CN114933960A - 一种连续流细菌破碎与澄清装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种连续流细菌破碎与澄清装置，包括：用于盛菌体悬浊液的第一容器、用于盛裂解液的第二容器、用于盛中和液的第三容器以及定时盘管，还包括第一静态混合器、第二静态混合器、至少一个静置容器以及澄清液收集容器；其中，第一静态混合器的进液端口通过三通管与第一容器和第二容器连通，第一静态混合器的出液端口与定时盘管的进液端口连通；第二静态混合器的进液端口通过三通管与定时盘管的出液端口和第三容器连通，第二静态混合器的出液端口通过管道与静置容器顶部的入口连通；静置容器的底部设置有过滤层；过滤层底部通过管路与澄清液收集容器连通。本申请可以克服大体积搅拌耗时长、裂解时间控制不精确与局部不均匀的缺点。

Description

一种连续流细菌破碎与澄清装置

技术领域

本发明涉及分离分析设备技术领域，尤其涉及一种连续流细菌破碎与澄清装置。

背景技术

质粒是一种独立于细胞染色体之外，能携带一定遗传信息，可进行自我复制的核酸大分子。质粒广泛存在于原核与真核生物细胞中，是一类重要的基因载体。除了在酵母发现过RNA质粒，其他质粒都是环状、双链DNA大分子，分子量在10⁶-10⁷。质粒是大肠杆菌中外源基因的载体，可以直接作为基因治疗的药物，是基因治疗、细胞治疗产品不可缺少的中间品。无论是构建基因工程重组菌株，开发基因治疗药物，开发核酸疫苗，还是建立个性化的细胞治疗药物都需要首先制备DNA质粒。

采用重组的大肠杆菌发酵生产DNA质粒，是质粒生产的主要手段。大肠杆菌的构建、菌体发酵与质粒表达属于上游生产工艺，细胞裂解与质粒纯化属于下游生产工艺。上游菌种构建技术与发酵工艺的进步，已经将质粒的产能提升至每升发酵液几百到几千毫克的水平。下游纯化方案中，第二步均为菌体裂解，后续还需要多步层析单元进一步去除RNA、宿主蛋白和内毒素等杂质。菌体裂解可以选择机械裂解，如使用高压匀浆的方法；也可以采用化学试剂裂解，如采用NaOH和SDS碱裂解。

使用NaOH和SDS碱裂解法从大肠杆菌中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于碱性环境中，在与阴离子表面活性剂协同作用下，大肠杆菌的细胞壁会破裂，将质粒DNA释放到水溶液中。菌体裂解操作，既要使细菌产出的质粒充分释放，避免裂解操作破坏产出的质粒，还要控制避免细菌内毒素大量释放到收集液中。由于质粒分子耐受一定浓度的NaOH，而蛋白分子往往不耐受NaOH，因此机械裂解被广泛应用于重组蛋白的生产工艺，碱裂解被广泛应用在质粒生产工艺中。

碱裂解法被普遍应用于质粒生产工艺，在实际应用中面临很多挑战。例如：NaOH浓度与裂解时间是决定裂解是否充分的关键参数，裂解不够充分会降低质粒的回收率，裂解过于充分会破坏质粒分子，造成料液粘稠难以过滤，还会将细菌细胞壁大量裂解为可溶内毒素，增加后续纯化的压力。因此需要对裂解参数进行精确控制，并需要将释放出的质粒与菌体碎片及时分离。

在实验室小规模质粒提取中，可以精准控制NaOH浓度和裂解时间，裂解时间结束后可以采用离心分离及时去除菌体碎片。但当发酵工艺放大时，精确的参数控制与及时的固液分离将面临更大的挑战：

1.对大体积、高粘度发酵液难以与NaOH溶液混合均匀，裂解结束后破碎菌液会更加粘稠，使得搅拌混合更加困难，需要较长时间、较大功率的搅拌；

2.菌液、裂解溶液(NaOH)与中和溶液(醋酸)的混匀困难使得大体积裂解的时间难以精确控制，裂解时间需要精确控制到分钟级别，控制不精确会造成局部裂解不足或过于充分，严重影响质粒回收率；

3.如果充分搅拌裂解，裂解时间过长，一方面会降解生产的质粒，造成产率降低，另一方面会将细菌细胞壁降解为大量可溶性内毒素，给后续纯化造成巨大压力；

4.菌体裂解后，产生大量细菌碎片，释放大量核酸与宿主蛋白，使菌液粘度增加，如采用离心澄清技术，需要大量人工操作，不利于工业化生产，也无法实现对裂解时间的精确控制；

5.如采用过滤澄清，会严重阻塞滤膜，过滤效率低，而且需要耗费大量滤膜；采用深层过滤技术，或添加助滤剂(如硅藻土)，也会被粘稠料液迅速阻塞；

6.如果采用静置分层澄清技术，需要耗费一定的静置时间，200L发酵破碎液的静置需要1小时以上，静置过程也会产生大量细菌内毒素。

综上所述，当前大规模裂解技术，很难平衡质粒回收率、内毒释放量和生产效率，无法做到小规模实验的效率与提取质量，是质粒纯化工艺中损失最大的步骤，200L的发酵规模，菌体破碎与澄清通常会50％以上的质粒损失。

发明内容

本发明的目的在于提供一种连续流细菌破碎与澄清装置，可以实现对裂解时间、澄清时间的精确控制，可线性放大生产规模，在放大过程中生产效率与产品质量保持稳定，利于实现全自动化操作。

为了达到上述目的，本发明提供了一种连续流细菌破碎与澄清装置，包括：用于盛菌体悬浊液的第一容器、用于盛裂解液的第二容器、用于盛中和液的第三容器以及定时盘管，还包括第一静态混合器、第二静态混合器、至少一个静置容器以及澄清液收集容器；其中，

所述第一静态混合器的进液端口通过三通管与所述第一容器和第二容器连通，所述第一静态混合器的出液端口与所述定时盘管的进液端口连通；

所述第二静态混合器的进液端口通过三通管与所述定时盘管的出液端口和第三容器连通，所述第二静态混合器的出液端口通过管道与所述静置容器顶部的入口连通；

所述静置容器的底部设置有过滤层；所述过滤层底部通过管路与所述澄清液收集容器连通。

可选的，所述第一静态混合器包括第一不锈钢管和沿轴向延伸设置在所述第一不锈钢管内的第一搅拌桨叶；

所述第一搅拌桨叶包括多片沿轴向依次交错布置的第一桨叶单元，所述第一桨叶单元为由第一矩形片两端绕轴线相对扭转180°后形成的剪切叶片；

所述第一矩形片的宽度尺寸与所述第一不锈钢管的直径尺寸相等。

可选的，相邻两片所述第一桨叶单元之间的错位角度为90°。

可选的，所述第一搅拌桨叶包括至少四片所述第一桨叶单元。

可选的，所述第二静态混合器包括第二不锈钢管和沿轴向延伸设置在所述第二不锈钢管内的第二搅拌桨叶；

所述第二搅拌桨叶包括多片沿轴向依次交错布置的第二桨叶单元，所述第二桨叶单元为由第二矩形片两端绕轴线相对扭转180°后形成的剪切叶片；

所述第二矩形片的宽度尺寸与所述第二不锈钢管的直径尺寸相等。

可选的，相邻两片所述第二桨叶单元之间的错位角度为90°。

可选的，所述第二搅拌桨叶包括至少六片所述第二桨叶单元。

可选的，所述静置容器设置有多个，所述静置容器为高径比大于等于2:1的罐体；

所述静置容器7存放环境温度为2-8℃。

可选的，所述过滤层的填充高度不小于5cm；

所述过滤层包括烧结板和填充在所述烧结板上的过滤填料。

可选的，所述过滤填料为吸附树脂、惰性玻璃珠或不锈钢珠。

有益效果：

(1)本申请的连续流细菌破碎与澄清装置通过第一静态混合器对大体积、高粘度发酵液与裂解液进行混合，通过第二静态混合器对裂解液与中和液进行混合，可以克服大体积搅拌耗时长、功率消耗大、裂解时间控制不精确、局部不均匀、回收率与内毒释放量难以平衡的缺点；

(2)本申请的连续流细菌破碎与澄清装置可以通过控制混合液的泵送流速与定时盘管的长度，实现对裂解起始与终止时间的精确控制，可以精确控制裂解力度，既可以保证质粒释放率，又可以避免过渡裂解破坏质粒、产生大量内毒素；

(3)可以同时设置多个静置容器，逐步开展静置澄清，有效缩短了单位体积菌液的静置时间，避免了细菌内毒素释放，取代了传统离心工艺，有利于实现全工艺自动化；

(4)采用树脂填充床进行深层过滤，可以在较低压力下去除破碎菌体，减小了滤膜面积；

(5)采用树脂填充床进行深层过滤，可以通过后续洗涤再生填充树脂，相比其他一次性的助滤剂，能有效节省操作成本。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种连续流细菌破碎与澄清装置的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的第一静态混合器的结构示意图；

图3为本发明实施例提供的第一搅拌桨叶的结构示意图；

图4为本发明实施例提供的第二静态混合器的结构示意图；

图5为本发明实施例提供的第二搅拌桨叶的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合示意图对本发明的具体实施方式进行更详细的描述。根据下列描述，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

如图1所示，本发明实施例提供的一种连续流细菌破碎与澄清装置，包括：用于盛菌体悬浊液的第一容器1、用于盛裂解液的第二容器2、用于盛中和液的第三容器3以及定时盘管4，还包括第一静态混合器5、第二静态混合器6、至少一个静置容器7以及澄清液收集容器8。其中，所述第一静态混合器5的进液端口通过三通管与所述第一容器1和第二容器2连通，所述第一静态混合器5的出液端口与所述定时盘管4的进液端口连通。所述第二静态混合器6的进液端口通过三通管与所述定时盘管4的出液端口和第三容器3连通，所述第二静态混合器6的出液端口通过管道与所述静置容器7顶部的入口连通。所述静置容器7的底部设置有过滤层9，所述过滤层9底部通过管路与所述澄清液收集容器8连通。

具体的，本实施例中可以使用三台蠕动泵，分别泵送菌体悬浊液、裂解液和中和液。菌体悬浊液和裂解液通过Y型三通管汇合成一路溶液，再通过第一静态混合器5进行在线混合，获得混合液。

混合液经过第一静态混合器5后，再进入定时盘管4，通过定时盘管4端口的限流阀控制混合液的泵送流速与定时盘管4的长度，实现对裂解时间的精确控制，获得裂解液。

裂解液与中和液混合，经过第二静态混合器6后迅速实现均匀混合。中和后的裂解液逐次注入静置容器7中，每个静置容器7可容纳设定时长流出的中和后的裂解液，例如每个静置容器7可容纳15分钟流出的中和后的裂解液。静置容器7存放于2-8℃低温环境中，以减少质粒在碱性环境中被降解。

静置容器7注满中和后的裂解液后加入助滤剂，静置10-20分钟。静置结束后，经过静置容器7底部的过滤层9进行深层过滤，将过滤后得到的澄清液收集到澄清液收集容器8中。

本实施例中，第一容器1、第二容器2、第三容器3、静置容器7以及澄清液收集容器8均可以采用罐子。定时盘管4为螺旋布置的不锈钢管道。菌体悬浊液为大肠杆菌发酵后通过发酵培养基置换获得，溶液环境：25mM Tris-HCl缓冲+10mM EDTA，pH 8.0。裂解液的主要溶质成分为碱与阴离子表面活性剂，0.2N NaOH+1％SDS。中和液为酸性溶液，3M醋酸钾+2M醋酸+0.2MCaCl₂。

具体的，如图2所示，所述第一静态混合器5包括第一不锈钢管10和沿轴向延伸设置在所述第一不锈钢管10内的第一搅拌桨叶11。如图3所示，所述第一搅拌桨叶11包括多片沿轴向依次交错布置的第一桨叶单元12，所述第一桨叶单元12为由第一矩形片两端绕轴线相对扭转180°后形成的剪切叶片。所述第一矩形片的宽度尺寸与所述第一不锈钢管10的直径尺寸相等，以使剪切叶片两侧边缘能够与第一不锈钢管10的内壁相贴合，使溶液只能沿着第一搅拌桨叶11轴向流动，从而被均匀混合。

为加强混合效果，相邻两片所述第一桨叶单元12之间的错位角度为90°。所述第一搅拌桨叶11包括至少四片所述第一桨叶单元12。

具体的，如图4所示，所述第二静态混合器6包括第二不锈钢管13和沿轴向延伸设置在所述第二不锈钢管13内的第二搅拌桨叶14。如图5所示，所述第二搅拌桨叶14包括多片沿轴向依次交错布置的第二桨叶单元15，所述第二桨叶单元15为由第二矩形片两端绕轴线相对扭转180°后形成的剪切叶片。所述第二矩形片的宽度尺寸与所述第二不锈钢管13的直径尺寸相等，以使剪切叶片两侧边缘能够与第二不锈钢管13的内壁相贴合，使溶液只能沿着第二搅拌桨叶14轴向流动，从而被均匀混合。

为加强混合效果，相邻两片所述第二桨叶单元15之间的错位角度为90°。所述第二搅拌桨叶14包括至少六片所述第二桨叶单元15。

具体的，所述静置容器7为高径比大于等于2:1的罐体，残渣上浮，清液下沉，高瘦的罐分离效果更好。需要说明的是，静置容器7可以设置多个，分成多个小批量澄清，可以缩短单位体积的静置时间。

具体的，所述过滤层9包括烧结板和填充在所述烧结板上的过滤填料。填充高度不小于5cm，起到深层过滤的效果，同时去除裂解液中宿主核酸、蛋白与内毒素。

本实施例中，用于过滤澄清的过滤填料，可以选择惰性材料，如硅藻土、不锈钢珠、玻璃珠，不锈钢珠、玻璃珠的粒径尺寸优选为100-5000微米；也可以选择对宿主蛋白、宿主DNA具有吸附能力的吸附树脂，吸附树脂的粒径尺寸为100-5000微米，吸附树脂优选同时具有分子排阻特征与疏水吸附性的多孔树脂，例如可以选用Bogen MixQ 700系列。

过滤填料在过滤操作后，可以使用洗涤溶液、消毒溶液反冲洗涤，通过在线洗涤，去除节流的细菌碎片，再生填充吸附树脂。

下面，本实施例将分别介绍两种不同体积的大肠杆菌通过本装置发酵裂解澄清的过程。

1、5L大肠杆菌发酵裂解澄清

使用5L发酵罐发酵大肠杆菌制备质粒，发酵结束后，通过错流过滤技术截留回收菌体，透过去除培养基，置换使用的洗滤溶液I为：25mM Trish/HCl,10mM EDTA,50mM葡萄糖，pH 8.0。置换完成后，控制体积为2L，将菌液与裂解液1:1混合，裂解溶液II为：0.2NNaOH，1％SDS。使用蠕动泵分别泵送菌液与裂解液，控制两台蠕动泵速度均为200±20ml/min，两路溶液通过Y型三通管汇合成一路溶液，再通过第一静态混合器，进行在线混合。

混合液经过第一静态混合器后，再通过10m长的定时盘管，与中和溶液III通过Y型三通混合，混合后再通过第二静态混合器。中和溶液III组成为：3M醋酸钾，5N醋酸。控制溶液III的泵送为200±20ml/min。裂解操作在2-8℃层析冷柜中进行。

裂解中和液体，先后注入两根10cm直径的玻璃静置管(由于处理料液量较少，用了一根玻璃管作为静置容器)中。玻璃静置管底部为不锈钢烧结板，下接排液阀门，烧结板上放置200g直径为3mm的玻璃珠。混合液注入后，加入100g(NH₄)HCO₃粉末，搅拌混合均匀。静置15分钟，菌体残渣上浮，开启玻璃静置管底部的排液阀门，收集裂解澄清液。

使用质粒抽提试剂盒计算回收率，该步骤裂解澄清的质粒回收率为60％。

2、20L大肠杆菌发酵裂解澄清

使用30L发酵罐发酵大肠杆菌制备质粒，发酵结束后，通过错流过滤技术截留回收菌体，透过去除培养基，置换使用的洗滤溶液I为：25mM Trish/HCl,10mM EDTA,50mM葡萄糖，pH 8.0。置换完成后，控制体积为25L，将菌液与裂解液1:1混合，裂解溶液II为：0.2NNaOH，1％SDS，在2-8℃冰柜中预冷2小时。使用两台蠕动泵，分别泵送菌液与裂解液，控制两台蠕动泵速度均为800±50ml/min，两路溶液通过Y型三通管汇合成一路溶液，再通过第一静态混合器，进行在线混合。

混合液经过第一静态混合器后，再通过40m长的定时盘管，定时盘管末端与中和溶液III通过Y型三通混合，混合后通过第二静态混合器。中和溶液III组成为：3M醋酸钾，5N醋酸。控制溶液III的泵送为800±50ml/min。

裂解中和液体，依次注入6组25L聚丙烯PP静置罐中。静置罐底部接排液阀门，静置罐底部放置1000g直径为100μm的疏水复合填料。混合液注入后，加入350g(NH₄)HCO₃粉末，搅拌混合均匀。静置15-20分钟，菌体残渣上浮。然后，开启静置罐底排液阀门，收集裂解澄清液。

使用质粒抽提试剂盒计算回收率，该步骤裂解澄清的质粒回收率为68％。

上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种连续流细菌破碎与澄清装置，包括：用于盛菌体悬浊液的第一容器(1)、用于盛裂解液的第二容器(2)、用于盛中和液的第三容器(3)以及定时盘管(4)，其特征在于，还包括第一静态混合器(5)、第二静态混合器(6)、至少一个静置容器(7)以及澄清液收集容器(8)；其中，

所述第一静态混合器(5)的进液端口通过三通管与所述第一容器(1)和第二容器(2)连通，所述第一静态混合器(5)的出液端口与所述定时盘管(4)的进液端口连通；

所述第二静态混合器(6)的进液端口通过三通管与所述定时盘管(4)的出液端口和第三容器(3)连通，所述第二静态混合器(6)的出液端口通过管道与所述静置容器(7)顶部的入口连通；

所述静置容器(7)的底部设置有过滤层(9)；所述过滤层(9)底部通过管路与所述澄清液收集容器(8)连通。

2.根据权利要求1所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：所述第一静态混合器(5)包括第一不锈钢管(10)和沿轴向延伸设置在所述第一不锈钢管(10)内的第一搅拌桨叶(11)；

所述第一搅拌桨叶(11)包括多片沿轴向依次交错布置的第一桨叶单元(12)，所述第一桨叶单元(12)为由第一矩形片两端绕轴线相对扭转180°后形成的剪切叶片；

所述第一矩形片的宽度尺寸与所述第一不锈钢管(10)的直径尺寸相等。

3.根据权利要求2所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：相邻两片所述第一桨叶单元(12)之间的错位角度为90°。

4.根据权利要求2所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：所述第一搅拌桨叶(11)包括至少四片所述第一桨叶单元(12)。

5.根据权利要求1所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：所述第二静态混合器(6)包括第二不锈钢管(13)和沿轴向延伸设置在所述第二不锈钢管(13)内的第二搅拌桨叶(14)；

所述第二搅拌桨叶(14)包括多片沿轴向依次交错布置的第二桨叶单元(15)，所述第二桨叶单元(15)为由第二矩形片两端绕轴线相对扭转180°后形成的剪切叶片；

所述第二矩形片的宽度尺寸与所述第二不锈钢管(13)的直径尺寸相等。

6.根据权利要求5所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：相邻两片所述第二桨叶单元(15)之间的错位角度为90°。

7.根据权利要求5所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：所述第二搅拌桨叶(14)包括至少六片所述第二桨叶单元(15)。

8.根据权利要求1所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：所述静置容器(7)设置有多个，所述静置容器(7)为高径比大于等于2:1的罐体；

所述静置容器(7)存放环境温度为2-8℃。

9.根据权利要求1所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：所述过滤层(9)的填充高度不小于5cm；

所述过滤层(9)包括烧结板和填充在所述烧结板上的过滤填料。

10.根据权利要求9所述的一种连续流细菌破碎与澄清装置，其特征在于：所述过滤填料为吸附树脂、惰性玻璃珠或不锈钢珠。

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