JP2525436B2 - 細胞培養による蛋白質の製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、蛋白質を産生する細胞を、蛋白質の産生を
増大させる化学剤の存在下に培養する、細胞培養による
蛋白質の製造に関する。

発明の背景 診断および治療のための細胞生成物を工業的に製造す
ることを目的に細胞を培養することは、高価につき時間
のかかる方法である。必要な装置は高価で、研究、開発
および製造の費用も高い。工業的に実行可能な方法にす
るためには、大量の生成物を産生する細胞系を使用する
ことが望ましい。

天然に生じる多くの細胞は、所望の蛋白質を多量には
産生しないが、本来的に所望の蛋白質を少量は産生し、
たえず蛋白質を合成している。他の細胞系は興味ある蛋
白質を本来的に製造しないが、このような細胞系も興味
ある蛋白質を産生するように誘導できることはよく知ら
れている。すなわち、これらの細胞系は特定の蛋白質を
産生する潜在能力を有し、適当な刺激を与えたときにこ
れらの蛋白質を産生する（Kruh,J.:Mol.Cell.Biol.,42:
65〜82,1982）。蛋白質産生の誘導は培養メジウムにジ
メチルスルホキシド（DMSO）のような化学的化合物また
は細胞へのSendaiウイルスのような感染剤の添加によつ
て達成できる。

細胞系における蛋白質産生の“誘導剤”、“増強
剤”、または“刺激剤”として作用できる化合物は数多
く知られている。本明細書においては、上記の語は、そ
れが発現する外見的効果に基づいて以下の意味をもつも
のとする。“誘導剤”は、蛋白質の産生を明らかに誘導
または開始させる試剤を指す。“増強剤”は、蛋白質の
産生を増加させる作用を明らかに示すが、蛋白質の産生
を誘導または開始させることはない試剤である。増強剤
は細胞培養物に、細胞系の誘導時もしくは誘導直後に添
加してもよいし、また所望の蛋白質を連続的に産生して
いる細胞系にいつでも添加することができる。“刺激
剤”は、誘導可能な細胞系の培養物に、通常は細胞が所
望の細胞密度に達したがまだ蛋白質の産生は誘導されて
いない時点で添加され、明らかに、以後の誘導剤による
蛋白質産生の誘導に対する引き金機構の一部として作用
する試剤である。

誘導剤であれ増強剤であれ、また刺激剤であれ、試剤
の選択は、細胞の種類、メジウムに加える試剤の最終濃
度、添加時間、その試剤に暴露する期間および毒性等の
各種因子に依存する。これまで、DMSO、尿素誘導体およ
びアルカン酸もしくは塩等、多くの添加剤が使用されて
きた。このような添加剤の中で、最近、酪酸ナトリウム
がとくに研究されている。この化合物は、各種の天然ま
たは選択細胞系の培養液にミリモル濃度を添加すると、
様々な形態学的および生物学的修飾が可逆的な様式で起
こることが明らかにされている（Kruh,J.:前出）。分子
レベルにおいて、酪酸塩はヒストンデアシラーゼを阻害
することによりヒストンの高アセチル化を起こすものと
考えられている。一般に、酪酸塩は遺伝子の発現を修飾
し、ほとんど全例において培養液中の細胞への添加は細
胞の生育を停止させるようである。

たとえば、酪酸ナトリウム（1mM）は、HeLa細胞培養
液中で、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンの合成を誘導する
のに用いられてきた（Ghoshほか:Biochem.J.,166:265〜
274,1977;Cox ＆ McClure:In Viro,19:^＃1,1〜6,1983年
１月）が、いずれの場合も酪酸塩処理は細胞の生育を阻
害する。また、英国特許明細書第2122207A号には、リン
パ芽球細胞系中Sendaiウイルスでのインターフエロン合
成の誘導に先立つて、酪酸塩を刺激剤として使用するこ
とが記載されている。しかしながら、英国特許第212220
7A号にはさらに、記載された特定の細胞系の場合、誘導
時または誘導直後に添加すると、酪酸塩はインターフエ
ロン合成の増強剤としては使用できないことも開示され
ている。

興味ある蛋白質の大量産生を誘導する必要がある細胞
系のほかに、誘導剤の使用を必要とせず本来的に所望の
蛋白質を産生できる他の細胞系がある（Trends Biotec
h.,3:No.12,1985;J.Immuno.Meth.,56:221〜234,198
3）。このような細胞系には遺伝子操作細胞系およびハ
イブリドーマ細胞系が包含される。選ばれた遺伝子操作
細胞系およびハイブリドーマ細胞系を用いることによ
り、誘導剤を使用しないで大量の稀な蛋白質を製造する
ことが可能になる。

数種の哺乳類細胞系において蛋白質産生の誘導剤とし
て認められている酪酸塩の効果が、ある種の遺伝子操作
細胞系の培養について研究されてきた。たとえば、全SV
40ゲノムおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
（HSV−TK）をコードする遺伝子を含有するプラスミド
をマイクロインジエクシヨンまたはトランスフエクシヨ
ンしたシリアハムスター細胞の培養液が酪酸塩で処理さ
れている（Yuanほか:J.Biol.Chem.,260:3778〜3783,198
5）。酪酸塩を細胞培養液に添加し、培養期間を通じ酪
酸塩の濃度を維持した。SV40の発現レベルは産生された
SV40T抗原の量の定量によつて測定し、HSV−TKの発現の
レベルはトリチウム化チミジンの取り込みによつて測定
した。Yuanらは、1mMから5mMの範囲の濃度の酪酸塩は、
両遺伝子の発現を対照値に比べて阻害したと報告してい
る。

さらに、他の研究者（Gorman,C.M.ほか:Nucl.Acids R
es.,11:7631〜7648,1983）が、クロマチン構造と組換え
プラスミドの発現の間の関係の検討に際して、DNA仲介
遺伝子転移に対する酪酸ナトリウムの効果を研究してい
る。過渡発現および安定トランスホーメーシヨンの両実
験において、細胞を、外来性DNA含有プラスミドでのト
ランスフエクシヨン直後に酪酸塩で処理した。安定トラ
ンスホーマントの場合には、トランスフエクシヨン直後
の最初の酪酸塩処理から５週後に、さらに２回目の酪酸
塩処理に付した。これらの結果は、酪酸塩が、外来性DN
Aを発現できる細胞の割合と増強剤依存性転写のレベル
の両者を増大させるという少なくとも２つのレベルにお
いて、遺伝子活性の初期段階に影響することを示してい
る。さらに、安定トランスホーマントでの実験の結果
は、挿入された組換えプラスミド遺伝子の発現が、細胞
をDNA取り込みの直後に酪酸塩で初期処理してあつた場
合、以後の酪酸塩処理で再誘導されることを示してい
る。トランスフエクシヨン直後の初期の酪酸塩処理を行
わなかつた細胞には、外来性遺伝子発現のみるべき誘導
は認められなかつた。これらの結果は、初期の酪酸塩処
理が、以後の酪酸塩誘導に対する挿入外来性DNA発現の
素地を作ることを示唆するものである。

要約すると、酪酸塩はこれまで多数の天然または遺伝
子操作細胞系の培養液に添加されてきたが、一般的に
は、酪酸塩の添加は遺伝子発現を開始また阻害し、細胞
の生育を停止させるように思われる。遺伝子操作を行つ
た細胞の場合、長期にわたる酪酸塩処理は外来性遺伝子
の発現を阻害するようである（Yuanほか：前出）。細胞
をトランスフエクシヨンの直後に酪酸塩で処理した特殊
な場合には、以後の酪酸塩処理は外来性遺伝子の発現を
再誘導するように思われる（Gormanほか：前出）。ハイ
ブリドーマ細胞培養における生育および免疫グロブリン
産生についての検討はみられない。

本発明は、ある蛋白質の本来的産生細胞である遺伝子
操作およびハイブリドーマ細胞の培養に際しての蛋白質
の産生を、酪酸塩のような化学剤を培養メジウム中に適
当濃度添加することによつて増大できることを発見し完
成されたものである。遺伝子操作を施した細胞の場合、
培養時に酪酸塩のような試剤で細胞を処理して蛋白質産
生レベルを上昇させるために、トランスフエクシヨン直
後の試剤による初期処理は必要ではないことが明らかに
された。とくに、予期に反して、ハイブリドーマ細胞の
培養液に、酪酸塩のような試剤を蛋白質の産生を増大さ
せるが細胞の生育は実質的に低下させない濃度で添加す
ることが可能であることが発見された。しかも、酪酸塩
のような試剤のもつと高レベルでは遺伝子操作細胞およ
びハイブリドーマ細胞の生育は阻害されるが、蛋白質の
産生を増大させしかも細胞の生存能は実質的に低下させ
ない濃度の試剤を使用できることも明らかにされたので
ある。

発明の要約 したがつて、本発明はその第一の態様として、蛋白質
の製造方法、すなわち、蛋白質の産生を増大させる試剤
をその蛋白質の産生を増大させるが細胞の生育速度は実
質的に低下させない濃度存在させて、本来的にその蛋白
質を産生する遺伝子操作細胞またはハイブリドーマ細胞
を培養することを特徴とする方法を提供する。

本発明のさらに別の態様として、（ａ）蛋白質の産生
を増大させる試剤をその蛋白質の産生を増大させるが細
胞の生育速度は実質的に低下させない濃度存在させて、
本来的にその蛋白質を産生する遺伝子操作細胞またはハ
イブリドーマ細胞を培養し、（ｂ）培養を蛋白質が蓄積
するまで続け、所望により（ｃ）蛋白質を単離する各工
程からなる蛋白質を得る方法を提供する。

本発明において、本来的に蛋白質を産生する細胞と
は、その蛋白質の産生を誘導する必要がない細胞と理解
すべきである。

“遺伝子操作細胞”の語は、所望の蛋白質を本来的に
産生する形質転換細胞を与えるために、所望の蛋白質を
コードする外来性DNAでトランスフエクシヨンまたはト
ランスホーメーシヨンした細胞を意味する。このような
遺伝子操作細胞には、その外来性DNAが、形質転換細胞
の内部に染色体外性遺伝体として維持されている細胞、
またはそのゲノム中に挿入されている細胞が包含され
る。このような遺伝子操作細胞の調製に適した宿主細胞
には、すべての種類の宿主細胞が包含されるが、通常は
酵母細胞または好ましくは動物細胞たとえば哺乳類細胞
を含めた真核細胞である。

“ハイブリドーマ細胞”の語は一般には、抗体産生細
胞たとえばＢリンパ球と適当な骨髄腫細胞の融合により
製造されるハイブリツド細胞である。しかしながら、本
明細書においては、“ハイブリドーマ細胞”の語は、抗
体産生細胞たとえばＢリンパ球を形質転換剤たとえばEp
stein−Barrウイルス（EBV）で処理して得られる“不死
化”抗体産生細胞も包含する。本発明における“ハイブ
リドーマ細胞は通常、動物起源のもので、たとえばマウ
スもしくはラツトのハイブリドーマ細胞またはヒト細胞
由来のハイブリドーマ細胞である。

本発明の方法で製造される蛋白質は、組換え蛋白質で
あつてもよい。たとえば、有用および／または治療用の
真核生物蛋白質、すなわちホルモンたとえばヒト生長ホ
ルモンのような生長ホルモン、酵素たとえば組織プラス
ミノ−ゲンアクテイベーター、酵素阻害剤たとえばメタ
ロプロテナーゼの組織インヒビターまたはリンホカイン
等である。蛋白質はまた、とくに細胞がハイブリドーマ
細胞である場合、免疫グロブリン分子であつてもよい。
このような免疫グロブリン分子には、天然の抗体分子も
しくはその類縁体またはこれらのいずれかの一部たとえ
ば天然もしくは類縁体のFAbフラグメントが包含され
る。本発明の方法はハイブリドーマ細胞からの免疫グロ
ブリンの製造の場合、とくに有用である。

本発明の方法において蛋白質の産生を増大させるため
に使用される試剤（以下、増強剤という）は、一般に
は、蛋白質の産生を増大させるが細胞の生育速度を実質
的に低下させない濃度で使用できる化学剤である。

増強剤は、直鎖状もしくは分岐状の、飽和もしくは不
飽和脂肪酸よりなる群から選ばれるのが好ましい。とく
にアルカン酸およびその塩である。とくに増強剤は、長
さが炭素原子１〜10個、とくに好ましくは炭素原子３〜
６個の直鎖のアルカン酸またはその塩である。上記の記
述を否定するものではないが、偶数個の炭素原子を有す
る化合物は奇数個の炭素原子を有する化合物よりも強力
のようである。増強剤としては酪酸もしくはその塩とく
にアルカリ金属塩、ことに酪酸塩たとえば酪酸ナトリウ
ムが好ましい。

増強剤は、培養メジウム中に0.01mM〜500mM、好まし
くは0.1mM〜200mM、とくに好ましくは0.2mM〜10mMの濃
度で存在させる。形質転換細胞系および他の哺乳類細胞
系の場合、もつとも好ましい濃度範囲は1mM〜10mMであ
る。ハイブリドーマ細胞系の場合、濃度範囲は、0.1mM
〜0.9mMが好ましく、0.3mM〜0.7mMがさらに好ましく、
0.4mM〜0.6mMがとくに好ましい。しかしながら、使用す
る増強剤の濃度は、培養する特定の細胞系を考慮して変
動させることが推賞される。特定の細胞系に対するもつ
とも適当な増強剤の濃度は、慣用の実務に従つて、前も
つて適当な小規模の試験によつて決定する必要がある。

本発明の好ましい態様によれば、本発明は、ハイブリ
ドーマ細胞の培養によつて蛋白質を得る方法において、
（ａ）蛋白質の産生を増大させる試剤をその蛋白質の産
生を増大させるが細胞の生育速度は実質的に低下させな
い濃度存在させて、本来的にその蛋白質を産生するハイ
ブリドーマ細胞を培養し、（ｂ）培養を蛋白質が蓄積す
るまで続け、所望により、（ｃ）蛋白質を単離する各工
程からなる方法を提供する。この好ましい態様において
は、ハイブリドーマ細胞はマウスまたはラツトハイブリ
ドーマ細胞であることが好ましい。

この方法で製造される蛋白質は好ましくは免疫グロブ
リンである。

増強剤は、好ましくはアルカン酸またはその塩であ
り、好ましくは直鎖状C₂〜C₁₀、とくにC₃〜C₆アルカン
酸またはその塩、とくに酪酸またはその塩ことにアルカ
リ金属塩たとえば酪酸ナトリウムである。増強剤は培養
メジウム中に0.1mM〜0.9mM、さらに好ましくは0.3mM〜
0.7mM、とくに好ましくは0.4mM〜0.6mMの濃度範囲で存
在させる。

本発明の方法における細胞の培養には、任意の適当な
培養操作および培養メジウムが使用できる。適当な培養
操作は、細胞培養技術分野の研究者によく知られてい
て、理解されているとおりである（たとえば、J.Immun.
Meth.,56:221〜234,1983参照）。血清補給および血清非
含有の両メジウムが使用できる。バツチ法および連続法
による両発酵操作、懸濁培養および付着培養たとえばミ
クロキヤリアー培養法、または撹拌タンクおよび気送発
酵槽等、細胞の種類に応じて適当な操作を採用できる。

本発明の方法においては、増強剤は、培養メジウムに
細胞を添加する前または後に、培養メジウムに添加され
る。所望により、増強剤を２回以上にわたつて添加する
こともできる。たとえば、培養の初期に増強剤を加え、
ついで培養の進行に従つてさらに増強剤を加えることが
望ましい場合も考えられる。もちろん、増強剤の添加
は、その濃度が細胞の生育速度を低下させる可能性があ
る濃度を越えないように十分制御して行う必要がある。

培養時の蛋白質の産生は、一般的な定量技術により、
たとえば問題の特定の蛋白質に適当な酵素連結免疫吸着
定量法または免疫放射定量法によつて監視することがで
きる。

所望の蛋白質は、必要に応じて細胞培養液から慣用の
分離技術を用いて単離できる。たとえば、培養メジウム
中の蛋白質は細胞から遠心分離によつて分離し、蛋白質
を含む上清を集め、ついでたとえば限外濾過によつて濃
縮する。このようにして得られた蛋白質は、所望によ
り、慣用の蛋白質精製法を用いてさらに精製できる。所
望の蛋白質が培養時に培養メジウム中に分泌されてこな
い場合は、細胞を破壊し、あとは前述したと同様に処理
すれば、蛋白質が得られる。

上述の増強剤は、対数期の生育が停止して生育の静止
もしくは衰退期にある細胞での蛋白質産生の増強にも使
用することができる。これは、所望の蛋白質がこれらの
遅い２時期にのみ細胞によつて産生される場合にとくに
有利である。

本発明の他の態様によれば、本発明は、蛋白質を製造
する方法において、蛋白質の産生を増大させる試剤をそ
の蛋白質の産生を増大させるが細胞の生存能を有意に低
下させない（たとえば細胞に対して実質的に非毒性であ
る）濃度で存在させて、本来的にその蛋白質を産生する
遺伝子操作細胞またはハイブリドーマ細胞を培養液中に
維持する方法を提供する。

本発明のこの態様において使用される細胞、増強剤お
よび培養操作は上に詳述したものが使用できる。使用さ
れる培養メジウムは、細胞の生存能は支持するが、細胞
の生育を賦活しないメジウムが好ましい。このようなメ
ジウムはいわゆる維持培地であつて、たとえば必須の生
長因子たとえばトランスフエリン、インスリン、アルブ
ミン等を含まない。

本発明のこの態様においては、通常、細胞は培養液中
で、効率的な蛋白質の産生に必要なバイオマスのレベル
に達するまで生育させる。この場合、所望により生育培
地中に増強剤を包含させることもできるが、しかしなが
ら場合によつては、たとえば蛋白質の産生が細胞に有害
な影響を与える場合には、細胞は増強剤なしで生育させ
ることが望ましい。すなわち、懸濁培養の場合には最大
細胞密度またはその付近まで、また付着細胞系の場合に
は集密状態またはその付近まで細胞を生育させる。細胞
を維持メジウムに移した段階で、増強剤を、蛋白質の産
生は増大させるが細胞の生存能は有意に低下させない濃
度加える。一般に、増強剤の適当な濃度は上述のとおり
であり、たとえば0.1mM〜500mM、さらに好ましくは0.1m
M〜200mM、とくに好ましくは1mM〜5mMが使用される。正
確な濃度は使用する細胞によつて決まる。

さらに他の態様においては、本発明は、蛋白質を製造
するにあたり、その蛋白質を本来的に産生する遺伝子操
作細胞またはハイブリツド細胞を、第１段階では生育培
地中であらかじめ定められた細胞密度に達するまで生育
させ、ついで第２段階で、蛋白質の産生を増大させる試
剤を蛋白質の産生は増大させるが細胞の生存能を低下さ
せることなく細胞の生育を阻害する濃度存在させた培地
中に細胞を維持する方法を提供する。

本発明のこの実施態様はとくに、所望の蛋白質の中程
度産生細胞または微量産生細胞である遺伝子操作細胞系
に適用すると、適当な濃度の増強剤の使用により蛋白質
の産生をかなり増大させることができる。

生育培地に蛋白質の産生を増大させる試剤を添加して
もよいが、添加は行わない方が好ましい。第１段階にお
いて細胞を生育させるあらかじめ定められた細胞濃度
は、培養最大細胞密度に近いあるいは集密状態に近い細
胞濃度が好ましい。第２段階で使用する増強剤の濃度は
一般的には前述のような範囲であるが、とくに細胞の生
育を停止させ、細胞の生存能保持時間を延長し、総蛋白
質産生レベルを増大させる濃度も使用できる。

以上概説したように、培養系にたとえば酪酸塩のよう
な化学剤を添加することの利点は、きわめてわずかな経
費で蛋白質の産生が実質的に増加できること、また培養
技術の変更はあつたとしてもきわめてわずかなことであ
る。さらに他の利点としては、細胞は本来的に所望の蛋
白質を産生する細胞であり、所望の蛋白質の大量生産の
誘導を必要とはしないので、製造プロトコールは単純
で、細胞に依存する適当な濃度範囲の酪酸塩を添加しさ
えすれば蛋白質の産生が増大することである。

図面の簡単な説明 本発明は以下の実施例により図面を参照しながらさら
に説明するが、これは本発明を単に例示するものであつ
て、いかなる意味においても本発明を限定するものでは
ない。

第１図は、血清を含まないメジウム中でのハイブリド
ーマ細胞の増殖に対する酪酸塩の効果を示すグラフであ
る。

第２図は、送気発酵槽中での、バイブリドーマ細胞の
増殖と抗体産生に対する酪酸塩の効果を示すグラフであ
る。

特殊な態様の説明 例１ ハイブリドーマ細胞の生育および抗体産生に対する酪酸
ナトリウムの効果 IgM分泌マウスハイブリドーマ細胞系NB1/19を、アル
ブミン、インスリン、トランスフエリン、ゲンタマイシ
ンおよび細胞の懸濁培養に必要な他の添加物を含有する
ダルベツコ改良イーグル最少（DMEM）血清非含有培地中
で懸濁培養して生育させた。NB1/19細胞系はヒトＢ血液
細胞の抗原決定基に特異性を有するマウスモノクローナ
ル抗体を産生する。この細胞系の調製については英国特
許GB2097425B号に詳細に記載されている。しかしなが
ら、この特定の細胞系に代えて、他のハイブリドーマ細
胞系も、本例および他例におけると同様に適切に使用で
きることを理解すべきである。

細胞は生存細胞密度1.0〜1.5×10⁶個/mlまで生育させ
た。生存細胞密度は、染色剤トリパンブルーを排除する
細胞の数を計数することにより測定した。懸濁培養液の
サンプルを血清を含まないメジウムに約1.3×10⁵細胞/m
lの密度に希釈した。その一部50ml容を振盪フラスコに
分配し、酪酸ナトリウムを0.1mM、0.3mM、0.5mMおよび
1.0mMの濃度に加えた。

振盪フラスコは５％二酸化炭素−95％空気で通気し、
栓をして、37℃で207時間まで振盪しながらインキユベ
ートした（第１表）。培養液からサンプル（1.0ml）を
ピペツトで取り出した。100μを生存細胞数の測定に
使用し、残りは300xgで５分間遠心分離した。上清を、
酵素連結免疫定量法（ELISA）によつて抗体の定量を行
うまで−20℃に保存した。

第１図および第１表には、それぞれ、各種濃度の酪酸
塩が、ハイブリドーマ細胞の生育および抗体の産生に与
える影響を示す。

例２ 血清補給メジウム中で培養したハイブリドーマ細胞にお
ける酪酸塩による抗体産生の増大 本実験のプロトコールは、10％ウシ胎仔血清を補給し
たダルベツコ改良イーグル最少培地中で細胞を培養した
ほかは、例１の場合と同様である。

第２表は、抗体産生に対する酪酸ナトリウム添加の影
響を示す。

例３ 気送発酵槽中で培養したハイブリドーマ細胞における抗
体産生の酪酸塩による増大 NB2/19ハイブリドーマ細胞を気送発酵槽（Birchほか:
Trends Biotech.3:No.7,162〜166）（５）中、グルタ
ミン、トランスフエリン、アルブミン、インスリン等を
含む血清非含有DMEMメジウムを用いて懸濁培養した。ハ
イブリドーマ細胞は、細胞密度１×10⁵細胞/mlで発酵槽
に接種した。

発酵槽にハイブリドーマ細胞を接種したときに、酪酸
ナトリウムを0.5mMの濃度に発酵槽へ添加した。

対照には酪酸ナトリウムを添加しなかつた。サンプル
は例１に記載したと同様に、周期的に採取した。

細胞の生育および抗体産生に対する酪酸塩の影響を第
２図に示す。

例４ 哺乳類細胞内組換えヒト生長ホルモンの酪酸ナトリウム
を用いた産生増大 付着性CBMGヒト生長ホルモン産生細胞の分子生物学に
ついては、C.N.PavlakisらによりPNAS（USA）,80:397〜
401,1983に記載されている。

CBMG細胞は、組織培養フラスコ内の10％胎仔ウシ血清
補給ダルベツコ改良イーグル最少培地（DMEM）中に0.7
×10⁵細胞/cm²を接種した。

培養液中の細胞が集密に生育したのち、DMEM血清補給
培地を、血清非含有DMEM維持培地に置換した。細胞を血
清補給培地から維持培地に移したのち、酪酸ナトリウム
を1mMおよび5mM添加した。培養上清中のヒト生長ホルモ
ンのレベルを免疫放射定量法によつて48時間後に測定し
た。結果を第３表に示す。

例５ 各種ハイブリドーマ細胞系に対する酪酸ナトリウムの影
響 血清を含まないメジウム（例１参照）または熱不活化
胎仔ウシ血清10％（v/v）を補給したDMEM中のいずれか
で、ハイブリドーマ細胞を懸濁培養により生育させた。
第４表に示すように、血清を含まないメジウムに血清を
補給した。細胞は例１におけるように、回転ボトルまた
は振盪フラスコ内で培養した。酪酸ナトリウムは、接種
直後に培養液に加えた。

酪酸塩処理により、細胞あたりの抗体産正量は増大し
た。第４表は、多数の異なるハイブリドーマ系につい
て、酪酸塩処理により、収穫抗体力価が増大することを
示している。

例６ ハイブリドーマ細胞からの抗体産生に対する各種アルカ
ン酸塩の影響 NB1/19細胞は例１の場合と同様にして培養した。各種
の直鎖状アルカン酸ナトリウム塩（プロピオン酸塩、酪
酸塩、ペンタン酸塩またはヘキサン酸塩）を接種培養液
に第５表に示す濃度で添加した。

第５表には、アルカン酸塩処理がハイブリドーマ細胞
の産生能を増大させることを示している。

Patterson編,Academic Press,1973参照）によつて細胞
から遊離させた核を計数することによつて測定した。上
清中のtPAの濃度はフイブリン−アガール法を用いて定
量した。

例７ 酪酸塩処理による細胞系からの組換えtPAの産生増大 組換え組織ブラスミノーゲンアクティベーター（tP
A）産生マウスC127細胞系を、回転容器（Bellco）中、
ミクロキヤリアー（ゲリビーズ,K.C.Biologicals）上で
培養した。生育メジウムは10％胎仔ウシ血清補給DMEMと
した。ミクロキヤリアーの濃度は、メジウム１あたり
5g（乾燥重量）とした。細胞は1mlあたり１×10⁵個の密
度で接種した。

細胞がミクロキヤリアーの表面上に集密に生育したの
ち、生育メジウムを吸引して、酪酸塩を含有する蛋白質
を含まないDMEM基礎培地で置換した。対照の培養液には
酪酸塩を加えなかつた。維持メジウムは第６表に示した
時間に、新鮮な維持メジウム（酪酸塩含有）で置換し
た。

細胞密度は、低張分解（“Tissue Culture Methods a
nd Applications",Kruse ＆

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞培養によって蛋白質を得る方法であっ
   て； （ａ） 構造的に該蛋白質を産生することができる遺伝
   子操作細胞またはハイブリドーマ細胞を、0.1mM〜200mM
   の濃度でのアルカン酸またはその塩の継続的存在下で、
   培養し； （ｂ） 培養を該蛋白質が蓄積するまで続け；ついで （ｃ） 所望により該蛋白質を単離する； ことを含む上記方法。
2. 【請求項２】アルカン酸またはその塩が、酪酸またはそ
   の塩である請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 【請求項３】アルカン酸またはその塩が、酪酸ナトリウ
   ムである請求の範囲第２項に記載の方法。
4. 【請求項４】アルカン酸またはその塩を、0.2mM〜10mM
   の濃度で存在させる、請求の範囲第１項から第３項のい
   ずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】蛋白質はホルモン、酵素、酵素阻害剤、リ
   ンフオカインまたは免疫グロブリンである請求の範囲第
   １項から第４項のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】蛋白質が、組織プラスミノーゲンアクテイ
   ベーターである請求の範囲第１項から第５項のいずれか
   １項に記載の方法。
7. 【請求項７】ハイブリドーマ細胞を培養する、請求の範
   囲第１項から第６項のいずれか１項に記載の方法。
8. 【請求項８】ハイブリドーマ細胞が、ラットハイブリド
   ーマ細胞である請求の範囲第７項に記載の方法。
9. 【請求項９】蛋白質が免疫グロブリンである請求の範囲
   第７項に記載の方法。
10. 【請求項１０】アルカン酸またはその塩を、0.1mM〜0.9
    mMの濃度で存在せしめる、請求の範囲第７項から第９項
    のいずれか１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】アルカン酸またはその塩を培養の始めに
    添加し、その後一定の間隔で、細胞の生育を減少せしめ
    る濃度を越えないようにコントロールして、アルカン酸
    またはその塩を添加する、請求の範囲第１項から第10項
    のいずれか１項に記載の方法。