JP2024515337A - 細胞増殖培地の製造方法及び製造システム - Google Patents
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Abstract
細胞増殖培地の製造方法が開示される。この方法は、細胞増殖培地の製造方法であって、バイオマススラリーを得るために、ガス発酵により微生物細胞を培養することと、固相から液相を分離及び除去することによってバイオマススラリーを濃縮することと、濃縮バイオマススラリーを高圧均質化により均質化し、微生物細胞を少なくとも部分的に分解することと、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって均質化されたバイオマススラリーを処理することと、及び処理されたバイオマススラリーを加熱すること、を含む。【選択図】【図1】
Description
本開示は、一般的に細胞増殖培地(複数可)に関し、及び、より具体的には、細胞製造培地の製造方法に関する。さらには、本開示は、細胞増殖培地の製造のためのシステムにも関する。
人間(ヒト)は、バランスの取れた食事の要件を満たすために様々な食品源に頼っている。典型的には、バランスの取れた食事には、タンパク質、炭水化物、脂肪、ビタミン、ミネラルが適切な割合で含まれている。動物由来の食料源は前述の栄養素のほとんどを提供するが、動物の飼育には広い土地、食料、水資源が費やされ、持続可能な解決策ではない。さらに、飼育動物は、ほんの少量の有用な生産物(動物の肉、血清など)と引き換えに犠牲にされるため、畜産の非倫理的な側面が形成される。
ヒトの食事では、植物(例えば、大豆)及び動物(例えば、牛、豚、家禽、魚)が、上記の栄養素、特に高品質のタンパク質の潜在的な供給源となっている。
さらに、食肉産業は世界的に大気中の二酸化炭素(CO2)の主な生産者である。したがって、適切な細胞増殖培地を使用した持続可能な動物タンパク質の生産、より具体的には細胞培養肉に対する長年の要求がある。特に、細胞の効率的な培養と人間の消費を目的とした製品の最も重要なコスト要因は増殖培地(細胞増殖培地と増殖サプリメントで構成される)であり、総コストの最大96%を占める可能性がある。特に、細胞増殖培地と増殖サプリメントは、細胞とその結果得られる製品の持続可能な大規模培養の制限要因となっている。
ヒトの食事では、植物(例えば、大豆)及び動物(例えば、牛、豚、家禽、魚)が、上記の栄養素、特に高品質のタンパク質の潜在的な供給源となっている。
さらに、食肉産業は世界的に大気中の二酸化炭素(CO2)の主な生産者である。したがって、適切な細胞増殖培地を使用した持続可能な動物タンパク質の生産、より具体的には細胞培養肉に対する長年の要求がある。特に、細胞の効率的な培養と人間の消費を目的とした製品の最も重要なコスト要因は増殖培地(細胞増殖培地と増殖サプリメントで構成される)であり、総コストの最大96%を占める可能性がある。特に、細胞増殖培地と増殖サプリメントは、細胞とその結果得られる製品の持続可能な大規模培養の制限要因となっている。
従来の増殖培地には、屠殺場で牛の胎児から採取された市販の血清が含まれている。さらに、この解決策は畜産に関連する倫理的及び環境的懸念を排除するものではない。さらに、そのような市販の血清サプリメントは高価であり、且つ、必ずしも食品グレードではない。したがって、血清サプリメントに代わる安価な食品グレードの代替品を特定することが重要である。
しかしながら、技術的な課題1つは、持続可能な無血清細胞培養培地の製剤化である。別の課題は、植物ベースの増殖培地には通常存在しない十分な量の鉄及びビタミンB12を含む細胞増殖培地を提供することである。
しかしながら、技術的な課題1つは、持続可能な無血清細胞培養培地の製剤化である。別の課題は、植物ベースの増殖培地には通常存在しない十分な量の鉄及びビタミンB12を含む細胞増殖培地を提供することである。
細胞培養技術の最近の進歩により、細胞促進剤として応用できる可能性のある化合物として、食品タンパク質の加水分解に由来する生理活性ペプチドを同定する道が開かれてきた(Roeselerら、2017)。
さらに、繊維状タンパク質とグリコサミノグリカンの補給によりウシ初代骨格筋細胞の細胞成長が改善され(Ronningら、2013)、鶏肉副産物からの生理活性ペプチド(Limaら、2019)はグルコースの取り込みを改善したことが以前に実証されている。
さらに、卵殻膜は、細胞の成長と生存をサポートする有効成分(炭水化物、タンパク質、ペプチド)、成長因子、酵素を含む、抗炎症特性を持つ別の有望な繊維状物質である(Ahmedら、2017;Vuongら2017)。
さらに、Nofimaは、鶏の枝肉、タラの背骨、卵殻膜、卵白粉末、豚血漿、酵母エキスなどの様々な副産物からの加水分解物がすべて、オーダーメイドの無血清培地に含まれる可能性があることを示した(Andreassenら、2020)。
さらに、繊維状タンパク質とグリコサミノグリカンの補給によりウシ初代骨格筋細胞の細胞成長が改善され(Ronningら、2013)、鶏肉副産物からの生理活性ペプチド(Limaら、2019)はグルコースの取り込みを改善したことが以前に実証されている。
さらに、卵殻膜は、細胞の成長と生存をサポートする有効成分(炭水化物、タンパク質、ペプチド)、成長因子、酵素を含む、抗炎症特性を持つ別の有望な繊維状物質である(Ahmedら、2017;Vuongら2017)。
さらに、Nofimaは、鶏の枝肉、タラの背骨、卵殻膜、卵白粉末、豚血漿、酵母エキスなどの様々な副産物からの加水分解物がすべて、オーダーメイドの無血清培地に含まれる可能性があることを示した(Andreassenら、2020)。
移行段階では、食品産業からの副産物を持続可能な無血清増殖培地の成分として使用できる。さらに、食品タンパク質の加水分解に由来する生理活性ペプチド、例えば、植物タンパク質は、細胞促進剤として応用できる潜在的な化合物であることが示されている(Roeaslerら、2017)。
市販されている加水分解物に関する問題の1つは、その組成を標準化された状態に維持することが難しいことである。したがって、肉を養殖するための長期的な目標は、農業から完全に解放されたタンパク質源を使用することである。
市販されている加水分解物に関する問題の1つは、その組成を標準化された状態に維持することが難しいことである。したがって、肉を養殖するための長期的な目標は、農業から完全に解放されたタンパク質源を使用することである。
したがって、前記の議論を考慮すると、手頃な価格で、食品グレードの成分のみを含み、及び細胞の増殖及び分化を促進するのに効果的である、という従来の細胞増殖培地に伴う欠点を克服する必要がある。
本開示は、細胞増殖培地の製造方法を提供することを目的とする。本開示はまた、細胞増殖培地を製造するためのシステムを提供することを目的とする。本開示は、細胞培養肉の製造に動物ベース又は代替の植物ベースの細胞増殖培地を使用するという既存の問題に対する解決策を提供しようとするものである。本開示の目的は、従来技術で遭遇する問題を少なくとも部分的に克服する解決策を提供することである。
一態様では、本開示の実施形態は、細胞増殖培地を製造する方法を提供し、この方法は、
- バイオマススラリーを得るために、ガス発酵により微生物細胞を培養することと、
- 固相から液相を分離及び除去することによって前記バイオマススラリーを濃縮することと、
- 前記濃縮バイオマススラリーを高圧均質化により均質化し、前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解することと、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記均質化されたバイオマススラリーを処理することと、及び
- 前記処理されたバイオマススラリーを加熱すること、を含む方法である。
- バイオマススラリーを得るために、ガス発酵により微生物細胞を培養することと、
- 固相から液相を分離及び除去することによって前記バイオマススラリーを濃縮することと、
- 前記濃縮バイオマススラリーを高圧均質化により均質化し、前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解することと、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記均質化されたバイオマススラリーを処理することと、及び
- 前記処理されたバイオマススラリーを加熱すること、を含む方法である。
別の態様では、本開示の実施形態は、細胞増殖培地を生産するためのシステムを提供し、このシステムは、
- バイオマススラリーを得るためにガス発酵により微生物細胞を培養するバイオリアクターと、
- 前記バイオマスの固相と液相を分離するための分離装置と、
- 前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解するために高圧均質化により前記バイオマススラリーを均質化するための均質化装置と、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記バイオマススラリーを処理するための反応チャンバーと、及び、
- 前記バイオマススラリーを加熱するためのインキュベーターと、を含むシステムである。
- バイオマススラリーを得るためにガス発酵により微生物細胞を培養するバイオリアクターと、
- 前記バイオマスの固相と液相を分離するための分離装置と、
- 前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解するために高圧均質化により前記バイオマススラリーを均質化するための均質化装置と、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記バイオマススラリーを処理するための反応チャンバーと、及び、
- 前記バイオマススラリーを加熱するためのインキュベーターと、を含むシステムである。
本開示の実施形態は、先行技術における前述の問題を実質的に除去するか、又は少なくとも部分的に対処し、微生物細胞に由来する細胞増殖培地を製造する効率的な方法を提供する。有益なことに、前述の細胞増殖培地は、細胞培養に使用されるウシ胎児血清(FBS)の持続可能な代替品である。
さらに、有益なことに、前述の細胞増殖培地は、生きた微生物が電気、空気、及び水を使用してタンパク質を生成する発酵様プロセスを通じて生成されるタンパク質が豊富な粉末又はスラリーである。タンパク質に加えて、前述の細胞増殖培地は、鉄、ビタミンB、他の関連する微量栄養素及び核酸を当然のことながらかなりの量で含み、これらはすべて増殖促進因子として機能する。
さらに、前述の細胞増殖培地は農業とは全く関係なく、肉を培養するための材料として使用することができる。
本開示の追加の態様、利点、特徴及び目的は、添付の特許請求の範囲と併せて解釈される図面及び例示的な実施形態の詳細な説明から明らかにされうる。
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲から逸脱することなく、様々な組み合わせで組み合わせることができることが理解されうる。
さらに、有益なことに、前述の細胞増殖培地は、生きた微生物が電気、空気、及び水を使用してタンパク質を生成する発酵様プロセスを通じて生成されるタンパク質が豊富な粉末又はスラリーである。タンパク質に加えて、前述の細胞増殖培地は、鉄、ビタミンB、他の関連する微量栄養素及び核酸を当然のことながらかなりの量で含み、これらはすべて増殖促進因子として機能する。
さらに、前述の細胞増殖培地は農業とは全く関係なく、肉を培養するための材料として使用することができる。
本開示の追加の態様、利点、特徴及び目的は、添付の特許請求の範囲と併せて解釈される図面及び例示的な実施形態の詳細な説明から明らかにされうる。
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲から逸脱することなく、様々な組み合わせで組み合わせることができることが理解されうる。
(図面の概要)
上記の概要、並びに例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解される。本開示を例示する目的で、本開示の例示的な構成が図面に示されている。しかしながら、本開示は、本明細書に開示される特定の方法及び手段に限定されない。更に、当業者は、図面が縮尺通りではないことを理解しうる。可能な限り、同様の要素は同じ番号で示されている。
上記の概要、並びに例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めばよりよく理解される。本開示を例示する目的で、本開示の例示的な構成が図面に示されている。しかしながら、本開示は、本明細書に開示される特定の方法及び手段に限定されない。更に、当業者は、図面が縮尺通りではないことを理解しうる。可能な限り、同様の要素は同じ番号で示されている。
添付図面において、下線が引かれた数字は、下線が引かれた数字が上に位置する項目、又は、下線が引かれた数字が隣接する項目を表すために用いられる。下線が引かれていない番号は、下線が引かれていない番号を項目に連結する線によって識別される項目に関する。番号に下線が引かれておらず、関連する矢印を伴う場合、下線が引かれていない番号は、矢印が指し示している一般的な項目を識別するために使用される。
以下の図を参照して、ここでは、本開示の実施形態を単なる例として説明する。
以下の詳細な説明は、本開示の実施形態及びそれらを行うことができる方法を示す。本開示を実施するいくつかの態様が開示されているが、当業者であれば、本開示を実施又は実行するための他の実施形態も可能であることを認識しうる。
一態様では、本開示の実施形態は、細胞増殖培地を製造する方法を提供し、この方法は、
- バイオマススラリーを得るために、ガス発酵により微生物細胞を培養することと、
- 固相から液相を分離及び除去することによって前記バイオマススラリーを濃縮することと、
- 前記濃縮バイオマススラリーを高圧均質化により均質化し、前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解することと、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記均質化されたバイオマススラリーを処理することと、及び
- 前記処理されたバイオマススラリーを加熱すること、を含む方法である。
- バイオマススラリーを得るために、ガス発酵により微生物細胞を培養することと、
- 固相から液相を分離及び除去することによって前記バイオマススラリーを濃縮することと、
- 前記濃縮バイオマススラリーを高圧均質化により均質化し、前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解することと、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記均質化されたバイオマススラリーを処理することと、及び
- 前記処理されたバイオマススラリーを加熱すること、を含む方法である。
別の態様では、本開示の実施形態は、細胞増殖培地を製造するためのシステムを提供し、このシステムは、
- バイオマススラリーを得るためにガス発酵により微生物細胞を培養するバイオリアクターと、
- 前記バイオマスの固相と液相を分離するための分離装置と、
- 前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解するために高圧均質化により前記バイオマススラリーを均質化するための均質化装置と、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記バイオマススラリーを処理するための反応チャンバーと、及び、
- 前記バイオマススラリーを加熱するためのインキュベーターと、を含むシステムである。
- バイオマススラリーを得るためにガス発酵により微生物細胞を培養するバイオリアクターと、
- 前記バイオマスの固相と液相を分離するための分離装置と、
- 前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解するために高圧均質化により前記バイオマススラリーを均質化するための均質化装置と、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記バイオマススラリーを処理するための反応チャンバーと、及び、
- 前記バイオマススラリーを加熱するためのインキュベーターと、を含むシステムである。
本開示は、前記の細胞増殖培地の製造方法を提供する。さらに、製造されるのは持続可能な細胞増殖培地であり、その製造は農業や畜産業から完全に切り離されている。前記細胞増殖培地は典型的には、独自の微生物が電気、空気、水を使用してタンパク質を増殖及び生産する発酵のようなプロセスを通じて生成される単細胞タンパク質粉末である。有益なことに、最終的な微生物バイオマスには、乾燥物中に60%を超えるタンパク質が含まれており、食品グレードのプロテアーゼを使用してペプチドに加水分解できる。
さらに、有益なことに、他の加水分解物、特に植物ベースの加水分解物と比較したときの前記細胞増殖培地の1つの利点は、その製造が高度に制御されており、各加水分解ステップ中に同じペプチド及びアミノ酸を製造するように自動化できることである。さらに、前記細胞増殖培地は、鉄、ビタミンB、及び他の関連する微量栄養素及び核酸を天然に相当量含み、これらはすべて増殖促進因子として機能する。
さらに、有益なことに、他の加水分解物、特に植物ベースの加水分解物と比較したときの前記細胞増殖培地の1つの利点は、その製造が高度に制御されており、各加水分解ステップ中に同じペプチド及びアミノ酸を製造するように自動化できることである。さらに、前記細胞増殖培地は、鉄、ビタミンB、及び他の関連する微量栄養素及び核酸を天然に相当量含み、これらはすべて増殖促進因子として機能する。
前述の方法から得られる細胞増殖培地は、動物を屠殺した後に得られる標準的な動物由来の血清(ウシ胎児血清など)に代わる、より持続可能で、より健康的で、動物実験のない代替品であることが理解されうる。さらに、そのような細胞増殖培地は、ベジタリアン又はヴィーガンとして認識される消費者の幅広い層による使用に適している可能性がある。さらに、前記細胞増殖培地の製造プロセスは、環境中に大量の二酸化炭素を放出する動物由来の血清の製造と比較して、地球温暖化の影響にほとんど寄与しない。
本開示全体を通じて、本書で使用される「細胞増殖培地」という用語は、細胞増殖に必須のいくつかの栄養素及び増殖因子の供給源として規定されたレシピを指す。任意に、細胞増殖培地を細胞培養培地の成分として添加することもできる。
具体的には、細胞増殖培地は微生物バイオマス由来の単細胞タンパク質粉末である。有益なことに、細胞増殖培地は動物も植物も含まない製品である。さらに、有益なことに、微生物細胞増殖培地は、ほぼすべての種類の細胞培養に適している。
増殖培地には通常、様々なアミノ酸、ビタミン、無機ミネラル、脂質、核酸誘導体、ホルモン(インスリン、副腎皮質ホルモン、ステロイドなど)、増殖因子(上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子など)、細胞接着因子(ラミニン、フィブロネクチンなど)、塩、炭水化物、抗生物質など、が含まれる。
具体的には、細胞増殖培地は微生物バイオマス由来の単細胞タンパク質粉末である。有益なことに、細胞増殖培地は動物も植物も含まない製品である。さらに、有益なことに、微生物細胞増殖培地は、ほぼすべての種類の細胞培養に適している。
増殖培地には通常、様々なアミノ酸、ビタミン、無機ミネラル、脂質、核酸誘導体、ホルモン(インスリン、副腎皮質ホルモン、ステロイドなど)、増殖因子(上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子など)、細胞接着因子(ラミニン、フィブロネクチンなど)、塩、炭水化物、抗生物質など、が含まれる。
任意に、微生物細胞は、単離された細菌株VTT-E-193585又はその誘導体を含む。前記単離された細菌株又はその誘導体は、典型的にはグラム陰性細菌(グラム染色法で使用されるクリスタルバイオレット染色を保持しない)である。前記単離された細菌株又はその誘導体は遺伝的に安定であり、最適な条件からストレスの多い条件に及ぶ広範囲のプロセス条件で経時的に増殖できることが理解されうる。
本書で使用する「遺伝的に安定」という用語は、変化に抵抗し、複数世代又は細胞分裂にわたって、理想的には数百から数千にわたってその遺伝子型を維持する種又は株/単離物の特性を指す。任意に、前記単離細菌株又はその誘導体は、エネルギー源として水素ガスを利用し、炭素源として二酸化炭素を利用する。
有益なことに、前記細菌株又はその誘導体は、タンパク質、鉄及びビタミンB12を含む。本方法において、単離された細菌株VTT-E-193585又はその誘導体を含む微生物細胞を使用すると、タンパク質、鉄及びビタミンB12が豊富な細胞増殖培地を得ることができ、したがって、動物タンパク質生産用細胞増殖培地への前記成分添加のためのさらなる処理は必要ない。
本書で使用する「遺伝的に安定」という用語は、変化に抵抗し、複数世代又は細胞分裂にわたって、理想的には数百から数千にわたってその遺伝子型を維持する種又は株/単離物の特性を指す。任意に、前記単離細菌株又はその誘導体は、エネルギー源として水素ガスを利用し、炭素源として二酸化炭素を利用する。
有益なことに、前記細菌株又はその誘導体は、タンパク質、鉄及びビタミンB12を含む。本方法において、単離された細菌株VTT-E-193585又はその誘導体を含む微生物細胞を使用すると、タンパク質、鉄及びビタミンB12が豊富な細胞増殖培地を得ることができ、したがって、動物タンパク質生産用細胞増殖培地への前記成分添加のためのさらなる処理は必要ない。
この方法は、バイオマススラリーを得るために、ガス発酵によって微生物細胞を培養することを含む。微生物細胞は通常、バイオリアクターと呼ばれる特別な容器で培養される。任意に、少量の微生物細胞(つまり、接種材料)をストック溶液からバイオリアクターにロードし、制御された条件で培養する。
バイオリアクターには通常、微生物細胞の増殖に適した空気、水、栄養素、増殖補助剤、光、最適な温度条件などが供給される。
これに関して、微生物細胞は、細胞増殖培地中の1以上の栄養素及び増殖補助剤を炭素源、窒素源、及びエネルギー源として使用して、高細胞密度バイオマスを製造する。特に、バイオリアクター以外に、当業者に知られている任意の従来のプロセスを通じて微生物細胞を増殖させることができる。
バイオリアクターには通常、微生物細胞の増殖に適した空気、水、栄養素、増殖補助剤、光、最適な温度条件などが供給される。
これに関して、微生物細胞は、細胞増殖培地中の1以上の栄養素及び増殖補助剤を炭素源、窒素源、及びエネルギー源として使用して、高細胞密度バイオマスを製造する。特に、バイオリアクター以外に、当業者に知られている任意の従来のプロセスを通じて微生物細胞を増殖させることができる。
本書で使用される「バイオマス」という用語は、サンプル中の生きている成分(すなわち、細菌)の量の尺度を指す。特に、バイオマスは典型的に、液相(水など)と混合された固相(すなわち細菌細胞)を含み、それによって粘稠なバイオマススラリーが得られる。任意に、バイオマススラリーの固相には、タンパク質、炭水化物、脂肪、ミネラル(カルシウム、鉄など)、ビタミン、繊維などが含まれてもよい。任意に、バイオマスは連続培養又はバッチ培養によって製造することもできる。
微生物は生殖時間が短いため、急速に増殖して高細胞密度バイオマスを製造し、その後、例えば食品成分粉末などの様々な用途のために収穫されることが理解されうる。
微生物は生殖時間が短いため、急速に増殖して高細胞密度バイオマスを製造し、その後、例えば食品成分粉末などの様々な用途のために収穫されることが理解されうる。
本書で使用される「ガス発酵」という用語は、微生物細胞がその増殖のためにエネルギー源及び炭素源として水素、二酸化炭素、及び一酸化炭素などのガスを利用するプロセスを指す。任意に、ガス発酵による培養のための供給物は、CO2、CH4、H2、O2、NH3、ミネラルから選択される少なくとも1つを含む。
さらに、NH3の添加は細菌細胞に窒素源を提供する。アンモニウム、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、バナジウム、鉄、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、モリブデン、マンガン、ホウ素、亜鉛、コバルト、セレン、ヨウ素、銅及び/又はニッケルを含有する鉱物などのミネラルの添加が細菌細胞の増殖を促進することは理解されうる。
任意に、前記ミネラルは、1g/L未満の塩化物塩、例えば、0.25g/L未満の塩化物塩、例えば、0.1g/L未満の塩化物塩を含むか、好ましくは塩化物塩を含まない。
さらに、NH3の添加は細菌細胞に窒素源を提供する。アンモニウム、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、バナジウム、鉄、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、モリブデン、マンガン、ホウ素、亜鉛、コバルト、セレン、ヨウ素、銅及び/又はニッケルを含有する鉱物などのミネラルの添加が細菌細胞の増殖を促進することは理解されうる。
任意に、前記ミネラルは、1g/L未満の塩化物塩、例えば、0.25g/L未満の塩化物塩、例えば、0.1g/L未満の塩化物塩を含むか、好ましくは塩化物塩を含まない。
さらに、固相から液相を分離除去することによりバイオマススラリーを濃縮する。バイオマススラリーを濃縮するということは、バイオマススラリーの固相から過剰な液相を除去することを意味することが理解されるであろう。特に、バイオマスの液相は、LPS含有エンドトキシンを含む細胞壁構造の加水分解成分を含む。
固相から液相を分離及び除去すると、エンドトキシンが減少した濃縮バイオマスが残る。任意に、分離は、濾過、遠心分離のうちの少なくとも1つから選択される分離方法を用いて実行される。
濾過技術は、典型的には、半透膜を通して液相と固相を分離し、半透膜上に固相を保持しながら液相を通過させる。遠心分離は、典型的には、粒子のサイズ、形状、密度、粘度、又は分離に使用されるローターの速度に応じて粒子を分離するための技術である。
遠心分離では通常、約90~95%の液相が固相から分離される。この段階で、バイオマスは液相の除去によって濃縮され、分離前の初期の乾燥物0.5~2%と比較して、乾燥物約5~30%を含む。
固相から液相を分離及び除去すると、エンドトキシンが減少した濃縮バイオマスが残る。任意に、分離は、濾過、遠心分離のうちの少なくとも1つから選択される分離方法を用いて実行される。
濾過技術は、典型的には、半透膜を通して液相と固相を分離し、半透膜上に固相を保持しながら液相を通過させる。遠心分離は、典型的には、粒子のサイズ、形状、密度、粘度、又は分離に使用されるローターの速度に応じて粒子を分離するための技術である。
遠心分離では通常、約90~95%の液相が固相から分離される。この段階で、バイオマスは液相の除去によって濃縮され、分離前の初期の乾燥物0.5~2%と比較して、乾燥物約5~30%を含む。
この方法は、濃縮された微生物バイオマススラリーを高圧均質化により均質化することをさらに含み、微生物細胞は少なくとも部分的に分解される。本書で使用される「均質化すること」という用語は、微生物の細胞壁を物理的に破壊する手段を指す。
典型的には、均質化技術は、流体の流れ、粒子間相互作用、圧力降下を利用して細胞の破壊を促進する。バイオマススラリーを熱処理とともにインキュベートすると細胞壁の外膜が部分的に破壊され、バイオマススラリーを均質化すると細胞壁がさらに破壊されることが理解されうる。
部分的な細胞壁の加水分解により、タンパク質が部分的に微生物細胞からバイオマスの残りの液相に放出される(すなわち、分離プロセス後)ことが理解されうる。
この段階では、均質化は、細胞内部からのタンパク質の放出を促進し、その結果、タンパク質は酵素加水分解により利用しやすくなる。
均質化によりタンパク質の放出が促進されるため、タンパク質はさらなる処理ステップで利用しやすくなる。たとえば、部分的な細胞溶解により細胞内部からタンパク質が放出され、次の段階で細胞内部が酵素加水分解に利用できるようになり、プロテアーゼによる処理がより効率的になる。さらに、均質化プロセス中にエンドトキシンがさらに除去され、エンドトキシン反応が10~1000倍低い最終製品が得られる。
典型的には、均質化技術は、流体の流れ、粒子間相互作用、圧力降下を利用して細胞の破壊を促進する。バイオマススラリーを熱処理とともにインキュベートすると細胞壁の外膜が部分的に破壊され、バイオマススラリーを均質化すると細胞壁がさらに破壊されることが理解されうる。
部分的な細胞壁の加水分解により、タンパク質が部分的に微生物細胞からバイオマスの残りの液相に放出される(すなわち、分離プロセス後)ことが理解されうる。
この段階では、均質化は、細胞内部からのタンパク質の放出を促進し、その結果、タンパク質は酵素加水分解により利用しやすくなる。
均質化によりタンパク質の放出が促進されるため、タンパク質はさらなる処理ステップで利用しやすくなる。たとえば、部分的な細胞溶解により細胞内部からタンパク質が放出され、次の段階で細胞内部が酵素加水分解に利用できるようになり、プロテアーゼによる処理がより効率的になる。さらに、均質化プロセス中にエンドトキシンがさらに除去され、エンドトキシン反応が10~1000倍低い最終製品が得られる。
微生物の細胞壁を破壊するために最も一般的に使用される技術は、高圧ホモジナイズ(HPH)を含む。
本書で使用される「高圧均質化」という用語は、固相及び液相(分離プロセス後に残る)を含むバイオマスなどのサンプルの流れをシステムに強制的に通させる物理的又は機械的プロセスを指し、高圧や剪断力の任意の組み合わせなどのサンプルに複数の力を加える均質化装置(詳細は後述)として実装され、これは、サンプルを均質化したり、サンプル内の成分の粒径を小さくしたりすることを目的としている。
本書で使用される「高圧均質化」という用語は、固相及び液相(分離プロセス後に残る)を含むバイオマスなどのサンプルの流れをシステムに強制的に通させる物理的又は機械的プロセスを指し、高圧や剪断力の任意の組み合わせなどのサンプルに複数の力を加える均質化装置(詳細は後述)として実装され、これは、サンプルを均質化したり、サンプル内の成分の粒径を小さくしたりすることを目的としている。
任意に、高圧均質化は、900バールから2000バールまでの圧力で実行される。任意に、均質化圧力は、通常、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800又は1900バールから、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900又は2000バールまでであってもよい。
任意に、高圧均質化は、所望の均質化をもたらすために、1回、2回、又は3回実行される。有益なことに、均質化プロセスにより細胞が部分的に溶解され、バイオマスの可溶性タンパク質含量が増加する。
任意に、高圧均質化は、所望の均質化をもたらすために、1回、2回、又は3回実行される。有益なことに、均質化プロセスにより細胞が部分的に溶解され、バイオマスの可溶性タンパク質含量が増加する。
均質化されたバイオマススラリーは、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって処理される。本書で使用される「処理」という用語は、特に濃縮バイオマススラリーの酵素処理を指し、より具体的には酵素加水分解を指す。
酵素的加水分解は、水を添加することによって酵素がより大きな分子(タンパク質分子など)の結合の切断を促進し、より小さなペプチドやアミノ酸を生成するプロセスを指す。
任意に、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによるバイオマススラリーの処理は、30℃から75℃までの温度で行われる。バイオマススラリーを処理するための温度は、典型的には、30、35、40、45、50、55、60、65又は70℃から35、40、45、50、55、60、65、70又は75℃までであり得る。
処理の酵素加水分解の継続時間は、0.5時間から最大16時間までありうる。この継続時間は、典型的には、0.5、1、2、3、5、10、又は15時間から、最大1、2、3、5、10、15、又は16時間までであってもよい。
一例では、バイオマススラリーは、pH7.0、温度50℃で1~12時間の範囲で処理される。
酵素的加水分解は、水を添加することによって酵素がより大きな分子(タンパク質分子など)の結合の切断を促進し、より小さなペプチドやアミノ酸を生成するプロセスを指す。
任意に、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによるバイオマススラリーの処理は、30℃から75℃までの温度で行われる。バイオマススラリーを処理するための温度は、典型的には、30、35、40、45、50、55、60、65又は70℃から35、40、45、50、55、60、65、70又は75℃までであり得る。
処理の酵素加水分解の継続時間は、0.5時間から最大16時間までありうる。この継続時間は、典型的には、0.5、1、2、3、5、10、又は15時間から、最大1、2、3、5、10、15、又は16時間までであってもよい。
一例では、バイオマススラリーは、pH7.0、温度50℃で1~12時間の範囲で処理される。
加水分解は通常、少なくとも1つのプロテアーゼを使用することによって達成される。任意に、少なくとも1つのプロテアーゼは食品グレードのプロテアーゼである。プロテアーゼは、典型的に水分子を使用してタンパク質分子内のペプチド結合を分解する。タンパク質分解的加水分解は、タンパク質の機能的(味、口当たりなど)及び構造的(溶解性、消化性、タンパク質分散性など)特性を大幅に改善することが理解されうる。有益なことに、バイオマススラリーのタンパク質分解加水分解は、ウシ初代骨格筋細胞に対するバイオマススラリーの成長促進特性を強化する。
任意に、少なくとも1つのプロテアーゼは、フレーバーザイム、アルカラーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、トリプシン、ペプシンのうちの少なくとも1つであるように選択される。アルカラーゼはエンドペプチダーゼであり、フレーバーザイムはエンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの混合物である。エンドペプチダーゼは通常、ポリペプチドの末端に位置する末端アミノ酸ではなく、ポリペプチド鎖内でポリペプチドを切断する。
未加工形態のバイオマススラリーは不溶性であるが、アルカラーゼ及びフレーバーザイムの両方による酵素加水分解により、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸を含むその水溶性画分が生成されることが理解されうる。
アルカラーゼ加水分解物(アルカラーゼを使用して得られるタンパク質加水分解物)とフレーバーザイム加水分解物(フレーバーザイムを使用して得られるタンパク質加水分解物)は両方とも細胞培養に有益である。アルカラーゼ加水分解物とフレーバーザイム加水分解物の両方を細胞培養物に補給すると、細胞生存率、細胞増殖、及び細胞数が改善される。
エンドペプチダーゼであるアルカラーゼは、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの混合物であるフレーバーザイムとは異なる分子量分布を持つ加水分解混合物を生成する。フレーバーザイムを使用して生成された加水分解物には、同じ原料のアルカラーゼ消化と比較して、小さなペプチドと遊離アミノ酸がより多く含まれている。
アルカラーゼを使用して生成された加水分解物には、より大きなペプチドがより多く含まれている。これら2つの酵素を組み合わせて使用すると、小さなペプチドの割合が高い加水分解物が生成された。アルカラーゼとフレーバーザイムの組み合わせを使用することにより、最高の収率と最低の平均分子量が達成された。
様々なプロテアーゼを使用できるが、フレーバーザイムとアルカラーゼを単独又は組み合わせて使用してタンパク質スラリーを加水分解すると、可溶性タンパク質、アミノ酸、及びペプチドの含有量がより多く含まれる材料が得られる。
アルカラーゼ及び/又はフレーバーザイムをウシ骨格筋細胞の増殖培地に添加すると、タンパク質スラリーの加水分解物により細胞生存率、細胞増殖及び細胞数がより効率的に改善された。
アルカラーゼとフレーバーザイムを共に組み合わせると、加水分解物の収率が向上し、分子量(MW)分布がより良好になるという相乗効果が示された。任意に、フレーバーザイム及びアルカラーゼを単独で又は組み合わせて使用することができる。
未加工形態のバイオマススラリーは不溶性であるが、アルカラーゼ及びフレーバーザイムの両方による酵素加水分解により、タンパク質、ペプチド及びアミノ酸を含むその水溶性画分が生成されることが理解されうる。
アルカラーゼ加水分解物(アルカラーゼを使用して得られるタンパク質加水分解物)とフレーバーザイム加水分解物(フレーバーザイムを使用して得られるタンパク質加水分解物)は両方とも細胞培養に有益である。アルカラーゼ加水分解物とフレーバーザイム加水分解物の両方を細胞培養物に補給すると、細胞生存率、細胞増殖、及び細胞数が改善される。
エンドペプチダーゼであるアルカラーゼは、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの混合物であるフレーバーザイムとは異なる分子量分布を持つ加水分解混合物を生成する。フレーバーザイムを使用して生成された加水分解物には、同じ原料のアルカラーゼ消化と比較して、小さなペプチドと遊離アミノ酸がより多く含まれている。
アルカラーゼを使用して生成された加水分解物には、より大きなペプチドがより多く含まれている。これら2つの酵素を組み合わせて使用すると、小さなペプチドの割合が高い加水分解物が生成された。アルカラーゼとフレーバーザイムの組み合わせを使用することにより、最高の収率と最低の平均分子量が達成された。
様々なプロテアーゼを使用できるが、フレーバーザイムとアルカラーゼを単独又は組み合わせて使用してタンパク質スラリーを加水分解すると、可溶性タンパク質、アミノ酸、及びペプチドの含有量がより多く含まれる材料が得られる。
アルカラーゼ及び/又はフレーバーザイムをウシ骨格筋細胞の増殖培地に添加すると、タンパク質スラリーの加水分解物により細胞生存率、細胞増殖及び細胞数がより効率的に改善された。
アルカラーゼとフレーバーザイムを共に組み合わせると、加水分解物の収率が向上し、分子量(MW)分布がより良好になるという相乗効果が示された。任意に、フレーバーザイム及びアルカラーゼを単独で又は組み合わせて使用することができる。
さらに、ニュートラーゼは広域スペクトルのエンドペプチダーゼであり、穏やかな加水分解を行う。任意に、優れた風味の利点を得るために、ニュートラーゼを単独で又はエキソペプチダーゼと組み合わせて使用できる。
パパインはエキソペプチダーゼ活性とエンドペプチダーゼ活性の両方を示す。トリプシンはエンドペプチダーゼである。ペプシンは、通常、pH1.5~2.5の範囲で活性を持つ酸性エンドペプチダーゼである。
高圧均質化により微生物細胞が少なくとも部分的に分解されるため、均質化ステップを行わない加水分解と比較した場合、細胞生存率、細胞増殖及び細胞数の増加が高く(大きく)なる。
パパインはエキソペプチダーゼ活性とエンドペプチダーゼ活性の両方を示す。トリプシンはエンドペプチダーゼである。ペプシンは、通常、pH1.5~2.5の範囲で活性を持つ酸性エンドペプチダーゼである。
高圧均質化により微生物細胞が少なくとも部分的に分解されるため、均質化ステップを行わない加水分解と比較した場合、細胞生存率、細胞増殖及び細胞数の増加が高く(大きく)なる。
細胞の培養中、血清を完全に除去することは細胞にとって劇的で過酷な条件であることが理解されうる。ただし、加水分解物(動物ベース又は植物ベース)の何れも、血清(つまりウシ胎児血清)の非存在下では細胞の増殖を完全に回復することはできない。
粗抽出物、つまり非加水分解のバイオマススラリーの最高濃度0.01mg/ml、及びフレーバーザイム及び/又はアルカラーゼを使用したタンパク質加水分解物の0.1mg/mlは、無血清のコントロールと比較して細胞増殖を2倍と大幅に向上させることができる。
さらに、高濃度のバイオマススラリー粗抽出物及びタンパク質加水分解物は、細胞培養において細菌感染を引き起こす可能性があることが理解されうる。したがって、細胞培養物に補充する場合は、バイオマススラリー粗抽出物とタンパク質加水分解物の濃度の決定は重要である。
粗抽出物、つまり非加水分解のバイオマススラリーの最高濃度0.01mg/ml、及びフレーバーザイム及び/又はアルカラーゼを使用したタンパク質加水分解物の0.1mg/mlは、無血清のコントロールと比較して細胞増殖を2倍と大幅に向上させることができる。
さらに、高濃度のバイオマススラリー粗抽出物及びタンパク質加水分解物は、細胞培養において細菌感染を引き起こす可能性があることが理解されうる。したがって、細胞培養物に補充する場合は、バイオマススラリー粗抽出物とタンパク質加水分解物の濃度の決定は重要である。
さらに、必要に応じて、この方法は、タンパク質加水分解物の分子量分布の分析、粗バイオマススラリー及び/又はタンパク質加水分解物の様々な濃度(通常は0.0001~0.1mg/mLの範囲)での細胞培養物中の血清の置換、及び、細胞毒性、細胞生存率、細胞増殖及び細胞形態の分析を含む。
フレーバーザイム及びアルカラーゼを単独又は組み合わせて使用するタンパク質加水分解により、多量の可溶性タンパク質、アミノ酸及びペプチド含量を有するタンパク質加水分解物(加水分解の生成物)が得られることが理解されうる。
ウシ骨格筋細胞の増殖培地に添加すると、タンパク質加水分解物は細胞生存率、細胞増殖、及び細胞数(濃度0.0001~0.1mg/mL)を改善した。
さらに、市販のプロテアーゼ(すなわち、アルカラーゼ及びフレーバーザイム)による酵素加水分解の分子量分布プロファイルからみて、フレーバーザイム加水分解産物はアルカラーゼ加水分解産物よりも低い分子量を有していた。なお、前記分子量プロファイルは、酵素の様々な作用機序と一致している。
フレーバーザイム及びアルカラーゼを単独又は組み合わせて使用するタンパク質加水分解により、多量の可溶性タンパク質、アミノ酸及びペプチド含量を有するタンパク質加水分解物(加水分解の生成物)が得られることが理解されうる。
ウシ骨格筋細胞の増殖培地に添加すると、タンパク質加水分解物は細胞生存率、細胞増殖、及び細胞数(濃度0.0001~0.1mg/mL)を改善した。
さらに、市販のプロテアーゼ(すなわち、アルカラーゼ及びフレーバーザイム)による酵素加水分解の分子量分布プロファイルからみて、フレーバーザイム加水分解産物はアルカラーゼ加水分解産物よりも低い分子量を有していた。なお、前記分子量プロファイルは、酵素の様々な作用機序と一致している。
任意に、この方法は、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによってバイオマススラリーを処理する前に、バイオマススラリーのpHを4.0から10までに調整することをさらに含む。バイオマススラリーのpHは、4、5、6、7、8又は9から最大で5、6、7、8、9、又は10までの範囲にすることができる。この点に関して、従来のpH調整剤(酸又は塩基)をバイオマススラリーに添加してpHを調整することができる。
バイオマススラリーの最適pHは、バイオマススラリーを処理するための少なくとも1つのプロテアーゼの活性を維持するのに役立つことが理解されるであろう。
バイオマススラリーの最適pHは、バイオマススラリーを処理するための少なくとも1つのプロテアーゼの活性を維持するのに役立つことが理解されるであろう。
さらに、この方法は、処理されたバイオマススラリーを加熱することを含む。処理されたバイオマススラリーは、バイオマススラリーの酵素不活化及び滅菌(又は低温殺菌)を可能にするために最適な温度で加熱される。加熱は、バイオマススラリー中のタンパク質及び他の所望の栄養素の活性化にとって安全な温度で行われることが理解されうる。
任意に、バイオマススラリーの加熱は、80℃から130℃までの温度で実行される。加熱温度は、典型的には、80、90、100又は110℃から90、100、110、120又は130℃までであり得る。
加熱時間は0.5分から最大60分までが可能である。加熱時間は典型的には、0.5、1、2、3、5、10、15、20、25、30又は45分から1、2、3、5、10、15、20、25、30、45又は60分までであり得る。特に、前記加熱温度は細菌性病原体を死滅させるのに十分である。
任意に、バイオマススラリーの加熱は、80℃から130℃までの温度で実行される。加熱温度は、典型的には、80、90、100又は110℃から90、100、110、120又は130℃までであり得る。
加熱時間は0.5分から最大60分までが可能である。加熱時間は典型的には、0.5、1、2、3、5、10、15、20、25、30又は45分から1、2、3、5、10、15、20、25、30、45又は60分までであり得る。特に、前記加熱温度は細菌性病原体を死滅させるのに十分である。
任意に、この方法は、加熱されたバイオマススラリーから不溶性成分を分離及び除去することをさらに含む。分離の目的は、加熱されたバイオマススラリーの可溶成分から不溶成分を除去することである。可溶性成分には、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン及びミネラルが含まれ得る。不溶性成分には、例えば細胞破片が含まれ得る。分離は、例えば、遠心分離、膜濾過により行うことができる。遠心分離による上清と濾過による透過液には可溶性成分が含まれており、増殖培地として使用できる。
任意に、この方法は、培養されたバイオマススラリーを熱処理しながらインキュベートすることをさらに含む。本書で使用される「インキュベートすること」という用語は、選択された温度で選択された時間行われる熱処理を指す。培養バイオマススラリーをインキュベートすることは、リポ多糖や核酸などの潜在的な抗栄養素の量を減少させる。さらに、加熱処理をしながらインキュベートすることで微生物細胞の細胞壁が部分的に加水分解される。
さらに、細胞壁の外膜の部分的な加水分解は、細胞内部へのアクセスを容易にし、細胞壁とともにエンドトキシンの部分的な除去をもたらす。
任意に、培養バイオマススラリーの熱処理を伴うインキュベートは、55℃から80℃までの範囲の温度で10分間から60分間行われる。インキュベーション中の温度は、例えば、55、56、57、58、59、60、65、70又は75℃から56、57、58、59、60、65、70、75又は80℃までであり得る。
インキュベーション時間は、例えば、10、15、20、25、30、35又は40分から20、25、30、35、40、55又は60分までであり得る。
さらに、細胞壁の外膜の部分的な加水分解は、細胞内部へのアクセスを容易にし、細胞壁とともにエンドトキシンの部分的な除去をもたらす。
任意に、培養バイオマススラリーの熱処理を伴うインキュベートは、55℃から80℃までの範囲の温度で10分間から60分間行われる。インキュベーション中の温度は、例えば、55、56、57、58、59、60、65、70又は75℃から56、57、58、59、60、65、70、75又は80℃までであり得る。
インキュベーション時間は、例えば、10、15、20、25、30、35又は40分から20、25、30、35、40、55又は60分までであり得る。
任意に、この方法は、噴霧乾燥によって加熱されたバイオマススラリーを乾燥させることをさらに含む。本書において「乾燥」という用語は、バイオマススラリーなどの原料から液体を乾燥させる工程を指す。噴霧乾燥プロセスは、高温ガス(窒素や酸素など)の噴霧を利用してバイオマスを急速に乾燥する。噴霧乾燥は、食品や医薬品などの熱に敏感なサンプルの乾燥に適している。
乾燥バイオマスは、インキュベーション、分離及び/又は均質化がされていないサンプルと比較して、インキュベーション、分離及び均質化ステップ後において含まれるエンドトキシンのレベルが低下している。あるいは、乾燥は、例えば乾燥ドラムなどの閉鎖システム内でバイオマスを回転させながら比較的低温を使用することによって達成することもできる。
乾燥バイオマスは、インキュベーション、分離及び/又は均質化がされていないサンプルと比較して、インキュベーション、分離及び均質化ステップ後において含まれるエンドトキシンのレベルが低下している。あるいは、乾燥は、例えば乾燥ドラムなどの閉鎖システム内でバイオマスを回転させながら比較的低温を使用することによって達成することもできる。
バイオマススラリーを乾燥させることにより、それに由来する乾燥バイオマスの容易かつ効果的な貯蔵及び輸送が可能になることが理解されうる。さらに、バイオマススラリーを乾燥させることにより、乾燥したバイオマスの潜在的な感染を防ぎ、それによってヒトや動物による消費に適さなくなることを防ぐ。
任意に、この方法は、濃縮バイオマススラリーを乾燥させてタンパク質粉末を得るステップをさらに含む。乾燥は、例えばドラム乾燥又は噴霧乾燥によって行うことができる。上述のとおり、乾燥バイオマス又はバイオマス粉末は、例えば細胞培養などのさらなる用途のために保管又は輸送することができる。ただし、プロテインパウダーの用途によっては、タンパク質粉末をさらに水と混合する必要がある場合もある。
これに関して、均質な混合物が得られるまで、5~20重量%のタンパク質粉末を80~95重量%の滅菌水に混合する。任意に、タンパク質粉末は、高剪断混合を使用して水と混合される。高剪断混合により、混合物中の塊が完全に水和され、粉砕されることが保証されることが理解されうる。
これに関して、均質な混合物が得られるまで、5~20重量%のタンパク質粉末を80~95重量%の滅菌水に混合する。任意に、タンパク質粉末は、高剪断混合を使用して水と混合される。高剪断混合により、混合物中の塊が完全に水和され、粉砕されることが保証されることが理解されうる。
加熱又は乾燥したバイオマススラリーとして得られる開示された細胞増殖培地の潜在的な用途は、細胞培養肉の製造である。一実施形態では、細胞増殖培地は、乾燥ステップの前(又はタンパク質粉末の生成前)に収集されたバイオマススラリーとして(すなわち、液体流として)使用され得る。
この場合、バイオマススラリーはこの段階で加水分解酵素にさらされる。得られた加水分解物を不溶性成分(細胞破片など)から分離し、可溶性成分(タンパク質加水分解物、ビタミン、ミネラルなど)を含む液体を乾燥し、溶解性を保った粉末として細胞培養肉製造会社に提供(販売用途など)される。
この場合、バイオマススラリーはこの段階で加水分解酵素にさらされる。得られた加水分解物を不溶性成分(細胞破片など)から分離し、可溶性成分(タンパク質加水分解物、ビタミン、ミネラルなど)を含む液体を乾燥し、溶解性を保った粉末として細胞培養肉製造会社に提供(販売用途など)される。
別の実施形態では、細胞増殖培地をタンパク質粉末として使用し、細胞培養肉製造会社に提供することができる。この場合、タンパク質粉末を水と混合して分散体のバイオマススラリーを形成する。
これに関して、均質な混合物が得られるまで、5~20重量%のタンパク質粉末を80~95重量%の滅菌水と混合する。
バイオマススラリーはプロテアーゼによって処理され、可溶性成分が不溶性成分から分離され、細胞培養における細胞増殖培地として使用される。しかしながら、タンパク質粉末と水を混合することによって得られるバイオマススラリーは効果的に加水分解されない可能性があり、それによって加水分解収率が低下する。
これに関して、均質な混合物が得られるまで、5~20重量%のタンパク質粉末を80~95重量%の滅菌水と混合する。
バイオマススラリーはプロテアーゼによって処理され、可溶性成分が不溶性成分から分離され、細胞培養における細胞増殖培地として使用される。しかしながら、タンパク質粉末と水を混合することによって得られるバイオマススラリーは効果的に加水分解されない可能性があり、それによって加水分解収率が低下する。
さらに別の実施形態では、細胞増殖培地製造会社と細胞培養肉製造会社が1つの場所に共存することができ、加水分解バイオマススラリーを連続プロセスで細胞培養肉製造に直接供給することができる。タンパク質粉末は細胞増殖培地として使用する前に水和する必要があるため、ある場所でこのように2つの生産者が共存すると、乾燥ステップが1つ省かれうることが理解されうる。
本開示は、上述のシステムにも関連する。上に開示した様々な実施形態及び変形例は、必要な変更を加えてシステムに適用される。
バイオマススラリーの液相と固相の分離は、工業規模で広く使用されている遠心分離機や膜濾過装置などの分離装置で実行できる。遠心分離機は典型的には、溶液中の成分を粒子サイズに基づいて分離するために遠心分離技術を使用する。膜濾過ユニットは、半透膜を利用して溶液の固相と液相を分離する濾過技術に基づいて動作する。遠心分離機は濾過と比較して細菌細胞を濃縮するのに好ましいことが理解されるであろう。
バイオマススラリーの液相と固相の分離は、工業規模で広く使用されている遠心分離機や膜濾過装置などの分離装置で実行できる。遠心分離機は典型的には、溶液中の成分を粒子サイズに基づいて分離するために遠心分離技術を使用する。膜濾過ユニットは、半透膜を利用して溶液の固相と液相を分離する濾過技術に基づいて動作する。遠心分離機は濾過と比較して細菌細胞を濃縮するのに好ましいことが理解されるであろう。
反応チャンバーは、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって処理するための一定量のバイオマススラリーを保持するための特別な容器である。反応チャンバーは、バイオマススラリーの供給物及び少なくとも1つのプロテアーゼの供給物を連続的に又はバッチで受け取ることができることが理解されうる。任意に、反応チャンバーは、バイオマススラリーの酵素加水分解から生じる条件に耐えるように設計される。
インキュベーターは、バイオマススラリーを加熱するための容器である。特に、インキュベーターの温度は、バイオマススラリーの成分、つまり細胞、酵素などに応じて調整される。インキュベーターでは、温度に加えて、湿度や空気など、細胞の成長に最適なレベルの他の最適条件も調整できる。
任意に、インキュベーターの一例はウォーターバスである。ウォーターバスを使用すると、バイオマススラリーと熱との直接接触を避けながら確実に加熱できることが理解されうる。任意に、インキュベーター内の温度は80℃から120℃までである。
任意に、インキュベーターの一例はウォーターバスである。ウォーターバスを使用すると、バイオマススラリーと熱との直接接触を避けながら確実に加熱できることが理解されうる。任意に、インキュベーター内の温度は80℃から120℃までである。
このシステムは、微生物細胞を少なくとも部分的に分解するために高圧均質化によりバイオマススラリーを均質化するための均質化装置をさらに含む。均質化装置は、物理的又は機械的な方法を使用して材料を破壊又は均質化する。
典型的には、使用される均質化装置には、乳鉢と乳棒、ブレンダー、ビーズミル、超音波処理装置、ローターステーターなどが含まれる。高圧均質化(HPH)は、細胞破砕効率を高めるために均質化装置を少なくとも1回、例えば1回、2回、又は3回、通過させることを含む。任意に、均質化装置は高圧ホモジナイザーであり、高圧ホモジナイザー内の圧力は900バールから2000バールまでである。高圧ホモジナイザーは通常、セル構造を破壊するために非常に高い圧力を使用する。任意に、均質化装置は液体ミルである。液体ミルは典型的にせん断力を使用してセル構造を破壊する。
典型的には、使用される均質化装置には、乳鉢と乳棒、ブレンダー、ビーズミル、超音波処理装置、ローターステーターなどが含まれる。高圧均質化(HPH)は、細胞破砕効率を高めるために均質化装置を少なくとも1回、例えば1回、2回、又は3回、通過させることを含む。任意に、均質化装置は高圧ホモジナイザーであり、高圧ホモジナイザー内の圧力は900バールから2000バールまでである。高圧ホモジナイザーは通常、セル構造を破壊するために非常に高い圧力を使用する。任意に、均質化装置は液体ミルである。液体ミルは典型的にせん断力を使用してセル構造を破壊する。
任意に、このシステムは、バイオマススラリーをインキュベートするための熱交換器をさらに備える。熱交換器は、2つ以上の流体間で熱を伝達するために使用されるシステムである。この点に関して、熱交換器は、熱交換流体がそれぞれ互いに平行に、又は互いに反対方向に移動するように、平行流又は対向流の流れ配置を有してもよい。通常、熱交換器は工業規模で広く使用されており、当業者にはよく知られている。任意に、熱交換器は、タンク熱交換器、管状熱交換器、又はプレート熱交換器のうちの少なくとも1つであるように選択される。
任意に、このシステムは、微生物バイオマススラリーを乾燥するための乾燥機をさらに備える。噴霧乾燥機は、高温ガスを使用してスラリー材料を迅速に乾燥させることができる。噴霧乾燥は通常、熱に弱い材料に適している。
任意に、噴霧乾燥生成物をさらに粉砕するか、又はフレーク又は粉末の形態に仕上げることができる。
あるいは、場合により、乾燥機はドラム乾燥機である。ドラム乾燥機は、バイオマスなどのスラリー材料を収容し、その中の材料を比較的低温で回転させてドラム乾燥製品のシートを製造するように構成された回転式の大容量容器である。
任意に、噴霧乾燥生成物をさらに粉砕するか、又はフレーク又は粉末の形態に仕上げることができる。
あるいは、場合により、乾燥機はドラム乾燥機である。ドラム乾燥機は、バイオマスなどのスラリー材料を収容し、その中の材料を比較的低温で回転させてドラム乾燥製品のシートを製造するように構成された回転式の大容量容器である。
任意に、少なくとも1つのプロテアーゼは、フレーバーザイム、アルカラーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、トリプシン、ペプシンのうちの少なくとも1つであるように選択される。
任意に、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによってバイオマススラリーを処理するための反応チャンバー内の温度は、30℃から75℃までである。
任意に、バイオリアクター内でのガス発酵のための供給物は、CO2、CH4、H2、O2、NH3から選択される少なくとも1つ、少なくとも1つのミネラルを含む。
任意に、システムは、単離された細菌株VTT-E-193585又はその誘導体を含む微生物細胞をさらに含む。
細胞増殖培地は、本開示のステップに従って調製された(図2)。分析により、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)で測定した細胞増殖培地の最高の収率(重量による)と最低の平均分子量は、アルカラーゼとフレーバーザイムの組み合わせを使用することによって得られることが実証された(表1)。フレーバーザイム単独では収率が最も低かった。
(図面の詳細な説明)
図1を参照すると、本開示の一実施形態による、細胞増殖培地を生成する方法のステップを示すフローチャート100が示されている。ステップ102では、ガス発酵により微生物細胞を培養してバイオマススラリーを得る。ステップ104では、固相から液相を分離し除去することによってバイオマススラリーを濃縮する。ステップ106では、バイオマススラリーは、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって処理される。ステップ107では、バイオマススラリーは高圧均質化により均質化される。ステップ108では、バイオマススラリーが加熱される。
ステップ102、104、106、及び108は単なる例示であり、本発明の範囲から逸脱することなく、1つ又は複数のステップが追加されるか、1つ又は複数のステップが削除されるか、又は1つ又は複数のステップが異なる順序で提供される他の代替案も提供することができる。
図1を参照すると、本開示の一実施形態による、細胞増殖培地を生成する方法のステップを示すフローチャート100が示されている。ステップ102では、ガス発酵により微生物細胞を培養してバイオマススラリーを得る。ステップ104では、固相から液相を分離し除去することによってバイオマススラリーを濃縮する。ステップ106では、バイオマススラリーは、少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって処理される。ステップ107では、バイオマススラリーは高圧均質化により均質化される。ステップ108では、バイオマススラリーが加熱される。
ステップ102、104、106、及び108は単なる例示であり、本発明の範囲から逸脱することなく、1つ又は複数のステップが追加されるか、1つ又は複数のステップが削除されるか、又は1つ又は複数のステップが異なる順序で提供される他の代替案も提供することができる。
図2を参照すると、本開示の異なる実施形態による細胞増殖培地製造ライン200のブロック図が示されている。図示されるように、細胞増殖培地生産ライン200はプロセスAから始まり、微生物細胞の接種物が、細胞培養培地及び増殖に最適な条件を使用してバイオリアクター培養202に供され、バイオマススラリー(固相及び液相208を含む)を形成する。
培養されたバイオマスは、熱処理によるインキュベーション204を受ける。インキュベートされたバイオマスは、バイオマススラリーの固相から液相208を分離すること206によって濃縮されて、濃縮バイオマス210が得られる。濃縮バイオマスは、高圧均質化212に付され、続いて乾燥214されて、タンパク質粉末216が得られる。
この段階では、プロセスBに示すように、タンパク質粉末216は再水和226を受け、続いてプロセスCに示すようにタンパク質加水分解220を受ける。
培養されたバイオマスは、熱処理によるインキュベーション204を受ける。インキュベートされたバイオマスは、バイオマススラリーの固相から液相208を分離すること206によって濃縮されて、濃縮バイオマス210が得られる。濃縮バイオマスは、高圧均質化212に付され、続いて乾燥214されて、タンパク質粉末216が得られる。
この段階では、プロセスBに示すように、タンパク質粉末216は再水和226を受け、続いてプロセスCに示すようにタンパク質加水分解220を受ける。
プロセスCに示すように、タンパク質加水分解220は、高圧均質化212から得られた均質化バイオマススラリーに対して、あるいは濃縮バイオマスから直接行われる。加水分解されたタンパク質は滅菌又は低温殺菌222を受け、滅菌又は低温殺菌された加水分解物が得られる。
滅菌又は低温殺菌222の後に分離224が続き、可溶性成分(タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、ミネラルなど)が不溶性成分(細胞残骸など)から分離され、不溶性成分226が除去されて、細胞増殖培地としての加水分解製品が、同じ場所にある細胞培養肉製造者230に提供される。
プロセスBの代替ステップは、滅菌又は低温殺菌された加水分解物を乾燥させ228、乾燥形態の細胞増殖培地を得ることであり、これは、同じ場所に設置された、又は細胞増殖培地製造ライン200から離れて設置された細胞培養肉製造者230に提供される。
滅菌又は低温殺菌222の後に分離224が続き、可溶性成分(タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ビタミン、ミネラルなど)が不溶性成分(細胞残骸など)から分離され、不溶性成分226が除去されて、細胞増殖培地としての加水分解製品が、同じ場所にある細胞培養肉製造者230に提供される。
プロセスBの代替ステップは、滅菌又は低温殺菌された加水分解物を乾燥させ228、乾燥形態の細胞増殖培地を得ることであり、これは、同じ場所に設置された、又は細胞増殖培地製造ライン200から離れて設置された細胞培養肉製造者230に提供される。
図3では、ウシ初代骨格筋細胞を、粗製バイオマススラリー、アルカラーゼ及びフレーバーザイム加水分解物を添加して96時間培養した。グラフは細胞の代謝活性(アデノシン三リン酸量)を発光(ルミネッセンス)で示したものである。データは平均値±SEM(n=3 独立した細胞試験を三重に播種)を表す。
(アスタリスクは有意差を示す。*<0.05、**<0.01、***<0.001、****p<0.0001。略語:n.s.-有意差なし)。
(アスタリスクは有意差を示す。*<0.05、**<0.01、***<0.001、****p<0.0001。略語:n.s.-有意差なし)。
図4では、ウシ初代骨格筋細胞を粗製バイオマススラリー、アルカラーゼ又はフレーバーザイム加水分解物を添加して96時間培養し、細胞のDNA含有量を分析した。グラフは、標準(ctr)細胞に対して正規化されたDNAを示す。データは平均値±SEMを表す(アスタリスクは有意差を示す。*<0.05、**<0.01、***<0.001、****p<0.0001。略語:n.s.-有意差なし)。
本特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲から逸脱することなく、上記で説明された本開示の実施形態に対する修正が可能である。本開示を記載及び特許請求するために使用される「含む(including)」、「備える(comprising)」、「組み込む(incorporating)」、「有する(have)」、「である(is)」等の表現は、非排他的な方法で解釈されること、すなわち、明示的に記載されていない項目、成分又は要素も存在することを可能にすることを意図している。単数形への言及はまた、複数形に関連すると解釈されるべきである。
Claims (20)
- 細胞増殖培地の製造方法であって、
- バイオマススラリーを得るために、ガス発酵により微生物細胞を培養することと、
- 固相から液相を分離及び除去することによって前記バイオマススラリーを濃縮することと、
- 前記濃縮バイオマススラリーを高圧均質化により均質化し、前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解することと、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記均質化されたバイオマススラリーを処理することと、及び
- 前記処理されたバイオマススラリーを加熱すること、を含む方法。 - 前記加熱されたバイオマススラリーから不溶成分を分離すること、及び、除去することを、さらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記培養されたバイオマススラリーを熱処理しながらインキュベートすることをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記加熱されたバイオマススラリーを乾燥することを、さらに含む請求項1~3の何れか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのプロテアーゼが、フレーバーザイム、アルカラーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、トリプシン、ペプシンのうちの少なくとも1つであるように選択される、請求項1~4の何れか一項に記載の方法。
- 前記バイオマススラリーの加熱が、80℃から130℃までの温度で行われる、請求項1~5の何れか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによってバイオマススラリーを処理する前に、バイオマススラリーのpHを4.0から10までに調整することをさらに含む、請求項1~6の何れか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによるバイオマススラリーの処理が、30℃から75℃までの温度で行われる、請求項1~7の何れか一項に記載の方法。
- 前記方法であって、さらに、
- タンパク質粉末を得るために前記濃縮されたバイオマススラリーを乾燥させることと、
- バイオマススラリーを得るために、前記乾燥されたタンパク質粉末を水と混合することと、を含む請求項1~8の何れか一項に記載の方法。 - ガス発酵による培養のための供給物が、CO2、CH4、H2、O2、NH3、ミネラルから選択される少なくとも1つを含む、請求項1~9の何れか一項に記載の方法。
- 前記微生物細胞が、単離された細菌株VTT-E-193585又はその誘導体を含む、請求項1~10の何れか一項に記載の方法。
- 細胞増殖培地を生産するためのシステムであって、
- バイオマススラリーを得るためにガス発酵により微生物細胞を培養するバイオリアクターと、
- 前記バイオマスの固相と液相を分離するための分離装置と、
- 前記微生物細胞を少なくとも部分的に分解するために高圧均質化により前記バイオマススラリーを均質化するための均質化装置と、
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記バイオマススラリーを処理するための反応チャンバーと、及び、
- 前記バイオマススラリーを加熱するためのインキュベーターと、を含むシステム。 - 前記加熱されたバイオマススラリーから不溶成分を分離するための分離装置をさらに含む請求項12に記載のシステム。
- 前記バイオマススラリーをインキュベートするための熱交換器をさらに含む請求項12又は13に記載のシステム。
- 前記加熱されたバイオマススラリーを乾燥するための噴霧乾燥機をさらに含む請求項12~14の何れか一項に記載のシステム。
- 前記少なくとも1つのプロテアーゼは、フレーバーザイム、アルカラーゼ、ニュートラーゼ、パパイン、トリプシン、ペプシンのうちの少なくとも1つであるように選択される請求項12~15の何れか一項に記載のシステム。
- 少なくとも1つのプロテアーゼを添加することによって前記バイオマススラリーを処理するための前記反応チャンバー内の温度が30℃~75℃である、請求項12~16の何れか一項に記載のシステム。
- 前記バイオリアクターにおけるガス発酵のための供給物が、CO2、CH4、H2、O2、NH3から選択される少なくとも1つ、少なくとも1つのミネラルを含む、請求項12~17の何れか一項に記載のシステム。
- 前記微生物細胞が、単離された細菌株VTT-E-193585又はその誘導体を含む、請求項12~18の何れか一項に記載のシステム。
- 請求項1~11の何れかに記載の方法により得られる細胞増殖培地。
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