ES2267280T3

ES2267280T3 - Clon celular recombinante estable, su preparacion y utilizacion del mismo.

Info

Publication number: ES2267280T3
Application number: ES99939251T
Authority: ES
Inventors: Manfred Reiter; Wolfgang Mundt; Friedrich Dorner
Original assignee: Baxter AG
Current assignee: Baxter AG
Priority date: 1999-08-05
Filing date: 1999-08-05
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: DK1200561T3; ATE330003T1; EP1200561B1; CA2381173A1; EP1200561A1; WO2001011021A1; JP2003506077A; CY1106111T1; AU5363699A; DE59913565D1; PT1200561E; AU780810B2

Abstract

Procedimiento para producir un clon celular recombinante estable, que es estable durante como mínimo 40 generaciones, bajo condiciones de producción en un medio libre de suero y proteínas, caracterizado porque incluye los siguientes pasos: - preparación de un clon celular original recombinante; - cultivo del clon celular original recombinante en un medio que contiene suero; - adaptación de las células a un medio libre de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección; - análisis del cultivo celular después de la adaptación para detectar células productoras de producto estables en ausencia de una presión de selección; y - clonación de un clon celular productor de producto estable bajo condiciones libres de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección.

Description

Clon celular recombinante estable, su preparación y utilización del mismo.

La presente invención se refiere a un clon celular recombinante estable que permanece estable durante como mínimo 40 generaciones en un medio libre de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección, a una biomasa obtenida por reproducción del clon celular estable bajo condiciones de cultivo libres de suero y proteínas, y a un procedimiento para producir proteínas recombinantes mediante tal biomasa. La invención también se refiere a un procedimiento para obtener clones celulares recombinantes estables. La invención se refiere además a la producción de una proteína recombinante en un medio mínimo libre de suero y proteínas sintético.

La producción de proteínas recombinantes, en particular de productos biomédicos como factores sanguíneos, está adquiriendo cada vez más importancia. Generalmente se añade suero al medio para posibilitar un crecimiento óptimo de células recombinantes. Debido al elevado coste del suero y para evitar posibles contaminaciones del medio de cultivo por patógenos virales o moleculares a través del suero, se desarrolló una serie de medios libres de suero que sobre todo no debían contener ningún aditivo de origen bovino o humano. La utilización de estos medios en el proceso de producción, además de implicar un escaso riesgo de contaminación de los productos producidos por patógenos virales o moleculares, también posibilita una purificación más sencilla de las proteínas expresadas.

En general, las células recombinantes se desarrollan en un medio que contiene suero hasta alcanzarse una alta densidad celular, aproximadamente para un "Working cell bank" (banco de células de trabajo) y, a continuación, durante la fase de producción, se adaptan a un medio libre de suero.

Miyaji y col. (1990, Cytotechnology 3:133-140) seleccionaron clones celulares independientes del suero en un medio libre de suero que contenía insulina y transferrina. Sin embargo se observó que, después de 16 días, la cantidad de células vivas y la tasa de expresión disminuían de forma permanente. Miyaji y col. (1990, Cytotechnology 4:173-180) intentaron mejorar la tasa de expresión y la productividad de las células recombinantes mediante coamplificación con un gen marcador.

Yamauchi y col. (1992, Biosci. Biotechnol. Biochem. 56:600-604) establecieron subclones CHO recombinantes independientes del suero cultivando células dependientes del suero sobre placas microtituladas como monocapa durante 3 a 4 semanas en un medio libre de suero que contenía seroalbúmina, insulina y transferrina. Aproximadamente un 0,1% de las células era independiente del suero. También se desarrolló una parte de los subclones en un cultivo en suspensión en un medio libre de suero, pero las células se aglomeraron y coagularon. Las células se duplicaron en 1,5 días. Sin embargo, no se da ningún dato sobre la estabilidad de los clones independientes del suero obtenidos ni sobre el cultivo a largo plazo de estos clones bajo condiciones libres de suero.

Con frecuencia, los medios que permiten mantener la actividad metabólica y el crecimiento celular durante la fase libre de suero contienen sustancias adicionales, tales como factores de crecimiento, por ejemplo insulina o transferrina, o factores de adherencia, que sustituyen a los componentes del suero.

Se han desarrollado diferentes técnicas para evitar la adición de factores polipeptídicos, tales como insulina o transferrina, y posibilitar unas condiciones de cultivo libres de proteínas. Por ejemplo, se han desarrollado medios completos libres de proteínas especialmente definidos que permiten un crecimiento celular también bajo condiciones libres de proteínas.

El documento WO 97/05240 describe la producción de proteínas recombinantes bajo condiciones libres de proteínas, donde las células coexpresan un factor de crecimiento junto con la proteína deseada.

El documento JP 2696O01 describe la utilización de un medio libre de proteínas para la producción de factor VIII en células CHO con adición de un agente tensioactivo no iónico o ciclodextrina para aumentar la productividad de las células huésped. Para aumentar la eficacia de estos aditivos se recomienda añadir butirato y litio, por ejemplo.

El documento WO 96/26266 describe el cultivo de células en un medio que contiene un hidrolizado proteínico con glutamina, donde el contenido de aminoácidos libres es inferior al 15% del peso total de la proteína y cuyos péptidos presentan un peso molecular inferior a 44 kD. Como medio para los cultivos celulares se utiliza un medio mínimo sintético como medio básico al que, además del hidrolizado proteínico, se le añaden suero bovino fetal, gentamicina y mercaptoetanol entre otros componentes. En dicho documento no se menciona la utilización de este medio con que contiene suero para la producción recombinante de factores sanguíneos.

El documento US 5,393,668 describe superficies sintéticas especiales que permiten el desarrollo de células adherentes bajo condiciones libres de proteínas.

Para estimular la proliferación celular, células CHO que sobreexpresaban insulina humana se reprodujeron sobre un sustrato artificial que tiene unida insulina covalente (Ito y col., 1996, PNAS USA 93:3598-3601).

Reiter y col. (1992, Cytotechnology 9:247-253) describen la inmovilización de una alta densidad de células r-CHO cultivadas en un medio que contiene suero sobre soportes y perfusión subsiguiente de las células inmovilizadas en un medio libre de proteínas durante la fase de producción, observándose una liberación continua de proteína en el sobrenadante del cultivo celular. Sin embargo, las células se perfundieron en el medio libre de proteínas durante menos de 10 generaciones.

Algunos procedimientos conocidos hasta la fecha para la producción con éxito de un cultivo celular "a escala industrial" bajo condiciones libres de proteínas han sido descritos para líneas celulares continuas, en particular para células VERO (WO 96/15231). Las células se desarrollaron bajo condiciones libres de suero y proteínas desde la ampolla original hasta alcanzar una escala industrial de 1.200 l. Sin embargo, no se trata de células recombinantes, sino de células huésped utilizadas para la producción de antígenos virales en un proceso lítico.

A diferencia de las células VERO adherentes, por ejemplo las células CHO sólo dependen de la adherencia de forma limitada. Las células CHO cultivadas mediante métodos convencionales bajo condiciones que contienen suero se pueden unir tanto a microsoportes lisos como a microsoportes porosos (US 4,978,616, Reiter y col., 1992, Cytotechnology 9:247-253). Si las células CHO se cultivan bajo condiciones libres de suero, pierden esta propiedad y no se adhieren a soportes lisos, por ejemplo Cytodex 3, o se desprenden fácilmente de éstos, a no ser que se añadan al medio aditivos promotores de la adhesión, por ejemplo fibronectina, insulina o transferrina. Debido a la escasa adherencia de las células CHO a los soportes bajo condiciones libres de suero, generalmente la producción de proteínas recombinantes se lleva a cabo en un cultivo en suspensión. El proceso de producción se puede desarrollar según un procedimiento continuo o por lotes. El cultivo celular recombinante se desarrolla en un biorreactor hasta alcanzar una densidad celular óptima, dado el caso se induce la expresión proteínica y, para la recogida, el medio que contiene las proteínas expresadas, pero también células recombinantes, se extrae a intervalos determinados del tanque de reacción y, en consecuencia, del proceso de producción. La eficiencia de producción en el biorreactor disminuye debido a la pérdida continua de biomasa, y sólo vuelve a aumentar lentamente cuando se añade medio fresco, ya que las células se han de desarrollar hasta alcanzar la densidad celular deseada. Por consiguiente, a pesar de tratarse de un proceso continuo, siempre se repite una fase de retraso en la que disminuye la tasa de producción de este sistema. Además, en un sistema de este tipo, la capacidad de crecimiento y producción está limitada por la densidad celular máxima alcanzable.

Siempre que se han adaptado células cultivadas bajo condiciones con contenido de suero a un medio libre de proteínas se ha comprobado que el rendimiento de la proteína expresada y la productividad de las células CHO recombinantes después de la adaptación al medio libre de proteínas experimentan una fuerte disminución en comparación con las condiciones con contenido de suero (Paterson y col., 1994, Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:691-658). Esto se ha de atribuir a una inestabilidad o a una reducción del crecimiento de los clones recombinantes a causa de la modificación de las condiciones de cultivo. Debido al cambio de las condiciones de fermentación, a pesar de utilizar un clon original estable, siempre ocurre que una gran parte de las células se convierte en células con expresión reducida o células no productoras que proliferan por encima de las células productoras durante el proceso de producción, con lo que una gran parte del cultivo de fermentación finalmente consiste en células no productoras o células de escasa expresión.

Por ello, la capacidad de producción máxima del cultivo de fermentación disminuye de forma continua y la producción máxima de producto está limitada a una cantidad determinada de generaciones o pasos celulares.

En el estado actual de la técnica se han descrito diferentes métodos relacionados con el cultivo de células en un medio libre de suero o libre de suero y proteínas y en presencia de una presión de selección (Zang y col., Biotechnology, tomo 13, 1 de Abril de 1995, páginas 389-392; WO 96 18734 A; Fischer y col., Thromb. Thrombolysis, 1996, 3(1), 57-62; Fischer y col., FEBS Letters, tomo 351, 1994, páginas 345-348; Kaufman y col., Molecular and Cellular Biology, tomo 9, nº 3, 1989, páginas 1233-1242).

Por consiguiente, existe la necesidad de un sistema que posibilite una producción continua, en particular a escala industrial, de proteínas recombinantes bajo condiciones libres de suero y proteínas durante el mayor período de tiempo posible.

También sería deseable obtener un clon celular recombinante que fuera estable durante muchas generaciones en la fase de producción bajo condiciones libres de proteínas y que exprese proteínas recombinantes.

En consecuencia, un objetivo de la presente invención consiste en poner a disposición un procedimiento para la producción de proteínas recombinantes bajo condiciones de cultivo y producción libres de suero y proteínas.

Otro objetivo consiste en poner a disposición un clon celular recombinante estable.

El objetivo se resuelve según la invención mediante las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones adjuntas.

Por consiguiente, el clon celular según la invención forma una población de células que se puede cultivar de forma estable durante como mínimo 40 generaciones en un medio libre de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección. En este contexto, preferentemente más de un 80%, en particular más de un 99% de las células de la población celular según la invención o del clon celular según la invención es estable durante como mínimo 40 generaciones.

El cultivo de las células tiene lugar sin selección, por ejemplo sin selección en el gen marcador de selección y/o el gen de amplificación, por ejemplo en ausencia de MTX en caso de células CHO-dhfr^{-}.

En el marco de esta invención, por "clon celular original" se entiende un producto de transfección de clon celular recombinante que, después de la transfección de células huésped con una secuencia de nucleótidos recombinante, expresa un producto recombinante estable bajo condiciones de laboratorio. El clon original se cultiva para optimizar el crecimiento en un medio que contiene suero. En caso dado, para aumentar la productividad el clon original se cultiva en presencia de un agente de selección y con selección del marcador de selección y/o marcador de amplificación. Para la producción a escala industrial, el clon celular original se cultiva bajo condiciones de cultivo que contienen suero hasta alcanzar una densidad celular elevada, y poco antes de la fase de producción se adapta a un medio libre de suero y/o proteínas. El cultivo tiene lugar sin presión de selección.

Se ha comprobado que, bajo estas condiciones, una gran parte de más del 95% de las células en un cultivo celular adaptado a un medio libre de suero y proteínas se convierte en células no productoras de producto. Mediante inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de producto se ha demostrado que, en función del tiempo de generación de las células en un medio libre de suero y proteínas, la cantidad de células no productoras en un cultivo aumenta y prolifera por encima de las células productoras de producto, lo que reduce la capacidad de producción del cultivo.

El cultivo celular obtenido después de la adaptación a un medio libre de suero y proteínas se analiza para detectar aquellos clones celulares de la población celular que producen productos estables bajo condiciones libres de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante inmunofluorescencia con anticuerpos marcados específicos dirigidos contra el polipéptido o la proteína recombinante. Las células identificadas como productoras de producto se aíslan del cultivo celular y se reproducen de nuevo bajo condiciones libres de suero y proteínas, preferentemente bajo condiciones equivalentes de producción. El aislamiento de las células se puede realizar separando las células y analizando las mismas para detectar aquellas que son productoras de producto. En caso dado, el cultivo celular que contiene las células estables se analiza de nuevo para detectar clones recombinantes estables y éstos se aíslan y se sacan del cultivo celular. A continuación se reproducen los clones celulares recombinantes estables obtenidos bajo condiciones libres de suero y proteínas.

El clon celular recombinante según la invención se caracteriza principalmente porque es estable y expresa un producto recombinante en un medio libre de suero y libre de proteínas y en ausencia de una presión de selección durante como mínimo 40, preferentemente como mínimo 50 y en particular más de 60 generaciones. Dicho clon posee esta estabilidad sin necesidad de ser apoyado por medios auxiliares como matrices o superficies sólidas, por ejemplo en forma de soportes. Además, de acuerdo con la invención tampoco es necesario un cultivo con altas densidades celulares.

De acuerdo con un aspecto especial de la invención, el clon celular recombinante estable se presenta en forma aislada. A partir del clon celular estable se obtiene un cultivo celular mediante reproducción de las células estables bajo condiciones libres de suero y proteínas.

El clon celular recombinante estable según la invención se deriva preferentemente de una célula recombinante de mamífero. Las células recombinantes de mamífero pueden ser todas aquellas células que contienen secuencias codificadoras de un polipéptido o proteína recombinante. Este grupo incluye todas las células de crecimiento continuo que crecen de forma adherente y no adherente. Son especialmente preferentes las células CHO o células BHK recombinantes. Los polipéptidos o proteínas recombinantes pueden ser factores sanguíneos, factores de crecimiento u otros productos relevantes desde el punto de vista biomédico.

De acuerdo con la presente invención son preferentes los clones recombinantes estables que contienen la secuencia codificadora de un factor sanguíneo recombinante como factor II, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, proteína S, proteína C o una forma activada de uno de estos factores, o vWF, y que son capaces de expresar el mismo de forma estable a lo largo de varias generaciones. Son especialmente preferentes las células CHO recombinantes que expresan vWF o un polipéptido con actividad de vWF, factor VIII o un polipéptido con actividad de factor VIII, vWF y factor VIII, factor IX o factor II.

El clon celular según la invención, seleccionado bajo condiciones libres de suero y proteínas, se caracteriza principalmente porque es estable durante como mínimo 40, preferentemente durante como mínimo 50 generaciones y en particular durante más de 60 generaciones en un medio libre de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección.

Para establecer un banco de células patrón se requieren 30 generaciones. Para realizar un cultivo por lotes medio con una tamaño de 1.000 litros se necesitan como mínimo aproximadamente 40 generaciones. Por consiguiente, por primera vez es posible producir bajo estas condiciones, partiendo de un clon individual, un "master cell bank" (MCB) (banco de células patrón), un "working cell bank" (WCB) (banco de células de trabajo) con aproximadamente 8 a 10 generaciones y, en consecuencia, un cultivo celular a escala de producción (biomasa de producción) con 20 a 25 generaciones, ya que los clones celulares conocidos hasta ahora se volvían inestables unas generaciones después del crecimiento en un medio libre de suero o proteínas, con lo que a) no era posible ningún cultivo celular uniforme con productores de producto y b) tampoco era posible ninguna productividad de producto durante un período de tiempo prolongado.

Por consiguiente, el clon celular según la invención es estable durante como mínimo 40 generaciones bajo condiciones de producción en un medio libre de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección. Los procedimientos descritos hasta la fecha sólo presentaban una cantidad de menos de 10 generaciones de productividad de producto bajo condiciones libres de proteínas (Reiter y col., 1992, supra).

Como criterio de estabilidad se emplea una cantidad mínima de como mínimo 40 generaciones, preferentemente más de 50, en particular más de 60 generaciones en el proceso de producción, durante las cuales se produce una expresión estable de las proteínas y las células no cambian de morfología-fenotipo ni presentan ninguna propiedad tumorógena.

Sorprendentemente, se comprobó que el clon celular según la invención bajo condiciones libres de suero y proteínas presenta una productividad de producto incluso mayor que la del clon celular original cultivado en un medio que contiene suero.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención pone a disposición un cultivo celular que contiene como mínimo un 90%, preferentemente más de un 95% y en especial más de un 98% de células recombinantes estables, que son estables y expresan un producto recombinante bajo condiciones libres de suero y proteínas durante como mínimo 40 generaciones, en particular durante como mínimo 50 generaciones.

En el marco de la presente invención, por "cultivo celular" se entiende un master "cell bank" (MCB) (banco de células patrón), un "working cell bank" (WCB) (banco de células de trabajo) o una biomasa de producción en un biorreactor de producción a escala industrial.

De acuerdo con la invención, el cultivo celular se obtiene principalmente cultivando un clon celular recombinante estable del tipo arriba descrito bajo condiciones libres de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección.

El cultivo celular según la invención se puede obtener reproduciendo el clon celular estable aislado del clon individual, de las células simiente hasta el MCB, el WCB o una biomasa a escala de producción en el biorreactor bajo condiciones libres de suero y proteínas, por ejemplo sin presión de selección sobre el gen de selección y/o el gen marcador. En particular se ha comprobado que las células recombinantes, obtenidas a partir del clon recombinante estable según la invención, son estables en un cultivo celular durante como mínimo 40 generaciones bajos condiciones libres de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección.

El cultivo celular proporcionado por la presente invención, que se produce a partir de un clon celular estable e independiente del suero y de las proteínas, presenta, bajo condiciones de cultivo y producción libres de proteínas, como mínimo un 90%, preferentemente como mínimo un 95% y en especial como mínimo un 98% de células recombinantes estables. Por "células recombinantes estables" se entienden principalmente células recombinantes de mamífero derivadas del clon celular estable. En este contexto son preferentes las células CHO recombinantes, preferentemente células CHO-dhfr^{-}, células CHO-K1 y células BHK, que expresan un factor sanguíneo, preferentemente vWF recombinante, factor VIII, factor III y vWF, factor IX o factor II.

El cultivo celular según la invención puede contener las células recombinantes estables en forma de un cultivo en suspensión. Las células también pueden estar inmovilizadas en un soporte, en particular en un microsoporte, siendo particularmente preferentes los microsoportes porosos. Se ha comprobado que los soportes porosos, por ejemplo Cytoline® o Cytopore®, son especialmente adecuados.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención pone a disposición un procedimiento para la producción a escala industrial de un producto recombinante bajo condiciones libres de suero y proteínas, utilizando el clon celular estable según la invención. Este procedimiento incluye los pasos de preparación de un clon celular recombinante estable aislado del tipo arriba descrito para producir un cultivo celular. La reproducción del clon celular estable aislado tiene lugar bajo condiciones libres de suero y proteínas en ausencia de una presión de selección desde el clon celular individual estable hasta el cultivo celular. En particular, el subcultivo de los clones celulares estables también se lleva a cabo bajo condiciones libres de proteínas, en particular sin adición de ninguna proteasa, por ejemplo tripsina. De este modo se asegura que no se pueda producir ninguna contaminación, en caso dado provocada por la adición de aditivos que contienen suero o proteínas humanas o de origen animal al cultivo celular en ningún momento durante la producción de un cultivo celular utilizado para la producción de un producto recombinante. Por consiguiente, por primera vez se describe un procedimiento que, a partir del clon inicial, permite desde la producción de un banco de células de trabajo hasta la biomasa de producción y producción subsiguiente de la proteína recombinante bajo condiciones libres de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección.

La obtención de los productos recombinantes con el cultivo celular según la invención, que contienen más de un 90%, preferentemente más de un 95% y en especial más de un 98% de células estables productoras de producto, puede tener lugar en forma de cultivo en suspensión o con células inmovilizadas en soportes. El proceso se puede realizar según un procedimiento por lotes, un procedimiento continuo o mediante técnica de perfusión con un medio libre de suero y proteínas.

A continuación, las proteínas recombinantes expresadas se retiran del sobrenadante del cultivo celular, se purifican con procedimientos conocidos en el estado actual de la técnica y se continúan procesando.

Como medio libre de suero y proteínas se puede utilizar cualquier medio sintético conocido. Los medios mínimos sintéticos convencionales pueden contener sales, aminoácidos, vitaminas, una fuente de hidratos de carbono y agua. Por ejemplo se puede tratar del medio F12 DMEM/HAM. El contenido de extracto de soja o extracto de levadura puede oscilar entre 0,1 y 100 g/l, ern particular entre 1 y 5 g/l. En una forma de realización especialmente preferente se puede utilizar extracto de soja, por ejemplo peptona de soja. El peso molecular de la peptona de soja es inferior a 50 kD, preferentemente inferior a 10 kD.

De forma especialmente preferente se utiliza un medio con la siguiente composición: medio mínimo sintético (de 1 a 25 g/l), peptona de soja (de 0,5 a 50 g/l), L-glutamina (de 0,05 a 1 g/l), NaHCO_{3} (de 0,1 a 10 g/l), ácido ascórbico (de 0,0005 a 0,05 g/l), etanolamina (de 0,0005 a 0,05 g/l), selenito de Na (de 0,0001 a 0,01 g/l). En caso dado se puede añadir al medio un agente tensioactivo no iónico, por ejemplo polipropilenglicol (PLURONIC F-61, PLURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 o PLURONIC F108) como antiespumante.

Este agente se añade generalmente para proteger las células frente a los efectos negativos de la aireación, dado que, sin la adición de un agente tensioactivo, las burbujas de aire que ascienden y revientan pueden deteriorar las células que se encuentran en la superficie de dichas burbujas ("sparging"), (Murhammer y Goochee, 1990, Biotechnol. Prog. 6:142-148).

La cantidad de agentes tensioactivos no iónicos puede oscilar entre 0,05 y 10 g/l, siendo especialmente preferente una cantidad a ser posible menor, entre 0,1 y 5 g/l. Además, el medio también puede contener ciclodextrina o un derivado de la misma.

No obstante, la adición de agentes tensioactivos no iónicos o de ciclodextrina no es esencial para la invención. Preferentemente, el medio libre de suero y proteínas contiene un inhibidor de proteasa, por ejemplo inhibidores de serina-proteasa, que son idóneos para el cultivo de tejidos y son de origen sintético o vegetal.

Los parámetros para el cultivo de células, como concentración de O_{2}, velocidad de perfusión o cambio de medio, pH, temperatura y técnica de cultivo, dependen de los tipos de células utilizados en cada caso y pueden ser determinados fácilmente por los especialistas. Por ejemplo, el cultivo de células CHO puede realizarse en un tanque agitador con perfusión con un medio libre de proteínas a una velocidad de perfusión de 1 a 10 cambios de volumen/día, un pH entre 7,0 y 7,8, preferentemente de aproximadamente 7,4, una concentración de O_{2} entre un 40% y un 60%, preferentemente de aproximadamente un 50%, y una temperatura entre 34ºC y 38ºC, preferentemente a 37ºC.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención pone a disposición un procedimiento para obtener un clon celular recombinante estable, que incluye los siguientes pasos:

-: reproducción de un clon original recombinante hasta obtener un cultivo celular en un medio que contiene de suero, sin presión de selección;

-: cultivo de las células bajo condiciones libres de suero y proteínas, preferentemente bajo condiciones equivalentes de producción, en ausencia de una presión de selección;

-: análisis del cultivo celular bajo condiciones libres de suero y proteínas para detectar las productoras de producto;

-: clonación de los clones celulares recombinantes estables bajo condiciones libres de suero y proteínas, pudiendo tener lugar la clonación mediante técnicas generales conocidas como aislamiento de las células mediante separación por dilución y cultivo de los clones individuales;

-: reproducción de los clones celulares aislados bajo condiciones libres de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección;

-: dado el caso análisis del cultivo celular para detectar productores de producto.

En este procedimiento sólo se consideran estables aquellos clones celulares recombinantes que expresan una proteína recombinante estable en un medio libre de proteínas durante como mínimo 10, preferentemente como mínimo 20 y en particular como mínimo 50 generaciones.

La invención se describe en relación con los siguientes ejemplos, pero no está limitada a los mismos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra la vista microscópica de un banco de células de trabajo de un clon original en el momento de la adaptación desde un medio que contiene suero a un medio libre de suero y proteínas (A), después de 10 generaciones en el medio libre de suero y proteínas (B) y después de 60 generaciones en el medio libre de suero y proteínas
(C).

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Figura 2: muestra la vista microscópica de un cultivo celular procedente de un clon celular recombinante estable bajo condiciones libres de suero y proteínas, en la etapa del banco de células de trabajo (A), después de 10 generaciones (B) y después de 60 generaciones (C).

Figura 3: muestra los resultados del cultivo de un clon celular rFVIII-CHO en un biorreactor de perfusión de 10 l.

a): Actividad de FVIII (mU/ml) y tasa de perfusión (1-5/día) durante un período de 42 días.

b): Productividad volumétrica (unidades de factor VIII/l/día) en el biorreactor de perfusión.

Ejemplos Ejemplo 1 Estabilidad de células rvWF-CHO después de cambiar de un medio que contienen suero a un medio libre de suero y proteínas

Células CHO-dhfr^{-} se sometieron a transfección con plásmido phAct-rvWF y pSV-dhfr, y se subclonaron clones que expresaban vWF de acuerdo con la descripción de Fischer y col. (1994, FEBS Letters 351:345-348). Con los subclones que expresaban rvWF de forma estable se formó un banco de células de trabajo ("working cell bank", WCB) y las células se inmovilizaron en un microsoporte poroso (Cytopore®) bajo condiciones de contenido de suero. Una vez alcanzada una densidad celular de 2 x 10^{7} células/ml matriz de soporte se llevó a cabo el cambio de las células a un medio libre de suero y proteínas. Las células se siguieron cultivando durante varias generaciones bajo condiciones libres de suero y proteínas. Las células se analizaron en diferentes momentos en un medio libre de suero y proteínas mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-vWF marcados. La evaluación de la estabilidad de las células se realizó en el banco de células de trabajo antes del cambio de medio, después de 10 generaciones y después de 60 generaciones en el medio libre de suero y proteínas. Mientras que el banco de células de trabajo todavía presentaba un 100% de células productoras de rvWF (Figura 1A), después de 10 generaciones en el medio libre de suero y proteínas la proporción de células productoras de rvWF había disminuido a aproximadamente el 50% (Figura 1 B). Después de 60 generaciones, más de un 95% de las células fueron identificadas como no productoras (Figura 1 C).

Ejemplo 2 Clonación de clones CHO recombinantes estables

Con el cultivo celular que contenía células rvWF-CHO según el Ejemplo 1 y que había sido cultivado durante 60 generaciones en un medio libre de suero y proteínas (Figura 1 C) se preparó una dilución y ésta se dispuso en una placa microtitulada a razón de 0,1 células/pocillo. Las células se cultivaron durante aproximadamente 3 semanas en un medio F12 DMEM/HAM sin adición de suero ni proteínas y sin presión de selección, y las células se analizaron por inmunofluorescencia con anticuerpos anti-vWF marcados. Un clon celular identificado como positivo se utilizó como clon inicial para la producción de un banco de células simiente. Con el banco de células simiente se formó un banco de células patrón (MCB) en un medio libre de suero y proteínas, y se congelaron ampollas individuales para la producción posterior de un banco de células de trabajo. Partiendo de una ampolla individual se produjo un banco de células de trabajo en un medio libre de suero y proteínas. Las células se inmovilizaron sobre microsoportes porosos y se cultivaron durante varias generaciones bajo condiciones libres de suero y proteínas. Las células se analizaron en cuanto a su productividad en diferentes momentos en el medio libre de suero y proteínas mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-vWF marcados. La evaluación de la estabilidad de las células se realizó en la etapa del banco de células de trabajo antes del cambio de medio, después de 10 y 60 generaciones en el medio libre de suero y proteínas. Tanto en el banco de células de trabajo (Figura 2 A) como después de 10 (Figura 2 B) y 60 generaciones (Figura 2 C), aproximadamente el 100% de las células fueron identificadas como clones recombinantes estables positivos que expresaban rvWF.

Ejemplo 3 Productividad específica celular de los clones celulares recombinantes

De la etapa definida durante el cultivo de células recombinantes se obtuvo una cierta cantidad de células y se incubó con medio fresco durante 24 h. La actividad rvWF:Risto-CoF se determinó en los sobrenadantes de cultivo celular. La Tabla 1 muestra que la productividad específica celular de los clones celulares recombinantes estables según la invención también era estable después de 60 generaciones en el medio libre de suero y proteínas, e incluso había aumentado en comparación con el clon original cultivado en un medio con contenido de suero.

TABLA 1

Clon celular	Prod. celular	Prod. celular	Prod. celular específica
	específica células de	específica tras 10	específica tras 60
	trabajo mU de	generaciones mU	generaciones mU
	rvWF/10^{6} células/día	rvWF/10^{6} células/día	rvWF/10^{6} células/día
Clon celular original rvWF-CHO	55	30	< 10
#808.68
Clone estable r-vWF-CHO F7 *)	62	65	60
*) \begin{minipage}[t]{155mm} Depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest el 22.1.1998 (ECACC (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK); número de depósito 98012206) \end{minipage}

Ejemplo 4 Cultivo de células rFVIII-CHO en medio mínimo libre de proteínas y suero

En un tanque agitador de 10 l se cultivó con perfusión un cultivo celular que contenía células rFVIII-CHO. Para ello se utilizó un medio libre de suero y proteínas. Las células se inmovilizaron en un microsoporte poroso (Cytopore®, Pharmacia) y se cultivaron durante como mínimo 6 semanas. La tasa de perfusión correspondía a 4 cambios de volumen/día, el pH era de aproximadamente 6,9-7,2, la concentración de O_{2} era de aproximadamente un 20-50% y la temperatura correspondía a aproximadamente 37ºC.

La Figura 3 muestra los resultados del cultivo de un clon celular rFVIII-CHO en un biorreactor de perfusión de 10 l.

TABLA 2

Días de cultivo	Productividad específica	Inmunofluorescencia
	(mU/10^{6} células/día)	(% células positivas FVIII)
15	702	n.a.
21	1.125	n.a
28	951	> 95%
35	691	.> 95%
42	970	n.a.

La Tabla 2 muestra la estabilidad y la productividad específica de las células que expresan rFVIII. Para obtener estos resultados se tomaron muestras después de 15, 21, 28, 35 y 42 días, se centrifugaron a 300 g y se resuspendieron en un medio fresco libre de suero y proteínas. Después de otras 24 horas se determinaron la concentración de factor VIII en los sobrenadantes de cultivo celular y la cantidad de células. A partir de estos datos se calculó la productividad de FVIII específica.

Se alcanzó una productividad estable media de 888 mU/10^{6} células/día. Esta productividad estable también se confirmó mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-FVIII marcados después de 15, 21, 28, 35 y 42 días en un medio libre de suero y proteínas.

Claims

1. Procedimiento para producir un clon celular recombinante estable, que es estable durante como mínimo 40 generaciones, bajo condiciones de producción en un medio libre de suero y proteínas, caracterizado porque incluye los siguientes pasos:

-: preparación de un clon celular original recombinante;

-: cultivo del clon celular original recombinante en un medio que contiene suero;

-: adaptación de las células a un medio libre de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección;

-: análisis del cultivo celular después de la adaptación para detectar células productoras de producto estables en ausencia de una presión de selección; y

-: clonación de un clon celular productor de producto estable bajo condiciones libres de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, después de la clonación, el clon celular estable se presenta en forma aislada.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque como clon original se prepara una célula recombinante de mamífero.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO o una célula BHK recombinante.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el clon celular recombinante contiene secuencias codificadoras de un polipéptido o proteína recombinante.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína recombinante es un factor sanguíneo seleccionado de entre el grupo consistente en factor II, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, proteína S, proteína C o una forma activada de uno de estos factores, o vWF.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como clon original se prepara una célula CHO recombinante que expresa el factor von Willebrand.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como clon original se prepara una célula CHO recombinante que expresa el factor VIII.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como clon original se prepara una célula CHO recombinante que coexpresa el factor VIII y vWF.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como clon original se prepara una célula CHO recombinante que expresa el factor IX.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque como clon original se prepara una célula CHO recombinante que expresa el factor II.

12. Clon celular recombinante estable obtenible mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque expresa un producto recombinante de forma estable a lo largo de como mínimo 40 generaciones bajo condiciones de producción en un medio libre de suero y proteínas y en ausencia de una presión de selección.

13. Clon celular según la reivindicación 12, caracterizado porque se presenta en forma aislada.

14. Clon celular según una de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque se deriva de una célula recombinante de mamífero.

15. Clon celular según la reivindicación 14, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO o una célula BHK recombinante.

16. Clon celular según la reivindicación 15, caracterizado porque la célula de mamífero es una célula CHO recombinante.

17. Clon celular según una de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque contiene secuencias codificadoras de un polipéptido o proteína recombinante.

18. Clon celular según la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína recombinante es un factor sanguíneo seleccionado de entre el grupo consistente en factor II, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XI, proteína S, proteína C o una forma activada de uno de estos factores, o vWF.

19. Clon celular según la reivindicación 18, caracterizado porque la proteína recombinante es factor VIII.

20. Clon celular según la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es una célula CHO recombinante que expresa factor von Willebrand.

21. Clon celular según la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es una célula CHO recombinante que expresa factor VIII.

22. Clon celular según la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es una célula CHO recombinante que coexpresa factor VIII y vWF.

23. Clon celular según la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es una célula CHO recombinante que expresa factor IX.

24. Clon celular según la reivindicación 16, caracterizado porque la célula es una célula CHO recombinante que expresa factor II.

25. Cultivo celular, caracterizado porque se puede obtener cultivando un clon celular recombinante estable según la reivindicación 12.

26. Cultivo celular, caracterizado porque contiene como mínimo un 90% de clones celulares recombinantes estables según la reivindicación 12.

27. Cultivo celular según la reivindicación 25 ó 26, caracterizado porque los clones celulares recombinantes estables son células de mamífero.

28. Cultivo celular según la reivindicación 27, caracterizado porque las células de mamífero son células CHO recombinantes.

29. Cultivo celular según la reivindicación 28, caracterizado porque las células CHO son células CHO-DHFR^{-} o células CHO-K1.

30. Cultivo celular según una de las reivindicaciones 25 a 29, caracterizado porque las células recombinantes estables contienen una secuencia codificadora de un polipéptido o proteína recombinante.

31. Cultivo celular según una de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizado porque las células recombinantes estables están inmovilizadas en un microsoporte.

32. Procedimiento para producir a escala industrial un producto recombinante bajo condiciones libres de suero y proteínas, caracterizado porque incluye los siguientes pasos:

-: preparación de un clon celular recombinante estable aislado según la reivindicación 12;

-: reproducción del clon celular estable en un medio libre de suero y proteínas desde el clon inicial hasta el cultivo celular, en ausencia de una presión de selección;

-: producción del cultivo celular que contiene células estables en un biorreactor en ausencia de una presión de selección; y

-: recogida de las proteínas del sobrenadante de cultivo.

33. Procedimiento según la reivindicación 32, caracterizado porque el medio libre de suero y proteínas es un medio mínimo sintético que contiene un extracto de levadura o soja.

34. Procedimiento según la reivindicación 32 ó 33, caracterizado porque el medio contiene ciclodextrina o un derivado de la misma.

35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 32 a 34, caracterizado porque el medio libre de suero y proteínas contiene un inhibidor de proteasa.