solucion de lisado, los componentes celulares se precipitan a partir de la solucion. Se puede proporcionar un respirador en la parte superior del mezclador de columna de burbujas para ventilar el exceso de gas.
En algunas realizaciones, la solucion de lisado comprende celulas que contienen plasmido lisadas con un alcali, un detergente o una mezcla de los mismos, y la solucion de neutralizacion/precipitacion neutraliza el alcali y precipita componentes de celulas hospedadoras tales como protemas, membranas, endotoxinas y ADN genomico . En algunas realizaciones, el alcali puede ser NaOH, el detergente puede ser SDS, y la solucion de neutralizacion/precipitacion puede comprender acetato de potasio, acetato de amonio o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, la solucion de neutralizacion/precipitacion puede comprender una solucion sin regulador que contiene aproximadamente 1 M de acetato de potasio y de aproximadamente 3 M a aproximadamente 7 M de acetato de amonio. El uso de tal solucion de neutralizacion/precipitacion produce una suspension con un pH de aproximadamente 7 a aproximadamente 8, que es preferible a un pH acido porque las condiciones acidas pueden conducir a la depurinacion del ADN. En algunas realizaciones, la solucion de neutralizacion/precipitacion puede proporcionarse en una forma enfriada de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C.
El mezclador de columna de burbujas proporciona el mezclado en una manera de bajo cizallamiento y evita asf la liberacion excesiva de ADN genomico y endotoxinas en la solucion de lisado neutralizado. Un experto en la tecnica sera capaz de determinar velocidades adecuadas para fluir gas a traves del mezclador de columna de burbujas. Los caudales de gas se pueden utilizar a aproximadamente 2 litros estandar por minuto a aproximadamente 20 litros estandar por minuto ("slpm"). Puede utilizarse cualquier gas adecuado, incluyendo, pero no limitado a, aire, nitrogeno, argon y dioxido de carbono. El gas puede ser aire comprimido filtrado.
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La combinacion de solucion de lisado y solucion de neutralizacion da como resultado la generacion de una dispersion que contiene solucion de lisado neutralizado y residuos. La solucion de lisado neutralizado puede recogerse en un tanque u otro recipiente de almacenamiento. En algunas realizaciones, el recipiente se enfna a 5- 10°C. El tiempo de retencion del lisado neutralizado en el recipiente es inferior a 1 hora. En una realizacion, se empleo un penodo de retencion suficiente para conseguir una separacion sustancialmente completa del residuo celular de la solucion de lisado neutralizado, resultando ventajoso el lisado bruto obtenido de partfculas solidas limitadas para el proceso subsiguiente de clarificacion. Sin embargo, la escala de proceso se limita al tanque de retencion de lisado bruto y el tiempo de proceso es alargado por este periodo de retencion.
Con el fin de conseguir una purificacion a gran escala de un producto de plasmido de bajo rendimiento, el penodo para la retencion de lisado neutralizado puede reducirse a menos de 1 hora. En algunas realizaciones, la solucion de lisado neutralizado puede procesarse simultaneamente en el momento en que se genera, por lo que el tiempo de retencion en el recipiente es insignificante. En algunas realizaciones, la solucion de lisado se procesa simultaneamente por el siguiente proceso despues de un periodo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 60 minutos de recoger el lisado en el recipiente. La reduccion o eliminacion del tiempo de retencion del lisado tambien elimina el lfmite de la capacidad del proceso por los envases ya que el lisado se procesa inmediatamente en su generacion.
La solucion de lisado neutralizado puede aclararse con cualquier aproximacion de separacion solido/lfquido, por ejemplo, filtracion de bolsas, filtracion de cartuchos, centrifugacion por lotes, centrifugacion continua. La eliminacion completa de las partfculas en la solucion es deseable para evitar la obstruccion de la membrana o columna en los siguientes procesos de purificacion. Al mismo tiempo, el lisado no puede ser sometido a un cizallamiento excesivo que fragmentara el ADN genomico y provocara la liberacion de ADN genomico, ADN genomico triturado, endotoxina y otros contaminantes que se liberaran en la solucion que contiene el plasmido. La filtracion por lotes puede usarse para procesar un pequeno volumen de lisado, pero poco practico a gran escala. La centrifugacion continua tambien es inadecuada debido a que el precipitado puede someterse a un alto esfuerzo cortante y liberar un alto nivel de contaminante a la solucion. En algunas realizaciones se puede utilizar una serie de filtraciones que emplean diferentes grados de medio filtrante. La filtracion primaria se puede usar para eliminar la mayona de los floculos de celulas grandes en tamanos de micrones, mientras que la filtracion secundaria consecutiva retiene las partfculas finas restantes. Puede realizarse una tercera filtracion opcional cuando se desea una claridad estricta para el siguiente proceso y la filtracion secundaria es insuficiente.
En algunas realizaciones, se pueden emplear filtros de bolsa y cartucho debido a su alta capacidad de retencion de contaminacion y una perturbacion minima a la solucion. Las bolsas de filtro o cartucho pueden ser de cualquier tamano, forma, clasificacion de tamano de poro, configuracion y tipo de medio. Se prefiere que el medio filtrante este hecho de materiales de grado farmaceutico o que cumplan con los requisitos de la Food and Drug Administration (FDA). El material de filtro tambien se prefiere que no tenga carga o que tenga una union limitada del producto. El lfmite de tamano de partfcula de los materiales de filtro puede variar desde aproximadamente 0.1 pm hasta unos pocos cientos de micras, con la condicion de que sea mayor que el tamano del producto diana que el producto no sea retenido por el medio filtrante. Los filtros de bolsa y los medios de filtro de cartucho pueden ser de una sola capa, multicapa, plisado o plisado multiple.
En algunas realizaciones, se pueden usar dos o mas filtros con clasificaciones de tamano de poros similares en paralelo para acomodar el proceso a gran escala. La mayona de las partfculas solidas en la solucion de lisado, incluyendo la pared celular y los componentes de membrana, los precipitados, el ADN genomico, la protema, los lfpidos, los lipopolisacaridos y otros contaminantes, se eliminaran por filtracion. Sin embargo, cuando la filtracion primaria es insuficiente para proporcionar una solucion de la claridad deseada, se puede colocar posteriormente una filtracion secundaria con un tamano de poro reducido o una tasa de retencion mas alta. En algunas realizaciones, dos o mas filtros secundarios pueden colocarse en paralelo para acomodar el proceso a gran escala. El uso de multiples filtros puede ser requerido en un proceso a gran escala, y un experto en la tecnica reconocera que se pueden variar facilmente detalles tales como el numero de filtros usados, asf como sus lfmites de tamano de partfcula.
En algunas realizaciones, la dispersion puede recogerse y mantenerse en un tanque de sedimentacion para permitir que los residuos se precipiten o floten. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la dispersion puede recogerse como una suspension de lisado celular bruto y componentes de celulas huesped precipitado del mezclador de columna de burbujas y mantenerse en un tanque de sedimentacion para permitir que los residuos se precipiten o floten. La dispersion puede mantenerse, tal como conservarse en el deposito de decantacion, durante un tiempo suficiente para conseguir una separacion sustancialmente completa de los componentes de la celula huesped precipitada, que constituyen los residuos, de la solucion de lisado neutralizado. Los componentes precipitados pueden elevarse a la superficie de la dispersion, ayudados por las burbujas de gas atrapadas introducidas por el mezclador de columna de burbujas. En algunas realizaciones, la dispersion puede mantenerse en el deposito de sedimentacion durante aproximadamente 6 a aproximadamente 24 horas, en algunas realizaciones de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 18 horas. En algunas realizaciones, la dispersion puede enfriarse a menos de aproximadamente 15°C durante el periodo de mantenimiento, en algunas realizaciones de
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aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C, para ayudar a precipitar el ARN u otras impurezas. En algunas realizaciones, la dispersion se puede mezclar suavemente durante el penodo de mantenimiento, tal como por un mezclador impulsor que funciona a una velocidad muy baja, preferiblemente de aproximadamente 15 rpm a aproximadamente 25 rpm.
En algunas realizaciones, se puede aplicar un vado al recipiente que contiene la dispersion, tal como, por ejemplo, un tanque de sedimentacion. Esto ayuda a llevar los componentes precipitados a la superficie del lfquido. Ademas, esto compacta el precipitado/desecho floculento flotante, ayudando a su posterior eliminacion y tambien permitiendo que un mayor porcentaje de solucion de lisado neutralizado sea recuperado en etapas posteriores. Ademas, esto elimina el aire atrapado en una solucion que puede contaminar etapas posteriores de cromatograffa. En algunas realizaciones, el vado aplicado puede ser de aproximadamente 15 pulgadas de Hg a aproximadamente 30 pulgadas de Hg (pulgadas^Hg), en algunas realizaciones, de aproximadamente 20 en Hg a aproximadamente 30 pulgadas^Hg, y en algunas realizaciones, de aproximadamente 25 en Hg a aproximadamente 30 pulgadas^Hg. En algunas realizaciones, el vado puede mantenerse a lo largo de este periodo de mantenimiento. El vado se puede aplicar usando una bomba de vado, o cualquier otro dispositivo de vado disponible o de presion negativa disponible. En algunas realizaciones, antes de comenzar la separacion solido/lfquido, cualquier vado aplicado al deposito se libera cuidadosamente. El lisado de celulas en bruto, es decir, la solucion de lisado neutralizado, se recoge despues del tanque usando una bomba y se pasa a traves de un filtro en profundidad y un filtro final, y despues se recoge en un tanque de retencion. En algunas realizaciones, el tanque de sedimentacion esta provisto de un visor, que permite al operador observar la posicion del nivel de lfquido y los componentes de celula huesped precipitados compactados. El bombeo de material desde el tanque se controla visualmente, y se detiene antes de que los componentes precipitados de la celula huesped entren en la lmea. Esto evita la obstruccion de los filtros subsiguientes. No se requiere filtracion de bolsas (o filtracion de cartuchos) o centrifugacion. Ademas, la alteracion de los desechos minimiza de este modo la liberacion de componentes tales como ADN genomico o endotoxinas en la solucion de lisado neutralizado. Despues de que la solucion de lisado neutralizado se bombea desde el tanque de sedimentacion, se puede hacer pasar a traves de uno o mas filtros para eliminar partfculas finas. En algunas realizaciones, se pueden usar aproximadamente de uno a aproximadamente tres filtros en serie, con el primer filtro eliminando partfculas mas grandes, y filtros subsiguientes quitando partfculas sucesivamente mas pequenas. En algunas realizaciones, se pueden usar dos filtros en serie. En algunas realizaciones, el primer filtro es un filtro de profundidad de prefiltracion con un lfmite de tamano de partfcula de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 15 pm, preferiblemente de aproximadamente 7.5 pm a aproximadamente 12 pm, o mas preferiblemente de aproximadamente 9 pm a aproximadamente 11 pm. En algunas realizaciones, el filtro de profundidad de prefiltrado tiene un lfmite de tamano de partfcula de aproximadamente 10 pm. El segundo filtro es preferiblemente un filtro de membrana con un corte de aproximadamente 0.01 pm a aproximadamente 0.25 pm, o preferiblemente de aproximadamente 0.05 pm a aproximadamente 0.15 pm. En algunas realizaciones, el filtro de membrana tiene un corte de aproximadamente 0.1 pm. Sin embargo, un experto en la tecnica reconocera que se pueden variar facilmente detalles tales como el numero de filtros usados, asf como sus lfmites de tamano de partfcula.
Una amplia seleccion de filtros esta comercialmente disponible en diferentes proveedores. Un tipo particular es los filtros de carton plisados serie 720 (filtros CPI, Houston, TX), que demostraron una gran capacidad de sujecion de la contaminacion y una capacidad de procesamiento superior. Las bolsas de filtro de multiples capas de alta eficiencia, tales como las series 300 y 500 (Knight Corporation, Houston, TX) han mostrado una considerable retencion a partfculas finas. Las bolsas de filtro PROGAF™ (Eaton Filtration, Cleveland, OH) con un diseno de densidad progresiva de hasta 12 capas de medio pueden proporcionar alta eficiencia en la eliminacion de partfculas con una variedad de tamanos. En algunas realizaciones, una combinacion de filtracion de cartucho plisada seguida por filtracion de cartucho multicapa o plisada puede proporcionar el mejor rendimiento para la clarificacion de partfculas en la solucion de lisado neutralizado.
Los filtros de cartucho o filtros de bolsa se prefieren para ser montados en los alojamientos de filtro o recipientes de filtro para la facilidad de operacion y capacidad de proceso mas alta. El material del recipiente puede ser acero inoxidable de tipo 304 o 316, o acero carbon, mientras que todas las carcasas de plastico con una opcion de policloruro de vinilo (PVC), cloruro de polivinilo cloruro (CPVC), poliester plastico (PPL) o la construccion de fluoruro de polivinilideno (PVDF) pueden ser ventajosas para aplicaciones ultrapuras o corrosivas. Los recipientes de filtro pueden ser disenados a medida o facilmente disponibles de varios fabricantes. Por ejemplo, Eaton Filtration (Cleveland, OH) ofrece una amplia seleccion de carcasas/recipientes disenados para satisfacer cualquier aplicacion exigente, como TOPLINE, SIDELINE, DUOLINE, MODULINE, POLYLINE, FLOWLINE, ECOLINE, MAXILINE. Un experto en la tecnica sera capaz de determinar la construccion y las caractensticas de la carcasa del filtro para acomodarse a los requisitos del proceso.
Opcionalmente, despues de la filtracion secundaria puede aplicarse un filtro adicional de profundidad o filtro de membrana. Se prefiere que el filtro tenga un corte de aproximadamente 0.1 pm a aproximadamente 0.2 pm para la eliminacion adicional de partfculas finas en la solucion de lisado neutralizado. Los filtros de cartucho, tales como Vangard PP y Alpha PP de Meissner (Camarillo, CA), Clarigard de Millipore (Billerica, MA), HP y PreFlow de Pall (East Hills, nY), pueden contemplarse como desechables o con la ayuda de alojamientos. Sin embargo, la mayona de estos filtros de cartucho estan limitados por su capacidad de proceso, especialmente en los formatos desechables. Preferible es el uso de componentes desechables que pueden ofrecer un formato escalable para
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acomodar aplicaciones a gran escala. Millipore (Billerica, MA) ha desarrollado un sistema de filtro de profundidad desechable de alto rendimiento, Millistak+ Pod, para las aplicaciones en el laboratorio o en escala de proceso. El medio de filtro en los filtros de vaina esta compuesto de fibra de celulosa de grado selecto y tierra de diatomeas, y se demuestra que tiene gran retencion de contaminantes y retencion superior. El diseno del disco apilado de la ayuda del formato de la vaina por el sostenedor inoxidable permitio la filtracion grande del area superficial en espacios apretados. Un experto en la tecnica puede determinar el grado de medio y el area de membrana del filtro Pod para satisfacer necesidades de operacion espedficas.
La solucion clarificada de lisado neutralizado, que contiene las moleculas biologicamente activas de interes, puede someterse luego a cromatograffa de intercambio ionico, incluyendo cromatograffa en columna o basada en membrana. Preferiblemente, se puede usar un enfoque basado en membrana, tal como cromatograffa de membrana de intercambio anionico. Por ejemplo, la solucion de lisado neutralizado puede aplicarse a una membrana de intercambio ionico. De acuerdo con algunas realizaciones, la molecula biologicamente activa de interes puede entrar en contacto con una membrana por lo que la molecula biologicamente activa de interes puede unirse a la membrana, mientras que las impurezas fluyen o son eliminadas de la membrana, separando asf la molecula biologicamente activa de interes de las impurezas. Alternativamente, la molecula biologicamente activa de interes puede fluir a traves de la membrana, mientras que las impurezas son retenidas. En algunas realizaciones, la molecula biologicamente activa de interes se une a la membrana y, despues de lavar para eliminar las impurezas unidas debilmente, la molecula biologicamente activa de interes se eluye de la membrana. La elucion se puede conseguir fluyendo una solucion salina a traves de la membrana. La solucion salina tiene una resistencia, concentracion o conductividad suficiente para superar la union de la molecula biologicamente activa de interes a la membrana. La molecula biologicamente activa de interes se recupera asf en el eluido de intercambio ionico.
Aunque cualquier membrana de intercambio ionico puede ser adecuada, en algunas realizaciones se puede usar una membrana de intercambio anionico tal como una membrana de intercambio anionico fuerte, que comprende grupos amina cuaternarios. Ejemplos de tales membranas incluyen, pero no pueden limitarse a, Mustang Q (Pall Corporation, East Hills, NY), Sartobind Q (Sartorius, Edgewood, NY) e Intercept Q (Millipore Corporate, Billerica, MA).
En algunas realizaciones, las celulas que contienen plasmido se lisan y neutralizan para producir una solucion de lisado neutralizado que puede procesarse mediante purificacion de membrana de intercambio anionico que comprende la purificacion usando un cartucho Pall Mustang Q (Pall Corporation, East Hills, NY). En algunas realizaciones, la solucion de lisado neutralizado puede ajustarse a una conductividad de aproximadamente menos de 95 mS/cm, o aproximadamente 85 mS/cm, por dilucion con una cantidad adecuada de agua purificada. La conductividad puede ser ajustada de aproximadamente 80 mS/cm a aproximadamente 85 mS/cm en algunas realizaciones. Para la dilucion se puede utilizar agua purificada igual a aproximadamente 1.5 veces el volumen del lisado para conseguir la conductividad deseada. El cartucho Mustang® Q se puede acondicionar fluyendo una solucion de sal adecuada a traves de ella. En algunas realizaciones, la solucion puede comprender desde aproximadamente cloruro de sodio 0.5 M a aproximadamente cloruro de sodio 1.0 M ("NaCl") y en algunas otras realizaciones NaCl 0.67 M. La solucion de equilibrio tambien puede incluir un agente tamponador, un agente quelante o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, esta solucion de equilibrio/lavado puede comprender, ademas de NaCl 0.67 M, Tris-HCl 10 mM, Na2EDTA 1 mM, con un pH de 8. En algunas realizaciones, la solucion de equilibrio/lavado puede ser bombeada a traves del cartucho a aproximadamente 800 mL/min a aproximadamente 1500 mL/min. La disolucion de lisado neutralizado diluido puede ser bombeada sobre el cartucho, en algunas realizaciones a menos de aproximadamente 4800 mL/min, en algunas realizaciones de
aproximadamente 2000 mL/min a aproximadamente 20.000 mL/min. El cartucho cargado puede lavarse con un regulador de equilibrio/lavado, preferiblemente a un caudal de aproximadamente 800 mL/min a aproximadamente 1500 mL/min. El lavado puede continuar en algunas realizaciones hasta que la absorbancia a 260 nm (A260) del efluente vuelva a aproximadamente la lmea de base. El plasmido puede eluirse con una solucion que comprende NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM, Na2EDTA 1 mM, y pH 8. La elucion puede realizarse en algunas realizaciones a un caudal de aproximadamente 500 mL/min a aproximadamente 9000 mL/min, de aproximadamente 500 mL/min a aproximadamente 8000 mL/min, de aproximadamente 500 mL/min a aproximadamente 7000 mL/min, de

aproximadamente 500 mL/min a aproximadamente 6000 mL/min, de aproximadamente 500 mL/min a

aproximadamente 5000 mL/min, de aproximadamente 500 mL/min a aproximadamente 4000 mL/min, de

aproximadamente 500 mL/min a aproximadamente 3000 mL/min, de aproximadamente 500 mL/min a

aproximadamente 2000 mL/min, de aproximadamente 600 mL/min a aproximadamente 5000 mL/min, de

aproximadamente 600 mL/min a aproximadamente 4000 mL/min, de aproximadamente 600 mL/min a
aproximadamente 3000 mL/min, de aproximadamente 600 mL/min a aproximadamente 2000 mL/min, o de
aproximadamente 600 mL/min a aproximadamente 1500 mL/min. En algunas realizaciones la elucion se continua hasta que la A260 del eluido vuelve a aproximadamente la lmea de base. Los expertos en la tecnica reconoceran que las velocidades de flujo pueden aumentarse facilmente utilizando grandes areas de membrana y que las concentraciones de sales espedficas de las soluciones enumeradas pueden alterarse para maximizar el rendimiento y la pureza de biomoleculas espedficas utilizando no mas que la experimentacion ordinaria. El eluido recogido es un eluido de intercambio ionico y se utiliza en la purificacion subsiguiente por etapas de interaccion hidrofoba.
El eluido de intercambio ionico recuperado de la membrana de intercambio ionico se somete a purificacion por
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cromatograffa de interaccion hidrofoba (en el presente documento, "HIC"). En algunas realizaciones, la molecula biologicamente activa de interes puede unirse a la membrana o columna HIC, mientras que las impurezas fluyen a traves de o se lavan. En algunas realizaciones, la molecula biologicamente activa de interes puede fluir mientras las impurezas se unen. En algunas realizaciones, la molecula biologicamente activa de interes fluye a traves de una membrana HIC (denominada en el presente documento "Metodo I"). En algunas realizaciones, las moleculas biologicamente activas de interes se unen a una columna HIC, tal como una columna de butilo (denominada en el presente documento "Metodo II"). En algunas realizaciones, puede usarse una combinacion de membrana HIC y columna HIC, tal como una columna de butilo (denominada en el presente documento como "Metodo III") para producir cantidades a gran escala de molecula biologicamente activa de interes con alta pureza.
El eluido de intercambio ionico puede acondicionarse antes de fluir sobre la membrana de interaccion hidrofoba. Tfpicamente, el acondicionamiento consiste en anadir una cantidad deseada de una sal deseada. En algunas realizaciones, el sulfato de amonio puede usarse en una cantidad adecuada para proporcionar la union del producto o de las impurezas, segun se desee. Tfpicamente, en los metodos III, no es necesario ningun acondicionamiento para el filtrado de HIC antes de cargar a la columna de butilo.
En algunas realizaciones, el eluido de intercambio ionico se produce por cromatograffa de intercambio anionico utilizando un cartucho Pall Mustang® Q y se purifica adicionalmente mediante interaccion hidrofoba. En algunas realizaciones, se puede usar una membrana HIC tal como una capsula Pall Kleenpak™ Nova (Pall Corporation, East Hills, NY) con filtros Supor PES. El cartucho puede acondicionarse fluyendo una solucion de equilibrio/lavado que comprende la concentracion de sulfato de amonio a traves de el. En algunas realizaciones, la solucion de equilibrio/lavado comprende de aproximadamente 1 M de sulfato de amonio a aproximadamente 3 M de sulfato de amonio y en algunas realizaciones comprende 2.4 M sulfato de amonio y 10 mM Tris-HCl a aproximadamente pH 8. En algunas realizaciones, la conductividad de la equilibrio/solucion de lavado es de aproximadamente 240 mS/cm a aproximadamente 260 mS/cm. En algunas realizaciones, la conductividad de la solucion de equilibrio/lavado es de aproximadamente 240 mS/cm a aproximadamente 300 mS/cm, en algunas realizaciones y la solucion de equilibrio/lavado es de aproximadamente 250 mS/cm a aproximadamente 270 mS/cm y en algunas realizaciones la solucion de equilibrio/lavado es de aproximadamente 245 mS/cm a aproximadamente 255 mS/cm. En algunas realizaciones, una columna HIC empleada puede ser una columna que esta empaquetada con resina de Toyopearl butil 650M (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA). En algunas realizaciones, la columna puede equilibrarse con una solucion compuesta de aproximadamente 1.5 M de sulfato de amonio a aproximadamente 3.0 M de sulfato de amonio. En algunas realizaciones, la columna puede equilibrarse con una solucion compuesta de sulfato de amonio 2.5 M y Tris-HCl 10 mM.
Las membranas de interaccion hidrofobas pueden ser cualquier membrana que se una a moleculas biologicamente activas de interes o impurezas basadas principalmente en interacciones hidrofobas. Ejemplos de membranas HIC incluyen, pero se limitan a filtros de polietersulfona de supor de Pall ("PES"), filtros de PVDF, filtros de capsulas GE PES y membranas hidrofilas similares con baja union a protemas y amplia compatibilidad qrnmica. Las resinas HIC tfpicas incluyen, pero sin limitacion, butilo, hexilo, fenilo, octilo, propilo, neopentilo, hidroxipropilo, bencilo, metilo y derivados de los mismos.
En algunas realizaciones, el eluido de intercambio ionico puede acondicionarse por dilucion con sulfato de amonio 3 M o 4.1 M para elevar la conductividad entre aproximadamente 240 mS/cm hasta aproximadamente 290 mS/cm, y en algunas realizaciones, de aproximadamente 245 mS/cm hasta aproximadamente 255 mS/cm. Cuando se utiliza el metodo HIC I, el eluido de intercambio ionico diluido puede fluir a traves del cartucho HIC acondicionado, a una velocidad de flujo, en algunas realizaciones, de aproximadamente 100 mL/min a aproximadamente 200 mL/min. El flujo a traves puede ser recogido para posterior ultrafiltracion/diafiltracion. Opcionalmente, el cartucho HIC se puede lavar con agua y la solucion de lavado se recupera para analizar los contaminantes eliminados del producto. Cuando se utiliza el metodo II, el eluido de intercambio ionico diluido puede cargarse en la columna a una velocidad de flujo de 10-20 litros de volumen/minuto (BV/min). La molecula biologicamente activa de interes puede lavarse, tal como desde aproximadamente sulfato de amonio 1.0 M hasta aproximadamente sulfato de amonio 2.5 M hasta que la absorbancia vuelve a la lmea de base, despues se eluye con, por ejemplo sulfato de amonio 0.5 a 2.0 M. Las impurezas pueden separarse con agua esteril para inyeccion (WFI) para que la columna pueda regenerarse para un uso repetible. El metodo III utiliza una membrana HIC como se describe en el metodo I, seguido de columna HIC como se describe en el metodo II. La eleccion del metodo I, II o III depende de los requisitos de propiedad y calidad del producto, que puede ser determinado por un experto en la materia. Usando cualquier metodo HIC, se genera un eluido HIC que contiene el material biologicamente activo de interes. Los expertos en la tecnica reconoceran que las velocidades de flujo se pueden aumentar facilmente usando grandes areas de membrana o diametros de columna y que las concentraciones de sales espedficas de las soluciones enumeradas pueden ser alteradas para maximizar el rendimiento y la pureza de biomoleculas espedficas usando no mas que ordinarias experimentacion.
Opcionalmente, el material biologicamente activo de interes, que esta presente en el eluido de HIC, puede purificarse adicionalmente. En algunas realizaciones, el eluido HIC puede someterse a ultrafiltracion/diafiltracion para concentrar el material biologicamente activo de interes, eliminar las sales en exceso y, si se desea, cambiar la composicion del diluyente. Los metodos para realizar la ultrafiltracion/diafiltracion son bien conocidos por los expertos en la tecnica. En algunas realizaciones, se utiliza filtracion de flujo tangencial. En algunas realizaciones, se
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utilizan metodos discontinuos.
Las membranas de ultrafiltracion/diafiltracion pueden seleccionarse basandose en el corte nominal del peso molecular ("NMWCO") para retener el material biologicamente activo de interes en el retenido, permitiendo a los materiales de bajo peso molecular tales como sales pasar al filtrado. Un experto en la tecnica sera capaz de seleccionar tales membranas basandose en el tamano y naturaleza del producto de interes, acoplado con no mas que la experimentacion ordinaria. En algunas realizaciones, tales como algunas realizaciones cuando el material biologicamente activo de interes es un plasmido, la ultrafiltracion/diafiltracion se puede llevar a cabo usando una unidad de Pall Centramate (Pall Corporation, East Hills, NY) o Millipore Pellicon® XL (Millipore Corporate, Billerica, MA) o una unidad con caractensticas similares y las membranas utilizadas pueden ser casetes de membrana de pantalla suspendida Pall Omega™ (Pall Corporation, East Hills, NY) o casetes de membrana de pantalla media Millipore (Millipore Corporate, Billerica, MA) o uno similar conocido en la tecnica con un NMWCO de 100 kD o 50 kD. En algunas realizaciones, el plasmido puede concentrarse hasta al menos aproximadamente 2.5 mg/mL, en algunas realizaciones hasta al menos aproximadamente 5.0 mg/mL, en algunas realizaciones a al menos aproximadamente 10.0 mg/mL, mientras que en otras realizaciones la concentracion es al menos 12.5 mg/mL, y en otras realizaciones la concentracion es de al menos 15 mg/ml o mas. En algunas realizaciones, la conductividad de la solucion de plasmido concentrada es menor que aproximadamente 50 mS/cm.
El material biologicamente activo desalado concentrado de interes recuperado en el retentado de la ultrafiltracion/diafiltracion puede someterse opcionalmente a filtracion esteril, si se desea un producto esteril. Los metodos para la filtracion esteril son bien conocidos por los expertos en la tecnica, y se puede seleccionar cualquier metodo de este tipo. El material resultante consiste en un producto biologicamente activo purificado sustancialmente. El producto puede usarse para una variedad de propositos, incluyendo, pero sin limitarse a, aplicaciones farmaceuticas, veterinarias o agncolas. Por lo tanto, los metodos proporcionan una preparacion en masa de moleculas biologicamente activas sustancialmente purificadas. Estas moleculas pueden ser plasmidos. En algunas realizaciones, pueden ser plasmidos que estan sustancialmente libres de ADN genomico, ARN, protema y endotoxina.
En algunas realizaciones, tales como las realizaciones en las que la molecula biologicamente activa es un plasmido, la filtracion esteril puede preferiblemente realizarse usando un filtro Pall AcroPak™ 200 (Pall Corporation, East Hills, NY) con un corte de 0.22 pm.
El ADN plasmfdico producido por el procedimiento proporcionado ha mostrado una alta pureza y contaminaciones extremadamente bajas. En algunas realizaciones, la alta pureza del ADN plasmfdico es el ADN plasirndico presente a niveles mayores o iguales al 90%, mayores o iguales al 91%, mayores o iguales al 92%, mayores o iguales al 93%, superior o igual al 94%, superior o igual al 95%, superior o igual al 96%, superior o igual al 97%, superior o igual al 98%, superior o igual al 99%. Es evidente que la pureza puede caracterizarse por un nivel bajo de contaminantes, incluyendo niveles bajos de ARN, ADN genomico, endotoxina y protema. En algunas realizaciones, el ADN plasirndico puede estar en cantidades de aproximadamente 10 mg o mas, 20 mg o mas, 30 mg o mas, 100 mg o mas, 200 mg o mas, 300 mg o mas, 500 g o mas, 1 g o mas, 10 g o mas, 20 g o mas, 30 g o mas, 100 go mas, 200 g o mas, 300 g o mas, 1 kg o mas, o 2 kg o mas. En algunas realizaciones, el ADN plasirndico puede estar en una concentracion de 1 mg/mL o mas. La figura 1 muestra un esquema de una realizacion del proceso de fabricacion.
La realizacion muestra un proceso continuo que se utiliza para tomar una muestra dada de celulas y que tiene las mismas etapas de procesos de purificacion desde el comienzo, incluyendo las etapas de lisis y neutralizacion, hasta las etapas de separacion (es decir, inicio del intercambio ionico cromatograffa) en un flujo continuo de muestra. Las celulas se resuspenden en solucion de resuspension contenida en un tanque de suspension celular 101. La solucion de lisis esta contenida en un tanque 102 de disolucion de lisis. La suspension celular y la solucion de lisis se bombean en las dos entradas de un conector "Y" con la bomba 104 o 105, respectivamente. La solucion que salfa del conector "Y" se mezclo mediante un mezclador 107 en lmea de alto cizallamiento. La solucion de lisado que sale del mezclador 107 pasa a traves de una bobina 108 de retencion durante un penodo de retencion de 4-6 minutos. La solucion de lisis/mezcla de celulas que sale de la bobina de retencion entra en un mezclador 109 de columna de burbujas mientras que simultaneamente una bomba 106 suministra solucion de neutralizacion/precipitacion (NP) desde otro tanque 103 de reserva de NP al mezclador de columna de burbujas. Simultaneamente, el gas comprimido del tanque 110 de gas comprimido se alimenta al rociador que esta situado en la parte inferior del mezclador 109 de columna de burbujas. La solucion de lisado neutralizado se recoge en un recipiente 111. La solucion de lisado se procesa simultaneamente por el siguiente proceso despues de un periodo de 1-60 minutos de recogida del lisado en el recipiente 111. Una bomba 112 para la filtracion primaria entrega la disolucion de lisado bruto a traves de un filtro 113 primario. La solucion filtrada primaria despues del filtro 113 es bombeada simultaneamente en un filtro 115 secundario a traves de la bomba 114. La solucion filtrada resultante de 115 se filtra a traves de un tercer filtro 117 a traves de la bomba 116. Una bomba 118 para el lisado clarificado impulsa el flujo de un recipiente 119 para el lisado clarificado a un mezclador 121 que se mezcla con agua del tanque 120 de agua. La mezcla y la solucion diluida se recogen en un recipiente 122 para el lisado diluido. La disolucion de lisado neutralizado diluido se bombea al cartucho 124 precompuesto de Mustang® Q, que se realiza mediante la bomba 123.
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En algunas realizaciones, el producto del procedimiento proporcionado aqu es un plasmido purificado, concentrado, desalado, esterilizado filtrado puede estar sustancialmente libre de impurezas tales como protema, ADN genomico, ARN y endotoxinas. Se proporcionan aqu niveles bajos de estas impurezas o contaminantes, preferiblemente cantidades libres sustanciales, siendo los niveles mas preferidos cantidades indetectables de tales impurezas o contaminantes. En algunas realizaciones, la protema residual, determinada por el ensayo de protema BCA (acido bicinconmico) (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL), en la solucion de molecula biologicamente activa, preferiblemente plasmido, producida por los metodos de produccion proporcionados, puede ser menor que o igual a aproximadamente 1% (en peso), inferior o igual a 0.9%, inferior o igual a 0.8%, inferior o igual a 0.7%, inferior o igual a 0.6%, inferior o igual a 0.5%, inferior o igual a 0.4%, inferior o igual a 0.3%, inferior o igual a 0.2%, o inferior o igual a aproximadamente 0.1%. En algunas realizaciones, la protema residual es menor o igual a 0.2% y, mas preferiblemente, menor o igual a 0.1%. En algunas realizaciones, la endotoxina residual en la solucion de molecula biologicamente activa, preferiblemente plasmido, producida por los metodos de produccion proporcionados, puede ser menor de aproximadamente 100 unidades de endotoxina por miligramo de plasmido (UE/mg), menor que aproximadamente o igual a aproximadamente 20 UE/mg, inferior o igual a aproximadamente 10 UE/mg, inferior o igual a aproximadamente 1.0 UE/mg, inferior o igual a aproximadamente 0.9 EU/mg, inferior o igual a aproximadamente 0.8 EU/mg, inferior o igual a aproximadamente 0.7 EU/mg, menor o igual a aproximadamente 0.6 EU/mg, menor o igual a aproximadamente 0.5 UE/mg, menor o igual a aproximadamente 0.4 EU/mg, inferior o igual a aproximadamente 0.3 UE/mg, inferior o igual a aproximadamente 0.2 UE/mg, o inferior o igual a aproximadamente 0.1 UE/mg. Preferiblemente, en algunas realizaciones, el nivel de endotoxina es menos bronceado o igual a aproximadamente 0.2 UE/mg, y mas preferiblemente, menor o igual a aproximadamente 0.1 UE/mg. En algunas realizaciones, el ARN residual, determinado por la interaccion hidrofoba HPLC, en la solucion de molecula biologicamente activa, preferiblemente plasmido, producido por los metodos de produccion proporcionados, puede ser menor o igual a aproximadamente 5% (en peso), menor o igual a aproximadamente 1%, menor o igual a 0.9%, menor o igual a 0.8%, menor o igual a 0.7%, menor o igual a 0.6%, menor o igual a 0.5%, menor o igual a 0.4, inferior o igual a 0.3%, inferior o igual a 0.2%, o inferior o igual a aproximadamente 0.1%. Preferiblemente, en algunas realizaciones, la cantidad de ARN es menor o igual a aproximadamente 0.5%, y mas preferiblemente, menor o igual que aproximadamente 0.4%. En algunas realizaciones, el ADN genomico residual, determinado por qPCR, en la solucion de molecula biologicamente activa, preferiblemente plasmido, producido por metodos de produccion proporcionados, puede ser menor o igual a aproximadamente 5% (en peso), menor o igual que aproximadamente 1%, inferior o igual a 0.9%, inferior o igual a 0.8%, inferior o igual a 0.7%, inferior o igual a 0.6%, inferior o igual a 0.5%, inferior o igual a 0.4%, inferior o igual a 0.3%, inferior o igual a 0.2%, inferior o igual a aproximadamente 0.1%, inferior o igual a aproximadamente 0.01%, inferior o igual a aproximadamente 0.001%, inferior o igual a aproximadamente 0,0001%, menor o igual que aproximadamente 0,00001%, o menor o igual a aproximadamente 0,000001%. Preferiblemente, en algunas realizaciones, la cantidad de ADN genomico es menor o igual a aproximadamente 0.1%, y mas preferiblemente menor que aproximadamente 0.001%, y lo mas preferiblemente menor o igual que aproximadamente 0.000001%.
Se pueden producir grandes cantidades de ADN plasmfdico con altos rendimientos y altas concentraciones mediante los metodos proporcionados en el presente documento. El ADN plasmfdico producido por el procedimiento proporcionado incluye soluciones de ADN plasmfdico de alta pureza. En algunas realizaciones, la alta pureza del ADN plasmfdico es mayor o igual que aproximadamente 90%, mayor o igual que aproximadamente 91%, mayor o igual que aproximadamente 92%, mayor o igual que aproximadamente 93%, mayor que o igual a aproximadamente 94%, mayor o igual que aproximadamente 95%, 5 mg/mL o mas, 6 mg/mL o mas, 7 mg/mL o mas, 8 mg/mL o mas, 9 mg/mL o mas, 10 mg/mL o mas, 11 mg/mL o mas, 12 mg/mL o mas, 13 mg/mL o mas, 14 mg/mL o mas, 15 mg/mL o mas. En algunas realizaciones, el ADN plasirndico puede estar en una concentracion de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 14 mg/mL, de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 13 mg/mL, de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 12 mg/mL, de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 11 mg/mL, de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 9 mg/mL, de aproximadamente 5 mg/mL a aproximadamente 8 mg/mL, una concentracion de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 14 mg/mL, de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 13 mg/mL, de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 12 mg/mL, de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 11 mg/mL, de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 9 mg/mL, de aproximadamente 6 mg/mL a aproximadamente 8 mg/mL, una concentracion de aproximadamente 7 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, de aproximadamente 7 mg/mL a aproximadamente 14 mg/mL, de aproximadamente 7 mg/mL a aproximadamente 13 mg/mL, de aproximadamente 7 mg/mL a aproximadamente 12 mg/mL, de aproximadamente 7 mg/mL a aproximadamente 11 mg/mL, de aproximadamente 7 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, de aproximadamente 7 mg/mL a aproximadamente 9 mg/mL, de aproximadamente 8 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, de aproximadamente 8 mg/mL a aproximadamente 14 mg/mL, de aproximadamente 8 mg/mL a aproximadamente 13 mg/mL, de aproximadamente 8 mg/mL a aproximadamente 12 mg/mL, de aproximadamente 8 mg/mL a aproximadamente 11 mg/mL, de aproximadamente 8 mg/mL a aproximadamente 10 mg/mL, de aproximadamente 9 mg/mL a aproximadamente 15 mg/mL, de aproximadamente 9 mg/mL a aproximadamente 14 mg/mL, de aproximadamente 9 mg/mL a aproximadamente 13 mg/mL, de aproximadamente 9 mg/mL a aproximadamente 12 mg/mL, de aproximadamente 9 mg/mL a aproximadamente 11 mg/mL, de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 15
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EJEMPLOS
La presente invencion se ilustra adicionalmente en los siguientes Ejemplos, en los que las partes y los porcentajes son en peso y los grados son Celsius, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invencion, se dan a modo de ilustracion solamente. A partir de la discusion anterior y de estos Ejemplos, el experto en la tecnica puede determinar las caractensticas esenciales de esta invencion, y sin apartarse de su alcance, puede realizar diversos cambios y modificaciones de la invencion para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por lo tanto, diversas modificaciones de la invencion ademas de las mostradas y descritas en el presente documento seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion anterior. Tales modificaciones tambien estan destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLO 1
Las celulas de Escherichia coli ("E. coli") que conteman un plasmido A se fermentaron a alta densidad de una densidad de celulas opticas ("OD600") a 72°C cuando se cosecharon por centrifugacion. El plasmido A tiene un tamano de 6549 pb. El plasmido rtpicamente se replica a un numero de copia bajo de ~250 copias/celula. Se suspendieron aproximadamente 3.1 kg de peso de celulas humedas ("WCW") de pasta celular en un regulador de resuspension que consisrta en Tris-hidrocloruro 25 mM (“Tris-HCl”, JT Baker, Phillipsburg, NJ), edetato disodico 10 mM (Na2EDTA), Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), pH 8, hasta un volumen final de aproximadamente 21.5 L. Esta suspension de celulas se bombeo a 300 mL/min en un lado de un conector en "Y". Simultaneamente, se bombeo solucion de lisis que constaba de hidroxido sodico 0.2 N ("NaOH", JT Baker, Phillipsburg, NJ), dodecil sulfato de sodio al 1% ("SDS", JT Baker, Phillipsburg, NJ) a 300 mL/min en el otro Lado del conector "Y". Los fluidos combinados que salfan del conector "Y" se pasaron inmediatamente a traves de un mezclador de rotor/estator Silverson Modelo L4R equipado con una Emulsor Screen estandar (Silverson Machines, Inc. East Longmeadow, MA) y un ensamblaje en lmea. El mezclador fue operado a una velocidad del rotor de 800 rpm.
El fluido que salfa del mezclador rotor/estator se hizo pasar a traves de una bobina de retencion de 50 pies y 0.625 pulgadas (diametro interno). A un caudal total de aproximadamente 600 mL/min, el tiempo de transito a traves de la bobina de retencion fue de aproximadamente 5 minutos para permitir la lisis celular completa.
Se hizo pasar el lisado celular (solucion de lisado) que salfa de la bobina de retencion en un mezclador de columna de burbujas. Simultaneamente, una solucion de neutralizacion/precipitacion fria (aproximadamente 4°C) consistente en acetato de potasio 1 M (JT Baker, Phillipsburg, NJ), acetato de amonio 7 M (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ) se bombeo de forma independiente al mezclador de columna de burbujas a 600 mL/min. La solucion de lisado y las soluciones de neutralizacion/precipitacion fluyeron verticalmente por la columna de mezcla y por la salida cerca de la parte superior. Mientras las soluciones pasaban a traves de la columna de mezcla, se introdujo aire comprimido en el fondo de la columna a una velocidad de aproximadamente 3.0 slpm a traves de un rociador sinterizado disenado para proporcionar una corriente constante de burbujas finas a lo largo del diametro de la mezcla. El exceso de aire se ventilo a traves de la parte superior de la columna. A medida que la disolucion de lisado y las soluciones de
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neutralizacion/precipitacion pasaron a traves de la columna, se mezclaron continuamente por la suave turbulencia de las burbujas ascendentes. Esto se evidencio por la formacion de un precipitado floculento blanco (componentes de residuos) que consistfa en SDS de potasio, protemas celulares desnaturalizadas, Kpidos unidos y componentes de pared celular, y ADN genomico asociado.
El lisado precipitado neutralizado (dispersion de solucion de lisado neutralizado y residuos) que sale del mezclador de columna de burbujas se recogio en un recipiente de sedimentacion. Este procedimiento se opero en un modo continuo hasta que toda la suspension de pasta celular se liso, neutralizo y precipito, y se recogio en el tanque de sedimentacion. Los volumenes totales de solucion fueron 21.5 L de suspension de celulas mas 5 L de lavado del deposito de resuspension con regulador de resuspension, 26,5 L de solucion de lisis y 53 L de solucion de neutralizacion, para un volumen total de aproximadamente 106 L.
Despues de la recogida, el material en el tanque de sedimentacion se observo a traves de un visor. El precipitado floculante podfa verse subiendo a la superficie del lfquido, ayudado por burbujas de aire claramente visibles que estaban atrapadas en los solidos. Se aplico un vacfo de aproximadamente 28 pulgadas de Hg al tanque de sedimentacion, lo que condujo a una compactacion significativa y visible del precipitado flotante.
El material se mantuvo al vacfo en el tanque de decantacion a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. El vacfo se ventilo entonces lentamente para evitar la interrupcion del precipitado compactado. El licor que contema el plasmido (solucion de lisado neutralizado) se bombeo cuidadosamente desde el tanque a traves de un accesorio sanitario en el fondo. Los niveles de lfquido y precipitado en el tanque se monitorizaron continuamente, y el bombeo se detuvo a tiempo para asegurar que el precipitado no saliera del tanque. Este se sometio a una filtracion de 10 pm de profundidad, seguido por una filtracion final de 0.1 pm. Una parte de la solucion de lisado neutralizado se perdio durante la filtracion, debido a la obstruccion de los filtros. Como resultado, se obtuvieron aproximadamente 69 L de disolucion neutralizada de lisado. La solucion de lisado neutralizado se diluyo entonces con aproximadamente 93 L de agua purificada consiguiendo un volumen total de 162 L y aproximadamente conductividad de 97 mS/cm, en preparacion para su posterior procesamiento con intercambio anionico. Se estimo que la concentracion de plasmido en la solucion de lisado neutralizado filtrada era de aproximadamente 17 pg/mL, correspondiente a aproximadamente 1170 mg de plasmido total.
La solucion de lisado neutralizada, clarificada y diluida, se purifico adicionalmente mediante intercambio anionico. Se equilibro un cartucho Pall Mustang Q de 260 mL de volumen de cama con 4 L de cloruro de sodio 0.67 M (“NaCl”, JT Baker, Phillipsburg, NJ) en 1 x regulador Tris-EDTA ("TE") compuesto de Tris-HCl 10 mM (JT Baker, Phillipsburg, NJ) y EDTA 1 mM (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) a pH 8. El volumen de 162 L de disolucion de lisado neutralizado diluido se bombeo sobre el cartucho Q a un caudal de 1.2 L/min. La absorbancia ultravioleta ("UV") del efluente del cartucho a 260 nm se monitorizo y se registro usando un registrador de grafico de banda. Despues de la carga, el cartucho se lavo con regulador de equilibrio a 1.2 L/min hasta que la A260 del efluente se aproximo a la lmea de base. El plasmido se eluyo despues del cartucho con 1 x regulador TE que contema NaCl 1M (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), se bombeo a 1.2 L/min. La elucion se termino con el A260 devuelto a la lmea de base. El volumen total de eluido era de aproximadamente 4.8 L y contema un total de aproximadamente 915 mg de ADN basado en A260. El rendimiento del intercambio de aniones Q es de aproximadamente 78%. Los contaminantes incluyendo la protema, la mayor parte del ARN, el ADN genomico y la endotoxina se eliminaron en el flujo pasante y se lavaron en este paso.
El eluido Q se purifico adicionalmente mediante interaccion hidrofoba a traves del metodo II de la columna de butilo. Se cargo una columna de K5/15 Amersham (Piscataway, NJ) con 290 mL de volumen de lecho ("BV") de resina de Toyopearl butil 650M (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA). Se mezclo un volumen de 24 L de sulfato de amonio 3M (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) con 4.8 L de Q eluyente antes de cargar. La columna se equilibro con 2 L de sulfato de amonio 2.5 M (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ), se bombeo a 43 mL/min. El eluido Q acondicionado se cargo a la columna de butilo a 43 mL/min, seguido de lavado con 5 L de sulfato de amonio 2.5 M (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) a 43 mL/min y el producto se eluyo con 1.5 L de sulfato de amonio 1.8 M (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ) a 43 mL/min. La columna se separo con agua esteril para inyeccion ("WFI", Baxter Healthcare, Deerfield, IL) para eliminar contaminantes unidos incluyendo ARN y endotoxina, y se regenero para uso repetible. El eluido alcanzo aproximadamente 870 mg de plasmido con un rendimiento del 95%, mientras que el porcentaje superenrollado del plasmido se enriquecio de 66% despues de Q a mas del 80% despues de la etapa de la columna de butilo.
El eluido de HIC de butilo se concentro y se desalinizo por ultrafiltracion/diafiltracion ("UF/DF"), utilizando un soporte de casete Pall Centramate™ provisto de un casete de membrana de pantalla suspendida Pall Omega (Pall Corporation, East Hills, NY), con un area de 1 ft2 y un lfmite nominal de peso molecular de 50 kDa. Se recupero un volumen de 41.2 ml de retenido en bloque, con una concentracion de ADN de 9.026 mg/ml (por A260). El primer lavado de WFI para el equipo UF/DF produjo 46.9 mL con una concentracion de 1.6 mg/mL. El segundo lavado de WFI produjo 65.8 mL con una concentracion de 0.268 mg/mL. La recuperacion combinada de ADN despues de la UF fue de aproximadamente 47 6 mg con un rendimiento del 55%. El porcentaje superenrollado final del plasmido logrado fue mas del 87% despues de la UF.
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Las muestras del Ejemplo 1 se sometieron a analisis por electroforesis en gel de agarosa, que se muestra como la figura 2. Tres bandas principales estan presentes en todos los carriles de muestra (carril 2-5), mientras que la banda mas baja es el formato superenrollado del plasmido diana A (6.5 Kb). El carril 1 representa la escalera de plasmido superenrollada (Invitrogen). El carril 2 representa el lisado celular que contiene un producto de plasmido de 6.5 kb, mientras que tambien estaba presente una gran cantidad de ARN en la muestra. El carril 3 representa el producto despues del intercambio de aniones Q, que mostro que el plasmido se concentro con menos aRn. El carril 4 mostro el producto despues de la purificacion con interaccion hidrofoba, y el carril 5 representa el producto final mezclado despues de UF. El ARN contaminante en el lisado se elimino y la pureza del plasmido superenrollado deseado aumento sustancialmente de 60% a >85%.
EJEMPLO2
Se resuspendio una cantidad de celulas de E. coli de 3140 gramos que conteman el plasmido B en regulador de resuspension constituido por Tris-HCl 25 mM (JT Baker, Phillipsburg, NJ) a pH de 8 y Na2EDTA 10 mM, hasta un volumen final de 18.8 L. El plasmido B tiene un tamano de 4.7 kb. Las celulas resuspendidas se mezclaron con la solucion de lisis que constaba de NaOH 0.2 N (JT Baker, Phillipsburg, NJ) y SDS al 1% (JT Baker, Phillipsburg, NJ) a un caudal igual a 300 mL/min mediante un rotor/estator Silverson Modelo L4R, que funcionaba a una velocidad del rotor de 800 rpm. El efluente de lisado del mezclador conservo un tiempo de retencion de 5 minutos en la bobina de retencion antes de entrar en la columna de burbujas para mezclar con la solucion de neutralizacion/precipitacion (NP) precalentada (4-5°C). La solucion de NP que contema acetato de potasio 1 M (JT Baker, Phillipsburg, NJ) y acetato de amonio 3 M (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ) se alimento al mezclador de columna de burbujas a 600 mL/min, simultaneamente, se introdujo desde el rociador inferior a una velocidad de flujo de 3-5 slpm.
El lisado celular neutralizado fue recibido primero por una bolsa de malla tejida de 200-400 pm que cuelga por debajo del orificio de salida de la columna de burbujas. El floculante de celulas grandes se mantuvo en la bolsa, mientras que la solucion de lisado bruto que contema el ADN plasirndico y los restos celulares reducidos se recogio en el tanque de sedimentacion preenfriado (5°C). Simultaneamente, el lisado crudo generado se bombeo a un filtro de cartucho plegado de 48 pm (filtros CPI, Houston, TX) instalado en un recipiente de filtro ECOLINE (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey) a un caudal de 2 L/min. El lisado primario filtrado se recogio en un recipiente con un volumen total de 75 L recuperado. Despues se realizo una segunda filtracion. El lisado primario filtrado se bombeo a un filtro de bolsa multicapa 523 (Knight Corporation, Barrington, IL) instalado en un recipiente de filtro ECOLINE (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey) a un caudal de 2 L/min. La solucion recuperada se recogio en un recipiente con un volumen total de 65 L recuperado. Finalmente, se realizo una filtracion en profundidad con el sistema de filtro de profundidad desechable Millistak Pod (Millipore, Bellerica, MA). El medio filtrante tema una distribucion de tamano de poro de 0.2-2.5 pm. Se utilizo un filtro Pod con el area de membrana de 0.11 m2 para clarificar el lisado secundario filtrado a un caudal de 0.5 L/min. Se consiguio un volumen de lisado clarificado final de 60 L, que demostro una alta claridad de valor NTU inferior a 2. La pureza del plasmido y las formas en las muestras de lisado en cada etapa de filtracion eran indistinguibles.
EJEMPLO 3
Se fermentaron celulas de E. coli que conteman un plasmido C (tamano de plasmido de 3.5 kb) a alta densidad celular y se cosecharon por centrifugacion. Se recupero un peso de celulas humedas de 24.4 kg de celulas de 400-L de volumen de trabajo de fermentacion. Las celulas se resuspendieron con 171 L de regulador de resuspension que consistfa en Tris-HCl 25 mM (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) a un pH de 8 y Na2EDTA 10 mM (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ) durante un penodo de 3 horas. Las celulas resuspendidas se mezclaron con una solucion de lisis fresca mediante un mezclador de alto cizallamiento Silverson a la misma velocidad de flujo de 600 mL/min, y se mantuvieron durante aproximadamente 5 minutos por medio de un bucle de retencion. La solucion de neutralizacion/precipitacion que consta de acetato de potasio 1 M (JT Baker, Phillipsburg, NJ) y acetato de amonio 3 M (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ) se bombearon al mezclador de burbujas a un caudal de 1.2 L/min para mezclar con las celulas lisadas. El aire comprimido alimentado con un caudal de gas de 5-6 slpm sirvio como fuerza de mezcla y transporte del lisado neutralizado a un tanque de recogida. Se utilizo un penodo aproximado de 5 horas para el proceso de lisis. Las celulas neutralizadas que salfan del dispositivo mezclador de burbujas fueron desviadas a un tanque colector y sometidas a continuacion de filtracion continua.
El lisado bruto neutralizado se proceso con tres filtraciones secuenciales durante su generacion y estos procesos de clarificacion se operaron simultaneamente con el proceso de lisis. La filtracion inicial se realizo bombeando los floculantes celulares que conteman lisado bruto en un recipiente de filtro TOPLINE (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey) equipado con un filtro de cartucho plisado de 48 pm (filtros CPI, Houston, TX) a un caudal de 2.4 L/min. La filtracion primaria se empleo para eliminar la mayona de partfculas grandes tales como floculos de celulas, y una membrana plisada ofrece mas area de filtracion, por lo tanto mayor caudal y capacidad de proceso mas grande que una construccion de capa unica o multicapa. Se utilizaron cuatro cartuchos plisados para procesar un volumen de 680 L de lisado bruto que contema lisado bruto, mientras que el lisado primario filtrado recuperado se estimo en 600 L. La solucion que salfa del filtro de carton plisado de 48 pm se bombeo directamente a un recipiente ECOLINE secundario (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey) equipado con un filtro de cartucho multicapa de 1 pm (filtros CPI, Houston, TX) a un caudal de 2.4 L/min. Este paso elimino una mayona de partfculas pequenas que oscilaban entre 1
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pm y 50 pm en el lisado filtrado secundario. El Mustang Q siguiente tiene un tamano de poro equivalente a 0.2 pm y, por lo tanto, se realizo una tercera filtracion en profundidad mediante un filtro con un tamano de poro de base absoluta de 0.2 pm o inferior. El filtro de profundidad del sistema de filtro Millitak + Pod es capaz de lograr un gran volumen de proceso y una alta retencion de partmulas finas. Se utilizo el filtro Millistak C0HC (Millipore, Bellerica, MA) instalado en un soporte de acero inoxidable para reducir la turbidez del lisado a la unidad de turbidez nefelometrica (NTU). Un area de membrana de 1.1 m2 de filtro C0HC proceso un volumen de 400 L de lisado secundario filtrado.
El lisado filtrado que sale del filtro Millistak se recogio en un recipiente. Se bombeo una fraccion de solucion de este recipiente a un conector "Y" a un caudal de 2.2 L/min para mezclar con agua que se bombeo al mismo conector "Y" a un caudal de 0.7 L/min. La mezcla se hizo fluir en un mezclador Kenics en lmea que conduda a otro tanque de retencion. La conductividad de dicho lisado diluido en el tanque de retencion tema un intervalo de 90-95 mS/cm. Se cargo un volumen de 400 L de lisado diluido a un Mustang Q de 10 pulgadas (Pall, East Hills, NY) que tema un volumen de lecho de 260 mL. La capsula Q se saturo antes de 200 L de carga Q. Se recuperaron aproximadamente 3 g de ADN plasirndico en el eluido Q. El porcentaje superenrollado del producto Q estaba entre 80%-90%, y el contenido de ARN en los eluidos Q no era perceptible por analisis de gel.
Las muestras del Ejemplo 3 se sometieron a analisis por electroforesis en gel de agarosa, que se muestra en la Figura 3. La banda de la intensidad mas alta en cada carril representa la forma superenrollada (SC) del plasmido, que esta presente en un porcentaje que oscila entre 80-90%. El carril 1 representa la escalera de plasmido superenrollada (Invitrogen). El carril 2 representa el lisado despues de la filtracion primaria usando un cartucho de 48 pm plisado, y muestra un alto contenido de ARN. El carril 3 representa el filtrado despues de la filtracion secundaria usando un cartucho de pliegue de 1 pm, y tambien muestra un alto contenido de ARN. El carril 4 representa el filtrado despues de una tercera filtracion usando un filtro C0HC Pod, y muestra una proporcion de ARN reducida. El carril 5 representa la fraccion de producto eluido #1 despues de pasar por la etapa de intercambio de aniones Mustang Q, que demostro una alta pureza con ARN limitado. El carril 6 representa la fraccion secundaria del eluido Q, con una pureza similar al eluido #1.
EJEMPLO 4
Se resuspendio un peso de celulas humedas de 25 kg de celulas de E. coli que conteman el plasmido C en 105 L de regulador de resuspension que consistfa en Tris-HCl 25 mM (JT Baker, Phillipsburg, NJ) a pH 8 y Na2EDTA 10 mM, para un penodo total de 3 horas. El plasmido C tiene un tamano de 3.5 kb. Las celulas resuspendidas se bombearon a un mezclador rotor/estator Silverson Modelo L4R a un caudal de 1500 mL/min, simultaneamente, la solucion de lisis consistente en NaOH 0.2 N (JT Baker, Phillipsburg, NJ) y SDS al 1% (JT Baker, Phillipsburg, NJ) se suministro al mismo mezclador a un caudal de 1500 mL/min. La mezcla que contiene celulas lisadas pasa a traves de una bobina de retencion con el diametro interior (ID) de 1 pulgada y longitud de 100 pies. El tiempo aproximado de retencion fue de 5 minutos para que el lisado entrara en el mezclador hasta salir de la bobina de retencion. Las celulas lisadas entraron entonces en la columna de burbujas para estar en contacto con la solucion de neutralizacion/precipitacion (NP) precalentada (4-5°C). La solucion de NP que contema acetato de potasio 1 M (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) y acetato de amonio 3 M (EMD Chemicals, Inc., Bibbstown, NJ) se alimento al mezclador de columna de burbujas a 3000 mL/min. Simultaneamente, se introdujo aire comprimido desde el rociador de fondo a una velocidad de flujo de 6-10 slpm para servir como fuerza de mezcla y facilitar la solucion neutralizada en una tubena de desviacion dirigida a un tanque de lisado bruto.
Despues de recoger el lisado crudo durante un penodo de 20 minutos, la solucion se bombeo desde el fondo del deposito de lisado bruto a un recipiente de filtro TOPLINE (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey) equipado con un filtro de cartucho plisado de 48 pm (CPI Filtros, Houston, TX) a un caudal de 6 L/min. Simultaneamente, se bombeo el filtrado del recipiente de filtro primario a un recipiente de filtro TOPLINE secundario (Eaton Filtration, Iselin, New Jersey) equipado con un filtro de cartucho plisado de 1 pm (filtros CPI, Houston, TX) a un caudal de 6 L/min. La filtracion primaria elimino el 99% de las partmulas de mas de 48 pm, y cinco de 10 pulgadas cartucho filtros clarificado el volumen total de 700 L de lisado bruto. El uso de tres filtros de cartucho de 10 pulgadas de 1 pm permitio completar la filtracion secundaria para eliminar el 99% de las partmulas de mas de 1 pm. El filtrado del recipiente secundario se recogio en un tanque de lisado clarificado con la ayuda de una bomba a un caudal de 5-6 L/min. Se empleo un tercer sistema de filtro de filtro Millitak + C0HC Pod (Millipore, Bellerica, MA) montado en un soporte de vaina a escala piloto de acero inoxidable para conseguir una alta claridad para la subsiguiente purificacion de Mustang Q. La solucion del tanque de lisado clarificado se bombeo al filtro de vaina a una velocidad de flujo de 6 L/min. Un area de membrana de 2.2 m2 de filtro C0HC proceso un volumen de 650 L de lisado secundario filtrado antes de que la presion de entrada alcanzara 10 psi. El filtrado mediante el tercer filtro Pod se recogio en el recipiente de lisado filtrado.
El lisado filtrado se suministro a un conector "Y" y se mezclo con agua a una relacion de 0.3-0.4 V de lisado de agua/V a traves de un mezclador Kenics en lmea antes de cargar a un Mustang Q. El lisado se bombeo a un caudal de 5 L/min, mientras que el agua se alimento a un caudal de 1.75-2 L/min. La mezcla se recogio en el tanque de lisado diluido. La conductividad de dicho lisado diluido en el tanque de retencion tema un intervalo de 90-95 mS/cm. Se cargo un volumen aproximado de 800 L de lisado diluido a un Mustang Q XT5000 (Pall, East Hills, NY) que tema
un volumen de lecho de 5000 mL. Se recuperaron aproximadamente 25 g de ADN plasirndico en el eluido Q. El eluido Q recuperado exhibfa un alto porcentaje de forma superenrollada y niveles limitados de contaminaciones.
EJEMPLO 5
5
La siguiente Tabla I representa catorce preparaciones de plasmido producidas usando el Metodo II con el plasmido A, un plasmido de copia baja, y algunos parametros de pureza detectados en el mismo. Los protocolos para la produccion fueron los que se discutieron en el Ejemplo 3, anterior.
10 anAlisis DE MUESTRAS de plAsmidos
15
El plasmido C tiene un tamano de 3.5 kb (como en el Ejemplo 3 y Ejemplo 4). El plasmido D1-D3 oscila entre 4.4-4.7 kb, con una construccion similar a la de los genes de expresion. El plasmido E1-E2 tiene un tamano de 3.8 kb, con una construccion similar excepto de otros genes de expresion. El plasmido F tiene un tamano de 2.5 kb.
Tabla I
Ensayo
Unidades Plasmido C Lote #1 Plasmido C Lote #2 Plasmido C Lote #3 Plasmido C Lote #4 Plasmido D Lote #1
Concentracion por A260
mq/mL 2.5 2.5 2.4 3.0 4.4
ARN de la celula huesped
% 0.4 0.63 0.31 0.62 < 0.1
Protema de la celula huesped
% < 0.1 < 0.12 < 0.13 < 0.1 < 0.07
ADN de la celula huesped
% 0.0000002 < 0.000002 < 0.000002 < 0.000002 < 0.0000003
Endotoxina
EU/mg 1 3.76 < 1.25 1.383 0.4
ph
7.1 6.87 5.70 6.22 5.2
Osmolalidad
mOsm/ kg H2O 19 19 11 15 15
Ensayo
Unidades Plasmido D1 Lote #1 Plasmido D2 Lote #1 Plasmido D3 Lote #1 Plasmido E1 Lote #1 Plasmido E2 Lote #1
Concentracion por A260
mq/mL 9.2 8.1 8.5 6.0 6.0
ARN de la celula huesped
% < 0.06 < 0.08 < 0.07 < 0.1 1
Protema de la celula huesped
% < 0.03 < 0.04 < 0.04 < 0.1 < 0.1
ADN de la celula huesped
% 0.00000005 0.00000005 < 0.0000005 < 0.0000000001 < 0.0000000001
Endotoxina
EU/mg 1.1 1.2 1.9 < 0.1 < 0.1
ph
6.2 5.8 6.0 6.5 5.5
Osmolalidad
mOsm/ kg H2O 58 32 47 10 32

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento a gran escala para producir muestras de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias a partir de celulas bacterianas, que comprende las etapas de:
    a) producir una solucion de lisado poniendo en contacto una suspension celular de dichas celulas bacterianas que comprende dichos plasmidos de bajo numero de copias con solucion de lisis;
    b) neutralizar dicha solucion de lisado con una solucion neutralizante para producir una dispersion que comprende solucion de lisado neutralizado y residuos y en donde el fluido de dispersion se mantiene durante menos de una hora para separar la solucion de lisado neutralizado;
    c) filtrar la dispersion a traves de al menos un filtro;
    d) realizar la separacion de intercambio ionico sobre dicha solucion de lisado neutralizado para producir un eluido de intercambio ionico; y
    e) realizar la separacion de interaccion hidrofoba sobre dicho eluido de intercambio ionico para producir una solucion de interaccion hidrofoba;
    en el que la etapa a) comprende mezclar dicha suspension de celulas con una solucion de lisis en un mezclador en lmea de alto cizallamiento;
    en el que la etapa b) comprende mezclar dicha solucion de lisado con dicha solucion neutralizante en un mezclador de burbujas; y
    en el que la etapa e) comprende realizar la separacion de interaccion hidrofoba usando una columna de interaccion hidrofoba o una membrana de interaccion hidrofoba para formar una solucion de interaccion hidrofoba;
    en el que el metodo comprende la transicion de una etapa a una etapa subsiguiente de forma sustancialmente continua.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa:
    f) preparar una solucion de plasmidos de bajo numero de copias por ultrafiltracion de dicha solucion de interaccion hidrofoba y que opcionalmente comprende ademas la etapa de:
    g) preparar de una solucion esteril de plasmidos de bajo numero de copias mediante filtracion esteril de dicha solucion de plasmidos de bajo numero de copias.
  3. 3. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la etapa de produccion comprende poner en contacto la suspension de celulas con la solucion de lisis en un mezclador durante una duracion de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 20 minutos o de aproximadamente 4 minutos a aproximadamente 8 minutos o aproximadamente 5 minutos.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho intercambio ionico es una membrana de intercambio anionico.
  5. 5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa e) comprende realizar la separacion de interaccion hidrofoba que comprende cromatograffa de interaccion hidrofoba butflica para producir una solucion de interaccion hidrofoba que es un eluido de solucion de cromatograffa de interaccion hidrofoba butflica.
  6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el metodo comprende ademas pasar la primera solucion de lisado bruto neutralizado a traves de un filtro secundario para producir una solucion de lisado neutra bruta subsiguiente.
  7. 7. Un procedimiento a gran escala para producir muestras de alta pureza de plasmidos de bajo numero de copias de celulas bacterianas, que comprende las etapas de:
    poner en contacto las celulas bacterianas que comprenden dichos plasmidos de bajo numero de copias en una dispersion de celulas con solucion de lisis para formar una solucion de lisado que neutraliza la solucion de lisado mezclando una solucion de neutralizacion en la solucion de lisado con un mezclador de columna de burbujas para formar una mezcla neutralizada y en la que el fluido de dispersion se mantiene durante menos de una hora para separar la solucion de lisado neutralizado;
    filtrar la mezcla neutralizada a traves de un filtro primario y un filtro secundario para formar una solucion filtrada;
    pasar la solucion filtrada a traves de una columna de intercambio ionico para formar una solucion de intercambio ionico;
    5 pasar la solucion de intercambio ionico a traves de una columna de interaccion hidrofoba o una membrana de interaccion hidrofoba para formar una solucion de interaccion hidrofoba; y
    ultrafiltrar la solucion de interaccion hidrofoba para formar una muestra de alta pureza de plasmidos;
    10 en el que cada transicion de un paso a un paso subsiguiente en el proceso a gran escala desde el paso de contacto hasta el paso de la etapa de solucion filtrada se produce sustancialmente de manera continua.
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