KR102539167B1 - 교번 접선 유동식의 신속한 수확 - Google Patents

교번 접선 유동식의 신속한 수확 Download PDF

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Abstract

세포가 세포 생성물을 수확 농도로 생산할 때까지 세포를 유체 배지 중에서 배양함으로써 세포 배양물로부터 세포 생성물을 수확하는 방법 및 시스템을 개시한다. 세포를 ATF 장치에 연결된 생물반응기를 포함하는 세포 배양 시스템에서 배양한다. 본 방법은 생물반응기 부피가 미리 결정된 부피에 도달할 때까지 유체 배지를 배출구 및 ATF 장치를 통해 생물반응기로부터 배출시키는 단계이며, 여기서 ATF 칼럼은 ATF 배출구에 세포 생성물을 함유하는 액체를 제공하고, 세포 생성물 농도가 수확 농도보다 낮은 유체 배지는 생물반응기로 다시 전달하는 것인 단계, 세포 생성물을 함유하는 액체를 ATF 배출구로부터 추출하는 단계, 생물반응기를 멸균 포스페이트 완충 염수 또는 어떠한 세포 생성물도 함유하지 않는 유체 배지로 리필하는 단계, 및 원하는 양의 세포 생성물이 나올 때까지 상기 단계를 반복하는 단계를 포함한다.

Description

교번 접선 유동식의 신속한 수확{ALTERNATING TANGENTIAL FLOW RAPID HARVESTING}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 7월 25일 출원된 미국 가출원 번호 62/366,557을 우선권 주장하고, 상기 가출원의 전체 내용이 본원에서 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 생물반응기로부터 생성물을 수확하기 위한, 예컨대, 유가식 생물반응기 배양물로부터 생성물을 수확하기 위한 교번 접선 유동 여과 유닛의 용도에 관한 것이다.
미생물, 식물, 또는 동물 세포의 배양은 상업상 중요한 가치가 있는 생물학적 및 화학적 물질을 제조하는 데 사용된다. 특히, 상업적 제조를 위해, 이러한 배양은 3가지 작동 모드: 회분식, 연속식, 유가식, 또는 농축 유가식으로 진행될 수 있다. 적용은 발효, 생명공학, 및 화학, 특수 화학물질 및 생성물 제조의 경우에는 폐기물 처리도 포함한다. 생성물은 전형적으로 임의의 원하는 세포 생성물, 예컨대, 단백질, 펩티드, 핵산, 바이러스, 아미노산 항생제, 특수 화학물질 및 가치가 있는 다른 분자를 비롯한, 내인성 및 재조합 생성물을 포함하는 가치가 높은 생성물이다. 원하는 단백질은 모노클로날 항체, 효소 및 다른 재조합 항체, 효소, 펩티드, 바이러스를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 심지어는 수율 및 생산성의 미미한 개선도 수익성을 증가시킨다. 그러므로, 회분식, 유가식, 또는 농축 유가식 반응기 작동을 개선시켜야 할 동기가 존재한다.
현행 기술을 사용하여 유가식 생물반응기로부터 생성물을 수확하는 것은 전형적으로 분리 프로세스, 예컨대, 원심분리 및 심층 여과를 사용하는데, 이는 시간이 많이 소요될 수 있고, 원하는 것보다 낮은 생성물 회수를 초래할 수 있다. 원심분리가 한동안 세포 수확의 일부가 되어 왔지만, 이러한 프로세스는 높은 전단을 유발하고, 이는 낮은 실행가능성 및 잠재적으로 변경된 단백질 품질로 이어지게 된다. 심층 여과가 원심분리에 비해 유익하지만, 예컨대, 차압 모니터링의 필요, 필터 처리, 큰 풋프린트, 및 규모 확장 문제와 같은 그 자체의 한계를 가지고 있다. 추가로, 원심분리 및 심층 여과는 둘 다 크로마토그래피 분리 프로세스에 적합한 유체를 제조하기 위해서는 제2 정화 단계가 요구된다는 문제를 안고 있다.
본 개시내용에 기술된 방법 및 시스템은 적어도 부분적으로는 교번 접선 유동 (ATF) 여과가 세포 배양물, 예컨대, 유가식 배양물 또는 농축 유가식 배양물로부터 신속한 수확을 수행하도록 적합화되어, 세포 생성물의 신속한 고수율의 수확이라는 유익한 결과를 달성할 수 있다는 발견을 기반으로 한다. 유가식 및 다른 유형의 세포 배양물을 수확하기 위해 ATF를 사용함으로써 최소 단계를 이용하여 신속한 수확 절차를 수행할 수 있는데, 그 이유는 신규한 방법이, 일반적으로 2개 이상의 단계, 예컨대, 원심분리 및 심층 여과를 필요로 하는 수확 절차를 간소화시키기 때문이다. ATF 수확을 통해 높은 정화율로 예컨대, 크로마토그래피 칼럼과 같이, 다음 단계에 적합한 공급 스트림을 얻을 수 있고, 이로써, 하류 시스템의 오염을 막을 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 ATF를 사용하여 유가식 및 농축 유가식 배양물을 수확하기 위한 연속 방법을 기술한다.
유가식 생물반응기로부터 단백질을 수확하기 위해 원심분리 또는 심층 여과 필터를 사용하는 것이 일반적이다. 그러나, 이러한 일반적인 기술을 사용하는 단백질 회수는 회수율이 낮고, 시간이 많이 소요되는 프로세스이다. 본원에 기술된 신규 방법 및 시스템에 따라, 유가식 생물반응기 상에서 신속한 수확 장치로서 ATF를 사용함으로써 수확 시간을 8 또는 10시간 미만으로 단축시킬 수 있다. 신규 방법은 또한 단백질 품질을 유지시키는데, 이는 세포 생존율이 전체 수확 프로세스 전 기간 동안에 걸쳐 높은 상태 그대로 유지되기 때문이다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 세포 배양물, 예컨대, 유가식 또는 농축 유가식 세포 배양물로부터 세포 생성물을 수확하는 방법을 포함한다. 세포 생성물은 임의의 원하는 내인성 및 재조합 단백질, 핵산, 바이러스, 및 가치가 있는 다른 분자를 포함한다. 원하는 단백질은 모노클로날 항체, 효소, 및 다른 재조합 또는 자연 발생 단백질을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 본 방법은 세포가 배양 배지 중에서 세포 생성물을 수확 농도로 생산할 때까지 세포를 출발 부피의 배양 배지 중에서 배양하는 단계이며, 여기서 세포는 교번 접선 유동 (ATF) 장치에 연결된 생물반응기를 포함하는 세포 배양 시스템에서 배양되는 것인 단계; 배양 배지 부피가 미리 결정된 부피에 도달할 때까지 배양 배지를 ATF 장치를 통해 생물반응기로부터 배출시키는 단계이며, 여기서 ATF 장치는 ATF 배출구에 세포 생성물을 함유하는 액체를 제공하고, 세포 생성물 농도가 수확 농도보다 낮은 배양 배지는 생물반응기로 복귀시키는 것인 단계; 세포 생성물을 함유하는 액체를 ATF 배출구로부터 추출하는 단계; 생물반응기를 출발 부피와 동일하거나, 그보다 높거나, 또는 그보다 낮은 부피가 될 때까지 유체 배지로 리필하는 단계; 및 원하는 양의 세포 생성물이 생물반응기로부터 나올 때까지 배출, 추출, 및 리필 단계 중 하나 이상의 단계를 반복하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 미리 결정된 부피는 출발 부피보다 더 낮거나, 또는 더 높을 수 있거나, 또는 출발 부피와 거의 동일할 수 있다. 생물반응기를 리필하는 데 사용되는 유체 배지는 포스페이트 완충 염수 (PBS), 또는 세포 배양 배지, 또는 세포를 살아있는 상태 그대로 유지시키는 데 사용될 수 있는 임의의 다른 액체일 수 있다.
일부 실행에서, 리필 단계는 생물반응기로부터의 배양 배지의 배출 속도와 동일한 속도로, 또는 ATF 배출구로부터의 액체의 추출 속도로 생물반응기를 동시에 리필하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 배출 단계 및 리필 단계는 순차적으로 수행되고/거나, 리필 단계 및 배출 단계는 2회 이상 수행된다.
신규 방법에서, 수확은 500 ℓ 내지 2,000 ℓ 부피에 대하여 18시간 미만, 예컨대, 24, 20, 18, 16, 14, 12, 10시간 미만, 또는 그 미만, 예컨대, 9, 8, 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5, 또는 5.0시간 미만, 또는 그 미만이 소요될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 생물반응기 부피가 미리 결정된 부피에 도달할 때까지 수행되는 배출 단계, 및 추출 단계 둘 다를 반복하는 것은 2.5시간 미만이 소요될 수 있다. 특정 실시양태에서, 배양 배지는 약 2 내지 30 ℓ/㎡/시간 (LMH), 예컨대, 약 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 내지 30 ℓ/㎡/시간 (LMH), 예컨대, 3 내지 25, 4 내지 20, 또는 5 내지 15 LMH의 필터 플럭스로 배출된다.
다양한 실행에서, 미리 결정된 부피는 출발 부피의 약 5% 내지 약 30%, 또는 출발 부피의 약 10% 내지 약 20%일 수 있다. 본 방법에서, 세포 배양물은 농축 유가식 배양물일 수 있고, 미리 결정된 부피는 출발 부피의 약 50%, 또는 출발 부피의 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 미리 결정된 부피는 배양 배지 중의 세포 농도 기준으로 결정된다.
일부 실행에서, ATF 장치는 공극 크기 예컨대, 약 0.1 내지 5.0 ㎛, 예컨대, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 또는 0.9 ㎛, 또는 1, 2, 3, 또는 4 ㎛, 또는 약 500 내지 1,000 kD, 예컨대, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 950 kD을 갖는 중공 섬유 필터를 포함할 수 있다.
본 방법에서, 배출 단계, 추출 단계, 및 리필 단계 중 임의의 2개 이상의 단계는 동시에 및 제1 유속으로 진행될 수 있다. 예를 들어, 배출 단계, 추출 단계, 및 리필 단계 중 임의의 하나 이상의 단계는, 세포가 세포 배양 프로세스 종료시 수확하고자 하는 세포 생성물 모두를 생산하기 이전에 시작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배출 단계, 추출 단계, 및 리필 단계는 세포가 유체 배지 중에서 수확 농도로 세포 생성물을 생산하기 1 내지 8일, 예컨대, 2 내지 7일, 또는 3 내지 6일 전에 시작된다.
일부 실시양태에서, 추출 및 리필 부피는 약 1.0 VVD (1일당 교환되는 베쓸 부피) 미만, 예컨대, 약 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1 VVD 미만이다.
일부 실행에서, 최종 수확 단계는 제1 유속과는 다른 제2 유속으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 최종 배출 단계를 통해 생물반응기에 출발 부피의 약 20% 미만, 예컨대, 10% 미만이 남게 될 수 있다
상기의 모든 방법에서, 세포 배양물은 유가식 세포 배양물 또는 농축 유가식 세포 배양물일 수 있고, 본 방법은 세포 생성물, 예컨대, 모노클로날 항체, 효소, 및/또는 바이러스를 제조하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포 배양물로부터 세포 생성물을 수확하기 위한 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 유입구 및 배출구를 포함하는 생물반응기; 생물반응기 유입구에 연결된, 세포 생성물을 함유하지 않는 세포 배양 배지 공급원; 생물반응기 배출구에 연결된 교번 접선 유동 (ATF) 장치; ATF 장치로부터의 배출구로 연결되고, ATF 장치로부터 유체가 나오도록 구성된 펌프; 및 단독으로 또는 다양한 조합 및 하위조합으로 본원에 기술된 방법 중 하나 이상의 것을 수행하도록 배열되고 프로그램화된 제어기를 포함한다.
본 개시내용에 기술된 방법 및 시스템은 유가식 배양물의 수확 동안 전단이 더 낮기 때문에, 높은 세포 생존율 유지 및 본원에 기술된 신규 방법을 사용하여 수확된 생성물의 더욱 우수한 단백질 품질을 비롯한, 여러 가지 이점을 제공한다. 세포 사멸 또는 스트레스는 흔히, 생성물의 품질을 손상시킬 수 있는 단백질 분해 또는 변형 효소의 방출을 유도한다. 신규 방법 및 시스템은 단백질 품질을 개선시키면서, 수율을 상향시키고, 생산성을 증가시킨다. 신규 방법 및 시스템은 그를 통해 대체로 무손상이고, 순수한 형태의 세포를 포함하는 세포 브로쓰를 회수할 수 있고, 배양된 세포를 그의 액체 배지로부터 수확 및 분리시키는 동안 증가하는 원치않는 생물제제의 후속 분리 성능을 손상시키지 않거나, 또는 상기 생물제제의 위험을 증가시키지 않는다. 분리 단계를 빠르게 완료하는 데에는 막을 통과하는 단백질 속도가 중요하다. 신규 방법 및 시스템을 이용하는 생산 시간이 경제적 이점을 나타내고, 이는 또한 예컨대, 분해와 같은 원치않는 생성물 변형을 막기 위해 불안정한 단백질을 빠르게 수득하는 데 요구될 수 있다.
"유가식 배양"이란, 세포 성장 및 생성물 형성에 필요한 하나 이상의 영양소가 다른 회분식 작동이 진행되는 동안 하나 이상의 공급 스트림을 통해 배양 동안 간헐적으로 또는 연속적으로 생물반응기에 공급되거나, 또는 제공되는 생명공학 프로세스를 위한 작동 기술을 지칭한다. 작동이 진행되는 동안 유출 스트림은 없으며, 이에 생물반응기 생성물은 그가 수확되는 시점인 실행 종료시까지 생물반응기 중에 그대로 남아있다. 상기 프로세스는 세포의 생존율 및 생산성이 완전하다면, 다회에 걸쳐 반복될 수 있다. 유가식 작동은 중요한 반응 속도를 제어하는 화합물의 농도를 조절하는 특별한 수단을 제공할 수 있기 때문에, 유가식 배양이 이롭고, 그러므로, 하나 이상의 공급량 조작을 통한 회분식 작동에 비하여 확실한 이점을 제공할 수 있다. 유가식 배양은 또한 발효로부터의 캐리오버 프로세스로서 그의 작동이 간단하고, 친숙하기 때문에 대규모 생산에도 이롭다.
"심층 여과"라는 용어는 매질 표면 바로 위보다는 매질 전역에 걸쳐 입자를 유지시키기 위해 다공성 여과 매질을 사용하는 여과를 지칭한다. 상기 필터는 다른 유형의 필터와 비교하였을 때, 막히기 전에 대량의 입자를 보유할 수 있으므로, 여과하고자 하는 유체가 높은 적재량으로 입자를 함유할 때에 보편적으로 사용된다. 심층 여과는, 액체 상으로부터 고체 오염물질을 포획하는 데 그의 심층이 사용되는 다중 다공성 층을 특징으로 한다.
"정용여과"라는 용어는 순수한 용액을 제조하기 위해 미세분자 투과성 필터를 사용함으로써 용액의 성분 (예컨대, 투과성 분자, 예컨대, 염, 소형 단백질, 용매 등)을 그의 분자 크기에 기초하여 제거 또는 분리하는 것을 포함하는 희석 프로세스를 지칭한다. 이는 대개 여과되는 용액에 액체를 첨가하는 것과 같은 속도로 필터 투과물을 나오게 함으로써 수행된다 (정적 정용여과로 지칭).
"세포 브로쓰"라는 용어는 배양 동안 세포가 현탁되어 있는 액체를 지칭한다. 유가식 프로세스에서, 세포 브로쓰는 공급 배지 및 영양소 둘 다 뿐만 아니라, 세포 생성물 (예컨대, 단백질 및 폐기물)을 포함한다.
"농축 유가식" (CFB)이라는 용어는 폐기물 생성물을 제거하고, 추가 배지를 반응기 베쓸 내로 공급하면서, 생물반응기 중에 단백질 생성물을 보유하는, 한외여과 막 (예컨대, 50 kDa 또는 30 kDa 공칭 MW 컷오프)을 포함하는 관류 시스템 (교번 접선 유동 (ATF)/접선 유동 여과 (TFF))을 사용하는 것을 지칭한다. 상기 프로세스는 더 높은 세포 농도를 얻을 수 있고, 종래 유가식 프로세스와 같이 반응기 중에 생성물을 보유한다.
"연속 공급"이라는 용어는 수확 기간 중 일정 기간 동안 배지 또는 배지 성분을 생물반응기에 연속하여 첨가하는 것을 지칭한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 보편적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기술한다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 조정할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이지, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터, 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 신속한 ATF 유가식 수확을 수행하기 위한 장치 및 프로세스에 관한 개략도이다.
도 2는 도 1의 신속한 ATF 유가식 수확 수행 방법에 관한 흐름도이다.
도 3은 도 1의 방법을 사용하였을 때의, 배양 시간의 함수로서의 생존가능한 세포 밀도 (VCD) 및 생존율을 나타낸 플롯이다.
도 4는 도 1의 방법을 사용하였을 때의, 배양 시간의 함수로서의 단백질 농도를 나타낸 플롯이다.
도 5는 도 1의 방법을 사용하였을 때의, 생존가능한 세포 계수 (IVC)의 적분 함수로서의 누적 단백질에 기반한 세포 특이적 생산성을 나타낸 플롯이다.
도 6은 신속한 ATF 유가식 수확을 수행하기 위한 전체 시스템 다이어그램이다.
도 7은 연속 정용여과를 이용하는 신속한 ATF 유가식 수확을 수행하기 위한 장치 및 프로세스에 관한 개략도이다.
도 8은 도 7의 신속한 ATF 유가식 수확 수행 방법에 관한 흐름도이다.
도 9는 도 7의 방법을 사용하였을 때의, 배양 시간의 함수로서의 생존가능한 세포 밀도 및 생존율을 나타낸 플롯이다.
도 10은 도 7의 방법을 사용하였을 때의, 배양 시간의 함수로서의 단백질 농도를 나타낸 플롯이다.
도 11은 도 7의 방법을 사용하였을 때의, 생존가능한 세포 계수의 적분 함수로서의 누적 단백질에 기반한 세포 특이적 생산성을 나타낸 플롯이다.
도 12는 연속 정용여과를 이용하는 신속한 ATF 농축 유가식 수확을 수행하기 위한 실시양태 및 장치 및 프로세스에 관한 개략도이다.
도 13은 연속 정용여과를 이용하는 신속한 ATF 농축 유가식 수확을 수행하기 위한 실시양태 및 장치 및 프로세스에 관한 개략도이다.
도 14는 연속 공급, 이어서, 신속한 수확을 이용하는 신속한 ATF 유가식 수확을 수행하기 위한 실시양태 및 장치 및 프로세스에 관한 개략도이다.
도 15는 종래의 유가식 프로세스와 비교한, 도 14의 방법을 사용하였을 때의, 배양 시간의 함수로서의 생존가능한 세포 밀도 및 생존율을 나타낸 플롯이다.
도 16은 종래의 유가식 프로세스와 비교한, 도 14의 방법을 사용하였을 때의, 생존가능한 세포 계수의 적분 함수로서의 누적 단백질에 기반한 세포 특이적 생산성을 나타낸 플롯이다.
도 17은 종래의 유가식 프로세스와 비교한, 도 14의 방법을 사용하였을 때의, 배양 시간의 함수로서의 단백질 농도를 나타낸 플롯이다.
도 18은 한외여과 필터와 함께 연속 공급을 이용하는 ATF 신속한 수확을 수행하기 위한 실시양태 및 장치 및 프로세스에 관한 개략도이다.
본 개시내용은 유가식 수확을 수행하기 위한 교번 접선 유동 (ATF) 여과의 용도를 기술한다. 유가식 배양물을 수확하기 위해 ATF를 사용함으로써, 프로세스되는 물질로서 단일 생성물을 포함하는 단일의 장치 세트를 이용하여 배치를 프로세싱하면서, 단일 프로세스 단계로 신속한 수확 절차를 수행할 수 있다. 본 방법은 다른 접선 유동 여과와 비교하였을 때, ATF의 경우, 더 높은 필터 플럭스로 생성물 수확을 수행할 수 있는 능력에 기인하여 ATF를 사용할 때에 성공적이다.
교번 접선 유동 (ATF)은 단일 단계로 여과를 수행하고, 생성물로부터 세포를 분리하는 데 사용되어 왔지만, 보통은 필터 플럭스 1.3-5.7 LMH로 제한이 되며, 이는 너무 느리기 때문에 상업적 배양 수확 환경에서는 유용하지 못하다. 예상 밖으로, 본원에 기술된 바와 같이 더 높은 플럭스 (예컨대, 10 LMH 초과)로 ATF 여과를 수행하였을 때, 필터는 오염되지 않았고, 생성물의 배양물로부터의 신속한 회수가 짧은 프로세싱 시간에 이루어졌다. ATF를 이용한 상기와 같은 배양물의 신속한 수확은 단일 단계로 추가의 프로세싱에 적합한 정화된 공급 스트림을 수득하는 데 경제적으로 유리한 방식으로서 상업적 프로세스에서 유용성을 가진다.
신규 방법은 또한, 지금까지는 일반적으로 예컨대, 원심분리에 이어서 심층 여과가 수행되는 것과 같이, 2개 이상의 단계가 요구되어 왔던 수확 절차를 간소화시킨다. 본원에 기술된 바와 같은 ATF 수확을 통해 높은 정화율로 다음 단계에서 예컨대, 크로마토그래피 칼럼에 직접 사용될 수 있는 공급 스트림을 얻을 수 있고, 이로써, 어떠한 다른 여과 또는 다른 정화 단계도 필요로 하지 않으면서 예컨대, 크로마토그래피 칼럼의 하류 오염을 막을 수 있다.
유가식 배양 동안, 생명공학 프로세스가 원하는 생성물을 생성하는 데 영향을 미친다. 배양 동안, 세포 성장, 및 예를 들어, 단백질, 핵산, 바이러스, 및 가치가 있는 다른 분자를 포함하는 내인성 및 재조합 생성물을 비롯한 임의의 원하는 세포 생성물을 포함할 수 있는 생성물 형성에 필요한 하나 이상의 영양소가 배양 동안 생물반응기에 공급되거나, 또는 제공된다. 이러한 공급은 작동이 진행되는 동안 하나 이상의 공급 스트림을 통해 연속적으로 또는 간헐적으로 수행된다. 작동이 진행되는 동안 유출 스트림은 없으며, 이에 생물반응기 내의 액체 및 세포의 부피는 작동 동안 증가된다. 생물반응기 생성물은 그가 수확되는 시점인 실행 종료시까지, 전형적으로 배양 5 내지 30일, 예컨대, 7 내지 25일, 또는 10 내지 21일 후에도 생물반응기 중에 그대로 남아있다. 유가식 배양물 수확은 브로쓰 중의 세포에 대한 손상 없이 가장 우수하게 수행됨으로써, 생성물 변형 없이, 및 크로마토그래피에 의한 생성물의 추가 프로세싱을 위해 필요한 정화를 수행하면서, 효율적인 프로세싱을 신속하게 제공한다. ATF가 유일하게 이러한 요건들을 뒷받침할 수 있다.
역사상, ATF는, 세포 배지가 세포를 함유하는 생물반응기에 연속적으로 제공되고, 정밀여과 막을 사용하여 폐기물 물질 및 단백질 생성물을 나오게 하면서, ATF가 연속적으로 배양물을 여과하는 관류 배양 시스템에서 사용되어 왔다. 상기 프로세스를 통해 단백질을 30일 또는 심지어는 그 초과 기간 동안 지속되는 배양 기간 동안 연속적으로 또는 빈번한 간헐적 간격으로, 및 낮은 필터 플럭스 (1.3 - 5.7 LMH)로 단백질을 수확할 수 있다. 상기 프로세스는 높은 세포 밀도 (예컨대, 50-150E6 세포/mL 이상)로 수행된다. 상기 ATF 지원 관류 배양은 또한 한외여과 필터 (예컨대, 공칭 공극 크기 50 kD 이하)를 포함하는 ATF를 이용하여 수행될 수 있고, 그 동안 폐기물 물질을 제거되지만, 생성물은 배양 브로쓰 내에 그대로 유지된다. 이들 배양은 낮은 필터 플럭스로 작동된다. 폐기물 생성물 제거가 훨씬 더 높은 농도의 세포를 허용하고, 이로써, 더 높은 농도의 원하는 생성물을 허용함에 따라, 원하는 세포 생성물이 세포 브로쓰에 유지되며, 이에 상기 배양은 종종 농축 유가식 (CFB)으로 지칭된다.
본 방법에서는 연속 세포 배양 동안 낮은 플럭스로 ATF를 이용하기보다는 그 대신으로 ATF 프로세스 유가식 배양물에 대한 (심층 여과 및 원심분리를 대체하는) 신속한 수확 장치로서 작용하도록 적합화된다. 신규 프로세스에서, ATF는 유가식 배양물은 일반적으로 7-20E6 세포/ml 범위의 세포 밀도로, 또는 CFB 배양물은 50-200E6 세포/ml (예컨대, 75-120E6 세포/ml) 범위의 세포 밀도로 상이하게 수확당일에 높은 필터 플럭스로 사용된다. 종래 관류 시스템과 달리, 신규 프로세스에서는 생성물, 예컨대, 단백질이 높은 필터 플럭스로 수확된다. 상기 전체 수확 프로세스는 높은 세포 생존율 및 더 우수한 생성물 품질을 유지하기 때문에, 유가식 또는 CFB 생물반응기 상의 신속한 수확 장치로서 ATF 시스템을 사용함으로써 상기 언급된 문제들을 극복할 수 있다.
본 방법은
(1) 단계식 정용여과를 이용하는 ATF 신속한 수확 (종래의 유가식 배양의 경우),
(2) 연속 정용여과를 이용하는 ATF 신속한 수확 (종래의 유가식 배양의 경우; 단계식 정용여과보다 더욱 효율적이고, 시간이 덜 소요된다),
(3) 연속 정용여과를 이용하는 ATF 신속한 수확 (농축 유가식 배양의 경우; 더욱 효율적이고, 시간이 덜 소요된다), 및
(4) 연속 공급을 이용하는 ATF 신속한 수확 (증가된 단백질 수율로, 더욱 효율적이고, 시간이 덜 소요된다)를 포함하는, 유가식 및 농축 유가식 생물반응기를 위한 4가지 상이한 신속한 수확 기술로 구현된다. 이들 4가지 상이한 방법을 위한 절차는 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
단계식 정용여과를 이용하는 신속한 수확
중공 섬유 다공성 막 (예컨대, 정밀여과 공극 크기, 예컨대, 0.1-5.0 ㎛ 또는 한외여과 막, 예컨대, 750 kDa MWCO)을 이용하는 ATF 시스템이 유가식 배양물로부터 수확하는 데 매우 적합한데, 그 이유는 상기 ATF 시스템은 세포 및 다른 소형 미립자를 또한 유지하기 때문이며, 이들은 하류 프로세스 이전에 제거되어야 한다. 원심분리 또는 심층 여과와 달리, ATF 사용은 또한 수확이 멸균 방식으로 수행될 수 있기 때문에 교차 오염을 감소시킨다.
도 1에 제시된 바와 같이, ATF 수확 생물반응기 시스템 (200)은 예를 들어, 교반식 탱크 반응기일 수 있는 생물반응기 (210)를 포함한다. 생물반응기 (210)는 배출관 (212)을 통해 ATF (220)에 연결된다. ATF는 교번 접선 유동을 이용함으로써 중공 섬유 여과를 사용하여 생물반응기 배양물을 관류시키는 데 사용되는 것과 같은 시스템이다. ATF (220)는 중공 섬유 필터 (224)를 통해 ATF를 수행하도록 다이아프램 펌프 (222)를 제어하는 장치로서 (예컨대, 미국 특허 번호 6,544,424 참조), 여기서 상기 필터 및 펌프 둘 다는 멸균 가능한 하우징 (226)에 내장되어 있는 것인 장치를 포함한다.
배지 및 첨가제는, 밸브 및/또는 펌프 (216)에 의해 제어되는 공급 라인 (214)을 통해 생물반응기 (210) 내로 도입된다. 공기 공급원 및 제어기 (240) (도 6)는 공기관 (228)을 통해 다이아프램 펌프 (222)에 연결된다. 하우징 (226) 내의 압력을 변경시키고, 하우징 (226) 내에 함유되어 있는 유체의 흐름을 지시하고, 유체가 중공 섬유 필터 (224)의 막을 통과하도록 드로잉하면서, 다이아프램 펌프 내에 함유되어 있는 2개 챔버의 부피를 증가 및 감소시키기 위해 다이아프램 펌프 (222)에 공기를 첨가하고, 그로부터 배출시킨다. 전형적으로, 중공 섬유의 내부 부분은 배출관 (212)을 통해 생물반응기에 유동적으로 연결되어 있는 반면, 중공 섬유 필터 (224)의 중공 섬유 바깥쪽 및 하우징 (226) 안쪽의 챔버는 생성물 배출관 (230)에 유동적으로 연결되어 있다. 생성물 배출관 (230)은 중공 섬유 필터를 통해 여과하고, 중공 섬유 필터 (224)와 하우징 (226) 사이의 챔버에 잔류하는 생성물의 배출을 제어하는 수확 펌프/밸브 (232)를 포함한다. 도 1에서, 생성물 배출관 (230)은 ATF (220) 상단부에 가깝게 위치하는 것으로 제시되어 있지만, 생성물 배출관 (230)은 또한 ATF (220)의 중간부 또는 하단부에 가깝게 위치할 수도 있다. 대안적으로 1개 초과의 생성물 배출관 (230)이 하우징 (226)에 연결되어 있을 수 있다.
ATF 수확 생물반응기 시스템 (200)을 사용하여 신속한 수확을 수행하기 위해, 10 ℓ/㎡/시간 (LMH) 초과 30 LMH 이하 (예를 들어, 12-18 LMH, 13-16 LMH, 또는 15 LMH)의 신속한 플럭스로 ATF를 이용하여 생성물 (예컨대, 단백질)이 수확된다. 신속한 수확은 배양 베쓸로부터 부피의 주기적 제거 및 리필 (회분식 여과)에 의해, 또는 여과 프로세스를 통해 액체를 수확하면서, 배양 브로쓰 중에 액체를 연속하여 보충해 줌으로써 (정적 정용여과) 달성될 수 있다. 상기 둘 다의 접근법은 하기 및 구체적인 예로 기술된다. 대부분의 생물반응기 디자인에서는 단지 부피의 대략 80% 정도를 제거할 수 있고, 적절한 교반을 그대로 유지할 수 있는 것이 실용적이고, 따라서, 일부 반응기는 가장 일반적으로는 80% 초과를 허용할 수 있지만, 회분식 또는 주기적 여과 방법에서는 80% 이하의 제거가 기술될 것이다.
(도 1에 6 L로 제시된) 600 L 생물반응기 중 500 L 양의 배지의 경우, 본 방법에서 (ATF 필터 크기가 11 ㎡라고 가정하였을 때) 15 LMH 플럭스일 때, 배출 시간은 대략 2.1 내지 2.5시간이 된다. 다른 부피 감소 값 (예컨대, 20%)도 사용될 수는 있지만, 생물반응기 (210) 부피의 남은 부피가 예를 들어, 30%까지 아래로 하락할 때까지 상기와 같은 단백질 배출은 계속된다. 상기 생물반응기 부피에서 수확 펌프 (232)는 정지된다. 세포 모두 생물반응기 (210)에 남아있고, 배지 브로쓰 내에 있으며, 이어서, 상기 배지 브로쓰는 수확 개시 시점과 거의 동일한 양의 유체가 될 때까지 충전된다. 일부 경우에서, 배지 브로쓰는 이어서, 수확 개시 시점보다 더 낮은 양, 또는 그보다 더 큰 양의 유체가 될 때까지 충전된다. 유체는 멸균 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 배양 배지 또는 생존가능한 세포 브로쓰와 화합성인 다른 유체일 수 있다. 수확 배출 프로세스는 생물반응기 (210)의 부피가 다시 대략 30%까지로 하락할 때까지, 대략 15 LMH의 플럭스로 재개한다. 이 사이클은 원한다면, 또는 필요하다면, 3 및 4회 반복된다. 생물반응기 (210) 내에 원래 함유되어 있던 유가식 배양물로부터 대략 96%의 단백질이 회수되고, 세포 생존율은 유지되었다.
신속한 수확 절차 단계가 도 2에 요약되어 있다. 유가식 배양 완료시, 단계 (150)에서 수확이 시작된다. 수확은, 단계 (160)에서, 생물반응기 (110)의 부피가 그의 초기 부피의 10-50%, 또는 더욱 바람직하게, 20-30%까지로 감소될 때까지, ATF를 이용하여 10-30 LMH (예컨대, 15 LMH) 플럭스로 세포 브로쓰를 배출함으로써 수행된다. 상기 생물반응기 부피에서, 수확 펌프 (232)는 정지되고, 단계 (170)에서 작업자는 원하는 회수율이 달성되었는지 여부를 결정한다. 이는 배출/리필 사이클 (예컨대, 2 또는 3) 횟수 또는 예컨대, 수확된 생성물의 총량 또는 농도를 검정하는 것과 같은 다른 수단에 의해 측정될 수 있다. 수확이 계속된다면, 단계 (180)에서 생물반응기 (210)는 리필되고, 배출 단계 (160)로 복귀하고, 최종적으로는 단계 (190)에서 수확이 종료된다.
연속 정용여과를 이용하는 신속한 수확
또 다른 실시양태에서, 연속 정용여과를 이용하는 신속한 ATF 수확 절차가 도 7에 제시되어 있다. 일부 경우에서, 이러한 정적 정용여과 방법은 회분식 방법보다 더 적은 부피로 더 높은 수율을 제공한다. 주어진 적용에 대해 최상의 방법을 선택하기 위하여 수율 및 시간에 대해 상기 둘 다의 방법에 관한 시험을 수행할 수 있다. ATF 연속 정용여과를 이용하여 수확하기 위한 컴포넌트는 도 1에 제시된 것과 유사하다. 본 절차의 경우, ATF 수확 생물반응기 시스템 (300)은 배출관 (312)을 통해 ATF (320)에 연결된 생물반응기 (310)를 포함한다. ATF (320)는 중공 섬유 필터 (324)를 통해 ATF를 수행하도록 다이아프램 펌프 (322)를 제어하는 장치로서, 여기서 상기 필터 및 펌프 둘 다는 멸균 가능한 하우징 (326)에 내장되어 있는 것인 장치를 포함한다.
배지 및 첨가제는, 밸브 및/또는 펌프 (316)에 의해 제어되는 공급 라인 (314)을 통해 생물반응기 (310) 내로 도입된다. 공기 공급원 및 제어기 (제시되지 않음)는 공기관 (328)을 통해 다이아프램 펌프 (322)에 유동적으로 연결된다. 중공 섬유의 내부 부분 (잔류물)은 배출관 (312)을 통해 생물반응기 (310)에 연결되어 있는 반면, 중공 섬유 필터 (324)의 중공 섬유 바깥쪽 및 하우징 (326) 안쪽의 챔버는 생성물 배출관 (330) (투과물)에 연결되어 있다. 생성물 배출관 (330)은 투과물 내의 생성물의 배출을 제어하는 수확 펌프/밸브 (332)를 포함한다.
상기 프로세스에서, 생물반응기 (310)의 부피가, 상승된 플럭스가 여과에 의해 최대 4 생물반응기 부피의 유체 전달을 위해 유지될 수 있는 부피까지 아래로 하락할 때까지, 10-30 LMH (일반적으로, 12-18 또는 15 LMH)의 플럭스로 ATF (320)를 이용하여 단백질이 또한 수확된다. 부피 감소율(%)은 0-100%, 예를 들어, 유가식 배양인 경우, 30%, 또는 CFB 배양인 경우, 0-50%일 수 있다. 일부 경우에서, 부피 감소율(%)은 예를 들어, 10-90%, 예컨대, 25-75%, 예컨대, 30-60%, 예컨대, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100%이다. 500 L 생물반응기 (310)의 경우, 11 ㎡ 필터를 통해서는 15 LMH 플럭스일 때, 30% 수준으로까지의 배출 시간은 대략 2.1시간이 된다.
일단 상기 감소된 생물반응기 부피 (예컨대, 1.8 L)에 도달하고 나면, 정용여과 프로세스는 생성물 배출관 (330) (투과물)을 통한 유체 수확 속도와 등가인 유속으로 PBS 또는 배양 배지 (또는 세포 생존율을 유지시키는 데 화합성을 띠는 다른 유체)를 공급 라인 (314)을 통해 첨가함으로써 생물반응기 부피를 유지하기 시작한다. 상기 정용여과 프로세스는 투과물 중 원하는 생성물의 수율이 90% 초과에 도달할 때까지 예를 들어, 15 LMH의 플럭스로 진행될 수 있다. 그러므로, 상기 방법에 의한 신속한 수확은 대략 6-8시간 미만 (예컨대, 6시간 미만)인 시간 내에 완료된다.
투과물 수집과 함께 회분식 세척을 사용하거나, 또는 일정 정용여과를 사용함으로써 유가식 또는 CFB 배양물로부터의 생성물의 신속한 수확이 달성될 수 있다.
연속 정용여과를 이용한 신속한 수확 절차의 단계는 도 8에 요약되어 있다. 유가식 배양 완료시, 단계 (250)에서 수확이 시작된다. 수확은, 단계 (260)에서, 생물반응기 (310)의 부피가 그의 초기 부피의 대략 30%가 될 때까지, ATF를 이용하여 10-30 LMH (예컨대, 15 LMH) 플럭스로 세포 브로쓰를 배출함으로써 수행된다. 상기 생물반응기 부피에서, 수확 펌프 (332)의 유속은 감소되고, 동시에, 단계 (270)에서, 유체는 대략 동일한 속도로 (예컨대, 15 LMH) 공급 라인 (214)을 통해 생물반응기 (210)에 첨가되고, 이로써, 정용여과 사이클은 완료된다. 일단 전체 대체되는 부피를 통해 사이클링에 의해 정용여과 사이클이 완료되고 나면, (단계 280에서) 수확이 계속되어야 하는지 (예컨대, 회수율이 아직 90% 또는 96%가 아닌 경우), 및 시스템이 단계 (270)로 복귀하여 추가의 정용여과 사이클을 수행하여야 하는지 여부가 결정된다. 일단 원하는 부피가 달성되고 나면, 수확 작동은 단계 (290)에서 완료된다.
농축 유가식을 위한 연속 정용여과를 이용하는 신속한 수확
또 다른 실시양태에서, 농축 유가식 시스템을 위해 연속 정용여과를 이용하는 신속한 ATF 수확 절차가 도 12에 제시되어 있다. 일부 경우에서, 농축 유가식 (CFB)을 위한 ATF 신속한 수확의 프로세스는 수확당일 생존가능한 세포 밀도에 의존한다. ATF 연속 정용여과를 이용하여 수확하기 위한 컴포넌트는 도 1에 제시된 것과 유사하다.
도 12에 제시된 바와 같이, ATF 수확 생물반응기 시스템 (400)은 예를 들어, 교반식 탱크 반응기일 수 있는 생물반응기 (410)를 포함한다. 생물반응기 (410)는 배출관 (412)을 통해 ATF (420)에 연결된다. ATF는 교번 접선 유동을 이용함으로써 중공 섬유 여과를 사용하여 생물반응기 배양물을 관류시키는 데 사용되는 것과 같은 시스템이다. ATF (420)는 중공 섬유 필터 (424)를 통해 ATF를 수행하도록 다이아프램 펌프 (422)를 제어하는 장치로서 (예컨대, 미국 특허 번호 6,544,424 참조), 여기서 상기 필터 및 펌프 둘 다는 멸균 가능한 하우징 (426)에 내장되어 있는 것인 장치를 포함한다.
배지 및 첨가제는, 밸브 및/또는 펌프 (416)에 의해 제어되는 공급 라인 (414)을 통해 생물반응기 (410) 내로 도입된다. 공기 공급원 및 제어기 (제시되지 않음)는 공기관 (428)을 통해 다이아프램 펌프 (422)에 유동적으로 연결된다. 하우징 (426) 내의 압력을 변경시키고, 하우징 (426) 내에 함유되어 있는 유체의 흐름을 지시하고, 유체가 중공 섬유 필터 (424)의 막을 통과하도록 드로잉하면서, 다이아프램 펌프 내에 함유되어 있는 2개 챔버의 부피를 증가 및 감소시키기 위해 다이아프램 펌프 (422)에 공기를 첨가하고, 그로부터 배출시킨다. 전형적으로, 중공 섬유의 내부 부분은 배출관 (412)을 통해 생물반응기에 유동적으로 연결되어 있는 반면, 중공 섬유 필터 (424)의 중공 섬유 바깥쪽 및 하우징 (426) 안쪽의 챔버는 생성물 배출관 (430)에 유동적으로 연결되어 있다. 생성물 배출관 (430)은 중공 섬유 필터를 통해 여과하고, 중공 섬유 필터 (424)와 하우징 (426) 사이의 챔버에 잔류하는 생성물의 배출을 제어하는 수확 펌프/밸브 (432)를 포함한다.
도 12에서, 생성물 배출관 (430)은 ATF (420) 상단부에 가깝게 위치하는 것으로 제시되어 있지만, 생성물 배출관 (430)은 또한 ATF (420)의 중간부 또는 하단부에 가깝게 위치할 수도 있다. 대안적으로 1개 초과의 생성물 배출관 (430)이 하우징 (426)에 연결되어 있을 수 있다.
농축 유가식 생물반응기 (410) 배양 종료시 수확당일 생존가능한 세포 밀도 (VCD)가 100E6 세포/mL 미만일 경우, 생물반응기 (410)의 부피가, 상승된 플럭스가 여과에 의해 최대 4 생물반응기 부피의 유체 전달을 위해 유지될 수 있는 부피까지 아래로 하락할 때까지, 10-30 LMH (일반적으로 12-18, 13-16, 또는 15 LMH)의 플럭스로 ATF (420)를 이용하여 단백질이 수확된다. 이는 세포 밀도에 의존하여 0-50%, 예를 들어 50%일 수 있다.
일단 상기 감소된 생물반응기 부피에 도달하고 나면, 연속 정용여과 프로세스는 생성물 배출관 (430) (투과물)을 통한 유체 수확 속도와 등가인 유속으로 PBS 또는 배양 배지 (또는 세포 생존율을 유지시키는 데 화합성을 띠는 다른 유체)를 공급 라인 (414)을 통해 첨가함으로써 생물반응기 부피를 유지하기 시작한다. 상기 정용여과 프로세스는 투과물 중 원하는 생성물의 수율이 90% 초과에 도달할 때까지 예를 들어, 10-30 LMH의 플럭스로 진행될 수 있다. 그러므로, 상기 방법에 의한 신속한 수확은 대략 6-8시간 미만 (예컨대, 6시간 미만)인 시간 내에 완료된다.
이는 수확당일 VCD가 이미 100E6 세포/mL를 초과한 경우에는 세포 밀도를 농축시키지 않도록 권장된다. 도 13을 참조하면, 이 경우에, 연속 정용여과 이전에 생물반응기 부피 감소는 없을 것이다. 연속 정용여과 프로세스는 생성물 배출관 (430)을 통한 유체 수확 속도와 등가인 유속으로 PBS 또는 배양 배지 (또는 세포 생존율을 유지시키는 데 화합성을 띠는 다른 유체)를 공급 라인 (414)을 통해 첨가함으로써 생물반응기 부피를 100%로 유지하기 시작한다. 상기 정용여과 프로세스는 투과물 중 원하는 생성물의 수율이 90% 초과에 도달할 때까지, 예컨대, 4 생물반응기 부피 교체 이후에, 예를 들어, 10-30 LMH의 플럭스로 진행될 수 있다. 4 부피 교체 후, 남은 배지는 PBS 또는 신선한 배지와의 교체에서 수확될 것이다.
하기 표 1에는 (공지된 측정 기술에 의해 측정될 수 있는) 수확당일의 세포 밀도에 의존하여 제안된 생물반응기 부피 감소가 제시되어 있다.
<표 1>
생물반응기 부피 관리
Figure 112022078691919-pat00001
상기 방법은 ATF 장치가 일반 작동으로부터 증가된 플럭스로 작동되는, 세포 생물반응기 수확을 작동시키는 신규한 방법을 제공한다. 이러한 독특한 접근법은 종전에 불가능했던 신속한 수확을 달성할 수 있다. 본 프로세스의 특징은 무입자 공급 스트림을 달성하는 단일 프로세스 단계 및 생성물 수확이 진행될 수 있는 속도이다. 이러한 특징은 프로세싱 시간 단축 및 다중 프로세싱 단계를 위한 장비 비용 절감에 기인하여 생물학적 제조 프로세스에서 상당한 경제적 이익을 제공한다.
연속 공급을 이용하는 ATF 신속한 수확
수확 시간을 추가로 단축시키기 위해 연속 공급 및 신속한 수확 프로세스를 이용하는 유가식이 개발되었다. 상기 기술은 세포 생존율을 유지시켜 생성물을 고품질로 보장하면서, 수확 시간을 반으로 단축시키고, 단백질 생산을 증가시키는 것 둘 다를 한다. 수확 동안 단백질 생산 증가는 현재 상업적으로 이용되고 있는 기존의 유가식 수확 기술에 의해서는 달성불가능하다. 예컨대, 세포 배양용 생물반응기 또는 제어 시스템과 같은, 유가식 배양에 사용되는 기본 장비를 바꾸지 않고도 달성되기 때문에, 생산성 증가는 특히 이롭다.
배양 최종일 동안의 유가식 생물반응기의 연속 저속 공급은 유가식 배양 및 수확 프로세스에 추가 시간을 주지 않고도 단백질 생산을 증가시킨다. 이는 정밀여과 필터 (투과물 중 생성물 수집)를 이용하여, 또는 한외여과 필터 (최종 수확 단계 동안 수집되는 반응기 내 생성물의 잔류)를 이용하여 달성될 수 있다. 추가로, 연속 수확 프로세스는 또한 유가식 배양물의 생존율을 증가시키며, 이는 단백질 품질에 바람직할 수 있다. 상기 프로세스는 원심분리 또는 심층 여과와 달리, 전체 프로세스가 멸균 방식으로 수행되기 때문에 교차 오염을 감소시킨다.
도 14는 연속 공급 & ATF 방법을 이용하는 신속한 수확을 사용하여 수행되는 유가식 기술을 이용하기 위한 장치에 대한 개략도를 보여주는 것이다. ATF 연속 정용여과를 이용하여 수확하기 위한 컴포넌트는 도 1에 제시된 것과 유사하다.
도 14에 제시된 바와 같이, ATF 수확 생물반응기 시스템 (500)은 예를 들어, 교반식 탱크 반응기일 수 있는 생물반응기 (510)를 포함한다. 생물반응기 (510)는 배출관 (512)을 통해 ATF (520)에 연결된다. ATF (520)는 중공 섬유 필터 (524)를 통해 ATF를 수행하도록 다이아프램 펌프 (522)를 제어하는 장치로서, 여기서 상기 필터 및 펌프 둘 다는 멸균 가능한 하우징 (526)에 내장되어 있는 것인 장치를 포함한다. 배지 및 첨가제는, 밸브 및/또는 펌프 (516)에 의해 제어되는 공급 라인 (514)을 통해 생물반응기 (510) 내로 도입된다. 공기 공급원 및 제어기는 공기관 (528)을 통해 다이아프램 펌프 (522)에 유동적으로 연결된다. 하우징 (526) 내의 압력을 변경시키고, 하우징 (526) 내에 함유되어 있는 유체의 흐름을 지시하고, 유체가 중공 섬유 필터 (524)의 막을 통과하도록 드로잉하면서, 다이아프램 펌프 내에 함유되어 있는 2개 챔버의 부피를 증가 및 감소시키기 위해 다이아프램 펌프 (522)에 공기를 첨가하고, 그로부터 배출시킨다. 전형적으로, 중공 섬유의 내부 부분은 배출관 (512)을 통해 생물반응기에 유동적으로 연결되어 있는 반면, 중공 섬유 필터 (524)의 중공 섬유 바깥쪽 및 하우징 (526) 안쪽의 챔버는 생성물 배출관 (530)에 유동적으로 연결되어 있다. 생성물 배출관 (530)은 중공 섬유 필터를 통해 여과하고, 중공 섬유 필터 (524)와 하우징 (526) 사이의 챔버에 잔류하는 생성물의 배출을 제어하는 수확 펌프/밸브 (532)를 포함한다.
연속 공급은 낮은 부피 (1.0 VVD (1일당 교환되는 베쓸 부피) 미만, 예컨대, 0.7 VVD 미만)로, 신속한 수확 전 다양한 일수 동안 (예를 들어, 2-8일 동안) 진행될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 연속 저속 공급 및 수확 (@ 0.5 VVD)은 배양 11일째부터 14일째까지 진행된다. 72시간 후, 신속한 수확이 진행됨에 따라 공급 및 수확이 동시에 진행된다. 생물반응기 (510)의 부피가 20% 미만 (바람직하게, <10%)까지 아래로 하락할 때까지, 10-30 LMH (일반적으로, 12-18, 13-16, 또는 15 LMH)의 플럭스로 ATF (520)를 이용하여 단백질이 수확되고, 실질적으로, 생물반응기의 액체 부분이 수확된다. 프로세스의 신속한 수확 파트는 제시된 크기의 생물반응기의 경우, 완료되는 데에는 대략 3시간이 소요된다.
연속 공급 및 신속한 수확 프로세스는 상당한 이점을 가지고 있다. 본 개시내용에서 앞서 기술된 방법은 14일의 배양 및 대략 6시간의 추가 수확 시간이 소요되며, 이를 통해 최종량의 단백질이 회수된다. 연속 공급 및 ATF를 이용하는 신속한 수확 프로세스에서는, 11일의 정규 배양, 이어서, 3일의 연속 공급/수확 (총 14일은 동일), 이어서, 단 3시간의 신속한 수확으로 진행된다. 상기 프로세스 결과, 유가식 배양물 제조에 사용되는 동일한 생물반응기 장비로부터 실질적으로 동일한 시간량 경과 후에 회수되는 단백질의 양은 증가된다. 추가로, 신속한 수확 이전의 낮은 부피의 수확 동안의 연속 공급은 현재 이용가능한 프로세스 기술보다 더 우수한 세포 생존율 및 생성물 품질을 유지하거나, 또는 개선시킨다.
신속한 수확을 위해 기술된 모든 실시양태에서, 최종 생성물 풀은 생성물에 대한 후속된 추가 프로세싱 또는 보관을 위해 부피를 감소시키기 위하여 한외여과 필터를 이용하는 ATF를 사용함으로써 추가로 농축될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술되며, 실시예는 특허청구범위에 기술되는 본 발명의 범주를 제한하지 않는다.
1) 단계식 정용여과를 이용하는 ATF 신속한 수확 - 종래의 유가식
ATF 단계식 정용여과를 이용하는 유가식 신속한 수확 시스템을 개선시키기 위해서는 다양한 시험 및 실험 절차가 요구되었다. 실시예에서는 신속한 수확을 위해 6 L 유가식 생물반응기 (리플리겐 코포레이션(Repligen Corp.: 미국 매사추세츠주 월섬)으로부터의 ATF2 시스템 포함)를 포함한다. ATF2 데이터를 사용하여 1,000 L 유가식 생물반응기 (리플리겐 코포레이션 (미국 매사추세츠주 월섬)으로부터의 ATF10 시스템, 500 L 및 1,000 L 생물반응기를 위한 상업적으로 이용가능한 관류 제품 포함)에 대해 외삽하였다.
또한, 시험을 수행하여 본 방법에 대한 회수율(%) 및 총 수확 시간을 측정하였다. 본 시험을 위해, LONG®R3IGF-1 적합화된 CHO DP12 세포의 냉동 바이알을 해동시키고, 100 ng/mL LONG®R3IGF-1, 200 nM 메토트렉세이트 및 4 mM 글루타맥스(Glutamax)®를 포함하는 CD 옵티CHO®(CD OptiCHO®) 배지를 함유하는 125 mL 진탕 플라스크 (작업 부피 40 mL) 중에서 성장시켰다. 4-6일 후, 생물반응기에 접종하는 데 충분한 개수의 세포를 생성하기 위하여 세포를 다시 1 L (작업 부피 200 mL) 진탕 플라스크에 계대접종/계대배양하였다. 일단 밀도가 5-7E6 세포/mL에 도달하고 나면, 세포를 SS-ATF2와 어셈블리된 3 L 생물반응기 (작업 부피 1.5 L)에 접종하였다. 공급 전략법 및 유가식 생물반응기에 대한 생물반응기 조건은 표 2 및 3에 기술되어 있다.
<표 2>
유가식 조건
Figure 112022078691919-pat00002
<표 3>
생물반응기 조건
Figure 112022078691919-pat00003
14일째, 유가식 배양 종료시, 0.9 LPM의 ATF 속도 및 15 LMH의 플럭스로 수확 프로세스를 시작하였다. (도 1에 제시된 바와 같이) 각 사이클 후에는 생물반응기를 멸균 PBS로 충전시켜 다시 100%가 되게 만들었고, 제2 수확 사이클을 동일한 플럭스로 시작하여 남은 양의 IgG를 회수하였다. 유사하게, 또 다른 사이클 (사이클 총 3회)을 유사한 방식으로 반복하였다.
도 3은 배양 시간의 함수로서의 생존가능한 세포 밀도 (VCD) 및 생존율의 결과 플롯을 보여주는 것이다. 이는 유가식 배양에서 전형적인 프로파일이며, 일반적으로, 수확당일의 생존율은 60 - 85%로 다양하다. 최대 VCD는 ~14 E6 세포/mL였고, 수확당일의 VCD는 9-10E6 세포/mL였다.
도 4는 1일째부터 14일째까지의 유가식 배양에서의 단백질 농도를 나타낸 플롯이다. 수확당일의 단백질의 최종 온도는 ~600 mg/L였고, 이를 신속한 수확 프로세스 시작 전의 개시 농도로서 사용하였다.
도 5는 시간 경과에 따른 세포 성장, 즉, 생존가능한 세포의 적분 (IVC)의 함수로서의 세포 특이적 생산성 또는 누적 단백질을 나타낸 플롯이다. IVC와 누적 단백질 사이의 선형 플롯은 세포 특이적 생산성이 유가식 프로세스 전 기간 동안에 걸쳐 거의 동일하게 유지된다는 것을 나타내는 것이다.
일반적으로, 유가식에서, 수확 정화는 원심분리에 이어서, 심층 여과에 의해 달성된다. 이는 현재 심층 여과 필터만을 단독으로 사용해서는 다량의 고체 공급 스트림 (특히 세포 밀도가 높을 때)을 취급할 수 없고, 대개는 연속하여 원심분리를 함께 사용하므로, 2 단계 프로세스이다. 추가로, 심층 여과는 규모 확장 및 차압 모니터링면에서 한계가 있다.
한편, ATF 단계식 정용여과를 사용할 때, 전체 프로세스는 지속 기간이 더 짧은 단일 단계로 조합될 수 있다. 0.2 ㎛ 정밀여과 필터를 이용하는 ATF가 유가식 배양물로부터 수확하는 데 매우 적합한데, 그 이유는 상기 ATF가 하류 프로세스에 유익한 세포 및 다른 소형 미립자 또한 유지하기 때문이다. 원심분리 또는 심층 여과와 달리, ATF 사용은 또한 수확이 멸균 방식으로 수행될 수 있기 때문에 교차 오염을 감소시킨다. 상업적으로 이용가능한 ATF10 시스템은 500 L 및 1,000 L 생물반응기를 위한 ATF 관류를 제공할 수 있고, 이를 다회에 걸쳐 사용함으로써 최대 2,000L 생물반응기까지 쉽게 규모 확장시킬 수 있다. 본원에 기술된 데이터에 기초하여, 단계식 정용여과를 이용하여 신속한 수확을 사용하였을 때, 단백질 회수율은 95%를 초과할 수 있다.
ATF 단계식 정용여과를 이용하는 수확 프로세스의 총 시간은 8시간 미만이다. 생존율이 유의적으로 하락하지 않았다는 것은 단백질 품질이 수확 프로세스 동안 변경되지 않는다는 것을 시사하는 것이다. 각 수확 사이클 이후의 결과 생존율 및 IgG 농도는 하기 표 4에 제시되어 있다. 각 사이클 후, 생물반응기로부터 샘플을 수집하여 생존율 및 단백질 농도를 측정하였다. 제1 사이클 후에는 어떠한 샘플도 수집되지 않았다 (ND = 비측정).
<표 4>
생존율 및 IgG 농도
Figure 112022078691919-pat00004
2개의 ATF10 생물반응기는 동시에 진행될 수 있다. 각 ATF10의 표면적은 11 ㎡이고, 이들이 동시에 사용될 때, 합산된 총 면적은 22 ㎡이다. 총 수확 시간은 ATF10 장치의 개수를 2개에서 3개 이상으로 증가시킴으로써 추가로 단축될 수 있다.
하기 표 5는 ATF2에서부터 중간 크기의 (표면적 2.5 ㎡) ATF6까지, ATF10까지의 표면적을 기준으로 하여 표로 작성된 것이다.
<표 5>
규모 확장 계산
Figure 112022078691919-pat00005
본 실험에서, 15 LMH의 플럭스로 6 L 유가식 생물반응기를 이용하는 ATF2가 96%의 생성물을 회수하면서 8시간 미만인 시간 내에 단백질을 수확할 수 있다는 것이 성공적으로 입증되었다. 표면적을 ATF2 (0.13 ㎡)로부터 ATF10 (11 ㎡)으로 외삽함으로써, 본원에 기술된 방법에 따라 ATF10을 사용하여 8시간 이내에 500 L 유가식 생물반응기가 신속하게 수확될 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 유사하게, 2개의 ATF10 (필터의 총 표면적 (SA): 22 ㎡)을 이용하여 1,000 L 유가식 생물반응기는 8시간 내에 수확될 수 있다. 추가로, 수확 프로세스 동안 생존율에 대한 최소의 손실도 없었다.
2) 연속 정용여과를 이용하는 ATF 신속한 수확 - 종래의 유가식
신속한 수확 기술을 평가하기 위해, ATF2에 연결된 2 L 유가식 생물반응기를 사용하여 규모 축소 모델 (SDM), 재순환 접근법을 이용하는 6 L 유가식 생물반응기를 모방하였다. ATF2 데이터를 이용하는 6 L 생물반응기를 사용하여 ATF10을 이용하는 500 L 및 1,000 L 유가식 생물반응기에 대해 외삽하였다.
또한, 앞서 기술된 방법과 유사하게 시험을 수행하여 본 방법에 대한 회수율(%) 및 총 수확 시간을 측정하였다.
도 9는 배양 시간의 함수로서의 생존가능한 세포 밀도 (VCD) 및 생존율의 결과 플롯을 보여주는 것이다. 이는 유가식 배양에서 전형적인 프로파일이며, 일반적으로, 수확당일의 생존율은 60 - 85%로 다양하다. 최대 VCD는 ~14E6 세포/mL였고, 수확당일의 VCD는 9-10E6 세포/mL였다.
도 10은 1일째부터 14일째까지의 유가식 배양에서의 단백질 농도를 나타낸 플롯이다. 수확당일의 단백질의 최종 온도는 ~600 mg/L였고, 이를 신속한 수확 프로세스 시작 전의 개시 농도로서 사용하였다.
도 11은 시간 경과에 따른 세포 성장, 즉, 생존가능한 세포의 적분 (IVC)의 함수로서의 세포 특이적 생산성 또는 누적 단백질을 나타낸 플롯이다. IVC와 누적 단백질 사이의 선형 플롯은 세포 특이적 생산성이 유가식 프로세스 전 기간 동안에 걸쳐 동일하게 유지된다는 것을 나타내는 것이다.
일반적으로, 유가식에서, 수확 정화는 원심분리에 이어서, 심층 여과에 의해 달성된다. 이는 현재 심층 여과 필터만을 단독으로 사용해서는 다량의 고체 공급 스트림 (특히 세포 밀도가 높을 때)을 취급할 수 없고, 대개는 연속하여 원심분리를 함께 사용하므로, 2 단계 프로세스이다. 추가로, 심층 여과는 규모 확장 및 차압 모니터링면에서 한계가 있을 수 있다.
한편, ATF 연속 정용여과를 사용할 때, 전체 프로세스는 ATF 단계식 정용여과 프로세스보다 지속 기간이 더욱더 짧은 단일 단계로 조합될 수 있다. 0.2 ㎛ 정밀여과 필터를 이용하는 ATF가 유가식 배양물로부터 수확하는 데 매우 적합한데, 그 이유는 상기 ATF가, 제거될 경우에 하류 프로세스에 유익한 것인 세포 및 다른 소형 미립자를 또한 유지하기 때문이다. ATF 사용은 또한 수확이 멸균 방식인 것으로 나타날 수 있어, 교차 오염을 감소시킨다. 본원에 기술된 시스템은 예를 들어, 2개 이상의 ATF10 관류 제품 (리플리겐 코포레이션: 미국 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 500, 1,000, 1,500, 또는 2,000 L로 규모 확장될 수 있다. 본원에 기술된 데이터에 기초하여, 단백질 회수율은 단계식 정용여과를 이용하는 신속한 수확을 사용하였을 때의 95%보다 더 우수한 회수율을 보일 수 있다.
ATF 연속 정용여과를 이용하는 수확 프로세스의 총 시간은 6시간 미만이다. 생존율이 유의적으로 하락하지 않았다는 것은 단백질 품질이 수확 프로세스 동안 변경되지 않는다는 것을 시사하는 것이다.
각 수확 사이클 이후의 결과 회수 및 IgG 농도는 하기 표 6에 제시되어 있다.
<표 6>
회수 및 IgG 농도
Figure 112022078691919-pat00006
연속 정용여과를 이용한 신속한 수확 이후의 단백질 회수는 하기 표 7에 제시되어 있다.
<표 7>
단백질 회수
Figure 112022078691919-pat00007
ATF2 및 ATF6을 이용한 데이터를 더 큰 ATF10에 대해 외삽하였다. 500 L 유가식 생물반응기는 ATF10 사용으로 6시간 미만 내에 수확될 수 있고, 1,000 L 유가식 생물반응기는 2개의 ATF10 (필터의 총 표면적 (SA): 22 ㎡) 사용으로 수확될 수 있는 것으로 확인되었다. 표 8는 ATF2에서부터 ATF6까지, ATF10까지의 표면적을 기준으로 하여 표로 작성된 것이다.
<표 8>
규모 확장
Figure 112022078691919-pat00008
15 LMH의 플럭스로 6 L 유가식 생물반응기를 이용하는 ATF2가 95%의 회수율로 6시간 미만인 시간 내에 단백질을 수확할 수 있다는 것이 성공적으로 입증되었다. 표면적을 ATF2 (0.13 ㎡)로부터 ATF10 (11 ㎡)으로 외삽함으로써, ATF10을 사용하여 6시간 이내에 500 L 유가식 생물반응기가 신속하게 수확될 수 있다는 것을 예측할 수 있다. 유사하게, 2개의 ATF10을 이용하여 1,000 L 유가식 생물반응기는 6시간 내에 수확될 수 있다. 추가로, 수확 프로세스 동안 생존율에 대한 유의적인 손실은 없었다.
3) 연속 정용여과를 이용하는 ATF 신속한 수확 - 농축 유가식 배양
CFB에서는, VCD가 100E6 세포/mL 미만일 때에만 오직 생물반응기 부피를 하락시키도록 권장된다. 하기 2개의 표는 ATF2로부터 ATF6으로, ATF10으로 규모 확장된 표면적을 기준으로 하여 표로 작성된 것이다. 첫 번째 표인 표 9는 연속 정용여과 프로세스를 시작하기 전, 생물반응기 부피가 50% 감소된 것을 고려한 것이다. 두 번째 표인 표 10은 생물반응기 부피가 감소되지 않은, 즉, 처음부터 정용여과를 시작한 것에 대한 것이다.
<표 9>
50% 감소하의 규모 확장
Figure 112022078691919-pat00009
<표 10>
0% 감소하의 규모 확장
Figure 112022078691919-pat00010
4) 연속 공급을 이용하는 ATF 신속한 수확
수확 시간을 반으로 추가로 단축시키고, 단백질 생산을 증가시키기 위해 연속 공급 및 신속한 수확 프로세스를 이용하는 FB가 개발되었다. 이는 높은 플럭스의 신속한 수확과 함께, 신속한 수확 이전의 낮은 부피 연속 공급을 통해 달성된다. 하기 기술되는 본 실시예에서, 현행의 상업적으로 이용가능한 기존 유가식 수확 기술과 비교하였을 때, 단백질 수율이 40% 증가되었다. 연속 공급 및 ATF를 이용하여 신속한 수확 프로세스에 관한 본 실시예에서는, 다른 실시예에 기술된 바와 같이, 11일의 정규 배양, 이어서, 3일의 연속 공급/수확 (총 14일은 동일), 이어서, 단 3시간의 신속한 수확으로 진행된다. 다른 실시양태는 세포 생존율 및 총 단백질 생산을 유사한 방식으로 개선시키기 위해 연속 공급 기간 또는 연속 공급 부피를 변경시킬 수 있다. 본 시험을 위해, 재순환 방법과 함께 2 L 생물반응기를 사용하여 6 L 유가식 생물반응기를 모방하였고, 재순환 접근법을 이용하여 플럭스를 15 LMH로 유지시켰다.
도 15는 연속 공급 및 종래의 유가식 둘 다에 대한 배양 시간의 함수로서의 생존가능한 세포 밀도 (VCD) 및 생존율의 결과 플롯을 보여주는 것이다. VCD 및 생존율 둘 다는 11일째 연속 공급 및 수확 개시 이후에 증가 추세를 보였다. 도 16은 둘 다의 프로세스에 대한, 시간 경과에 따른 세포 성장, 즉, 생존가능한 세포의 적분 (IVC)의 함수로서의 세포 특이적 생산성 또는 누적 단백질을 나타낸 플롯이다. 도 17은 종래의 유가식과 비교한, 11일째의 연속 공급 및 수확 시작 이후의 전체 누적량의 증가를 보여주는 1일째부터 14일째까지의 유가식 배양에서의 단백질을 나타낸 플롯이다.
표 11은 유가식 수확 배양을 위해 사용된 조건을 보여주는 것이다.
<표 11>
유가식 조건
Figure 112022078691919-pat00011
수확 매 0 내지 3시간 이후의 결과 생존율은 하기 표 12에 제시되어 있다. VCD & 생존율 측정은 대략 2.7시간째에 수행되었다.
<표 12>
VCD 및 생존율
Figure 112022078691919-pat00012
하기 규모 확장 데이터를 필터의 표면적 (SA)에 기초하여 ATF2에서 ATF10으로 외삽하였다:
<표 13>
0% 감소하의 규모 확장
Figure 112022078691919-pat00013
연속 공급 및 신속한 수확 프로세스는 유의적인 이점을 보였다. 본 실시예의 경우, 11일의 정규 배양, 이어서, 3일의 연속 공급/수확, 이어서, 단 3시간의 신속한 수확으로 진행하였을 때, 통상의 유가식 프로세스에 의해 회수된 단백질 양의 1.4배되는 양을 수득하였다. 현재 이용가능한 기술보다 더 높은 세포 생존율을 유지할 수 있고, 더 높은 단백질 생산을 수득할 수 있는 프로세스가 유의적이고, 의미있는 프로세스 개선점이다.
도 18에 제시된 바와 같이, 시스템 (600)은 한외여과 필터가 장착된 ATF를 이용하면서, 연속 공급을 이용하여 프로세스를 수행할 수 있다. 시스템 (600)의 다른 소자는 선행 실시양태에서의 것과 동일한 것이다. 생성물은 생물반응기에 유지되고, 모든 생성물은 신속한 수확 단계 동안 수확된다. 이는 여전히 계속해서 생성물 수율을 증가시키면서, 최종 생성물 풀의 부피를 추가로 감소시킨다.
하기 규모 확장 데이터가 외삽되었다:
<표 14>
규모 확장
Figure 112022078691919-pat00014
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 하기 기술내용은 본 발명의 범주를 제한하는 것이 아니라, 본 발명을 예시하고자 하는 것이며, 본 발명의 범주는 첨부된 특허청구범위의 범주에 의해 정의됨을 이해하여야 한다. 다른 측면, 이점, 및 변형은 하기 특허청구범위의 범주 내에 포함된다.

Claims (19)

  1. 세포 생성물이 배양 배지 중에서 수확 농도에 도달할 때까지 유가식 또는 농축 유가식 배양물 중에서 세포 생성물을 생산하는 단계; 및
    세포 생성물이 교번 접선 유동(ATF) 필터의 투과물 채널 내로 통과하도록 ATF 필터를 통해 상기 배양 배지를 통과시킴으로써 세포 생성물을 수확하는 단계이며, 여기서
    생존가능한 세포 밀도가 제1 값 초과이면, 적어도 90%의 세포 생성물이 투과물 내에 존재할 때까지 ATF 필터가 10 ℓ/㎡/시간 (LMH) 초과의 필터 플럭스로 정용여과 모드에서 작동되고,
    생존가능한 세포 밀도가 제1 값 미만이면, 생존가능한 세포 밀도가 상기 제1 값에 도달하거나 또는 배양 배지가 출발 부피보다 낮은 미리 결정된 부피에 도달할 때까지 ATF 필터가 농축 모드에서 10 ℓ/㎡/시간 (LMH) 초과의 필터 플럭스로 작동되며, 그 이후 적어도 90%의 세포 생성물이 투과물 내에 존재할 때까지 정용여과 모드에서 작동되는 것인 단계
    를 포함하는, 교번 접선 유동(ATF) 필터를 사용하여 유가식 또는 농축 유가식 배양물로부터 세포 생성물을 수확하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수확이 500 ℓ 내지 2,000 ℓ 부피에 대하여 18시간 미만이 소요되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 수확이 6.0시간 미만이 소요되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, ATF 필터가 중공 섬유 필터를 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 필터가 공극 크기 0.1 내지 5.0 ㎛, 또는 500 내지 1,000 kD을 갖는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 세포 생성물이 모노클로날 항체, 효소, 또는 바이러스인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 정용여과 모드가 단계식 정용여과 또는 연속 정용여과인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 정용여과가 보충액으로 세포 배양 배지를 사용하는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 정용여과가 보충액으로 포스페이트 완충 염수를 사용하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 미리 결정된 부피가 출발 부피의 5% 내지 30%, 또는 출발 부피의 10% 내지 20%인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 미리 결정된 부피가 출발 부피의 50%인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 생존가능한 세포 밀도에 대한 상기 제1 값이 100e6 세포/mL인 방법.
  13. 유입구 및 배출구를 포함하는 생물반응기;
    생물반응기 유입구에 연결된, 세포 생성물을 함유하지 않는 유체 배지 공급원;
    생물반응기 배출구에 연결된 교번 접선 유동(ATF) 장치;
    ATF 장치의 배출구에 연결되고, ATF 장치로부터 유체가 나오도록 구성된 펌프; 및
    제1항의 방법을 수행하도록 배열되고 프로그램화된 제어기
    를 포함하는 시스템.
  14. 제13항에 있어서, ATF 장치가 중공 섬유 필터를 포함하는 것인 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 필터가 공극 크기 0.1 내지 5.0 ㎛, 또는 500 내지 1,000 kD을 갖는 것인 시스템.
  16. 제13항에 있어서, 제어기가 상기 미리 결정된 부피를 출발 부피의 5% 내지 30%로, 또는 출발 부피의 10% 내지 20%로 설정하도록 배열되고 프로그램화된 것인 시스템.
  17. 제13항에 있어서, 상기 미리 결정된 부피가 출발 부피의 50%인 시스템.
  18. 제13항에 있어서, 정용여과 모드에서 작동하는 ATF 장치가 단계식 정용여과 또는 연속 정용여과에 대해 프로그램화된 것인 시스템.
  19. 제13항에 있어서, 생존가능한 세포 밀도에 대한 상기 제1 값이 100e6 세포/mL인 시스템.
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