WO2024024671A1 - 動物細胞増殖促進剤 - Google Patents

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WO2024024671A1
WO2024024671A1 PCT/JP2023/026783 JP2023026783W WO2024024671A1 WO 2024024671 A1 WO2024024671 A1 WO 2024024671A1 JP 2023026783 W JP2023026783 W JP 2023026783W WO 2024024671 A1 WO2024024671 A1 WO 2024024671A1
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WO
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animal cell
serum
animal
cell culture
culture medium
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PCT/JP2023/026783
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French (fr)
Inventor
シュエン 鍾
啓太 平野
Original Assignee
不二製油グループ本社株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to an animal cell proliferation promoter.
  • Efficient cell growth in animal cell culture expands the scope of research and development in various fields. For example, it is expected that efficient progress will be made in the fields of regenerative medicine and cultured meat using cells. It is also possible to improve the production of necessary substances such as hormones, antibodies, and enzymes for life support.
  • adding serum derived from animals such as cows and horses or components derived from animal serum to a culture medium as a growth factor is commonly used as an operational standard.
  • serum-free media and chemically synthesized growth factors have been developed and are being used or added to culture media instead of animal serum.
  • Patent Document 1 proposes adding soybean protein hydrolyzate and yeast extract to a serum-free medium to increase the cell proliferation rate.
  • Patent Document 2 discloses a technology regarding an animal cell culture medium containing a hydrolyzate of ⁇ -conglycinin concentrate.
  • An object of the present invention is to provide a material that can promote the growth of animal cells by adding it to a serum-reduced medium.
  • the present invention (1) An animal cell growth promoter containing a protein material having all the characteristics of a) to c) below; a) Protein content in solid content is 70% by mass or more, b) NSI is 80 or higher; c) In the measurement results of molecular weight distribution, the area ratio of 2,000 Da or more and less than 20,000 Da is 30% or more, and the area ratio of 20,000 Da or more is 70% or less, (2) The animal cell growth promoter according to (1), wherein the protein material has an area ratio of 2,000 Da or more and less than 20,000 Da of 45 to 90% as measured by the molecular weight distribution; (3) The animal cell proliferation promoter according to (2), wherein the area ratio of less than 2,000 Da is 45% or less in the measurement results of molecular weight distribution; (4) An animal cell culture medium containing 0.015% by weight or more of the animal cell growth promoter described in (1) as a protein material in the medium; (5) An animal cell culture medium containing 0.015% by weight or more of the animal cell growth promoter described in (2) as
  • growth of animal cells can be promoted in a serum-reduced medium.
  • the vertical axis of the graph represents the proliferation ability of the mouse striated muscle-derived myoblast cell line C2C12 cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 5% FBS (fetal bovine serum) used as the basal medium. It represents cell proliferation ability (fold).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the vertical axis of the graph represents the proliferation ability of the mouse striated muscle-derived myoblast cell line C2C12 cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 5% FBS (fetal bovine serum) used as the basal medium. It represents cell proliferation ability (fold).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the vertical axis of the graph represents the proliferation ability of the mouse striated muscle-derived myoblast cell line C2C12 cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 5% FBS (fetal bovine serum) used as the basal medium. It represents cell proliferation ability (fold). It is a graph showing the results of a cell proliferation ability test using the human proximal tubule cell line HK2 using plant protein material A. The vertical axis of the graph represents the cell proliferation ability (fold) of the test group, with the proliferation ability of the human proximal tubule cell line HK2 freshly cultured in the BIO-MPM-1 serum-free medium used as the basal medium as 1. It is.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the animal cell growth promoter of the present invention is characterized by containing a vegetable protein material having all of the following characteristics a) to c).
  • a) Protein content in solid content is 70% by mass or more
  • b) NSI is 80 or higher
  • the above-mentioned vegetable protein material is preferably 50% by mass or more, more preferably 60% by mass or more, 70% by mass or more, 80% by mass or more, 90% by mass or more. , 95% by mass or more, and 100% by mass.
  • a vegetable protein material or an animal protein material can be used, and it is preferable to use a vegetable protein material.
  • the concept of the protein material of the present invention is a food material whose main component is vegetable or animal protein and which is used as a raw material for various processed foods and beverages.
  • Examples of the origin of the vegetable protein material include legumes such as soybeans, peas, mung beans, lupin beans, chickpeas, kidney beans, lentil beans, and cowpeas, seeds such as sesame seeds, canola seeds, coconut seeds, and almond seeds, and corn. , grains such as buckwheat, wheat, and rice, vegetables, and fruits.
  • the vegetable protein material is prepared from legume protein.
  • the vegetable protein material is prepared from soybean protein, pea protein, mung bean protein or broad bean protein.
  • the vegetable protein material is prepared from soy protein or pea protein.
  • soybean-derived protein materials are prepared by further concentrating protein from soybean raw materials such as defatted soybeans and whole soybeans, and are generally prepared using isolated soybean protein, concentrated soybean protein, powdered soymilk, or their combinations. It conceptually includes things that have been processed in various ways.
  • the protein material of the present invention will be further explained using a vegetable protein material as an example.
  • the vegetable protein material used in the animal cell culture medium of this embodiment has a protein content of 70% by mass or more, for example, 80% by mass or more, 85% by mass or more, or 90% by mass or more. be.
  • isolated protein is preferred, and for example, when it is prepared from a soybean-derived protein material, isolated soybean protein may be mentioned.
  • Protein purity is measured by Kjeldahl method. Specifically, the mass of nitrogen measured by the Kjeldahl method with respect to the mass of protein material dried at 105°C for 12 hours is expressed as "% by mass" as the protein content in the dried material. Note that the nitrogen conversion factor is 6.25. Basically, it is calculated by rounding off the number to the second decimal place.
  • the vegetable protein material used in the animal cell culture medium of this embodiment has an NSI (Nitrogen Solubility Index) of 80 or more, which is used as an index of protein solubility. More preferably, those having an NSI of 85 or more, 90 or more, 95 or more, or 97 or more can be used.
  • NSI Nonrogen Solubility Index
  • a vegetable protein material with a high NSI it is possible to use a vegetable protein material that has not been subjected to treatments that make the protein insolubilized, such as enzymatic decomposition treatment or mineral addition treatment, or that has been subjected to only a small amount of treatment. preferable.
  • a high NSI of the vegetable protein material indicates high dispersibility in water, which may contribute to the dispersion stability of the animal cell culture medium of this embodiment. If the NSI is too low, precipitation tends to occur, which is not preferable.
  • NSI is expressed as the ratio (mass%) of water-soluble nitrogen (crude protein) to the total nitrogen amount based on the method described below, and in the present invention, it is a value measured according to the method described below.
  • ⁇ Measurement method of NSI> Add 60 ml of water to 3 g of sample, stir with a propeller at 37°C for 1 hour, centrifuge at 1,400 xg for 10 minutes, and collect supernatant liquid (I). Next, 100 ml of water is added again to the remaining precipitate, stirred again with a propeller at 37°C for 1 hour, and then centrifuged to collect the supernatant liquid (II). Combine liquids (I) and (II) and add water to the mixture to make 250ml. After filtering this through filter paper (No. 5), the nitrogen content (water-soluble nitrogen) in the filtrate is measured by the Kjeldahl method.
  • the total amount of nitrogen in the sample is measured using the Kjeldahl method, and the ratio of water-soluble nitrogen to the total nitrogen amount expressed as mass % is defined as NSI. Basically, it is calculated by rounding off the number to the second decimal place.
  • the area ratio of the molecular weight distribution is 30% or more of 2,000 Da or more and less than 20,000 Da; 20,000Da or more is less than 70%. In a specific embodiment, 35% or more is 2,000 Da or more and less than 20,000 Da, and 65% or less is 20,000 Da or more. In a specific embodiment, when the molecular weight of the vegetable protein material is measured by gel filtration, the area ratio of the molecular weight distribution is 10 to 40%, for example, 10 to 35%, 15% to 10,000Da.
  • the area proportion less than 2,000 Da is 15% or less, such as 5% or less, 13% or less, 9% or less, 8% or less, 7% or less, and the lower limit is, for example, 0% or more, 1 % or more, 1.5% or more, 2% or more, 3% or more.
  • the area ratio of the molecular weight distribution is 45 to 90%, for example, 50 to 85%, 2,000 Da or more and less than 20,000 Da. 55-80%, 55-75%, 60-70%.
  • the area ratio of less than 2,000 Da is 45% or less, such as 40% or less, 35% or less, 33% or less, and the lower limit is, for example, 0% or more, 1% or more, 2% or more, 5% or more, 10% or more, 15% or more.
  • the area proportion of 10,000 Da or more is less than 50%, such as 5-45%, 10-40%, 12-35%.
  • the area proportion of 20,000 Da or more is less than 55%, such as less than 50%, less than 40%, less than 30%, less than 25%, less than 20%, less than 15%.
  • the molecular weight distribution was measured by HPLC (or high performance liquid chromatography). That is, the protein material was adjusted to a concentration of 0.1% by mass using an eluent, and the sample solution was filtered through a 0.2 ⁇ m filter.
  • a gel filtration system was constructed by connecting two types of columns in series, and the known proteins listed in Table 1 as molecular weight markers were first charged, and a calibration curve was created based on the relationship between molecular weight and retention time.
  • the vegetable protein material used in the animal cell culture medium of this embodiment can be obtained by applying a combination of "degradation treatment” for decomposing proteins and “molecular weight distribution adjustment treatment” for adjusting the molecular weight distribution of proteins.
  • “decomposition treatment” include enzyme treatment, pH adjustment treatment (e.g. acid treatment, alkali treatment), heat treatment, cooling treatment, high pressure treatment, organic solvent treatment, mineral addition treatment, supercritical treatment, ultrasonic treatment, Examples include electrolysis treatment and combinations thereof.
  • molecular weight distribution adjustment treatment examples include filtration, gel filtration, chromatography, centrifugation, electrophoresis, dialysis, and combinations thereof.
  • the order and number of times of “decomposition treatment” and “molecular weight distribution adjustment treatment” are not particularly limited, and the “molecular weight distribution adjustment treatment” may be performed after the “decomposition treatment” or the “molecular weight distribution adjustment treatment” may be performed.
  • the “disassembly process” may be performed after that, or both processes may be performed at the same time.
  • each process may be performed multiple times. It is also possible to perform the steps in the following order. Note that if the desired molecular weight distribution can be obtained by the "decomposition treatment", the "molecular weight distribution adjustment treatment” may not be performed. When performing these treatments multiple times in combination, all the treatments starting from the raw material may be performed consecutively, or may be performed after a period of time. For example, a commercially available product that has undergone a certain treatment may be used as a raw material to undergo other treatments.
  • a specific vegetable protein material may be obtained by mixing a vegetable protein material that has undergone molecular weight distribution adjustment treatment with a protein that has not undergone molecular weight distribution adjustment treatment.
  • the ratio between the two can be adjusted as appropriate within the range that satisfies the above characteristics, but the mass ratio is, for example, 1:99 to 99:1, for example 50:50 to Examples include 95:5, 75:25 to 90:10, etc.
  • the vegetable protein material used in the animal cell culture medium of this aspect is a vegetable protein material that has undergone "decomposition/molecular weight distribution adjustment treatment.”
  • reaction temperature can be 20 to 80°C, preferably 40 to 60°C.
  • the treatment can be carried out within a pH range of, for example, pH 2 to pH 12, with the upper and lower limits being the values of .
  • acid treatment it may be a method of adding an acid or a method of performing a fermentation treatment such as lactic acid fermentation.
  • acids to be added include inorganic acids such as hydrochloric acid and phosphoric acid, acetic acid, lactic acid, citric acid, gluconic acid, phytic acid, sorbic acid, adipic acid, succinic acid, tartaric acid, fumaric acid, malic acid, and ascorbic acid.
  • examples include organic acids.
  • the acid may be added using foods and drinks containing acids such as lemon juice, concentrated fruit juice, fermented milk, yogurt, and brewed vinegar.
  • an alkali such as sodium hydroxide or potassium hydroxide may be added.
  • denaturing agents such as guanidine hydrochloride, urea, arginine, PEG, etc.
  • heating temperatures include 60°C, 70°C, 80°C, 90°C, 100°C, 110°C, 120°C, 125°C, 130°C, 135°C, 140°C, 145°C, 150°C.
  • the upper and lower limits can be any temperature range of 60°C to 150°C, for example.
  • cooling temperatures are -10°C, -15°C, -20°C, -25°C, -30°C, -35°C, -40°C, -45°C, -50°C, -55°C, -60°C,
  • the range includes an upper limit and a lower limit of any temperature of -65°C, -70°C, and -75°C, for example, -10°C to -75°C.
  • heating or cooling times include 5 seconds, 10 seconds, 30 seconds, 1 minute, 5 minutes, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 60 minutes, 70 minutes, 80 minutes, 90 minutes
  • Examples include a range where the upper and lower limits are arbitrary times of 100 minutes, 120 minutes, 150 minutes, 180 minutes, and 200 minutes, for example, from 5 seconds to 200 minutes.
  • examples of pressure conditions include a range with upper and lower limits of arbitrary pressures of 100MPa, 200MPa, 300MPa, 400MPa, 500MPa, 600MPa, 700MPa, 800MPa, 900MPa, and 1,000MPa, for example, 100MPa to 1,000MPa. Can be mentioned.
  • examples of solvents used include alcohols and ketones, such as ethanol and acetone.
  • examples of minerals used include divalent metal ions such as calcium and magnesium.
  • supercritical treatment for example, carbon dioxide in a supercritical state at a temperature of about 30° C. or higher and a pressure of about 7 MPa or higher can be used.
  • ultrasonic treatment the treatment can be performed by irradiating with a frequency of 100 KHz to 2 MHz and a power of 100 to 1,000 W, for example.
  • electrolysis treatment for example, an aqueous protein solution can be treated by applying a voltage of 100 mV to 1,000 mV.
  • the treatment to degrade proteins is selected from heat treatment, and combinations thereof.
  • Those skilled in the art can appropriately set the conditions for the treatment to adjust the molecular weight distribution of the protein, such as the type of filter medium, carrier for gel filtration, centrifugal rotation speed, current, time, etc.
  • filter media include filter paper, filter cloth, diatomaceous earth, ceramic, glass, membrane, and the like.
  • carriers for gel filtration include dextran, agarose, and the like.
  • centrifugation conditions include 1,000 to 3,000 x g for 5 to 20 minutes.
  • soy protein materials such as "Fujipro E”, “Fujipro CL”, “Fujipro AL”, “New Fujipro 4500”, “Prolina RD-1”, “Prolina 900”, “Prolina HD101R” etc. , none of them fall under the category of vegetable protein materials that satisfy all of the characteristics a) to c) above.
  • the animal cell culture medium of the present invention contains the animal cell growth promoter described above.
  • the animal cell culture medium of the present invention is preferably a serum-reduced medium.
  • One embodiment of the serum-reduced medium may be a serum-reduced medium.
  • a serum-reduced medium is one in which serum is reduced compared to a normal serum medium, and preferably the amount of serum in the medium is less than 10%, more preferably 9.5%, 9%, 8%. %, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 0.1%, etc.
  • Another embodiment of the serum-reduced medium may be a serum-free medium.
  • the type of medium is not particularly limited, and any commercially available medium can be used.
  • Preferred media vary depending on the type of animal cells to be cultured, and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • animal cells include fibroblasts, epidermal cells, mammary cells, adipocytes, myoblasts, smooth muscle cells, endothelial cells, osteoblasts, hepatocytes, vascular endothelial cells, or their precursor cells. It will be done.
  • Other examples include somatic stem cells such as hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and neural stem cells, pluripotent stem cells, and induced pluripotent stem cells.
  • useful substances such as antibodies, enzymes (urokinase, etc.), hormones (insulin, etc.), cytokines (interferon, interleukin, tumor necrosis factor, colony stimulating factor, growth factors, etc.), and other physiologically active proteins and peptides.
  • animal cells include non-transformed cells such as skin cells, chondrocytes, hepatocytes, pancreatic cells, and kidney cells, as well as cells into which genes encoding genes or genes involved in the biosynthesis of useful substances have been introduced.
  • Transformed cells are exemplified.
  • Examples of transformed cells include antibody-producing cells such as mouse myeloma cells and Chinese hamster ovary cells. Useful substances can be efficiently produced by culturing these animal cells.
  • the animal cell is preferably derived from a mammal, such as mouse, rat, rabbit, human, horse, cow, monkey, pig, chicken, duck, dog, sheep, cat, goat, etc. .
  • the amount of the animal cell growth promoter of the present invention in the medium varies depending on the type of animal cells to be cultured, but is preferably 0.015% by mass or more as a protein material in the animal cell culture medium. Preferably it is 0.02% by mass or more, and 0.04% by mass or more.
  • the upper limit is preferably 0.5% by mass or less, more preferably 0.4% by mass or less, and even more preferably 0.3% by mass or less, 0.2% by mass or less, 0.15% by mass or less, and 0.1% by mass or less.
  • Specific examples include 0.015-0.5 mass%, 0.015-0.4 mass%, 0.015-0.3 mass%, 0.015-0.2 mass%, 0.015-0.15 mass%, 0.015-0.1 mass%, 0.02-0.5 mass%, 0.02-0.4 mass% %, 0.02-0.3 mass%, 0.02-0.2 mass%, 0.02-0.15 mass%, 0.02-0.1 mass%, 0.04-0.5 mass%, 0.04-0.4 mass%, 0.04-0.3 mass%, 0.04-0.2 mass%, Examples include 0.04 to 0.15% by mass and 0.04 to 0.1% by mass.
  • the protein material of the present invention is excellent in that it can promote the growth of animal cells even at a low concentration of 0.1% by mass or less.
  • promoting the proliferation of animal cells means that the proliferation of cells cultured in a medium supplemented with the protein material of the present invention is higher than the proliferation of cells cultured in a medium without additives.
  • the cell proliferation ability cultured in an additive-free medium is set to 1
  • the cell proliferation ability cultured in a medium supplemented with a vegetable protein material is 1.07 or more.
  • it is 1.08 or more, more preferably 1.10 or more, still more preferably 1.13 or more, still more preferably 1.15 or more. Note that the method for measuring cell proliferation will be described later.
  • animal cell proliferation promoting effect When animal cells are cultured in the animal cell culture medium of the present invention, cell proliferation of the animal cells is promoted by the protein material of the present invention. As long as the animal cells whose proliferation is promoted can produce substances useful for producing cultured meat, the production of cultured meat by animal cells can also be promoted. Furthermore, when the animal cells whose proliferation is promoted are of a type that produces substances useful to the human body, the production of the useful substances by the animal cells can also be promoted.
  • Various useful substances produced from animal cells include antibodies, enzymes, hormones, and the like.
  • Vegetable protein material (Preparation of vegetable protein material) The following vegetable protein materials were obtained and prepared. The protein content of these vegetable protein materials was all 80% by mass or more. Detailed analysis values are shown in Table 2.
  • Vegetable protein material A Decomposition and molecular weight distribution adjustment product of isolated soy protein (Fuji Oil Co., Ltd. test product, raw material isolated soy protein: Fuji Pro F (Fuji Oil Co., Ltd. commercial product))
  • Vegetable protein material B Decomposition and molecular weight distribution adjustment product of isolated soy protein (Fuji Oil Co., Ltd. test product, raw material isolated soy protein: Fuji Pro F (Fuji Oil Co., Ltd. commercial product)) Isolated soy protein hydrolyzate: Fuji Oil Co., Ltd. commercial product
  • Example 1 Growth-promoting effect on mouse striated muscle-derived myoblasts The proliferation-promoting effect of vegetable protein material A on mouse striated muscle-derived myoblasts was confirmed according to the following method.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • C2C12 mouse striated muscle-derived myoblast cell line
  • Cell proliferation was measured using Cell Counting Kit-8 manufactured by Dojindo Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. That is, a water-soluble tetrazolium salt (WST-8) was added to each medium after culture, and after incubation at 37°C for 60 minutes, the absorbance was measured at 450 nm.
  • the measurement principle is that NADH produced by dehydratase in cells reduces water-soluble tetrazolium salt (WST-8) to orange-colored water-soluble formazan via an electron carrier. The absorbance of this formazan at 450 nm is proportional to the number of living cells, and the number of living cells can be measured.
  • Example 2 Plant protein material B was used as the plant protein material, and cells were cultured in the same manner as in Example 1, except that 1.0 g/L was added to DMEM containing 5% FBS, and the proliferation ability was evaluated. . The results are shown in Figure 2. It was confirmed that plant protein material B also has a proliferation effect on C2C12 in a serum-reduced medium.
  • Example 3 Comparative Example 1
  • Cells were cultured in the same manner as in Example 1, except that vegetable protein material A or isolated soy protein hydrolyzate was used as the vegetable protein material, and 0.5 g/L was added to DMEM containing 5% FBS. and the proliferation ability was evaluated. The results are shown in Figure 3. While it was confirmed that plant protein material A has a high C2C12 growth effect in serum-reduced medium (Example 3, indicated as protein material A in the figure), the molecular weight distribution is defined by the present invention.
  • the isolated soybean protein hydrolyzate that did not meet the numerical values had a low C2C12 proliferation effect (Comparative Example 1, indicated as isolated soybean protein hydrolyzate in the figure), and did not meet the acceptance criteria of the present invention.
  • Example 4 Comparative Example 2
  • the effect of the vegetable protein material of the present invention in a serum-free medium was confirmed by the following procedure.
  • a serum-free medium (BIO-MPM-1, manufactured by Biological Industries Ltd.) containing 5 ⁇ M/mL Fibronectin (adhesion factor) to which glutamine was added at 2 mM was prepared.
  • a cell suspension containing the human proximal tubule cell line HK2 at 1 ⁇ 10 4 cells/mL was obtained.
  • Example 4 Growth effect of human proximal tubule cell line HK2 in serum-free medium when the amount of vegetable protein material A added was 0.5 g/L, 1.25 g/L, 2.5 g/L, and 5 g/L (Example 4) was confirmed to be high.

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Abstract

本発明は、血清が低減された培地に添加することで、動物細胞の増殖を促進することができる素材を提供することを目的とする。　特定の分子量分布やNSIを有する植物性蛋白質素材が低濃度の添加で動物細胞の増殖を促進することを見出した。

Description

動物細胞増殖促進剤
　本発明は、動物細胞増殖促進剤に関する。
　動物細胞培養において効率的に細胞を増殖させることで、様々な分野での研究および開発の範囲が広がる。例えば、再生医療や細胞を用いた培養肉の分野において効率よく進められることが期待される。また、生命維持のためのホルモン、抗体、酵素など必要な物質の産生性向上も可能である。
　従来の技術としては、ウシや馬などの動物由来の血清や動物血清由来の成分を増殖因子として培地に添加することが操作基準のように汎用されている。
　しかしながら、近年注目されている再生医療分野及び細胞を用いた培養肉の研究分野においては、組成分が完全に明らかになっていない動物血清中に含まれる不要物質の安全性や動物個体による品質安定性などの問題が懸念されている。
　そこで、近年無血清培地及び化学合成した増殖因子の開発が進められ、動物血清の代わりに培養培地への使用・添加に利用されている。
　動物血清の代わりに培養培地へ利用されている増殖因子となる成分は化学合成であり高価である。可食成分ではないこと、および増殖因子が高価なため製造コストが高くなり将来の食卓に新たな選択肢となりうる培養肉の開発への活用が制限されていることが課題である。また、窒素源としてアミノ酸や低分子のペプチドが培地に添加されているが、これらの成分は細胞の栄養素として細胞増殖に寄与し、低分子成分のみでは血清の持つ機能を全て代替することは困難である。
　特許文献１では、大豆蛋白質加水分解物及び酵母抽出物を無血清培地に添加して、細胞増殖率を高めることが提案されている。また、特許文献２ではβ－コングリシニン濃縮物の加水分解物を含む動物細胞培養用培地に関する技術が開示されている。
特表２００２－５２００１４号公報 特開２０１１－１８２７３６号公報
　本発明は、血清が低減された培地に添加することで、動物細胞の増殖を促進することができる素材を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の課題の解決に対し鋭意検討を重ねた。様々な蛋白質素材を検討する中で、従来の大豆蛋白質等とは異なる、特定の分子量分布やNSIを有する蛋白質素材が低濃度の添加で動物細胞の増殖を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、
（１）下記ａ）～ｃ）の全特徴を有する蛋白質素材を含む動物細胞増殖促進剤、
　ａ）固形分中の蛋白質含量が70質量％以上、
　ｂ）NSIが80以上、
　ｃ）分子量分布の測定結果で、2,000Da以上20,000Da未満の面積比率が30％以上、かつ20,000Da以上の面積比率が70％以下、
（２）蛋白質素材が、分子量分布の測定結果で、2,000Da以上20,000Da未満の面積比率が45～90％である、（１）記載の動物細胞増殖促進剤、
（３）分子量分布の測定結果で、2,000Da未満の面積比率が45％以下である、（２）記載の動物細胞増殖促進剤、
（４）（１）記載の動物細胞増殖促進剤を蛋白質素材として、培地中0.015重量％以上含む動物細胞培養用培地、
（５）（２）記載の動物細胞増殖促進剤を蛋白質素材として、培地中0.015重量％以上含む動物細胞培養用培地、
（６）（３）記載の動物細胞増殖促進剤を蛋白質素材として、培地中0.015重量％以上含む動物細胞培養用培地、
（７）動物細胞培養用培地が、培地中の血清量が10％未満の血清が低減された培地である、（４）記載の動物細胞培養用培地、
（８）動物細胞培養用培地が、培地中の血清量が10％未満の血清が低減された培地である、（５）記載の動物細胞培養用培地、
（９）動物細胞培養用培地が、培地中の血清量が10％未満の血清が低減された培地である、（６）記載の動物細胞培養用培地、
（１０）血清が低減された培地が、無血清培地である、（７）記載の動物細胞培養用培地、
（１１）血清が低減された培地が、無血清培地である、（８）記載の動物細胞培養用培地、
（１２）血清が低減された培地が、無血清培地である、（９）記載の動物細胞培養用培地、
（１３）（４）記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法、
（１４）（５）記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法、
（１５）（６）記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法、
（１６）（７）記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法、
（１７）（１０）記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法、
（１８）（１）記載の動物細胞増殖促進剤を動物細胞培養用培地中に添加し、動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法、
（１９）（１）記載の動物細胞増殖促進剤を培地中の血清量が10％未満の血清が低減された動物細胞培養用培地に添加し、動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法、
（２０）血清が低減された動物細胞培養用培地が、無血清の動物細胞培養用培地である、（１９）記載の動物細胞の増殖を促進する方法、
である。
　本発明により、血清が低減された培地において、動物細胞の増殖を促進することができる。
植物性蛋白質素材Ａを用いてマウス横紋筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を用いた細胞増殖能の試験を行った結果を示すグラフである。　グラフの縦軸は、基礎培地として使用した５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養したマウス横紋筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の増殖能を１として試験群の細胞増殖能（ｆｏｌｄ）を表したものである。 植物性蛋白質素材Ｂを用いてマウス横紋筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を用いた細胞増殖能の試験を行った結果を示すグラフである。　グラフの縦軸は、基礎培地として使用した５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養したマウス横紋筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の増殖能を１として試験群の細胞増殖能（ｆｏｌｄ）を表したものである。 植物性蛋白質素材Ａあるいは分離大豆蛋白質加水分解物を用いてマウス横紋筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２を用いた細胞増殖能の試験を行った結果を示すグラフである。　グラフの縦軸は、基礎培地として使用した５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養したマウス横紋筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の増殖能を１として試験群の細胞増殖能（ｆｏｌｄ）を表したものである。 植物性蛋白質素材Ａを用いてヒト近位尿細管細胞株ＨＫ２を用いた細胞増殖能の試験を行った結果を示すグラフである。　グラフの縦軸は、基礎培地として使用したＢＩＯ－ＭＰＭ－１無血清培地で培養したてヒト近位尿細管細胞株ＨＫ２の増殖能を１として試験群の細胞増殖能（ｆｏｌｄ）を表したものである。
（動物細胞増殖促進剤）
　本発明の動物細胞増殖促進剤は、下記ａ）～ｃ）の全特徴を有する植物性蛋白質素材を含むことを特徴とする。
　ａ）固形分中の蛋白質含量が70質量％以上、
　ｂ）NSIが80以上、
　ｃ）分子量分布の測定結果で、2,000以上20,000未満の面積比率が30％以上、かつ20,000以上の面積比率が70％以下。
　本発明の動物細胞増殖促進剤の固形分中、上記植物性蛋白質素材は好ましくは50質量％以上であり、より好ましくは60質量％以上、70質量％以上、80質量％以上、90質量％以上、95質量％以上、100質量％でありうる。
（蛋白質素材）
　本発明の蛋白質素材は、植物性蛋白質素材、動物性蛋白質素材を用いることができ、植物性蛋白質素材を用いることが好ましい。
　本発明の蛋白質素材の概念は、植物性あるいは動物性蛋白質を主成分とし、各種加工食品や飲料に原料として使用されている食品素材である。該植物性蛋白質素材の由来の例として、大豆、エンドウ、緑豆、ルピン豆、ヒヨコ豆、インゲン豆、ヒラ豆、ササゲ等の豆類、ゴマ、キャノーラ種子、ココナッツ種子、アーモンド種子等の種子類、とうもろこし、そば、麦、米などの穀物類、野菜類、果物類などが挙げられる。より具体的な実施形態では、該植物性蛋白質素材は、豆類の蛋白質から調製される。さらに具体的な実施形態では、該植物性蛋白質素材は大豆蛋白質、エンドウ豆蛋白質、緑豆蛋白質又は空豆蛋白質から調製される。さらにより具体的な実施形態では、該植物性蛋白質素材は大豆蛋白質又はエンドウ豆蛋白質から調製される。一例として大豆由来の蛋白質素材の場合、脱脂大豆や丸大豆等の大豆原料からさらに蛋白質を濃縮加工して調製されるものであり、一般には分離大豆蛋白質、濃縮大豆蛋白質や粉末豆乳、あるいはそれらを種々加工したものなどが概念的に包含される。
　また、動物性蛋白質素材としては、例えば、カゼイン、カゼインナトリウム、ホエー蛋白等の乳蛋白、卵白等が挙げられる。
　植物性蛋白質素材と動物性蛋白質素材は併用して使用することができる。併用する場合は、配合比率は特に限定されないが、植物性蛋白質素材：動物性蛋白質素材＝９９：１～１：９９である。
　本発明の蛋白質素材について、植物性蛋白質素材を例として、さらに説明する。
ａ）蛋白質純度
　本態様の動物細胞培養用培地に用いられる植物性蛋白質素材は固形分中の蛋白質含量が70質量％以上、例えば、80質量％以上、85質量％以上、又は90質量％以上である。上記範囲に含まれる植物性蛋白質素材の原料としては、分離蛋白質が好ましく、例えば大豆由来の蛋白質素材から調製する場合、分離大豆蛋白質などが挙げられる。
＜蛋白質純度の測定＞
　蛋白質純度はケルダール法により測定する。具体的には、105℃で12時間乾燥した蛋白質素材質量に対して、ケルダール法により測定した窒素の質量を、乾燥物中の蛋白質含量として「質量％」で表す。なお、窒素換算係数は6.25とする。基本的に、小数点以下第２桁の数値を四捨五入して求められる。
ｂ）蛋白質のＮＳＩ
　本態様の動物細胞培養用培地に用いられる植物性蛋白質素材は、蛋白質の溶解性の指標として用いられているＮＳＩ（Nitrogen Solubility Index：窒素溶解指数）が80以上のものである。より好ましくはＮＳＩが85以上、90以上、95以上、又は97以上のものを用いることができる。例えば、ＮＳＩが高い植物性蛋白質素材として、蛋白質が不溶化される処理、例えば酵素分解処理やミネラルの添加処理等、がされていないもの、あるいはされていたとしてもわずかであるもの、を用いることが好ましい。
　植物性蛋白質素材のＮＳＩが高いことは、水への分散性が高いことを示し、本態様の動物細胞培養用培地の分散安定性に寄与し得る。ＮＳＩが低すぎると沈殿が生じやすくなり、好ましくない。
　なお、ＮＳＩは後述する方法に基づき、全窒素量に占める水溶性窒素（粗蛋白）の比率（質量％）で表すものとし、本発明においては後述の方法に準じて測定された値とする。
＜ＮＳＩの測定法＞
　試料３ｇに60mlの水を加え、37℃で１時間プロペラ攪拌した後、1,400×ｇにて10分間遠心分離し、上澄み液（Ｉ）を採取する。次に、残った沈殿に再度水100mlを加え、再度37℃で1時間プロペラ撹拌した後、遠心分離し、上澄み液（II）を採取する。（Ｉ）液及び（II）液を合わせ、その混合液に水を加えて250mlとする。これをろ紙（ＮＯ．５）にてろ過した後、ろ液中の窒素含量（水溶性窒素）をケルダール法にて測定する。同時に試料中の全窒素量をケルダール法にて測定し、全窒素量に対する水溶性窒素の割合を質量％として表したものをNSIとする。基本的に、小数点以下第２桁の数値を四捨五入して求められる。
ｃ）分子量分布
　本態様の動物細胞培養用培地に用いられる植物性蛋白質素材は、ゲルろ過によって分子量を測定した場合に、その分子量分布の面積比率は、2,000Da以上20,000Da未満が30％以上、20,000Da以上が70％以下である。具体的な実施形態では、2,000Da以上20,000Da未満が35％以上、20,000Da以上が65％以下である。
　ある特定の実施形態では、植物性蛋白質素材は、ゲルろ過によって分子量を測定した場合に、その分子量分布の面積比率は、2,000Da以上10,000Da未満が10～40％、例えば10～35％、15～35％、10～30％、20～30％であり、10,000Da以上が50～80％、例えば55～75％、60～75％、60～70％、65～75％である。さらに具体的な実施形態では、2,000Da未満の面積比率は15％以下、例えば5%以下、13％以下、9％以下、8％以下、7％以下であり、下限は例えば0％以上、1％以上、1.5％以上、2％以上、3％以上である。
　他の特定の実施形態では植物性蛋白質素材は、ゲルろ過によって分子量を測定した場合に、その分子量分布の面積比率は、2,000Da以上20,000Da未満が45～90％、例えば、50～85％、55～80％、55～75％、60～70％である。
　さらに具体的な実施形態では、2,000Da未満の面積比率は45％以下、例えば、40％以下、35％以下、33％以下であり、下限は例えば0％以上、1％以上、2％以上、5％以上、10％以上、15％以上である。また、さらにより具体的な実施形態では、10,000Da以上の面積比率は50％未満、例えば、5～45％、10～40％、12～35％である。さらにより具体的な実施形態において、20,000Da以上の面積比率は55％未満、例えば50％以下、40％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下である。
　植物性蛋白質素材の分子量分布がこのような範囲にあることは、中程度に低分子化されたものが主成分であることを示す一方、高度に分解された低分子のペプチドは少ないことを示している。なお、分子量分布の測定は、後述する方法に基づくものとする。
＜分子量分布＞
　分子量分布の測定はHPLC（もしくは高速液体クロマトグラフィー）により行った、すなわち、溶離液で蛋白質素材を0.1質量％濃度に調整し、0.2μmフィルターでろ過したものを試料液とした。２種のカラム直列接続によってゲルろ過システムを組み、はじめに表１に記載している分子量マーカーとなる既知の蛋白質等をチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を作成した。次に試料液をチャージし、各分子量画分の含有量比率％をクロマト全体の吸光度のチャート面積に対する、特定の分子量範囲（時間範囲）の面積の割合によって求める（１stカラム：「TSK gel G3000SWXL」（SIGMA-ALDRICH社）、2ndカラム：「TSK gel G2000SW XL」（SIGMA-ALDRICH社）、溶離液：１％SDS＋1.17％NaCl＋50mMリン酸バッファー（pH7.0）、23℃、流速：0.4ml/分、検出：UV220nm）。
（表１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
（植物性蛋白質素材の「分解・分子量分布調整処理」）
　本態様の動物細胞培養用培地に用いられる植物性蛋白質素材は、蛋白質を分解させる「分解処理」と、蛋白質の分子量分布の調整する「分子量分布調整処理」を組み合わせて適用することにより得られ得る。上記「分解処理」の例として、酵素処理、ｐＨ調整処理（例えば、酸処理、アルカリ処理）、加熱処理、冷却処理、高圧処理、有機溶媒処理、ミネラル添加処理、超臨界処理、超音波処理、電気分解処理及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。上記「分子量分布調整処理」の例として、ろ過、ゲルろ過、クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、透析及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。「分解処理」と「分子量分布調整処理」の順序及び回数は特に限定されず、「分解処理」を行ってから「分子量分布調整処理」を行ってもよいし、「分子量分布調整処理」を行ってから「分解処理」を行ってもよいし、両処理を同時に行ってもよい。また、例えば２回以上の「分子量分布調整処理」の間に「分解処理」を行う、２回以上の「分解処理」の間に「分子量分布調整処理」を行う、各々複数回の処理を任意の順に行う、等も可能である。なお、「分解処理」によって所望の分子量分布が得られる場合は、「分子量分布調整処理」を行わなくてもよい。これらの処理を組み合わせて、複数回行う際、原料から全ての処理を連続で行ってもよいし、時間をおいてから行ってもよい。例えば、ある処理を経た市販品を原料として他の処理を行ってもよい。なお、上記特性を満たす限り、分子量分布調整処理を経た植物性蛋白質素材と、分子量分布調整処理を経ていない蛋白質を混合して、特定の植物性蛋白質素材としてもよい。この場合、両者の比率（処理を経た蛋白質素材：処理を経ていない蛋白質）は上記特性を満たす範囲で適宜調整可能であるが、質量比で例えば1：99～99：1、例えば50：50～95：5、75：25～90：10等が挙げられる。ある実施形態では、本態様の動物細胞培養用培地に用いられる植物性蛋白質素材は、「分解・分子量分布調整処理」を経た植物性蛋白質素材からなる。
　蛋白質を分解又は変性させる処理の条件、例えば酵素、pH、有機溶媒、ミネラル等の種類や濃度、温度、圧力、出力強度、電流、時間等は、当業者が適宜設定できる。酵素の場合、使用される酵素の例として、「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼが挙げられる。反応温度は20～80℃、好ましくは40～60℃で反応を行うことができる。ｐＨ調整処理の場合、例えばpH2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12の任意の値を上限、下限とするpH範囲、例えばpH2～12の範囲で処理し得る。酸処理の場合、酸を添加する方法であっても、また、乳酸発酵などの発酵処理を行う方法であってもよい。添加する酸の例として、塩酸、リン酸等の無機酸、酢酸、乳酸、クエン酸、グルコン酸、フィチン酸、ソルビン酸、アジピン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、リンゴ酸、アスコルビン酸等の有機酸が挙げられる。また、レモンなどの果汁、濃縮果汁、発酵乳、ヨーグルト、醸造酢などの酸を含有する飲食品を用いて酸を添加してもよい。アルカリ処理の場合、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリを添加し得る。変性剤処理の場合、塩酸グアニジン、尿素、アルギニン、PEG等の変性剤を添加し得る。加熱又は冷却処理の場合、加熱温度の例として、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、110℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃の任意の温度を上限、下限とする範囲、例えば60℃～150℃が挙げられる。冷却温度の例として、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃の任意の温度を上限、下限とする範囲、例えば-10℃～-75℃が挙げられる。加熱又は冷却時間の例として、5秒、10秒、30秒、1分、5分、10分、20分、30分、40分、50分、60分、70分、80分、90分、100分、120分、150分、180分、200分の任意の時間を上限、下限とする範囲、例えば5秒間～200分間が挙げられる。高圧処理の場合、圧力の条件の例として、100MPa、200MPa、300MPa、400MPa、500MPa、600MPa、700MPa、800MPa、900MPa、1,000MPaの任意の圧力を上限、下限とする範囲、例えば100MPa～1,000MPaが挙げられる。有機溶媒処理の場合、用いられる溶媒の例として、アルコールやケトン、例えばエタノールやアセトンが挙げられる。ミネラル添加処理の場合、用いられるミネラルの例として、カルシウム、マグネシウムなどの２価金属イオンが挙げられる。超臨界処理の場合、例えば、温度約30℃以上で約7MPa以上の超臨界状態の二酸化炭素を使用して処理できる。超音波処理の場合、例えば100KHz～2MHzの周波数で100～1,000Wの出力で照射して処理し得る。電気分解処理の場合、例えば蛋白質水溶液を100mV～1,000mVの電圧を印加することにより処理し得る。具体的な実施形態において、蛋白質を分解させる処理は、加熱処理、及びそれらの組み合わせから選択される。
　蛋白質の分子量分布を調整する処理の条件、例えばろ材の種類、ゲルろ過の担体、遠心分離回転数、電流、時間等は、当業者が適宜設定できる。ろ材の例として、ろ紙、ろ布、ケイ藻土、セラミック、ガラス、メンブラン等が挙げられる。ゲルろ過の担体の例として、デキストラン、アガロース等が挙げられる。遠心分離の条件の例として、1,000～3,000×g、5～20分間等が挙げられる。
　なお、従来の市販の大豆蛋白質素材である「フジプロE」、「フジプロCL」、「フジプロAL」、「ニューフジプロ4500」、「プロリーナRD-1」、「プロリーナ900」、「プロリーナHD101R」などは、いずれも上記ａ）～ｃ）の全特性を満たす植物性蛋白質素材に該当しない。
（動物細胞培養用培地）
　本発明の動物細胞培養用培地は、上記動物細胞増殖促進剤を含む。
　本発明の動物細胞培養用培地は、血清が低減された培地であることが好ましい。
　血清が低減された培地の１つの実施形態としては血清低減培地でありうる。本発明では血清低減培地とは、通常の血清培地よりも血清が低減されたものであり、好ましくは、培地中の血清量が10％未満であり、より好ましくは、9.5％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％等のものが挙げられる。
　また、血清が低減された培地の別の実施形態としては無血清培地でありうる。
　培地の種類は特に限定されず市販されている培地を使用することができる。好ましい培地は培養する動物細胞の種類によって異なり、当業者が適宜選択することができる。
　動物細胞としては、例えば、線維芽細胞、表皮細胞、乳腺細胞、脂肪細胞、筋芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、骨芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、または、それらの前駆細胞が挙げられる。また、その他として造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞などの体性幹細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞が挙げられる。
　また、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インシュリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等）、その他の生理活性蛋白質・ペプチドなどの有用物質を産生する動物細胞が挙げられ、かかる動物細胞としては、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、腎細胞等の非形質転換細胞や、コードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞が例示される。形質転換細胞の例としては、マウスミエローマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの抗体産生細胞などが挙げられる。これらの動物細胞を培養して有用物質を効率的に製造することができる。また、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などを培養し、効率的に増殖させることにより、これらを再生医療の分野にも利用することができる。
　動物細胞の由来としては、好ましくは哺乳動物由来の細胞であり、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ウマ、ウシ、サル、ブタ、ニワトリ、カモ、イヌ、ヒツジ、ネコ、ヤギなどが挙げられる。
　本発明の動物細胞増殖促進剤の培地中の量は、培養する動物細胞の種類によって異なるが、望ましくは動物細胞培養用培地中、蛋白質素材として0.015質量％以上である。好ましくは0.02質量％以上、0.04質量％以上である。上限は、好ましくは0.5質量％以下であり、より好ましくは0.4質量％以下であり、さらに好ましくは0.3質量％以下、0.2質量％以下、0.15質量％以下、0.1質量％以下とすることもできる。具体例として、0.015～0.5質量％、0.015～0.4質量％、0.015～0.3質量％、0.015～0.2質量％、0.015～0.15質量％、0.015～0.1質量％、0.02～0.5質量％、0.02～0.4質量％、0.02～0.3質量％、0.02～0.2質量％、0.02～0.15質量％、0.02～0.1質量％、0.04～0.5質量％、0.04～0.4質量％、0.04～0.3質量％、0.04～0.2質量％、0.04～0.15質量％、0.04～0.1質量％が挙げられる。本発明の蛋白質素材が上記範囲の量で含有することにより、動物細胞培養の増殖を促進することができる。
　特に、本発明の蛋白質素材は上記のように、0.1質量％以下の低い濃度においても、動物細胞の増殖を促進することができる点で優れている。
　本発明において、動物細胞の増殖を促進するとは、本発明の蛋白質素材を添加した培地で培養した細胞の増殖が、無添加の培地で培養した細胞の増殖よりも高いことをいう。
　具体的には、無添加の培地で培養した細胞増殖能を1としたときに、植物性蛋白質素材を添加した培地で培養した細胞増殖能が、1.07以上であることをいう。好ましくは、1.08以上であり、より好ましくは1.10以上であり、さらに好ましくは1.13以上であり、さらに好ましくは1.15以上である。
　なお、細胞増殖の測定方法は後述する。
（動物細胞の増殖促進効果）
　本発明の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養すると、本発明の蛋白質素材により動物細胞の細胞増殖が促進される。これにより、増殖が促進される動物細胞が培養肉の製造に有用な物質を産生できるものであれば、動物細胞による培養肉の産生も促進され得る。
　また、増殖が促進される動物細胞がヒトの生体に有用な物質を産生する種類のものである場合は、動物細胞による該有用物質の産生も促進されうる。動物細胞から産生される各種有用物質としては抗体の他、酵素やホルモン等が挙げられる。
　以下に実施例を記載することで本発明を説明する。尚、例中の部及び％は特に断らない限り質量基準を意味するものとする。
（植物性蛋白質素材の調製）
　以下の植物性蛋白素材を入手、調製した。これら植物性蛋白素材の蛋白質含量は、どれも80質量％以上であった。詳細な分析値を表２に示した。
　植物性蛋白質素材Ａ：分離大豆蛋白質の分解・分子量分布調整処理品（不二製油株式会社テスト製造品、原料分離大豆蛋白質：フジプロF（不二製油株式会社市販品））
　植物性蛋白質素材Ｂ：分離大豆蛋白質の分解・分子量分布調整処理品（不二製油株式会社テスト製造品、原料分離大豆蛋白質：フジプロF（不二製油株式会社市販品））
　分離大豆蛋白質加水分解物：不二製油株式会社市販品
（表２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
（実施例１）マウス横紋筋由来筋芽細胞への増殖促進効果
　植物性蛋白質素材Ａのマウス横紋筋由来筋芽細胞への増殖促進効果を、以下の方法に従い確認した。
（細胞の培養方法）
　Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Suspensionを100倍希釈となるように添加した5％FBS（ウシ胎児血清）を含む、ダルベッコ改変イーグル培地（以下、DMEMと称する。）を調製した。これを用いてマウス横紋筋由来筋芽細胞株C2C12（以下、C2C12と称する。）を５×１０4cell/mLに調製した細胞浮遊液を取得した。得られた細胞浮遊液を96well-plateに0.1mL/well、各8wellに添加した。37℃、24時間（ＣＯ2濃度=5％）平衡化後、各濃度の植物性蛋白質素材Ａを添加した5％FBSを含むDMEMに置換した。これを37℃、48～72時間培養（ＣＯ2濃度=5％）した後に、細胞増殖測定を行った。
　なお、植物性蛋白質素材を添加していない5％FBSを含むDMEMまたは10％FBSを含むDMEMでの培養も行った。
　なお、植物性蛋白質素材Ａは5％FBSを含むDMEMに対して0.2ｇ/L（0.02％相当）～1.5ｇ/L（0.15％相当）添加した。
（細胞増殖能の評価方法）
　(株)同仁化学研究所製のCell Counting Kit-8を用いて、細胞増殖測定を行った。
　すなわち、培養後の各培地に、水溶性テトラゾリウム塩（WST-8）を添加し、37℃、60分間インキュベーション後、吸光度450nmで測定した。
　測定原理は、細胞中の脱水酵素により産生されるNADHは電子伝達体を介して水溶性テトラゾリウム塩（WST-8）をオレンジ色の水溶性ホルマザンに還元する。このホルマザンの450nmの吸光度は生細胞数に比例し、生細胞数を計測することができる。
　結果を図１に示した。
　通常の10％FBSを含むDMEMでの細胞増殖能と比べ、FBSの濃度を半減した5％FBSを含むDMEMでの増殖能が明らかに低下した。一方、5％FBSを含むDMEMに対して0.2ｇ/L（0.02％相当）～1.5ｇ/L（0.15％相当）の植物性蛋白質素材ＡをDMEMに添加することで、低下した増殖能が有意に回復した。
　従って、植物性蛋白質素材Ａは血清低減培地において、C2C12の増殖効果があることが確認された。
（実施例２）
　植物性蛋白質素材として、植物性蛋白質素材Ｂを使用し、５％FBSを含むDMEMに対して、1.0ｇ/L添加した以外は実施例１と同様にして細胞を培養し、増殖能を評価した。結果を図２に示した。
　植物性蛋白質素材Ｂにおいても、血清低減培地において、C2C12の増殖効果があることが確認された。
（実施例３、比較例１）
　植物性蛋白質素材として、植物性蛋白質素材Ａあるいは分離大豆蛋白質加水分解物を使用し、５％FBSを含むDMEMに対して、0.5ｇ/L添加した以外は実施例１と同様にして細胞を培養し、増殖能を評価した。結果を図３に示した。
　植物性蛋白質素材Ａにおいて、血清低減培地において、C2C12の増殖効果が高いことが確認されたのに対し（実施例３、図中、蛋白質素材Ａと表記。）、分子量分布が本発明で規定する数値を満たさない分離大豆蛋白質加水分解物はC2C12の増殖効果が低く（比較例１、図中、分離大豆蛋白質加水分解物と表記。）、本発明の合格基準を満たさない結果となった。
（実施例４、比較例２）
　本発明の植物性蛋白素材の無血清培地における効果を以下の手順で確認した。
グルタミンを2mMとなるように添加した5 μM/mL Fibronectin（接着因子）を含む無血清培地（BIO-MPM-１、Biological Industries Ltd.社製）を調製した。これを用いてヒト近位尿細管細胞株HK2を１×１０4cells/mLに調製した細胞浮遊液を取得した。得られた細胞浮遊液を96well-plateに0.1mL/well、各8wellに添加した。37℃、24時間（ＣＯ2濃度=5％）平衡化後、各濃度の植物性蛋白質素材Ａを添加した無血清培地（BIO-MPM-１）に置換した。これを37℃、48～72時間培養（ＣＯ2濃度=5％）した後に、細胞増殖測定を行った。
　なお、植物性蛋白質素材ＡはBIO-MPM-１無血清培地に対して0.125ｇ/L（0.0125％相当）～5ｇ/L（0.5％相当）添加した。また、細胞増殖能の評価を実施例１と同様に行った。評価結果を図４に示した。
　植物性蛋白質素材Ａの添加量が0.5g/L、1.25g/L、2.5g/L及び5g/L（実施例４）において、無血清培地において、ヒト近位尿細管細胞株HK2の増殖効果が高いことが確認された。

Claims (20)

  1. 下記ａ）～ｃ）の全特徴を有する蛋白質素材を含む動物細胞増殖促進剤。
    　ａ）固形分中の蛋白質含量が70質量％以上、
    　ｂ）NSIが80以上、
    　ｃ）分子量分布の測定結果で、2,000Da以上20,000Da未満の面積比率が30％以上、かつ20,000Da以上の面積比率が70％以下。
  2. 　蛋白質素材が、分子量分布の測定結果で、2,000Da以上20,000Da未満の面積比率が45～90％である、請求項１記載の動物細胞増殖促進剤。
  3. 　分子量分布の測定結果で、2,000Da未満の面積比率が45％以下である、請求項２記載の動物細胞増殖促進剤。
  4. 請求項１記載の動物細胞増殖促進剤を蛋白質素材として、培地中0.015重量％以上含む動物細胞培養用培地。
  5. 請求項２記載の動物細胞増殖促進剤を蛋白質素材として、培地中0.015重量％以上含む動物細胞培養用培地。
  6. 請求項３記載の動物細胞増殖促進剤を蛋白質素材として、培地中0.015重量％以上含む動物細胞培養用培地。
  7. 動物細胞培養用培地が、培地中の血清量が10％未満の血清が低減された培地である、請求項４記載の動物細胞培養用培地。
  8. 動物細胞培養用培地が、培地中の血清量が10％未満の血清が低減された培地である、請求項５記載の動物細胞培養用培地。
  9. 動物細胞培養用培地が、培地中の血清量が10％未満の血清が低減された培地である、請求項６記載の動物細胞培養用培地。
  10. 血清が低減された培地が、無血清培地である、請求項７記載の動物細胞培養用培地。
  11. 血清が低減された培地が、無血清培地である、請求項８記載の動物細胞培養用培地。
  12. 血清が低減された培地が、無血清培地である、請求項９記載の動物細胞培養用培地。
  13. 請求項４記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
  14. 請求項５記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
  15. 請求項６記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
  16. 請求項７記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
  17. 請求項１０記載の動物細胞培養用培地中で動物細胞を培養する、動物細胞の培養方法。
  18. 請求項１記載の動物細胞増殖促進剤を動物細胞培養用培地中に添加し、動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
  19. 請求項１記載の動物細胞増殖促進剤を、培地中の血清量が10％未満の血清が低減された動物細胞培養用培地に添加し、動物細胞を培養する、動物細胞の増殖を促進する方法。
  20. 血清が低減された動物細胞培養用培地が、無血清の動物細胞培養用培地である、請求項１９記載の動物細胞の増殖を促進する方法。
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