JPS6342699A - 組み換え蛋白質の生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 止血は、過剰の血管外の血液の損失が傷害部位における
フィブリンの凝固の形成によって防止される主要な機構
である。これらのフィブリンが形成される生理学的機構
は、現在明らかにされつつある。今日まで証拠が示唆す
るところによると、凝血の機構は種々の血漿因子の非常
に複雑な活性化のカスケードに起因し、そして因子の各
々は連続する酵素前駆体の順次の活性化に原因となる。

このカスケードの適切な機能化は、究極的に、フィブリ
ンの形成および血液損失の停止に導く。

しかしながら、不都合なことには、血漿因子の１または
２以上の欠乏または完全な不存在のために、この凝固の
カスケード内の代謝のエラーに起因する種々の病気の状
態が認識された。これらの病気の状態の主なものは、古
典的な血友病または単に血友病Ａである。血友病Ａは遺
伝性Ｘ染色体連結の劣性の特徴であり、これは通常因子
ＶＩＩＩと表示される抗血友病因子Ａの不存在によって
出現する。血友病Ａを処置するための治療的努力は、種
々の製薬学的配合物中の因子ＶＩＩＩの濃縮物を輸注す
ることによって感染した個体の血液を補充することに集
中されてきた。このような因子ＶＩＩＩの濃縮物は、過
去において、血液がらの因子ＶＩＩＩの極低温沈澱によ
って大部分が調製されてきた。しかしながら、正常の個
体における因子の量は微景であるため、生理学的に許容
されうる体積の希釈物の投与に適合する活性のレベルを
有する治療のために十分な量を分離するために、きわめ
て大量の血漿を処理しなくてはならない。

組み換えＤＮＡ技術が出現し、そして医学的に重要生を
もつ大量の蛋白質の発現が保証された（なかでも）ので
、因子ＶＩＩＩの先行の分離技術および精製技術の欠点
はますます明らかにされてきた。事実、最近の刊行物は
因子ＶＩＩＩを暗号化する（　ｅｎｃｏｄｅ　）遺伝子
のクローニングおよび発現の成功を報告した（下を参照
）。しかしながら、理解されうるように、この技術が達
成されてさえ、全体の方法の効率のある種の制限　は、
このような技術から得られる技術を最適化するために克
服する必要があろう。例えば、組み換えＤＮＡ技術によ
って生産される因子ＶＩＩＩの特定の場合において、因
子ＶＩＩＩを暗号化する因子■ＩＩＩを含有する形質転
換された宿主細胞を他の血清蛋白質を含有する複雑な培
地中で培養する。

こうして、培養上澄みから因子ＶＩＩＩが発現すると、
血清蛋白質の不均質集団からの困難な回収および精製に
なお直面する。しかしながら、このような困難は、宿主
の生存能力および因子ＶＩ１１を発現するその能力を弱
化しないで細胞の生長を支持するような方法、血清蛋白
質の不存在下に組み換え宿主を培養することによって軽
減できるであろう。

本発明は、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培地中で
因子ＶＩＩＩの発現を支配できる遺伝子を保持する宿主
細胞を培養することによって、組み換え因子ＶＩＩＩの
生産を提供するこのような手段に関する。

血液凝固因子（とくに因子ＶＩＩＩ）の調製は、種々の
刊行物中に開示されている。例えは、欧州特許出願１６
０４５７号は、遺伝子工学の方法によって因子ＶＩＩＩ
の完全ＤＮＡ解読配列から、機能的ヒト因子ＶＩＩＩを
生産することを記載している。非組み換え細胞の環境に
関連する不純物類、例えば、フオンウィレプラント（ｖ
ｏｎＷ　ｉ　ｌ　１ｅｂｒａｎｄ　）因子を含有しない
因子ＶＩＩＩを、その同定および機能性を証明するため
に十分な量で生産されると記載されている。同様に、Ｐ
ＣＴ出願Ｗ０　８５１０１９６１号は、ブタ因子ＶＩＩ
Ｉ遺伝子の同定および分離ならびにブタおよびヒトの因
子ＶＩＩＩ遺伝子の間の相同性によるヒト因子ＶＩＩＩ
の同時の分離および同定を記載している。また、前記遺
伝子からの組み換えＤＮＡ技術によるブタおよびヒト因
子ＶＩＩＩの発現が開示されている。同様に、欧州特許
出願１５０７３５号は、微生物または哺乳動物の組繊細
胞中の発現により、因子ＶＩＩＩｃ（前駆体およびサブ
ユニットを含む）の生産のための方法および組成物を提
供すると記載されている。英国特許出願ＧＢ２゜１２５
．４０９号は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）のような宿主中でのその生産を含む、因子ＩＸ（
その不存在または欠乏はクリスマス病に関連する）実質
的に完全なりＮＡ配列を開示している。

前記文献は、細胞培養技術におけるリポ蛋白質について
の種々の役割を開示している。例えば、細胞生理学雑誌
（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、１１３（３
）、３７３−３８４ページ（１９８２）において、細胞
外マトリックス上に維持するとき、ウシ副腎皮質の細胞
の生存および生長のためには高い密度のリポ蛋白質が絶
対必要であると著者らは述べている。細胞生理学雑誌　
（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　、１２０　
（３）、３５４−３６３ページ（１９８４）において、
培地を高い密度のリポ蛋白質、トランスフェリン、線維
芽細胞生長因子、ヒドロコーチ　ゾーンおよび上皮生長
因子を補充したとき、ウサギ肋骨軟骨細胞の一次培養物
は角膜内皮細胞の細胞外マトリックス上で増殖した。

同様に、ウシのレンズの上皮細胞を、血清不合培地に移
す時、高い密度のリポ蛋白質、トランスフェリン、イン
　シュリンおよび線維芽細胞生長因子を補充したダルベ
ツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変性イーグル（Ｅａｇｔｅ
）培地の混合物に対して暴露したとき、細胞外マトリッ
クス被覆皿上で活性的に増殖した［実験的眼の研究（Ｅ
ｘｐ、　Ｅｙｅ　Ｒ，ｃｓｅａｒｃｈ）、３５　（３）
、２５９−２７０　（１９８２）　］。高い密度のリポ
蛋白質は、血清不合培地中でヒト呻乳動物癌細胞系ＭＣ
Ｆ−７を系統的に適合させる方法において、血清の代替
物として使用することか報告されたしバイオケミカル・
アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーシ
ョンズ（Ｂｉ、ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ
ｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）、１３３（１）、１０５−１１
２．１９８５］。それゆえ、特定の細胞系について特定
の場合において、高い密度のリポ蛋白質補充培地は、あ
る細胞系を血清不合培地中の生長に適合させるなめに必
要であり、そして細胞外マトリックスＬの増殖のために
必要でありうることか知られている。いずれの場合にお
いても、所定の細胞培養物へのリポ蛋白質の効果は予測
できない。例えば、細胞のｔｆｉ造および機能（Ｃｅｌ
ｌ　　５ｔｒｕｃｔ、　Ｆｕｎｃ↑、）、８（１）、６
フー７６ページ（１９８３）において、低密度のリポ蛋
白質はヒト正常ＨＥ　Ｌ細胞および４−ニトロキノリン
−１−オキシド形質転換ヒト線維芽細胞の生長を血清の
不存在下に促進することが記載された。しかしながら、
低密度のリポ蛋白質はアルファ線で形質転換した前記ヒ
ト線維芽細胞の最適な生長に対して作用しなかった。

上で引用した参考文献は、ここで教示するようなリポ蛋
白質の使用を開示または示唆していない。

すなわち、哺乳動物の細胞の生長を補足するために、お
よびトランスフェクションした不均質遺伝子の前記細胞
からの発現を増大するために使用することは、従来報告
されていない。詳しくは、このような方法は組み換え因
子ＶＩＩＩの生産に適用されてきていない。

本発明は、因子ＶＩＩＩの遺伝子を保持する宿主細胞中
で組み換え因子ＶＩＩＩの発現を増大する方法であって
、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培地中で宿主細胞
を培養して組み換え因子■ＩＩＩの発現を実施すること
を特徴とする方法に関する。

前述のように、組み換えＤＮＡ技術により、従来骨るこ
とが不可能であった大きい量で、蛋白質を生産する技術
を利用できる。典型的には、蛋白質の生産に起因する遺
伝子を同定しかつ分離するための方法は多少標準のプロ
トコールに従う。問題の蛋白質をまず分離し、そして技
術、例えば、問題の蛋白質に対して特異的のモノクロー
ナル抗体を使用する免疫親和精製を利用して大規模に精
製する。ポリペプチドのアミノ酸配列を現在慣用されて
いる技術により決定することかできそして、このように
して得られた配列に基づいて、オリゴヌクレオチドの１
０−ブを調製し、そして試験する種々の組織からの蛋白
質の合成部位を同定および／または分離するなめに使用
することができる。

次いで、ポリアデニル化ｍＲＮＡを同定した組織から分
離することができ、次いでこれを利用してＲＮＡ支配置
）　Ｎ　Ａポリメラーゼ（また、［逆トランスクルプタ
ーゼ」呼ぶ）の作用によって一本鎖の相補的ＤＮＡ　（
ｃＤＮＡ）を形成する。逆トランスクリプターゼ産生物
（ｍＲＮＡ鋳型の部分的または完全なコピー）は、典型
的には、３′末端に短い、部分的に二本鎖のへヤピンル
ープを示し、１）　Ｎ　Ａポリメラーゼのためのプライ
マーとして作用する。ＤＮＡポリメラーゼは遊離の３”
−ヒドロキシ基を有するＤＮＡ鎖の存在を必要とし、こ
の鎖にヌクレオチド残基が付加され、これにより５′−
３゛方向に鎖を延長する。次いで、得られる二本鎖ｃＤ
ＮＡを８１ヌクレアーゼで処理して、残留する一本鎖断
片を除去し、これにより「プラント末端の」二重らせん
ＤＮＡセグメントを発生させる。ｃＤＮＡライブラリー
を生産する他の手順を利用できる。例えば、次の文献を
参照：チャン（Ｃｈａｎ）およびホワイテッド（Ｗｈｉ
ｔｔｅｄ）、工業微生物学における発展（Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔｓ　　１ｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、Ｖｏｌ、９．１７１−１８０
ページ（１９８５）、これをここに引用によって加える
。次いで、問題の蛋白質を暗号化する前記ＤＮＡセグメ
ントを、適当な宿主の引続く形質転換のために、適当な
ベクター中に結合し、これにより所望産生物の合成を支
配する発現系をつくる。上に言及した一般的手順は、次
の文献に詳述されている：分子クローニング、実験室の
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、
　Ａ　　Ｉ、ｂ。

ｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｎｕａｌ）　、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ）ら、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−１１９８２、これをここに引用によって
加える。組み換え因子ＶＴＩＩの生産に特別に関係する
手順の詳細な説明は、次の文献から得ることができる：
欧州特許出願１６０４５７号；　ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／
ＵＳ８４１０１６４１号、ＷＯ８５１０１９６１号とし
て発行された：欧州特許出願１５７５５６号；および欧
州特許出願１５０７３５号。こうして、ここに使用する
とき、用語１組み換え因子ＶＩＩＩＪは、上に概説した
ような分子生物学的技術によって生産される機能的蛋白
質を意味し、前記蛋白質はヒト因子ＶＩＩＩの欠乏を補
正することができる。

ここに開示しかつ特許請求した方法は、因子■ＩＩＩの
ための遺伝子を保持する宿主から組み換え因子ＶＩＩＩ
の発現を増大させる。用語「組み換え因子ＶＴＩＩの発
現を増大させる」は、リポ蛋白質および血清不含の条件
を利用しない組み換え系において可能であるよりも、大
きい程度に発現を増大させることを意味する。「血清不
合」とは、血清の本質的に不存在下に因子ＶＩＩＩのた
めの遺伝子を保持する宿主細胞を培養することを意味す
る。血清の不存在下に本発明の方法を実施することが好
ましいか、因子ＶＩＩＩの数社に悪影響を及ぼさない少
菫の血清の存在は、本発明の範囲内に明らかに包含され
ると解釈される。しがしながら、当業者は理解できるよ
うに、栄養培地中の増大量の血清の存在は、前記血清中
に存在する異質蛋白質類の増大した集団からの因子ＶＩ
ＩＩの精製を困難とさせる。

因子ＶＩＩＩの発現に適当な宿主細胞は、一般に、多細
胞の有機体から誘導することができ、哺乳動物の細胞、
例えば、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａの細胞、チャイニーズ
ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞系、シリアンハムスタ
ー（ｂａｂｙ　　ｈａｍｓｔｃｒ　）の腎（ＢＨＫ）細
胞、Ｗ−１３８、Ｃ０８−７およびＭＤＣＫの細胞系は
好ましい。シリアンハムスターの腎細胞、ことに欧州特
許出願１６０４５７号に記載されているように因子ＶＩ
ＩＩの発現を支配できる遺伝子でトランスフェクション
されたものはとくに好ましい（クローナル変異種および
その子孫のような誘導体を包含する）。このような細胞
系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
　Ｃｏｆ　１ｅｃｔｉｏｎ　）に受託され、そして受託
番号ＡＴＣＣＣＲＬ−８５４４を与えられている。

因子ＶＩＴＩを暗号化する遺伝子を保持する所望の宿主
細胞系は、典型的な量（すなわち、約７〜約１０％の範
囲内）の血清を含有する適当な培地中で生長期を通す慣
用技術によって培養する。

細胞が全面生長に到達しかつ細胞サイクルの維持期が開
始するまで、血清を培地中に維持する。この手順はこの
分野において標準である。しかしながら、培養が細胞サ
イクルの維持期に到達する近時点くすなわち、細胞が全
面生長に到達するとき）、血清を含有する使用済みの栄
養培地をリポ蛋白質を補充した血清不合栄養培地と交換
し、そして培養を維持期において続け、指示されたとき
、各収穫物から因子ＶＩＩＩを回収する。当業者は理解
＝１６− するように、培養の維持期が実施されている血清不合条
件（リポ蛋白質が補充されている）は、血清蛋白質が存
在する場合よりも、使用済み栄養培地からの因子ＶＩＩ
Ｉの精製を大きく促進することができる。さらに理解さ
れるように、栄養培地のリポ蛋白質の存在は宿主細胞か
らの因子ＶＴＩＩの発現の増大に影響を及ぼすばかりで
なく（血清補給条件下の培養に比較して）、かつまた延
長した期間の間の細胞の生存能力を支持し、こうして因
子ＶＩＩＩの収穫物の数の増大を可能とする。

宿主細胞系を培養するために選択する栄養培地は、本発
明にとって臨界的でなく、そして選択した宿主細胞系に
適する、この分野において知られているもののいずれか
であるか、あるいはそれらの組み合わせであることがで
きる。このような培地の例は、次の通りである：ダルベ
ツコの変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　　Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｆ、ａｇＩｃＭｅｄｉｕｍ）　、イ
ーグルの最小必須培地、イーグルの基礎培地、ハム（Ｈ
ａｍ）の培地Ｆ−１０、ハムの培地Ｆ−１２、ＲＰＭＩ
−１６４０培地など。

すべてのこのような培地は、例えば、シグマ・ケミカル
・カンパニー（Ｓ　ｉｇｍａ　　ＣｈｅＩＩｌｉｃａｌ
　　Ｃｏ＋ｎｐａｎｙ）　、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）およ
びＭ、Ａ、バイオプロダクツ（Ｂ　１ｏｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ）のような源から商業的に入手可能である。栄養培地
は、また、種々の緩衝剤、例えば、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
ホン酸）を含有することができ、そしてまた、因子、例
えば、インシュリン、トランスフェリン、テステステロ
ン、ナトリウムセレナイト、エタノールアミン、グルタ
ミン、飽和脂肪酸、飽和脂肪酸などをリポ蛋白質の外に
補充されることができる。栄養培地へのこのような因子
の添加量は、この分野において普通のものである。例え
ば、インシュリンの量は培地１＋ｎｌにつき約５〜約１
０マイクログラム（μｇ）の範囲であることができ、ト
ランスフェリンの量は培地１…１につき約２．５〜約２
５μｇの範囲であることができ、グルタミンの量は培地
１＋ｅｌにつき約２００〜約６００μｇの範囲であるこ
とができ、飽和および不飽和の脂肪酸の量は培地１ｍｌ
につき約１〜約１０μｇの範囲であることができ、そし
てテステステロンの量は培地１ｍｌにつき約１０〜約５
０ナノグラム（ｎｇ）の範囲であることができる。

栄養培地を補充するために使用するリポ蛋白質は任意の
源であることができるが、哺乳動物源、例えば、ウシ、
ウマ、ヒツジ、ブタまたはヒトが好ましい。ウシリポ蛋
白質はとくに好ましい。ウシリポ蛋白質は種々の源から
入手可能であり、例えば、ベンテックスリポ蛋白質溶液
（Ｐ　ｃｎｔｅｘ　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　　５ｏｌ
ｕｔｉｏｎ）　　（カタログ番号８２−〇〇４）および
ベンテックスコレステロール溶液（カタログ番号８２−
１０８）、両者はマイルス・ラボラトリーズ・インコー
ホレーテッド（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　　Ｉｎｃ、　、米国インデイアナ州エルクハルト）か
ら入手可能である。ウシリポ蛋白質は、また、前述の標
準技術を使用して新しく分離したウシ血清の超遠心によ
り調製することができる。リポ蛋白質は、前記細胞の生
命環の維持期の間細胞の生存能力を持続できる量で栄養
培地中に存在する。リポ蛋白質は、前記細胞の生活環の
維持期の間に、細胞の生存能力を持続することのできる
量で、栄養培地中の存在する。好ましくは、この量は栄
養培地の１ｍｌ当り０　、１　ｍｇ〜２．０ＩＩ１ｇの
間で変化することがわかった。栄養培地の１ｍ１当りｏ
、２ｍｇ〜１．０＋ｏｇのリポ蛋白質の含量はとくに好
ましい。

慣用技術、例えば、回転瓶培養の加えて、本発明の方法
は、また、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄＳｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、Ｖｏｌ、　
ＬＶＩＩＩ、［細胞の培養（Ｃｅｌｆ　　Ｃｕ１ｔ、ｕ
ｒｅ）　ｊ（１９７９）、Ｗ、Ｂ、ジャコバイ（Ｊ　ａ
ｋｏｂｙ　）および１．Ｈ，パスタン（Ｐａｓｔａｎ）
　、編（これを引用によってここに加える）に記載され
ているようなマイクロキャリヤー系とともに使用するた
めに適用できる。適当なマイクロキャリヤーは、例えば
、種々のサイトテックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ　）マイクロ
キャリヤー［すなわち、サイトテックス−１、サイトテ
ックス−２、サイ１〜デックス−３、ファーマシア・イ
ンコーホレーテッド（ｐ　）ＩＢｍａｃ　ｉａ　。

Ｉｎｃ、）から入手可能」、ゲリビーズ（Ｇｅｌｉｂｅ
ａｄｓ）［Ｋ、Ｃ，バイオロジカルス（Ｂ　ｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓ）から入手可能］などを包含する。さらに、
本発明の方法は、また、細胞懸濁系に適用できる。

培養条件は、使用する細胞についての標準の高所に関し
て選択する。因子ＶＩＩＴの発現を指示できる遺伝子を
有する選択した細胞系は、このような反応のもとて生長
できるということで十分であり、そしてこのような時間
の間、リポ蛋白質を補充した血清不合栄養培地において
、同様に前記宿主から組み換え因子ＶＩＩＩの発現を増
大するために十分であろう。例えば、哺乳動物細胞系に
ついて、培養は約３６〜３８℃において約２４〜約７２
時間の間実施することが望ましいであろう。

しかしながら、これらのパラメーターの選択は日常のこ
とであり、かつ当業者の技量の範囲内である。宿主細胞
の培養後、因子ＶＩＩＩを使用済み栄養培地から、標準
法、例えは、遠心または限外濾過によって回収できる。

望むならばおよび／または必要に応じて、回収された因
子ＶＩＩＩを、例えば、イオン交換または大きさ排除ク
ロマトグラフィー（ｓｉｚｅ　　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　
　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫精製などによ
って精製することができる。

次の実施例により本発明をさらに説明するが、これらの
実施例は本発明を限定するものではない。

実施例１ 本発明における使用に適するウシリポ蛋白質を次のよう
にして調製する。新鮮なウシ血清（商業的屠殺場から入
手した）の５０ｍ１を、１６ｇの臭化カリウムに添加し
て、ウシ血清の密度を１，２１ｇ／Ｉｌ＋ｌの密度を調
節した。次いで、この血清を４０．００　Ｏｒｐｍで２
４時間４℃において遠心機内［ベックマン（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ）　Ｔｉ４５は好ましい］内で２４時間遠心して、
相分離させる。次いで、上の黄色油状リポ蛋白質の分画
を集め、再び４０゜０００　ｒｐｍで２４時間遠心した
。リポ蛋白質の分画を分離し、ＮａＣｌ：　ＥＤＴＡ　
（０，１５ミリモルのＮａＣ１’、１．０ミリモルＥＤ
ＴＡ、ｐＨ７，４）に対して広範に透析した。次いで、
透析したりポ蛋白質を０．１μフイルター［ミリポア（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）］で滅菌した。必要に応じて、リ
ポ蛋白質はブラッドフォード（Ｂ　ｒａｄｆｏｒｄ　）
キット［バイオラド・インコーホレーテッド（Ｂ　１ｏ
ｒａｄ、　Ｉ　ｎｃ、　）からカタログ番号５００−０
００２で商業的に入手可能］により定量することができ
、そしてコレステロール含量はシグマ・ケミカル（Ｓ　
ｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、　）から入手
できるキット（カタログ番号３５１−２０）を使用して
定量することができる。

実施例２ 因子ＶＩＩＩの発現を指示できる遺伝子でトランスフェ
クションしたシリアンハムスター（ｂａｂｙｈａ＋ｌ１
ｓｔｅｒ　）腎細胞（ＢＨＫ−２１）は、ジエネンテク
・インコーホレーテッド（Ｇ　ｅｎｅｎｔｅｃｈ　。

Ｉｎｃ、、米国カリフォルニア州南すンフランシスコ）
から入手した。前記細胞系を欧州特許比Ｍｉｌ１６０４
５７号に詳述されているようにして調製し、そしてアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）に寄託し、そしてＡＴＣＣＣＲＬ−８５
４４の受託番号を与えられた。

因子ＶＩＩＩを暗号化する遺伝子を含有するＢＨＫ−２
１細胞を全面生長に生長させ←Ｅの欧州特許出願１６０
４５７号に詳述されているように）、引続いて０．２５
％のトリプシン−ＥＤＴＡ　（ＧＩＢＣＯから商業的に
大手可能）でトリプシン化した。次いで、細胞をバンク
の均衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、そして血球針で顕
微鏡下に計数した。２０Ｘ１０’細胞を４９０センチメ
ーター（ｃＩｌｌ）２の回転瓶［コーニング・グラス・
インコーホ−レーテッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ　　Ｇ　１ａ
ｓｓ、　Ｔ　ｎｃ、　）　］の中に接種し、これにハム
の培地４−１２およびダルゲッコの（低グルコース）最
少必須培地（５０：５０重量）および７％の胎児ウシ血
清を含有する生長培地の１５０ｍ１を添加する。細胞を
３７℃で７２時間Ｑ　、　３　ｒｐｍの回転速度で生長
させた。

細胞が全面生長に到達した後、使用済みの培地をデカン
テーションし、廃棄し、そして細胞を１００＋＋＋Ｉお
ＨＢＳＳで洗浄した。次いで、血清不含栄養培地を蛋白
質し、そして次の成分を含有した：ハムの培地Ｆ−１２
およびダルベツコのく低グルコース）最少必須培地＜５
０　：　５０、重量）、実施例１のようにして調製した
ウシリポ蛋白質（０゜４＋ｅｇ／ｗ＋Ｉ）　、ウシイン
シュリン（５，０ＪｚＨ／＋Ａｌ）、ウシトランスフェ
リン（２，５μｓ／ｍｌ）、グルタミン（２９２７１ｇ
／翔ｌ）およびＭｇＣｂ　（１５ミリモル）。

次いで、この血清不合栄養培地の１００ｍ１を細胞に添
加し、これを３７℃で４８時間０　、３　ｒｐｍの回転
速度で生長させた。次いで、使用済みの血清不合栄養培
地を因子ＶＩＩＩのために収穫し、そして１００＋＋＋
ｌの新鮮な血清不合栄養培地を細胞に添加し、再び３７
℃で４８時間Ｑ　、　３　ｒｐｍの回転速度で生長させ
た。組み換え因子ＶＩＩＩを含有する使用済みの血清不
合栄養培地の３つの収穫物が得られるまで、この方法を
反復した。各収穫物を個々に因子ＶＩＩＩの活性につい
て、発色性基質決定法により、アッセイした。前記アッ
セイはコーチスト因子ＶＩ　Ｉ　Ｉ　（Ｃｏａｔｅｓｔ
　　Ｆａｃｔｏｒ　　ＶＩＩＩ）として既知の試験キラ
Ｉ・とじて商業的に販売されており、そしてヘレナ・ラ
ボラトリーズ（Ｈｅｌｅｎａ　　Ｌ、　ａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、米国テキサス州ヒーアウモント）（カタログ
番号５２９３）から商業的に入手可能である。使用する
手順は製造業者から提供されるか、あるいは欧州特許出
願１６０４５７号にさらに詳述されている。コーチスト
因子ＶＩＩＩキットで決定した、３つの収穫物の各々に
ついての因子ＶＩＩＩの活性を表■に記載する。

友り 因子ＶＩＩＩの活性 ａ　　　ｃｙ＞＃ｑ　　　　　　　単位／１ａ８　因子
ＶＩＩＩ活性の１単位は、ヒト血漿の１翰１中に存在す
るその活性であると定義される９表１に記載されている
データから理解できるように、リポ蛋白質を補充した血
清不合条件下に因子ＶＩＩＩを暗号化する遺伝子を含有
するＢＨＫ−２１細胞を培養すると、因子ＶＩＩＩの生
産が増大された。比較のため、リポ蛋白質を補充しない
普通の血清含有栄養培地を使用して、前述のＢＨＫ−２
１細胞系（すなわち、Ａ　Ｔ　ＣＣＣＲ＋−−８５４４
）を培養すると、因子Ｖｌｌｌは約１５０〜約２００単
位／１で生産された。さらに、細胞は血清不合条件下に
生長せず、典型的には第２の収穫後に死亡した。

実施例３ 実施例２に記載するＢＨＫ−２１細胞系のクローナル変
異型（すなわち、Ａ　Ｔ　ＣＣＣＲＬ　−８５４４のク
ローナル変異型）を、ジェネンテク・インコーホレーテ
ッド（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　　Ｉｎｃ、　、米国カリ
フォルニア州南すンフランシスコ）から入手した。実施
例２の手順を利用して、前記クローナル変異型をリポ蛋
白質を補充した血清不合栄養培地条件下に５回の収穫で
培養した。これらのデータを表ＩＩに記載する。

表ＩＩ 因子ＶＩＩＴの活性 収穫胸の番号　　　　　　単位／＋８ ８　因子ＶＩＩＩ活性の１単位は、ヒト血漿の１ｍｌ中
に存在するその活性であると定義される。

表ＩＩに記載されているデータがら理解できるように、
リポ蛋白質を補充した血清不合条件下に因子ＶＩＩＩを
暗号化する遺伝子を含有するＢＨＫ−２１細胞のクロー
ナル変異型を培養すると、因子ＶＩＩＩの生産が有意に
増大された。比較のため、リポ蛋白質を補充しない普通
の血清含有栄養培地を使用すると、因子ＶＩＩＩは約８
００〜約１２００単位／１の量で生産された（クローナ
ル変異型について）。さらに、細胞は血清不含条件下に
生長せず、典型的には第２の収穫後に死亡した。

実施例４ 本発明の方法が、また、マイクロキャリヤー系を利用す
る組み換え因子ＶＩＩＩの生産に適用できることを示す
ために、次を実施した。

１ｇのサイテックス−３マイクロキヤリヤー（ファーマ
シア・インコーホレーテッド）を、洗浄しかつ５００ｍ
１のリン酸塩干渉化生理的食塩水（ギブコ）で４時間水
和し、その後マイクロキャリヤー１２１℃で３０分間オ
ートクレーブ処理した。マイクロキャリヤーを、同重量
部のハムのＦ−１２培地およびダルベツコの変性イーグ
ル培地を含有する生長培地の２５０ｍ１で洗浄し、次い
でヘルフ（Ｂｅｌｌｃｏ）回転フラスコ（ヘルフ・グラ
ス・インコーホレーテッド）内で７％の胎児ウシ血清ア
ルブミンを補充した前記生長培地の２５０ｍ１中に懸濁
させた。因子ＶＩＩＩの発現を指示できる遺伝子でトラ
ンスフェクションした４０Ｘ１０’ＢＨＫ−２１細胞（
実施例３に記載するような）をマイクロキャリヤーに添
加した。得られる細胞懸濁液を３７°Ｃで３時間イン　
キュベーションしく２分〜３０分の間隔で３Ｏｒｐｍに
おいて）、その後７％の胎児ウシ血清アルブミンを補充
した前記生長培地の２５０ｍ１を添加した。次いで、マ
イクロキャリヤーを連続的に撹拌しながら３７℃におい
て７２時間インキュベーションし、使用済みの培地を除
去し、そしてマイクロキャリヤーをＨＢＳＳで２回洗浄
した。実施例２に記載する血清不合栄養培地の５００ａ
＋Ｉをマイクロキャリヤーに添加し、そしてこの系を連
続的に撹拌（３０ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベ
ーションした。２４時間の間隔後、血清不合栄養培地を
収穫し、マイクロキャリヤー系において５００ｍ１の新
鮮な血清不合栄養培地と交換した。培養を第９日目に停
止し、組み換え因子ＶＩＩＩを含有する使用済み血清不
合栄養培地を合計６回収穫した。収穫物の各々を個々に
因子ＶＩＩＩ活性について、実施例２に記載する発色性
基質の決定法を用いてアッセイした。結果を表ＩＩＩに
示す。

表ＩＩＩ 因子ＶＩＩＩの活性 暖１１ゆ１隻　　　　　　単位／１ａ ８　因子ＶＩＩＩ活性の１単位は、ヒト血漿の１ｍｌ中
に存在するその活性であると定義される。

表ＩＩＩに記載されているデータから理解できるように
、リポ蛋白質を補充した血清不合条件下に因子ＶＩＩＩ
を暗号化する遺伝子を含有するＢＨＫ−２１細胞をマイ
クロキャリヤー系を利用して培養することにより、因子
ＶＩＩＩの生産が有意に増大された。比較のため、リポ
蛋白質を補充しない普通の血清含有栄養培地を使用する
と、因子ＶＩＩＩは約２００〜約３００単位／ｌの量で
生産された。さらに、この特定の場合において６回のみ
の収穫を実施したが、当業者は理解するように、細胞の
生存能力はより大きい程度に維持されるので、追加の収
穫を実施できる（典型的には１０〜約１５回程度に多く
）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、因子VIIIの遺伝子を保持する宿主細胞 の中で組み換え因子VIIIの発現を増大する方 法であって、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培地中
   で宿主細胞を培養して組み換え因子VIIIの発現を実施す
   ることを特徴とする方法。 ２、前記宿主細胞が哺乳動物の宿主である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、前記哺乳動物の宿主がベビーハムスターの腎細胞で
   ある特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記リポ蛋白質が哺乳動物源からのものである特許
   請求の範囲第１、２または３項記載の方法。 ５、前記哺乳動物源がウシ、ウマ、ヒツジ、ブタまたは
   ヒトから選択される特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記リポ蛋白質がウシリポ蛋白質である特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ７、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．１
   ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲第
   ６項記載の方法。 ８、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．２
   ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 ９、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
   ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
   ｔｉｏｎ）に受託されかつ受託番号ＡＴＣＣＣＲＬ８５
   ４４を与えられた宿主細胞系およびその誘導体からの組
   み換え因子VIIIの発現を増大す る方法であって、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培
   地中で前記宿主細胞を培養して、前記因子VIIIの発現さ
   せることを特徴とする方法。 １０、前記リポ蛋白質が哺乳動物源からのものである特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、前記哺乳動物源がウシ、ウマ、ヒツジ、ブタまた
   はヒトから選択される特許請求の範囲第１０項記載の方
   法。 １２、前記リポ蛋白質がウシリポ蛋白質である特許請求
   の範囲第１１項記載の方法。 １３、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．
   １ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲
   第１２項記載の方法。 １４、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．
   ２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲
   第１３項記載の方法。 １５、因子VIIIを暗号化する遺伝子を含有 する宿主細胞を培養することによって組み換え因子VII
   Iを調製する方法において、リポ蛋白質 を補充した血清不含栄養培地中で前記宿主細胞を培養す
   ることを特徴とする方法。 １６、前記宿主細胞が哺乳動物の宿主である特許請求の
   範囲第１５項記載の方法。 １７、前記哺乳動物の宿がシリアンハムスターの腎細胞
   である特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、前記リポ蛋白質が哺乳動物源からのものである特
   許請求の範囲第１５、１６または１７項記載の方法。 １９、前記哺乳動物源がウシ、ウマ、ヒツジ、ブタまた
   はヒトから選択される特許請求の範囲第１８項記載の方
   法。 ２０、前記リポ蛋白質がウシリポ蛋白質である特許請求
   の範囲第１９項記載の方法。 ２１、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．
   １ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲
   第２０項記載の方法。 ２２、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．
   ２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲
   第２１項記載の方法。 ２３、因子VIIIを暗号化する遺伝子を含有 する宿主細胞をリポ蛋白質を補充した血清不含栄養培地
   中で培養することによって調製されたことを特徴とする
   組み換え因子VIII。 ２４、前記宿主細胞が哺乳動物の宿主である特許請求の
   範囲第２３項記載の組み換え因子VIII。 ２５、前記哺乳動物の宿主がシリアンハムスターの腎細
   胞である特許請求の範囲第２４項記載の組み換え因子V
   III。 ２６、前記リポ蛋白質が哺乳動物源からのものである特
   許請求の範囲第２３、２４または２５項記載の組み換え
   因子VIII。 ２７、前記哺乳動物源がウシ、ウマ、ヒツジ、ブタまた
   はヒトから選択される特許請求の範囲第２６項記載の組
   み換え因子VIII。 ２８、前記リポ蛋白質がウシリポ蛋白質である特許請求
   の範囲第２７項記載の組み換え因子VIII。 ２９、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．
   １ｍｇ／ｍｌ〜２．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲
   第２８項記載の組み換え因子VIII。 ３０、栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量が０．
   ２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌである特許請求の範囲
   第２９項記載の組み換え因子VIII。