JP2003506077A - 組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用 - Google Patents
組換え安定細胞クローン、その産生およびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、血清およびタンパク質を全く含まない培地で，少なくとも４０世代の間安定である、安定な組換え細胞クローン、ならびに、血清またはタンパク質の使用を含まない培養条件下でこの安定な細胞クローンを増殖することによって得られるバイオマスに関する。本発明はまた、このバイオマスを用いて組換えタンパク質を産生するための方法、安定な組換え細胞クローンを産生するための方法、および血清またはタンパク質を含む合成最小培地における組換えタンパク質の産生に関する。
Description
【０００１】
本発明は、無血清無タンパク質培地で、少なくとも４０世代の間安定である、
安定な組換え細胞クローン、血清およびタンパク質を含まない培養条件下におけ
るこの安定な細胞クローンの増殖によって得られるバイオマス、およびバイオマ
スの手法による組換えタンパク質の調製のための方法に関する。さらに、本発明
は、安定な組換え細胞クローンの調製のための方法に関する。さらに、本発明は
、無血清無タンパク質合成最小培地における組換えタンパク質の調製に関する。
安定な組換え細胞クローン、血清およびタンパク質を含まない培養条件下におけ
るこの安定な細胞クローンの増殖によって得られるバイオマス、およびバイオマ
スの手法による組換えタンパク質の調製のための方法に関する。さらに、本発明
は、安定な組換え細胞クローンの調製のための方法に関する。さらに、本発明は
、無血清無タンパク質合成最小培地における組換えタンパク質の調製に関する。
【０００２】
特定の生物医学的製品（例えば、血液因子）において、組換えタンパク質の調
製はますます重要となっている。組換え細胞の最適な増殖を可能にするために、
通常、血清が培地に加えられる。血清の高い費用のために、および培養培地中の
血清を介するウイルス病原体または分子病原体によって可能性のあるコンタミネ
ーションを防ぐために、多くの無血清培地が開発されてきたが、これらは、特に
、ウシまたはヒト起源の添加物をなんら含んではならない。調製プロセスにおけ
るこのような培地の使用は、ウイルス病原体および分子病原体による調製産物の
コンタミネーションの低い危険性を可能にするのみでなく、発現タンパク質のよ
り簡単な精製をも可能にする。
製はますます重要となっている。組換え細胞の最適な増殖を可能にするために、
通常、血清が培地に加えられる。血清の高い費用のために、および培養培地中の
血清を介するウイルス病原体または分子病原体によって可能性のあるコンタミネ
ーションを防ぐために、多くの無血清培地が開発されてきたが、これらは、特に
、ウシまたはヒト起源の添加物をなんら含んではならない。調製プロセスにおけ
るこのような培地の使用は、ウイルス病原体および分子病原体による調製産物の
コンタミネーションの低い危険性を可能にするのみでなく、発現タンパク質のよ
り簡単な精製をも可能にする。
【０００３】
組換え細胞は、ほとんどの場合、高細胞密度（「ワーキング細胞バンク（ｗｏ
ｒｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）」の細胞密度とほぼ等しい）が達成されるま
で、血清含有培地で培養され、次いで、産生段階の間、組換え細胞は、無血清培
地に再び適用される。
ｒｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）」の細胞密度とほぼ等しい）が達成されるま
で、血清含有培地で培養され、次いで、産生段階の間、組換え細胞は、無血清培
地に再び適用される。
【０００４】
Ｍｉｙａｊｉら（１９９０、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ３：１３３−
１４０）は、インスリンおよびトランスフェリンを含む無血清培地において、血
清非依存性細胞クローンを選択した。しかし、１６日後に、その生存可能な数お
よび発現率は連続的に減少したことが示された。Ｍｉｙａｊｉら（１９９０、Ｃ
ｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１７３−１８０）は、マーカー遺伝子との同
時増殖によって、組換え細胞の発現率および生産性を改善することを試みた。
１４０）は、インスリンおよびトランスフェリンを含む無血清培地において、血
清非依存性細胞クローンを選択した。しかし、１６日後に、その生存可能な数お
よび発現率は連続的に減少したことが示された。Ｍｉｙａｊｉら（１９９０、Ｃ
ｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１７３−１８０）は、マーカー遺伝子との同
時増殖によって、組換え細胞の発現率および生産性を改善することを試みた。
【０００５】
Ｙａｍａｕｃｈｉら（１９９２、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．５６：６００−６０４）は、ヒト血清アルブミン、インスリンお
よびトランスフェリンを含む無血清培地で、マイクロタイタープレート上に血清
依存性細胞を単一層として３〜４週間培養することによって、血清非依存性組換
えＣＨＯサブクローンを樹立した。約０．１％の細胞が、血清非依存性であった
。サブクローンの一部はまた、無血清培地における懸濁培養で増殖したが、ここ
では、細胞は凝集体およびクランプを形成した。細胞の倍加時間は、１．５日で
あった。しかし、得られた血清非依存性クローンの安定性について、および血清
を含まない条件下でのこれらのクローンの長期培養について、何の示唆も提供さ
れていない。
ｉｏｃｈｅｍ．５６：６００−６０４）は、ヒト血清アルブミン、インスリンお
よびトランスフェリンを含む無血清培地で、マイクロタイタープレート上に血清
依存性細胞を単一層として３〜４週間培養することによって、血清非依存性組換
えＣＨＯサブクローンを樹立した。約０．１％の細胞が、血清非依存性であった
。サブクローンの一部はまた、無血清培地における懸濁培養で増殖したが、ここ
では、細胞は凝集体およびクランプを形成した。細胞の倍加時間は、１．５日で
あった。しかし、得られた血清非依存性クローンの安定性について、および血清
を含まない条件下でのこれらのクローンの長期培養について、何の示唆も提供さ
れていない。
【０００６】
細胞遊離段階の間の細胞の代謝活性および増殖の維持を可能にする培地は、し
ばしば添加物質（例えば、増殖因子、インスリンまたはトランスフェリン、ある
いは血清構成成分に代わる接着因子）を含んだ。
ばしば添加物質（例えば、増殖因子、インスリンまたはトランスフェリン、ある
いは血清構成成分に代わる接着因子）を含んだ。
【０００７】
インスリンまたはトランスフェリンのようなポリペプチド因子の添加を省くた
めに、そして無タンパク質培地条件を可能とするために、種々の技術が開発され
てきた。例えば、タンパク質を含まない条件下でさえも細胞増殖を可能とする、
特別に規定された、完全無タンパク質培地が開発されてきた。
めに、そして無タンパク質培地条件を可能とするために、種々の技術が開発され
てきた。例えば、タンパク質を含まない条件下でさえも細胞増殖を可能とする、
特別に規定された、完全無タンパク質培地が開発されてきた。
【０００８】
ＷＯ９７／０５２４０は、細胞が所望のタンパク質に加えて増殖因子を共発現
する、タンパク質を含まない条件下における組換えタンパク質の調製について記
載する。
する、タンパク質を含まない条件下における組換えタンパク質の調製について記
載する。
【０００９】
日本国特許第２６９６００１号は、宿主細胞の産生を向上するための非イオン
性界面活性剤またはシクロデキストリンの添加による、ＣＨＯ細胞における第Ｖ
ＩＩＩ因子の調製のための無タンパク質培地の使用について記載する。これらの
添加物の有効性を増すために、例えば、ブチラートおよびリチウムを添加するこ
とが、推奨されてきた。
性界面活性剤またはシクロデキストリンの添加による、ＣＨＯ細胞における第Ｖ
ＩＩＩ因子の調製のための無タンパク質培地の使用について記載する。これらの
添加物の有効性を増すために、例えば、ブチラートおよびリチウムを添加するこ
とが、推奨されてきた。
【００１０】
ＷＯ９６／２６２６６は、グルタミン含有タンパク質加水分解産物を含む培地
での細胞の培養について記載し、その加水分解産物の遊離アミノ酸含量は、全タ
ンパク質量の１５％未満であり、そしてその加水分解産物のペプチドは、４４ｋ
ｄ未満の分子量を有する。合成最小培地は、細胞培養のための培養培地における
基本培地として使用され、その基本培地には、タンパク質加水分解産物に以外に
、ウシ胎仔血清、ゲンタマイシンおよびメルカプトエタノールを含む他の添加物
もまた、加えられる。血液因子の組換え調製に対するこの血清含有培地の使用は
、述べられていない。
での細胞の培養について記載し、その加水分解産物の遊離アミノ酸含量は、全タ
ンパク質量の１５％未満であり、そしてその加水分解産物のペプチドは、４４ｋ
ｄ未満の分子量を有する。合成最小培地は、細胞培養のための培養培地における
基本培地として使用され、その基本培地には、タンパク質加水分解産物に以外に
、ウシ胎仔血清、ゲンタマイシンおよびメルカプトエタノールを含む他の添加物
もまた、加えられる。血液因子の組換え調製に対するこの血清含有培地の使用は
、述べられていない。
【００１１】
米国特許第５，３９３，６６８号は、タンパク質を含まない条件下における接
着細胞の増殖を可能にする特定の合成表面について記載する。
着細胞の増殖を可能にする特定の合成表面について記載する。
【００１２】
細胞増殖を刺激するために、ヒトインスリンを過剰発現するＣＨＯ細胞を、共
有結合インスリンが結合する人工基板上で増殖させた（Ｉｔｏら、１９９６、Ｐ
ＮＡＳ ＵＳＡ ９３：３５９８−３６０１）。
有結合インスリンが結合する人工基板上で増殖させた（Ｉｔｏら、１９９６、Ｐ
ＮＡＳ ＵＳＡ ９３：３５９８−３６０１）。
【００１３】
Ｒｅｉｔｅｒら（１９９２、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２４７−２
５３）は、血清含有培地において高密度で培養させたｒ−ＣＨＯ細胞の支持体へ
の固定、および、引き続いて起こる、増殖期間の間の無タンパク質培地中での固
定化細胞の灌流について記載し、ここでは、タンパク質の細胞上清への連続的放
出が観察された。しかし、細胞は、無タンパク質培地中で、１０世代未満の間、
灌流された。
５３）は、血清含有培地において高密度で培養させたｒ−ＣＨＯ細胞の支持体へ
の固定、および、引き続いて起こる、増殖期間の間の無タンパク質培地中での固
定化細胞の灌流について記載し、ここでは、タンパク質の細胞上清への連続的放
出が観察された。しかし、細胞は、無タンパク質培地中で、１０世代未満の間、
灌流された。
【００１４】
タンパク質を含まない条件下での工業的な「大規模な」細胞培養の首尾よい調
製のために、今日まで、利用可能な方法は、連続継代細胞系（特にＶＥＲＯ細胞
（ＷＯ９６／１５２３１））について記載されてきた。この細胞は、ここでは、
血清およびタンパク質を含まない条件下で、元のアンプルから１２００Ｌの工業
的規模まで培養された。しかし、使用された細胞は、組換え細胞ではなく、溶解
プロセスでウイルス抗原の産生のために使用される宿主細胞である。
製のために、今日まで、利用可能な方法は、連続継代細胞系（特にＶＥＲＯ細胞
（ＷＯ９６／１５２３１））について記載されてきた。この細胞は、ここでは、
血清およびタンパク質を含まない条件下で、元のアンプルから１２００Ｌの工業
的規模まで培養された。しかし、使用された細胞は、組換え細胞ではなく、溶解
プロセスでウイルス抗原の産生のために使用される宿主細胞である。
【００１５】
接着性ＶＥＲＯ細胞と対照的に、ＣＨＯ細胞は、例えば、限定された範囲で接
着に依存しているだけである。血清含有条件下で従来の方法によって培養された
ＣＨＯ細胞は、滑らかな微細支持体（ｍｉｃｒｏｓｕｐｐｏｒｔ）および多孔性
微細支持体の両方に結合可能である（米国特許第４，９７８，６１６号、Ｒｅｉ
ｔｅｒら、１９９２、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ９：２４７−２５３）
。ＣＨＯ細胞を血清を含まない条件下で増殖させる場合、ＣＨＯ細胞はこの性質
を失い、そして滑らかな支持体（例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３）に接着しないか
、あるいは接着促進添加物（例えば、フィブロネクチン、インスリンまたはトラ
ンスフェリン）が培地に全く加えられない程度まで、ＣＨＯ細胞が滑らかな支持
体から容易に分離する。血清を含まない条件下で、ＣＨＯ細胞の支持体への接着
が少ないため、従って、組換えタンパク質の産生は、通常、懸濁培養で行われる
。本明細書中で、この産生プロセスは、連続方法またはバッチ方法によって実行
され得る。本明細書中で、組換え細胞培養は、最適細胞密度が達成されるまで、
バイオリアクター中で培養される；タンパク質発現は、必要に応じて誘発され、
そして、発現タンパク質のみでなく組換え細胞も含む培地は、収集のために、反
応タンクから一定の間隔で流し出され、従って、産生プロセスから除去される。
バイオマスの連続的損失の結果として、バイオリアクターでの産生効率は下がり
、そしてその産生効率は、新鮮培地をゆっくり加えた後にのみ増加する。なぜな
ら、細胞は、所望の細胞密度に達するまで増殖しなくてはならないからである。
従って、そして連続プロセスにもかかわらず、このシステムには生産速度が減少
する遅延期が常に存在する。さらに、増殖および産生のための能力は、このよう
なシステムでは、最大の達成可能な細胞密度によって限定されている。
着に依存しているだけである。血清含有条件下で従来の方法によって培養された
ＣＨＯ細胞は、滑らかな微細支持体（ｍｉｃｒｏｓｕｐｐｏｒｔ）および多孔性
微細支持体の両方に結合可能である（米国特許第４，９７８，６１６号、Ｒｅｉ
ｔｅｒら、１９９２、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ９：２４７−２５３）
。ＣＨＯ細胞を血清を含まない条件下で増殖させる場合、ＣＨＯ細胞はこの性質
を失い、そして滑らかな支持体（例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３）に接着しないか
、あるいは接着促進添加物（例えば、フィブロネクチン、インスリンまたはトラ
ンスフェリン）が培地に全く加えられない程度まで、ＣＨＯ細胞が滑らかな支持
体から容易に分離する。血清を含まない条件下で、ＣＨＯ細胞の支持体への接着
が少ないため、従って、組換えタンパク質の産生は、通常、懸濁培養で行われる
。本明細書中で、この産生プロセスは、連続方法またはバッチ方法によって実行
され得る。本明細書中で、組換え細胞培養は、最適細胞密度が達成されるまで、
バイオリアクター中で培養される；タンパク質発現は、必要に応じて誘発され、
そして、発現タンパク質のみでなく組換え細胞も含む培地は、収集のために、反
応タンクから一定の間隔で流し出され、従って、産生プロセスから除去される。
バイオマスの連続的損失の結果として、バイオリアクターでの産生効率は下がり
、そしてその産生効率は、新鮮培地をゆっくり加えた後にのみ増加する。なぜな
ら、細胞は、所望の細胞密度に達するまで増殖しなくてはならないからである。
従って、そして連続プロセスにもかかわらず、このシステムには生産速度が減少
する遅延期が常に存在する。さらに、増殖および産生のための能力は、このよう
なシステムでは、最大の達成可能な細胞密度によって限定されている。
【００１６】
無タンパク質培地に対する血清含有条件下で培養された細胞の適用の際、発現
タンパク質の収量および組換えＣＨＯ細胞の生産性は、血清含有条件と比較して
、無タンパク質培地での適用後にひどく減少することが、一貫して観察された（
Ｐａｔｅｒｓｏｎら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６５８）。
タンパク質の収量および組換えＣＨＯ細胞の生産性は、血清含有条件と比較して
、無タンパク質培地での適用後にひどく減少することが、一貫して観察された（
Ｐａｔｅｒｓｏｎら、１９９４、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．４０：６９１−６５８）。
【００１７】
このことは、培養条件における変化の結果としての、組換えクローンの不安定
性または増殖の減少によって説明される。変化した醗酵条件のために−そして安
定な本来のクローンの使用にもかかわらず−細胞の大部分が、減少した発現を有
する細胞に、または非産生細胞に常に変化し、この細胞は、産生プロセスの間、
産物産生細胞を過剰増殖し、その結果、最後には、大部分が非産生細胞または低
発現の細胞からなる醗酵培養が得られる。
性または増殖の減少によって説明される。変化した醗酵条件のために−そして安
定な本来のクローンの使用にもかかわらず−細胞の大部分が、減少した発現を有
する細胞に、または非産生細胞に常に変化し、この細胞は、産生プロセスの間、
産物産生細胞を過剰増殖し、その結果、最後には、大部分が非産生細胞または低
発現の細胞からなる醗酵培養が得られる。
【００１８】
この状況の結果は、醗酵培養の最大の産生能力は連続的に減少し、そして最大
の産物産生は、一定数の世代または細胞継代に限定されるということである。
の産物産生は、一定数の世代または細胞継代に限定されるということである。
【００１９】
従って、特に、血清およびタンパク質を含まない条件下での組換えタンパク質
の工業的産生において、可能な限り長い期間にわたって連続的産生を可能とする
システムに対する必要性がある。
の工業的産生において、可能な限り長い期間にわたって連続的産生を可能とする
システムに対する必要性がある。
【００２０】
さらに、タンパク質を含まない条件下で産生時期に多世代にわたって安定で、
かつ組換えタンパク質を発現する、組換え細胞クローンを得ることが望まれる。
従って、本発明の課題は、血清およびタンパク質を含まない、培養および産生条
件下で組換えタンパク質の調製のための効率的な方法を提供することである。
かつ組換えタンパク質を発現する、組換え細胞クローンを得ることが望まれる。
従って、本発明の課題は、血清およびタンパク質を含まない、培養および産生条
件下で組換えタンパク質の調製のための効率的な方法を提供することである。
【００２１】
さらなる目的は、安定な組換え細胞クローンを提供することである。
【００２２】
本発明に従って、この課題は、細胞培養から得られ得る組換え細胞クローンを
利用可能とすることによって解決され、ここで、細胞クローンは、血清含有培地
において組換えの本来の細胞クローンを培養し、そして無血清無タンパク質培地
にこの細胞を再び適用した後に得られる。本発明書中で、細胞はさらに、産生条
件と同じ条件下で、無血清無タンパク質培地で少なくとも４０世代の間培養され
る。
利用可能とすることによって解決され、ここで、細胞クローンは、血清含有培地
において組換えの本来の細胞クローンを培養し、そして無血清無タンパク質培地
にこの細胞を再び適用した後に得られる。本発明書中で、細胞はさらに、産生条
件と同じ条件下で、無血清無タンパク質培地で少なくとも４０世代の間培養され
る。
【００２３】
従って、本発明に従う細胞クローンは、支配的な部分において、無血清無タン
パク質培地で安定な様式で少なくとも４０世代の間培養し得る細胞集団を形成す
る。本明細書中で、８０％を超える、詳細には９９％を超える、本発明に従う細
胞集団または本発明に従う細胞クローンが、少なくとも４０世代の間安定である
ことが好ましい。
パク質培地で安定な様式で少なくとも４０世代の間培養し得る細胞集団を形成す
る。本明細書中で、８０％を超える、詳細には９９％を超える、本発明に従う細
胞集団または本発明に従う細胞クローンが、少なくとも４０世代の間安定である
ことが好ましい。
【００２４】
本明細書中で、細胞を培養することが、選択マーカーおよび／または増殖遺伝
子に対する選択なしで（例えば、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞の場合、ＭＴＸが存在
しないで）実行されることが好ましい。
子に対する選択なしで（例えば、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞の場合、ＭＴＸが存在
しないで）実行されることが好ましい。
【００２５】
本発明の文脈において、用語、本来の細胞クローン（ｏｒｉｇｉｎａｌ ｃｅ
ｌｌ ｃｌｏｎｅ）は、組換え細胞クローントランスフェクト体を意味し、これ
は、組換えヌクレオチド配列による宿主細胞の形質導入後に、研究室条件下で安
定な様式で組換え産物を発現する。本来のクローンは、血清含有培地で増殖最適
化のために培養される。生産性を上げるために、本来のクローンは、必要に応じ
て、選択試薬の存在下で、かつ選択マーカーおよび／または増殖マーカーに対す
る選択を伴って培養される。工業的産生のために、本来の細胞クローンは、高い
細胞密度が達成されるまで、血清含有培養条件下で培養され、そして、この本来
の細胞クローンは、産生期直前に、無血清および／または無タンパク質培地に適
用される。本明細書中で、培養は、好ましくは、選択的圧力なしで実行される。
ｌｌ ｃｌｏｎｅ）は、組換え細胞クローントランスフェクト体を意味し、これ
は、組換えヌクレオチド配列による宿主細胞の形質導入後に、研究室条件下で安
定な様式で組換え産物を発現する。本来のクローンは、血清含有培地で増殖最適
化のために培養される。生産性を上げるために、本来のクローンは、必要に応じ
て、選択試薬の存在下で、かつ選択マーカーおよび／または増殖マーカーに対す
る選択を伴って培養される。工業的産生のために、本来の細胞クローンは、高い
細胞密度が達成されるまで、血清含有培養条件下で培養され、そして、この本来
の細胞クローンは、産生期直前に、無血清および／または無タンパク質培地に適
用される。本明細書中で、培養は、好ましくは、選択的圧力なしで実行される。
【００２６】
これらの条件下では、無血清無タンパク質培地に再び適用されたこのような細
胞培養における、大部分（９５％を超える）の細胞が、産物非産生細胞に変化す
ることがわかった。産物特異的抗体による免疫蛍光の方法によって、無血清無タ
ンパク質培地における細胞の世代時間の関数として、培養での非産生細胞の数は
増加し、産物産生細胞を過剰増殖させ、その結果、培養の生産性が減るというこ
とが示され得る。
胞培養における、大部分（９５％を超える）の細胞が、産物非産生細胞に変化す
ることがわかった。産物特異的抗体による免疫蛍光の方法によって、無血清無タ
ンパク質培地における細胞の世代時間の関数として、培養での非産生細胞の数は
増加し、産物産生細胞を過剰増殖させ、その結果、培養の生産性が減るというこ
とが示され得る。
【００２７】
無血清無タンパク質培地への再適用の後に得られる細胞培養は、血清およびタ
ンパク質を含まない条件下で安定な産物を産生する細胞集団の細胞クローンにつ
いて、必要に応じて選択的圧力の存在しない状態で、試験される。これは、例え
ば、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質に対してなされる、特異的に標
識された抗原を用いる免疫蛍光によって、達成され得る。産物産生細胞として同
定された細胞は、細胞培養から単離され、そして、血清およびタンパク質を含ま
ない条件（これは、好ましくは、産生条件と等しい）下で再び増殖される。細胞
の単離は、本明細書中で、細胞の単離および産物産生細胞についての試験によっ
てなされ得る。必要に応じて、安定な細胞を含む細胞培養は、安定な組換えクロ
ーンについて再び試験され、次いで、このクローンは、細胞培養から単離されク
ローンニングされる。次いで、血清およびタンパク質を含まない条件下で得られ
た安定な組換え細胞クローンは、血清およびタンパク質を含まない条件下でさら
に増殖される。
ンパク質を含まない条件下で安定な産物を産生する細胞集団の細胞クローンにつ
いて、必要に応じて選択的圧力の存在しない状態で、試験される。これは、例え
ば、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質に対してなされる、特異的に標
識された抗原を用いる免疫蛍光によって、達成され得る。産物産生細胞として同
定された細胞は、細胞培養から単離され、そして、血清およびタンパク質を含ま
ない条件（これは、好ましくは、産生条件と等しい）下で再び増殖される。細胞
の単離は、本明細書中で、細胞の単離および産物産生細胞についての試験によっ
てなされ得る。必要に応じて、安定な細胞を含む細胞培養は、安定な組換えクロ
ーンについて再び試験され、次いで、このクローンは、細胞培養から単離されク
ローンニングされる。次いで、血清およびタンパク質を含まない条件下で得られ
た安定な組換え細胞クローンは、血清およびタンパク質を含まない条件下でさら
に増殖される。
【００２８】
本発明に従う組換え細胞クローンは、特に、無血清無タンパク質培地で少なく
とも４０世代の間、好ましくは少なくとも５０世代、そして特に有利には６０世
代を超えて、安定であり、かつ組換えタンパク質を発現することによって特徴付
けらる。本明細書中で、この安定性は、例えば、支持体として、マトリックスま
たは固体表面のような助けなしに、現れる。さらに、本発明に従えば、高い細胞
密度を利用する培養を実行することを必要をしない。
とも４０世代の間、好ましくは少なくとも５０世代、そして特に有利には６０世
代を超えて、安定であり、かつ組換えタンパク質を発現することによって特徴付
けらる。本明細書中で、この安定性は、例えば、支持体として、マトリックスま
たは固体表面のような助けなしに、現れる。さらに、本発明に従えば、高い細胞
密度を利用する培養を実行することを必要をしない。
【００２９】
本発明の特定の局面に従って、安定な組換え細胞クローンは、単離した形態で
存在する。安定な細胞クローンから開始して、細胞培養は、血清およびタンパク
質を含まない条件下で安定な細胞の増殖によって達成される。
存在する。安定な細胞クローンから開始して、細胞培養は、血清およびタンパク
質を含まない条件下で安定な細胞の増殖によって達成される。
【００３０】
本発明に従う安定な組換え細胞クローンは、好ましくは、組換え哺乳動物細胞
に由来する。本明細書中では、組換え哺乳動物細胞は、組換えポリペプチドまた
は組換えタンパク質をコードする配列を含む任意の細胞であり得る。この規定は
、全ての連続的増殖細胞（接着性のものも非接着性のものも両方とも）を含有す
る。組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞を使用することが、特に好ましい
。組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質は、血液因子、増殖因子および他
の生物的関連産物であり得る。
に由来する。本明細書中では、組換え哺乳動物細胞は、組換えポリペプチドまた
は組換えタンパク質をコードする配列を含む任意の細胞であり得る。この規定は
、全ての連続的増殖細胞（接着性のものも非接着性のものも両方とも）を含有す
る。組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞を使用することが、特に好ましい
。組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質は、血液因子、増殖因子および他
の生物的関連産物であり得る。
【００３１】
本発明に従って、組換え血液因子（例えば、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ
因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プ
ロテインＣ、これらの因子の１つの活性化形態、またはｖＷＦ）に対するコード
配列を含み、かつ安定な条件下で数世代にわたってこれらの血液因子を発現可能
な、安定な組換え細胞クローンを使用することが好ましい。本明細書中で、ｖＷ
ＦまたはｖＷＦ活性を有するポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ活
性を有するポリペプチド、ｖＷＦおよび第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第Ｉ
Ｉ因子を発現するＣＨＯ細胞を使用することが、好ましい。
因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プ
ロテインＣ、これらの因子の１つの活性化形態、またはｖＷＦ）に対するコード
配列を含み、かつ安定な条件下で数世代にわたってこれらの血液因子を発現可能
な、安定な組換え細胞クローンを使用することが好ましい。本明細書中で、ｖＷ
ＦまたはｖＷＦ活性を有するポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ活
性を有するポリペプチド、ｖＷＦおよび第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第Ｉ
Ｉ因子を発現するＣＨＯ細胞を使用することが、好ましい。
【００３２】
本発明に従って、血清およびタンパク質を含まない条件下で選択された細胞ク
ローンは、特に、少なくとも５０［原文のまま；４０］世代、好ましくは少なく
とも５０世代の間、そして特に有利には６０世代を超える間、無血清無タンパク
質培地において安定であることによって特徴付けられる。
ローンは、特に、少なくとも５０［原文のまま；４０］世代、好ましくは少なく
とも５０世代の間、そして特に有利には６０世代を超える間、無血清無タンパク
質培地において安定であることによって特徴付けられる。
【００３３】
マスター細胞バンクを発展させるために、３０世代が必要とされる。１０００
Ｌ規模で平均バッチ培養を実行するためには、少なくとも４０世代が要求される
。従って、最初、個々のクローンから、約８〜１０世代を用いて、「マスター細
胞バンク（ＭＣＢ）」、「ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）」を調製し、次いで
、これらの条件下で２０〜２５世代までを用いて、産生規模（産生バイオマス）
で細胞培養を調製することが可能である。なぜなら、今日まで利用可能な細胞ク
ローンは、血清または無タンパク質培地での数世代の増殖後不安定になり、ａ）
産物産生細胞による均一な細胞培養、およびｂ）長期間にわたる安定な産物生産
性、を得るには無力となるからである。
Ｌ規模で平均バッチ培養を実行するためには、少なくとも４０世代が要求される
。従って、最初、個々のクローンから、約８〜１０世代を用いて、「マスター細
胞バンク（ＭＣＢ）」、「ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）」を調製し、次いで
、これらの条件下で２０〜２５世代までを用いて、産生規模（産生バイオマス）
で細胞培養を調製することが可能である。なぜなら、今日まで利用可能な細胞ク
ローンは、血清または無タンパク質培地での数世代の増殖後不安定になり、ａ）
産物産生細胞による均一な細胞培養、およびｂ）長期間にわたる安定な産物生産
性、を得るには無力となるからである。
【００３４】
従って、本発明に従う細胞クローンは、無血清無タンパク質培地における産生
条件下で少なくとも４０世代の間安定である。今日までに記載される方法は、タ
ンパク質を含まない条件下で、産物生産性を有する１０世代未満の世代数のみを
提供した（上記のＲｅｉｔｅｒら、１９９２）。
条件下で少なくとも４０世代の間安定である。今日までに記載される方法は、タ
ンパク質を含まない条件下で、産物生産性を有する１０世代未満の世代数のみを
提供した（上記のＲｅｉｔｅｒら、１９９２）。
【００３５】
安定性の基準として、最小数である少なくとも４０世代、好ましくは５０を超
える、そして特に有利には６０を超える世代が、産生プロセスで使用され、その
プロセスの間、タンパク質の安定な発現が起こり、そして細胞の形態ならびに表
現型は変化せず、そして腫瘍遺伝子的特徴が全く現れない。
える、そして特に有利には６０を超える世代が、産生プロセスで使用され、その
プロセスの間、タンパク質の安定な発現が起こり、そして細胞の形態ならびに表
現型は変化せず、そして腫瘍遺伝子的特徴が全く現れない。
【００３６】
予期しなかったが、本発明による細胞クローンは、血清およびタンパク質を含
まない条件下で、血清含有培地で培養された本来の細胞クローンと比較してさえ
も、増加した生産性を示すことが示された。
まない条件下で、血清含有培地で培養された本来の細胞クローンと比較してさえ
も、増加した生産性を示すことが示された。
【００３７】
別の局面によると、本発明は、血清およびタンパク質を含まない条件下で、少
なくとも９０％の、好ましくは９５％より多くの、そして特により有利には９８
％より多くの、安定な組換え細胞を含む細胞培養を利用可能とし、この安定な組
換え細胞は、少なくとも４０世代の間、特に少なくとも５０世代の間、安定であ
り、かつ組換え産物を発現する 本発明の文脈において、細胞培養は、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）、ワーキ
ング細胞バンク（ＷＣＢ−ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）または工業的
産生バイオリアクターにおける産生バイオマスを意味する。
なくとも９０％の、好ましくは９５％より多くの、そして特により有利には９８
％より多くの、安定な組換え細胞を含む細胞培養を利用可能とし、この安定な組
換え細胞は、少なくとも４０世代の間、特に少なくとも５０世代の間、安定であ
り、かつ組換え産物を発現する 本発明の文脈において、細胞培養は、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）、ワーキ
ング細胞バンク（ＷＣＢ−ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）または工業的
産生バイオリアクターにおける産生バイオマスを意味する。
【００３８】
本発明に従って、細胞培養は、特に、血清およびタンパク質を含まない条件下
での、上述した型の安定な組換え細胞クローンを培養することによって得られる
。
での、上述した型の安定な組換え細胞クローンを培養することによって得られる
。
【００３９】
本発明に従う細胞培養は、本明細書中で、個々のクローン（すなわちシードセ
ル）からＭＣＢ，ＷＣＢまたは血清およびタンパク質を含まない条件下でのバイ
オリアクターにおける産生規模のバイオマスまでの、単離された安定な細胞クロ
ーンの増殖によって、好ましくは、選択および／またはマーカー遺伝子に対する
選択的圧力なしに、得られ得る。特に、本発明に従って安定な組換えクローンか
ら得られた細胞培養中の組換え細胞は、血清およびタンパク質を含まない条件下
で、少なくとも４０世代の間安定であることが示された。
ル）からＭＣＢ，ＷＣＢまたは血清およびタンパク質を含まない条件下でのバイ
オリアクターにおける産生規模のバイオマスまでの、単離された安定な細胞クロ
ーンの増殖によって、好ましくは、選択および／またはマーカー遺伝子に対する
選択的圧力なしに、得られ得る。特に、本発明に従って安定な組換えクローンか
ら得られた細胞培養中の組換え細胞は、血清およびタンパク質を含まない条件下
で、少なくとも４０世代の間安定であることが示された。
【００４０】
ほとんどタンパク質を含まない培養および産生条件下で、本発明に従って利用
可能となった細胞培養（これは、血清およびタンパク質非依存性安定細胞クロー
ンから調製される）は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に
有利には少なくとも９８％の安定な組換え細胞を発現する。本明細書中で、用語
「安定な組換え細胞」は、詳細には、安定な細胞クローンに由来する組換え哺乳
動物細胞を意味する。本明細書中で、組換えＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−ｄ
ｈｆｒ-細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＢＨＫ細胞を使用することが好まれ、
これらの細胞は、血液因子、好ましくは、組換えｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子、第Ｖ
ＩＩＩ因子およびｖＷＦ、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現する。
可能となった細胞培養（これは、血清およびタンパク質非依存性安定細胞クロー
ンから調製される）は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に
有利には少なくとも９８％の安定な組換え細胞を発現する。本明細書中で、用語
「安定な組換え細胞」は、詳細には、安定な細胞クローンに由来する組換え哺乳
動物細胞を意味する。本明細書中で、組換えＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−ｄ
ｈｆｒ-細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、およびＢＨＫ細胞を使用することが好まれ、
これらの細胞は、血液因子、好ましくは、組換えｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子、第Ｖ
ＩＩＩ因子およびｖＷＦ、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現する。
【００４１】
本発明に従う細胞培養は、懸濁培養として、安定な組換え細胞を含み得る。こ
の細胞はまた、支持体、特に微細支持体に固定され得、ここでは、多孔性の微細
支持体が特に好ましい。例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）またはＣｙｔｏ
ｐｏｒｅ（登録商標）のような多孔性支持体は、特に適切であることがわかった
。
の細胞はまた、支持体、特に微細支持体に固定され得、ここでは、多孔性の微細
支持体が特に好ましい。例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（登録商標）またはＣｙｔｏ
ｐｏｒｅ（登録商標）のような多孔性支持体は、特に適切であることがわかった
。
【００４２】
別の局面によると、本発明は、本発明に従って利用可能となった安定な細胞ク
ローンを使用して、血清およびタンパク質を含まない条件下で、組換え産物の工
業的産生のための方法を示す。本明細書中の方法は、細胞培養の調製のための、
上記の型の単離された安定な組換え細胞クローンの調製工程を含む。本明細書中
で、単離された安定な細胞クローンの増殖は、安定な個々の細胞クローンから細
胞培養まで、血清およびタンパク質を含まない条件下で起こる。特に、安定な細
胞クローンの継代培養はまた、タンパク質を含まない条件下で、特にプロテアー
ゼ（例えば、トリプシンなど）の添加なしに、起こる。結果として、組換え産物
の産生において利用される細胞培養の調製中のいかなるときでも、ヒトまたは動
物起源の血清およびタンパク質を含む添加物の細胞培養への添加によって、ある
環境下で起こり得るコンタミネーションが起きない、ということが保証される。
従って、開始クローンから始まり、そしてワーキング細胞バンクの調製、バイオ
マスの産生、そして引き続い起こる、血清およびタンパク質を含まない条件下で
の組換えタンパク質の産生を介する調製を可能とする方法が、初めて記載される
。
ローンを使用して、血清およびタンパク質を含まない条件下で、組換え産物の工
業的産生のための方法を示す。本明細書中の方法は、細胞培養の調製のための、
上記の型の単離された安定な組換え細胞クローンの調製工程を含む。本明細書中
で、単離された安定な細胞クローンの増殖は、安定な個々の細胞クローンから細
胞培養まで、血清およびタンパク質を含まない条件下で起こる。特に、安定な細
胞クローンの継代培養はまた、タンパク質を含まない条件下で、特にプロテアー
ゼ（例えば、トリプシンなど）の添加なしに、起こる。結果として、組換え産物
の産生において利用される細胞培養の調製中のいかなるときでも、ヒトまたは動
物起源の血清およびタンパク質を含む添加物の細胞培養への添加によって、ある
環境下で起こり得るコンタミネーションが起きない、ということが保証される。
従って、開始クローンから始まり、そしてワーキング細胞バンクの調製、バイオ
マスの産生、そして引き続い起こる、血清およびタンパク質を含まない条件下で
の組換えタンパク質の産生を介する調製を可能とする方法が、初めて記載される
。
【００４３】
本発明に従う、細胞培養を用いる組換え産物の調製（これは、９０％を超える
、好ましくは９５％を超える、そして特に有利には９８％を超える、安定な産物
産生細胞を含む）は、懸濁培養としてまたは細胞を支持体に固定させて実行され
得る。本明細書中で、このプロセスは、バッチ形式もしくは連続形式で、または
無血清無タンパク質培地による灌流技術によって、実行され得る。
、好ましくは９５％を超える、そして特に有利には９８％を超える、安定な産物
産生細胞を含む）は、懸濁培養としてまたは細胞を支持体に固定させて実行され
得る。本明細書中で、このプロセスは、バッチ形式もしくは連続形式で、または
無血清無タンパク質培地による灌流技術によって、実行され得る。
【００４４】
次いで、発現する組換えタンパク質は、細胞培養上清から得られ、次いで、公
知の技術水準の方法で精製され、そしてさらに処理される。
知の技術水準の方法で精製され、そしてさらに処理される。
【００４５】
無血清無タンパク質培地として、任意の公知の合成培地を使用し得る。従来の
合成最小培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、ならびに炭水化物供給源および
水を含み得る。例えば、それは、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２培地であり得る。大
豆抽出物および酵母抽出物の含量は、０．１〜１００ｇ／Ｌ、特に有利には１〜
５ｇ／Ｌであり得る。特に好ましい実施形態において、大豆抽出物（例えば、大
豆ペプトン）を使用し得る。大豆ペプトンの分子量は、５０ｋｄ未満、好ましく
は１０ｋｄ未満である。
合成最小培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、ならびに炭水化物供給源および
水を含み得る。例えば、それは、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ１２培地であり得る。大
豆抽出物および酵母抽出物の含量は、０．１〜１００ｇ／Ｌ、特に有利には１〜
５ｇ／Ｌであり得る。特に好ましい実施形態において、大豆抽出物（例えば、大
豆ペプトン）を使用し得る。大豆ペプトンの分子量は、５０ｋｄ未満、好ましく
は１０ｋｄ未満である。
【００４６】
以下の組成物を含有する培地を使用することが特に好ましい：合成最小培地（
１〜２５ｇ／Ｌ）、大豆ペプトン（０．５〜５０ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（０
．０５〜１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（０．１〜１０ｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（
０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）、エタノールアミン（０．０００５〜０．０５
ｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０００１〜０．０１ｇ／Ｌ）。必要に応
じて、消泡剤として、非イオン界面活性剤（例えば、ポリプロピレングリコール
（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８、ＳＹＮＰＥＲＯ
ＮＩＣ Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−７１またはＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ１
０８）が培地に加えられ得る。
１〜２５ｇ／Ｌ）、大豆ペプトン（０．５〜５０ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（０
．０５〜１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（０．１〜１０ｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（
０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）、エタノールアミン（０．０００５〜０．０５
ｇ／Ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０００１〜０．０１ｇ／Ｌ）。必要に応
じて、消泡剤として、非イオン界面活性剤（例えば、ポリプロピレングリコール
（ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−６８、ＳＹＮＰＥＲＯ
ＮＩＣ Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ−７１またはＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ１
０８）が培地に加えられ得る。
【００４７】
この薬剤は、通常、通気のネガティブ効果から細胞を保護するために使用され
る。なぜなら、界面活性剤の添加なしでは、上昇する曝気気泡は、これらの気泡
（「スパージング」）の表面に位置したこれらの細胞に損傷を生じ得るからであ
る（ＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎ
ｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１４２−１４８）。
る。なぜなら、界面活性剤の添加なしでは、上昇する曝気気泡は、これらの気泡
（「スパージング」）の表面に位置したこれらの細胞に損傷を生じ得るからであ
る（ＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎ
ｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１４２−１４８）。
【００４８】
本明細書中で、非イオン性界面活性剤の量は、０．０５〜１０ｇ／Ｌであり得
るが、０．１〜５ｇ／Ｌのできる限り少ない量として使用することが特に好まし
い。さらに、培地はまた、シクロデキストリンまたはその誘導体を含み得る。
るが、０．１〜５ｇ／Ｌのできる限り少ない量として使用することが特に好まし
い。さらに、培地はまた、シクロデキストリンまたはその誘導体を含み得る。
【００４９】
しかし、非イオン性界面活性剤またはシクロデキストリンの添加は、本発明に
不可欠ではない。無血清無タンパク質培地が、プロテアーゼインヒビター（例え
ば、組織培養における使用に適切で、かつ合成または植物由来のセリンプロテア
ーゼインヒビター）を含むことが好ましい。
不可欠ではない。無血清無タンパク質培地が、プロテアーゼインヒビター（例え
ば、組織培養における使用に適切で、かつ合成または植物由来のセリンプロテア
ーゼインヒビター）を含むことが好ましい。
【００５０】
本明細書中で、Ｏ2濃度、培地における灌流速度または変化速度、ｐＨ、温度
および培養技術のような細胞培養についてのパラメーターは、使用される個々の
細胞の型に依存し、そして、これらは、当業者によって簡単な様式で決定され得
る。例えば、ＣＨＯ細胞の培養は攪拌された容器中で行われ得、そして無タンパ
ク質培地を用いる灌流は、灌流速度１〜１０容積変化／日、ｐＨ７．０〜７．８
（好ましくはｐＨ７．４）、Ｏ2濃度４０〜６０％（好ましくは５０％）、そし
て温度３４〜３８℃（好ましくは３７℃）で起こり得る。
および培養技術のような細胞培養についてのパラメーターは、使用される個々の
細胞の型に依存し、そして、これらは、当業者によって簡単な様式で決定され得
る。例えば、ＣＨＯ細胞の培養は攪拌された容器中で行われ得、そして無タンパ
ク質培地を用いる灌流は、灌流速度１〜１０容積変化／日、ｐＨ７．０〜７．８
（好ましくはｐＨ７．４）、Ｏ2濃度４０〜６０％（好ましくは５０％）、そし
て温度３４〜３８℃（好ましくは３７℃）で起こり得る。
【００５１】
さらなる局面では、本発明は、以下の工程を包含する安定な組換え細胞クロー
ンを得るための方法を利用可能にする； −組換えの本来のクローンを、血清含有培地で、好ましくは選択的圧力なく、
細胞培養物まで増殖させる工程、 −好ましくは産生条件と等しい条件である血清およびタンパク質を含まない条
件下で、細胞を培養する工程、 −血清およびタンパク質を含まない条件下で、細胞培養物を、産物産生細胞に
ついて試験する工程、 −血清およびタンパク質を含まない条件下で、安定な組換え細胞クローンをク
ローニングする工程で、ここでは、このクローニングは、通常公知な技術（例え
ば、希釈による細胞の単離および個々のクローンを増殖）によって行われ得る、
工程、 −血清およびタンパク質を含まない条件下で単離された細胞クローンを増殖さ
せる工程、および −必要に応じて、細胞培養物を、産物再生細胞について試験する工程。
ンを得るための方法を利用可能にする； −組換えの本来のクローンを、血清含有培地で、好ましくは選択的圧力なく、
細胞培養物まで増殖させる工程、 −好ましくは産生条件と等しい条件である血清およびタンパク質を含まない条
件下で、細胞を培養する工程、 −血清およびタンパク質を含まない条件下で、細胞培養物を、産物産生細胞に
ついて試験する工程、 −血清およびタンパク質を含まない条件下で、安定な組換え細胞クローンをク
ローニングする工程で、ここでは、このクローニングは、通常公知な技術（例え
ば、希釈による細胞の単離および個々のクローンを増殖）によって行われ得る、
工程、 −血清およびタンパク質を含まない条件下で単離された細胞クローンを増殖さ
せる工程、および −必要に応じて、細胞培養物を、産物再生細胞について試験する工程。
【００５２】
本明細書中で、無タンパク質培地で、少なくとも１０世代の間、好ましくは少
なくとも２０世代の間、そして特に有利には少なくとも５０世代の間、安定な組
換えタンパク質を発現する、これらの組換え細胞クローンのみが、安定であると
考えられるべきである。
なくとも２０世代の間、そして特に有利には少なくとも５０世代の間、安定な組
換えタンパク質を発現する、これらの組換え細胞クローンのみが、安定であると
考えられるべきである。
【００５３】
別の局面によると、本発明は、以下の工程を包含する安定な組換え細胞クロー
ンを得るための方法を利用可能にする； −血清およびタンパク質を含まない条件下で非組換え開始細胞または細胞株を
増殖し、そして血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な非組換え細胞ク
ローンをクローニングする工程、 −組換え核酸によって安定な細胞クローンをトランスフェクトし、そして安定
な組換え細胞クローンを単離する工程、 −必要に応じて、産生条件と同じである条件下で、無血清無タンパク質培地で
安定な細胞クローンのトランスフェクト体を培養する工程、 −安定な組換え細胞を、産生および産物安定性について試験する工程。
ンを得るための方法を利用可能にする； −血清およびタンパク質を含まない条件下で非組換え開始細胞または細胞株を
増殖し、そして血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な非組換え細胞ク
ローンをクローニングする工程、 −組換え核酸によって安定な細胞クローンをトランスフェクトし、そして安定
な組換え細胞クローンを単離する工程、 −必要に応じて、産生条件と同じである条件下で、無血清無タンパク質培地で
安定な細胞クローンのトランスフェクト体を培養する工程、 −安定な組換え細胞を、産生および産物安定性について試験する工程。
【００５４】
本発明は、以下の実施例を参考として援用するが、この実施例に限定されない
。
。
【００５５】
（実施例）
（実施例１：血清含有培地から無血清無タンパク質培地への再適用後のｒｖＷ
ＦＣＨＯ細胞の安定性） プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒｖＷＦおよびｐＳＶ−ｄｈｆｒで同時トランスフェ
クトされたＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞、およびｖＷＦ発現クローンを、Ｆｉｓｃｈ
ｅｒら（１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５１：３４５−３４８）に記
載されるように、サブクローニングした。安定な様式でｒｖＷＦを発現したサブ
クローンから、ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）を、血清を含むがＭＴＸが存在
しないむ条件下で、調製し、そして、血清を含む条件下で多孔性超微細支持体（
Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標））上に、細胞を固定した。支持体マトリックスが
細胞密度２×１０7細胞／ｍＬに達した後、無血清無タンパク質培地への細胞の
変換を行った。さらに、数世代の間、細胞を血清およびタンパク質を含まない条
件下で培養した。標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光の方法によって、無
血清無タンパク質培地において、種々の時間に、細胞を試験した。細胞の安定性
の評価を、培地変更の前に、無血清無タンパク質培地において１０世代後および
６０世代後に、ワーキング細胞バンクで行った。ワーキング細胞バンクが、なお
１００％のｒｖＷＦ産生細胞を示した（図１Ａ）が、ｒｖＷＦ産生細胞の一部は
、無血清無タンパク質培地において１０世代後に、約５０％に減少した（図１Ｂ
）。６０世代後には、９５％を超える細胞が非産生細胞と同定された（図１Ｃ）
。
ＦＣＨＯ細胞の安定性） プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒｖＷＦおよびｐＳＶ−ｄｈｆｒで同時トランスフェ
クトされたＣＨＯ−ｄｈｆｒ-細胞、およびｖＷＦ発現クローンを、Ｆｉｓｃｈ
ｅｒら（１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５１：３４５−３４８）に記
載されるように、サブクローニングした。安定な様式でｒｖＷＦを発現したサブ
クローンから、ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）を、血清を含むがＭＴＸが存在
しないむ条件下で、調製し、そして、血清を含む条件下で多孔性超微細支持体（
Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標））上に、細胞を固定した。支持体マトリックスが
細胞密度２×１０7細胞／ｍＬに達した後、無血清無タンパク質培地への細胞の
変換を行った。さらに、数世代の間、細胞を血清およびタンパク質を含まない条
件下で培養した。標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光の方法によって、無
血清無タンパク質培地において、種々の時間に、細胞を試験した。細胞の安定性
の評価を、培地変更の前に、無血清無タンパク質培地において１０世代後および
６０世代後に、ワーキング細胞バンクで行った。ワーキング細胞バンクが、なお
１００％のｒｖＷＦ産生細胞を示した（図１Ａ）が、ｒｖＷＦ産生細胞の一部は
、無血清無タンパク質培地において１０世代後に、約５０％に減少した（図１Ｂ
）。６０世代後には、９５％を超える細胞が非産生細胞と同定された（図１Ｃ）
。
【００５６】
（実施例２：安定な組換えＣＨＯクローンのクローニング）
実施例１による、ｒｖＷＦ ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物（これは、無血清無
タンパク質培地で６０世代の間培養された（図１Ｃ））から、希釈液を調製し、
そして、各場合に、０．１細胞／ウェルをマイクロタイタープレートに播種した
。この細胞を、血清もタンパク質添加物も含まないＤＭＥＭ／ＨＡＭ１２培地で
、かつ選択的圧力もなく、約３週間培養し、そして標識された抗ｖＷＦ抗体を用
いる免疫蛍光方法によって、この細胞を試験した。ポジティブと同定された細胞
クローンを、シードセルバンクの調製のための開始クローンとして使用した。こ
のシードセルバンクから、無血清無タンパク質培地で、マスター細胞バンク（Ｍ
ＣＢ）を調製し、そして個々のアンプルを冷凍し、そしてワーキング細胞バンク
の後の調製のために貯蔵した。個々のアンプルから開始して、ワーキング細胞バ
ンクを、無血清無タンパク質培地で調製した。この細胞を、多孔性超微細支持体
上に固定し、そして数世代の間、血清およびタンパク質を含まない条件下で培養
し続けた。標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光方法によって、異なる時期
に、無血清無タンパク質培地で、生産性について、この細胞を試験した。ワーキ
ング細胞バンクの段階で、および無血清無タンパク質培地において１０世代後な
らびに６０世代後に、細胞の安定性の評価を行った。ワーキング細胞バンクの段
階（図２Ａ）、および１０世代後（図２Ｂ）ならびに６０世代後（図２Ｃ）に、
約１００％の細胞がｒｖＷＦを発現するポジティブな安定組換えクローンである
と同定された。
タンパク質培地で６０世代の間培養された（図１Ｃ））から、希釈液を調製し、
そして、各場合に、０．１細胞／ウェルをマイクロタイタープレートに播種した
。この細胞を、血清もタンパク質添加物も含まないＤＭＥＭ／ＨＡＭ１２培地で
、かつ選択的圧力もなく、約３週間培養し、そして標識された抗ｖＷＦ抗体を用
いる免疫蛍光方法によって、この細胞を試験した。ポジティブと同定された細胞
クローンを、シードセルバンクの調製のための開始クローンとして使用した。こ
のシードセルバンクから、無血清無タンパク質培地で、マスター細胞バンク（Ｍ
ＣＢ）を調製し、そして個々のアンプルを冷凍し、そしてワーキング細胞バンク
の後の調製のために貯蔵した。個々のアンプルから開始して、ワーキング細胞バ
ンクを、無血清無タンパク質培地で調製した。この細胞を、多孔性超微細支持体
上に固定し、そして数世代の間、血清およびタンパク質を含まない条件下で培養
し続けた。標識された抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光方法によって、異なる時期
に、無血清無タンパク質培地で、生産性について、この細胞を試験した。ワーキ
ング細胞バンクの段階で、および無血清無タンパク質培地において１０世代後な
らびに６０世代後に、細胞の安定性の評価を行った。ワーキング細胞バンクの段
階（図２Ａ）、および１０世代後（図２Ｂ）ならびに６０世代後（図２Ｃ）に、
約１００％の細胞がｒｖＷＦを発現するポジティブな安定組換えクローンである
と同定された。
【００５７】
（実施例３：組換え細胞クローンの細胞特異的生産性）
組換え細胞を培養する間の規定された段階から、規定された細胞数を取り出し
、そして２４時間の間新鮮な培地によって培養した。ｒｖＷＦ：Ｒｉｓｔｏ−Ｃ
ｏＦ［リストセチン補助因子］活性を、細胞培養上清において決定した。表１は
、本発明による安定な組換え細胞クローンにおける細胞特異的生産性は、無血清
無タンパク質培地において、６０世代後でさえも、安定であったこと、そしてこ
の生産性は、血清含有培地で培養された本来のクローンと比較して、向上したこ
とを示す。
、そして２４時間の間新鮮な培地によって培養した。ｒｖＷＦ：Ｒｉｓｔｏ−Ｃ
ｏＦ［リストセチン補助因子］活性を、細胞培養上清において決定した。表１は
、本発明による安定な組換え細胞クローンにおける細胞特異的生産性は、無血清
無タンパク質培地において、６０世代後でさえも、安定であったこと、そしてこ
の生産性は、血清含有培地で培養された本来のクローンと比較して、向上したこ
とを示す。
【００５８】
【表１】
（実施例４：タンパク質および血清を含まない最小培地でのｒＦＶＩＩＩ Ｃ
ＨＯ細胞の培養） ｒＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、１０Ｌの攪拌タンク内で培養
し、そして灌流させた。ここでは、無血清無タンパク質培地を使用した。本明細
書中で、この細胞を、多孔性超超微細支持体（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定し、そして少なくとも６週間培養した。灌流速度は
、４容積変化／日で、ｐＨは６．９〜７．２で、Ｏ2濃度は約２０〜５０％で、
そして温度は３７℃であった。
ＨＯ細胞の培養） ｒＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、１０Ｌの攪拌タンク内で培養
し、そして灌流させた。ここでは、無血清無タンパク質培地を使用した。本明細
書中で、この細胞を、多孔性超超微細支持体（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固定し、そして少なくとも６週間培養した。灌流速度は
、４容積変化／日で、ｐＨは６．９〜７．２で、Ｏ2濃度は約２０〜５０％で、
そして温度は３７℃であった。
【００５９】
図３は、１０Ｌの灌流バイオリアクター内でｒＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞クロー
ンを培養した結果を示す。
ンを培養した結果を示す。
【００６０】
ａ）４２日の期間にわたるＦＶＩＩＩ活性（ｍＵ／ｍＬ）および灌流速度（１
〜５／日）。
〜５／日）。
【００６１】
ｂ）灌流リアクター内の容積測定の生産性（単位因子ＶＩＩＩ／Ｌ／日）。
【００６２】
【表２】
表２は、ｒＦＶＩＩＩ発現細胞の安定性および特異的生産性を示す。これらの
結果のために、１５、２１、２８、３５および４２日後にサンプルを取り出し、
３００Ｇで遠心分離し、そして新鮮な無血清無タンパク質培地に再懸濁した。さ
らに２４時間後に、細胞培養上清中の第ＶＩＩＩ因子濃度および細胞数を決定し
た。これらのデータから、特異的ＦＶＩＩＩ生産性を計算した。
結果のために、１５、２１、２８、３５および４２日後にサンプルを取り出し、
３００Ｇで遠心分離し、そして新鮮な無血清無タンパク質培地に再懸濁した。さ
らに２４時間後に、細胞培養上清中の第ＶＩＩＩ因子濃度および細胞数を決定し
た。これらのデータから、特異的ＦＶＩＩＩ生産性を計算した。
【００６３】
８８８ｍＵ／１０6細胞／日という安定な平均生産性が達成された。この安定
な生産性はまた、無血清無タンパク質培地で、１５、２１、２８、３５および４
２日後に、標識された抗ＦＶＩＩＩ抗原を用いる免疫蛍光によって確認された。
な生産性はまた、無血清無タンパク質培地で、１５、２１、２８、３５および４
２日後に、標識された抗ＦＶＩＩＩ抗原を用いる免疫蛍光によって確認された。
【図１】
図１は、血清含有培地から無血清無タンパク質培地へ再び適用した時点（Ａ）
、無血清無タンパク質培地において１０世代後（Ｂ）、および無血清無タンパク
質培地において６０世代後（Ｃ）、の本来のクローンのワーキング細胞バンクの
顕微鏡写真を示す。
、無血清無タンパク質培地において１０世代後（Ｂ）、および無血清無タンパク
質培地において６０世代後（Ｃ）、の本来のクローンのワーキング細胞バンクの
顕微鏡写真を示す。
【図２】
図２は、血清およびタンパク質を含まない条件下で安定な組換え細胞クローン
から始めた細胞培養の、ワーキング細胞バンク段階（Ａ）、１０世代後（Ｂ）、
および６０世代後（Ｃ）の顕微鏡写真を示す。
から始めた細胞培養の、ワーキング細胞バンク段階（Ａ）、１０世代後（Ｂ）、
および６０世代後（Ｃ）の顕微鏡写真を示す。
【図３】
図３は、１０Ｌの灌流バイオリアクター中でｒＦＶＩＩＩ ＣＨＯ細胞クロー
ンを培養した結果を示す。 ａ）４２日の期間にわたるＦＶＩＩＩ活性（ｍＵ／ｍＬ）および灌流速度（１
〜５／日）。 ｂ）灌流リアクター内の容積測定による生産性（単位第ＶＩＩＩ因子／ｌ／日
）。
ンを培養した結果を示す。 ａ）４２日の期間にわたるＦＶＩＩＩ活性（ｍＵ／ｍＬ）および灌流速度（１
〜５／日）。 ｂ）灌流リアクター内の容積測定による生産性（単位第ＶＩＩＩ因子／ｌ／日
）。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ
Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ
，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，
ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ
Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ
，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，
ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ
Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ
，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，
ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ
Ｕ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ドルナー， フリードリッヒ
オーストリア国 アー−1230 ウィーン，
ペーターリーニガッセ 17
Ｆターム(参考） 4B064 AG01 CA10 CA19 CC03 CD01
CD04 CD19 DA03
4B065 AA90X AA93Y AB01 AC20
BA01 BA02 BA23 BB27 BB29
BB32 BC01 BC25 BD41 CA24
CA44
4H045 AA20 BA09 CA40 DA65 DA66
EA20 EA23 EA24 FA72 FA74
Claims (25)
- 【請求項１】 安定な組換え細胞クローンを調製する方法であって、該方法
は、以下の工程： 組換えの本来の細胞クローンを調製する工程、 該組換えの本来の細胞クローンを、血清含有培地で培養する工程、 該細胞を、無血清無タンパク質培地に再適用する工程、 該細胞培養を、安定な産物産生細胞について試験する工程、および 安定な産物産生細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でク
ローニングする工程、 を含有することによって特徴付けられる、方法。 - 【請求項２】 クローニング後に、前記安定な細胞クローンを単離した形態
で得ることによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 組換え哺乳動物細胞が、前記本来のクローンとして調製され
ることによって特徴付けられる、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記哺乳動物細胞が、組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ
細胞であることによって特徴付けられる、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記組換え細胞クローンが、組換えポリペプチドまたは組換
えタンパク質をコードする配列を含むことによって特徴付けられる、請求項１〜
４のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 請求項５に記載の方法であって、該方法は、前記組換えタン
パク質が、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子
、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プロテインＣあるいはこれらの因子の
１つの活性な形態、またはｖＷＦから成る群から選択される血液因子であること
によって特徴付けられる、方法。 - 【請求項７】 前記本来の細胞クローンとして、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａ
ｎｄの因子を発現する、組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられ
る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 前記本来の細胞クローンとして、第ＶＩＩＩ因子を発現する
、組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】 前記本来の細胞クローンとして、第ＶＩＩＩ因子およびｖＷ
Ｆを共発現する組換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求
項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記本来の細胞クローンとして、第ＩＸ因子を発現する組
換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記本来の細胞クローンとして、第ＩＩ因子を発現する組
換えＣＨＯ細胞を調製することによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれ
か１項に記載の方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって調製
され得ることによって特徴付けられる、組換え細胞クローン。 - 【請求項１３】 細胞培養物であって、該細胞培養物は、以下の工程： 血清含有培地で組換えの本来のクローンを増殖させる工程、 該細胞を、細胞培養物まで、血清およびタンパク質を含まない条件下で培養す
る工程、 該細胞培養を、血清およびタンパク質を含まない条件下で、産物産生細胞につ
いて試験する工程、 安定な細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でクローニン
グする工程、および 安定な細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下で増殖させる
工程、 によって得られ得ることによって特徴付けられる、細胞培養物。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載の安定な組換え細胞クローンを培養する
することによって得られ得ることによって特徴付けられる、細胞培養物。 - 【請求項１５】 血清およびタンパク質を含まない条件下で組換え産物を発
現するように誘導され得ることによって特徴付けられる、請求項１３または１４
に記載の細胞培養物。 - 【請求項１６】 前記安定な組換え細胞クローンが哺乳動物細胞であること
によって特徴付けられる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養物
。 - 【請求項１７】 前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｄ
ＨＦＲ-細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞またはＢＨＫ細胞であることによって特徴付け
られる、請求項１６に記載の細胞培養物。 - 【請求項１８】 前記安定な組換え細胞が、組換えポリペプチドまたは組換
えタンパク質をコードする配列を含むことによって特徴付けられる、請求項１３
〜１７のいずれか１項に記載の細胞培養物。 - 【請求項１９】 前記細胞が微細支持体上に固定されることによって特徴付
けられる、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の細胞培養。 - 【請求項２０】 血清およびタンパク質を含まない条件下で組換え産物を工
業的に産生するための方法であって、該方法は、以下の工程： 請求項１２に記載の、単離された、安定な組換え細胞クローンを調製する工程
、 該安定な細胞クローンを、無血清無タンパク質培地で、開始クローンから前記
細胞培養物まで増殖させる工程、 前記安定な細胞を含む細胞培養物を、バイオリアクターで調製する工程、およ
び タンパク質を、該培養物上清から収集する工程、 を包含することによって特徴付けられる、方法。 - 【請求項２１】 前記無血清無タンパク質培地は、酵母抽出物または大豆抽
出物を含む合成最小培地であることによって特徴付けられる、請求項２０に記載
の方法。 - 【請求項２２】 前記培地は、シクロデキストリンまたはその誘導体を含む
ことによって特徴付けられる、請求項２０または２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記無血清無タンパク質培地は、プロテアーゼインヒビタ
ーを含むことによって特徴付けられる、請求項２０〜２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 安定な組換え細胞クローンを得るための方法であって、該
方法は、以下の工程： 組換えの本来のクローンを、血清含有培地で細胞培養まで増殖する工程、 該細胞を、産生条件と等しい血清およびタンパク質を含まない条件下で培養す
る工程、 該細胞培養物を、血清およびタンパク質を含まない条件下で、産物産生細胞に
ついて試験する工程、 組換え細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でクローニン
グする工程、および 該安定な細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下で増殖させ
る工程、 包含することによって特徴付けられる、方法。 - 【請求項２５】 安定な組換え細胞クローンを得るための方法であって、該
方法は、以下の工程： 非組換え開始細胞を、血清およびタンパク質を含まない条件下で増殖させる工
程、 安定な非組換え細胞クローンを、血清およびタンパク質を含まない条件下でク
ローニングする工程、 該安定な細胞クローンを、組換え核酸によってトランスフェクトし、そして安
定なトランスフェクト体の単離産生条件と等しい条件下で、無血清無タンパク質
培地で、該トランスフェクト体を培養し、そして産物の安定性について該細胞を
試験する工程、 を包含することによって特徴付けられる、方法。
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| PCT/AT1999/000197 WO2001011021A1 (de) | 1999-08-05 | 1999-08-05 | Rekombinanter stabiler zellklon, seine herstellung und verwendung |
Related Child Applications (2)
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