CN102471794B - 提高维生素k依赖性蛋白质的表达产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括一种或多种选自i)维生素K的还原形式和/或ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式的化合物用于在细胞培养物中表达一种或多种功能性维生素K依赖性蛋白质的用途以及用于发酵表达一种或多种维生素K依赖性蛋白质的真核细胞的方法，其中在发酵方法之前和/或期间，将一种或多种选自i)维生素K的还原形式和/或ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式的化合物加入细胞培养基。

Description

提高维生素K依赖性蛋白质的表达产量的方法
维生素K参与蛋白质中某些谷氨酸残基的羧化以形成γ-羧基谷氨酸残基(Gla-残基)。经修饰的残基位于称为Gla结构域的特定蛋白质结构域内。Gla-残基通常参与钙结合。Gla-残基是所有已知Gla-蛋白的生物活性所必需的。
在过去30年已阐明了如何将维生素K用于把Glu转化成Gla的生物化学法。在细胞内，维生素K通过维生素K环氧化物还原酶(VKOR)被电子还原成维生素K的还原形式(称为维生素K氢醌)。编码VKOR的基因(VKORC1)最近已被鉴定，并且详细地描述于Rost等人，2004((2004)Nature，427，537-541))中。随后另一种酶氧化维生素K氢醌以使Glu羧化成Gla；该酶称为γ-谷氨酰羧化酶或维生素K依赖性羧化酶(VKGC)。只有这种羧化酶能够同时将维生素K氢醌氧化成维生素K环氧化物时，羧化反应才进行；羧化和环氧化反应据认为是偶联反应。维生素K环氧化物随后被维生素K环氧化物还原酶再转变成维生素K。这两种酶包含所谓的维生素K循环(维生素K)。http: //en.wikipedia.org/wiki/Vitamin_K-cite_note-Stafford- 28#cite_note-Stafford-28。
目前，已在一级结构水平上表征了下列人含Gla蛋白质：凝血因子II(凝血酶原)、VII、IX、X、抗凝蛋白C和S及因子X靶向蛋白Z，以及骨Gla-蛋白质骨钙素、抑制钙化的基质Gla蛋白(MGP)、调节细胞生长的生长抑制特异性基因6蛋白(Gas6)以及功能仍然未知的4种跨膜Gla蛋白(TMGP)。Gas6可用作激活Axl受体酪氨酸激酶和刺激细胞增殖或阻止某些细胞的细胞凋亡的生长因子。在其功能已知的所有情况下，此类蛋白质中的Gla残基的存在显示是功能活性所必需的。多个Gla残基允许Gla-结构域经历构象变化，所述构象变化是维生素K依赖性蛋白的活性以及对磷脂膜表面的结合所必需的。
维生素K依赖性凝血蛋白质需要完全或几乎完全羧化来在钙离子存在的情况下结合膜表面。如果维生素K拮抗剂抑制γ羧化，那么羧化不全的维生素K依赖性蛋白不能形成钙依赖性结构，这导致对磷脂膜的低亲和力和较低的活性。B型血友病患者中发现的羧化不全因子IX突变体的前凝血剂活性丧失可归因于受损的钙诱导构象变化和结合磷脂小囊泡的能力的丧失。
生物技术已提供了产生低成本生物药剂产品的希望。关于凝血因子，这提供了为更广泛的血友病患者提供充分治疗的机会。不幸地，该希望主要因天然存在的生物分子的固有复杂性和多种与它们的重组蛋白质对应物在基因工程改造的细胞中的合成相关的限制而未得到满足。
本申请针对的是对产生维生素K依赖性蛋白例如因子IX或因子IX或因子VII/VIIa的方法的需要，所述蛋白已被适当加工以便它们具有活性并且对于商业生产来说具有足够的产率。为了增加维生素K依赖性凝血蛋白的可用度(以满足对出血障碍例如B型血友病的治疗的世界范围内医学需要)，提高完全功能性蛋白质的产量，在本实例中需要来自基因工程改造的细胞的因子IX。具体地，需要鉴定和补充获得基本上完全的翻译后修饰所需要的酶促活性的缺乏。
因此，存在对在宿主生物中增加维生素K依赖性蛋白的表达，特别是重组表达，从而导致表达的维生素K依赖性蛋白的分泌速率和/或活性提高的强烈需求。
在人因子IX的情况下，γ-羧化蛋白质的重组过表达显示对更高的分泌率下前肽切割和γ-羧化的限制，从而当维生素K在培养基中可过量获得时，也产生只被Gla残基部分占据的蛋白质。这导致分泌活性减小的维生素K依赖性重组蛋白变体。维生素K向培养基的加入在高表达水平上不增加因子IX活性。已显示为了引发活性因子IX而需要存在于细胞培养基中的维生素K达到5μg/ml的饱和度。低于该水平，活性因子IX从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的分泌量依赖于维生素K浓度(Kaufman，R.J.等人(1986)，J.Biol.Chem.，261，9622-9628)。
维生素K和维生素K类似物构成一组具有共同的2-甲基-1，4-萘醌结构(称为甲萘醌)的亲脂性、疏水性维生素。
维生素的维生素K族的所有成员共有甲基化的萘醌环结构，并且在于3位置连接的脂肪族侧链中变化。
植物和蓝细菌(cyanobacteria)(几乎不变地)只合成一种称为叶绿醌(phylloquinone)(也称为维生素K1)的化学形式，其具有与叶绿素中相同的植基(phytyl)侧链。
通常由肠中细菌产生的甲基萘醌类(也称为维生素K2)与叶绿醌的差异在于3-侧链通常包含重复异戊二烯基单元的聚合物而非植基链。为了命名，按照异戊二烯基单元的数目分类甲基萘醌类，该数目以后缀给出(即缩写为Mk-n的甲基萘醌-n)，一些异戊二烯基单元也可被饱和，如由前缀二氢、四氢等所标示的，并且缩写为Mk-N(H2)、Mk-N(H4)等。
普遍公认萘醌是官能团，其作用机制对于所有维生素K类是相似的。
在无细胞系统中还显示甲萘醌和还原型甲萘醌在促进γ羧化中无活性(Sadowski等人(1976)，J.Biol.Chem.第251卷，No.9pp.2770-2776)。
除了将维生素K补充到细胞培养基中外，还已尝试增加功能性维生素K的表达的其他方法。
维生素K依赖性γ-羧化酶(VKGC)的过表达在因子IX的情况下未导致蛋白质分泌增加(Rehemtulla，A.等人(1993)PNAS 90，4611-4615)。
最近一些研究小组显示，VKGC和VKOR的共表达可增加功能性维生素K依赖性蛋白的表达水平(WO 2005/030039、WO 2005/040367、WO2006/089613、WO 2006/101474、WO 2007/065173和WO 2007/075976)。
发明概述
本发明的发明者已令人惊讶地发现，通过用选自i)维生素K的还原形式和/或ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式之中的一种或多种化合物补充维生素K依赖性蛋白的细胞培养基，相应的活性维生素K依赖性蛋白的表达产率与当将相同量的所述各维生素K和/或维生素K其类似物和/或维生素K前体(但非其还原形式)加入细胞培养基时获得的表达产率相比较而言获得显著增加。
本发明的一个实施方案是维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式用于增加哺乳动物细胞中功能性维生素K依赖性蛋白的表达产率的用途。
本发明的一个实施方案涉及产生重组生物活性维生素K依赖性蛋白产物的方法，该方法包括在细胞培养基(所述培养基在表达期过程中至少在一些时间点包含维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式)中使用具有与表达所述生物活性维生素K依赖性蛋白的启动子有效连接的编码维生素K依赖性蛋白的至少一个基因的哺乳动物细胞，和收获所述维生素K依赖性蛋白产物。任选地，哺乳动物细胞系此外还包含与至少一个启动子有效连接的编码加工因子(processing factor)的基因。在优选实施方案中，维生素K依赖性蛋白产物为因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C或蛋白S。更优选地，维生素K依赖性蛋白为因子IX或因子VII。
在优选实施方案中，所述加工因子是与一个或多个启动子有效连接的核酸，所述核酸选自成对碱性氨基酸转化酶(paired basicamino acidconverting enzyme)(PACE)、维生素K依赖性环氧化物还原酶(VKOR)、维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶(VKGC)和其组合。更优选，所述加工因子蛋白包括VKOR和VKGC。优选地，所述基因中的至少一个被过表达。
本发明因而包括选自i)维生素K的还原形式和/或ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式之中的一种或多种化合物用于在细胞培养物中表达一种或多种功能性维生素K依赖性蛋白的用途，以及用于发酵表达一种或多种维生素K依赖性蛋白的真核细胞的方法，其中在发酵方法之前和/或在发酵方法过程中将选自i)维生素K的还原形式和/或ii)维生素K类似物的还原形式和/或iii)维生素K前体的还原形式之中的一种或多种化合物加入细胞培养基。
本发明还包括维生素K和/或维生素K类似物和/或维生素K前体的还原形式用于在发酵中增加细胞的存活力的用途。
附图概述
图1：前体因子IX的维生素K依赖性羧化。
图2：维生素K1、K2和甲萘醌的化学式。
图3：亚硫酸氢钠甲萘醌的还原。
图4：实验2中反应器A4和B4的总活细胞数目曲线。
图5：实验3中4个反应器的活细胞密度曲线。
图6：在增加滴度的MSB和rMSB下细胞的存活力随时间的关系。
图7：在增加滴度的MSB和rMSB下活细胞密度数据。
发明详述
虽然所描述的实施方案代表了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说应理解，可进行改变而不背离本发明的要旨。本发明的范围因此只由所附权利要求书确定。
本发明的优选实施方案涉及维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式用于增加细胞培养物中功能性维生素K依赖性蛋白的表达产率的用途。将维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式添加至细胞培养基中，在所述培养基中其被细胞吸收。
优选地，使用水溶性的维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式。然而，通过胞吞作用和/或特异性受体，不溶于水的维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式也可被细胞吸收。
本发明的一个实施方案涉及维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式用于在细胞培养物中表达功能性维生素K依赖性蛋白的用途，其中相应功能性维生素K依赖性蛋白的表达产率与当将相同量的相应维生素K和/或维生素K类似物和/或维生素K前体但非其还原形式以相同的方式加入细胞培养基时获得的表达产率相比较而言得到增加。本发明的优选实施方案涉及用于增加哺乳动物细胞中生物活性维生素K依赖性蛋白的产率的方法。优选对所述细胞进行基因工程改造。
针对因子IX和因子VII的产生描述了本发明的实施方案。然而，所述公开的方法适用于所有维生素K依赖性蛋白：凝血因子II(凝血酶原)、VII、IX和X、抗凝蛋白C和S及因子X靶向蛋白Z，以及骨Gla-蛋白骨钙素、抑制钙化的基质Gla蛋白(MGP)、调节细胞生长的生长抑制特异性基因6蛋白(Gas6)以及所述4种跨膜Gla蛋白(TMGP)。
在本发明的一个优选实施方案中，维生素K依赖性蛋白在表达期期间的某些时间点上在含有维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式的细胞培养基中表达。
维生素K和维生素K类似物包括一组具有共同的2-甲基-1，4-萘醌结构(称为甲萘醌)的亲脂性、疏水性维生素。
本发明的维生素K族的所有成员共有甲基化的萘醌环结构，并且在于3-位置上连接的脂肪族侧链中具有变化。
植物和蓝细菌(几乎不变地)只合成一种称为叶绿醌(也称为维生素K1)的化学形式，其具有与叶绿素中相同的植基侧链。
通常由肠中细菌产生的甲基萘醌类(也称为维生素K2)与叶绿醌的差异在于3-侧链通常包含重复异戊二烯基单元的聚合物而非植基链。为了命名，按照异戊二烯基单元的数目分类甲基萘醌类，该数目以后缀给出(即缩写为Mk-n的甲基萘醌-n)，一些异戊二烯基单元也可被饱和，如由前缀二氢、四氢等所标示的，并且缩写为Mk-n(H2)、Mk-n(H4)等。
通常认识到萘醌是官能团，其作用机制对于所有维生素K类是相似的。
在部分纯化的肝微粒体酶制剂中测量叶绿醌和几种甲基萘醌类用作VKGC的辅因子的相对能力(Buitenhuis等人，Biochim.Biophys Acta(1990)1034：170-175)。甲基萘醌类的活性随3-侧链长度变化而变化，并且随着长度增加而活性减小。
如本文中所使用的，术语“维生素K”包括：
a)维生素K1(叶绿醌，参见图2)，包括其各种盐，如维生素K1二磷酸盐(2-甲基-3-植基-1，4-萘氢醌-1，4-二磷酸盐)、维生素K1二乙酸盐(2-甲基-3-植基-1，4-萘氢醌-1，4-二乙酸盐)和维生素K1二硫酸盐：(2-甲基-3-植基-1，4-萘氢醌-1，4-二硫酸盐)。
b)具有可变数目(n)的维生素K2(甲基萘醌类，参见图2)
c)维生素K类似物
d)维生素K前体如甲萘醌(参见图2)、甲萘氢醌二乙酸盐(2-甲基-1，4-萘氢醌二乙酸盐)、甲萘氢醌二磷酸盐(2-甲基-1，4-二羟基萘-双(二氢磷酸)四钠六水合物)、甲萘氢醌二丁酸盐：(2-甲基-1，4-二羟基萘二丁酸盐)、甲萘氢醌二硫酸盐：2-甲基-1，4-二羟基萘双(硫酸氢)二钠盐、甲萘醌烟酰胺亚硫酸氢盐(2-甲基-1，4-二羟基萘双(硫酸氢)二钠盐和甲萘多昔：(3-甲基-4-氧-1(4H)-萘乙二烯)氨基]氧基]-醋酸铵盐。
如本文中所使用的，“维生素K类似物”包含任何其他化合物，只要所述化合物包含2-甲基-1，4-萘醌环结构并且可在维生素K依赖性蛋白的谷氨酸残基向Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1即可。
如本文中所使用的，“维生素K前体”包括任何其他化合物，所述化合物在被哺乳动物细胞吸收后可被所述哺乳动物细胞转化成化合物，所述化合物包含甲基化的萘醌环结构，并且可在维生素K依赖性蛋白的谷氨酸残基至Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1即可，例如甲萘醌。
如本文中所使用的，“维生素K的还原形式和/或生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式”意指任何化合物，包括如上定义的维生素K、维生素K类似物和维生素K前体的不同形式的氢醌形式，所述化合物可被接受为将维生素K依赖性蛋白中的谷氨酸残基转化成Gla-残基的羧化反应中VKGC的共底物而无需其他还原步骤。
维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式必须在目的维生素K依赖性蛋白的表达期过程中一些时间点上存在于细胞培养基中。本发明包括表达维生素K依赖性蛋白的方法，其中细胞培养基中包含单一的维生素K的还原形式或单一的维生素K类似物的还原形式或单一的维生素K前体的还原形式或化合物的这些种类中每一种类的超过一个成员以及化合物的这些种类中每一个种类的一个或多个成员的组合。
还原醌类的一个方法是利用锌粉和氯化锌或锌粉和氢离子的作用。
已知在酸性pH下，优选在2至4.5的pH下的抗坏血酸(Isaacs等人(1997)J.Chem.Soc.Perkin Trans.2，第1465至1467页)具有有限的还原醌类的能力。
本发明的一个实施方案是通过使用锌粉与约pH5.3下的抗坏血酸的组合以利用锌还原MSB来产生rMSB的新型方法。抗坏血酸用作氢离子的来源和帮助使rMSB保持还原形式。
本发明的其他实施方案涉及产生重组生物活性维生素K依赖性蛋白产物的方法，所述方法包括在细胞培养基中使用具有与表达所述生物活性维生素K依赖性蛋白的启动子有效连接的编码维生素K依赖性蛋白的基因的哺乳动物细胞和收获维生素K依赖性蛋白产物，所述培养基在表达期过程中至少在某些时间点上包含维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体蛋白的还原形式。任选地，此外细胞系包含与至少一个启动子有效连接的编码加工因子的至少一个基因。
如本文中所使用的，“功能性”是指维生素K依赖性蛋白，当从血浆分离时，优选具有相应维生素K依赖性蛋白的至少10％，优选至少25％的生物活性。例如，当表达因子IX时，参照来源于人血浆的因子IX标准例如(CSL Behring)测定其功能性。相应维生素K依赖性蛋白标准的生物活性被视为100％。相应维生素K依赖性蛋白优选具有相应维生素K依赖性蛋白标准的生物活性的至少10％。优选地，根据本发明的实施方案的相应维生素K依赖性蛋白具有相应维生素K依赖性蛋白标准的生物活性的至少25％，更优选相应维生素K依赖性蛋白标准的生物活性的至少50％。
本发明的另一个方面是通过在本发明的方法或过程中使用维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式，维生素K依赖性蛋白的比活性对维生素K依赖性蛋白的抗原含量的比率与当将相同量的所述各维生素K和/或维生素K类似物和/或维生素K前体但非其还原形式以相同方式加入细胞培养基时获得的维生素K依赖性蛋白的比活性对相同功能性维生素K依赖性蛋白的维生素K依赖性蛋白的抗原含量的比率相比较而言，优选增加至少15％或优选至少25％，或更优选至少50％，或甚至更优选至少75％或至少100％。
以非限定性实例为例，在维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式存在的情况下，根据本发明表达的维生素K依赖性蛋白因子IX具有至少0.7，优选至少1，更优选至少1.5或甚至更优选至少2的活性/抗原比。
本发明的另一个方面是通过在本发明的方法或过程中使用维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式，维生素K依赖性蛋白的细胞密度比活性生产率(productivity)与当将相同量的所述各维生素K和/或维生素K类似物和/或维生素K前体但非其还原形式以相同方式加入细胞培养基时获得的相同功能性维生素K依赖性蛋白的细胞密度比活性生产率相比较而言，增加至少25％或优选至少50％或更优选至少75％。
同样地作为非限定性实例，在维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式存在的情况下根据本发明表达的维生素K依赖性蛋白因子IX具有至少0.22U/106个细胞/天或优选至少U/106个细胞/天或至少0.37U/106个细胞/天的细胞比活性生产率。
在某些实施方案中，通过用对于如WO 00/54787(将其通过引用并入本文)中论述的γ羧化酶具有更低的亲和力的前肽序列替代天然前肽序列来增加γ-羧化作用。有用的前肽序列包括异源维生素K依赖性蛋白的野生型序列或前肽序列的改变形式或其组合。维生素K依赖性蛋白的前肽序列是指导该蛋白质的γ羧化的酶的识别元件。除非它们包含高百分比的γ羧化部分，否则维生素K依赖性蛋白不具有完全功能性。因此，当产生此类蛋白质的重组变型时，重要地实施机制以确保所述蛋白质的完全γ羧化。
几个前肽序列的序列比对示于WO 00/54787的图3中。因此，在本发明中有用的前肽是具有图3中显示的序列的那些前体，其中显示了几个有用的前肽的18个氨基酸序列连同此类前肽对于γ羧化酶的相对亲和力。可通过修饰凝血酶原或蛋白C上氨基酸-9或-13的任一个来产生低亲和力前肽。优选的修饰包括位置-9上的Arg或His残基的置换和位置-13上的Pro或Ser残基的置换。其他优选的嵌合蛋白质包括选自改变的因子IX、因子X、因子VII、蛋白S、蛋白C和凝血酶原或与对于所选择的前肽序列来说是非天然的成熟维生素K依赖性蛋白组合的未改变前肽之中的前肽。
术语“加工因子”是包括促进功能性维生素K依赖性蛋白的形成的任何蛋白质、肽、非肽辅因子、底物或核酸的广义术语。此类加工因子的实例包括但不限于PACE、VKOR和VKGC。
如本文中所使用的，术语″PACE″是最初从人肝细胞系分离的成对碱性氨基酸转化(或切割)酶的缩写词，其为枯草杆菌蛋白酶样内肽酶，即切割前肽的酶，其展示对于蛋白质在碱性残基例如-Lys-Arg-、-Arg-Arg或-Lys-Lys-处进行切割的特异性。PACE和需要加工以产生成熟蛋白质的前蛋白的共表达导致成熟蛋白的高水平表达。此外，PACE与需要γ-羧化以获得生物活性的蛋白质的共表达允许真核生物(优选哺乳动物)细胞中功能性的生物活性成熟蛋白质的增加的产量的表达。
维生素K依赖性环氧化物还原酶(VKOR)对于维生素K依赖性蛋白是重要的，因为在其为辅因子的反应过程中所述维生素K被转化成维生素K环氧化物。人饮食中维生素K的量是有限的。因此，必须通过VKOR将维生素K环氧化物转化回维生素K以防止耗尽。因此，与VLOR共转染为维生素K依赖性酶例如维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶(VKCG)的适当功能发挥提供了充足的维生素K。维生素K依赖性VKCG的适当功能发挥是维生素K依赖性凝血因子的Gla-结构域的适当γ-羧化所必需的。
维生素K依赖性γ-谷氨酰羧化酶(VKGC)是参与维生素K依赖性蛋白的翻译后修饰的酶。VKGC将羧基掺入谷氨酸以在前肽的约40个残基内修饰维生素K依赖性蛋白的多个残基。人维生素K依赖性γ谷氨酰羧化酶的cDNA序列由美国专利5,268,275(将所述美国专利通过引用并入本文)进行了描述。
载体是具有在宿主中复制的能力(通常由复制起始点赋予的)和帮助识别转化体的选择基因的DNA构建体。载体在本文中用于扩增编码维生素K依赖性蛋白的DNA和/或表达编码维生素K依赖性蛋白的DNA。表达载体是可复制的DNA构建体，其中编码维生素K依赖性蛋白的DNA序列与能够实现维生素K依赖性蛋白在适当的宿主中表达的适当控制序列有效连接。对于此类控制序列的需要将视所选择的宿主和所选择的转化方法而变化。通常，控制序列包括转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译的终止的序列。
载体包括质粒、病毒(例如腺病毒、巨细胞病毒)、噬菌体和DNA片段，所述载体能够通过重组整合入宿主基因组。载体独立于宿主基因组而复制和起作用，或在某些情况下可以整合入基因组本身。表达载体应当包含与待表达的基因有效连接的并且可在宿主生物中发挥作用的启动子和RNA结合位点。
当DNA区域在功能上彼此相关时，它们是有效连接或可操作地地关联的。例如，如果启动子控制序列的转录，那么其与编码序列有效连接；或如果核糖体结合位点被这样放置以允许翻译，则其与编码序列有效连接。转化的宿主细胞是已使用重组DNA技术，用一个或多个包含一个或多个编码一种或多种维生素K依赖性蛋白载体的基因的载体所转化或转染的细胞。
本发明的实施方案涉及为细胞提供加工维生素K依赖性蛋白的必需酶和辅因子，以便获得更高产量的生物活性维生素K依赖性蛋白。当由重组细胞产生足够水平的完全功能性维生素K依赖性蛋白时，避免了设计用以从想要的产品中除去无用的、部分修饰的或未修饰的维生素K依赖性蛋白的冗长纯化步骤。这降低了生产成本并且消除了可能对于患者具有不想要的副作用的无活性物质。
在优选实施方案中，用于通过与PACE、VKGC和/或VKOR共表达来产生维生素K依赖性蛋白的方法可包括下列技术。首先，可将包含超过一种蛋白质例如PACE和维生素K依赖性蛋白的编码序列的单个载体插入所选择的宿主细胞。可选择地，可将编码维生素K依赖性蛋白+一种或多种其它蛋白质的两个或更多个分开的载体插入宿主。当在用于所选择的宿主细胞的适当条件下培养时，产生所述两种或更多种蛋白质并且相互作用以将前蛋白切割和修饰成成熟蛋白质。
另一个选择是使用两种转化的宿主细胞，其中一种宿主细胞表达维生素K依赖性蛋白，并且另一种宿主细胞表达如下将被分泌入培养基的蛋白质中的一种或多种：PACE、VKGC和/或VKOR。可在允许重组维生素K依赖性蛋白和共表达的重组蛋白质的表达和分泌或释放(包括通过细胞外PACE切割成成熟形式和N-末端谷氨酸的γ羧化)的条件下共培养此类宿主细胞。在该方法中，优选PACE蛋白缺乏跨膜结构域以便其分泌进入培养基。
在某些情况下，可能期望相对于另一基因而言具有多个拷贝、2或更多个拷贝的表达维生素K依赖性蛋白的基因，或反之亦然。这可以以多种方式实现。例如，可使用分开的载体或质粒，其中包含维生素K依赖性蛋白编码多核苷酸的载体具有比包含另一多核苷酸序列的载体而言更多的拷贝数，或反之亦然。在该情况下，理想的是在2个质粒上具有不同的选择标记，以便确这些保质粒在宿主中的连续维持。可选择地，可将一个或两个基因整合入宿主基因组，并且可使所述基因之一与扩增基因(例如，dhfr或金属硫蛋白基因之一)连接。
可选择地，可使用两个转录调控区，所述调控区具有不同转录起始率，提供增加的维生素K依赖性蛋白的表达或相对于维生素K依赖性蛋白而言任何其他加工因子蛋白的表达。作为另一选择，可使用不同的启动子，其中一个启动子提供低水平的维生素K依赖性蛋白的组成型表达，而第二启动子提供高水平的或诱导型的另一产物的表达。许多种启动子对于所选择的宿主细胞是已知的，并且可被本领域技术人员容易地选择和用于本发明，例如CMV、MMTV、SV 40或SRa启动子，它们均为公知的哺乳动物启动子。
任选地通过过表达PACE、VKOR和/或VKGC中的一种或多种和/或通过修饰Gla区域以使γ-羧化最大化来使生物活性的维生素K依赖性蛋白例如因子IX或因子VII/VIIa的产量最大化。即，以充足的量表达限速成分以便整个系统运行产生商业上可行的量的维生素K依赖性蛋白。
适当的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞例如哺乳动物细胞和昆虫细胞。来源于多细胞生物的细胞是特别适合的用于重组维生素K依赖性蛋白合成的宿主，哺乳动物细胞是特别优选的。在细胞培养中增殖此类细胞已变成常规方法(Tissue Culture，Academic Press，Kruse和Patterson，编者(1973))。有用的宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系和WI138、HEK 293、BHK、COS-7、Per.C6、HepG2、HeLa、Vero、COS、CV以及MDCK细胞系。一个优选的细胞系是CHO-K1或CHO-S。
此类细胞的表达载体通常包括(必要时)复制起点、位于编码待表达的维生素K依赖性蛋白的DNA上游并且与其有效连接的启动子连同核糖体结合位点、RNA剪接位点(如果使用含内含子的基因组DNA)、多腺苷酸化位点和转录终止序列。
复制始点可通过构建载体以包括外源起点来提供，例如其可来源于SV 40或其他病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)来源，或可由宿主细胞染色体复制机制提供。如果将载体整合入宿主细胞染色体，那么后者通常是足够的。
不使用包含病毒复制起点的载体，而是可利用选择标记和维生素K依赖性蛋白的DNA通过共转化的方法来转化哺乳动物细胞。适当的选择标记的实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)或胸苷激酶。
一般地，如果将除哺乳动物细胞外的细胞用于表达维生素K依赖性蛋白时，可能必需还提供编码目的蛋白质的生物功能所需的翻译后修饰所必需的蛋白质的其他基因。
本发明的克隆基因可编码任何物种来源，包括小鼠、大鼠、兔、猫、猪和人，但优选编码人来源的维生素K依赖性蛋白。还涉及可与编码本文中公开的蛋白质的DNA杂交的编码维生素K依赖性蛋白的DNA。
此类序列的杂交可在减小的严格度的条件或甚至严格条件(例如，由在标准原位杂交测定中针对编码本文中公开的维生素K依赖性蛋白的DNA的60℃或甚至70℃下0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠，0.1％SDS的洗涤严格度代表的条件。参见J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第2d版，1989Cold Spring Harbor Laboratory))下进行。
提及的用于在细胞培养中表达维生素K依赖性蛋白的方法是悬浮细胞培养法，其中存在3个主要选择：1.灌注法和2.分批法以及3.充排法(draw-fill processes)。
1.灌注法：
在悬浮细胞-灌注法中，将细胞接种在装有培养基优选不存在动物来源成分的种子培养容器中并且进行增殖直至细胞达到最低密度。随后，将扩增的种子培养物转移至装有不存在动物来源成分的培养基的大规模培养容器内并且进行增殖直至至少达到预定的细胞密度。
在该时期中，将细胞以悬浮形式生长以允许培养容器内的细胞数量增加至预定或临界值。通过用新鲜培养基连续灌注培养容器来实施培养基更换。
灌注的培养基的量取决于细胞密度，并且通常可以为10-300％，优选10％至95％，25％至80％的罐体积/天(24小时)。
当细胞密度达到适合于启动生产期的值时，每24小时更换罐中60-95％的罐培养基，优选80％的罐培养基。也优选地将80％的培养基更换用于生产期。
在生长期中，增殖培养物直至细胞达到一定密度。达到该密度后，培养物进入生产期。
也可在该点上改变设置点，将其设置在适合产生相应维生素K依赖性蛋白的值上。优选连续进行培养基灌注。可以每确定的时期内培养基的百分比罐体积的培养基来表示培养基的流速。培养基灌注可以为10至200％的罐体积/10-48小时，优选地，培养基灌注为90％/10-48小时，更优选80％罐体积/24小时。
可使用许多细胞保留装置来实现培养容器内的细胞保留。可将下列成套装置用于该方法。
(1).外置沉降头(External settling head)
(2).内置沉降头(Internal settling head)
(3).连续离心机
(4).内置或外置旋转过滤器(spin filter)
(5).外置过滤器或中空纤维滤注(hollow fibre cartridge)
(6).超声细胞分离装置
(7).培养容器内部的一段管。
2.分批法：
2.1简单分批法：
在简单分批法中，将细胞接种至装有不存在动物来源成分的培养基的种子培养容器中并且增殖直至细胞达到最低密度。随后将扩增的种子培养物转移至装有培养基(优选不存在动物来源成分)的大规模培养容器中。然后操作培养容器直至培养基中的营养物被耗尽。
必须确定收获的时间。操作常规分批法直至所有营养物被耗尽。然而，这通常引起细胞裂解，这可对产物造成损害或可对纯化引起问题。
2.2补料分批法：
如先前提到的，简单分批法包括利用细胞接种培养容器和操作培养罐直至培养基中的营养物被耗尽。分批法例如该方法可通过将营养物的浓缩液补充至罐中来进行扩展。这延长了处理时间并且最终导致培养容器内相应维生素K依赖性蛋白的产量增加。
通常，培养物中最至关重要的营养物是葡萄糖浓度。因此，可将进料的控制和起始与该营养物的水平联系起来。当葡萄糖浓度下降至低于临界值时，开始进料，并且加入的进料量足以使葡萄糖浓度升回至该临界值。
如在简单分批中一样，必须将收获的时间确定为罐的最长可能操作与细胞裂解和产品质量降低的风险之间的平衡。
进料的添加方法也是可变的。可以以单脉冲形式(每天1次、2次、3次等)加入进料或可在整个24小时期间逐渐进料。必须确定收获的时间。操作常规或简单分批直至所有营养物耗尽。然而，因毒性代谢产物的积累，该方法不能无限持续。这导致细胞生存力的减少和最终细胞裂解。这可引起对产物的破坏或对随后的纯化产生问题。
3.充排法：
简单draw-fill法与重复的分批发酵十分相似。在分批发酵中，细胞生长在培养容器中并且在运行结束时收获培养基。在充排法中，在任何营养物耗尽之前收获培养容器。与从培养瓶除去所有内容物，其中仅除去一定比例的罐体积(通常是80％的罐体积)。
在收获后，将相同体积的新鲜培养基加回容器。随后使细胞在容器中再生长一次并且在一定天数后进行另外80％的收获。在重复的分秕法中，可将收获后留在容器中的细胞用作下一批次的接种物。
可以两个阶段操作所述方法，第一阶段与简单分批法一样操作。在第一次收获后，再次如简单分批法一样操作培养容器；然而，由于起始细胞密度更高，分批的长度比第一分批更短。可无限地继续这些短的重复的分批阶段″。
可在宽范围的循环时间和宽范围的充排体积内操作培养容器。
在实施本发明时，培养的细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为已建立的哺乳动物细胞系，包括但不限于CHO(例如，ATCC CCL 61)、COS-1(例如，ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)和HEK293(例如，ATCC CRL 1573；Graham等人，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)细胞系。
一种优选的CHO细胞系是可从ATCC获得的CHO K1细胞系。另一种优选的CHO细胞系是可从Invitrogen获得的CHO-S细胞系。
其他适当的细胞系包括但不限于大鼠Hep I(大鼠肝瘤；ATCC CRL1600)、大鼠Hep II(大鼠肝瘤；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)；DUKX细胞(CHO细胞系)(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)(DUKX细胞也称为DXB11细胞)和DG44(CHO细胞系)(Cell，33：405，1983，和Somatic Cell and Molecular Genetics12：555，1986)。也有用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤细胞和骨髓瘤与其他细胞的融合细胞。在某些实施方案中，所述细胞可以是突变型细胞或重组细胞，例如表达在性质或数量上与它们所源自的细胞类型不同的酶谱的细胞，所述酶催化蛋白质的翻译后修饰(例如，糖基化酶例如糖基转移酶和/或糖苷酶或加工酶例如前肽)。
在某些实施方案中，用于实施本发明的细胞能够在悬浮培养物中生长。如本文中所使用的，能够悬浮的细胞(suspension-competent cell)是可悬浮生长而不产生大的坚硬的聚集体的细胞，即为单分散或在疏松聚集体(每个聚集体只有少数细胞)生长的细胞。能够悬浮的细胞包括但不限于悬浮生长而无需适应或处理的细胞(例如，造血细胞或淋巴样细胞)和已通过使贴壁依赖性细胞(attachment dependent cell)(例如，上皮或成纤维细胞)逐步适应悬浮生长的而变得能够悬浮生长的细胞。
在某些实施方案中，用于实施本发明的细胞是粘着细胞(也称为锚着依赖性或附着依赖性细胞)。如本文中所使用的，粘着细胞是需要将它们自己粘附或锚定至适当的表面以进行增殖和生长的细胞。基于微载体的发酵是这样的实施方案的实例。
本发明包括将哺乳动物细胞培养在优选不存在动物来源成分的培养基中。如本文中所使用的，“动物来源的”成分是在完整动物(intactanimal)中产生的任何成分(例如，从血清分离和纯化的蛋白质)或通过使用完整动物中产生的成分所产生的成分(例如，通过使用从动物产生和纯化的酶水解植物来源材料制备的氨基酸)。相反地，具有动物蛋白质的序列(即，具有动物的基因组来源)但在缺乏完整动物中产生的以及从其分离和纯化的成分的培养基中于细胞培养物中(例如，在重组酵母或细菌细胞中或在已建立的连续哺乳动物细胞系(重组或非重组的)中)体外产生的蛋白质不是″动物来源的″成分(例如，在酵母或细菌细胞中产生的胰岛素，或在已建立的哺乳动物细胞系例如CHO、BHK或HEK细胞中产生的胰岛素或在Namalwa细胞中产生的干扰素)。例如，具有动物蛋白质的序列(即，具有动物的基因组来源)但在缺乏动物来源成分的培养基中于重组细胞中产生的蛋白质(例如，在酵母或细菌细菌中产生的胰岛素)不是“动物来源的”成分。因此，缺乏动物来源成分的细胞培养基是可包含重组产生的动物蛋白质的培养基；然而，这样的培养基不包含例如动物血清或从动物血清纯化的蛋白质或其他产物。这样的培养基可以例如包含一种或多种来源于植物的成分。
可使用缺乏动物来源成分的任何细胞培养基，所述培养基在本发明的条件下支持细胞生长和维持。通常，所述培养基包含水、摩尔渗透压(osmolality)调节剂、缓冲剂、能量来源、氨基酸、无机或重组铁来源、一种或多种合成或重组生长因子、维生素及辅因子。缺乏动物来源成分和/或蛋白质的培养基可从商业提供商例如Sigma、SAFC、Invitrogen和Gibco获得。
培养容器可以是例如其中通过常规叶轮类型获得搅拌的常规搅拌釜式反应器(CSTR)，或其中通过从容器底部引入空气来获得搅拌的气升式反应器(airlift reactor)。控制在指定限度内的参数有pH、溶解氧张力(DOT)和温度。pH可通过例如改变顶部空间气体和/或喷雾器中的CO2浓度以及需要时通过向培养液体中添加碱来进行控制。
溶解氧张力可以通过例如用空气或纯氧或其混合物鼓泡来维持。温度控制介质是水，必要时进行加热或冷却。水可通过围绕容器的套或通过浸在培养物中的蛇形管。
在从培养容器取出培养基后，可将其进行一个或多个处理步骤以获得所需的蛋白质，所述处理步骤包括、不限于亲和层析、疏水相互作用层析；离子交换层析；大小排阻层析；电泳方法(例如，制备性等电聚焦(IEF)、差异溶解度(differential solubility)(例如，硫酸铵沉淀)或提取等。通常参见，Scopes，Protein Purification，Springer-Verlag，New York，1982；和Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989。
可在任何适当的发酵容器中，利用生长培养基和在适合于由如上所述选择的特定宿主细胞表达维生素K依赖性蛋白的条件下进行培养。在期望的目的维生素K依赖性蛋白的表达期过程中某些点处，可将维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式包含在细胞培养基中。优选所述维生素K的还原形式和/或维生素K类似物的还原形式和/或维生素K前体的还原形式在整个生长和表达期过程中存在。在优选实施方案中，可从培养基中直接收集维生素K依赖性蛋白，或者裂解宿主细胞和从其收集维生素K依赖性蛋白。在优选实施方案中，随后可按照已知的技术进一步纯化维生素K依赖性蛋白。
可利用多种生物化学和色谱方法浓缩和纯化在上述类型的分泌细胞的培养基中积累的重组维生素K依赖性蛋白，所述方法包括利用所需蛋白质与细胞培养基中其他物质之间的大小、电荷、疏水性、溶解性、特异亲和力等的差异的方法。
作为一般提议，根据本发明产生的重组蛋白质的纯度优选为本领域技术人员已知导致所述蛋白质的最佳活性和稳定性的适当纯度。例如，当重组蛋白质为因子IX时，所述因子IX优选具有超高纯度。
优选，将所述重组蛋白经历多个层析纯化步骤，例如亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、染料层析(dye chromatography)、羟磷灰石层析、大小排阻层析和优选免疫亲和层析，以浓缩所需蛋白质和除去在制造、贮存和/或使用过程中引起重组蛋白质的片段化、激活和/或降解的物质。优选通过纯化除去的此类物质的举例说明性实例包括其他蛋白质污染物，例如修饰酶如PACE/弗林蛋白酶、VKOR和VKGC；蛋白质，例如宿主细胞蛋白质，其在重组蛋白质生产过程中被从生产细胞释放至组织培养基中；非蛋白质污染物例如脂质；和蛋白质与非蛋白质污染物的混合物，例如脂蛋白类。用于维生素K依赖性蛋白的纯化方法在本领域内是已知的。例如，参见美国专利5,714,583，将其通过引用并入本文。
为了使病毒污染的理论风险降至最低，可在方法中包括额外步骤，所述步骤允许使病毒有效失活或消除。此类步骤例如是液体或固体状态下的加热处理，利用溶剂和/或去垢剂的处理，可见或紫外光谱的辐照，γ-辐射或纳米过滤。
FIX和其他维生素K依赖性凝血因子的基因序列是已知的和可获得的，例如因子II(登录号NM_000506)、因子VII(登录号NMJH9616)、FIX(登录号NM_000133)和因子X(登录号NM_000504)。
可将如本发明中描述的维生素K依赖性蛋白配制成用于治疗用途的药物制剂。可将纯化的蛋白质溶解在常规生理相容性缓冲剂水溶液(可以任选地向所述缓冲液中加入药物赋形剂)中以提供药物制剂。
此类药物载体和赋形剂以及适当的药物制剂在本领域内是公知的(参见例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptidesand Proteins”，Frokjaer等人，Taylor & Francis(2000)或“Handbookof Pharmaceutical Excipients”，第3版，Kibbe等人，Pharmaceutical Press(2000))。具体地，可以以冻干或稳定的液体形式配制包含本发明的蛋白质变体的药物组合物。可利用多种本领域内已知的方法冻干蛋白质变体。可在使用前通过加入一种或多种药学上可接受的稀释剂例如无菌水或无菌生理盐水溶液来重建冻干制剂。
利用任何制药上适当的施用方法上将组合物制剂递送至个体。多种递送系统是已知的并且可用于通过任何方便的途径施用组合物。优选地，全身性施用本发明的组合物。为了进行全身性使用，按照常规方法将本发明的蛋白质配制用于胃肠外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、大脑内、肺内、鼻内或经皮肤)或肠内(例如，口服、经阴道或经直肠)递送。最优选的施用途径是静脉内和皮下施用。可通过输注连续地或通过单次快速静脉注射施用制剂。某些制剂包含缓释系统。
以治疗有效剂量给患者施用本发明的插入蛋白质，所述治疗有效剂量意指足以产生所需效果，预防或减轻待治疗的状况或适应症的严重性或传播而未达到产生不可耐受的有害副作用的剂量。确切的剂量取决于许多因素例如适应征、制剂、施用模式，并且必须针对每一个相应的适应征在临床前和临床试验中进行确定。
可将本发明的药物组合物单独地或与其他治疗剂组合施用。可包含所述试剂作为相同药物的部分。
实施例
实施例1：因子IX构建体的克隆
将人凝血因子IXcDNA符合读框地克隆至人白蛋白cDNA的5’，两个cDNA通过FIX来源的连接子序列分隔。FIX与白蛋白之间的该连接子序列来源于参与FIX激活的内源FIX序列，从而使得能够利用激活FIX的相同酶(FXIa或FVIIa/TF)切割融合蛋白。
所述FIX序列在位点148上利用苏氨酸(已知的Ala/Thr多态性位点上的最普遍的表型)并且包含P-3V突变以最优化前肽切割(不存在于分泌的产物中)。白蛋白信号肽替代了FIX的信号肽并且所得的cDNA序列经密码子最优化以进行高效的哺乳动物细胞表达。蛋白质编码序列在5’末端侧翼连接HindIII限制位点和共有Kozac序列以及在3’末端侧翼连接EcoRI限制位点。核苷酸为SEQ ID NO：1[信号序列bp 1-60，前肽bp 61-123)、FIX(bp 124-1368)、连接子bp 1369-1422)、白蛋白(bp1423-3180)]，并且所得的rIX-FP蛋白质的氨基酸序列为SEQ IDNO：2[FIX序列(aa 1-415)、连接子序列(aa 416-433)；白蛋白序列(aa 434-1018)]。
将rIX-FP序列克隆入Lonza GSTM表达载体pEE12.4内，并且将人PACE/弗林蛋白酶丝氨酸酶蛋白cDNA克隆入Lonza GSTM表达载体pEE6.4。PACE/弗林蛋白酶是高表达细胞系中前肽序列的高效切割所必需的。将处于单个CMV启动子的控制之下的rIX-FP和PACE/弗林蛋白酶cDNA组合以产生最终的双基因构建体。
实施例2：克隆A2和A5的转染和选择
使rIX-FP-PACE/弗林蛋白酶构建体电穿孔进入CHOK1SV细胞，利用商业化的无谷氨酰胺培养基在96孔板中选择集落。随后就FIX表达和活性筛选所获得的集落，选择两个具有所需表达/活性特征谱的克隆(A2和A5)进行进一步开发。
实施例3：还原型甲萘醌亚硫酸氢盐(rMSB)的产生
所述方法包括使用抗坏血酸的水溶液和锌粉的催化加成原位还原亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)。在抗坏血酸和痕量Zn存在的情况下，所得的过滤的反应混合物包含MSB和两种相应的异构还原产物(在图3中显示为No.2和No.3，还原型维生素K)。该滤液混合物用作终产物混合物。
将抗坏血酸(12.75g)在具有适合塞子(stopper)的200mL量筒中溶解在脱气的Milli Q水(100mL)中。
将亚硫酸氢钠甲萘醌(10.00g)在100mL烧杯中溶解在脱气的Milli Q水(50mL)中，加入抗坏血酸溶液中。用2x20mL脱气的MilliQ水将烧杯漂洗2次，倒入200mL量筒中。用脱气的Milli Q水将所得的抗坏血酸/亚硫酸氢钠甲萘醌配制成200mL，在室温下通过翻转反应容器来混合，进行10分钟。
按照教科书：实用有机化学(Practical Organic Chemistry)；Arthur Israel Vogel，A.R.Tatchell，B.S.Furnis.[年，编者]制备活化锌。简而言之，向50mL聚丙烯管中的40g锌粉加入15mL 10％v/v盐酸。振荡混合物，使其静置2分钟。将混合物转移至500mL Pyrex烧杯，用Milli Q水洗涤数次。这也包括用MilliQ水充分淘洗以除去细粉。将经漂洗的活化锌悬浮于Milli Q水中，转移至过滤器，在所述过滤器中将其捕获在0.45μmGV膜上。用50mL HPLC级乙腈洗涤锌数次，然后在旋转蒸发器上于60℃下干燥1.5小时。将干燥的活化锌在氩气下贮存于Pyrex瓶中。
将活化锌粉末(4.73g)加入所述抗坏血酸/亚硫酸氢钠甲萘醌溶液内，通过持续轻轻翻转量筒25至30分钟进行混合。
完成后，将溶液在真空下通过0.22μmGV膜过滤。随后将滤液转移至无菌瓶中，用氩气冲洗，然后用箔覆盖以保护免受光照并且于-70℃下贮存。将该滤液加入生物反应器。
预期还原的MSB在某种程度上是不稳定的。因此当添加至生物反应器时rMSB的实际浓度可能比宣称的浓度略低(参见下列分析数据)。因此，如本发明中所使用的，rMSB的宣称浓度应当被理解为相应于用于如实施例3中所述产生rMSB的实际MSB浓度的标称浓度(nominalconcentration)。
还原型MSB的测定
通过偶联电喷雾电离质谱(ESI-MS)的反相HPLC测定还原型MSB。
使用Merck Supersher RP-Select B(4.0x75mm)柱子，利用10mM醋酸铵缓冲液作为缓冲液A和利用95％乙腈、10mM醋酸铵作为缓冲液B来完成HPLC分离。
使用下列梯度。
将亚硫酸氢钠甲萘醌(Sigma Lot 087K0737，97％by C of A？)用于制备标准。
以负离子模式操作Waters Q-ToF II质谱仪，将甲萘醌亚硫酸氢盐在253的m/z上的提取离子色谱图进行积分，用于绘制拟合二次多项式(未强行通过0)的5点校正曲线。
将还原型甲萘醌亚硫酸氢盐在m/z 255处的提取离子色谱图积分，用于对照利用MSB标准获得的标准曲线计算还原型甲萘醌亚硫酸氢盐的浓度。
结果概述于下列表中(50mg/mL的rMSB标称浓度)。
实施例4
如实施例1和2中所述产生表达与人白蛋白的重组因子IX融合蛋白的CHO细胞系。为了研究增加活性分子的表达的方法，进行许多实验，评估向培养物中添加亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)和还原型MSB(rMSB)的效应。本研究的目的是确定MSB或rMSB添加中任一种是否能够增加活性分子的表达或减少表达的抗原性材料的量。通过特殊因子IX测定试剂盒测定分子的活性，假定活性的增加归因于由维生素K3的可用度驱动的该分子上谷氨酸残基的γ-羧化的增加。
在用于细胞增殖的所有情况下和在生产率评估过程中使用的培养基是化学成分确定的培养基(此处称为培养基A，如下文中所描述的)。在其中将其他培养基类型用于比较目的的情况下，在正文中描述了它们。在该研究中测量的重要参数是与人白蛋白融合的重组因子IX(rIX-FP)的抗原性表达、因该表达而产生的FIX活性和通过活细胞密度测量的细胞生长。测量这些重要细胞结果的细节描述于下文中。
方法和材料：
培养基组成
用于增殖的培养基是特别设计用于在CHO细胞中产生重组蛋白质的可商购获得的无血清化学成分确定的培养基：“培养基A”。克隆利用Lonza谷氨酰胺合成酶(GS)系统并且在谷氨酰胺不存在的情况下传代，利用25uM甲硫氨酸硫酰亚胺(MSX)维持选择。在最后培养阶段，用于生产率测量，未将谷氨酰胺和MSX加入培养基。
大剂量添加(Bolus Addition)
当葡萄糖浓度达到2g/l的下限时，向培养物中大剂量添加100g/L葡萄糖，一旦达到下限浓度，鼓动进料以增加残留培养基浓度至4g/l的更高量。
由于因子IX分子的维生素K依赖性γ-羧化，因此维生素K是细胞产生活性重组因子IX所必需的。在描述本发明的实验中，以亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB，Sigma)形式存在的维生素K3被选择为维生素K的来源，因为该形式是水溶性的，从而易于进入细胞。每天以50ng/ml的浓度添加MSB。
如先前实施例3中所述制备还原型MSB(rMSB)。将rMSB于-70℃下贮存，在即将使用前解冻。由于还原型MSB的固有的不稳定性质，还原型MSB的确切浓度的定量在实验时是不可获得的。因此还原型MSB的所有宣称浓度为从还原过程开始时MSB的起始浓度衍生得到的计算值。预期实际的还原型MSB浓度因在整个还原过程中发生的一定程度的少量损失而低于计算的量。
发酵参数
反应器为Sartorius/Braun 5L盘形底玻璃反应器，具有用于搅拌的单个Rushton叶轮和环形喷雾器。除非另有所指，否则在下列条件下进行所有反应器培养。
体积：始于总共4升(3.2升培养基和0.8升接种物)；
温度：37℃，从接种直至收获；
充气：在整个期间，0.0375空体积/分钟vvm的顶空空气，以0.025vvm的最大速率响应于溶解氧(D.O.)设定点而喷射；
D.O.：40％饱和度的设定点；
氧气：以0.075vvm的最大流速响应于D.O.设定点而喷射；
搅拌：在100rpm的恒定速度；
pH：7.00±0.05的单设定点；
碱：2M NaOH；
酸：100％CO2；
接种物：3×105-5×105个细胞/mL的起始细胞密度。
细胞培养测定：
按照制造商的说明书利用Innovartis CedeX自动化细胞计数器进行细胞计数。按照制造商的说明书利用利用Yellow SpringsInstruments(YSI)7100分析仪进行葡萄糖、乳酸盐、氨和谷氨酰胺测定。按照制造商的说明书使用来自Siemens(以前Bayer)的RapidLab248 Blood Gas分析仪进行溶解二氧化碳浓度的离线测定。使用内部过程ELISA(internal procedure ELISA)进行抗原测定以定量因子IX抗原。使用“BIOPHEN FIX”生色FIX测试进行因子IX活性测定。对于所有测定每天从接种的点进行取样。
培养瓶生产率测定
如下所述进行培养瓶生产率测定。
使用表达rIX-FP的CHO-S细胞系，将其培养在含有8mM L-谷氨酰胺的备选市售无血清化学成分确定的培养基(“培养基B”)中，该培养基被特别设计用于在CHO细胞中产生重组蛋白质。在第N-1和N次(以N为最后传代次数)传代中，加入50ng/ml MSB。在接种后48小时再进行一次添加。将30mL体积的培养物以2x105个活细胞/mL接种于125mL摇瓶中，于湿润的培养箱(Multitron，Infors HT)中在37C，5％CO2，125rpm下进行培养。就细胞密度、细胞活力、rIX-FP活性和抗原含量测定样品。
结果：
实验1：摇瓶中FIX表达的比较
进行实验1以评估培养瓶形式中还原型MSB相比于MSB的添加对培养物性能的效应。本实验中研究的测试条件的概述示于表1中。使细胞经历标准培养瓶生产率测定，对细胞密度、因子IX抗原和因子IX活性进行测定。获自该培养瓶生产率测定的结果概述示于表2和表3中。
表1：用于实验1的培养瓶测试条件
 还原型或非还原型MSB   添加次数   培养瓶编号
 非还原型   1   C1.0
 非还原型   1   C1.1
 非还原型   2   C2.0
 非还原型   2   C2.1
 还原型   1   D1.0
 还原型   1   D1.1
 还原型   2   D2.0
 还原型   2   D2.1
72小时和96小时的活性结果示于下面。对于所有测试条件，它们显示非常相似的在72小时获得的结果。对于MSB的2次添加获得的活性存在略微增加，并且使用还原型MSB产生的所有结果比非还原型MSB添加略高。有趣地，对于还原型MSB条件的两次添加不存在增加。然而由于较少次数的重复和条件之间活性结果的较小差异，对72小时时的结果的解释有限。
对于96小时的样品获得活性结果的更明确的增加。在该情况下，还原型MSB条件获得的活性结果比对于MSB添加获得的活性结果更大。所有记录值为一式两份重复培养瓶的平均值。
表2：72小时的培养瓶生产率实验结果
表3：96小时的培养瓶生产率实验结果
 实验条件   培养瓶   活性   抗原   比率
 MSB单次添加   C1.0，C1.1   629.5   2573   0.24
 MSB两次添加   C2.0，C2.1   649   1155.5   0.56
 还原型MSB单次添加   D1.0，D1.1   1070.5   1249   0.86
 还原型MSB两次添加   D2.0，D2.1   902   1271   0.71
根据表2和3中所示的结果，对于还原型MSB的添加相对于MSB的添加观察到对活性FIX的产生的正效应和活性FIX分子对FIX抗原之比例(比率)的增加。
获自培养瓶生产率工作的初步结果表明，因MSB还原形式的存在，细胞的活性分子分泌方面可能存在差异。为了测试还原型MSB对CHO细胞中rIX-FP的产量的效应，进行基于反应器的实验。
实验2：在补料分批条件下FIX表达的比较
在反应器补料分批条件下，在标准条件下培养rIX-FP CHO-K1克隆。本实验评估在MSB添加或还原型MSB添加下细胞生长、来自所述细胞的抗原产量和活性rIX-FP产量。本实验中利用的进料是基于葡萄糖的(100g/l)，其补充有下列氨基酸：
21.4g/L的天冬酰胺；
5.6g/L的半胱氨酸；
5g/L的天冬氨酸。
反应器测试条件是利用非还原型MSB添加的反应器A4和利用还原型MSB添加的反应器B4。在两个反应器中，如实施例4中所述使用培养基A。
获自培养物的细胞生长结果示于图4中。
上述数据显示，对于两个条件(还原型和非还原型MSB)的活细胞密度获得非常相似的生长特征和最大细胞密度。在这两个条件下，唯一的差异是还原型与非还原型MSB之间的预期比较。抗原、活性分子和相应比率的测定结果示于表4中。活性分子对抗原的比率大于1是可能的，因为针对其测量它们中每一个的IU对血浆具有不同的标准参照。
表4：在反应器A4 MSB和反应器B4还原型MSB下产生的总活性和抗原的比较(对于两个反应器获得的达到接种后192小时的数据)
在该情况下在还原型MSB添加条件下产生的更高比率是由与MSB添加条件相比较而言产生的活性FIX分子增加和产生的FIX抗原水平降低引起的。
实验3：在扩展的充排条件下FIX表达的比较
在扩展的充排条件下，利用两种培养基(培养基A和另一种商购可得的无血清化学成分确定的培养基，其被特别设计用于在CHO细胞中生产重组蛋白质：培养基C)培养CHO-K1克隆A5。当比较培养基的性能时，评估MSB或还原型MSB的添加的效应(表5)。与先前的实验一样，来自本研究的结果是细胞的生长参数以及活性rIX-FP分子和rFIX-FP抗原的产量。
表5：用于实施例3的反应器测试条件
  反应器   培养基   维生素K
  A2   培养基A   还原型的
  A4   培养基A   非还原型的
  B2   培养基C   还原型的
  B4   培养基C   非还原型的
在本研究中，观察到细胞生长方面的差异。该差异是能够在培养基A中获得更多的细胞数量。通过在MSB/rMSB的该浓度(50ng/ml/天)下比较还原型和非还原型MSB，关于反应器之间的细胞生长几乎不存在差异。
分析在不同测试条件下细胞的FIX抗原和活性FIX分子产量。这些结果的概述示于表6中。在扩展的充排组合下存在显著的差异。培养基A比来自相似培养体积的培养基C产生高20％-30％的抗原和高22％-27％的活性。
表6：实验3的抗原性和活性测定结果的比较
实验4：MSB和rMSB对细胞生长和存活力的效应
为了测试浓度不断增加的MSB和还原型MSB对细胞生长和存活力的效应，进行进一步的研究。除MSB添加或还原型MSB添加外，在相同的参数下培养8个反应器。与先前的实验一样，还原型MSB的浓度是计算值，真实浓度可能比计算值低。使用的培养基是实验1中描述的培养基A。每天在每细胞基础上增加添加(表7)，监测对细胞生长的效应。以充排模式进行反应器，第一循环具有6天的持续时间，第二循环具有4天的持续时间。
表7：用于实施例4的反应器测试条件
  反应器   [MSB]   维生素K
  A1   50ng/mL≡200μg/天   非还原型的
  A2   240μg/109个细胞/天   非还原型的
  A3   720μg/109个细胞/天   非还原型的
  A4   2160μg/109个细胞/天   非还原型的
  B2   标称240μg/109个细胞/天   还原型的
  B3   标称720μg/109个细胞/天   还原型的
  B4   标称2160μg/109个细胞/天   还原型的
活细胞密度和细胞存活力数据分别示于图6和7中。
在实验完成之前终止反应器A3和A4，并且将这反映在数据曲线中。及早终止反应器，因为不断增加的MSB浓度将在反应器中引起细胞死亡。反应器中观察到的细胞死亡反映在对氧的需要减少。反应器A4包含最高的MSB浓度并且首先开始其下降，然后是具有第二高MSB浓度的反应器A3。反应器A4的细胞死亡在反应器A3中细胞死亡开始后10小时内开始。
实施例5：在增加MSB和还原型MSB滴度下的细胞存活力数据
进行本工作以评估MSB和还原型MSB添加对细胞生长和活性因子IX融合蛋白分子的生产率的影响。最初利用CHO-S克隆进行培养瓶实验以获得支持进一步研究的数据。在本实验中，在72小时和96小时的时间点上收集数据。在72小时上，还原型MSB添加获得增加的活性产生。与MSB添加相比较而言，抗原性产量也增加；然而最高比率通过还原型MSB添加维持。在该情况下，还原型MSB的单次添加产生与MSB的两次添加相比较而言有所增加的、但可比较的活性产量。在96小时的时间点上收集的数据显示对于还原型MSB添加而言活性只有略微增加。然而，所有还原型MSB添加的培养瓶维持与MSB添加相比较而言相等或更高的比率。总的说来，与MSB添加相比较，从还原型MSB的添加获得增加的比率和相等的或增加的活性表达。
当表达固有地不稳定的蛋白质时，培养形式例如输注或充排式更合乎需要，因为其允许除去消耗的培养基和随后纯化和稳定所需蛋白质。为了进一步扩展细胞能力和阐明与MSB添加相比较而言还原型MSB添加的可能效应，进行补料分批培养。本研究的结果示于实验2中。在补料分批条件下，在还原型MSB或MSB添加下获得相似的生长(参见图4)。数据显示，在还原型MSB添加条件下，活性rIX-FP的量从22357IU增加至35444IU，表示59％的增加。有趣地，与观察到的活性分子的增加同时发生的是抗原性产量降至38197 IU，表示77％的MSB值。活性的增加和抗原性材料的减少因还原型MSB的添加而导致比率的较大增加。
为了测试充排模式下的细胞响应，将CHO-K1克隆培养在两种培养基中，并且再次评估MSB和还原型MSB添加的效应。细胞的生长对于所述测试培养基而言确实存在差异(参考图5)。对于培养基A获得达到更高细胞密度的生长。然而，每一种培养基测试的一式两份重复是完全可重现的，从而再次显示在测试的浓度下由于MSB或还原型MSB的添加而引起的生长特征的差异几乎不存在或不存在。与先前的实验一样，测定活性分子和抗原性分子的量。对于两种培养基类型，对于还原型MSB添加观察到更高的活性值，虽然在该情况下，这种增加非常少，其中MSB添加值在还原型MSB添加值的94-98％范围内。在于测试条件下产生的抗原性材料的量上观察到更大的差异。对于培养基A和C，还原型MSB添加反应器产生比MSB添加的抗原性材料更少的抗原性材料。与MSB添加相比较当在培养基A中培养时，还原型MSB产生78％的抗原材料，在培养基C中产生84％的抗原性材料。取决于培养基类型，还原型MSB添加次数，这导致19至35％的比率增加。
设计终实验用以测试对于细胞来说是可耐受的MSB和还原型MSB的水平。来自本研究的结果是在此类培养物中获得的细胞存活力和活细胞密度(分别参见图6和图7)。所使用的对照条件是每天添加50ng/ml MSB，并且在这些条件下获得的细胞数目和存活力是如预期的，并且与先前的结果一致。通过将MSB添加增加至210ug/106个细胞/天，观察到细胞存活力和细胞数目的显著减少。在720和2160ug/106个细胞/天观察到的细胞存活力和细胞数目的进一步减少表明MSB添加对细胞的毒性随着浓度的增加而增加。
对于还原型MSB也观察到添加的毒性效应，虽然其程度更低。用于还原型MSB添加的浓度是如先前所述的标称计算值。对于240和720ug/106个细胞/天的添加，细胞生长可与对照相当。对于2160ug/106个细胞/天的还原型MSB添加，观察到的毒性不导致细胞死亡，但导致细胞生长减少，与等量的MSB条件完全相反。这些结果表明，在所使用的浓度下，还原型MSB对细胞具有比MSB的添加低得多的毒性效应。
在多种培养形式中评估了MSB和还原型MSB添加的效应。在相当的条件下从这些研究获得的一致结果是还原型MSB添加与MSB添加相比较而言恢复至相等或增加的活性产量和减少的抗原性产量。还原型MSB的毒性似乎更低，如通过在更高浓度上细胞的耐受性所显示的；还原型MSB效应的确切作用机制还未被完全阐明。所述效应可能是通过进入细胞、培养物中或细胞质内还原型MSB的稳定性增加或关于细胞的γ羧化途径的直接机制。尽管确切的机制还不清楚，但还原型MSB向培养物的添加的最终结果是表达的活性材料相对于总抗原性材料的比率增加。在重组rIX-FP的生产中，这代表了显著的有利方面。
实验6：
如Thromb.Haemost.2008Apr；99(4)：659-67中所述在CHO-S细胞中克隆和表达白蛋白融合的因子VII。
在分批或补料分批条件下，在5升的生物反应器系统中以3升的起始体积进行哺乳动物细胞的培养。控制参数是温度(37℃)、pH(7.2)、搅拌(250rpm)和溶解氧。所使用的培养基是商购可得的化学成分确定的培养基(CD-CHO，Invitrogen)，该培养基以50ng/ml的起始浓度补充有MSB或rMSP。每一天使浓度增加50ng/ml直至第5天达到250ng/ml的最大浓度，随后在余下的培养期保持该浓度。培养的持续时间不超过12天。
使用生色测定法(FVII测试试剂盒(Chromogenix，82190063))测定FVII的活性。通过反相HPLC测定蛋白质的量。
从MSB转换成rMSB已在因子IX和因子VII的情况下实现了增加表达的活性产物量的益处。在每一种情况下，也观察到比活性的相应增加。

Claims (22)

1.用于对表达一种或多种维生素K依赖性蛋白质的真核细胞进行发酵的方法，其中在所述发酵方法之前和/或过程中将选自： 
i)维生素K的还原形式和/或 
ii)维生素K类似物的还原形式和/或 
iii)维生素K前体的还原形式 
之中的一种或多种化合物加入细胞培养基； 
其中所述维生素K类似物是包含2-甲基-1,4-萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白的谷氨酸残基向Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物；并且 
所述维生素K前体是在被哺乳动物细胞吸收后能被所述哺乳动物细胞转化成包含甲基化的萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白质的谷氨酸残基至Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物。 
2.权利要求1的方法，其中所述维生素K依赖性蛋白质选自凝血因子FIX、FVII、FX、FII、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨钙素、抑制钙化的基质Gla蛋白(MGP)或调节细胞生长的生长抑制特异性基因6蛋白(Gas6)。 
3.权利要求2的方法，其中所述维生素K依赖性蛋白质为凝血因子FIX或FVII。 
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述还原的维生素K类似物是还原型甲萘醌亚硫酸氢盐。 
5.权利要求1至3中任一项的方法，其中在生物反应器中进行所述表达。 
6.权利要求1至3中任一项的方法，其中以充排模式进行所述发酵。 
7.权利要求1至3中任一项的方法，其中以分批模式进行所述发酵。 
8.权利要求1至3中任一项的方法，其中以灌注模式进行所述发酵。 
9.权利要求1至3中任一项的方法，其中，使用悬浮的细胞进行所 述发酵。 
10.权利要求1至3中任一项的方法，其中利用贴壁细胞进行所述发酵。 
11.一种或多种选自下述中的化合物的用途： 
i)维生素K的还原形式，和/或 
ii)维生素K类似物的还原形式，和/或 
iii)维生素K前体的还原形式； 
其中所述化合物用于通过将所述化合物加入细胞培养基来在细胞培养物中表达一种或多种功能性维生素K依赖性蛋白质； 
其中所述维生素K类似物是包含2-甲基-1,4-萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白的谷氨酸残基向Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物；并且 
所述维生素K前体是在被哺乳动物细胞吸收后能被所述哺乳动物细胞转化成包含甲基化的萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白质的谷氨酸残基至Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物。 
12.权利要求11的用途，其中相应的功能性维生素K依赖性蛋白质的表达产率与当将相同量的所述相应维生素K和/或维生素K类似物和/或维生素K前体的非还原形式以与相应还原形式相同的方式加入细胞培养基时获得的所述相同功能性维生素K依赖性蛋白质的表达产率相比较而言得到增加。 
13.权利要求11或12的用途，其中所述维生素K依赖性蛋白质的活性与抗原水平表达之间的比率得到增加。 
14.权利要求11或12的用途，其中所述维生素K依赖性蛋白质的活性与抗原水平表达之间的比率增加至少15％。 
15.权利要求11或12的用途，其中所述维生素K依赖性蛋白质选自凝血因子FIX、FVII、FX和FII、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、骨钙素、抑制钙化的基质Gla蛋白(MGP)或调节细胞生长的生长抑制特异性基因6蛋白(Gas6)。 
16.权利要求11或12的用途，其中所述维生素K依赖性蛋白质是凝血因子FIX或FVII。 
17.权利要求11或12的用途，其中所述还原型维生素K类似物是还原型甲萘醌亚硫酸氢盐。 
18.权利要求11或12的用途，其中在生物反应器中进行所述表达。 
19.权利要求11或12的用途，其中以充排模式进行所述发酵。 
20.用于维生素K依赖性蛋白质的发酵的培养基，其补充有维生素K和/或维生素K类似物和/或维生素K前体的还原形式； 
其中所述维生素K类似物是包含2-甲基-1,4-萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白的谷氨酸残基向Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物；并且 
所述维生素K前体是在被哺乳动物细胞吸收后能被所述哺乳动物细胞转化成包含甲基化的萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白质的谷氨酸残基至Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物。 
21.权利要求20的培养基，其中补充有还原型甲萘醌亚硫酸氢盐。 
22.维生素K和/或维生素K类似物和/或维生素K前体的还原形式在细胞培养基中增强发酵中细胞的存活力的用途； 
其中所述维生素K类似物是包含2-甲基-1,4-萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白的谷氨酸残基向Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物；并且 
所述维生素K前体是在被哺乳动物细胞吸收后能被所述哺乳动物细胞转化成包含甲基化的萘醌环结构、并且能在维生素K依赖性蛋白质的谷氨酸残基至Gla残基的维生素K循环依赖性γ羧化中在功能上替代维生素K1的化合物。 
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