JPH05207875A

JPH05207875A - 無血清培地

Info

Publication number: JPH05207875A
Application number: JP4012924A
Authority: JP
Inventors: Atsunori Shindou; 敦徳進藤; Maki Suzuki; 摩紀鈴木; Nobumi Kusuhara; 信海楠原
Original assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Toatsu Chemicals Inc
Priority date: 1992-01-28
Filing date: 1992-01-28
Publication date: 1993-08-20

Abstract

(57)【要約】【目的】無血清培地、および該培地を利用して生理活
性物質を生産する方法を提供する。【構成】Ｌ−ヒドロキシアミノ酸を０．２ｇ／ｌ以上
含有してなる無血清培地。及び該培地で生理活性物質生
産細胞を培養し、組織型プラスミノーゲン活性化因子或
いはモノクローナル抗体等の生理活性物質を生産する。【効果】本発明により血清や血清アルブミンを含まな
い安価で安定な無血清培地が提供され、比較的培養の困
難な付着性細胞の培養に本無血清培地を用いた場合に
も、細胞のマイクロキャリヤ−などの付着壁からの剥離
を抑え、血清培地と同等以上の量の生理活性物質を得る
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞培養により種
々の生理活性物質を生産させる際に用いられる無血清培
地、およびその培地を利用して生理活性物質を生産する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、遺伝子工学技術や細胞融合技術の
急速な進歩に伴い、種々の有用な生理活性物質を、動物
細胞培養により生産させることが可能になった。従来か
ら、動物細胞用の培地には、細胞増殖工程、生理活性物
質生産工程に係わらず、牛胎児血清あるいは子牛血清の
ような哺乳動物の血清を多量に添加した培地が用いられ
てきた。

【０００３】しかしながら、これらの血清は非常に高価
で、かつ価格の変動が大きいうえに、不安定な液体成分
のため冷凍保存する必要があり、大量の入手が困難であ
るため、培地の経済性、大量供給の点で問題がある。ま
た、血清には原因不明のロット間差があるため、培養液
中の生理活性物質の蓄積量に変動を生じ、生理活性物質
の安定生産に障害となる。その上、血清には多種類の異
種タンパク質が含まれるため、培養液からこれらの血清
由来物質を除去することが非常に煩雑かつ困難であり、
目的の生理活性物質の分離精製における障害にもなって
いた。

【０００４】最近、血清の代わりに血清アルブミンを含
む無血清培地が開発された。しかし、この血清アルブミ
ンも大量に添加する必要があること、依然として高価で
あること、血清同様ロット間差があること、目的の生理
活性物質を分離精製する際に血清アルブミンの除去が困
難であることなどの問題があり、ほとんど問題点が未だ
解決されていない。

【０００５】また、現在までに比較的培養の簡単な浮遊
性細胞を中心として、血清アルブミンを含まない無血清
培地が開発され、市販されてきた（大野・村上編、無血
清細胞培養マニュアル、講談社、Ｐ３１〜３９、１９８
９年）が、該無血清培地は培養の難しい付着性細胞には
実質的に使用できない、保存期間が短かい、非常に高価
であるなど、産業上使用するには問題点が多い。さら
に、付着性細胞の場合には、血清培地などの適当な増殖
培地で増殖させた後、無血清培地に切り換えると細胞が
付着壁から剥離し、長期間培養できないという問題があ
る。特に、スケ−ルアップを目的とした、マイクロキャ
リヤ−などを用いるジャ−ファ−メンタ−などの撹拌培
養の場合は撹拌せん断力により細胞はさらに剥離しやす
い傾向にある。

【０００６】以上のような背景から、付着性細胞、浮遊
性細胞に係わらず、生理活性物質の生産工程だけでも血
清や血清アルブミンを含まない培地で培養可能ならば、
血清のロット間差による生理活性物質生産量の変動、分
離精製における不純物除去の問題が解決できる。さら
に、血清や血清アルブミンを代替する物質が安価であ
り、安定であれば、培地の経済性、大量供給の面での問
題点も大幅に改善することが可能になる。また、これら
の安価な物質の添加により、血清培地と同等以上の量の
生理活性物質を生産できれば、生理活性物質の工業的大
量生産が可能となる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血清
や血清アルブミンを含まない生理活性物質生産用培地を
提供することである。本発明の他の目的は、安価で安定
な無血清培地を提供することにある。本発明のさらに他
の目的は、付着性細胞を用いた場合でも細胞の付着壁か
らの剥離を抑える無血清培地を提供することである。本
発明のさらに他の目的は、長期間に渡って無血清培地と
同等以上の量の生理活性物質を生産可能とする無血清培
地を提供することである。本発明のさらに他の目的は、
無血清培地を用いて生理活性物質を生産する方法を提供
することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の問
題点を解決するために鋭意検討した結果、生理活性物質
の生産工程において、通常の動物細胞に用いられている
血清を含まない基本培地にＬ−ヒドロキシアミノ酸を
０．２ｇ／ｌ以上添加することにより、付着性細胞を用
いた場合にも、長期間に渡って血清培地と同等以上の量
の生理活性物質を生産できることを見出し、本発明を完
成させるに至った。

【０００９】すなわち、本発明はＬ−ヒドロキシアミノ
酸を０．２ｇ／ｌ以上含有してなることを特徴とする無
血清培地、および生理活性物質生産細胞を上記無血清培
地で培養して生理活性物質を生産する方法である。

【００１０】本発明に使用される基本培地としては、従
来から知られている動物細胞培養用の血清を含まない基
本培地のいずれも用いることができる。例えば、イ−グ
ル最小必須培地、ダルベッコ変法イ−グル培地、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地、ハムＦ−１２培地などが挙げられ
る。これらの基本培地は複数種を適当な割合で混合した
り、インシュリンやトランスフェリンなどを添加して使
用することも可能である。

【００１１】本発明の無血清培地に使用されるＬ−ヒド
ロキシアミノ酸としてはヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ
−セリン、Ｌ−スレオニンなどが挙げられる。このよう
なＬ−ヒドロキシアミノ酸は通常の培地に栄養源として
数１０ｍｇ／ｌ程度含まれるが、本発明の培地には０．
２ｇ／ｌ以上の任意の濃度に含有される必要がある。Ｌ
−ヒドロキシアミノ酸の含有量は０．２ｇ／ｌ以上であ
れば特に制限はないが、通常用いられる範囲の濃度で、
好ましくは０．２〜５ｇ／ｌの範囲で使用するとよい結
果が得られる。

【００１２】また、その他の成分として、糖、アミノ
酸、核酸関連物質、ビタミン、微量元素、プロテア−ゼ
阻害剤などを必要に応じて培地に添加しても差し支えな
い。そのような成分としては、次のような例が挙げられ
る。例えば、一般に糖源としてグルコ−スが用いられる
が、培養中に培地に蓄積する乳酸の量を減らす目的で、
ガラクト−スなどを添加する場合が挙げられる。また、
例えば、プロリン要求性細胞（チャイニ−ズハムスタ−
卵巣細胞など）を、ダルベッコ変法イ−グル培地（この
培地はプロリンを含まない）を基本培地とする本発明の
無血清培地で培養する際に、Ｌ−プロリンを適量添加す
る。また、例えば、メタロチオネインのプロモ−タ−を
接続したプラスミドで形質転換した組み換え細胞によ
り、生理活性物質を生産させる場合には、亜鉛、カドミ
ウムもしくはその塩を本発明の無血清培地に添加する。
また、例えば、本発明の無血清培地において、組織型プ
ラスミノ−ゲン活性化因子の一本鎖の方を二本鎖のもの
よりも多く生産させたい場合には、アプロチニン、ε−
アミノカプロン酸、ｐ−アミノメチル安息香酸などのプ
ロテア−ゼ阻害剤を添加する。また、例えば、生理活性
物質の生産量を増大させる目的で本発明の無血清培地に
酪酸または、プロピオン酸もしくはそれらの塩を添加す
る場合などが挙げられる。

【００１３】また、本発明の無血清培地は、血清や血清
アルブミンを添加しても使用可能であることは言うまで
もない。しかし、本発明の目的の１つは、生理活性物質
の生産工程において、培地から血清や血清アルブミンを
除去することにあるので、生理活性物質を培養液から回
収する際、血清や血清アルブミンの添加が支障を来す場
合は血清や血清アルブミンの使用は好ましくない。

【００１４】本発明の培地は、種々の生理活性物質の生
産に使用される。そのような生理活性物質として例え
ば、各種酵素類（組織型プラスミノ−ゲン活性化因子な
ど）、各種モノクロ−ナル抗体（ヒトモノクロ−ナル抗
体、マウスモノクロ−ナル抗体など）、各種リンホカイ
ン（インタ−フェロンなど）、各種ホルモン（ヒト成長
ホルモンなど）などを挙げることができ、本発明の無血
清培地を用いて生産することが出来る。

【００１５】そして、そのような生理活性物質の生産に
使用される細胞としては、比較的培養の難しい付着性細
胞はもちろんのこと、浮遊性細胞のいずれにも用いるこ
とができ、動物由来の各種細胞の培養による生理活性物
質の生産が可能である。例えば、繊維芽細胞、上皮性細
胞、リンパ球系細胞、これらの形質転換細胞、ハイブリ
ド−マなどが挙げられる。

【００１６】生理活性物質の生産するための生理活性物
質生産細胞の培養方法は、特に限定されるものではな
く、通常の動物細胞培養の方法で行うことが出来る。例
えば、マルチウエルプレ−ト、ペトリ皿、組織培養フラ
スコ、ロ−ラ−ボトル、スピナ−フラスコ、ジャ−ファ
−メンタ−や、マイクロキャリヤ−、ホロ−ファイバ−
などを用い、使用する細胞に適した増殖用の培地（血清
アルブミンや増殖因子を含む無血清培地、あるいは血清
を添加した培地）に細胞の適当量を植え込み、適温、適
切な時間増殖させた後、増殖用の培地を除去し、本発明
の培地に切り換えて、生理活性物質を生産させる。

【００１７】また、例えば、上記同様の方法により生理
活性物質を生産させた後、数日間毎に培養液を回収する
と共に、新鮮な本発明の培地を加えると言う操作を繰り
返し生産を継続する。また、例えば、使用する細胞に適
した増殖用の培地に細胞の適当量を植え込み、適温、適
切な時間増殖させた後、本発明の培地を連続的に添加す
ると同時に増殖用の培地を抜き出すパ−ヒュ−ジョン培
養を行い、血清アルブミンや増殖因子、血清を徐々に除
去し、最終的には完全に除去し、生理活性物質を生産さ
せる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。実施例１．付着性細胞であり、組織型プラスミノ−ゲン
活性化因子（以後ｔＰＡと略す）を生産する、組み換え
マウスＣ−１２７細胞、ｈＴ−３８２株（特開昭６２−
１２６９７８）を使用した。ベルコ社の５００ｍｌスピ
ンナ−フラスコにマイクロキャリヤ−（Ｃｙｔｏｄｅｘ
１、ファルマシア社）を２ｇと、予め不活性化させた牛
胎児血清（以後ＦＣＳと略す）を１０％含むダルベッコ
変法イ−グル培地（増殖用の培地）を５００ｍｌ仕込ん
だ。上記の種細胞を７×１０⁷個播種し、３７℃、４０
ｒｐｍの条件で培養を開始した。増殖３日目に、撹拌を
停止し、細胞の付着したマイクロキャリヤ−を沈降さ
せ、培養液を吸引除去した。新鮮な増殖用の培地を加
え、再び培養を続けた。増殖４日目に上記同様の操作に
より生産培地に切り換え、ｔＰＡを生産させた。生産用
の培地には、塩化亜鉛２０μＭ、ε−アミノカプロン酸
１０ｍＭを含むダルベッコ変法イ−グル培地に、表１
（表１）に示した種々の物質を添加した培地を用いた。
２日間培養した後、培養液中のｔＰＡをＥＬＩＳＡ法に
より定量した。また、顕微鏡によりマイクロキャリヤ−
からの細胞の剥離の程度を観察した。以上の結果を表１
（表１）に示した。

【００１９】

【表１】（注）細胞の剥離（顕微鏡観察）＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋の順に細胞の剥離の程度が
大きい。

【００２０】実施例２．実施例１と同じ細胞を使用し、
同様の実験を行い、結果を表２（表２）に示した。

【００２１】

【表２】（注）細胞の剥離（顕微鏡観察）＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋の順に細胞の剥離の程度が
大きい。

【００２２】実施例３．実施例１と同じ細胞を使用し
た。ｐＨ電極、ＤＯ電極及びガス吹き込み管をセットし
た撹拌羽根付きの実容量１ｌ（全容量約１．５ｌ）のベ
ルコ社のスピンナ−フラスコに、マイクロキャリヤ−
（Ｃｙｔｏｄｅｘ１、ファルマシア社）を５ｇと、予め
不活性化させたＦＣＳを１０％含むダルベッコ変法イ−
グル培地（増殖用の培地）を１ｌ仕込んだ。上記の種細
胞を１０⁸個播種し、３７℃、３０ｒｐｍ、ＤＯ＝１〜
２ｐｐｍ、ｐＨ＝７．０〜７．２の条件で培養を開始し
た。増殖４日目に、撹拌を停止し、細胞の付着したマイ
クロキャリヤ−を沈降させ、培養液を吸引除去した。新
鮮な増殖用の培地を加え、再び培養を続けた。増殖５日
目に上記同様の操作により、生産培地に切り換え、３５
℃の上記同条件でｔＰＡを生産させた。生産用の培地に
は、インシュリン５ｍｇ／ｌ、トランスフェリン５ｍｇ
／ｌ、塩化亜鉛２０μＭ、ε−アミノカプロン酸１０ｍ
Ｍを含むダルベッコ変法イ−グル培地に、表３（表３）
に示した種々の成分を添加した培地を用いた。以後２日
に一度培地交換を行い、３０日間ｔＰＡを生産させた。
ｔＰＡは、ＥＬＩＳＡ法により定量し、平均蓄積量、総
蓄積量を産出した。また、生産２０日目には顕微鏡によ
りマイクロキャリヤ−からの細胞の剥離の程度を観察し
た。以上の結果を表３（表３）に示した。

【００２３】

【表３】（略号）ＯＨＰ：４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（注）細胞の剥離（顕微鏡観察）＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋の順に細胞の剥離の程度が
大きい。

【００２４】実施例４．浮遊性細胞であり、ヒトモノク
ロ−ナル抗体（以後ＩｇＭと略す）を生産するハイブリ
ド−マ、ＭＰ５１２１株（ＷＯ９０／１１３５０）を使
用した。２５ｃｍ²の組織培養フラスコに、ＲＰＭＩ１
６４０培地にＦＣＳを１０％加えた培地（増殖用の培
地）を５ｍｌ仕込んだ。上記細胞の種細胞を１×１０
⁵個／ｍｌとなるように植え込み、３７℃の炭酸ガスイ
ンキュベ−タ−で培養を開始した。増殖３日目に培養液
の全量を抜き出し、遠心分離により培養液を除去し、細
胞を分離した。新鮮な増殖用の培地５ｍｌに細胞を懸濁
し、この細胞懸濁液を２５ｃｍ²の組織培養フラスコに
戻し、培養を続けた。こうして４日間培養した後、同様
の操作により、増殖用の培地を除去し、生産用の培地に
１×１０⁶個／ｍｌとなるように細胞を懸濁し、細胞懸
濁液の５ｍｌを組織培養フラスコに戻し、３７℃で引き
続きＩｇＭの生産を開始した。生産用の培地には、イン
シュリン１０ｍｇ／ｌ、トランスフェリン１０ｍｇ／ｌ
を含むＲＰＭＩ１６４０培地に、表４に示した種々の成
分を添加した培地を用いた。以後毎日、前記同様の方法
で生産培地のほぼ全量を回収し、新鮮な生産用の培地５
ｍｌに細胞を懸濁するという操作を繰り返し、３０日間
ＩｇＭを生産させた。回収した培養液中のＩｇＭはＥＬ
ＩＳＡ法で定量し、３０日間の総ＩｇＭ生産量を算出し
た。結果を表４（表４）に示した。

【００２５】

【表４】

【００２６】

【発明の効果】本発明においては、付着性細胞、浮遊
性細胞にかかわらず、血清や血清アルブミンを含まない
培地の提供が可能である。即ち、実施例に示したよう
に、培養の比較的困難とされる付着性細胞を適当な培地
で増殖させた後、本発明の無血清培地に切り換えると、
細胞の付着壁からの剥離を抑えることに有効である。さ
らに、本発明の培地で長期に渡って生理活性物質を生産
させると、血清培地と同等以上の生理活性物質の総蓄積
量を示し、動物細胞培養により生理活性物質を安価かつ
大量に生産することに、極めて有効である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ−ヒドロキシアミノ酸を０．２ｇ／ｌ
以上含有してなることを特徴とする、無血清培地。
【請求項２】Ｌ−ヒドロキシアミノ酸が、ヒドロキシ
−Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、又はＬ−スレオニンであ
る、請求項１記載の無血清培地。
【請求項３】生理活性物質生産細胞を請求項１、又は
請求項２記載の無血清培地で培養して、生理活性物質を
生産する方法。
【請求項４】生理活性物質が組織型プラスミノ−ゲン
活性化因子である、請求項３記載の生理活性物質を生産
する方法。
【請求項５】生理活性物質がモノクロ−ナル抗体であ
る、請求項３記載の生理活性物質を生産する方法。