JPH0630610B2

JPH0630610B2 - 組み換え蛋白質の生産

Info

Publication number: JPH0630610B2
Application number: JP62169926A
Authority: JP
Inventors: シヤム・ユエン・チヤン
Original assignee: Miles Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1986-07-11
Filing date: 1987-07-09
Publication date: 1994-04-27
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: EP0254076B1; ATE63335T1; EP0254076A1; DK359487A; DE3769872D1; JPS6342699A; DK359487D0

Description

【発明の詳細な説明】止血は、過剰の血管外の血液の損失が障害部位における
フィブリンの凝固の形成によって防止される主要な機構
である。これらのフィブリンが形成される生理学的機構
は、現在明らかにされつつある。今日まで証拠が示唆す
るところによると、凝血の機構は種々の血漿因子の非常
に複雑な活性化のカスケードに起因し、そして因子の各
々は連続する酵素前駆体の順次の活性化に原因となる。
このカスケードの適切な機能化は、究極的に、フィブリ
ンの形成および血液損失の停止に導く。

しかしながら、不都合なことには、血漿因子の１または
２以上の欠乏または完全な不存在のために、この凝固の
カスケード内の代謝のエラーに起因する種々の病気の状
態が認識された。これらの病気の状態の主なものは、古
典的な血友病または単に血友病Ａである。血友病Ａは遺
伝性Ｘ染色体連結の劣性の特徴であり、これは通常因子
ＶＩＩＩと表示される抗血友病因子Ａの不存在によって
出現する。血友病Ａを処置するための治療的努力は、種
々の製薬学的配合物中の因子ＶＩＩＩの濃縮物を輸注す
ることによって感染した個体の血液を補充することに集
中されてきた。このような因子ＶＩＩＩの濃縮物は、過
去において、血液からの因子ＶＩＩＩの極低温沈澱によ
って大部分が調製されてきた。しかしながら、正常の個
体における因子の量は微量であるため、生理学的に許容
されうる体積の希釈物の投与に適合する活性のレベルを
有する治療のために十分な量を分離するために、きわめ
て大量の血漿を処理しなくてはならない。

組み換えＤＮＡ技術が出現し、そして医学的に重要生を
もつ大量の蛋白質の発現が保証された（なかでも）の
で、因子ＶＩＩＩの先行の分離技術および精製技術の欠
点はますます明らかにされてきた。事実、最近の刊行物
は因子ＶＩＩＩを暗号化する（encode）遺伝子のクロー
ニングおよび発現の成功を報告した（下を参照）。しか
しながら、理解されうるように、この技術が達成されて
さえ、全体の方法の効率のある種の制限は、このような
技術から得られる技術を最適化するために克服する必要
があろう。例えば、組み換えＤＮＡ技術によって生産さ
れる因子ＶＩＩＩの特定の場合において、因子ＶＩＩＩ
を暗号化する因子ＶＩＩＩを含有する形質転換された宿
主細胞を他の血清蛋白質を含有する複雑な培地中で培養
する。こうして、培養上澄みから因子ＶＩＩＩが発現す
ると、血清蛋白質の不均質集団からの困難な回収および
精製になお直面する。しかしながら、このような困難
は、宿主の生存能力および因子ＶＩＩＩを発現するその
能力を弱化しないで細胞の生長を支持するような方法、
血清蛋白質の不存在下に組み換え宿主を培養することに
よって軽減できるであろう。

本発明は、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培地中で
因子ＶＩＩＩの発現を支配できる遺伝子を保持する宿主
細胞を培養することによって、組み換え因子ＶＩＩＩの
生産を提供するこのような手段に関する。

血液凝固因子（とくに因子ＶＩＩＩ）の調製は、種々の
刊行物中に開示されている。例えば、欧州特許出願１６
０４５７号は、遺伝子工学の方法によって因子ＶＩＩＩ
の完全ＤＮＡ解読配列から、機能的ヒト因子ＶＩＩＩを
生産することを記載している。非組み換え細胞の環境に
関連する不純物類、例えば、フォンウィレブラント（vo
nWillebrand）因子を含有しない因子ＶＩＩＩを、その
同定および機能性を証明するために十分な量で生産され
ると記載されている。同様に、ＰＣＴ出願ＷＯ８５／
０１９６１号は、ブタ因子ＶＩＩＩ遺伝子の同定および
分離ならびにブタおよびヒトの因子ＶＩＩＩ遺伝子の間
の相同性によるヒト因子ＶＩＩＩの同時の分離および同
定を記載している。また、前記遺伝子からの組み換えＤ
ＮＡ技術によるブタおよびヒト因子ＶＩＩＩの発現が開
示されている。同様に、欧州特許出願１５０７３５号
は、微生物または哺乳動物の組織細胞中の発現により、
因子ＶＩＩＩｃ（前駆体およびサブユニットを含む）の
生産のための方法および組成物を提供すると記載されて
いる。英国特許出願ＧＢ２，１２５，４０９号は、大腸
菌（Ｅscherichia coli）のような宿主中でのその生産
を含む、因子ＩＸ（その不存在または欠乏はクリスマス
病に関連する）実質的に完全なＤＮＡ配列を開示してい
る。

前記文献は、細胞培養技術におけるリポ蛋白質について
の種々の役割を開示している。例えば、細胞生理学雑誌
（Ｊ．Ｃell.Ｐhysiol.）、１１３（３）、３７３−３
８４ページ（１９８２）において、細胞外マトリックス
上に維持するとき、ウシ副腎皮質の細胞の生存および生
長のためには高い密度のリポ蛋白質が絶対必要であると
著者らは述べている。細胞生理学雑誌（Ｊ．Ｃell.Ｐhy
siol.）、１２０（３）、３５４−３６３ページ（１９
８４）において、培地を高い密度のリポ蛋白質、トラン
スフェリン、線維芽細胞生長因子、ヒドロコーチゾー
ンおよび上皮生長因子を補充したとき、ウサギ肋骨軟骨
細胞の一次培養物は角膜内皮細胞の細胞外マトリックス
上で増殖した。同様に、ウシのレンズの上皮細胞を、血
清不含培地に移す時、高い密度のリポ蛋白質、トランス
フェリン、インシュリンおよび線維芽細胞生長因子を
補充したダルベッコ（Ｄulbecco）の変性イーグル（Ｅa
gle）培地の混合物に対して暴露したとき、細胞外マト
リックス被覆皿上で活性的に増殖した［実験的眼の研究
（Ｅxp.Ｅye Ｒesearch）、３５（３）、２５９−２７
０（１９８２）］。高い密度のリポ蛋白質は、血清不含
培地中でヒト哺乳動物癌細胞系ＭＣＦ−７を系統的に適
合させる方法において、血清の代替物として使用するこ
とが報告された［バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂiochem.
Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.）、１３３（１）、１０５−１
１２、１９８５］。それゆえ、特定の細胞系について特
定の場合において、高い密度のリポ蛋白質補充培地は、
ある細胞系を血清不含培地中の生長に適合させるために
必要であり、そして細胞外マトリックス上の増殖ために
必要でありうることが知られている。いずれの場合にお
いても、所定の細胞培養物へのリポ蛋白質の効果は予測
できない。例えば、細胞の構造および機能（Ｃell Ｓt
ruct. Ｆunct.）、８（１）、６７−７６ページ（１９
８３）において、低密度のリポ蛋白質はヒト正常ＨＥＬ
細胞および４−ニトロキノリン−１−オキシド形質転換
ヒト線維芽細胞の生長を血清の不存在下に促進すること
が記載された。しかしながら、低密度のリポ蛋白質はア
ルファ線で形質転換した前記ヒト線維芽細胞の最適な生
長に対して作用しなかった。

上で引用した参考文献は、ここで教示するようなリポ蛋
白質の使用を開示または示唆していない。すなわち、哺
乳動物の細胞の生長を補捉するために、およびトランス
フェクションした不均質遺伝子の前記細胞からの発現を
増大するために使用することは、従来報告されていな
い。詳しくは、このような方法は組み換え因子ＶＩＩＩ
の生産に適用されてきていない。

本発明は、因子ＶＩＩＩの遺伝子を保持する宿主細胞中
で組み換え因子ＶＩＩＩの発現を増大する方法であっ
て、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培地中で宿主細
胞を培養して組み換え因子ＶＩＩＩの発現を実施するこ
とを特徴とする方法に関する。

前述のように、組み換えＤＮＡ技術により、従来得るこ
とが不可能であった大きい量で、蛋白質を生産する技術
を利用できる。典型的には、蛋白質の生産に起因する遺
伝子を同定しかつ分離するための方法は多少標準のプロ
トコールに従う。問題の蛋白質をまず分離し、そして技
術、例えば、問題の蛋白質に対して特異的のモノクロー
ナル抗体を使用する免疫親和精製を利用して大規模に精
製する。ポリペプチドのアミノ酸配列を現在慣用されて
いる技術により決定することができそして、このように
して得られた配列に基づいて、オリゴヌクレオチドのプ
ローブを調製し、そして試験する種々の組織からの蛋白
質の合成部位を同定および／または分離するために使用
することができる。次いで、ポリアデニル化ｍＲＮＡを
同定した組織から分離することができ、次いでこれを利
用してＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼ（また、「逆トラ
ンスクルプターゼ」呼ぶ）の作用によって一本鎖の相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を形成する。逆トランスクリプタ
ーゼ産生物（ｍＲＮＡ鋳型の部分的または完全なコピ
ー）は、典型的には、３′末端に短い、部分的に二本鎖
のヘヤピンループを示し、ＤＮＡポリメラーゼのための
プライマーとして作用する。ＤＮＡポリメラーゼは遊離
の３′−ヒドロキシ基を有するＤＮＡ鎖の存在を必要と
し、この鎖にヌクレオチド残基が付加され、これにより
５′−３′方向に鎖を延長する。次いで、得られる二本
鎖ｃＤＮＡをＳ１ヌクレアーゼで処理して、残留する一
本鎖断片を除去し、これにより「ブラント末端の」二重
らせんＤＮＡセグメントを発生させる。ｃＤＮＡライブ
ラリーを生産する他の手順を利用できる。例えば、次の
文献を参照：チャン（Ｃhan）およびホワイテッド（Ｗh
itted）、工業微生物学における発展（Ｄevelopments i
nＩndustrial Ｍicrobiology）、Ｖol.９、１７１−１
８０ページ（１９８５）、これをここに引用によって加
える。次いで、問題の蛋白質を暗号化する前記ＤＮＡセ
グメントを、適当な宿主の引続く形質転換のために、適
当なベクター中に結合し、これにより所望産生物の合成
を支配する発現系をつくる。上に言及した一般的手順
は、次の文献に詳述されている：分子クローニング、実
験室のマニュアル（Ｍolecular Ｃloning, ＡＬbor
atory Ｍannual）、マニアチス（Ｍaniatis）ら、コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８
２、これをここに引用によって加える。組み換え因子Ｖ
ＩＩＩの生産に特別に関係する手順の詳細な説明は、次
の文献から得ることができる：欧州特許出願１６０４５
７号；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ８４／０１６４１号、
ＷＯ８５／０１９６１号として発行された；欧州特許
出願１５７５５６号；および欧州特許出願１５０７３５
号。こうして、ここに使用するとき、用語「組み換え因
子ＶＩＩＩ」は、上に概説したような分子生物学的技術
によって生産される機能的蛋白質を意味し、前記蛋白質
はヒト因子ＶＩＩＩの欠乏を補正することができる。

ここに開示しかつ特許請求した方法は、因子ＶＩＩＩの
ための遺伝子を保持する宿主から組み換え因子ＶＩＩＩ
の発現を増大させる。用語「組み換え因子ＶＩＩＩの発
現を増大させる」は、リポ蛋白質および血清不含の条件
を利用しない組み換え系において可能であるよりも、大
きい程度に発現を増大させることを意味する。「血清不
含」とは、血清の本質的に不存在下に因子ＶＩＩＩのた
めの遺伝子を保持する宿主細胞を培養することを意味す
る。血清の不存在下に本発明の方法を実施することが好
ましいが、因子ＶＩＩＩの収量に悪影響を及ぼさない少
量の血清の存在は、本発明の範囲内に明らかに包含され
ると解釈される。しかしながら、当業者は理解できるよ
うに、栄養培地中の増大量の血清の存在は、前記血清中
に存在する異質蛋白質類の増大した集団からの因子ＶＩ
ＩＩの精製を困難とさせる。

因子ＶＩＩＩの発現に適当な宿主細胞は、一般に、多細
胞の有機体から誘導することができ、哺乳動物の細胞、
例えば、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａの細胞、チャイニーズ
ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞系、シリアンハムスタ
ー（baby hamster）の腎（ＢＨＫ）細胞、Ｗ−１３８、
ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫの細胞系は好ましい。シリア
ンハムスターの腎細胞、ことに欧州特許出願１６０４５
７号に記載されているように因子ＶＩＩＩの発現を支配
できる遺伝子でトランスフェクションされたものはとく
に好ましい（クローナル変異種およびその子孫のような
誘導体を包含する）。このような細胞系は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａmerican Ｔy
pe Ｃulture Ｃollection）に受託され、そして受託
番号ＡＴＣＣＣＲＬ−８５４４を与えられている。

因子ＶＩＩＩを暗号化する遺伝子を保持する所望の宿主
細胞系は、典型的な量（すなわち、約７〜約１０％の範
囲内）の血清を含有する適当な培地中で生長期を通す慣
用技術によって培養する。細胞が全面生長に到達しかつ
細胞サイクルの維持期が開始するまで、血清を培地中に
維持する。この手順はこの分野において標準である。し
かしながら、培養が細胞サイクルの維持期に到達する近
時点（すなわち、細胞が全面生長に到達するとき）、血
清を含有する使用済みの栄養培地をリポ蛋白質を補充し
た血清不含栄養培地と交換し、そして培養を維持期にお
いて続け、指示されたとき、各収穫物から因子ＶＩＩＩ
を回収する。当業者は理解するように、培養の維持期が
実施されている血清不含条件（リポ蛋白質が補充されて
いる）は、血清蛋白質が存在する場合よりも、使用済み
栄養培地からの因子ＶＩＩＩの精製を大きく促進するこ
とができる。さらに理解されるように、栄養培地のリポ
蛋白質の存在は宿主細胞からの因子ＶＩＩＩの発現の増
大に影響を及ぼすばかりでなく（血清補給条件下の培養
に比較して）、かつまた延長した期間の間の細胞の生存
能力を支持し、こうして因子ＶＩＩＩの収穫物の数の増
大を可能とする。

宿主細胞系を培養するために選択する栄養培地は、本発
明にとって臨界的でなく、そして選択した宿主細胞系に
適する、この分野において知られているもののいずれか
であるか、あるいはそれらの組み合わせであることがで
きる。このような培地の例は、次の通りである：ダルベ
ッコの変性イーグル培地（Ｄulbecco′s Ｍodified
Ｅagle Ｍedium）、イーグルの最小必須培地、イーグ
ルの基礎培地、ハム（Ｈam）の培地Ｆ−１０、ハムの培
地Ｆ−１２、ＲＰＭＩ−１６４０培地など。すべてのこ
のような培地は、例えば、シグマ・ケミカル・カンパニ
ー（Ｓigma Ｃhemical Ｃompany）、ギブコ（ＧＩＢ
ＣＯ）およびＭ．Ａ．バイオプロダクツ（Ｂioproduct
s）のような源から商業的に入手可能である。栄養培地
は、また、種々の緩衝剤、例えば、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスル
ホン酸）を含有することができ、そしてまた、因子、例
えば、インシュリン、トランスフェリン、テステステロ
ン、ナトリウムセレナイト、エタノールアミン、グルタ
ミン、飽和脂肪酸、飽和脂肪酸などをリポ蛋白質の外に
補充されることができる。栄養培地へのこのような因子
の添加量は、この分野において普通のものである。例え
ば、インシュリンの量は培地１ｍにつき約５〜約１０
マイクログラム（μｇ）の範囲であることができ、トラ
ンスフェリンの量は培地１ｍにつき約２．５〜約２５
μｇの範囲であることができ、グルタミンの量は培地１
ｍにつき約２００〜約６００μｇの範囲であることが
でき、飽和および不飽和の脂肪酸の量は培地１ｍにつ
き約１〜約１０μｇの範囲であることができ、そしてテ
ステステロンの量は培地１ｍにつき約１０〜約５０ナ
ノグラム（ng）の範囲であることができる。

栄養培地を補充するために使用するリポ蛋白質は任意の
源であることができるが、哺乳動物源、例えば、ウシ、
ウマ、ヒツジ、ブタまたはヒトが好ましい。ウシリポ蛋
白質はとくに好ましい。ウシリポ蛋白質は種々の源から
入手可能であり、例えば、ペンテックスリポ蛋白質溶液
（Ｐentex Ｌipoprotein Ｓolution）（カタログ番号
８２−００４）およびペンテックスコレステロール溶液
（カタログ番号８２−１０８）、両者はマイルス・ラボ
ラトリーズ・インコーポレーテッド（Ｍiles Ｌaborat
ories, Ｉnc.、米国インディアナ州エルクハルト）か
ら入手可能である。ウシリポ蛋白質は、また、前述の標
準技術を使用して新しく分離したウシ血清の超遠心によ
り調製することができる。リポ蛋白質は、前記細胞の生
命環の維持期の間細胞の生存能力を持続できる量で栄養
培地中に存在する。リポ蛋白質は、前記細胞の生活環の
維持期の間に、細胞の生存能力を持続することのできる
量で、栄養培地中の存在する。好ましくは、この量は栄
養培地の１ｍ当り０．１mg〜２．０mgの間で変化する
ことがわかった。栄養培地の１ｍ当り０．２mg〜１．
０mgのリポ蛋白質の含量はとくに好ましい。

慣用技術、例えば、回転瓶培養の加えて、本発明の方法
は、また、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍethods
in Ｅnzymology）、Ｖol.ＬＶＩＩＩ、「細胞の培養
（Ｃell Ｃulture）」（１９７９）、Ｗ，Ｂ．ジャコ
バイ（Ｊakoby）およびＩ．Ｈ．パスタン（Ｐastan）、
編（これを引用によってここに加える）に記載されてい
るようなマイクロキャリヤー系とともに使用するために
適用できる。適当なマイクロキャリヤーは、例えば、種
々のサイトデックス（Ｃytodex）マイクロキャリヤー
［すなわち、サイトデックス−１、サイトデックス−
２、サイトデックス−３、ファーマシア・インコーポレ
ーテッド（Ｐharmacia,Ｉnc.）から入手可能」、ゲリビ
ーズ（Ｇelibeads）［Ｋ．Ｃ．バイオロジカルス（Ｂio
logicals）から入手可能］などを包含する。さらに、本
発明の方法は、また、細胞懸濁系に適用できる。

培養条件は、使用する細胞についての標準の高所に関し
て選択する。因子ＶＩＩＩの発現を指示できる遺伝子を
有する選択した細胞系は、このような反応のもとで生長
できるということで十分であり、そしてこのような時間
の間、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培地におい
て、同様に前記宿主から組み換え因子ＶＩＩＩの発現を
増大するために十分であろう。例えば、哺乳動物細胞系
について、培養は約３６〜３８℃において約２４〜約７
２時間の間実施することが望ましいであろう。しかしな
がら、これらのパラメーター選択は日常のことであり、
かつ当業者の技量の範囲内である。宿主細胞の培養後、
因子ＶＩＩＩを使用済み栄養培地から、標準法、例え
ば、遠心または限外過によって回収できる。望むなら
ばおよび／または必要に応じて、回収された因子ＶＩＩ
Ｉを、例えば、イオン交換または大きさ排除クロマトグ
ラフィー（size exclusion chromatography）、免疫精
製などによって精製することができる。

次の実施例により本発明をさらに説明するが、これらの
実施例は本発明を限定するものではない。

実施例１本発明における使用に適するウシリポ蛋白質を次のよう
にして調製する。新鮮なウシ血清（商業的屠殺場から入
手した）の５０ｍを、１６ｇの臭化カリウムに添加し
て、ウシ血清の密度を１．２１ｇ／ｍの密度を調節し
た。次いで、この血清を４０，０００rpmで２４時間４
℃において遠心機内［ベックマン（Ｂeckman）Ti４５は
好ましい］内で２４時間遠心して、相分離させる。次い
で、上の黄色油状リポ蛋白質の分画を集め、再び４０，
０００rpmで２４時間遠心した。リポ蛋白質の分画を分
離し、ＮａＣｌ：ＥＤＴＡ（０．１５ミリモルのＮａＣ
ｌ、１．０ミリモルＥＤＴＡ、pH７．４）に対して広範
に透析した。次いで、透析したリポ蛋白質を０．１μフ
ィルター［ミリポア（Ｍillipore）］で滅菌した。必要
に応じて、リポ蛋白質はブラッドフォード（Ｂradfor
d）キット［バイオラド・インコーポレーテッド（Ｂior
ad,Ｉnc.）からカタログ番号５００−０００２で商業的
に入手可能］により定量することができ、そしてコレス
テロール含量はシグマ・ケミカル（Ｓigma Ｃhemical
Ｃo.）から入手できるキット（カタログ番号３５１−
２０）を使用して定量することができる。

実施例２因子ＶＩＩＩの発現を指示できる遺伝子でトランスフェ
クションしたシリアンハムスター（baby hamster）腎細
胞（ＢＨＫ−２１）は、ジェネンテク・インコーポレー
テッド（Ｇenentech,Ｉnc.、米国カリフォルニア州南サ
ンフランシスコ）から入手した。前記細胞系を欧州特許
出願１６０４５７号に詳述されているようにして調製
し、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection）に
寄託し、そしてＡＴＣＣＣＲＬ−８５４４の受託番号
を与えられた。

因子ＶＩＩＩを暗号化する遺伝子を含有するＢＨＫ−２
１細胞を全面生長に生長させ（上の欧州特許出願１６０
４５７号に詳述されているように）、引続いて０．２５
％のトリプシン−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯから商業的に入
手可能）でトリプシン化した。次いで、細胞をハンクの
均衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、そして血球計で顕微
鏡下に計数した。２０×１０⁶細胞を４９０センチメー
ター（cm）²の回転瓶［コーニング・グラス・インコー
ポーレーテッド（Ｃorning Ｇlass, Ｉnc.）］の中に
接種し、これにハムの培地４−１２およびダルゲッコの
（低グルコース）最少必須培地（５０：５０重量）およ
び７％の胎児ウシ血清を含有する生長培地の１５０ｍ
を添加する。細胞を３７℃で７２時間０．３rpmの回転
速度で生長させた。細胞が全面生長に到達した後、使用
済みの培地をデカンテーションし、廃棄し、そして細胞
を１００ｍおＨＢＳＳで洗浄した。次いで、血清不含
栄養培地を蛋白質し、そして次の成分を含有した：ハム
の培地Ｆ−１２およびダルベッコの（低グルコース）最
少必須培地（５０：５０、重量）、実施例１のようにし
て調製したウシリポ蛋白質（０．４mg／ｍ）、ウシイ
ンシュリン（５．０μｇ／ｍ）、ウシトランスフェリ
ン（２．５μｇ／ｍ）、グルタミン（２９２μｇ／ｍ
）およびＭｇＣｌ₂（１５ミリモル）。

次いで、この血清不含栄養培地の１００ｍを細胞に添
加し、これを３７℃で４８時間０．３rpmの回転速度で
生長させた。次いで、使用済みの血清不含栄養培地を因
子ＶＩＩＩのために収穫し、そして１００ｍの新鮮な
血清不含栄養培地を細胞に添加し、再び３７℃で４８時
間０．３rpmの回転速度で生長させた。組み換え因子Ｖ
ＩＩＩを含有する使用済みの血清不含栄養培地の３つの
収穫物が得られるまで、この方法を反復した。各収穫物
を個々に因子ＶＩＩＩの活性について、発色性基質決定
法により、アッセイした。前記アッセイはコーテスト因
子ＶＩＩＩ（Ｃoatest Ｆactor ＶＩＩＩ）として既
知の試験キットとして商業的に販売されており、そして
ヘレナ・ラボラトリーズ（Ｈelena Ｌaboratories、米
国テキサス州ビーアウモント）（カタログ番号５２９
３）から商業的に入手可能である。使用する手順は製造
業者から提供されるか、あるいは欧州特許出願１６０４
５７号にさらに詳述されている。コーテスト因子ＶＩＩ
Ｉキットで決定した、３つの収穫物の各々についての因
子ＶＩＩＩの活性を表Ｉに記載する。

表Ｉに記載されているデータから理解できるように、リ
ポ蛋白質を補充した血清不含条件下に因子ＶＩＩＩを暗
号化する遺伝子を含有するＢＨＫ−２１細胞を培養する
と、因子ＶＩＩＩの生産が増大された。比較のため、リ
ポ蛋白質を補充しない普通の血清含有栄養培地を使用し
て、前述のＢＨＫ−２１細胞系（すなわち、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−８５４４）を培養すると、因子ＶＩＩＩは約１
５０〜約２００単位／で生産された。さらに、細胞は
血清不含条件下に生長せず、典型的には第２の収穫後に
死亡した。

実施例３実施例２に記載するＢＨＫ−２１細胞系のクローナル変
異型（すなわち、ＡＴＣＣＣＲＬ−８５４４のクロー
ナル変異型）を、ジェネンテク・インコーポレーテッド
（Ｇenentech, Ｉnc.、米国カリフォルニア州南サンフ
ランシスコ）から入手した。実施例２の手順を利用し
て、前記クローナル変異型をリポ蛋白質を補充した血清
不含栄養培地条件下に５回の収穫で培養した。これらの
データを表ＩＩに記載する。

ように、リポ蛋白質を補充した血清不含条件下に因子Ｖ
ＩＩＩを暗号化する遺伝子を含有するＢＨＫ−２１細胞
のクローナル変異型を培養すると、因子ＶＩＩＩの生産
が有意に増大された。比較のため、リポ蛋白質を補充し
ない普通の血清含有栄養培地を使用すると、因子ＶＩＩ
Ｉは約８００〜約１２００単位／の量で生産された
（クローナル変異型について）。さらに、細胞は血清不
含条件下に生長せず、典型的には第２の収穫後に死亡し
た。

実施例４本発明の方法が、また、マイクロキャリヤー系を利用す
る組み換え因子ＶＩＩＩの生産に適用できることを示す
ために、次を実施した。

１ｇのサイテックス−３マイクロキャリヤー（ファーマ
シア・インコーポレーテッド）を、洗浄しかつ５００ｍ
のリン酸塩干渉化生理的食塩水（ギブコ）で４時間水
和し、その後マイクロキャリヤー１２１℃で３０分間オ
ートクレーブ処理した。マイクロキャリヤーを、同重量
部のハムのＦ−１２培地およびダルベッコの変性イーグ
ル培地を含有する生長培地の２５０ｍで洗浄し、次い
でベルコ（Ｂellco）回転フラスコ（ベルコ・グラス・
インコーポレーテッド）内で７％の胎児ウシ血清アルブ
ミンを補充した前記生長培地の２５０ｍ中に懸濁させ
た。因子ＶＩＩＩの発現を指示できる遺伝子でトランス
フェクションした４０×１０⁶ＢＨＫ−２１細胞（実施
例３に記載するような）をマイクロキャリヤーに添加し
た。得られる細胞懸濁液を３７℃で３時間インキュベ
ーションし（２分〜３０分の間隔で３０rpmにおい
て）、その後７％の胎児ウシ血清アルブミンを補充した
前記生長培地の２５０ｍを添加した。次いで、マイク
ロキャリヤーを連続的に攪拌しながら３７℃において７
２時間インキュベーションし、使用済みの培地を除去
し、そしてマイクロキャリヤーをＨＢＳＳで２回洗浄し
た。実施例２に記載する血清不含栄養培地の５００ｍ
をマイクロキャリヤーに添加し、そしてこの系を連続的
に攪拌（３０rpm）しながら３７℃でインキュベーショ
ンした。２４時間の間隔後、血清不含栄養培地を収穫
し、マイクロキャリヤー系において５００ｍの新鮮な
血清不含栄養培地と交換した。培養を第９日目に停止
し、組み換え因子ＶＩＩＩを含有する使用済み血清不含
栄養培地を合計６回収穫した。収穫物の各々を個々に因
子ＶＩＩＩ活性について、実施例２に記載する発色性基
質の決定法を用いてアッセイした。結果を表ＩＩＩに示
す。

表ＩＩＩに記載されているデータから理解できるよう
に、リポ蛋白質を補充した血清不含条件下に因子ＶＩＩ
Ｉを暗号化する遺伝子を含有するＢＨＫ−２１細胞をマ
イクロキャリヤー系を利用して培養することにより、因
子ＶＩＩＩの生産が有意に増大された。比較のため、リ
ポ蛋白質を補充しない普通の血清含有栄養培地を使用す
ると、因子ＶＩＩＩは約２００〜約３００単位／の量
で生産された。さらに、この特定の場合において６回の
みの収穫を実施したが、当業者は理解するように、細胞
の生存能力はより大きい程度に維持されるので、追加の
収穫を実施できる（典型的には１０〜約１５回程度に多
く）。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】因子ＶＩＩＩの遺伝子を保持する哺乳動物
の宿主細胞の中で組み換え因子ＶＩＩＩの発現を増大す
る方法であって、リポ蛋白質を補充した血清不含栄養培
地中で該宿主細胞を培養して組み換え因子ＶＩＩＩの発
現を実施することを特徴とする方法。
【請求項２】前記哺乳動物の宿主細胞がベビーハムスタ
ーの腎細胞である特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】前記リポ蛋白質が哺乳動物源からのもので
ある特許請求の範囲第１または２項記載の方法。
【請求項４】前記哺乳動物源がウシ、ウマ、ヒツジ、ブ
タまたはヒトから選択される特許請求の範囲第３項記載
の方法。
【請求項５】前記リポ蛋白質がウシリポ蛋白質である特
許請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量
が０．１mg／ｍ〜２．０mg／ｍである特許請求の範
囲第５項記載の方法。
【請求項７】栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在量
が０．２mg／ｍ〜１．０mg／ｍである特許請求の範
囲第６項記載の方法。
【請求項８】前記宿主細胞がアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａmerican Ｔype Ｃulture
Ｃollection）に受託されかつ受託番号ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ８５４４を与えられた宿主細胞系およびその誘導体
である特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項９】前記リポ蛋白質が哺乳動物源からのもので
ある特許請求の範囲第８項記載の方法。
【請求項１０】前記哺乳動物源がウシ、ウマ、ヒツジ、
ブタまたはヒトから選択される特許請求の範囲第９項記
載の方法。
【請求項１１】前記リポ蛋白質がウシリポ蛋白質である
特許請求の範囲第１０項記載の方法。
【請求項１２】栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在
量が０．１mg／ｍ〜２．０mg／ｍである特許請求の
範囲第１１項記載の方法。
【請求項１３】栄養培地中の前記ウシリポ蛋白質の存在
量が０．２mg／ｍ〜１．０mg／ｍである特許請求の
範囲第１２項記載の方法。