CN116368147A - 用于细胞培养生产肉类的生长因子组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白的生长因子组合物在培养细胞以生产细胞培养肉中的应用。本发明还涉及包括使用包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白的生长因子组合物来培养细胞以生产细胞培养肉的方法。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域,特别是通过细胞培养生产肉类或类肉食品的新兴领域。
背景技术
培养肉生产是一种新兴的创新技术,利用组织工程从培养的组织生产动物肉,而不是传统的饲养以供屠宰的农场动物。这种方法涉及培养动物细胞,使其成长为肌肉组织和脂肪细胞。通过这项技术,可以获得富含蛋白质的食品,其在物质和营养方面与传统的肉类和鱼类食品相当。该技术被认为是一个有望减少对传统农场动物饲养的需求的机会,在传统农场动物饲养中,除了明显的动物福利问题外,还非常依赖于资源,因为用于种植饲料作物的水和土地使用量不断增加。该技术还将减少传统肉类生产的许多消极后果,包括温室气体排放、森林砍伐、污染和抗生素抗性。
由于人们对肉类生产的生态足迹的认识不断提高,对动物福利的关注不断增加,提出了用“实验室培养肉”(该术语也称为“体外培养肉”、“清洁肉”或“细胞培养肉”(CCM))取代或减少传统肉类消费的最先进的解决方案。研究界的一个共识是,使用再生医学和组织工程中已经建立的方法在实验室中培养肉,是创造CCM的一个有前途的方法。
估计在2040年,全球肉类消费中将有多达35%都是CCM。这一趋势是由动物福利问题和减少传统肉类生产对环境影响的需求所推动的。
目前的畜牧业生产方法效率相对较低,饲料向动物蛋白的转化率很低,牛肉约为1.9%,猪约为13%。相比之下,大规模的CCM估计需要225克的营养物质(氨基酸、葡萄糖等)来生产同样的200克蛋白质。因此,预测CCM生产的效率比传统牛肉生产高约30~45倍。
亚洲,特别是中国对肉类的需求和消费增加也推动了CCM趋势。事实上,据联合国粮食及农业组织(FAO)估计,到2050年,肉类的需求将增加70%,达到4.7亿吨,而目前的生产方法是不可持续的。事实上,由于肉类和其他动物性蛋白质的消费迅速增加,反过来又需要大量的饲料,世界即将遭遇一场危机。
总的来说,推动CCM发展的动力是:1)世界上对肉类的需求迅速增长;2)人们对于肉类生产对环境的影响越来越关注;3)人们对于与密集型畜牧业生产有关的动物福利越来越关注。这导致替代性肉类产品如CCM的市场迅速崛起,因为消费者希望因高成本、动物福利或环境问题而减少肉类消费。
然而,迄今为止,尽管已经成功地生产了以餐食用量单位计的“原型”实验室肉,但成本实在太高,使得该技术在商业生产中是不可行的。
肉类细胞培养生产中一个非常重要的成本因素来自于对大量专门的细胞培养基的需求,特别是对合适的生长因子蛋白的需求,而生长因子蛋白往往是细胞培养基中最昂贵的成分。目前,CCM的生产成本在很大程度上(高达90%)由生长因子的成本驱动,使得生产在经济上不可行。
发明内容
本发明至少部分基于以下发现:如果在纯化的最终产品中包括某些原生植物种子蛋白,则可以保护和改善纯化的生长因子(GF)的储存时间。本发明还至少部分基于以下发现:这些原生的种子蛋白可以提高细胞培养基中生长因子的生物活性,从而提高细胞培养基的品质。
此外,在最终产品中包括这些种子蛋白可以大大降低下游加工成本。由于易于扩大植物作物的规模、高效的产率和较低的下游加工成本等经济效益,总体成本可节省高达1000倍,消除了CCM生产中的最大障碍,即生长因子的成本。
本发明的一个目的是提供改进的生长因子组合物和补充剂,这些组合物和补充剂对生成细胞培养肉(CCM)特别有用。该目标通过本发明的描述和权利要求得以实现。
生长因子既可以来自原生来源,也可以在瞬时或转基因宿主生物体中重组生产。基于植物种子的重组生长因子生产对肉类生产用的细胞培养基有很多优势。其是一个无内毒素、易于扩展、价格低廉的生产平台,种子是重组生长因子的天然、长期储存载体,使下游加工前的储存更容易、成本更低、物流更便捷。此外,本文所述的基于植物的生长因子生产可以设置为完全无动物,即完全不使用取自动物的任何生物材料,这对预期CCM产品的很大一部分消费者非常有利。
因此,在第一方面,本发明涉及一种生长因子组合物或补充剂,包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白,用于培养细胞以生产细胞培养肉。重组动物生长因子可以是植物来源的,即重组动物生长因子可以在转基因植物中生产。
本发明还涉及一种培养细胞以生产细胞培养肉的方法,该方法包括:(a)提供能够生长以生成类肉组织的至少一种细胞培养物,以及(b)向所述至少一种细胞培养物供应用于维持所述细胞培养物生长和/或细胞分化的生长培养基,该方法的特征在于,所述生长培养基包括至少一种生长因子组合物,该组合物包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白。
本发明还涉及生长因子补充剂。因此,另一个方面涉及一种生长因子补充剂,特别是一种用于培养细胞以生产细胞培养肉的生长因子补充剂。该生长因子补充剂优选包括选自下组的转基因植物种子材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。该提取物优选包括在所述植物中表达的一种或多种重组动物生长因子,其范围为约0.1重量%~约97重量%。
本发明的又一个方面涉及包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白的生长因子组合物在培养细胞以生产细胞培养肉中的应用,其中该生长因子组合物来自非动物来源,优选在转基因植物中生产。所用的生长因子组合物优选是本文所述和定义的生长因子组合物。
本发明的另一个方面提出了一种包括本发明的生长因子补充剂的细胞培养基,特别是一种用于培养细胞培养肉(CCM)的细胞培养基。细胞培养基可以是成分限定的,并称为生长因子培养基。因此,本发明的细胞培养基优选包括本文所述的生长因子补充剂,该生长因子补充剂如本文所述包括选自下组的转基因植物种子材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
又一个方面提供一种试剂盒,包括:(a)细胞培养基,特别是用于培养细胞以生产细胞培养肉的细胞培养基;和(b)如本文所述和定义的生长因子补充剂,用于维持所述细胞的生长。因此,该试剂盒可以包括选自下组的转基因植物种子材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜,该提取物优选包括在所述转基因植物中表达的一种或多种重组动物生长因子,其范围为约0.1重量%~约97重量%。
如本文所用,术语“细胞培养肉”缩写为CCM,是指通过体外培养动物细胞生成的肉,以取代被屠宰的动物。该术语有时也被称为“培养肉”、“实验室培养肉”、“体外培养肉”或“清洁肉”。
如本文所用,术语“非动物”应理解为与动物无关或不来源于动物。本文公开的组合物是非动物的,即组合物不是直接或间接来源于动物。
如本文所用,术语“无内毒素”应理解为没有可测量的内毒素存在,并且优选地,无内毒素的物质和组合物来源于不产生内毒素的生物体。
生长因子(GF)可以优选为植物制的或植物衍生的动物GF,这是指GF是在转基因植物中生产(表达)的动物GF。
附图说明
图1:3T3细胞在含有植物表达的重组EGF与大麦种子蛋白的培养基中生长的细胞增殖试验的结果。
图2:3T3细胞在含有植物表达的人碱性FGF与大麦种子蛋白的培养基中生长的细胞增殖试验的结果。
图3:FDC-P1细胞在含有大麦生产的IGF-1补充剂和不同量的大麦种子蛋白的培养基中的细胞增殖试验的结果。大肠杆菌生产的IGF-1用作比较。
图4:EGF在具有不同浓度的大麦种子蛋白的补充剂中的稳定性。
图5:显示EGF补充剂的组成的染色电泳凝胶。
图6:显示碱性FGF补充剂的组成的染色电泳凝胶。
图7:在大麦种子中表达的五种不同的生长因子,与其他大麦种子蛋白。
具体实施方式
对肉类需求的增长以及对肉类生产的环境影响的日益关注,促进了类肉产品(如细胞培养肉(CCM))生产的创新,其中环境和动物福利是关注焦点。然而,要使CCM成为肉类的现实替代品,它必须满足几个要求:
a)(在味道和质地上)至少与传统的动物肉一样好或更好;
b)达到与传统的动物肉相似(或更低)的消费价格;
c)可以得到世界市场所需的量;
d)在营养上与传统的动物肉一样好或更好;
e)满足动物福利的要求;
f)比传统的动物肉生产更具环境可持续性。
目前,CCM显然已经能够满足其中的许多要求,包括e)和f),与传统的动物养殖相比,耗水量减少99%,土地和温室气体排放减少93%。
然而,CCM的生产需要大量低价的动物GF,作为培养基的一部分。目前,全世界的GF生产商为研发市场或制药市场提供小规模、试验性的量。生产成本高,GF的销售价格从每毫克数百到数千欧元不等。这些价格对于CCM生产来说是令人望而却步的,并构成了新兴CCM行业的主要瓶颈,因为这些价格导致细胞培养肉的生产成本达到每公斤肉数百到数千欧元。GF占细胞培养基成本的90%。除非GF的生产和交付成本能够比目前的价格低大约100~1000倍,并且GF的生产和交付量能够达到未来的CCM生产所需的巨大量,否则CCM的技术和业务的发展是不可想象的。
因此,如果世界上要实施CCM生产,则经济地大规模生产低成本的GF是非常重要的,因为CCM生产中GF成本的比例非常高,导致目前基本上没有市场化产品。
本发明通过提供细胞培养GF组合物解决了这些问题,其作为例如GF补充剂提供,其能够以大大低于目前的GF溶液的成本生产。使用本文公开的GF解决方案,CCM的生产在经济上变得可行。
本发明的另一个优点涉及用于与GF共纯化某些原生储存蛋白的改良的下游加工,可将下游加工成本大幅降低到用于细胞培养生产肉类的GF的商业生产的关键水平。非常令人惊讶地发现,这些原生植物储存蛋白对过量表达的GF有非常有益和令人惊讶的稳定作用。这意味着利用简单的共纯化方案,提供与一种或多种原生种子蛋白共纯化的生长因子,通常是一组这样的蛋白,与典型的表达系统所需的更严格的纯化步骤相比,特别是与使用细菌系统时相比,不仅植物表达的GF的纯化工艺变得更简单,成本更低,而且与此同时,所得到的GF提取物具有理想的特性,与没有这种共纯化的植物蛋白的更高度纯化的GF相比有着令人惊讶的优势。
因此,在一个方面,本发明涉及一种方法,该方法依次包括以下一个或多个步骤,优选全部步骤:收获种子;用种子清洗机或种子分选机清洗种子;将分选后的种子去壳;对去壳后的种子进行消毒并研磨成细粉;在提取缓冲液中提取总可溶性蛋白;将提取物澄清;选择合适的纯化方式对GF和种子蛋白进行共纯化,例如使用诸如亲和色谱法选择特异性亲和力;缓冲液交换和填充及精加工。
因此,在一个实施方式中,本发明涉及一种方法,该方法依次包括以下一个或多个步骤,优选全部步骤:收获种子;用种子清洗机或种子分选机清洗种子;将分选后的种子去壳;对去壳后的种子进行消毒并研磨成细粉;在提取缓冲液中提取总可溶性蛋白;将提取物澄清;用合适的纯化步骤,例如通过使用不同过滤步骤的尺寸分级,对GF和种子蛋白进行共纯化;缓冲液交换和填充及精加工。
本发明的生长因子种子提取物可以通过在磨坊中研磨含有所需重组生长因子的收获的转基因种子以获得细粉(面粉)来适当地制备。磨碎/研磨的材料可以任选地以化学方式或酶方式加工,以加强所需转基因蛋白的释放,例如用选自β-葡聚糖酶、淀粉酶、木聚糖酶或纤维素酶的一种或多种酶处理。然后可以将优化的提取缓冲液加入到磨碎的面粉中,并将得到的溶液充分混合(例如通过搅拌)。提取缓冲液可以适当地选自但不限于常规的水性缓冲液,例如磷酸盐缓冲液、TES(2-{[三(羟甲基)-甲基]氨基}乙磺酸)、TRIS三(羟甲基)-氨基甲烷、MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)、HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪-乙磺酸))、MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)、ADA等以及它们的混合物。缓冲液可进一步包括盐和通常用于蛋白质纯化缓冲液的其他成分,这些成分不会干扰提取过程。
在一些实施方式中,固体可以从液体提取物中分离出来,例如通过离心力,并收获上清液。
如此得到的GF提取物可以方便地混合在常规细胞培养基中,例如本文所述的那些,特别是那些适合于细胞培养肉生产的培养基。
如此得到的初始粗转基因种子提取物可以通过进一步纯化和浓缩来进一步加工。有用的色谱纯化的一个例子包括在提取物中加入有效结合生长因子的IMAC色谱树脂,此时已经在其上加入了多-His标签(用本领域技术人员已知的常规生物技术方法)。也可以使用其他有用的亲和标签并进行适当的亲和纯化,例如但不限于使用重复HQ序列、链霉亲和素标签、多聚半胱氨酸标签、PDZ配体、FLAG表位、Glu-Glu标签等,这些都是本领域技术人员已知的。提取物和树脂的混合物在合适的缓冲液中搅拌,此后可以通过离心将IMAC树脂(或其他亲和树脂)与液体分离。丢弃液相,将树脂重悬在合适的洗涤缓冲液中,然后旋转,将液相从树脂上倾析出来。根据需要反复洗涤。将树脂重悬于合适的洗脱缓冲液中,离心后将上清液从树脂上倾析出来,通常通过凝胶过滤色谱法(脱盐)进行缓冲液交换。其他有用的色谱技术可以替代或补充使用,例如离子交换色谱法和尺寸排除色谱法。柱色谱法可以与这些技术中的任一种一起使用,但其他技术也同样适用,例如扩展床色谱法。
为了真实地模拟原生肌肉组织,细胞和生物材料必须在正确的条件下结合起来,形成成熟的组织,在这个过程中GF是至关重要的添加剂。此外,为了满足消费者接受度,CCM还必须模拟传统肉类的品质,例如物理外观、气味、质地和味道。因此,重要的是CCM不仅包含骨骼肌细胞,还包含肌肉组织的其他关键成分,包括结缔组织、微血管网络和脂肪组织的成分(Pandurangan等人,2015)。用于解决这些挑战的技术是组织工程技术,它结合了基于支架的技术(使用可食用的支架)以及共培养技术(使用多种细胞培养方案),其中所有组织相关的细胞类型被共培养以形成一致的肌肉组织结构(Kosnik等人,2003;Edelman等人,2005)。
不同类型的干细胞已被用于CCM生产,包括胚胎干细胞(ES)、诱导多能干细胞(iPS)、卫星肌肉干细胞(成肌细胞)和其他成人干细胞(即间充质干细胞和脂肪干细胞)。卫星细胞是祖细胞群,位于骨骼肌纤维的外围,是维持肌肉组织的主要细胞来源(Peault等人,2007)。
目前,从肌肉活检中分离和培养的卫星干细胞被认为是最适合于CCM生产的细胞来源(Post等人,2012)。已经成功地从几种动物物种的肌肉中分离出卫星细胞用于CCM生产,包括牛(Dodson等人,1987)、鸡(Yablonka-Reuveni等人,1987)、羊(Dodson等人,1986)和猪(Blanton等人,1999)。
用于研究肌肉再生的最佳特征和最广泛使用的卫星细胞模型之一是小鼠成肌干细胞系C2C12(Germani等人,2003)。C2C12成肌细胞一直是用于研究生物材料(包括GF)对肌肉生长作用的主要细胞模型(Ben-Arya等人,2019)。从牲畜动物的肌肉活检中分离出来用于CCM的卫星细胞是组织特异性干细胞,不具备多能表型,因此不具备在培养中无限增殖的能力(Peault等人,2007)。直到最近,人们的普遍看法都是没有稳定的、来自牲畜动物的特征化细胞系存在。幸运的是,对于CCM生产行业来说,一组科学家现已成功地从牛囊胚建立了一个稳定的多能细胞系(Bogliotti等人,2018),他们的成功无疑将促进从牲畜动物生成更稳定的细胞系。iPS作为CCM生产的一个可能的细胞来源也受到关注。iPS细胞已被广泛研究,它们可以成为降低CCM生产成本的重要因素,因为它们可以减少从动物活检中不断重复地生成干细胞的时间和精力(Kadim等人,2015)。事实上,很少有CCM公司将其作为CCM的细胞来源来投注。
CCM生产用的理想培养基应该是化学限定的,用精确选择的营养物质和GF配制,并且不含动物来源(Sharma等人,2015)。GF是干细胞增殖和分化的天然调节器,它们对干细胞研究的生物学重要性是无可争议的(Ribeiro等人,2010)。GF与其他生物材料相结合,已被广泛用于培养肌肉干细胞,以用于各种组织工程,包括CCM生产。使用卫星细胞系(如C2C12成肌细胞),已经鉴定出几种GF作为调节肌肉生长和再生的主要角色(Perry等人,2000)。
迄今为止,许多无动物和无血清的细胞培养基产品已经可以商购用于CCM生产,这是过去20年中再生医学研究领域的巨大进步的结果(Specht等人,2018)。然而,尽管近年来在干细胞研究方面积累了大量的科学证据,但CCM还没有准备好供公众消费,主要原因是在能够实现大规模生产之前,必须先解决CCM的极高生产成本问题。一个主要的障碍是GF的成本,估计约占培养基成本的99%(Ben-Arye等人,2019)。因此,GF需要大幅降低其价格,它们应该来自无动物来源,优选也来自无内毒素来源(非细菌)。
目前,可用于CCM的GF是在生物反应器中用动物细胞、细菌或酵母制备的。这些生产系统既过于昂贵,又难以扩大规模,而且是来自动物的,不是无内毒素的(如来自大肠杆菌),或者在细胞培养物中的活性有问题(超糖基化/不适当的翻译后修饰)。这些系统不像植物种子那样为重组蛋白的生产提供惰性环境,因此可能需要将GF纯化到更高的纯度水平,超过大麦或水稻等作物种子生产系统中生产的GF所需要的纯度水平。此外,这些现有的系统还可能存在公众认知的问题,而公众认知对CCM的营销非常重要。然而,这些重要的标准使得在转基因植物中生产GF成为一种有吸引力的选择,这将使大规模生产清洁和具有成本效益的GF成为可能(Pandurangan等人,2015)。
植物在细胞和分子水平上有复杂的机制来对抗生物和非生物胁迫(stress)。非生物胁迫的后果之一是细胞蛋白质的变性和聚集,导致细胞死亡。细胞色素(CYP)的伴侣式活性及其在蛋白质通过肽基脯氨酰键异构化进行折叠的限速步骤中的作用,与它们参与应激反应(stress responses)有关。许多植物CYP的表达在对应激的反应中被诱导,这表明它们可能在抗压(stress tolerance)中发挥作用。例如,拟南芥的CYP、即旋转异构酶亲环素1(ROTAMASE CYCLOPHILIN 1,ROC1)的表达在受伤后增加。类似地,玉米和豆类的CYP基因表达在对热应激、创伤、高盐度或低温的反应中增加(Mainali,H.R.等人,2017)。这些和其他发现证明了植物CYP在抗压中的作用。因此,CYP蛋白(如亲环蛋白和相关蛋白)是植物蛋白的例子,其作为与植物中表达的GF的共同成分,可以有很大帮助。
正统种子是指在异地保存过程中,在干燥和/或冷冻状态下存活的种子。正统种子发育的末期体现为一个发育调节的脱水期,导致整个结构中大量水分的流失。在干燥过程中,成熟的正统种子达到5~10%的水分水平,并且经常可以进一步干燥到1~5%的水分,而几乎没有活力的损失。当脱水发生时,细胞质会凝结,细胞内成分变得更加拥挤。这些条件为许多不希望的相互作用提供了环境,可能导致蛋白质的聚集和变性以及细胞器-细胞膜的融合(Hoekstra等人,2001)。干燥耐受性的获得或承受这些非常低的水势和随后的分子拥挤的能力,与各种保护性化合物的积累有关,包括蛋白质(和糖类)。
最有可能对成熟种子中的细胞稳定性做出重大贡献的两类蛋白质包括小型热休克蛋白(HSP)和晚期胚发育丰富蛋白(LEA)。在种子发育后期积累的小的HSP可能通过作为分子伴侣的作用来帮助最小化细胞质凝结的聚集效应,从而有助于稳定玻璃态。LEA蛋白是一类多样化的高丰度、热稳定的蛋白,在胚成熟后期和种子发育末期的发育调节的脱水期中积累。许多研究报道,脱水蛋白可能作为分子伴侣或分子屏障对酶或磷脂起到保护作用。
脱水蛋白(DHN)或第2组LEA(晚期胚发育丰富)蛋白在植物对非生物胁迫的反应和适应中起着根本作用。它们通常在成熟的种子中积累,或在盐度、脱水、寒冷和冷冻胁迫下在植物组织中被诱导。因此,有些LEA在植物的生命周期中可能具有双重作用,在发芽期间作为储存蛋白,在种子发育过程中也具有耐干燥功能。
虽然成熟的种子中存在的绝大多数单个蛋白质具有代谢或结构作用,但所有的种子也都含有一组或多组蛋白质,它们的存在量很高,并为发芽和幼苗生长期间提供氨基酸的储库。
尽管它们的详细结构有很大差别,但所有的种子储存蛋白都有一些共同的特性。首先,它们在特定的组织和特定的发育阶段有高水平的合成。事实上,它们的合成受到营养的调控,并且它们充当盈余氮的汇集。然而,大多数还含有半胱氨酸和甲硫氨酸,因此它们的合成也需要足够的硫。许多种子含有不同组的储存蛋白质,其中一些富含硫氨基酸,另一些中的硫氨基酸则很贫乏。
种子储存蛋白的第二个共同特性是它们在成熟的种子中存在于离散的沉积物中,称为蛋白体。最后,所有的储存蛋白部分都是各种成分的混合物,在单一基因型内和同一物种的基因型之间都表现出多态性。
谷物种子的总蛋白质含量约为谷物干重的10~15%,其中约有一半是储存蛋白。谷类种子储存蛋白由分泌途径产生并沉积在离散的蛋白体中。
因此,某些植物蛋白被认为会导致稳定性的增加和对应激的反应,包括脱水蛋白、蛋白酶抑制剂、大麦醇溶蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
正统的种子能够在极端条件下存活的一个结果是这些种子中存在的蛋白质的稳定性增加。这表现为在植物中表达的转基因蛋白质,例如大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。因此,在这种植物中表达并储存在种子中的蛋白质被发现可以在很长一段时间内保持其稳定性和生物活性。因此,在植物种子中生产蛋白质是特别有利的,因为植物种子中的环境赋予了蛋白质更高的稳定性。
在植物种子中表达生物活性蛋白如GF可能是特别有利的,所述GF包括例如以下GF:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。这些GF中的任何一种或这些GF中的任何两种或更多种的组合都可以在植物种子中生长,并以具有完整的生物活性的形式从中回收。
在本文公开的用途、组合物(包括补充剂)、方法和试剂盒中,植物种子蛋白可以是在植物种子中表达的任何植物蛋白,例如上述公开的一种或多种。例如,植物种子蛋白可以是选自下组的一种或多种蛋白质:脱水蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、脱水蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
本发明中的重组GF可以是任何重组的动物GF。示例性的GF包括上述任一种GF。这些GF中的任何一种或这些GF中的任何两种或更多种的组合都可以包含在组合物中。
在典型的实施方式中,基于组合物的总重量,组合物可以包括约3%~约99.9%的一种或多种种子蛋白,例如约5%~约99.9%、约10%~约99.9%或约20%~约99.9%。该范围的下端值可以在约3%~约20%的范围内,例如约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%、约10%、约12%、约14%、约16%、约18%或约20%。该范围的上端值可以在约80%~约99.9%的范围内,例如约90%~约99.9%,例如约95%~约99.9%,例如约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%、约99.5%、约99.6%、约99.7%、约99.8%或约99.9%。
在一些实施方式中,组合物可以包括约0.1%~约97%的范围内的一种或多种GF,特别是重组动物GF,例如从约0.2%或从约0.3%或从约0.4%或从约0.5%或从约1%或从约5%、到约97%或到约95%或到约90%或到约85%或到约80%或到约75%或到约70%的范围。在一些实施方式中,组合物包括约10%~约30%的范围内的一种或多种GF。
本文所述组合物的一个明显优势是它们不受动物污染,也不含内毒素。组合物来自非动物来源,这意味着组合物中不存在血清、内毒素和抗生素等原生动物成分,也不存在人类或动物的传染病原体或其他内源性哺乳动物污染原体,包括例如不希望的GF或细胞因子。
本发明的组合物优选是非动物的,即组合物来自非动物来源。组合物优选是植物来源的,这意味着组合物也不含细菌内毒素,该细菌内毒素是由大肠杆菌等革兰氏阴性细菌产生和释放的。
因此,通过在植物中进行分子耕种来生产GF,会产生一种非常理想的产品。此外,通过以植物提取物的形式回收产品(GF),可以大幅提高产率并降低生产成本。单个GF的下游纯化对于CCM来说是成本高昂的,但对于本文公开的组合物来说是没有必要的,因为GF在植物种子混合物中保留了它们的生物活性,可以随时使用,例如作为生长培养基的补充剂或在生长培养基中使用。令人惊讶和有利的是,这导致生长因子补充剂的改进特性,表现为更有活性和更稳定的生长因子(当存在于细胞培养基中时)。
从上述内容可以看出,本文所述的组合物在生成CCM方面特别有用,因为这些组合物满足了它们在成本效益高的CCM培养中使用的几个重要特征。因此,由于植物种子蛋白的存在,组合物中的GF在长期储存期间是稳定的。藉此,组合物可以被储存起来,直到它们在生长培养基中使用,而GF的生物活性损失很小或没有损失。
组合物可以储存直到使用,例如作为生长培养基的补充剂。组合物可以在临使用前(即在细胞培养中使用前)添加到培养基中,也可以在培养基拼装时添加到培养基中。在这两种情况下,组合物都可以储存在独立的容器中,在那里它们可以稳定地长期储存。
GF组合物可以以干燥形式提供,例如作为冻干植物提取物或者作为GF或GF提取物和特定植物种子蛋白的干燥组合,例如脱水蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、脱水蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白中的一种或多种。
或者,GF组合物也可以以液体形式提供,在使用前添加到生长培养基中。优选地,这种液体组合物是水性的,可以任选地包括一种或多种缓冲剂、盐或其他蛋白质稳定剂。GF组合物还可以包含其他合适的辅料,包括但不限于甘油、氨基酸、糖类(单糖和/或多糖)、维生素和无机微量元素。
组合物也可以直接添加到生长培养基中,可以是干燥形式,也可以是液体形式。一旦与生长培养基结合,最终培养基中所含的GF浓度在一些实施方式中可以在0.000001%(w/v)~约5%(w/v)的范围内,优选在约0.000001%(w/v)~约2%(w/v)的范围内、在约0.000001%(w/v)~约1%(w/v)的范围内、在约0.000001%(w/v)~约0.5%(w/v)的范围内、在约0.000001%(w/v)~约0.1%(w/v)的范围内、在约0.000001%(w/v)~约0.05%(w/v)的范围内、或在约0.000001%(w/v)~约0.01%(w/v)的范围内。
生长培养基可以包括维持动物细胞生长以生成细胞培养肉所需的营养成分,包括一种或多种氨基酸(包括必需氨基酸、非必需氨基酸)、单糖、维生素、无机离子、微量元素。生长培养基可以另外含有体细胞素和/或激素。
生长培养基可以是本领域内已知用于生长动物细胞的任何生长培养基。一般来说,生长培养基可以是基于血清的,例如基于人血清、牛血清(小牛血清、新生小牛血清和/或胎牛血清)或马血清的培养基。
或者,生长培养基也可以是人工/合成或设计的,即通过一并添加所需的营养物质,例如维生素、盐、蛋白质、碳水化合物、辅助因子和溶解的O2和CO2,制成生长培养基。
如本文、包括权利要求书中所用,除非上下文中另有说明,单数形式的术语解释为也包括复数形式,反之亦然。因此应注意,除非上下文中另外清楚地说明,单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
在整个说明书和权利要求书中,术语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”以及它们的变体应理解为是指“包括但不限于”,并且不旨在排除其它组成部分。
在术语、特征、数值和范围等与诸如约、左右、大约、基本上、大致上、至少等术语联用的情况下,本发明也涵盖精确的这些术语、特征、数值和范围等(即,“约3”应当也涵盖精确的3,或者“基本上恒定”应当也涵盖精确地恒定)。
术语“至少一个”应理解为是指“一个或多个”,并且因此同时包括包含一个组成部分的实施方式和包含多个组成部分的实施方式。另外,引用了用“至少一个”来描述特征的独立权利要求的从属权利要求中,当该特征通过“所述”和“所述至少一个”被引用时,都具有相同含义。
应理解,可以对本发明的前述实施方式进行改变,同时仍然落在本发明的范围内。除非另有说明,本说明书中描述的特征可以被起到相同、等同或相似目的的替代性特征替代。因此,除非另有说明,所公开的各特征表示等同或相似特征的通用系列的例子。
示例性语言如“例如”、“诸如”、“比如”等的使用仅旨在更好地说明本发明,并且不表示对本发明的范围构成限制,除非如此声称。除非上下文中另外清楚地说明,本说明书中描述的任何步骤都可以按任何顺序实施或同时实施。
本说明书中描述的所有特征和/或步骤都可以按任何组合方式组合,但其中至少一些特征和/或步骤相互排斥的组合除外。具体而言,本发明的优选特征可适用于本发明的所有方面,并且可以按任何组合方式使用。
下面的非限制性实施例进一步描述了本发明。
实施例
实施例1:转化的大麦植物在种子中表达EGF并纯化
用标准的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的未成熟胚(IE)的转化生成了遗传转化的大麦(Hordeum vulgare)栽培品种,该未成熟胚是从大麦种子中分离出来的,具有一个合成的基因,该基因根据大麦中的密码子用法进行了密码子优化,编码表皮生长因子(EGF),被克隆到基因表达盒中,由种子特异性启动子驱动,以确保该基因的高度种子特异性表达。
随后,在生长柜中的合适的培养基上对IE进行组织培养,选择得到的小植株,将其转移到土壤或任何合适的生长基质中,使其在合适的气候条件下生长,收获成熟的种子,用标准的蛋白质检测方法(如ELISA或Western印迹分析)筛选出目标蛋白EGF高产的转化大麦品系。
将选定的品系进一步扩大为第二代和第三代,用于生产种子,收获种子,然后用种子清洗机或种子分选机清洗种子,将分选的种子去壳,对去壳后的种子进行消毒,用干磨或湿磨研磨成细粉,通常颗粒大小在直径100~400μm的范围内,最佳粒径在直径250μm左右,在提取缓冲液中提取总可溶性蛋白,将提取物澄清,选择特异性亲和技术来共纯化EGF和特定种子蛋白,使用亲和色谱法,选择严格和合适的亲和条件来共纯化EGF和特定种子蛋白,进行缓冲液交换和填充及精加工。
用于提取大麦种子蛋白和EGF的提取缓冲液,例如磷酸盐缓冲液,含50mM磷酸二氢钾,500mM NaCl和pH 7.0~8.0,有或没有高浓度的EGF蛋白稳定剂如甘露醇或海藻糖,或Tris缓冲液,含50mM Tris,500mM NaCl和pH8.0,有或没有高浓度的EGF蛋白稳定剂如甘露醇或海藻糖。
为了在亲和色谱法前澄清提取物,将提取物在10℃下以5000×G力离心10分钟。
通常情况下,利用的亲和技术是批量模式的目标蛋白结合或扩张床吸附(EBA)柱或填料模式的固定化金属亲和色谱(IMAC),带有FPLC装置,FPLC装置该利用镍和组氨酸对种子胚乳室中表达的组氨酸标记的EGF的相互作用。为了便于使用填料模式柱和FPLC,大麦提取物在上样至填料柱之前先用切向流过滤(TFF)进行过滤。经优化后,使用越来越高的咪唑浓度将EGF和共纯化的特定种子蛋白从柱子上洗脱下来。
实施例2:生长因子提取物的生产
转基因植物:在其种子中表达异源人表皮生长因子(EGF)的大麦植物如下所述获得:
将53aa的人EGF的cDNA(Genebank编号:NP 001954.2)根据大麦密码子的用法进行密码子优化(Genscript,美国),随后用于制备处于来自大麦的0.42kb D-大麦醇溶蛋白启动子(Genebank编号:X84368)控制下的表达盒。将一个6aa的组氨酸标签融合到EGF蛋白的N末端。原生的N-端D-大麦醇溶蛋白信号肽用于将重组蛋白靶向到内质网。将该表达盒克隆到二元载体中。
大麦(Hordeum vulgare L.)Cv Golden Promise植株无性生长约65~85天,或直到花期后约3~20天。选择大麦头部,用70%乙醇和3%次氯酸钠在旋转摇床中将种子消毒20分钟,将未成熟的胚从种子中取出,放在再生培养基上,基本上按照Tingey等人的描述进行。将携带EGF二元载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(AGL0)培养物移到每个外植体上(所用培养物的OD值约为0.7)。在去除多余的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)后,将外植体转移到新鲜的再生培养基板上,并放置在24℃的暗柜中。1天后,将外植体转移到补充有30μg/mL潮霉素B的新鲜再生培养基上,并在那里放置4~6周。芽的再生基本上按照Tingey等人的描述进行。将愈伤组织移植到芽诱导培养基(SIM)上,每2周将存活的愈伤组织和再生的芽转移到新鲜SIM上,直到形成小植株。然后将小植株转移到含有20μg/mL潮霉素B的根诱导培养基(RIM)上,将存活的植株盆栽在土壤中。对所有转化体都进行重组EGF蛋白表达的分析。
从每个转基因品系的第一代种子(T1种子)中随机选择四颗种子进行分析。用机械力将种子粉碎后,在Retsch MM301珠磨机(Qiagen)中在96深孔微孔板格式中研磨。通过在pH 7.0的500μL的50mM磷酸二氢钾中提取,从粉碎的种子中提取水溶性蛋白。通过在珠磨机中混合,在室温下进行1小时提取,通过在4℃下以3000×g离心5分钟来澄清粗蛋白提取物。收集澄清的提取物并用于EGF目标蛋白的定量分析。根据制造商的说明,使用市售的EGF夹心ELISA试剂盒对种子中的目标蛋白积累进行分析。在该实验中,种子中的EGF含量被确定在500mg/kg的范围内。
生长因子提取物:通过将从所得到的转基因大麦植物收获的种子在磨机中研磨获得细粉(面粉),制备转基因植物提取物。在研磨好的大麦面粉中加入提取缓冲液(50mM磷酸二氢钾pH 7.0),提取缓冲液与研磨好的面粉的体积/重量比为5/1。将得到的溶液在4℃下搅拌60分钟。通过离心力将固体从液体提取物中分离出来,在冷藏的离心机(HeraeusPrimo R)中以8300rpm离心15分钟,将上清液倾析到新的小瓶中。通过SDS-PAGE和Western印迹,用特异性抗体分析所得到的水性提取物中异源生长因子的含量。在该实验中,EGF含量约为未纯化提取物蛋白质含量的0.1%。
实施例3:培养基的组成
生成了一种用于培养肌肉干细胞(这里称为成肌细胞)的培养基组合物,包含基础培养基、缓冲体系、谷氨酰胺、血清(或血清替代品)、从转基因植物中提取的特定生长因子和其他补充剂。
使用高纯度和定义好的干细胞培养基是连续培养应用的关键点。用于培养干细胞的基础培养基必须根据细胞类型及其对细胞行为的预期调节来专门选择,以支持增殖或分化。
CCM培养基通常分为两种培养基类型,生长培养基(扩展培养基)和分化培养基。生长培养基通常含有较高浓度的血清(10%~20%),而分化培养基含有较低浓度的血清(1%~5%)或完全无血清。最常用于培养成肌细胞的基础培养基是:(a)DMEM,(b)F-12,(c)RPMI-1640和(d)MCDB120,或它们的组合。
常添加到增殖用生长培养基中的生长因子是FGFb、IGF-1和EGF,其浓度为1~20ng/ml,常添加到分化培养基中的生长因子是IGF-1、EGF、NRG1和GDNF,其浓度为1~20ng/ml。
实施例4:含大麦生长因子的DMEM
已知支持成肌细胞生长和分化的基础培养基的一个例子是高葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagles Medium,DMEM),含有相关的缓冲体系和其他必需的基础要素,包括高浓度葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠,另外还补充有血清(FBS,胎牛血清或HS,马血清)、ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、NAA(非必需氨基酸)、地塞米松、白蛋白(BSA)、生长因子和pen/strep(青霉素和链霉素)。
在CCM领域,在基本培养基、血清类型、成分浓度和生长因子的来源的组合方面可以发现一些变化。优选地,培养基应该是化学限定的,不含血清,不含动物来源和传染病原体。
常添加到肌肉干细胞或卫星细胞增殖用生长培养基中的生长因子是FGFb、IGF-1和EGF,其浓度为1~20ng/ml,常添加到分化培养基中的生长因子是IGF-1、EGF、NRG1和GDNF,其浓度为1~20ng/ml。
实施例5:MSC和ADSC的培养基
生成了一种用于培养间充质干细胞(MSC)和脂肪衍生干细胞(ADSC)的培养基组合物,包含基础培养基、低葡萄糖、缓冲体系、谷氨酰胺、血清(或血清替代品)、从转基因植物中提取的特定生长因子和其他补充剂。
使用高纯度和定义好的干细胞培养基是成功培养应用的关键点。用于培养干细胞的基础培养基必须根据细胞类型及其对细胞行为的预期调节来专门选择,以支持增殖或分化。
通常,用于从MSC和/或ADSC生成脂肪细胞的特定脂肪生成培养基(分化培养基)通常基于基础培养基DMEM/汉姆氏F-12加L-谷氨酰胺和10%血清,并通常补充有其他必需元素,例如青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺、抗坏血酸-2-磷酸,并额外补充有三碘甲腺原氨酸、氢化可的松、异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、罗格列酮和胰岛素。在基本扩展培养基和特定脂肪生成培养基、血清类型、成分浓度和生长因子的来源的组合方面可以发现一些变化。优选地,培养基应该是化学定义的,不含血清,不含动物来源和传染病原体。
常添加到MCS增殖用生长培养基中的生长因子是FGFb、IGF-1和EGF,其浓度为1~20ng/ml,常添加到脂肪生成分化培养基中的生长因子是IGF-1、EGF、IL-6、LIF、NRG1和GDNF,其浓度为1~20ng/ml。
实施例6:在DMEM中与EGF共纯化的大麦种子蛋白对3T3细胞生长的作用
在含2mM谷氨酰胺和10%小牛血清成分的DMEM培养基中,加入大麦生产的30%的纯人表皮生长因子、或含有30%的EGF和70%的特定大麦种子蛋白的生长因子补充剂,用3T3细胞进行细胞增殖试验,浓度为0~1ng/ml培养基,并在37℃下孵育44小时。作为比较,在培养基组合物中加入大麦生产的97%纯人EGF、或97%的EGF和仅3%的特定大麦种子蛋白,浓度为0~1ng/ml培养基,用3T3细胞进行细胞增殖试验。通过测量490nm处的光学密度来监测细胞生长,结果如图1所示。在同时含有人EGF和大麦种子蛋白的培养基中以及单独含有人EGF的培养基中,细胞生长有明显转变,但与含有高度纯化的EGF、或97%的EGF和3%的特定大麦种子蛋白(同样是从大麦中纯化)的相同培养基相比,当存在大麦种子蛋白时,OD值达到1时的EGF浓度大约低一个数量级。
实施例7:在DMEM中与FGFb共纯化的大麦种子蛋白对3T3细胞生长的作用
在含2mM谷氨酰胺和10%小牛血清成分的DMEM培养基中,加入大麦生产的碱性成纤维细胞生长因子和特定植物种子蛋白,用3T3细胞进行细胞增殖试验。作为参比,在培养基组合物中加入大麦生产的碱性成纤维细胞生长因子,使用3T3细胞但不使用特定植物种子蛋白进行细胞增殖试验。
通过测量490nm处的光学密度来监测细胞生长,结果如图2所示。同样,在含有人FGFb和大麦种子蛋白的培养基中,细胞生长有明显的转变,与含有少量的大麦种子蛋白、或含有比例为97%的FGFb和3%的大麦种子蛋白的培养基相比,当大麦种子蛋白以25%的FGFb和75%的大麦种子蛋白的比例与FGFb一起存在时,OD值达到1时的FGFb浓度大约低一个数量级。
实施例8:在DMEM中与IGF-1共纯化的大麦种子蛋白对FDC-P1细胞生长的作用
在含1%的FBS和10pg/ml的IL-3的DMEM培养基组合物中,加入纯度为25%或5%的大麦生产的胰岛素样生长因子1(IGF-1),或加入比例为25%的IGF-1和75%的特定大麦种子蛋白,以及比例为5%的IGF-1和95%的特定大麦种子蛋白,用FDC-P1细胞进行细胞增殖试验,并与作为参比的、纯度为98%的大肠杆菌生产的IGF-1生长因子进行比较。
通过测量490nm处的光学密度来监测细胞生长,结果如图3所示。同样,与大肠杆菌生产的IGF-1相比,在含有人IGF-1和大麦种子蛋白的培养基中,细胞生长有明显的转变,当大麦种子蛋白以75%的量存在时,OD值达到1时的IGF-1浓度大约低一个数量级,而当大麦种子蛋白以95%的量存在时,OD值达到1时的IGF-1浓度大约低两个数量级。当使用含1%FBS和10pg/mL鼠IL-3的DMEM重复实验时,也得到了类似的结果。
实施例9:EGF在具有不同浓度的大麦种子蛋白的补充剂中的稳定性
大麦生产的EGF补充剂中含有不同浓度的特定大麦种子蛋白,更具体地说,补充剂中分别含有95%和70%的大麦种子蛋白,其余部分为大麦生产的EGF。见图4。补充剂在室温(23℃)下储存在48%的甘油和0.5%的NaCl中。2个月和4个月后检测稳定性(剩余的EGF)。浓度较低的补充剂,即含有95%植物蛋白的补充剂显示出明显的高稳定性,EGF在2个月后剩余93%,在4个月后剩余70%,与之相比,含有70%植物蛋白的补充剂分别为66%和54%。结果如图4所示。
实施例10:EGF补充剂组合物的表征
将收获的生产EGF的大麦种子干燥,在种子分选机中清洗,去壳,然后消毒,之后研磨成细粉,在50mM磷酸二氢钾、500mM NaCl和pH 7.0~8.0中从研磨的粉末中提取总水溶性蛋白质,然后在10℃下在离心机中以5000×G力澄清10分钟,随后用IMAC亲和色谱法进行纯化。洗脱的蛋白质包括30%的EGF和70%的原生大麦种子蛋白。将EGF和共纯化的原生大麦种子蛋白从柱子上洗脱下来,将10μL样品在上样缓冲液中上样到12%的Nupage Bis-Tris凝胶上,在200V下跑动45分钟,然后进行考马斯(Coomassie)染色。将染色的条带切下,通过凝胶内胰蛋白酶消化来分析和鉴定蛋白质,然后进行质谱(MS)分析。除EGF外,鉴定到的蛋白质包括胚球蛋白、脱水蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂、亲环蛋白和枯草杆菌蛋白酶抑制剂,如图5所示。
实施例11:碱性FGF“粗”补充剂组合物的表征
将收获的生产FGFb的大麦种子干燥,在种子分选机中清洗,去壳,然后消毒,之后研磨成细粉,在50mM Tris、500mM NaCl、10mM 2-巯基乙醇和pH 8.0中从研磨的粉末中提取总水溶性蛋白质,然后在10℃下在离心机中以5000×G力澄清10分钟,随后用IMAC亲和色谱法进行纯化。将EGF和共纯化的原生大麦种子蛋白从柱子上洗脱下来,将10μL样品在上样缓冲液中上样到12%的Nupage Bis-Tris凝胶上,在200V下跑动45分钟,然后进行考马斯(Coomassie)染色。洗脱的蛋白质包括30%的FGFb和70%的原生大麦种子蛋白。将染色的条带切下,通过凝胶内胰蛋白酶消化来分析和鉴定蛋白质,然后进行质谱(MS)分析。除FGFb外,鉴定到的蛋白质包括胚球蛋白、LEA、β-淀粉酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、枯草杆菌蛋白酶抑制剂、硫素和防卫素,如图6所示。
图12:在大麦种子中表达的不同生长因子,与其他大麦种子蛋白。
将从五个不同的转基因大麦品系收获的大麦种子干燥,它们表达五种不同的生长因子,分别是:胰岛素生长因子1(IGF-1)、血管上皮生长因子(VEGF)、头蛋白、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白介素-6(IL-6)。将来自各品系的种子在种子分选机中清洗,去壳,然后消毒,之后研磨成细粉,在50mM磷酸二氢钾,500mM NaCl和pH 7.0~8.0中从研磨的粉末中提取总水溶性蛋白质,然后在10℃下在离心机中以5000×G力澄清10分钟,随后用IMAC亲和色谱法进行纯化。在各种情况下,洗脱的蛋白质分别包括10%~30%的各自的生长因子和70%~90%的原生大麦种子蛋白。将生长因子和共纯化的原生大麦种子蛋白上样到8个独立的12%的Nupage Bis-Tris凝胶上,在200V下跑动45分钟,然后进行考马斯(Coomassie)染色。将每种生长因子和共纯化的原生大麦种子蛋白的样品也上样到独立的12%的Nupage Bis-Tris凝胶上,在200V下跑动45分钟,以进行Western印迹分析,使用多克隆山羊抗鼠免疫球蛋白/HRP或多克隆山羊抗鼠免疫球蛋白/HRP进行检测,如图7所示。
具体实施方式
1.包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白的生长因子组合物在培养细胞以生产细胞培养肉中的应用。
2.如实施方式1所述的应用,其中,所述一种或多种植物种子蛋白选自下组:脱水蛋白、蛋白酶抑制剂、大麦醇溶蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
3.如实施方式1或2所述的应用,其中,所述重组动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
4.如上述实施方式中任一项所述的应用,其中,生长因子组合物包括约3%~约99.9%的一种或多种种子蛋白。
5.如上述实施方式中任一项所述的应用,其中,生长因子组合物包括约0.1%~约97%的一种或多种重组动物生长因子。
6.如上述实施方式中任一项所述的应用,其中,生长因子组合物来自非动物来源,优选在转基因植物中生产。
7.如上述实施方式中任一项所述的应用,其中,生长因子组合物基本上无内毒素。
8.如上述实施方式中任一项所述的应用,其中,生长因子组合物是包括选自下组的转基因植物种子材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
9.如上述实施方式中任一项所述的应用,其中,所述重组生长因子和一种或多种植物种子蛋白添加到将在其中培养细胞的细胞培养基中。
10.培养细胞以生产细胞培养肉的方法,该方法包括:
a.提供能够生长以生成类肉组织的至少一种细胞培养物;以及
b.向所述至少一种细胞培养物供应用于维持所述细胞培养物生长的生长培养基;
该方法的特征在于,所述生长培养基包括至少一种生长因子组合物,该组合物包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白。
11.如上述实施方式所述的方法,其中,生长培养基中的生长因子的浓度在约0.000001%(w/v)~约5%(w/v)的范围内,优选在约0.000001%(w/v)~约0.01%(w/v)的范围内。
12.如上述两个实施方式中任一项所述的方法,其中,一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白以生长因子补充剂的形式提供,该生长因子补充剂被添加到生长培养基中。
13.如上述实施方式中任一项所述的方法,其中,生长因子补充剂中的一种或多种重组动物生长因子的量在约0.1重量%~约97重量%的范围内。
14.如上述四个实施方式中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种植物种子蛋白选自下组:脱水蛋白、蛋白酶抑制剂、大麦醇溶蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
15.如上述五个实施方式中任一项所述的方法,其中,所述重组动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
16.如上述六个实施方式中任一项所述的方法,其中,生长因子组合物来自非动物来源,优选在转基因植物中生产。
17.如上述七个实施方式中任一项所述的方法,其中,生长因子组合物基本上无内毒素。
18.如上述八个实施方式中任一项所述的方法,其中,生长因子组合物是包括选自下组的转基因植物材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
19.一种生长因子补充剂,特别是一种用于培养细胞以生产细胞培养肉的生长因子补充剂,该生长因子补充剂包括选自下组的转基因植物材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
20.如上述实施方式所述的生长因子补充剂,其中,所述提取物包括一种或多种重组动物生长因子,其范围为约0.1重量%~约97重量%。
21.如上述两个实施方式中任一项所述的生长因子补充剂,其中,所述提取物包括选自下组的一种或多种原生植物种子蛋白:脱水蛋白、蛋白酶抑制剂、大麦醇溶蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
22.如上述三个实施方式中任一项所述的生长因子补充剂,其中,所述提取物包括约3%~约99.9%的一种或多种植物种子蛋白。
23.如上述四个实施方式中任一项所述的生长因子补充剂,其中,所述重组动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
24.如实施方式19~23中任一项所述的生长因子补充剂,其中无内毒素。
25.如实施方式19~24中任一项所述的生长因子补充剂,其选自干制剂和水性制剂。
26.用于生产生长因子补充剂的方法,该生长因子补充剂特别是用于补充用于生产细胞培养肉的细胞培养基,该方法包括:
-提供在其种子中表达转基因动物生长因子的植物,并使所述植物生长直到获得成熟的种子;
-收获所述种子;
-用种子清洗机或种子分选机清洗种子;
-将清洗或分选后的种子去壳;
-对去壳后的种子进行消毒并研磨成细粉;
-在提取缓冲液中提取可溶性蛋白;
-将所得提取物澄清;
-任选地从提取物中进一步纯化所述生长因子。
27.如实施方式26所述的方法,其中,所述转基因动物生长因子在提供时带有亲和标签,并且其中,该方法包括亲和纯化所述动物生长因子。
28.如实施方式26或27所述的方法,其中,所述转基因动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
29.如实施方式26~28中任一项所述的方法,其中,所述植物选自下组:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
30.如实施方式26~29中任一项所述的方法,其中还包括将所述所得提取物干燥的步骤。
31.如实施方式26~30中任一项所述的方法,其中还包括将所述所得生长因子补充剂混合在细胞培养基中、以获得经补充的适合于培养细胞培养肉(CCM)的细胞培养基。
32.一种细胞培养基,包括实施方式19~25中任一项所述的生长因子补充剂。
33.如上述实施方式所述的细胞培养基,其中,细胞培养基中包含约0.000001%(w/v)~约5%(w/v)的重组动物生长因子,优选约0.000001%(w/v)~约0.01%(w/v)。
34.一种试剂盒,其包括:
a.细胞培养基,特别是用于培养细胞以生产细胞培养肉的细胞培养基;以及
b.用于维持所述细胞生长的生长因子补充剂。
35.如上述实施方式所述的试剂盒,其中,细胞培养基和生长因子补充剂在单独的容器中提供,在使用前混合。
36.如上述两个实施方式中任一项所述的试剂盒,其中,生长因子补充剂是实施方式19~25中任一项所述的生长因子补充剂。
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Claims (27)
1.包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白的生长因子组合物在培养细胞以生产细胞培养肉中的应用,其中该生长因子组合物来自非动物来源,优选在转基因植物中生产。
2.如权利要求1所述的应用,其中,所述一种或多种植物种子蛋白选自下组:脱水蛋白、蛋白酶抑制剂、大麦醇溶蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
3.如权利要求1或2所述的应用,其中,所述重组动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
4.如权利要求1~3中任一项所述的应用,其中,生长因子组合物包括约3重量%~约99.9重量%的一种或多种种子蛋白和约0.1重量%~约97重量%的一种或多种重组动物生长因子。
5.如前述权利要求中任一项所述的应用,其中,生长因子组合物是包括选自下组的转基因植物种子材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
6.如前述权利要求中任一项所述的应用,其中,所述重组生长因子和一种或多种植物种子蛋白添加到将在其中培养细胞的细胞培养基中。
7.培养细胞以生产细胞培养肉的方法,该方法包括:
b.提供能够生长以生成类肉组织的至少一种细胞培养物;以及
c.向所述至少一种细胞培养物供应用于维持所述细胞培养物生长和/或分化的生长培养基;
该方法的特征在于,所述生长培养基包括至少一种生长因子组合物,该组合物包括一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白,
其中所述生长因子来自非动物来源,优选在转基因植物中生产。
8.如权利要求7所述的方法,其中,生长培养基中的生长因子的浓度在约0.000001%(w/v)~约5%(w/v)的范围内,优选在约0.000001%(w/v)~约0.01%(w/v)的范围内。
9.如上述两个权利要求中任一项所述的方法,其中,一种或多种重组动物生长因子和一种或多种植物种子蛋白以生长因子补充剂的形式提供,该生长因子补充剂被添加到生长培养基中。
10.如上述权利要求中任一项所述的方法,其中,生长因子补充剂中的一种或多种重组动物生长因子的量在约0.1重量%~约97重量%的范围内。
11.如上述四个权利要求中任一项所述的方法,其中,所述一种或多种植物种子蛋白选自下组:脱水蛋白、蛋白酶抑制剂、大麦醇溶蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
12.如上述五个权利要求中任一项所述的方法,其中,所述重组动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
13.如上述六个权利要求中任一项所述的方法,其中,生长因子组合物是包括选自下组的转基因植物材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
14.一种生长因子补充剂,特别是一种用于培养细胞以生产细胞培养肉的生长因子补充剂,该生长因子补充剂包括选自下组的转基因植物材料的提取物:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜;该提取物包括约0.1重量%~约97重量%的一种或多种重组动物生长因子和选自下组的一种或多种原生植物种子蛋白:脱水蛋白、蛋白酶抑制剂、大麦醇溶蛋白、晚期胚发育丰富蛋白(LEA)、亲环蛋白、ABA反应蛋白、球蛋白、白蛋白、醇溶蛋白、豌豆球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白。
15.如权利要求14所述的生长因子补充剂,其中,所述提取物包括约3%~约99.9%的一种或多种植物种子蛋白。
16.如上述两个权利要求中任一项所述的生长因子补充剂,其中,所述重组动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
17.如权利要求14~16中任一项所述的生长因子补充剂,其中无内毒素。
18.如实施方式14~17中任一项所述的生长因子补充剂,其选自干制剂和水性制剂。
19.用于生产生长因子补充剂的方法,该生长因子补充剂特别是用于补充用于生产细胞培养肉的细胞培养基,该方法包括:
-提供在其种子中表达转基因动物生长因子的植物,并使所述植物生长直到获得成熟的种子;
-收获所述种子;
-用种子清洗机或种子分选机清洗种子;
-将清洗或分选后的种子去壳;
-对去壳后的种子进行消毒并研磨成细粉;
-在提取缓冲液中提取可溶性蛋白;
-将所得提取物澄清;
-任选地从提取物中进一步纯化所述生长因子。
20.如权利要求19所述的方法,其中,所述转基因动物生长因子在提供时带有亲和标签,并且其中,该方法包括亲和纯化所述动物生长因子。
21.如权利要求19或20所述的方法,其中,所述转基因动物生长因子选自下组:角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、成纤维细胞生长因子-9(FGF9)、成纤维细胞生长因子-16(FGF16)、成纤维细胞生长因子-19(FGF19)、成纤维细胞生长因子-20(FGF20)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-I)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素(IN)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、头蛋白、红细胞生成素(Epo)、白血病抑制因子(LIF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、神经调节蛋白-1(NRG-1)、转化生长因子-β1(TGFb1)、转化生长因子-β3(TGFb3)、以及干细胞因子(SCF)。
22.如权利要求19~21中任一项所述的方法,其中,所述植物选自下组:大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、水稻、大豆、豌豆、小米、高粱和油菜。
23.如权利要求19~22中任一项所述的方法,其中还包括将所述所得提取物干燥的步骤。
24.如权利要求19~23中任一项所述的方法,其中还包括将所述所得生长因子补充剂混合在细胞培养基中、以获得经补充的适合于培养细胞培养肉(CCM)的细胞培养基。
25.一种细胞培养基,包括权利要求14~18中任一项所述的生长因子补充剂。
26.一种试剂盒,其包括:
a.细胞培养基,特别是用于培养细胞以生产细胞培养肉的细胞培养基;以及
b.用于维持所述细胞生长的、权利要求14~18中任一项所述的生长因子补充剂。
27.如权利要求26所述的试剂盒,其中,细胞培养基和生长因子补充剂在单独的容器中提供,在使用前混合。
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