JP2023528510A - 細胞培養肉のための増殖因子組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための、１つ以上の組換え動物成長因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む成長因子組成物の使用に関する。本発明はまた、１つ以上の組換え動物成長因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む成長因子組成物を使用して細胞培養肉を生産するための細胞を培養する方法に関する。

Description

本発明は、細胞培養技術の分野に属し、具体的には、細胞培養による肉または肉様食品の生産の新たな分野に属する。

培養肉生産は、屠殺のための家畜の従来の飼育の代わりに、組織工学を使用して培養組織から動物の肉を生産するための新しい革新的な技術である。このアプローチには、筋肉組織や脂肪細胞に成長する動物細胞の培養が含まれる。この技術により、従来の肉や魚をベースとした食品と物質的にも栄養的にも同等のタンパク質が豊富な食品が得られる。この技術は、明らかな動物福祉の懸念に加えて、非常に資源を必要とするものであり、飼料作物を栽培するための水と土地の利用がますます増加している、家畜の従来の飼育の必要性を減らす有望な機会と見なされている。また、それは温室効果ガスの排出、森林伐採、汚染、抗生物質耐性など、従来の肉生産の悪影響の多くを軽減する。

食肉生産のエコロジカル・フットプリントに対する意識の高まり、および動物福祉への関心の高まりにより、従来の肉の消費を「実験室で培養した肉」（「インビトロミート」、「クリーンミート」または「細胞培養肉」（ＣＣＭ）なる用語としても知られる）に置き換えるか減らすための最先端のソリューションが提案されている。研究コミュニティ内では、再生医療や組織工学からすでに確立された方法を使用して実験室で肉を培養することが、ＣＣＭを作成するための有望なアプローチであるというコンセンサスがある。

２０４０年には世界の食肉消費量の３５％がＣＣＭになると推定されている。この傾向は、動物福祉の問題と、伝統的な食肉生産の環境への影響を減らす必要性によって推進されている。

現在の家畜生産方法は比較的非効率的であり、飼料から動物性タンパク質への変換率は低く、牛肉で約１．９％、豚で約１３％である。対照的に、スケールアップされたＣＣＭでは、同じ２００ｇのタンパク質を生成するために推定２２５ｇの栄養素（アミノ酸、グルコースなど）が必要である。したがって、ＣＣＭ生産は、従来の牛肉生産よりも約３０～４５倍効率的であると予測されている。

ＣＣＭの傾向は、アジア、特に中国での肉の需要と消費の増加によっても推進されている。事実、国連食糧農業機関（ＦＡＯ）は、食肉の需要が２０５０年までに７０％増加し、４億７０００万トンに達すると推定しており、現在の生産方法は持続可能ではない。事実、肉やその他の動物性タンパク質の消費が急速に増加し、大量の飼料が必要になるため、世界は危機に瀕している。

全体として、ＣＣＭ開発の背後にある原動力は、１）世界で急速に増大している食肉の需要、２）食肉生産の環境への影響に関する懸念の高まり、および３）集約的な家畜生産に関連する動物福祉に関する懸念の高まりである。これにより、ＣＣＭなどの代替肉製品の市場が急速に台頭してきた。これは、消費者が高コスト、動物福祉、または環境問題のために肉の消費を減らしたいと考えているためである。

しかし、これまでに食事サイズ単位の「プロトタイプ」実験肉が成功裏に生産されてきたが、この技術を商業生産するにはコストが高すぎる。

肉の細胞培養生産における非常に重要なコスト要因は、大量の特殊な細胞培養培地の必要性、特に細胞培養培地の最も高価な成分である傾向がある適切な増殖因子タンパク質の必要性から生じる。現在、ＣＣＭ生産のコストの大部分（最大９０％）は増殖因子のコストに左右されており、生産を経済的に実行不可能にしている。

発明の概要
本発明は、少なくとも部分的に、特定の天然植物種子タンパク質が、精製された最終生成物に含まれる場合、精製された増殖因子（ＧＦ）の保存時間を保護および改善できるという発見に基づく。本発明はまた、少なくとも部分的に、これらの天然の種子タンパク質が細胞培養培地中の増殖因子の生物活性を改善し、したがって細胞培養培地の品質を改善できるという発見に基づく。

さらに、これらの種子タンパク質を最終製品に含めることで、下流の処理コストを大幅に削減できる。植物作物のスケールアップの容易さ、効果的な収量、および下流の処理コストの削減という経済的な利点により、全体的なコストを最大１０００倍削減でき、増殖因子のコストという、ＣＣＭ生産における最大の障害を排除できる。

本発明の目的は、細胞培養肉（ＣＣＭ）の生成に特に有用な改良された増殖因子組成物およびサプリメントを提供することである。この目的は、本明細書に記載され特許請求される本発明に従って達成される。

増殖因子は、天然の供給源から供給されるか、一過性またはトランスジェニック宿主生物で組換え的に生成される。組換え増殖因子の植物種子ベースの生産には、食肉生産用の細胞培養培地にとって多くの利点がある。これは、エンドトキシンフリーであり、拡張が容易で、安価な生産プラットフォームである。種子は、組換え増殖因子の天然の長期保存媒体であり、下流処理前の備蓄を容易にし、コストを削減し、ロジスティクスを向上させる。さらに、本明細書に記載の増殖因子の植物ベースの生産は、完全に動物を含まない、すなわち、動物から採取された生体材料を一切使用せずに完全に製造することができ、これは将来のＣＣＭ製品の消費者の大部分にとって非常に有益である。

したがって、第１の態様では、本発明は、細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための、１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む増殖因子組成物またはサプリメントに関する。組換え動物増殖因子は植物由来であり得る、すなわち、組換え動物増殖因子はトランスジェニック植物において産生され得る。

本発明はまた、細胞培養肉の生産のために細胞を培養する方法にも関し、この方法は、（ａ）増殖して肉様組織を生成することができる少なくとも１つの細胞培養物を提供するステップ、および（ｂ）該細胞培養物の増殖および／または細胞分化を維持するための増殖培地を有する該少なくとも１つの細胞培養物を供給するステップ、を含み、この方法は、該増殖培地が、１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む少なくとも１つの増殖因子組成物を含むことを特徴とする。

本発明はまた、増殖因子サプリメントにも関する。したがって、さらなる態様は、増殖因子サプリメント、特に細胞培養肉の生産のための細胞の培養に使用するための増殖因子サプリメントに関する。増殖因子サプリメントは、好ましくは、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物種子材料からの抽出物を含む。抽出物は、好ましくは、約０．１重量％～約９７重量％の範囲で、該植物で発現される１つ以上の組換え動物増殖因子を含む。

本発明のなおさらなる態様は、細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための、１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む増殖因子組成物、ここで、増殖因子組成物は、非動物源であり、好ましくはトランスジェニック植物で生産される、の使用に関する。使用される増殖因子組成物は、好ましくは、本明細書に記載および定義される増殖因子組成物である。

本発明の他の態様は、本発明の増殖因子サプリメントを含む細胞培養培地、特に細胞培養肉（ＣＣＭ）の培養のための細胞培養培地を示す。細胞培養培地は、増殖因子培地と定義され、言及され得る。したがって、本発明の細胞培養培地は、好ましくは、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物種子材料からの抽出物を含む、本明細書に記載の増殖因子サプリメントを含む。

さらに他の態様は、（ａ）細胞培養培地、特に細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための細胞培養培地；および（ｂ）該細胞の増殖を維持するための、本明細書に記載および定義される増殖因子サプリメント、を含むキットを提供する。したがって、キットは、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物種子材料からの抽出物を含むことができ、抽出物は、好ましくは、約０．１重量％から約９７重量％の、該トランスジェニック植物で発現された１つ以上の組み換え動物増殖因子を含む。

本明細書で使用される「細胞培養肉」なる用語は、ＣＣＭと略され、屠殺された動物に代わる、動物細胞のインビトロ培養によって生成される肉を意味する。この用語は、「培養肉」、「実験室培養肉」、「インビトロ肉」、または「クリーンミート」と呼ばれ得る。

本明細書で使用される「非動物」なる用語は、動物に関連しない、または動物に由来しないと理解されるべきである。本明細書に開示される組成物は非動物性である、すなわち、組成物は直接的も間接的にも動物に由来しない。

本明細書で使用される「エンドトキシンフリー」なる用語は、測定可能なエンドトキシンが存在しないことと理解されるべきであり、好ましくはエンドトキシンフリーの物質および組成物は、エンドトキシンを産生しない生物に由来する。

増殖因子（ＧＦ）は、好ましくは、植物生産または植物由来の動物ＧＦであり得、これは、ＧＦがトランスジェニック植物において産生（発現）された動物ＧＦであることを意味する。

図１は、大麦種子タンパク質を含む植物発現組換えＥＧＦを含む培地で増殖させた３Ｔ３細胞の細胞増殖アッセイの結果である。 図２は、植物発現ヒトＦＧＦ－Ｂａｓｉｃと大麦種子タンパク質を含む培地中で増殖させた３Ｔ３細胞の細胞増殖アッセイの結果である。 図３は、異なる量の大麦種子タンパク質を含む大麦産生ＩＧＦ－１サプリメントを含む培地におけるＦＤＣ－Ｐ１細胞の細胞増殖アッセイからの結果である。大腸菌は、比較として使用されるＩＧＦ－１を産生した。 図４は、異なる濃度の大麦種子タンパク質を添加した場合のＥＧＦの安定性を示す。 図５は、ＥＧＦサプリメントの組成を示す染色電気泳動ゲルである。 図６は、ＦＧＦｂａｓｉｃサプリメントの組成を示す染色電気泳動ゲルである。 図７は、大麦種子で発現する５つの異なる成長因子と、他の大麦種子タンパク質を示す。

詳細な説明
食肉に対する需要の高まりと、食肉生産の環境への影響に関する懸念の高まりは、環境と動物福祉が焦点となる細胞培養肉（ＣＣＭ）などの食肉様物質生産における革新を促進した。しかしながら、ＣＣＭが肉の現実的な代替品であるためには、いくつかの要件：
ａ）従来の動物由来の肉と少なくとも同等またはより優れた（味と食感）であること；
ｂ）従来の動物由来の肉と同等（またはそれ以下）の消費者価格に到達すること；
ｃ）世界市場に必要な量が入手可能であること；
ｄ）従来の動物由来の肉と同等またはそれ以上の栄養状態であること；
ｅ）動物福祉の要件を満たすこと；
ｆ）従来の畜肉生産よりも環境的に持続可能であること、
を満たす必要がある。

現在、ＣＣＭは、ｅ）とｆ）を含むこれらの多くを、従来の畜産よりも９９％少ない水消費量と９３％少ない土地と少ない温室効果ガス排出量で既に満たせることは明らかである。

しかしながら、ＣＣＭの生産には、培地の一部として低価格で大量の動物ＧＦが必要である。現在、ＧＦの世界的な生産者は、Ｒ＆Ｄ市場または医薬品市場に少量の、パイロット規模で対応している。生産コストは高く、ＧＦは１ミリグラムあたり数百から数千ユーロの価格で販売されている。これらの価格はＣＣＭ生産にとって非常に高額なものであり、これらの価格が肉１ｋｇあたり数百から数千ユーロに達する細胞培養肉の生産コストにつながるため、新興のＣＣＭセクターの主要なボトルネックとなっている。ＧＦは、細胞培養培地のコストの最大９０％を占める。現在の価格の約１００～１０００分の１のコストで、将来のＣＣＭ生産に必要な大量のＧＦを生産して提供できなければ、ＣＣＭの技術とビジネスを発展させることは考えられない。

したがって、ＣＣＭ生産におけるＧＦコストの割合が非常に高いため、現在は本質的に市場性のない製品になっているＣＣＭの生産を導入する場合、低コストのＧＦの経済的な大規模生産は、世界にとって非常に重要である。

本発明は、例えば、現在のＧＦソリューションよりも大幅に低コストで製造できるＧＦサプリメントとして、細胞培養ＧＦ組成物を提供することにより、これらの問題に対処する。本明細書に開示されたＧＦソリューションを使用すると、ＣＣＭ生産は経済的に実行可能になる。

本発明の他の利点は、肉の細胞培養生産のためのＧＦの商業的生産に重要なレベルまで下流処理コストを劇的に削減することができる、特定の天然貯蔵タンパク質のＧＦとの同時精製のための改変された下流処理に関する。これらの天然の植物貯蔵タンパク質は、非常に驚くべきことに、過剰発現したＧＦに対して非常に有益で驚くべき安定化効果を持つことが判明した。これは、１つ以上の天然の種子タンパク質および典型的にそのようなタンパク質のグループと共精製された成長因子を提供する単純な共精製スキームを利用することで、植物発現ＧＦの精製プロセスがより単純になり、典型的な発現システム、特に細菌システムを使用する場合に必要なより厳密な精製ステップと比較してコストが低くなるだけでなく、同時に得られたＧＦ抽出物は、そのような共精製された植物タンパク質を含まないより高度に精製されたＧＦよりも望ましい特性と驚くべき利点を有することを意味する。

したがって、一態様では、本発明は、以下のステップの１つ以上、好ましくはすべてを順に含むプロセスに関する：種子を収穫する；種子洗浄機または種子選別機で種子を洗浄する；選別された種子を脱皮する；脱皮種子を滅菌し、微粉末に粉砕する；抽出バッファーで総可溶性タンパク質を抽出する；抽出物を清澄化（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）する；例えばアフィニティークロマトグラフィーを使用して特定の親和性を選択するなど、ＧＦとシードタンパク質の同時精製に適した精製を選択する；バッファー交換および無菌製剤（ｆｉｌｌ ａｎｄ ｆｉｎｉｓｈ）。

したがって、一実施形態では、本発明は、以下のステップの１つ以上、好ましくはすべてを順に含むプロセスに関する：種子を収穫する；種子洗浄機または種子選別機で種子を洗浄する；選別された種子を脱皮する；脱皮種子を滅菌し、微粉末に粉砕する；抽出バッファーで総可溶性タンパク質を抽出する；抽出物を清澄化（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ）する；異なるろ過ステップを使用したサイズ分画などの適切な精製ステップによるＧＦとシードタンパク質の同時精製；バッファー交換および無菌製剤（ｆｉｌｌ ａｎｄ ｆｉｎｉｓｈ）。

本発明による増殖因子種子抽出物は、所望の組み換え増殖因子を含む収穫されたトランスジェニック種子をミルで粉砕して微粉末（穀粉）を得ることによって適切に調製できる。すりつぶし／粉砕された材料は、必要に応じて化学的または酵素的に処理して、ベータ－グルカナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼまたはセルラーゼから選択される１つ以上の酵素による酵素処理などにより、所望のトランスジェニックタンパク質の放出を促進できる。次に、最適化された抽出バッファーを粉砕した穀粉に添加し、得られた溶液を（例えば、撹拌により）よく混合する。抽出バッファーは、リン酸緩衝液、ＴＥＳ（２－｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸））、ＭＯＰＳ（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＡＤＡなど、およびそれらの混合物であり得る。バッファーはさらに、抽出プロセスを妨害しない、タンパク質精製バッファーで従来使用される塩およびさらなる成分を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、遠心力などによって液体抽出物から固体を分離し、上清を回収することができる。

このようにして得られたＧＦ抽出物は、本明細書に記載のもの、特に細胞培養肉の生産に適したものなどの従来の細胞培養培地に好適に混合することができる。

このようにして得られた最初の粗トランスジェニック種子抽出物は、さらなる精製および濃縮によってさらに処理できる。有用なクロマトグラフィー精製の一例は、（当業者に知られている従来のバイオテクノロジー法を用いて）ポリＨｉｓタグが付加されている場合に、増殖因子に効果的に結合するＩＭＡＣクロマトグラフィー樹脂を抽出物に添加することを含む。当業者に知られている反復ＨＱ配列、ストレプトアビジンタグ、ポリシステインタグ、ＰＤＺリガンド、ＦＬＡＧエピトープ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグなどを使用するが、これらに限定されない適切なアフィニティー精製と共に、他の有用なアフィニティータグを使用してもよい。抽出物と樹脂の混合物を適切なバッファー中で攪拌した後、ＩＭＡＣ樹脂（または他の親和性樹脂）を遠心分離によって液体から分離することができる。液相を廃棄し、樹脂を適切な洗浄バッファーに再懸濁し、遠沈し、液相を樹脂からデカンテーションする。洗浄は必要に応じて繰り返される。樹脂を適切な溶出バッファーに再懸濁し、遠心分離後、上清を樹脂からデカンテーションし、典型的にはバッファー交換のためにゲルろ過クロマトグラフィー（脱塩）に供する。イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーなどの他の有用なクロマトグラフィー技術を代替的または追加的に使用できる。カラムクロマトグラフィーは、これらの技術のいずれでも使用できるが、拡張床クロマトグラフィー（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などの他の技術も同様に適用できる。

本来の筋肉組織を現実的に模倣するには、細胞と生体材料を適切な条件下で組み合わせて成熟組織を形成する必要があり、これは、ＧＦが重要な添加物となるプロセスである。さらに、消費者のし好に応えるために、ＣＣＭは物理的な外観、匂い、食感、味など、従来の肉の品質を模倣する必要もある。したがって、ＣＣＭには骨格筋細胞だけでなく、結合組織、微小血管網、脂肪組織の成分など、筋肉組織の他の重要な成分も含まれていることが重要である（Pandurangan et.al. 2015）。これらの課題に対処するために使用される技術は、食用足場を使用する足場ベースの技術と、すべての組織関連細胞タイプを共培養してコヒーレントな筋肉組織構造を形成する複数の細胞培養プロトコルを使用する共培養技術を組み合わせた組織工学技術である（Kosnik et.al. 2003; Edelman et.al. 2005）。

ＣＣＭの生産には、胚性幹細胞（ＥＳｃ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）、サテライト筋幹細胞（筋芽細胞）、その他の成体幹細胞（すなわち、間葉系幹細胞や脂肪幹細胞）など、さまざまな種類の幹細胞が使用されている。サテライト細胞は、骨格筋線維の周辺に位置する前駆細胞の集団であり、筋肉組織維持のための主要な細胞源である（Peault, et.al. 2007）。

現在、筋肉生検から分離および培養されたサテライト幹細胞は、ＣＣＭ生産に最も適した細胞源と考えられている（Post et.al., 2012）。サテライト細胞は、ウシ（Dodson, et.al. 1987）、ニワトリ（Yablonka-Reuveni, et.al. 1987）、ラム（Dodson, et.al. 1986）およびブタ（Blanton, et.al. 1999）を含むいくつかの動物種の筋肉から成功裏に分離された。

筋肉再生を調査するための最もよく特徴付けられ、最も広く使用されている衛星細胞モデルの１つは、マウス筋芽細胞幹細胞株Ｃ２Ｃ１２である（Germani, et.al. 2003)。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞は、筋肉の成長に対するＧＦを含む生体材料の効果を研究するために適用される主要な細胞モデルであった（Ben-Arya et.al. 2019）。ＣＣＭのために家畜の筋肉生検から分離されたサテライト細胞は、組織特異的な幹細胞であり、多能性表現型を持たないため、培養で無制限に増殖する能力はない（Peault, et.al. 2007）。最近まで、一般的な懸念は、家畜動物からの安定した、特徴付けられた細胞株が存在しないということであった。幸いなことに、ＣＣＭ生産部門では、科学者グループが現在、ウシ胚盤胞から安定した多能性細胞株を確立することに成功しており（Bogliotti et.al. 2018）、彼らの成功により、家畜からのより安定した細胞株の生成が間違いなく促進されるであろう。ｉＰＳは、ＣＣＭ生産のための可能な細胞ソースとしても注目されている。ｉＰＳ細胞は広く研究されており、動物生検から幹細胞を生成するために常に繰り返されるイベントの時間と労力を削減することにより、ＣＣＭの生産コストを下げる貴重な要因となる可能性がある（Kadim, et.al. 2015）。事実、ＣＣＭの細胞ソースとしてそれらに賭けているＣＣＭ企業はほとんどない。

CＣＭ生産のための理想的な培養培地は、化学的に規定され、正確に選択された栄養素およびＧＦで処方され、動物源フリーでなければならない（Sharma et.al. 2015)。ＧＦは幹細胞の増殖と分化の天然の調節因子であり、幹細胞研究におけるその生物学的重要性は議論の余地がない（Ribeiro, et.al. 2010）。ＧＦは、他の生体材料と組み合わせて、ＣＣＭ生産を含むさまざまな組織工学用途の筋幹細胞の培養にすでに広く利用されている。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞などのサテライト細胞株を使用して、いくつかのＧＦが筋肉の成長と再生の調節における主要な役割を果たしていることが確認されている（Perry et.al. 2000）。

現在までに、過去２０年間の再生医療研究分野における大幅な進歩の結果、多数の動物フリーおよび血清フリー細胞培地製品がＣＣＭ生産用にすでに市販されている（Specht, et.al. 2018）。しかしながら、近年の幹細胞研究において豊富な科学的証拠が蓄積されているにもかかわらず、大規模生産を達成する前に対処しなければならないＣＣＭの非常に高い生産コストが主な原因で、ＣＣＭはまだ一般消費の準備ができていない。主な障害は、培地コストの約９９％と推定されるＧＦのコストである（Ben-Arye et.al. 2019）。したがって、ＧＦははるかに安価である必要があり、動物フリーのソースから、できればエンドトキシンフリーのソース（非細菌性）からも入手する必要がある。

現在、ＣＣＭで使用できるＧＦは、動物細胞、細菌、または酵母を使用したバイオリアクターで作られている。これらの生産システムは、高価すぎてスケールアップが困難であるだけでなく、動物由来であり、エンドトキシンフリーではない（例えば、大腸菌由来）か、細胞培養での活性に問題がある（過剰グリコシル化／不適切な翻訳後の修飾）。これらのシステムは、植物種子のように組換えタンパク質生産のための不活性環境を提供しないため、大麦や米などの作物種子生産システムで生産されるＧＦに必要なレベルを超えてＧＦをより高い純度レベルに精製する必要がある場合がある。さらに、これらの現在利用可能なシステムは、ＣＣＭのマーケティングにおいて重要な一般の認識にも問題があり得る。しかしながら、これらの重要な基準により、トランスジェニック植物でのＧＦ生産は魅力的な代替手段となり、クリーンで費用対効果の高いＧＦの大量生産が可能になり得る（Pandurangan, et.al. 2015）。

植物は、生物的および非生物的ストレスに対抗するために、細胞および分子レベルで洗練されたメカニズムを持っている。非生物的ストレスの結果の１つは、細胞死につながる細胞タンパク質の変性および凝集である。シトクロム（ＣＹＰ）のシャペロン様活性と、ペプチジルプロリル結合異性化によるタンパク質フォールディングの律速段階におけるその役割は、ストレス応答への関与と関連する。多くの植物ＣＹＰの発現はストレスに応答して誘導され、ストレス耐性におけるそれらの機能の可能性を示唆している。例えば、シロイヌナズナのＣＹＰ、ＲＯＴＡＭＡＳＥ ＣＹＣＬＯＰＨＩＬＩＮ １（ＲＯＣ１）の発現は、損傷時に増加する。同様に、トウモロコシおよびマメのＣＹＰ遺伝子発現は、熱ストレス、損傷、高塩分濃度、または低温に反応して増加する（Mainali, H.R. et. al. 2017）。これらおよびその他の発見は、ストレス耐性における植物CYPの役割を示している。したがって、シクロフィリンや関連タンパク質などのＣＹＰタンパク質は、植物で発現するＧＦとの共成分として非常に役立つ植物タンパク質の例である。

オーソドックスな種子は、生息域外保存中に乾燥および／または凍結しても生き残る種子である。オーソドックスな種子の発達の終わりは、構造全体から大量の水分が失われる原因となる、発達的に調節された脱水期間によって代表される。乾燥中、成熟したオーソドックス種子は５～１０％の水分レベルに達し、生存率をほとんどまたはまったく失うことなく、さらに１～５％の水分まで乾燥させることができる。脱水が起こると、細胞質が凝縮し、細胞内成分がより密となる。これらの条件は、オルガネラ－細胞膜融合だけでなく、タンパク質の凝集と変性につながる可能性のある多くの望ましくない相互作用の環境を提供する（Hoekstra et al. 2001）。乾燥耐性の獲得、またはこれらの非常に低い水ポテンシャルとそれに続く分子の密に耐える能力は、タンパク質（および糖）を含むさまざまな保護化合物の蓄積と相関している。

成熟した種子の細胞安定性に大きく寄与する可能性が最も高い２つのクラスのタンパク質には、小さい熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）および後期胚発生蓄積（ＬＥＡ）タンパク質が含まれる。種子の発育後期に蓄積する小さいＨＳＰは、分子シャペロンとして作用することで細胞質凝縮の凝集効果を最小限に抑え、それによってガラス状態の安定化に寄与し得る。ＬＥＡタンパク質は、非常に豊富に存在する熱安定性タンパク質の多様なクラスであり、胚の成熟後期、および種子の発育の終わりに発生的に調節される脱水期に蓄積する。多くの研究は、デヒドリンが分子シャペロンまたは分子シールドとして酵素またはリン脂質に対して保護機能を果たし得ることを報告している。

デヒドリン（ＤＨＮ）、またはグループ２ＬＥＡ（Ｌａｔｅ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｂｕｎｄａｎｔ）タンパク質は、植物の応答および非生物的ストレスへの適応において基本的な役割を果たす。それらは典型的には、成熟する種子に蓄積するか、塩分、脱水、寒冷および凍結ストレスに続いて栄養組織に誘導される。したがって、一部のＬＥＡは植物のライフサイクル中に二重の役割を果たし、発芽中の貯蔵タンパク質として機能するだけでなく、種子の発育中の乾燥耐性においても機能し得る。

成熟した種子に存在する個々のタンパク質の大部分は、代謝または構造上の役割を有するが、すべての種子には、大量に存在し、発芽および苗の成長時に使用するアミノ酸の貯蔵を提供するタンパク質のグループが１つ以上含まれている。

詳細な構造はさまざまであるが、すべての種子貯蔵タンパク質には多くの共通の特性がある。第一に、それらは特定の組織や発生の特定の段階で高レベルで合成される。事実、それらの合成は栄養によって調節されており、余剰窒素の受け皿（ｓｉｎｋ）として機能する。しかしながら、ほとんどはシステインとメチオニンも含んでいるため、合成には十分な硫黄も必要である。多くの種子には、貯蔵タンパク質の別々のグループが含まれており、その中には硫黄アミノ酸が豊富なものもあれば、硫黄アミノ酸が少ないものもある。

種子貯蔵タンパク質の２番目の一般的な特性は、タンパク質体と呼ばれる個別の堆積物で成熟した種子に存在することである。最後に、すべての貯蔵タンパク質画分は、単一の遺伝子型内および同じ種の遺伝子型間で多型を示す成分の混合物である。

穀物種子の総タンパク質含有量は、穀物の乾燥重量の約１０～１５％であり、全体の約半分が貯蔵タンパク質である。穀物種子貯蔵タンパク質は、分泌経路によって産生され、個別のタンパク質体に保存される。

したがって、デヒドリン、プロテアーゼ阻害剤、ホルデイン、後期胚発生蓄積タンパク質 （ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ－応答タンパク質、グロブリン、アルブミン、プロラミン、ビシリン、グルテリン、およびゼインを含む、特定の植物タンパク質は、安定性およびストレスに対する応答性を増加させると信じられている。

オーソドックスな種子が極限の条件に耐えることができる結果、これらの種子に存在するタンパク質の安定性が向上する。これは、例えば大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネなどの植物で発現するトランスジェニックタンパク質によって明らかになる。したがって、そのような植物で発現され、種子に保存されたタンパク質は、長期間にわたって安定性と生物活性を維持することがわかっている。結果として、植物種子中の環境がタンパク質に高い安定性を与えるので、植物種子中のタンパク質の産生は特に有利である。

生物活性タンパク質、例えばＧＦのケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ｔａ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、植物種子中のＧＦなどの生物活性タンパク質の発現は具体的な利点であり得る。これらのＧＦのいずれか、またはこれらのＧＦの任意の２つ以上の組み合わせは、植物の種子で成長させ、そこから完全な生物活性で回収することができる。

本明細書に開示される使用、組成物（サプリメントを含む）、方法およびキットにおいて、植物種子タンパク質は、上記に開示されるものの１つ以上など、植物種子で発現される任意の植物タンパク質であり得る。例えば、植物種子タンパク質は、デヒドリン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答性タンパク質、グロブリン、アルブミン、デヒドリン、プロラミン、ビシリン、グルテリンおよびゼインからなる群から選択される１つ以上のタンパク質であり得る。

本発明における組換えＧＦは、任意の組換え動物ＧＦであり得る。例示的なＧＦには、上に挙げたＧＦのいずれかが含まれる。これらのＧＦのいずれか１つ、またはＧＦの２つ以上の組み合わせを組成物に含めることができる。

組成物は、典型的な実施形態において、組成物の総重量に基づいて、約３重量％から約９９．９重量％、例えば約５重量％から約９９．９重量％、約１０重量％から約９９．９重量％、または約２０％から約９９．９％の１つ以上の種子タンパク質を含むことができる。範囲の下端は、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１２％、約１４％、約１６％、約１８％、または約２０％などの、約３％から約２０％の範囲であり得る。範囲の上限は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％または約９９．９％など、約９０％から約９９．９％、約９５％から約９９．９％などのように、約８０％から約９９．９％であり得る。

組成物は、いくつかの実施形態において、約０．２％から、または約０．３％から、または約０．４％から、または約０．５％から、または約１％から、または約５％から、約９７％まで、または約９５％まで、または約９０％まで、または約８５％まで、または約８０％まで、または約７５％まで、または約７０％までの範囲など、約０．１％から約９７％の範囲で、１つ以上のＧＦ、特に組換え動物ＧＦを含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、約１０％から約３０％の範囲の１つ以上のＧＦを含む。

本明細書に記載の組成物の明確な利点は、動物汚染がなく、エンドトキシンもないことである。組成物は非動物源由来であり、これは、血清、エンドトキシン、および抗生物質などの天然の動物成分が組成物に存在せず、ヒトまたは動物の感染因子または他の内因性哺乳動物汚染因子（例えば、望ましくないＧＦまたはサイトカイン）も存在しない。

本発明の組成物は好ましくは非動物性である、すなわち、組成物は非動物源に由来する。組成物は、好ましくは植物由来であり、これは、組成物が、大腸菌などのグラム陰性菌から産生および放出される細菌エンドトキシンも含まないことを意味する。

したがって、植物での分子農業によるＧＦの生産は、非常に望ましい製品をもたらす。さらに、生成物（ＧＦ）を植物抽出物として回収することにより、収量が大幅に増加し、生産コストが削減される。個々のＧＦの下流精製は、ＣＣＭにとって莫大な費用がかかるが、ＧＦは植物種子混合物中でその生物活性を保持し、成長培地のサプリメントとして、または成長培地中ですぐに使用できるため、本明細書に開示する組成物には必要ない。驚くべきことに、かつ有利なことに、これは、細胞培養培地中に存在する場合、より活性でより安定な増殖因子として現れる増殖因子サプリメントの改善された特性をもたらす。

前述から明らかなように、本明細書に記載の組成物は、コスト効果の高いＣＣＭ培養での使用に関するいくつかの重要な特徴を満たすため、ＣＣＭの生成に特に有用である。したがって、組成物中のＧＦは、植物種子タンパク質の存在により、長期保存の間安定である。それにより、組成物は、増殖培地での使用まで、ＧＦの生物活性の損失を最小限に抑えるかまたはまったく損失せずに保存することができる。

組成物は、例えば増殖培地のサプリメントとして、使用するまで保存することができる。組成物は、使用の直前（すなわち、細胞培養での使用の直前）に培地に添加するか、または培地を一緒にするときに培地に添加することができる。いずれの場合も、組成物は別々の容器に保存することができ、長期間保存しても安定している。

ＧＦ組成物は乾燥形態で、例えば凍結乾燥植物抽出物、またはＧＦまたはＧＦ抽出物と特定の植物種子タンパク質、例えばデヒドリン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答タンパク質、グロブリン、アルブミン、デヒドリン、プロラミン、ビシリン、グルテリン、およびゼインの１つ以上、の乾燥組み合わせ物として、提供することができる。

あるいは、ＧＦ組成物は、液体形態で提供され、使用前に増殖培地に添加され得る。好ましくは、そのような液体組成物は水性であり、任意に１つ以上のバッファー、塩または他のタンパク質安定化剤を含むことができる。ＧＦ組成物はまた、グリセロール、アミノ酸、糖類（単糖類および／または多糖類）、ビタミン、および無機微量元素を含むがこれらに限定されない他の適切な賦形剤を含むことができる。

組成物はまた、乾燥形態または液体形態のいずれかで、増殖培地に直接添加することもできる。増殖培地と組み合わせると、最終培地に含まれるＧＦの濃度は、いくつかの実施形態では、０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約２％（ｗ／ｖ）の範囲、約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約１％（ｗ／ｖ）の範囲、約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約０．５％（ｗ／ｖ）の範囲、約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約０．１％（ｗ／ｖ）の範囲、約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約０．０５％（ｗ／ｖ）の範囲、または約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。

増殖培地は、細胞培養肉の生成のために、必須アミノ酸、非必須アミノ酸を含むアミノ酸の１つ以上、単糖、ビタミン、無機イオン、微量元素を含む、動物細胞の増殖を維持するために必要な栄養成分を含むことができる。増殖培地は、ソマトメジンおよび／またはホルモンをさらに含んでもよい。

増殖培地は、動物細胞を増殖させるための当技術分野で知られている任意の増殖培地であり得る。一般に、増殖培地は、血清ベース、例えば、ヒト血清、ウシ血清（ウシ血清、新生ウシ血清および／またはウシ胎児血清）、またはウマ血清に基づく培地であり得る。

増殖培地はさらに、またはあるいは、人工的／合成的または設計されたもの、すなわち、ビタミン、塩、タンパク質、炭水化物、補因子、溶存Ｏ_２およびＣＯ_２などの必要な栄養素を一緒に追加することによって作成された成長培地であり得る。

特許請求の範囲を含む本明細書で使用されるように、単数形の用語は複数形も含むと解釈されるべきであり、その逆もまた同様である。したがって、本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。

明細書および特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｅ）」という用語、およびそれらの変形は、「含むがこれに限定されない」を意味すると理解されるべきであり、他の構成要素を排除することを意図するものではない。

本発明はまた、特徴、値、および範囲などが、約、周囲、一般に、実質的に、本質的に、少なくともなどの用語と併せて使用される場合、これらの用語は、正確な用語、特徴、値、および範囲などをカバーする（すなわち、「約３」は正確に３も含む、または「実質的に一定」は正確に一定も含む）。

「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると理解されるべきであり、したがって、１つ以上の構成要素を含む両方の実施形態を含む。さらに、「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を使用して特徴を説明する独立項を参照する従属項は、特徴が「その（ｔｈｅ）」および「少なくとも１つ（ｔｈｅ ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」で参照される場合の両方で同じ意味を持ちます。

本発明の範囲内にありながら、本発明の前述の実施形態に対する変更を行うことができることを理解されたい。明細書に開示された特性は、別段の記載がない限り、同じ、同等または同様の目的を果たす代替特性に置き換えることができる。したがって、別段の記載がない限り、開示された各特徴は、一連の同等または類似の特徴の一般的な一例を表す。

「たとえば（ｆｏｒ ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」、「たとえば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」などの例示的な言葉の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、特許請求されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載されているステップは、文脈上明確に示されていない限り、任意の順序で、または同時に実行することができる。

本明細書に開示されたすべての特徴および／またはステップは、特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。特に、本発明の好ましい特徴は、本発明のすべての態様に適用可能であり、任意の組み合わせで使用することができる。

本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。

実施例１：種子にＥＧＦを発現させた形質転換大麦および精製
遺伝的に形質転換されたＨｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ大麦品種は、大麦種子から単離された未熟胚（ＩＥ）の標準的なアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換により、大麦におけるコドン使用頻度に従ってコドン最適化され、遺伝子の高い種子特異的発現を保証する種子特異的プロモーターによって駆動される遺伝子発現カセットにクローニングされた表皮増殖因子、ＥＧＦをコードする合成遺伝子を用いて生成された。

これに、清澄キャビネット内の適切な培地でＩＥを組織培養し、得られた小植物を選択し、それらを土壌または任意の適切な成長マトリックスに移し、適切な気候条件下でそれらを成長させ、スクリーニングのために成熟した種子を収穫し、ＥＬＩＳＡやウエスタンブロット分析などの標準的なタンパク質アッセイ法により、標的タンパク質ＥＧＦの強力な産生が続いた。

選択された系統は、種子を収穫し、続いて種子洗浄機または種子選別機で種子を洗浄し、選別された種子を脱皮し、脱皮した種子を滅菌し、乾式粉砕または湿式粉砕により粉砕して微粉末、典型的には直径１００～４００μｍの範囲の粒子サイズ、最適な粒子サイズは直径２５０μｍ前後、とし、抽出バッファー内の総可溶性タンパク質を抽出し、抽出物を清澄化、ＥＧＦと特定のシードタンパク質の共精製のための特定のアフィニティー技術を選択し、アフィニティークロマトグラフィーを使用し、ＥＧＦと特定のシードタンパク質の共精製のためのストリンジェントで適切なアフィニティー条件を選択し、交換および無菌製剤（ｆｉｌｌ ａｎｄ ｆｉｎｉｓｈ）を行う、種子の生産のための第２世代および第３世代にさらに拡大された。

大麦種子タンパク質とＥＧＦの抽出には、マンニトールやトレハロースなどの高濃度のＥＧＦ用タンパク質安定化剤を含むまたは含まない、５０ｍＭ リン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０～８．０のリン酸バッファー、またはマンニトールやトレハロースなどの高濃度のＥＧＦ用タンパク質安定化剤を含むまたは含まない、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０のＴｒｉｓバッファー、などの抽出バッファーが用いられる。

アフィニティークロマトグラフィーの前に抽出物を清澄化するために、抽出物を１０℃で１０分間、５０００×Ｇで遠心分離する。

典型的には、利用されるアフィニティー技術には、バッチモードの標的タンパク質結合または拡張床吸着（ＥＢＡ）カラム、または種子の胚乳コンパートメントで発現されたヒスチジンタグ付きＥＧＦ上のニッケルとヒスチジンの相互作用を使用するＦＰＬＣ装置を備えたパックドモードの固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）がある。パックドモードカラムとＦＰＬＣの使用を容易にするために、大麦抽出物はまずタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）でパックドカラムにロードする前にろ過される。ＥＧＦと共精製された特定の種子タンパク質は、最適化に続いてイミダゾールの濃度を上げてカラムから溶出される。

実施例２：増殖因子抽出物の製造
トランスジェニック植物：種子中に異種ヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）を発現する大麦植物は、次のようにして得られた：
５３ａａのヒトＥＧＦのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｎｏ．ＮＰ００１９５４．２）は、大麦のコドン使用に関して最適化されたコドンであり（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＵＳＡ）、その後、大麦の０．４２ｋｂ Ｄホルデインプロモーターの制御下で発現カセットを調製するために使用された（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｎｏ Ｘ８４３６８）。６ａａヒスチジンタグをＥＧＦタンパク質のＮ末端に融合させた。天然のＮ末端Ｄホルデインシグナルペプチドを使用して、組換えタンパク質を小胞体に標的化した。この発現カセットをバイナリーベクターにクローニングした。

Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ． Ｃｖ Ｇｏｌｄｅｎ Ｐｒｏｍｉｓｅ植物は、約６５～８５日間、または開花後約３～２０日まで栄養生長した。大麦の頭を選択し、種子を７０％エタノールと３％次亜塩素酸ナトリウムでロータリーシェーカーで２０分間滅菌し、未熟胚を種子から取り出し、基本的にＴｉｎｇｅｙらによって説明されているように再生培地に置いた。

ＥＧＦバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＡＧＬ０）培養物を各外植片にピペットで移した（使用した培養物のＯＤ値は約０．７であった）。 過剰なアグロバクテリウム・ツメファシエンスを除去した後、外植片を新鮮な再生培地プレートに移し、２４℃の暗いキャビネットに入れた。１日後、外植片を３０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢを添加した新鮮な再生培地に移し、４～６週間放置した。シュートの再生は基本的に、Ｔｉｎｇｅｙらによって記述されているように行われた。カルスをシュート誘導培地（ＳＩＭ）に移し、生き残ったカルスと再生シュートを２週間ごとに新鮮なＳＩＭに移し、これらを小さな苗木が形成されるまで続けた。次に、小さな苗木を、２０μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを含む根誘導培地（ＲＩＭ）に移し、生き残った植物を土壌に植えた。すべての形質転換体を組換えＥＧＦタンパク質の発現について分析した。

各トランスジェニック系統から、最初の種子世代（Ｔ１種子）からの４つの種子を分析のために無作為に選択した。種子は、機械的な力で粉砕し、次いでＲｅｔｓｃｈ ＭＭ３０１ビーズミル（Ｑｉａｇｅｎ）で９６ディープウェルマイクロプレート形式で粉砕した。水溶性タンパク質は、５００μＬの５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０で抽出することにより、粉砕された種子から抽出された。抽出は、ビーズミルで混合することにより室温で１時間行い、粗タンパク質抽出物を４℃で３０００×ｇで５分間遠心分離することにより清澄化した。清澄化された抽出物を収集し、ＥＧＦ標的タンパク質の定量分析に使用した。種子中の標的タンパク質の蓄積は、製造元の指示に従って、市販のＥＧＦサンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。この実験では、種子中のＥＧＦの含有量は５００ｍｇ／ｋｇの範囲であると測定された。

増殖因子抽出物：得られたトランスジェニック大麦植物から収穫した種子をミルで粉砕して微粉末（穀粉）を得ることにより、トランスジェニック植物抽出物を調製した。抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０）を、抽出緩衝液対粉砕穀粉が５／１の体積／重量比で粉砕大麦粉に添加した。得られた溶液を４℃で６０分間攪拌した。遠心力によって液体抽出物から固形物を分離し、冷蔵遠心機（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｐｒｉｍｏ Ｒ）で８３００ｒｐｍで１５分間以上遠心分離し、上清を新しいバイアルにデカントした。得られた水性抽出物の異種増殖因子の含有量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。この実験では、ＥＧＦ含有量は未精製抽出物のタンパク質含有量の約０．１％であった。

実施例３：培地組成物
ここでは筋芽細胞と呼ばれる筋幹細胞を培養するための、基礎培地、バッファーシステム、グルタミン、血清（または血清代替物）、トランスジェニック植物から抽出された特定の増殖因子、および追加のサプリメントを含む培地組成物が生成された。

非常に純粋で規定された幹細胞培地を使用することは、連続培養適用の鍵である。幹細胞培養用の基礎培地は、細胞の種類と、増殖または分化をサポートする細胞挙動の意図した調節に応じて、具体的に選択する必要がある。

ＣＣＭ培地は、通常、増殖培地（拡張培地）と分化培地の２種類の培地に分けられる。 通常、増殖培地には高濃度の血清（１０％～２０％）が含まれるが、分化培地には低濃度の血清（１％～５％）が含まれているか、完全に血清フリーである。筋芽細胞の培養に最も一般的に使用される基礎培地は、（ａ）ＤＭＥＭ、（ｂ）Ｆ－１２、（ｃ）ＲＰＭＩ－１６４０、（ｄ）ＭＣＤＢ１２０、またはそれらの組み合わせである。

増殖のために増殖培地に一般的に添加される増殖因子は、１～２０ｎｇ／ｍｌの濃度の ＦＧＦｂ、ＩＧＦ－１、およびＥＧＦであり、分化培地に一般に添加される増殖因子は、１～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ－１、ＥＧＦ、ＮＲＧ１、およびＧＤＮＦである。

実施例４：大麦由来の増殖因子を含むＤＭＥＭ
筋芽細胞の増殖と分化の両方をサポートすることが知られている基礎培地の例は、高濃度グルコース、Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウムを含む関連するバッファーシステム及び他の必須基礎要素を含む、高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）であり、これはさらに、血清（ＦＢＳ、ウシ胎児血清またはＨＳ、ウマ血清）、ＩＴＳ（インスリン－トランスフェリン－セレン）、ＮＡＡ（非必須アミノ酸）、デキサメタゾン、アルブミン（ＢＳＡ）、増殖因子、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリンおよびストレプトマイシン）が追加的に補足されている。

基礎培地、血清の種類、成分濃度、および増殖因子の供給源の組み合わせに関して、ＣＣＭ分野ではいくつかのバリエーションが見られる。好ましくは、培養培地は、化学的に規定され、血清フリーであり、動物源および感染因子を含まないものであるべきである。

筋幹細胞またはサテライト細胞の増殖のために増殖培地に一般的に添加される増殖因子は、１～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦｂ、ＩＧＦ－１およびＥＧＦであり、分化培地に一般的に添加される増殖因子は１～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ－１、ＥＧＦ、ＮＲＧ１およびＧＤＮＦである。

実施例５：ＭＳＣおよびＡＤＳＣの培地
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および脂肪由来間質細胞（ＡＤＳＣ）を培養するための、基礎培地、低グルコース、バッファーシステム、グルタミン、血清（または代替血清）、トランスジェニック植物から抽出された特定の増殖因子、および追加のサプリメントを含む、培地組成物が生成された。

非常に純粋で規定された幹細胞培地を使用することは、連続培養適用の鍵である。幹細胞培養用の基礎培地は、細胞の種類と、増殖または分化をサポートする細胞挙動の意図した調節に応じて、具体的に選択する必要がある。

典型的には、ＭＳＣおよび／またはＡＤＳＣから脂肪細胞を生成するために使用される特定の脂肪生成培地（分化培地）は、通常、Ｌ－グルタミンおよび１０％血清を含む基礎培地ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２に基づいており、通常、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸－２－リン酸のような他の必須要素が追加されており、さらにトリヨードチリオニン、ヒドロコルチゾン、イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、ロシグリタゾンおよびインスリンが補充されている。基礎拡張培地と特定の脂肪生成培地の組み合わせ、血清の種類、成分濃度、および増殖因子の供給源には、いくつかのバリエーションが見られる。好ましくは、培養培地は、化学的に規定され、血清フリーであり、動物源および感染因子を含まないものであるべきである。

ＭＣＳ増殖のために増殖培地に一般的に添加される増殖因子は、１～２０ｎｇ／ｍｌ の濃度のＦＧＦｂ、ＩＧＦ－１およびＥＧＦであり、脂肪生成分化培地に一般的に添加される増殖因子は、１～２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦ－１、ＥＧＦ、ＩＬ－６、ＬＩＦ、ＮＲＧ１およびＧＤＮＦである。

実施例６：３Ｔ３細胞増殖に対するＥＧＦを含むＤＭＥＭ中の共精製大麦種子タンパク質の効果
大麦生産の３０％の純粋なヒト上皮増殖因子を含む、または３０％ＥＧＦと７０％特異的大麦種子タンパク質を含む成長因子サプリメントを、２ｍＭグルタミンと１０％仔牛血清組成物を含むＤＭＥＭ培地に添加し、０～１ｎｇ／ｍｌ培地の濃度の３Ｔ３細胞を、３７°Ｃで４４時間インキュベートし、細胞増殖アッセイを行った。比較として、大麦生産の９７％の純粋なヒトＥＧＦ、または９７％ＥＧＦと３％のみの特異的な大麦種子タンパク質を、３Ｔ３細胞を使用する細胞増殖アッセイのために、０～１ｎｇ／ｍｌ培地の濃度で培地組成物に添加した。細胞増殖は、４９０ｎｍで光学密度を測定することによってモニタリングされ、結果は図１に示される。ヒトＥＧＦと大麦種子タンパク質の両方を含む培地、およびヒトＥＧＦのみを含む培地では、細胞増殖に顕著な変化があったが、大麦を含む場合は、高度に精製されたＥＧＦを含む、または９７％ＥＧＦおよび３％のみの特異的な大麦種子タンパク質を含む同じ培地と比較して、約１桁低いＥＧＦ濃度で１のＯＤが達成された。

実施例７：３Ｔ３細胞増殖に対するＦＧＦｂを含むＤＭＥＭ中の共精製大麦種子タンパク質の効果
３Ｔ３細胞を用いた細胞増殖アッセイのために、特定の植物種子タンパク質を含むオオムギ産生線維芽細胞増殖因子塩基性を、２ｍＭグルタミンおよび１０％仔牛血清組成物を含むＤＭＥＭ培地に添加した。参照として、特定の植物種子タンパク質を含まない３Ｔ３細胞を使用した細胞増殖アッセイ用の培地組成物に、大麦産生線維芽細胞増殖因子塩基性を添加した。

細胞増殖は、４９０ｎｍで光学密度を測定することによってモニタリングされ、結果は図２に示される。ここでも、ヒトＦＧＦｂおよび大麦種子タンパク質を含む培地では細胞増殖に顕著な変化があり、大麦種子タンパク質がＦＧＦｂとともに存在する場合、微少な量の大麦種子タンパク質量、または９７％ＦＧＦおよび３％の大麦種子タンパク質の培地と比較して、２５％ＦＧＦｂと７５％オオムギ種子タンパク質の比率で、約１桁低いＦＧＦｂ濃度で１のＯＤが達成された。

実施例８：ＦＤＣ－Ｐ１細胞増殖に対するＩＧＦ－１を含むＤＭＥＭ中の共精製大麦種子タンパク質の効果
大麦生産のインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）をＩＧＦ－１の純度が２５％または５％で含む増殖因子サプリメント、それぞれ２５％のＩＧＦ－１と７５％の特定の大麦種子タンパク質比率、および５％ＩＧＦ－１および９５％特異的な大麦種子タンパク質である、をＦＤＣ－Ｐ１細胞を使用した細胞増殖アッセイのために、１％ＦＢＳおよび１０ｐｇ／ｍｌ ＩＬ－３を含むＤＭＥＭ培地組成物に添加し、参照としての純度９８％の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生ＩＧＦ－１増殖因子と比較した。

細胞増殖は、４９０ｎｍで光学密度を測定することによってモニタリングされ、結果は図３に示される。ここでも、ヒトＩＧＦ－１と大麦種子タンパク質の両方を含む培地では、大腸菌で産生されたＩＧＦ－１と比較して、細胞増殖に顕著な変化があり、オムギ種子タンパク質が７５％で存在する場合は１桁低い、オオムギ種子タンパク質が９５％で存在する場合は２桁低いＩＧＦ－１濃度で１のＯＤが達成された。１％ＦＢＳおよび１０ｐｇ／ｍＬマウスＩＬ－３を含むＤＭＥＭを使用して実験を繰り返した場合、同様の結果が得られた。

実施例９：サプリメント中の大麦種子タンパク質の濃度が異なる場合のＥＧＦの安定性
異なる濃度の特定の大麦種子タンパク質、より具体的にはサプリメント中のそれぞれ９５％および７０％の大麦種子タンパク質、残りは大麦生産ＥＧＦを含む大麦生産ＥＧＦサプリメント。図４。サプリメントは、４８％グリセロールおよび０．５％ＮａＣｌ中、室温（２３°Ｃ）で保存された。安定性（ＥＧＦの残存）は、２か月後と４か月後に評価された。濃縮度の低いサプリメント、つまり９５％の植物性タンパク質を含むサプリメントは、著しく高い安定性を示し、２か月後には９３％のＥＧＦが残存し、４か月後には７０％が残存し、これに対して７０％の植物性タンパク質を含むサプリメントはそれぞれ６６％および５４％であった。結果を図４に示す。

実施例１０：ＥＧＦサプリメント組成物の特徴
ＥＧＦを生成する収穫された大麦種子を乾燥させ、種子選別機で洗浄し、脱皮し、滅菌してから微粉末に粉砕し、５０ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌおよびｐＨ７．０～８．０中で粉砕粉末から総水溶性タンパク質を抽出し、その後、ＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィーで精製する前に、５０００×Ｇの力で１０℃で１０分間遠心分離機して清澄化した。溶出されたタンパク質には、３０％のＥＧＦと７０％の天然大麦種子タンパク質が含まれる。カラムから溶出されたＥＧＦおよび共精製された天然大麦種子タンパク質、およびローディングバッファー中の１０μＬのサンプルを１２％ Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードし、２００Ｖで４５分間泳動し、続いてクーマシー染色を行った。切除された染色されたバンドと、ゲル内トリプシン消化によるタンパク質の分析と同定、それに続く質量分析（ＭＳ）。ＥＧＦに加えて同定されたタンパク質には、図５に示されるように、胚グロブリン、デヒドリン、セルピン、シクロフィリン、およびサブチリシン阻害剤が含まれる。

実施例１１：ＦＧＦｂａｓｉｃ「粗製」サプリメント組成物の特徴
ＦＧＦｂを生成する収穫された大麦種子を乾燥させ、種子選別機で洗浄し、脱皮し、滅菌してから微粉末に粉砕し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ２－メルカプトエタノール、ｐＨ８．０で粉砕粉末から総水溶性タンパク質を抽出し、その後ＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィーで精製する前に、５０００×Ｇの力で１０℃で１０分間遠心分離機で清澄化した。カラムから溶出されたＥＧＦおよび共精製された天然大麦種子タンパク質、およびローディングバッファー中の１０μＬのサンプルを１２％ Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードし、２００Ｖで４５分間泳動し、続いてクーマシー染色を行った。溶出されたタンパク質には、３０％のＦＧＦｂと７０％の天然オオムギ種子タンパク質が含まれる。切除された染色されたバンドと、ゲル内トリプシン消化によるタンパク質の分析と同定、それに続く質量分析（ＭＳ）。ＦＧＦｂに加えて同定されたタンパク質には、図６に示すように、胚グロブリン、ＬＥＡ、β－アミラーゼ、セルピン、サブチリシン阻害剤、チオニン、およびデフェンシンが含まれる。

実施例１２：大麦種子において、他の大麦種子タンパク質と共に発現された異なる増殖因子
乾燥した場所で５つの異なる増殖因子を発現する５つの異なるトランスジェニック大麦系統から収穫された大麦種子；これらには、それぞれ、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ－１）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ノギン、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、およびインターロイキン６（ＩＬ－６）が含まれていた。各系統からの種子を種子選別機で洗浄し、脱皮し、滅菌してから微粉末に粉砕し、５０ｍＭリン酸カリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌおよびｐＨ７．０～８．０で粉砕粉末から全水溶性タンパク質を抽出した後、ＩＭＡＣアフィニティークロマトグラフィーで精製する前に、５０００Ｇの力で１０℃で１０分間遠心分離機で清澄化した。溶出されたタンパク質は、それぞれの場合において、１０％から３０％の範囲のそれぞれの増殖因子および７０％から９０％の範囲の天然大麦種子タンパク質を含む。増殖因子、および共精製された天然大麦種子タンパク質を８つの別々の１２％ Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードし、２００Ｖで４５分間泳動した後、クーマシー染色を行った。各増殖因子および共精製された天然大麦種子タンパク質のサンプルも、図７に示されるように、別の１２％ Ｎｕｐａｇｅ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードし、ポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＨＲＰまたは検出のためのポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＨＲＰを使用するウエスタンブロット分析に供された。

特定の実施形態
１．細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための、１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む増殖因子組成物の使用。

２．該１つ以上の植物種子タンパク質が、デヒドリン、プロテアーゼ阻害剤、ホルデイン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答性タンパク質、グロブリン、アルブミン、プロラミン、ビシリン、グルテリンおよびゼインからなる群から選択される、実施形態１に記載の使用。

３．該組換え動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、実施形態１または２に記載の使用。

４．増殖因子組成物が約３重量％から約９９．９重量％の範囲の１つ以上の種子タンパク質を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の使用。

５．増殖因子組成物が約０．１重量％から約９７重量％の範囲の１つ以上の組換え動物増殖因子を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の使用。

６．増殖因子組成物が非動物源由来であり、好ましくはトランスジェニック植物で産生される、前述の実施形態のいずれか１つに記載の使用。

７．増殖因子組成物が実質的にエンドトキシンフリーである、前述の実施形態のいずれか１つに記載の使用。

８．増殖因子組成物が、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物種子材料からの抽出物である、前述の実施形態のいずれかに記載の使用。

９．該組換え増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質が、細胞が培養される細胞培養培地に添加される、前述の実施形態のいずれかに記載の使用。

１０． ａ．増殖して肉様組織を生成することができる少なくとも１つの細胞培養物を提供すること、および
ｂ．該細胞培養物の増殖を維持するための増殖培地を有する少なくとも１つの細胞培養物を供給すること、
を含み、該増殖培地が、１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む少なくとも１つの増殖因子組成物を含むことを特徴とする、細胞培養肉の生産のために細胞を培養する方法。

１１．増殖培地中の増殖因子の濃度が、約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは約０．０００００１％から約０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲である、前述の実施形態に記載の方法。

１２．１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質が、増殖培地に添加される増殖因子サプリメントとして提供される、前述の２つの実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１３．増殖因子サプリメント中の１つ以上の組換え動物増殖因子の量が、約０．１重量％から約９７重量％の範囲である、前述の実施形態に記載の方法。

１４．該１つ以上の植物種子タンパク質が、デヒドリン、プロテアーゼ阻害剤、ホルデイン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答性タンパク質、グロブリン、アルブミン、プロラミン、ビシリン、グルテリンおよびゼインからなる群から選択される、前述の４つの実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１５．該組換え動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、前述の５つの実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１６．増殖因子組成物が非動物源由来であり、好ましくはトランスジェニック植物で産生される、前述の６つの実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１７．増殖因子組成物が実質的にエンドトキシンフリーである、前述の７つの実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１８．増殖因子組成物が、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物材料からの抽出物である、前述の８つの実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１９．増殖因子サプリメント、特に細胞培養肉の生産のための細胞の培養に使用するための増殖因子サプリメントであって、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物材料からの抽出物を含む増殖因子サプリメント。

２０．該抽出物が約０．１重量％から約９７重量％の範囲で１つ以上の組換え動物増殖因子を含む、前述の実施形態に記載の増殖因子サプリメント。

２１．抽出物が、デヒドリン、プロテアーゼ阻害剤、ホルデイン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答性タンパク質、グロブリン、アルブミン、プロラミン、ビシリン、グルテリンおよびゼインからなる群から選択される１つ以上の天然植物種子タンパク質を含む、前述の２つの実施形態のいずれか１つに記載の増殖因子サプリメント。

２２．抽出物が約３％～約９９．９％の範囲の１つ以上の植物種子タンパク質を含む、前述の３つの実施形態のいずれか１つに記載の増殖因子サプリメント。

２３．該組換え動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、前述の４つの実施形態のいずれか１つに記載の増殖因子サプリメント。

２４．エンドトキシンフリーである、実施形態１９～２３のいずれかに記載の増殖因子サプリメント。

２５．乾燥製剤および水性製剤から選択される、実施形態１９～２４のいずれかに記載の増殖因子サプリメント。

２６． －その種子にトランスジェニック動物増殖因子を発現する植物を提供し、成熟した種子が得られるまで該植物を成長させること、
－該種子を収穫すること、
－種子洗浄機または種子選別機で種子を洗浄すること、
－洗浄または選別された種子を脱皮すること、
－脱皮種子を滅菌し、微粉末に粉砕すること、
－抽出バッファーで可溶性タンパク質を抽出すること、
－抽出物を清澄化すること、
－任意に、抽出物からの該増殖因子をさらに精製すること、
を含む、増殖因子サプリメント、特に細胞培養肉生産のための細胞培養培地を補充するための増殖因子サプリメントを製造する方法。

２７．該トランスジェニック動物増殖因子にアフィニティータグが提供され、方法が該動物増殖因子のアフィニティー精製を含む、実施形態２６に記載の方法。

２８．該トランスジェニック動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、実施形態２６または２７の方法。

２９．該植物が、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群より選択される、実施形態２６～２８のいずれかに記載の方法。

３０．該得られた抽出物を乾燥させるステップをさらに含む、実施形態２６～２９のいずれかに記載の方法。

３１．該得られた増殖因子サプリメントを細胞培養培地に混合し、細胞培養肉（ＣＣＭ）を培養するのに適した補充された細胞培養培地を得ることをさらに含む、実施形態２６～３０のいずれかに記載の方法。

３２．実施形態１９～２５に記載の増殖因子サプリメントを含む細胞培養培地。

３３．細胞培養培地が約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）、好ましくは約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲の組換え動物増殖因子を含む、前述の態様の細胞培養培地。

３４． ａ．細胞培養培地、特に細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための細胞培養培地；および
ｂ．該細胞の増殖を維持するための増殖因子サプリメント、
を含むキット。

３５．細胞培養培地および増殖因子サプリメントが、使用前に混合されるように別個の容器にて提供される、前述の実施形態に記載のキット。

３６．増殖因子サプリメントが、実施形態１９～２５のいずれかに記載の増殖因子サプリメントである、前述の２つの実施形態のいずれか１つに記載のキット。

参照文献
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Claims (27)

1. 細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための、１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む増殖因子組成物の使用であって、増殖因子組成物が非動物源由来であり、好ましくはトランスジェニック植物で生産される、使用。
2. 該１つ以上の植物種子タンパク質が、デヒドリン、プロテアーゼ阻害剤、ホルデイン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答性タンパク質、グロブリン、アルブミン、プロラミン、ビシリン、グルテリンおよびゼインからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
3. 該組換え動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
4. 増殖因子組成物が約３重量％から約９９．９重量％の範囲の１つ以上の種子タンパク質およびが約０．１重量％から約９７重量％の範囲の１つ以上の組換え動物増殖因子を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の使用。
5. 増殖因子組成物が、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物種子材料からの抽出物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。
6. 該組換え増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質が、細胞が培養される細胞培養培地に添加される、請求項１～５のいずれか１項に記載の使用。
7. ｂ．増殖して肉様組織を生成することができる少なくとも１つの細胞培養物を提供すること、および
   ｃ．該細胞培養物の増殖および／または分化を維持するための増殖培地を有する該少なくとも１つの細胞培養物を供給すること、
   を含み、該増殖培地が、１つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質を含む少なくとも１つの増殖因子組成物を含むことを特徴とし、該増殖因子が非動物源由来であり、好ましくはトランスジェニック植物で生産される、細胞培養肉の生産のために細胞を培養する方法。
8. 増殖培地中の増殖因子の濃度が、約０．０００００１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の範囲、好ましくは約０．０００００１％から約０．０１％（ｗ／ｖ）の範囲である、請求項７に記載の方法。
9. １つ以上の組換え動物増殖因子および１つ以上の植物種子タンパク質が、増殖培地に添加される増殖因子サプリメントとして提供される、請求項７または８に記載の方法。
10. 増殖因子サプリメント中の１つ以上の組換え動物増殖因子の量が、約０．１重量％から約９７重量％の範囲である、請求項９に記載の方法。
11. 該１つ以上の植物種子タンパク質が、デヒドリン、プロテアーゼ阻害剤、ホルデイン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答性タンパク質、グロブリン、アルブミン、プロラミン、ビシリン、グルテリンおよびゼインからなる群から選択される、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 該組換え動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 増殖因子組成物が、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物材料からの抽出物である、請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 増殖因子サプリメント、特に細胞培養肉の生産のための細胞の培養に使用するための増殖因子サプリメントであって、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群から選択されるトランスジェニック植物材料からの抽出物を含み、抽出物が約０．１重量％から約９７重量％の範囲で１つ以上の組換え動物増殖因子を含み、抽出物が、デヒドリン、プロテアーゼ阻害剤、ホルデイン、後期胚発生蓄積タンパク質（ＬＥＡ）、シクロフィリン、ＡＢＡ応答性タンパク質、グロブリン、アルブミン、プロラミン、ビシリン、グルテリンおよびゼインからなる群から選択される１つ以上の天然植物種子タンパク質を含む、増殖因子サプリメント。
15. 抽出物が約３％～約９９．９％の範囲の１つ以上の植物種子タンパク質を含む、請求項１４に記載の増殖因子サプリメント。
16. 該組換え動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の増殖因子サプリメント。
17. エンドトキシンフリーである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の増殖因子サプリメント。
18. 乾燥製剤および水性製剤から選択される、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の増殖因子サプリメント。
19. －その種子にトランスジェニック動物増殖因子を発現する植物を提供し、成熟した種子が得られるまで該植物を成長させること、
    －該種子を収穫すること、
    －種子洗浄機または種子選別機で種子を洗浄すること、
    －洗浄または選別された種子を脱皮すること、
    －脱皮種子を滅菌し、微粉末に粉砕すること、
    －抽出バッファーで可溶性タンパク質を抽出すること、
    －抽出物を清澄化すること、
    －任意に、抽出物からの該増殖因子をさらに精製すること、
    を含む、増殖因子サプリメント、特に細胞培養肉生産のための細胞培養培地を補充するための増殖因子サプリメントを製造する方法。
20. 該トランスジェニック動物増殖因子にアフィニティータグが提供され、方法が該動物増殖因子のアフィニティー精製を含む、請求項１９に記載の方法。
21. 該トランスジェニック動物増殖因子が、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管上皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子塩基性（ｂＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子酸性（ａＦＧＦ）、線維芽細胞増殖因子－９（ＦＧＦ９）、線維芽細胞増殖因子－１６（ＦＧＦ１６）、線維芽細胞増殖因子－１９（ＦＧＦ１９）、線維芽細胞増殖因子－２０（ＦＧＦ２０）、線維芽細胞増殖因子－２１（ＦＧＦ２１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子－２（ＩＧＦ－２）、インスリン（ＩＮ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、ノギン、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ニューレグリン－１（ＮＲＧ－１）、形質転換増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ１）、形質転換増殖因子ベータ３（ＴＧＦｂ３）、および幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 該植物が、大麦、小麦、エンバク、ライ麦、トウモロコシ、米、大豆、エンドウ豆、キビ、モロコシおよびナタネからなる群より選択される、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 該得られた抽出物を乾燥させるステップをさらに含む、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 該得られた増殖因子サプリメントを細胞培養培地に混合し、細胞培養肉（ＣＣＭ）を培養するのに適した補充された細胞培養培地を得ることをさらに含む、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 請求項１４～１８のいずれか１項に記載の増殖因子サプリメントを含む細胞培養培地。
26. ａ．細胞培養培地、特に細胞培養肉の生産のために細胞を培養するための細胞培養培地；および
    ｂ．該細胞の増殖を維持するための請求項１４～１８のいずれか１項に記載の増殖因子サプリメント、
    を含むキット。
27. 細胞培養培地および増殖因子サプリメントが、使用前に混合されるように別個の容器にて提供される、請求項２６に記載のキット。

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