KR20160145676A - 고 세포 밀도의 유입 및 배출 발효 공정 - Google Patents

고 세포 밀도의 유입 및 배출 발효 공정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물반응기 시스템에서 생성물을 제조하기 위한 고 세포 밀도 발효 유입 및 배출 공정에 관한 것인데, 여기서 발효하는 동안, 불순물들을 포함하는 배지는 불순물 여과기 유닛을 통해 제거되는 반면, 새로운 새 배지가 세포 배양 용기에 추가되어, 소모된 영양분 및 배출된 배지를 보충한다.

Description

고 세포 밀도의 유입 및 배출 발효 공정 {A HIGH CELL DENSITY FILL AND DRAW FERMENTATION PROCESS}
발명의 분야
본 발명은 고 세포 밀도의 유입 및 배출 발효 공정에 관한 것이다. 본 발명의 방법들은 고 세포 밀도의 종균 배양을 준비하기에 적합하며 폴리펩티드의 제조, 특히 제약학적 제품을 위한 제약학적 활성 성분의 제조에 사용하기 위한 것이다.
발명의 배경
전통적으로, 예컨대, 단백질 생성을 위한 박테리아, 효모 및 포유동물 세포들은 주로 발효조라고도 불리는 생물반응기에서 현탁 배양으로서 배양된다. 이러한 생물반응기에서 환경 조건들은 세포들에 대한 영양분 공급 및 불순물의 제거를 조작함으로써 간단히 제어될 수 있으며, 교반 수단들은 반응기 내부의 배지를 교반하여 균일하게 분포된 세포들을 제공할 수 있다.
생물반응기는 회분식(batch) 또는 유가식(fed-batch) 공정에서 폐쇄 시스템으로 또는 소위 화학성분조절 연속배양장치(chemostat) 또는 관류 공정(perfusion process)에서 연속 시스템으로 작동될 수 있다.
회분식 작동에서 배지는 통상적으로 필요한 영양분, 예를 들면 글루코오스, 비타민, 아미노산 및 무기질을 보유한 배지를 함유한다. 발효하는 동안, 영양분들은 소모되어, 배지는 점점 영양분이 부족하게 된다. 동시에, 불순물들의 농도는 증가하고, 이는 궁극적으로 세포 성장을 저해하는 결과를 가져온다. 유가식 공정에서 상기 영양분들 중 하나 또는 그 이상이 배양하는 동안 생물 반응기에 공급되어 보다 우수한 성장 조건들 및 보다 높은 세포 밀도를 구현한다. 반복되는 회분식 공정들에서, 수집 후 용기에 남는 세포들은 다음 회분을 위한 접종물질로서 사용될 수 있다.
화학성분조절 연속배양장치와 같은 연속 시스템에서는 새로운 배지가 연속적으로 추가되는 반면, 생성물, 세포들 및 불순물들을 포함하는 배지가 연속으로 제거되어 배지 부피를 일정하게 유지시킨다. 배지가 생물반응기에 추가되는 속도를 변화시킴으로써, 미생물 또는 세포들의 성장률이 제어될 수 있다. 효모 및 박테리아 세포들과 같은 높은 성장률을 가진 세포들에 있어서, 화학성분조절 연속배양장치는 전형적으로 원하는 세포 밀도를 유지시키기 위하여 배지로부터 배양액과 함께 세포들을 제거한다.
관류 공정은 특수한 유형의 연속식 공정인데, 이 공정에서 생물반응기에 새로운 배지를 보유한 현탁 세포 배양이 공급되고 사용된 배지는 연속적으로 수집된다. 균일한 세포 밀도를 유지시키기 위하여 상기 세포들은 수집 흐름으로부터 연속적으로 여과되거나 다른 방식으로 분리되어 생물반응기로 회수된다. 끊임없는 새로운 배지 추가 및 불순물 제거는 세포들에게 최적의 환경을 제공하여 높은 세포 농도 및 그에 따른 보다 높은 생산성을 구현한다. 이는 잠재적으로 높은 세포 밀도로 건강한 배지를 지속시킬 수 있을 뿐만 아니라 생물반응기내 생성물의 체류 시간을 짧게 한다. 이는 생성물의 품질에 보다 바람직하며, 불안정한 폴리펩티드의 제조에 필요하다. 관류 방식의 또다른 이점은 유가식 공정들에 비해 보다 소형의 생물반응기를 사용할 수 있게 된다는 점인데, 이는 보다 작은 작업 부피로 인해 인플레이스 세정(clean-in-place) 작업 감소 및 스테인리스 스틸 반응기들 대신 일회용 생물반응기의 사용 가능성과 같은 이점들을 제공한다. 더욱이, 생성물은 배지 (생성물, 세포들 및 불순물들을 보유)를 제거함으로써 또는 소위 블리드(bleed)를 통해 연속적으로 수집될 수 있다.
유입 및 배출 공정은 반복된 회분식 발효와 아주 유사하다. 회분식 발효에서 세포들은 배양 용기에서 성장하고 배지는 가동이 끝날때 수집된다. 유입 및 배출 공정에서 배양 용기는 임의의 영양분이 다 소모되기 전에 수집된다. 용기로부터 모든 내용물들을 제거하는 대신, 탱크 부피의 일 부분만을 제거한다 (전형적으로 탱크 부피의 30%-80%). 수집 후, 대략 동일한 부피의 새로운 배지가 다시 용기에 추가된다. 그 후 세포들을 용기에서 한번 더 성장시키고 일정한 수시간 또는 일정한 수일 후 추가로 30%-80%의 수집이 이루어진다.
이 공정은 또한 두 단계로 작동될 수 있는데, 첫번째 단계는 단순한 회분식 공정과 동일하다. 첫번째 수집 후, 배양 용기는 다시 단순한 회분식 공정으로 작동되나; 회분 길이는 첫번째 회분보다 짧은데, 이는 보다 높은 초기 세포 밀도 때문이다. 이러한 짧은 반복된 회분 단계들이 제한없이 지속될 수 있다. 배양 용기는 광범위한 순환 시간 및 광범위한 유입 및 배출 부피 내에서 작동될 수 있다. EP2451963은 비타민 k-의존성 단백질들을 생성하기 위한 유입 및 배출 공정들을 설명한다. 그러나 EP2451963은 불순물 여과기 유닛 또는 전문화된 생성물 수집 모듈을 구비한 특수한 생물반응기를 사용하는 유입 및 배출 공정들을 개시하지 않는다.
본 발명은 대규모 생물반응기 시스템들에서 유입 및 배출 세포 배양 공정들의 개선된 그리고 보다 효율적인 이용 및 취급에 대한 수요를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명이 해결할 과제는 세포 밀도를 개선하고 그에 따라 생물반응기의 생산성 및 수집된 배지에서의 생성물의 농도를 증가시키기 위한 고 세포 밀도의 유입 및 배출 발효 공정을 제공하는 것이며, 이 때 생성물 (예컨대, 종균 배양 또는 폴리펩티드)의 생산성은 예컨대, 최적화된 세포 성장 조건들로 인해 개선될 수 있다.
상기 해법은, 생물반응기에 불순물 여과기 유닛을 보유하게 함으로써, 불순물 여과기 유닛이 생성물의 분자량 (MW) 미만의 MW를 가진 불순물들을 세포 배양 용기로부터 제거될 수 있게 하는 동시에, 생성물은 세포 배양 용기 내부에서 보유되게 하며, 새로운 배지가 세포 배양 용기 유입구를 통해 추가되어 불순물 여과기 유닛을 통해 제거된 배지를 대체하거나 부분적으로 대체하고, 세포 배양 용기 내에서 세포들을 고 세포 밀도로 배양시킨 후, 배출 및 유입 발효 공정을 반복수행하게 함으로써, 발효 공정 동안 생물반응기에서 증가된 세포 밀도를 얻을 수 있고, 특히 수집된 배지에서 보다 현저히 높은 농도의 관심 생성물을 얻을 수 있으며 그에 따라 불순물 여과기 유닛을 보유하지 않은 생물반응기에서의 유사한 발효 공정들에 관한 생산 경제에 비해 우수한 생산 경제를 얻을 수 있음을 본 발명의 발명자가 발견한 것에 기초한다.
본 발명의 한 양상은 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물로부터 선택된 생성물의 제조 방법에 관한 것으로, 여기서 생물반응기 시스템은 다음을 포함하고:
적합한 배지내 세포들을 포함하는 세포 배양 용기 (1);
상기 세포 배양 용기 (1)에 배지를 제공하기 위한 세포 배양 용기 유입구 (2);
생성물의 분자량(MW) 미만의 MW를 가진 불순물들을, 상기 세포 배양 용기 (1)로부터 제거시키는 동시에 세포 배양 용기 (1) 내부에 생성물을 보유하게 하는 불순물 여과기 유닛 (3), 여기서 불순물 여과기 유닛 (3)은 세포 배양 용기 (1) 내부의 배지와 유체 연결 상태에 있으며; 및
상기 생성물 및 불순물들을 포함하는 배지를 세포 배양 용기 (1)로부터 제거시키는 수집 배출구 (4);
상기 방법은 다음 단계들을 포함한다:
(a) 세포 배양 용기 (1) 내에서 생체고분자를 발현시키는 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나 생체고분자가 특정 농도에 도달하거나, 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 미생물이 특정 미생물 농도에 도달할 때까지 충분한 시간 동안 적합한 조건들하의 적합한 배지에서, 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 발효시키는 단계, 여기서 발효시키는 동안, 불순물을 포함하는 배지는 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거되고, 새로운 제 1 배지가 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 추가되어 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거된 배지를 대체 또는 부분적으로 대체하고;
(b) 세포 배양 용기 (1)로부터 생성물 및 불순물들을 포함하는 특정 부피의 배지를 수집 배출구 (4)를 통해 제거하는 단계, 및
(c) 새로운 제 2 배지를 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 세포 배양 용기 (1)에 추가하여 상기 단계 (b)에서 수집 배출구 (4)를 통해 제거된 배지를 대체 또는 부분적으로 대체하는 단계; 및
(d) 선택적으로, 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 불순물을 포함하는 배지를 제거하고, 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 제 3 배지를 추가하여 단계 (b) 동안, 단계 (c) 동안, 또는 단계 (b) 및 단계 (c) 모두 동안 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거된 배지를 대체 또는 부분적으로 대체하는 단계;
(e) 선택적으로, 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계,
(f) 선택적으로 단계 (d)를 반복하는 단계, 및
(g) 선택적으로, 세포에 의해 발현된 생체고분자, 세포 또는 미생물로부터 선택된 생성물 및 불순물을 포함하는 특정 부피의 배지로부터 생성물을 정제하는 단계.
본 발명의 또다른 목적은 발명의 설명, 도면 및 청구범위를 참고하면 명확해질 것이다.
도면의 설명
도 1은 본 발명의 생물반응기 시스템에서 생성물을 제조하는 방법에 관한 도식적 설명이다. 도 1a에서는 팽창 방식의 세포 배양 용기가 도시되어 있다. 도 1b에서, 생성물 및 불순물을 포함하는 배지가 제거되었다. 도 1c에서, 새로운 새 배지를 세포 배양 용기에 추가하여, 소모된 영양분 및 제거된 배지를 대체하였다.
정의:
발명의 상세한 구체예들에 관하여 논하기에 앞서, 본 발명의 주요 양상들 및 구체예들에 관련된 구체적인 용어들의 정의를 제공한다. 모든 용어들은 해당 용어들에 대한 숙련된 기술자가 통상적으로 이해하는 바에 따라 정의된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "생체고분자" 는 폴리펩티드, 단백질 또는 바이러스 입자를 의미하며, 이는 토종이거나 생물학적으로 또는 합성적으로 변형될 수 있으며, 분절들, 다합체, 응집체, 접합체, 융합 생성물 등을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "세포"는 원핵 및 진핵 세포들 모두를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "미생물"은 모든 원핵생물, 즉 박테리아 및 고세균류; 및, 원생동물, 곰팡이류, 해조류, 미소식물 (녹색 해조류)을 포함한 다양한 형태의 진핵생물, 및 동물들, 가령, 담륜충 플라나리아 및 바이러스도 포함하고자 한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "생물반응기(bioreactor)"는 생물학적으로 활성인 환경을 지원하는 임의의 장치 또는 시스템을 의미한다. 한 경우에서 (그러나 이에 제한되는 것은 아님), 생물반응기는 유기체 또는 이러한 유기체들로부터 유래된 화학적 활성 물질들에 관련된 화학적 공정이 실시되는 용기이다. 이 공정은 산소성 또는 무산소성 일 수 있다. 생물반응기는 통상적으로 수 리터 내지 평방 미터 크기 범위의 원통형이며, 종종 스테인리스로 제조되지만, 일회용 재료들과 같은 다른 재료들로도 제조될 수 있다.
생물반응기는 또한 세포 배양에 관한 내용에서 세포들 또는 조직들을 성장시키기 위한 장치 또는 시스템을 의미할 수도 있다. 작업 방식에 근거하여, 생물반응기는 회분식, 유가식 또는 연속식 (예컨대, 연속 교반-탱크 반응기 모델)으로 분류될 수 있다. 생물반응기의 한 예는 관류 시스템이다. 생물반응기에는 상기 세포들에 새로운 또는 농축된 배지를 공급하기 위한 하나 이상의 유입구들, 및 생성물을 수집하거나 생물반응기를 비우기 위한 하나 이상의 배출구가 장착될 수 있다. 추가적으로, 생물반응기에는 분리 장치가 생물반응기에 부착될 수 있도록 하는 방식으로 구성된 최소한 하나의 배출구가 장착될 수 있다. 전형적으로 기체 (즉, 대기, 산소, 질소, 이산화탄소) 유속, 온도, pH 및 용해 산소 수준, 및 교반 속도/순환 속도과 같은 생물반응기들의 환경 조건들을 면밀히 모니터하고 제어할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "불순물"은 생물반응기에 존재하는 세포들 또는 미생물들에 의해 생성된 바람직하지 않은 화학적 또는 생물학적 화합물들, 또는 발효 공정 동안 사멸하거나 부수어진 세포들 또는 미생물들로부터 생긴 화합물들을 의미한다. 불순물들은 생체고분자의 배지 성분들 또는 파쇄 생성물들 뿐만 아니라, 예컨대, 에틸 알콜, 부틸 알콜, 젖산, 아세톤 에탄올, 기체상 화합물, 펩티드, 지질, 암모니아, 방향족 화합물, 및 DNA 및 RNA 분절들을 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "유입구(inlet)"는 세포 배양 용기, 컨테이너, 탱크 또는 유닛 내부로 유체, 가령, 배지, 완충액, 또는 물의 유입을 가능하게 하는 임의의 수단들을 포함하고자 하며, 이는 전형적으로 예를 들어 튜브 또는 밸브가 연결될 수 있는 부속품(fitting)에 장착되는 개구이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "배출구(outlet)"는 유체, 가령, 배지, 완충액, 또는 물이 세포 배양 용기, 컨테이너, 탱크 또는 유닛을 나가게 할 수 있는 임의의 수단들을 포함하고자 하며, 이는 전형적으로 예를 들어 튜브 또는 밸브가 연결될 수 있는 부속품(fitting)에 장착되는 개구이다.
본 출원에서 사용되는 용어 "유체(fluid)"는 유동하는 임의의 물질을 정의하고자 하며 그러므로 유동할 수 있는 액체 및 기체들을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 용어 "유체 연결 상태에 있는"은 유체, 가령, 액체, 예컨대 배지 또는 완충액이 컨테이너, 탱크 또는 유닛 (예컨대 불순물 여과기 유닛)과 또다른 컨테이너, 탱크, 용기 또는 유닛 (예컨대 세포 배양 용기) 사이를 유동할 수 있는 것을 의미한다. 상기 유체 연결상태는 하나 이상의 밸브들 및/또는 홀딩 컨테이너(holding container)에 의해 방해받을 수 있으므로, 유체 연결상태를 통한 유체의 유동은 결정에 따라 언제든 언제나 시작 및 중단될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "배지(medium)"는 세포 배지를 의미한다. 수많은 세포 배지는 공지이며 상업적으로 구매가능하다. 이러한 배지는 전형적으로 특정 유형의 세포들의 배양에 적합한 조성을 가지며 염, 아미노산, 비타민, 지질, 세척제, 완충액, 성장 인자, 호르몬, 시토카인, 미량 원소 및 탄수화물을 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "발효(fermentation)", "세포들을 발효시키는 것", 및 "배양"은 광범위하게는 성장 배지내 또는 성장 배지 상에서 세포들 및 미생물들의 대량 성장을 의미한다. 본 출원에서 사용되는, 발효, 세포들을 발효시키는 것 및 배양은 호환적으로 사용될 수 있으며, 제어된 조건들하에서, 일반적으로 세포들의 자연적인 환경을 벗어나 세포들이 성장되는 과정이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 발명자는 생성물 크기 미만의 크기를 가진 불순물들, 및 배지를 세포 배양 용기로부터 제거되게 하는 동시에, 새로운 배지를 세포 배양 용기에 추가시켜 유입 및 배출 발효 공정 동안 불순물 여과기 유닛을 통해 제거된 배지를 대체시키는 불순물 여과기 유닛이 장착된 생물반응기 시스템을 사용함으로써, 수집된 배지에서 보다 현저히 높은 농도의 관심생성물 뿐만 아니라 소모된 배지 1리터 당 생산성의 증가를 얻을 수 있음을 발견하였다. 이 공정은 또한 본 출원에서 고-밀도의 유입 및 배출 발효 공정으로도 명명될 수 있다.
생성물
본 출원에서 사용되는 생성물은 세포에 의해 발현된 생체고분자, 세포 및 미생물을 의미한다.
생체고분자는 폴리펩티드, 단백질 또는 바이러스 입자를 의미하며, 이것은 분절들, 다합체, 응집체, 접합체, 융합 생성물 등을 비롯하여, 토종일 수 있거나 생물학적으로 또는 합성적으로 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 생체고분자는 재조합 단백질과 같은 폴리펩티드이다. 본 출원에서 사용되는, 단백질 또는 폴리펩티드는 호환적으로 사용될 수 있으며 약 30개 보다 많은 아미노산 잔기들의 아미노산 사슬을 의미한다. 단백질들은 둘 이상의 응집된 폴리펩티드 사슬들, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 또는 펩티드의 분절들을 포함하는 단량체 또는 다합체로서 존재할 수 있다.
본 발명의 방법들을 사용하여 생성될 수 있는 관심 폴리펩티드들의 예에는 재조합 치료 단백질, 가령, 항체 또는 이의 분절들, 혈액 응고 인자들, 시토카인, 효소, 펩티드 호르몬 등이 포함된다. 이러한 단백질들의 구체적인 예들에는 인간 성장 호르몬, 난포-자극 호르몬, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 에리트로포이에틴 (EPO), 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 알파-갈락토시다제 A, α-L-이두로니다제 (rhIDU; 라로니다제), N-아세틸갈락토사민-4-설파타제 (rhASB; 갈설파제), DNAse, 조직 플라스미노겐 활성제 (TPA), 글루코세레브로시다제, 인터페론 (IF), 가령, 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ, 인슐린, 인슐린 유도체, 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1), 테넥테플라제, 항혈우병 인자, 인간 혈액응고 인자, 및 에타네르셉트; 및 항체, 가령, 트라스투주맙, 인플릭시맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 다클리주맙, 아달리무맙, 압식시맙, 아푸투주맙, 알렘투주맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노주맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 골리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 메폴리주맙, 모타비주맙, 나탈리주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 펨투무맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 테피바주맙 및 자놀리무맙이 포함된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 생체고분자는 재조합 단백질, 가령, 성장 인간 성장 호르몬, 난포-자극 호르몬, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX 에리트로포이에틴 (EPO), 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 인터페론 (IF), 인슐린, 인슐린 유도체, 인슐린-유사 성장 인자 1이다.
또한 본 발명의 또다른 구체예에서, 생체고분자는 항체 또는 이의 분절이고, 여기서 분절은 예컨대 Fab 분절, Fv 분절 또는 단일쇄 Fv (scFv) 분절, 혈액 응고 인자, 시토카인, 효소 또는 펩티드 호르몬일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 생성물은 혈액-응고 인자, 가령, 혈액-응고 인자 VIIa이다.
폴리펩티드들은 프로모터 서열로 불리는 조절 서열의 제어하에 포유동물 세포들에서 전형적으로 발현된다. 폴리펩티드를 발현시키는 세포들은 항시성 프로모터 (즉 비조절 서열; 이는 관련 유전자의 반복적 전사를 가능하게 함)의 제어하에 또는 유도성 프로모터 (생물적 또는 비생물적 인자들의 존재 또는 부재에 의해 유도되는 조절 서열)의 제어하에 있을 수 있다. 항시성 프로모터의 한 예는 중국 햄스터 EF-1α 프로모터이다. 한 구체예에서, 생체고분자는 중국 햄스터 EF-1α 조절 서열의 제어하에 발현된다.
본 발명의 생물반응기 배열 및 방법을 사용함으로써, 고 생산성으로 폴리펩티드를 발현시키는 것이 가능하다. 그러므로, 한 구체예에서, 세포들은 폴리펩티드, 예컨대 항체를 발현시키며, 최소한 1 그램/L/일, 그리고 바람직하게는 보다 높은, 가령, 2 또는 3 그램/L/일 또는 그 이상의 생산성을 가진다.
본 발명의 시스템 및 본 발명의 방법을 이용하여 생성된 관심대상의 분리된 생성물 (예컨대 폴리펩티드)은 주어진 생성물에 관하여 해당 기술분야에 공지된 방법들에 의해 정제되고, 관심대상의 최종 시판 관련 조성물 (예컨대 제약학적 조성물)로 제제화되어, 적합한 용기내 포장될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 생성물은 또한 세포일 수 있다. 세포는 모든 공지된 살아있는 유기체들의 기본적인 구조적 및 기능적 단위이다. 두가지 유형의 세포들이 존재한다: 진핵 및 원핵. 원핵 세포들은 대개 독립적인 반면, 진핵 세포들은 단세포 유기체로 존재하거나 다세포 유기체들에서 발견될 수 있다. 원핵생물 세포는 핵 및 진핵생물들의 다른 소기관들 대부분이 없으므로 진핵생물 세포보다 더 단순하며 그러므로 더 작다. 두가지 종류의 원핵생물이 존재한다: 박테리아 및 고세균류; 이들은 유사한 구조를 공유한다. 식물류, 동물류, 곰팡이류, 점균류, 원생동물, 및 해조류들은 모두 진핵생물이다. 원핵생물과 진핵생물들 간의 주된 차이점은 진핵 세포들은 특정 대사 활동들이 일어나는 막-결합 구획들을 함유한다는 것이다. 이들 막-결합 구획들 중 가장 중요한 것은 진핵 세포의 DNA를 수용하고 있는 막-결정 구획(membrane-delineated compartment)인 세포핵이다. .
한 구체예에서 생성물은 세포, 가령, 포유동물 세포에서 선택된다.
또다른 구체예에서, 생체고분자를 발현시키는 세포는 대장균, 바실루스, 사카로마이세스, 피키아, 아스페르길루스, 푸사륨, 또는 클루이베로마이세스 속의 효모, CHO (중국 햄스터 난소) 세포들, 하이브리도마, BHK (어린 햄스터 신장) 세포들, 골수종 세포들, HEK-293 세포들, PER.C6® 세포들, 인간 암니오사이트를 비롯한 암니오사이트, 가령, CAP® 및 CAP-T® 세포주, 인간 림프모구 세포들 및 마우스 세포들, 가령, NSO 세포들로 이루어진 군에서 선택된 최소한 하나의 세포이다.
또한 또다른 구체예에서 생체고분자를 발현시키는 세포는 포유동물 세포, 가령, CHO, NSO, PER.C6®, BHK, 또는 HEK에서 선택된다.
본 출원에서 사용되는 미생물은 모든 원핵생물, 즉 박테리아 및 고세균류; 및, 원생동물, 곰팡이류, 해조류, 미소식물 (녹색 해조류)을 포함한 다양한 형태의 진핵생물, 및 동물들, 가령, 담륜충 플라나리아 및 바이러스를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서 미생물은 곰팡이, 효모, 후미콜라, 사카로마이세스, 아스페르길루스, 바실루스, 락토바실루스에서 선택된다.
본 출원에서 사용되는 생성물은 바이러스 일 수 있다. 바이러스는 오직 유기체의 살아있는 세포들 내부에서 복제하는 소형 감염체이다. 바이러스들은 동물류 및 식물류에서부터 박테리아 및 고세균류에 이르기까지 모든 유형의 유기체들을 감염시킬 수 있다. 바이러스 개체군은 세포 분열을 통해 성장하지 않는데, 이들은 무세포(a-cellular)이기 때문이다. 대신, 이들은 그들 자신을 다수 복제하기 위하여 숙주 세포의 세포기구 및 대사를 사용하며, 세포 내부에서 복제한다. 예방접종은 바이러스들에 의한 감염을 예방하는 효과적인 방법일 수 있다. 백신은 약독화 생 바이러스 또는 사멸 바이러스, 또는 바이러스 단백질 (항원)로 이루어질 수 있다. 생백신은 약화된 형태의 바이러스를 함유하며, 이는 질병을 유발하지 않으나, 그럼에도 불구하고, 면역성을 부여한다. 이러한 바이러스들을 약독화되었다고 한다. 아단위 백신을 제조하기 위하여 생명공학 및 유전 공학 기술들이 사용된다. 이들 백신들은 상기 바이러스의 캡시드 단백질만을 사용한다. B형 간염 백신은 이러한 유형의 백신의 한 예이다. 본원 발명의 한 구체예에서, 생성물은 바이러스 또는 바이러스의 일부이다.
생물반응기
본 출원에서 사용되는 생물반응기는 생물학적 활성 환경을 지원하는, 예를 들면 생물학적 생성물을 생성하기 위한 세포들의 배양을 위한 임의의 장치 또는 시스템을 의미한다. 생물반응기는 수 리터 내지 몇 평방 미터 (즉 몇 1000 리터) 크기 범위일 수 있으며, 예컨대 스테인리스 스틸 또는 유리의 배양 용기에 기반한 종래의 생물반응기 또는 일회용 재료, 가령, 일회용 백에 기반한 "일회용(Single-use)" 생물반응기 일 수 있다.
생물반응기는 과거에는 전형적으로 가장 빈번하게는 스테인리스 스틸 탱크에 기반한 종래의 유형을 보유하였으나, 전형적으로 다층 플라스틱 재료로 제조된 일회용 백에 기반한 일회용 생물반응기가 보다 널리 사용되고 있다. 교반을 위해, 일부 일회용 생물반응기는 종래의 생물반응기의 교반기들과 유사하지만 플라스틱 백 안에 교반기가 통합되어 있는 교반기들을 사용하나, 다른 일회용 생물반응기는 흔들림 운동(rocking motion)을 이용하여 교반된다. 교반되는 일회용 생물반응기는 최대 수천 리터, 예컨대 2000 내지 5000 리터에 이르는 부피를 가질 수 있으나, 흔들리는 일회용 생물반응기는 전형적으로 최대 약 1000 리터의 부피를 가진다.
일회용 생물반응기는 종래의 생물반응기에 비하여, 상당한 수반 비용 절감과 함께 세척 및 멸균 필요성 감소를 비롯한 여러 이점들을 가진다. 게다가, 제약학적 생산을 위한 복잡한 적격성 확인 및 검증 절차가 단순화 될 수 있고, 교차 오염의 위험이 감소된다. 또한, 일회용 생물반응기는 종래의 생물반응기에비해 보다 적은 수의 부품들을 포함하기 때문에, 초기 및 유지 비용이 절감된다.
작업 방식에 기반하여, 생물반응기는 회분식, 유가식 또는 연속식으로 분류될 수 있다. 연속식 생물반응기의 예들은 화학성분조절 연속배양장치 및 관류 생물반응기이다. 생물반응기에는 전형적으로 세포들에게 배지를 공급하기 위한 하나 이상의 유입구들, 및 생성물을 수집하거나 생물반응기를 비우기 위한 하나 이상의 배출구가 장착된다. 추가적으로, 생물반응기에는 불순물 여과기 유닛이 생물반응기에 부착될 수 있도록 하는 방식으로 구성된 최소한 하나의 배출구가 장착될 수 있다. 전형적으로, 생물반응기의 환경 조건들, 가령, 기체 (즉, 대기, 산소, 질소, 이산화탄소) 유속, 온도, pH 및 용해 산소 수준, 및 교반 속도/순환 속도를 면밀히 모니터하여 제어할 수 있다.
생물반응기는 선택적으로 또한 비타민 또는 성장 인자와 같은 성분들을 추가하기 위한 별도의 유입구를 포함할 수도 있다. 이러한 경우에, 이러한 성분들은 배지 뿐만 아니라 세포 배양 용기에도 추가될 수 있으며, 농축 또는 희석 형태일 수 있다.
세포 배양 용기
본 출원에서 사용되는 "세포 배양 용기"는 세포들이 적합한 배지에서 적합한 조건하에 성장되는 생물반응기 시스템의 중요 부분을 의미한다. 세포 배양 용기는 상기 설명한 바와 같이, 일회용 용기, 예컨대 일회용 백, 또는 종래의 재사용가능한 용기, 전형적으로 스테인리스 스틸 또는 유리 용기일 수 있다. 스테인리스 스틸 용기는 전형적으로 예정된 외양의 조립품들로 구성되나, 일회용 백은 사용 후 폐기되는 사전-멸균된 플라스틱 배양 챔버를 이용한다. 이는 공간-소모의 값비싼 인플레이스 세정 (CIP) 및 인플레이스 스팀 (SIP) 설비들을 없애주며 생산 회귀 시간을 감소시킨다.
본 발명의 세포 배양 용기는 전형적으로 최소한 50 L, 바람직하게는 최소한 100 L, 더욱 바람직하게는 최소한 250 L, 그리고 또한 더욱 바람직하게는 최소한 500 L의 부피를 가진다. 많은 경우들에서, 이 부피는 또한 더 클 것이며, 예컨대 최소한 1000 L 또는 최소한 2000 L가 될 것이다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 방법은 세포 배양 용기 (1) 내 최소한 50 L, 가령, 최소한 75 L, 가령, 최소한 100 L, 가령, 최소한 200 L, 가령, 최소한 300 L, 가령, 최소한 500 L의 적합한 배지에서 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 발효시키는 단계를 포함한다.
불순물 여과기 유닛
화학적 및 물리적 성질들에 따라 재료를 분리하기 위하여 수많은 전문화된 여과기 및 여과법들이 개발되어 왔다. 공지의 여과기들에는 편평 표면 여과기, 주름형 여과기, 다중-유닛 카세트, 및 관형 형태들, 가령, 중공사가 포함된다. 본 출원에 기재된 발명에 있어서, 멸균성이 확보될 수 있는 한 임의의 초미세여과 기술 시스템이 이용될 수 있다.
본 출원에 기재된 폴리펩티드의 생성 및 불순물의 제거에 사용할 수 있는 여과 시스템들의 예에는 카트리지 시스템, 판틀형(plate and frame)시스템, 및 중공사 시스템과 같은 시스템들이 있다. 상기 시스템들은 막을 통해 액체를 펌핑함에 의해, (예컨대 PallSep™사가 공급하는 것과 같은) 진동에 의해 또는 교번 접선 유동 (ATF)에 의해 작동될 수 있으며, 폴리머 및 세라믹 막 모두 여과 공정에 매우 적합하다. 숙련된 기술자는 적합한 성질을 보유한 막을 선택할 수 있을 것이다.
중공사막들은 널리 다양한 산업들에서 성공적으로 사용되어 왔으며, 높은 막 집적 밀도, 투과액 역압(permeate back-pressure)을 견딜 수 있는 능력을 포함한 몇가지 이점들을 가지므로, 시스템 설계 및 작동에 있어서 유연성을 가질 수 있게 한다. 중공사 카트리지들은 여과하는 동안 내부로부터 외부를 향해 작동할 수 있으며, 이는 공정 유체(농축물)가 중공사의 중심을 통해 유동하게 하고 막 섬유의 외부쪽으로 섬유벽을 통해 침투하여 통과하도록 한다. 접선 유동은 막 오염을 제한하는 것에 도움을 줄 수 있다. 중공사막 시스템에 이용될 수 있는 다른 작동 기술들에는 투과액 및 농축물 역류 유동을 이용한 역세척(back flushing)이 포함된다.
따라서 불순물 여과기 유닛은 생물반응기에 부착된 외부 여과기 모듈에 배치될 수 있다. 대안적으로, 불순물 여과기는 생물반응기 내부에 배치될 수 있다. 여과기 유닛은 또한 여과기의 오염을 방지하기 위한 펌프 또는 시스템, 가령, ATF 시스템 또는 PallSep™ 시스템을 포함할 수도 있는데, 여기서 제어된 수평 진동은 공급 유체를 통해 막 요소를 이동한다. 진동은 막 표면에서 진동 에너지를 생성하고, 이는 막 표면 위의 작은 경계층에 한정되며 유체의 대부분에 적용되지 않는 (종래의 접선 유동 여과 시스템들에서 전형적으로 생성되는 것보다 높은) 전단을 제공한다. 이는 높은 고형 공급 흐름들에서 조차도, 상기 막들이 보유 화학종들로 두꺼워지지 않게 해준다.
한 구체예에서, 불순물 여과기 유닛은 막 여과기, 중력 분리 유닛 및 원심 분리 유닛에서 선택된다.
숙련된 기술자는 불순물들을 불순물 여과기 밖에 관류시키고 생성물 수집 배출구를 통해 관심 폴리펩티드를 수집할 수 있게 함과 관련하여 이에 적합한 막 공칭 분획 분자량 (NMWC) 공경(pore size) 및 불순물을 제거하기에 적합한 여과기 유형을 선택할 수 있을 것이다.
1000 내지 30,000 (1-30 kDa) 범위, 가령, 2000 내지 20,000 (2-20 kDa) 범위 또는 2000 내지 15,000 (2-15 kDa) 범위에 속하는 NMWC를 보유한 불순물 여과기가 종종 선택된다. 그러나 생성물이 세포인 경우 불순물 여과기는 1000 내지 500,000 (1-500 kDa) 범위의 NMWC로 선택될 수 있으나, 통상적으로 불순물 여과기가 20,000 (20 kDa) 미만의 분획(cutoff)을 가지는 것이 바람직하다. 그러므로 한 구체예에서 불순물 여과기 유닛은 최소한 1000, 가령, 2000 내지 15,000 범위 내의 NMWC 공경을 가지는 막 여과기이다.
본 발명의 한 구체예에서 불순물 여과기는 생체고분자의 분자량의 최대 10% 이상, 가령, 20% 이상, 가령, 30% 이상, 가령, 40% 이상, 가령, 50% 이상의 공칭 분획 분자량(NMWC)을 가지는 공경을 가진다.
또다른 구체예에서 불순물 여과기 유닛은 관심 생성물 (예컨대 폴리펩티드)의 분자량(MW)의 최대 80%의 분획 분자량 (NMWC) 공경을 가지는 막 여과기이다. 예를 들어 관심 폴리펩티드의 MW가 100,000 (100 kDa)인 경우, 불순물 여과기의 바람직한 최대 분획은 이 경우 80,000 (80 kDa)이 될 것이다. 더욱 바람직하게는, 불순물 여과기는 관심 폴리펩티드 MW의 최대 50%의 NMWC 공경을 가진다. 그러므로 한 구체예에서, 불순물 여과기는 생체고분자 MW의 최대 80%, 가령, 최대 50%의 분획 분자량 (NMWC) 공경을 가진다.
연장 가동하는 동안, 발효를 종결하지 않고 여과기를 교환하고 시스템을 재멸균하는 것이 가능하다.
수집 배출구
한 구체예에서 수집 배출구는 가장 단순한 형태, 단지 보관 또는 추가 하위 가공을 위하여 불순물 및 배지와 함께 생성물을 수집하기에 적합한 컨테이너 또는 백으로 안내하는 배출구이다. 수집 배출구는 또한 예를 들면, 생체고분자보다 큰 세포들, 세포 조직파편 및 불순물들로부터 생체고분자를 분리할 수 있는 분리 장치와 유체 연결상태에 있을 수도 있다.
생물반응기에 존재하는 세포들이 충분한 세포 밀도에 도달한 경우 또는 수집 배출구를 통과하는 유출에 충분한 생성물이 존재하는 경우, 생성물의 수집이 개시될 수 있다. 이는 예를 들면 분광광도계를 이용하여 세포 밀도를 측정함으로써, 또는 공지의 수단, 예를 들면 폴리펩티드 생성물의 경우 적합한 단백질 분석법을 이용하여 관심 생성물의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
세포 배지
본 출원에서 사용되는 배지는 일반적으로 세포 배지를 의미한다. 수많은 세포 배지는 공지이며 상업적으로 구매가능하다. 이러한 배지는 전형적으로 특정 유형의 세포들의 배양에 적합한 조성을 가지며 염, 아미노산, 비타민, 지질, 세척제, 완충액, 성장 인자, 호르몬, 시토카인, 미량 원소 및 탄수화물을 포함할 수 있다. 염의 예에는 마그네슘 염, 예를 들면 MgCl2 X 6H2O, 및 철 염, 예를 들면 FeSO4 X 7H2O, 칼륨 염, 예를 들면 KH2PO4, KCI, 나트륨 염, 예를 들면 NaH2PO4 또는 Na2HPO4, 및 칼슘 염, 예를 들면 CaCl2 X 2H2O가 포함된다. 아미노산의 예에는 20가지 천연 아미노산, 예를 들면 히스티딘, 글루타민, 트레오닌, 세린, 메티오닌이 있다. 비타민의 예에는 아스코르베이트, 비오틴, 콜린, 미오-이노시톨, D-판토테네이트 및 리보플라빈이 포함된다. 지질의 예에는 지방산, 예를 들면 리놀레산 및 올레산이 포함된다. 세척제의 예에는 Tween® 80 및 Pluronic® F68이 포함된다. 완충액의 예는 HEPES이다. 성장 인자/호르몬/시토카인의 예에는 IGF, 하이드로코르티손 및 (재조합) 인슐린이 포함된다. 미량 원소의 예에는 Zn, Mg 및 Se이 포함된다. 탄수화물의 예에는 글루코오스, 과당, 갈락토오스 및 피루베이트가 포함된다. 배지 내 포함될 수 있는 다른 성분들의 예는 소이 펩톤(soy peptone) 및 에탄올 아민이 있다. 숙련된 기술자는 관심 대상의 특정 발현 세포들 및 폴리펩티드에 관하여 적합한 조건들 뿐만 아니라 적합한 배지 및 배지 보충물도 잘 알고 있을 것이다.
발효하는 동안 실리콘계 항기포제 및 탈포제 또는 비이온성 계면활성제, 가령, 에틸렌 옥사이드/프로필렌 옥사이드 단량체들의 블록 공중합체(coblock polymers)가 배지에 추가될 수 있다.
세포 배지의 pH, 온도, 용해 산소 농도 및 삼투압농도는 특정 세포 유형에 따라 달라질 것이며, 문제되는 세포들의 성장 및 생산성에 최적이 되도록 선택될 것이다. 해당 기술분야의 숙련된 기술자는 주어진 배양에 있어 최적의 조건들, 가령, pH, 온도, 용해 산소 농도 및 삼투압농도를 결정하는 방법을 알고 있을 것이다. 통상적으로, 포유동물 세포들에 있어서 최적 pH는 6.6 내지 7.6 이고, 최적 온도는 30 내지 39℃이며, 최적 삼투압농도는 260 내지 400 mOsm/kg이다. 미생물 시스템들에 있어서 pH는 3 내지 8이고 온도는 20 내지 45℃ 일 수 있다.
서로 다른 배지 성분들의 용해도는 상당히 달라지는데, 많은 성분들은 높은 용해도를 가지며 그에 따라 물에 쉽게 용해될 것인 반면, 다른 성분들, 가령, 특정 비타민, 아미노산, 지질 및 성장 인자는 물에서 낮은 용해도를 가질 것이기 때문이다. 이러한 이유로, 세포 배지는 보통 모든 성분들을 즉시 사용가능한 조성물 (a ready-to-use composition)로서 함께 혼합하여 제조된다.
본 발명의 한 구체예에서 새로운 제 1 배지, 새로운 제 2 배지 및 선택적으로 새로운 제 3 배지는 상이한 농도를 가지는 상이한 성분들로부터 제조된다.
또다른 구체예에서 새로운 제 1 배지, 새로운 제 2 배지 및 선택적으로 새로운 제 3 배지는 동일한 조성의 배지로부터 선택된다.
새로운 제 1 배지, 새로운 제 2 배지 및 선택적으로 새로운 제 3 배지는 통상적으로 불순물 여과기 (3) 또는 생성물 수집 배출구 (4)를 통해 세포 배양 용기로부터 제거되었던 배지와 동일한 온도까지 예열되며 통상적으로 제거 후 즉시 세포 배양 용기에 추가된다.
기재된 발명은 바람직하게는 고 세포 밀도를 이용하여 작동하기 때문에, 유리하게는 새로운 발효를 재시작 (즉 접종)하기 위해 하나의 발효에서 얻은 고 세포 밀도의 세포 배지를 이용할 수 있다. 이 내용에서 높은 생존가능 세포 밀도는 전형적으로 최소한 1000만개 세포들/ml, 바람직하게는 최소한 2000만개 세포들/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 3000만개 세포들/ml, 예컨대 최소한 4000만개 세포들/ml, 가령, 최소한 5000만개 세포들/ml의 밀도이다.
발효 공정
발효 공정의 개시는 통상적으로 고 세포 밀도의 세포 배양물을 세포 배양 용기 내 배지에 추가함(즉 접종함)으로써 발생한다. 발효를 시작하는 동안 생성물 및 불순물의 수준이 낮을 경우 불순물 여과기 유닛을 통해 어떠한 액체도 통과하지 못하도록 불순물 여과기 유닛이 폐쇄될 수 있다. 세포 밀도가 증가하고 그에 따라 불순물 수준 또한 증가할 경우, 불순물 여과기 유닛을 통해 나가는 액체의 관류가 개시될 수 있으며 소모된 영양분 및 배출된 배지를 보충하기 위하여 불순물 여과기 유닛을 통과하는 배지의 비율과 동일한 비율로 세포 배양 용기에 새로운 새 배지가 공급될 수 있다. 그 후 생성물, 세포들 및 불순물들을 보유한 배지가 제거되기에 앞서 세포들이 특정 세포 밀도에 도달할 때까지 세포들을 충분한 시간 동안 성장시킨다.
한 구체예에서 생성물은 세포에 의해 발현된 생체고분자로부터 선택된다. 또다른 구체예에서 생성물은 세포로부터 선택된다. 또다른 구체예에서 생성물은 미생물로부터 선택된다.
본 출원에서 사용되는, 단계 (a)에서 세포들을 발효시키기에 충분한 시간은 세포들의 성장률, 세포 배양 용기의 크기 및 발효를 접종(seeding)하기 위한 세포 배양물의 양에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 한 구체예에서 단계 (a)에서 세포들을 발효시키기에 충분한 시간은 가령 1 내지 3일 동안, 가령 4 내지 5일 동안, 가령 6 내지 7일 동안, 가령 8 내지 9일 동안 또는 그 보다 더 긴 시간이 될 수 있다.
생물반응기에 존재하는 세포들이 충분한 세포 밀도에 도달한 경우 또는 수집 배출구를 통과하는 유출에 충분한 생성물이 존재하는 경우, 생성물의 수집이 개시될 수 있다. 이는 예를 들면 분광광도계를 이용하여 세포 밀도를 측정함으로써, 또는 공지의 수단, 예를 들면 폴리펩티드 생성물의 경우 적합한 단백질 분석법을 이용하여 관심 생성물의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 단계 (a)에서 특정 세포 밀도는 최소한 3000만개 세포들/ml, 바람직하게는 최소한 4000만개 세포들/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 5000만개 세포들/ml, 예컨대 최소한 6000만개 세포들/ml, 가령 최소한 7000만개 세포들/ml, 가령 최소한 8000만개 세포들/ml의 세포 밀도이다.
또다른 구체예에서 단계 (a)에서 특정 생체고분자 수준은 최소한 0.010 g/L, 가령 최소한 0.050 g/L, 가령 최소한 0.10 g/L, 가령 최소한 0.50 g/L, 가령 최소한 1.0 g/L, 가령 최소한 5.0 g/L의 수준이다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 방법은 단계 (a) 동안, 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 불순물을 제거하지 않고 세포 배양 용기 (1)에서 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 생체고분자를 발현시키는 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 생체고분자가 특정 농도에 도달하거나, 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 미생물이 특정 미생물의 밀도에 도달할 때까지 충분한 시간 동안 적합한 조건하의 적합한 배지에서 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 발효시키는 단계를 포함한다.
단계 (a)에서 세포들을 발효시키는 동안 전형적으로 매일 불순물들을 포함하는 배지의 약 0.5-1 반응기 부피가 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 밖으로 관류되며, 이 부피는 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 제 1 배지를 추가함으로써 대체되거나 부분적으로 대체된다. 본 내용에서 용어 "반응기 부피"는 특정 시스템 중 작업중인 세포 배양 용기 부피에 상응하는 것으로 이해될 것이다.
본 출원에서 사용되는, 대체 또는 부분적으로 대체되는 것은 수집 배출구 (4)를 통해 밖으로 통과하는 배지의 부피와 동일한 부피가 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 추가되는 새로운 제 1 배지로 대체되는 것을 의미하거나, 일부 경우에서는 이것이 세포 배양 용기내 생성물의 양, 예컨대 생체고분자의 양, 또는 세포의 세포 밀도 또는 미생물의 밀도를 제어하는 방법일 수 있기 때문에 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 제 2 배지가 추가되어 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 밖으로 통과하는 배지의 부피를 단지 부분적으로 대체하는 것이 유리할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 한 구체예에서 단계 (a)에서 새로운 제 1 배지의 최소한 60%, 가령 최소한 60%, 가령 최소한 70%, 가령 최소한 80%, 가령 최소한 90%가 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 추가되어 불순물 여과기 유닛 (3)을 통하여 제거된 배지를 부분적으로 대체한다.
또다른 구체예에서 새로운 제 1 배지가 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 추가되어 단계 (a)에서 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거된 배지를 대체한다.
또다른 구체예에서 상기 방법은 단계 (a)에서 생체고분자를 발현시키는 세포들이 동일한 조건들하에 불순물 여과기 유닛 (3)이 없는 생물반응기 시스템을 이용하여 얻을 수 있는 세포 밀도보다 더 높은 세포 밀도에 도달하는 것을 포함한다.
또한 또다른 구체예에서 상기 방법은 단계 (a)에서 세포들이 동일한 조건들하에 불순물 여과기 유닛 (3)이 없는 생물반응기 시스템을 이용하여 얻을 수 있는 세포 밀도보다 더 높은 세포 밀도에 도달하는 것을 포함한다.
또다른 구체예에서 상기 방법은 단계 (a)에서 미생물이 동일한 조건들하에 불순물 여과기 유닛 (3)이 없는 생물반응기 시스템을 이용하여 얻을 수 있는 세포 밀도보다 더 높은 세포 밀도에 도달하는 것을 포함한다.
단계 (a)에서 생체고분자를 발현시키는 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나 생체고분자가 특정 농도에 도달하거나, 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 또는 미생물이 미생물의 특정 밀도에 도달할 경우, 생성물 및 불순물들을 포함하는 특정 부피의 배지가 수집 배출구 (4)를 통해 세포 배양 용기 (1)로부터 제거된다.
세포 배양 용기로부터 제거된 생성물 및 불순물을 포함하는 배지의 특정 부피는 개개의 생물반응기 시스템 및 세포주의 특징을 고려하여 숙련된 기술자에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 세포 배양 용기내 배지의 약 30% 내지 약 80% 범위, 예컨대 약 0.3 내지 약 0.8 반응기 부피가 될 것이다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 방법은 단계 (b)에서 생성물 수집 모듈 (4)를 통해 세포 배양 용기(1)로부터 생성물 및 불순물을 포함하는 배지의 최소한 30%, 가령 최소한 40%, 가령 최소한 50%, 가령 최소한 60% 가령 최소한 70% 가령 최소한 80%를 제거하는 단계를 포함한다.
생성물 및 불순물들을 포함하는 특정 부피의 배지가 단계 (b)에서 세포 배양 용기로부터 제거된 후 새로운 제 2 배지가 단계 (c)에서 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 세포 배양 용기 (1)에 추가되어, 단계 (b)에서 수집 배출구 (4)를 통해 제거된 배지를 대체 또는 부분적으로 대체한다.
본 출원에서 사용되는, 대체 또는 부분적으로 대체되는 것은, 수집 배출구 (4)를 통해 밖으로 통과하는 배지의 부피와 동일한 부피가 세포 배양 용기 유입구(2)를 통해 추가되는 새로운 제 2 배지로 대체되는 것을 의미하거나, 일부 경우에서는 이것이 세포 배양 용기내 생성물의 양, 예컨대 생체고분자의 양, 또는 세포의 세포 밀도 또는 미생물의 밀도를 제어하는 방법일 수 있기 때문에 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 제 2 배지를 추가하여 수집 배출구(4)를 통해 밖으로 통과하는 배지의 부피를 단지 부분적으로 대체하는 것이 유리할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 한 구체예에서 단계 (c)에서 새로운 제 2 배지의 최소한 60%, 가령 최소한 60%, 가령 최소한 70% 가령 최소한 80% 가령 최소한 90%가 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 추가되어 단계 (b)에서 수집 배출구(3)을 통해 제거된 배지를 부분적으로 대체한다.
또다른 구체예에서 새로운 제 2 배지는 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 추가되어 단계 (b)에서 수집 배출구(3)을 통해 제거된 배지를 대체한다.
본 발명에 따라 불순물 여과기 유닛 (3)을 통하여 불순물을 제거하지 않고 단계 (b) 및 (c)가 최소한 2 내지 20회 반복될 수 있다.
또다른 구체예에서 상기 방법은 단계 (b) 및 (c)가 최소한 2 내지 30회 반복되는 단계 (e)를 추가로 포함한다.
또한 또다른 구체예에서 상기 방법은 단계 (a)에 앞서, 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 불순물을 제거하지 않고 세포 배양 용기 (1)에서 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 생체고분자를 발현시키는 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 생체고분자가 특정 농도에 도달하거나, 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 미생물이 특정 미생물의 밀도에 도달할 때까지 충분한 시간 동안 적합한 조건하의 적합한 배지에서 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 발효시키는 것을 포함한다.
수집 배출구 (4)를 통해 세포 배양 용기로부터 생성물 및 불순물들을 포함하는 배지를 제거하고 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 배지를 추가하는 순환을 여러 번 거친 후, 세포 배양 용기내에서 불순물들의 수준이 증가하는 비율로 축적되기 시작할 수 있다. 이러한 상황에서 불순물 여과기 유닛을 통해 불순물을 포함하는 배지를 제거하고, 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 제 3 배지를 추가하여, 단계 (b) 동안, 단계 (c) 동안 또는 단계 (b)와 단계 (c) 모두 동안 불순물 여과기 유닛(3)을 통해 제거된 배지를 대체하거나 부분적으로 대체하는 것이 유익할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 방법은 단계 (d)를 추가로 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예에서 상기 방법은 단계 (d)에서 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 제 3 배지가 추가되어 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거된 배지를 대체하는 것을 포함한다.
본 발명의 또다른 구체예에서 단계 (d)에서 새로운 제 3 배지의 최소한 50%, 가령 최소한 60%, 가령 최소한 70% 가령 최소한 80% 가령 최소한 90%가 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 추가되어 단계 (b) 동안, 단계 (c) 동안 또는 단계 (b) 및 단계 (c) 모두 동안 수집 배출구 (3)을 통해 제거된 배지를 부분적으로 대체한다.
또다른 구체예에서 상기 방법은 단계 (d)가 최소한 2 내지 30회 반복되는 단계 (f)를 포함한다.
세포 유형 및 성장 조건들에 따라, 세포들은 1시간 미만 및 최대 수일 이내 배(double)가 될 수 있다. 포유동물 세포주는 약 14 내지 48 시간 마다 배가 될 수 있으나, 생물반응기 내 폴리펩티드들의 고수율 발현에 적합화된 세포주는 전형적으로 약 15 내지 약 36 시간 마다 배가 된다. 세포들이 매 24 시간 마다 배가 될 경우, 생성물 및 불순물을 포함하는 반응기 부피 배지의 절반 (즉, 0.5)은 수집 배출구 (4)를 통해 매일 제거되고 반응기 부피의 0.5는 소모된 영양분 및 배출된 배지를 보충하기 위하여 새로운 새 배지로 대체되어, 그에 따라 생물반응기 시스템에서의 생산성을 일정하게 유지할 수 있다.
배가 시간(doubling time)이 24 시간 보다 빠를 경우, 생성물 및 불순물을 포함하는 보다 많은 반응기 부피 배지가 매일 제거되고 새로운 새 배지로 대체될 수 있다. 배가 시간이 24시간 보다 늦을 경우, 보다 적은 반응기 부피가 매일 제거되어 생물반응기 시스템에서의 생산성을 일정하게 유지시킬 수 있다. 숙련된 기술자는 관심 생성물의 최적 생산에 적합한 세포주를 선택하고 세포 성장을 제어하는 방법을 알고 있다.
해당 분야의 숙련된 기술자들은 세포 배양 용기 내 배지의 온도가 세포들의 생산성에 중요한 인자이며, 약 30-38℃ 범위의 온도가 종종 최적이고, 발효하는 동안 온도를 감소시키는 것이 유리할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 특히 포유동물 세포들, 가령 CHO 세포들에 있어서 이러한 절차들은 널리 공지이며, 전형적으로 원하는 세포 밀도를 얻기 위하여 예컨대 약 37℃의 제 1 온도에서의 초기 발효 단계, 그리고 그 후 폴리펩티드 생성물의 발현을 증가시키고 세포 분열을 감소시키기 위하여 나머지 발효에 있어서는 온도를 예를 들면, 약 32-35℃로 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 방법은 단계 (a)에서 30-38℃ 범위의 온도의 적합한 배지에서 세포 배양 용기(1)에서 세포들을 발효시키는 것을 포함한다.
상기 공정은 해당 분야에 공지된 바와 같이 그리고 본 출원에 설명된 바와 같이, 성장 조건들, 배지 농도, 세포 밀도, pH 등이 원하는 특정 조건들 내에서 유지되도록, 연속적으로 모니터된다.
본 발명에 의해 수득된 생성물은 배지 및 불순물로부터 분리될 수 있다.
생성물이 세포들 또는 미생물들인 경우 이들은 표준 기법들에 따라 여과 원심분리 또는 침강에 의해 분리될 수 있다. 생성물이 생체고분자인 경우, 세포들 및 불순물로부터의 정화 공정 후, 크로마토그래피 시스템을 이용한 추가 정제에 의해 정제될 수 있다. 숙련된 기술자는 본 발명의 생성물을 정제하기에 적합한 기법들을 알고 있다.
한 구체예에서 상기 방법은 세포에 의해 발현된 생체고분자, 세포 또는 미생물에서 선택된 생성물, 및 불순물들을 포함하는 특정 부피의 배지로부터 생성물을 정제하는 단계 (g)를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법은 통상적인 유닛에서 여러 개의 세포 배양 용기들을, 가령 2, 가령 3, 또는 더욱 바람직하게는 4개의 세포 배양 용기들을 연속적으로 작동함에 특히 유용할 수 있으며, 통상의 유닛은 또한 생성물을 정제하기 위한 정제 시설을 포함한다. 이러한 상황에서, 예를 들면, 4개의 세포 배양 용기들은 배양 용기 4가 다른 배양 용기들에 대한 종균 배양을 제조하는 기능을 하도록 작동되는데, 예컨대 배양 용기 4는 팽창 방식으로 작동된다.
이 때 세포 배양 용기 1, 2 및 3은, 세포들이 약 3일의 배가 시간을 가지며 생성물 및 불순물을 포함하는 배지가 1일 째에 세포 배양 용기 1로부터 제거되어 정제 시설로 공급되고 정제를 위해 제거된 배지가 새로운 새 배지로 대체되는 방식으로 작동될 수 있다. 생성물 및 불순물을 포함하는 배지는 2일 째 세포 배양 용기 2로부터 제거되어 정제 시설로 공급되며 정제를 위해 제거된 배지는 새로운 새 배지로 대체된다. 생성물 및 불순물을 포함하는 배지는 3일 째 세포 배양 용기 3으로부터 제거되어 정제 시설로 공급되고 정제를 위해 제거된 배지는 새로운 새 배지로 대체되고, 이 공정은 배양 용기 중 하나의 생산성이 허용할 수 없는 수준으로 감소될 때까지 수많은 주기 동안 반복되며, 이러한 수준에 도달한 후 세포 배양 용기 내 세포들은 새로운 발효를 접종시키기 위하여 사용되고 공정은 지속된다.
본 출원에 언급된 모든 특허 및 비-특허 문헌들은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
상기 설명한 구성들의 모든 가능한 변형들에 속하는 이 구성들의 임의의 조합은 본 출원에서 달리 언급하지 않는 한 또는 달리 명확하게 본 내용에 대조되는 것으로 언급되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "하나" 및 "그것"은 본 출원에서 달리 언급되지 않는 한 또는 내용상 명확히 대조되는 것으로 언급되지 않는 한 단수형 및 복수형 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 생물반응기 시스템에서, 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법, 여기서 생물반응기 시스템은 다음을 포함하며:
    적합한 배지내 세포들을 포함하는 세포 배양 용기 (1);
    상기 세포 배양 용기 (1)에 배지를 제공하기 위한 세포 배양 용기 유입구 (2);
    생성물의 분자량(MW) 미만의 MW를 가진 불순물들을, 상기 세포 배양 용기 (1)로부터 제거시키는 동시에, 세포 배양 용기 (1) 내부에 생성물을 보유하게 하는 불순물 여과기 유닛 (3), 여기서 불순물 여과기 유닛 (3)은 세포 배양 용기 (1) 내부의 배지와 유체 연결 상태에 있으며; 및
    상기 생성물 및 불순물들을 포함하는 배지를 세포 배양 용기 (1)로부터 제거시키는 수집 배출구 (4);
    상기 방법은 다음 단계들을 포함함:
    (a) 생체고분자를 발현시키는 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나 생체고분자가 특정 농도에 도달하거나, 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 미생물이 특정 미생물 농도에 도달할 때까지 충분한 시간 동안 적합한 조건들하의 적합한 배지에서, 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 세포 배양 용기 (1) 내에서 발효시키는 단계, 여기서 발효시키는 동안, 불순물을 포함하는 배지는 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거되고, 새로운 제 1 배지가 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 추가되어 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거된 배지를 대체 또는 부분적으로 대체하고;
    (b) 세포 배양 용기 (1)로부터 생성물 및 불순물들을 포함하는 특정 부피의 배지를 수집 배출구 (4)를 통해 제거하는 단계, 및
    (c) 새로운 제 2 배지를 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 세포 배양 용기 (1)에 추가하여 상기 단계 (b)에서 수집 배출구 (4)를 통해 제거된 배지를 대체 또는 부분적으로 대체하는 단계; 및
    (d) 선택적으로, 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 불순물을 포함하는 배지를 제거하고, 세포 배양 용기 유입구 (2)를 통해 새로운 제 3 배지를 추가하여 단계 (b) 동안, 단계 (c) 동안, 또는 단계 (b) 및 단계 (c) 모두 동안 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 제거된 배지를 대체 또는 부분적으로 대체하는 단계;
    (e) 선택적으로, 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계,
    (f) 선택적으로 단계 (d)를 반복하는 단계, 및
    (g) 선택적으로, 세포에 의해 발현된 생체고분자, 세포 또는 미생물로부터 선택된 생성물 및 불순물을 포함하는 특정 부피의 배지로부터 생성물을 정제하는 단계.
  2. 청구항 1항에 있어서, 단계 (a) 동안 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 불순물을 제거하지 않고, 생체고분자를 발현시키는 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 생체고분자가 특정 농도에 도달하거나, 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 미생물이 특정 미생물의 밀도에 도달할 때까지 충분한 시간 동안 적합한 조건하의 적합한 배지에서, 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 세포 배양 용기 (1)에서 발효시키는 것을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 단계 (a)에 앞서 불순물 여과기 유닛 (3)을 통해 불순물을 제거하지 않고, 생체고분자를 발현시키는 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 생체고분자가 특정 농도에 도달하거나, 세포들이 특정 세포 밀도에 도달하거나, 미생물이 특정 미생물의 밀도에 도달할 때까지 충분한 시간 동안 적합한 조건하의 적합한 배지에서 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 세포 배양 용기 (1)에서 발효시키는 것을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  4. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 새로운 제 1 배지, 새로운 제 2 배지 및 선택적으로 새로운 제 3 배지는 동일한 조성의 배지로부터 선택됨을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  5. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  6. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 최소한 2 내지 30회 반복되는 단계 (e)를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  7. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 최소한 2 내지 30회 반복되는 단계 (f)를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  8. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 세포에 의해 발현된 생체고분자, 세포 또는 미생물에서 선택된 생성물, 및 불순물들을 포함하는 특정 부피의 배지로부터 생성물을 정제하는 단계 (g)를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  9. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 세포 배양 용기 (1) 내 최소한 50 L, 가령, 최소한 75 L, 가령, 최소한 100 L, 가령, 최소한 200 L, 가령, 최소한 300 L, 가령, 최소한 500 L의 적합한 배지에서 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물을 발효시킴을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  10. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)에서 세포들이 최소한 3000만개 세포들/ml, 바람직하게는 최소한 4000만개 세포들/ml, 더욱 바람직하게는 최소한 5000만개 세포들/ml, 예컨대 최소한 6000만개 세포들/ml, 가령 최소한 7000만개 세포들/ml, 가령 최소한 8000만개 세포들/ml의 세포 밀도에 도달할 때까지 생체고분자를 발현시키는 세포들, 세포들 또는 미생물들을 세포 배양 용기 (1)에서 발효시킴을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  11. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 생성물 및 불순물을 포함하는 배지의 최소한 30%, 가령 최소한 40%, 가령 최소한 50%, 가령 최소한 60% 가령 최소한 70% 가령 최소한 80%를 생성물 수집 모듈 (4)를 통해 세포 배양 용기(1)로부터 제거함을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  12. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 생체고분자를 발현시키는 세포는 포유동물 세포, 가령, CHO, NSO, PER.C6®, BHK, 또는 HEK에서 선택됨을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  13. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 생체고분자는 재조합 단백질, 가령, 성장 인간 성장 호르몬, 난포-자극 호르몬, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX 에리트로포이에틴 (EPO), 과립구 집락-자극 인자 (G-CSF), 인터페론 (IF), 인슐린, 인슐린 유도체, 인슐린-유사 성장 인자 1임을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  14. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체고분자는 항체 또는 이의 분절이고, 여기서 분절은 예컨대 Fab 분절, Fv 분절 또는 단일쇄 Fv (scFv) 분절 또는 혈액-응고 인자, 가령 혈액-응고 인자 VIIa일 수 있음을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
  15. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 불순물 여과기는 생체고분자의 분자량의 최대 10% 이상, 가령, 20% 이상, 가령, 30% 이상, 가령, 40% 이상, 가령, 50% 이상의 공칭 분획 분자량(NMWC)을 가지는 공경(pore size)을 가짐을 특징으로 하는, 생물반응기 시스템에서 세포에 의해 발현되는 생체고분자, 세포 및 미생물에서 선택된 생성물의 제조 방법.
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