KR101007171B1 - 세포 배양 배지 - Google Patents

Abstract

단백질 생성을 향상시키기 위해 짧은 지방산의 존재 하에 세포를 배양하는 방법.

Description

세포 배양 배지 {CELL CULTURE MEDIUM}

본 발명은 일반적으로 동물 세포 배양 분야에 관한 것이다. 이는 치료용 또는 다른 유용한 단백질을 생성하기 위해 동물 세포를 배양하는 방법 및 각각의 세포 배양 배지를 고안한다.

소듐 부티레이트 또는 다른 부티르산염은, 예를 들면, EP-239 292 A 에 기재된 바와 같이, 동물 세포 배양에서 제조되는 단백질의 수율을 향상시킨다는 것이 주지되어 있다. 상기 효과는 천연 분비 단백질, 예를 들면, 하이브리도마 (hybridoma)로부터의 항체, 또는 재조합 세포주에서 관찰될 수 있다. 부티레이트는 바람직하게는 5 mM 이하의 농도로 세포 배양 배지에 첨가된다. 배양 배지에의 부티르산 첨가에 관한 풍부한 과학 문헌에 의해 확인된 바와 같이, 상기 부티르산의 효과는 명확하고; 프로피오네이트 또는 펜타노에이트는 약 1 mM 의 농도에서 상당히 덜 효과적이다.

그러나, 세포 배양 보충물로서 부티레이트를 사용하는 것은 한계 및 결점이 있다. 0.1 내지 10 mM 범위로 부티레이트를 첨가하는 경우, 과다 투여하여 독성 및 세포 증식 억제 효과를 초래하지 않도록 주의깊게 균형을 유지할 필요가 있다. 성장율에 대한 부정적 효과는 농도가 소량 증가하는 경우에도 현저해질 수 있다. 대규모 생물반응기 배양 중에, 각각의 세포주 및 재조합 클론에 대한, 부티레이트의 최적량을 주의깊게 선택하고 조절하여야 한다. 예를 들면, EP-239 292 A 에 따르면, 하이브리도마 세포에 대해서는 0.1 mM 내지 1 mM 의 농도 범위가 바람직하고, 반면에, 다른 세포주는 1 mM 을 초과하는 농도에서도 부티레이트를 양호하게 허용할 수 있다. 하이브리도마 세포는, 예를 들면, 불충분한 산소 또는 영양 공급, 또는 화학적 화합물의 독성 영향의 부정적 효과에 대하여 다른 세포 유형 보다 더욱 민감하고, 이들은 일단 상기 부정적 자극을 받으면 세포 예정사 (programmed cell death)를 용이하고 비가역적으로 개시한다는 것이 주지되어 있다. 이와 같이, 부티레이트는 세포 배양에서 생산성을 증가시키기 위한, 일정 정도의 양면성을 갖는 수단임이 증명되었다.

Kim 등 (Biotechnology and Bioengineering 71,2001, 184-193, Overexpression of bcl-2 inhibits sodium butyrate-induced apoptosis in CHO cell resulting in enhanced humanized antibody production)은 bcl-2 재조합 세포주를 사용하여 5 mM 에서 소듐 부티레이트의 세포독성 효과를 제거하고, 상기 방법은 향상된 단백질 생성을 초래하였다. 그러나, 상기 방법은 재조합 bcl-2 및 생성 단백질 모두를 생성하는 재조합물을 생성하기 위한 광범위한 세포주 공학 (engineering)을 필요로 한다. 부티레이트 배지 보충물의 부정적 효과를 제거하는 보다 간단한 방법이 유리할 것이다.

US 5378 612 는 소듐 부티레이트 1 mM 가 이미 포함된 CHO 세포 배양용 배양 배지에 리튬염 (1O mM) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS, 1 ㎍/ml) 을 첨가하는 것의 단백질 수율 향상 상승 효과를 기술한다. 2 개의 상이한 리튬염에 대하여, 상기 수율 효과는 약 1.3 배이었고, 반면, LPS 는 부티레이트 대조군에 비하여 약 4 배의 향상된 효과를 나타내었다. 흥미롭게도, 10 mM 의 소듐 아세테이트는 상기 시험 시스템에서 대조군에 비해 사실상 아무런 잇점이 없음이 증명되었다.

Kooistra 등 (Biochem. J. 1987, butyrate stimulates tissue-type plasminogen-activator synthesis in cultured human endothelial, 247: 605-612)은 혈청 함유, 내피세포 배양에서 tPA 생성에 대한 잠재적 발현 향상 효과에 대해 각종 화합물을 시험하였고, 그들 중 일부 알카노산은 5 mM 의 아세테이트를 포함하였다. 오직, 프로피오네이트, 발레레이트, 및 부티레이트 (탁월한 효과를 가짐)가 상기 효과를 갖는다는 것을 발견하였다. 아세테이트는 대조군과 유의미하게 차이가 나지는 않았다.

본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 피하고, 동물 세포 배양에서 생성 단백질 수율을 향상시키기 위한 또다른 방법을 고안하는 것이다.

상기 목적은 세포 배양 배지에 아세테이트를 보충하는 동물 세포 배양 방법에 의해 본 발명에 따라 달성되고; 본 발명의 또다른 목적은 독립항 1, 6, 10, 11 및 12 항에 따른 아세테이트를 포함하는 상응하는 세포 배양 배지이다.

본 발명의 가능한 구현예를 도 및 표로 제시한다:

도 1 은 유가식 (fed-batch) 진탕 플라스크 배양에서 NS0 생산성에 대한 포타슘 및 소듐 아세테이트의 효과를 나타낸다.

도 2 는 소듐 아세테이트를 함유하지 않거나 또는 10 mM 을 함유하는 유가식 생물반응기 발효에 대한 NS0 성장 프로파일을 나타낸다.

도 3 은 도 2 에 따른 발효 실행에서 NS0 생산성에 대한 10 mM 의 소듐 아세테이트의 효과를 나타낸다.

도 4 는 접종물 배양 중 (접종물 중) 소듐 아세테이트를 포함하는 것 및 추가 아세테이트의 첨가 시기 (접종 시 또는 중간-대수기 중, 즉, 공급 시)가 NS0 에 미치는 영향을 비교한다. 모든 값은 대조군에 대한 백분율 차이로 표시된다.

도 5, 6 은 맞춤 (custom-made) 고밀도 성장 배지 중 7.5 mM 아세테이트를 갖는 재조합 NS0 세포의 성장 및 항체 생성을 나타낸다.

도 7,8 은 소듐 아세테이트를 갖는 NS0 세포 배양 보충물의 투여량-반응 곡선을 나타낸다.

도 9 내지 11 은 소듐 n-부티레이트를 갖는 NS0 세포 배양 배지 보충물의 비교 데이타를 나타낸다.

도 12 내지 14 는 소듐 아세테이트를 갖는 VPM 8 하이브리도마 세포 배양 보충물에 대한 투여량-반응 곡선을 나타낸다.

도 15 내지 17 은 소듐 n-부티레이트를 갖는 VPM 8 하이브리도마 세포 배양 보충물의 비교 데이타를 나타낸다.

본 발명에 따르면, 생성 단백질의 제조 방법이 고안되는데, 여기서, 생성 단백질은 세포 배양 중 포유동물 세포로부터 발현되고, 적어도 세포 배양 중 일정 기 간 동안 생성된다. 즉, 생성 단백질은 세포에 의해 구조적으로 발현되거나 또는 세포에 일정 자극을 가하여 일점 시점에서 발현을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 이는 구조적으로 발현된다. 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:

a) 포유동물 세포에 대한 세포 배양 배지를 제공하는 단계, 및

b) 및 아세트산 또는 아세테이트염, 또는 생물학적으로 활성화된 아세틸 에스테르를 최종 농도가 1 내지 20 mM, 바람직하게는 3 내지 15 mM, 더욱 바람직하게는 5 내지 12 mM, 가장 바람직하게는 6 내지 9.5 mM 이 되도록 추가로 첨가하는 단계로서, 세포 배양을 개시하기 전에 배지에 직접 첨가하거나 세포 배양 중 배지에 이를 공급하는 단계,

c) 상기 배지 중에 포유동물 세포를 추가로 배양하여 생성 단백질의 발현을 수반하는 단계, 및

d) 최종적으로, 세포 배양으로부터 상기 단백질을 채취하는 단계.

추가의 바람직한 구현예에서, 아세트산 또는 염, 또는 생물학적으로 활성화된 에스테르의 농도는, 상기 바람직한 농도 범위를 조합하여 추론될 수 있는 바와 같이, 6 내지 20 mM, 더욱 바람직하게는 6 내지 12 mM, 가장 바람직하게는 6 내지 9.5 mM 이다.

본 발명에 따른 생성 유전자는 고함량으로 발현시키고 채취하려는 생성 단백질이다. 이는 목적된 임의의 단백질, 예를 들면, 치료 단백질, 예컨대, 인터루킨 또는 효소, 또는 다중결합 (multimeric) 단백질 또는 다중결합 단백질의 하부 유닛 (subunit), 예컨대, 그들의 항체 또는 단편일 수 있다. 상기 재조합 생성 유전자는 호스트 (host) 생성 세포로부터 이전에 발현된 폴리펩티드를 분비시키는 신호 서열 코드화 (coding) 서열 부분을 포함할 수 있다. 상기 생성 단백질은 전이 유전자 프로모터 (promoter)로부터 발현된 재조합 단백질일 수 있거나 또는 이는 본래 활성인 유전자좌 (gene locus), 예를 들면, 통상적인 세포 융합 기술에 의해 생성되는 하이브리도마 세포 중 면역글로불린 유전자좌이다. 배양액 (culture broth)으로부터 단백질을 정제하기 위한 채취 및 분리 정제 (downstream processing) 기술은 당업계에 주지되어 있고, 통상적인 일이다. 시초에, 원심분리, 한외여과 (ultrafiltration) 및/또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 기술이 종종 적용되었는데, 이는 상기가 고부피의 재료를 처리할 수 있도록 하기 때문이다.

본 발명에 따른 아세테이트염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속과 같은 임의의 염일 수 있거나, 또는 임의의 다른 금속 아세테이트염이 사용될 수 있다. 배지는 통상적으로 버퍼되기 때문에, 비록 염이 바람직하다 하더라도, 아세트산 또는 아세트산 무수물의 첨가가 또한 용인될 수 있다. 유사하게, 높은 가수분해율 또는 세포외 효소의 활성에 기인하여, 배양하는 동안 배양 배지 중에 제자리에서 아세테이트를 방출하는 분리가능한 아세테이트 복합염 또는 아세트산의 에스테르가 사용될 수 있다. 상기는, 특히, 세포외효소의 활성에 적용하는 경우, "생물학적으로 활성가능한" 에스테르로 명칭될 수 있다. 아세테이트의 알칼리 및 알칼리토 금속염이 본 발명의 바람직한 구현예이다. 더욱 바람직하게는, 상기 염은 알칼리 금속염이나, 단, 상기 알칼리 금속은 리튬이 아니고, 가장 바람직하게는, 이는 소듐 아세테이트이다. 소듐 아세테이트는, 하기에 설명되는 바와 같이, 보존 배지 (maintenance medium) 에 반대되는 세포 성장 배지 내에서, 및 세포 배양 개시 시 또는 세포 배양 개시 전, 또는 모두에서의 소듐 아세테이트를 사용한 세포 처리 시에 6 내지 9.5 mM 의 농도로 배합되는 것이 특히 바람직하다.

바람직하게는, 본 발명의 세포 배양 배지에는 부티레이트가 배제된다. 부티레이트는 성장율을 용이하게 저하시키고, 세포자멸사 (apoptosis)를 유발하고; 이의 농도를 주의깊게 균형잡을 필요가 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 이는 성장률에 거의 또는 매우 미소한 영향을 나타내는 아세테이트로 용이하게 치환될 수 있다. 아세테이트는 세포자멸사를 유발하는 것으로 공지되지 않았다.

본 발명에 따르면, 아세테이트 또는 그의 균등물은 세포 배양 개시 전에 신선한 배지에 직접 첨가되거나 또는 이를 세포 배양 중, 바람직하게는 성장 배지 내에서의 대수 성장기 동안에 이를 배지에 공급한다. 공급물 첨가의 경우에, 아세테이트의 효과가 일정정도 지연되어 발생한다는 것을 고려해야 하는데, 즉, 생성 단백질 수율 향상 효과에 관하여 지연기 (lag phase)가 관찰될 수 있다. 일반적으로, 공급을 통해 아세테이트를 첨가하는 것이 덜 효과적이다. 본 발명에 따르면, 세포 배양 전에 및 전술한 양으로, 임의로 농도에 의존하는 아세테이트의 추가 공급과 함께, 세포 배양 배지, 바람직하게는 세포성장 배양 배지에 직접 아세테이트를 첨가하는 것이 매우 바람직하다. 가장 바람직하게는, 아세테이트는 전술한 함량으로, 특히 6 내지 9 mM 로 소듐 아세테이트 형태로 배양 개시 전에 배 양 배지에 오직 직접 첨가되고, 세포 배양 중 공급을 통하여 재보급되지 않고, 바람직하게는, 고세포밀도 성장 배지와 같은 적합한 배지 내에서의 배양 성장 중에 재보급되지 않는다.

본 발명에 따른 "세포 배양을 개시하기 전에 배지에 첨가하는 것"은 탐지가능한 성장 개시 전 초기 지연기를 포함하는 접종 시 쯤에 또는 배양 배지의 접종 전에도 세포를, 전술한 함량으로, 아세테이트 또는 그의 균등물에 노출시키는 것을 의미한다. 다시, "접종 전"이라는 것은 배양전 접종물 그자체를 전술한 함량으로 아세테이트 배지 보충물을 포함하는 배지 중에 성장시키는 것을 의미한다. 두가지 양태 모두를 결합시키는 것이 또한 가능하다. 특히 바람직한 하나의 구현예에서, 오직 접종 배양만이 전술한 함량의 아세테이트로 처리되는 반면, 대량 생산 배양에 사용되는 세포 배양 성장 배지는 1 mM 을 초과하는 범위의 아세테이트염은 배제된다.

적합한 세포 또는 세포주는 임의의 포유동물 세포주일 수 있다. 적합한 세포주는, 예를 들면 SV-40 무한증식 원숭이 신장세포 (COS-7) 세포, 원위 세뇨관세포 (canine kidney cell) (MDCK), 아프리카 녹색 원숭이 신장세포 (VERO-76), 유아 햄스터 신장 (BHK) 세포, 예컨대, ATCC CCL10, 인간 간세포 (Hep G2), 림프구 세포 (Jurkat T-세포주), 하이브리도마 세포 (예를 들면, SP2/0-Ag14, Shulman 등 1977) 또는 "골수종" 세포 (예를 들면, NS0 세포)일 수 있다. 상기 세포 전부가 균등하게 세포 배양 배지에 대한 아세테이트의 첨가에 양호하게 반응하지는 않는다는 것을 이해하여야 한다. 첨가로, 제공된 세포 유형 또는 세포주에 대해, 아세테이트의 효과는 상기 명시된 아세테이트 농도 범위 내에서 직선이거나 또는 일정하지 않을 수 있다. 세포주에 의존하여, 아세테이트의 수율 향상 효과가 최대치이고 아세테이트 농도가 보다 낮은 또는 보다 높은 쪽으로 이동하는 경우 상기 효과가 감소되는, 최적의 개별 농도를 나타낼 수 있고; 상기 최적 농도는 세포 유형 사이에서 상당히 변할 수 있고, 간단한 투여량 반응 실험에 의해 확립될 필요가 있을 수 있다.

포유동물 세포주에 대한 적합한 배지 및 배양 방법은, 예를 들면, US 5633162 에 기재된 바와 같이 주지되어 있다. 실험실 플라스크 또는 저밀도 세포 배양용이고, 특정 세포 유형의 필요에 의해 개조되는 표준 세포 배양 배지의 예는 하기와 같다: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 (Morre, G. , The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. 등 , Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), Dulbecco 의 개질된 Eagle 배지 (DMEM), Eagle 의 최소 필수 배지 (MEM), Ham 의 F12 배지 (Ham, R. 등 , Proc. Natl. Acad. Sc. 53, p288 ff. 1965), 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴이 결여된 Iscoves 의 개질된 DMEM (Iscoves 등 , J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978). 상기 배양 배지는 소태아 혈청 (FBS, FCS 로도 지칭)으로 보충될 수 있고, 후자는 다혈색 (plethora)의 호르몬 및 성장 인자의 천연 공급원을 제공한다는 것이 공지되어 있다. 척추동물 및 포유동물 세포의 세포 배양은, 각각, 통상적인 사건이 되었고, 예를 들면, [R. Ian Fresney, Culture of Animal cells, amanual, 4^th edition, Wiley-Liss/N. Y. , 2000]에 상세하게 기재되어 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 상기와 같이 배양되는 동물 세포의 성장을 용인하고 지지하는 배지이다. 성장은 일정 기간 이상의 세포 배양 동안 생존가능 세포 밀도가 증가하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따르면, 상기 "성장 배지"의 정의는 당업계에 통상적인 그 의미로 "보존 배지"라는 용어에 반대되는 것으로 이해되어야 한다. 보존 배지는 세포의 생존가능성을 지지하나 세포의 성장을 촉진하지는 않는 세포 배양 배지이다. 종종, 상기 보존 배지는 트랜스페린, 인슐린, 알부민 등과 같은 필수 성장 인자를 함유하지 않는다.

전술한 함량으로 아세테이트 또는 그의 균등물을 포함하는, 포유동물 세포 배양 배지인 배지의 상기 구현예는, 특히, 예를 들면 하이브리도마 및 골수종 세포와 같은 림프계 세포를 배양하는데 또는 상기 배양에 적합한 배지에 적용된다. 상기 하이브리도마라는 용어는 세포 융합에 의해 수득되는, 소위 콰드로마 (quadroma) 등을 포함하는 항체 분비 세포뿐만 아니라, 세포 주기 활성을 갖는 재조합 유전자 산물 또는 바이러스, 예를 들면 Eppstein-Barr-Virus 와 같은 무한증식제, 또는 임의의 화학적 무한증식제를 사용한 무한증식에 의해 수득되는 B-림프구성 항체 분비 세포도 포함한다. 본원에서, "하이브리도마"는 예를 들면 SP2/0-Ag14 (Shulman 등, 1977)와 같은 비분비 하이브리도마에 까지도 확장된다. 따라서, 본원에서의 하이브리도마로부터 채취하려는 생성 단백질은 부모 세포로부터의 항체와 같은 동종 유전자 생성물에 반드시 연관되지는 않고, 오히려 재조합 생성 단백질일 수 있다.

바람직하게는, 상기 세포는 '골수형'이고, 가장 바람직하게는, 상기는 골수종 NS0 세포주 (예를 들면, European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research (Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, 영국)에서 자유로이 이용가능한 세포주 ECACC 제 85110503 및 그의 유도체)이다. '골수형' 세포는 NS0 가 하나의 예인 종양 세포주이다. NS0 세포는, 비록 당업계에 통상 '골수형' 세포로서 매우 부정확하게 알려져 있지만, 실제로는 형질세포종이고, 하이브리도마와 같은 B-림프구 림프계 세포 계통의 결과이다 (Barnes 등, Cytotechnology 32: 109-123,2000). 따라서, 상응하는 세포 유형 또한 특히 바람직한 구현예이다. '골수종' NS0 세포는, 특히 재조합 항체 생성에 사용되는 경우, 매우 높은 생성 수율을 잠재적으로 야기시킨다는 것이 발견되었다. 가장 표준인 NS0 세포주는 콜레스테롤 의존적이고, 이는 통상적으로 콜레스테롤을 배양 배지의 필수 성분으로 만든다. 본 발명에 따르면, 림프계 세포는, 소위 트리오마 (trioma)를 야기하는 비분비 하이브리도마 세포주를 사용하는 융합, 또는 형질전환제 (transforming agent) 또는 바이러스 뿐만 아니라, 임의의 다른 림프계 세포주를 사용한 무한증식을 포함하는, 적합한 종양 세포주와의 세포 융합과 같은 다수의 기술에 의해 항체 분비 세포로부터 발생되는 하이브리도마 세포를 포함한다. 그러나, 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 포유동물 세포 또는 세포주는 하이브리도마 세포주가 아니고, 이는 상기 세포 또는 세포주가 비하이브리도마 세포주, 더욱 바람직하게는 비하이브리도마 재조합 세포주, 가장 바람직하게는 상기 정의된 재조합 '골수종' 세포주란 의미이다.

추가의 바람직한 구현예에서, 상기 세포주는 재조합 글루타민 합성효소 (GS)를 발현할 수 있는 NS0 세포주이다. NS0 세포는 글루타민 합성효소 (GS) 발현 시스템 (system)과 함께 사용되는 경우 특히 유리하다 (Bebbington 등, 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cell using a glutamine synthetase gene as anamplifiable selectable marker, Bio/Technology 10: 169-175; Cockett 등, 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cell using glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8: 662-667). 바람직하게는, 생성 단백질 유전자 서열 및 GS 유전자 서열은 상기 핵산 전달 감염된 (transfected) NS0 세포주 발생용 단일 GS 플라스미드 벡터 (plasmid vector) 상에서 전달되고, 상기 유전자는, 예를 들면, 내부 리보솜 도입 부위를 사용하는 상이하거나 또는 동일한 프로모터로부터 발현된다. 상기 GS 시스템은 치료 단백질을 생성하는데 특히 중요한 오직 2 개의 시스템 중 하나이다. 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 시스템과 비교하여, GS 시스템, 특히, NS0 골수종 세포와 조합되어 사용되는 GS 시스템은 발생 중에 큰 시간적 잇점을 제공하는데, 이는, 증가한 농도의 선별제 (selective agent) 존재 하에서의 복수 선별 필요성을 피하면서, 초기 핵산 전달 감염으로부터 고도로 생산성인 세포주가 종종 생성되어 유전자 증폭을 달성할 수 있기 때문이다 (Brown 등, 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9: 231-236). NS0 세포는 글루타민-합성효소 중에서 표현형적으로 부족하다. 따라서, 마우스 종양 세포주로부터 유래된 NS0 세포주 (Galfre, G. andMilstein,, C., Methods in Enzymol. 73,3-75, 1981)가 종종 산업적 규모에서 GS 시스템과 조합되어 사용되는 선택 세포주이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 소 태아 혈청 (FCS 또는 FBS)이 없어, '혈청-배제' 로도 불린다. 혈청 배제 배지 내의 세포는 일반적으로 최적 성장을 위해 혈청 배제 배지 내에 인슐린 및 트랜스페린을 필요로 한다. 트랜스페린은 비펩티드 킬레이트화제 또는 철포획체 (siderophore), 예컨대, WO 94/02592 에 기재되어 있는 트로폴론, 또는 유리하게는 비타민 C 와 같은 산화방지제와 함께, 증가된 농도의 유기 철 공급원에 의해 부분 이상으로 치환될 수 있다. 대부분의 세포주는, 예를 들면, 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 인슐린 유사 성장 인자 I 및 II (IGFI, IGFII) 등을 포함하는, 하나 이상의 합성 성장 인자 (재조합 폴리펩티드를 포함하는)를 필요로 한다. 필요할 수 있는 기타 부류의 인자에는 하기가 포함된다: 프로스타글란딘, 수송 및 결합 단백질 (예를 들면 세룰로플라스민, 고밀도 및 저밀도 지질 단백질, 소 혈청 알부민 (BSA)), 스테로이드 호르몬을 포함하는 호르몬, 및 지방산. 폴리펩티드 인자 시험은, 성장 자극물로 알려진 것들의 존재 하에서 새로운 폴리펩티드 인자를 시험하는, 단계형 방식으로 가장 잘 시행된다. 상기 성장 인자는 합성 또는 재조합된다. 동물 세포 배양에서 주지된 몇가지 방법론적 접근이 있는데, 하나의 예를 하기에 기술한다. 초기 단계는 세포가 혈청 보충된 배양 배지로부터 전달된 후 3 - 6 일 동안 생존하고/하거나 느리게 성장할 조건을 수득하는 것이다. 대부분의 세포 유형에서, 상기는 적어도 부분적으로 접종물 밀도의 기능이다. 일단 최적의 호르몬/성장 인자/폴리펩티드 보충물이 발견되는 경우, 상기 생존을 위해 요구되는 접종물 밀도는 감소할 것이다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 단백질이 배제된, 더욱 바람직하게는 단백질 배제 성장 배지인데, 즉, 이는 태아혈청 및 개별 단백질 성장 인자 보충물, 또는 재조합 트랜스페린 또는 지질 결합 및 수송용 혈청 알부민과 같은 기타 단백질 모두가 배제된 것이다. 가장 바람직하게는, 이는 상기 정의된 바와 같은 단백질 배제 배지이나, 여기에 재조합 또는 정제 알부민, 또는 그들의 서열 변형 또는 단편이 첨가되었다. 그러나, 통상적으로 배지 보충물로서 콜레스테롤을 필요로 하는 NS0 세포주에 대해서도, 단백질 생성을 위해 연속적으로 배양 및 성장될 수 있는 콜레스테롤-독립적인 하부종이 수득됨이 보고되었다 (Lonza Biologics, UK)는 것을 주목하여야 한다. 본 발명에 따른 단백질 배제 배양 배지는 특히 NS0 와 같은 골수종 세포주를 함께 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 방법 및 하기 구체화되는 세포 배양 배지의 더욱 바람직하고 가능한 구현예는, 공기부양 또는 관류 (perfusion) 생물반응기와 같은 산업적 유가식 생물반응기에서, 10⁵ 세포/ml 이상, 바람직하게는 10⁶ 세포/ml 의 생존가능 세포 밀 도 이상으로, 동물 세포를 고밀도 발효 또는 고밀도 성장 발효시키는 것이다. 결과적으로, 고밀도 성장 배양 배지가 사용되어야 한다. 상기 고밀도 성장 배지는 통상적으로 모든 아미노산과 같은 영양분, 상기 제공된 범위의 글루코오스와 같은 에너지원, 무기염, 비타민, 미량 원소 (통상적으로 최종 농도가 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 버퍼, 4 개의 뉴클레오시드 또는 그의 상응하는 뉴클레오티드, (환원된) 글루타티온과 같은 산화방지제, 비타민 C 및 기타 성분, 예컨대, 중요 막 지질, 예를 들면, 콜레스테롤 또는 포스페이티딜콜린, 또는 지질 전구체, 예컨대, 콜린 또는 이노시톨이 보충될 수 있다. 고밀도 배지는 상기 화합물 대부분 또는 전부가 풍부할 것이고, 본질적으로 등장성인 배지의 오스몰농도가 규제되는 것에 기인하여 무기염을 제외하고, RPMI 1640 과 비교하는 경우, EP-435 911 A 또는 GB-2251249 로부터 초래될 수 있는 전술한 표준 배지보다도 더욱 높은 함량으로 (강화된) 상기를 포함할 것이다. GB-2251249 는 적합한 고밀도 성장 배지의 예를 제공한다. 본 발명에 따르면, 상기 고밀도 세포 배양 배지는, 바람직하게는 부티레이트의 부재 하에, 전술한 함량으로 아세테이트를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 고밀도 배양 배지는 트립토판을 제외한 대다수의 아미노산이 배양 배지 내에서 75 mg/l 를 초과하여 존재하는 점에서 균형적으로 강화된다. 더욱 바람직하게는, 일반적인 아미노산의 요건과 함께, 글루타민 및 아스파라긴의 공동 함량이 전체로 1 g/l 초과, 가장 바람직하게는 2 g/l 를 초과하는 고밀도 배양 배지이다. 당연하게도, 후자의 보다 바람직한 구현예는, 특히, GS 유전자 서열의 증폭이 일어난 후에, 글루타민 합성효소 (GS) 벡터로 핵산전달감염된 재조합 세포주의 경우에 덜 적합하다. 상기 세포에서, 예를 들면, 외인성 및 내인성 공급원 공동으로부터의 글루타민 과량은 회피되어야 하는 암모니아의 생성을 초래할 것이다.

본 발명의 내용에서, 고밀도 세포 배양은 10⁵ 세포/ml 이상 또는 초과, 바람직하게는 10⁶ 세포/ml 이상 또는 초과의 생존가능 세포 밀도를 일시적으로 갖는 동물 세포 집단으로서 정의되고, 상기 집단은 일정한 또는 증가하는 배양 부피 중에서 보다 낮은 생존가능 세포 밀도를 갖는 단일세포 또는 접종물로부터 계속해서 성장한 집단이다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 배양은, 바람직하게는 적어도 글루타민을 포함하는 하나 이상의 다른 아미노산이, 별개의 공급으로 글루코오스 농도를 조절하는 것과는 별도로, 배지 중 그들의 농도를 유지하기 위하여 GB-2251249 에 기재된 바와 같이 세포 배양에 공급되는 유가식 배양이다. 더욱 바람직하게는, 글루타민, 및 이상적으로 글루타민을 포함하는 임의로 하나 이상의 다른 아미노산의 공급이 EP-229 809-A 에 기재된 바와 같은 세포 배양에 글루코오스와 같은 하나 이상의 에너지원을 공급하는 것과 조합된다. 글루타민은 적어도 부분적으로 아스파라긴으로 치환될 수 있다 (아스파라긴에 의한 글루타민의 치환에 대해서는 [Kurano, N. 등, 1990, J. Biotechnology 15,113-128] 참조). 통상적으로, 배양을 시작한 후 25 내지 60 시간에 공급을 개시하고; 예를 들면, 세포가 약 10⁶ 세포/ml 의 밀도에 도달하는 경우에 공급을 개시하는 것이 유용하다. 공급물에 존재할 수 있는 아미노산은 통상적으로 아미노산 당 배양물 부피 1 리터 당 10 내지 300 mg 의 전체 첨가 범위로 투여되고; 특히, 글리신, 리신, 아르기닌, 발린, 이소류신 및 류신은 통상적으로 다른 아미노산에 비하여 배양물 부피 1 리터 당 150 이상 내지 200 mg 의 보다 높은 함량으로 공급된다. GS 세포주를 제외하고, 글루타민 및/또는 아스파라긴의 총 공급물을 배양물 부피 1 리터 당 0.5 내지 3 g 의 범위, 바람직하게는 배양물 부피 1 리터 당 1 내지 2 g 범위로 조절하는 것이 유리할 수 있다. 공급물은 단기 첨가 (short addition) 또는 연속적인 펌핑 (pumping) 공급으로 첨가될 수 있고, 바람직하게는 상기 공급물은 생물반응기 내로 거의 연속적으로 펌핑된다. 당연하게도, 유가식 배양 중에 생물반응기 내에서 pH 는, 염기 또는 버퍼를 첨가하여, 제공된 세포주에 대한 대략 최적의 생리학적 pH 로 주의깊게 조절된다. 글루코오스가 에너지원으로 사용되는 경우에 글루코오스 공급물의 공급은 통상적으로 배지의 글루코오스 농도가 배양 1 리터 당 1 내지 10 그램, 바람직하게는 3 내지 6 그램으로 유지하도록 조절된다. 아미노산을 포함하는 것과는 별개로, 공급물은 바람직하게는 배양 1 리터 당 5 내지 20 mg 의 범위로 저함량의 콜린을 포함한다.

예를 들면, NS0 세포 배양에 적합한 아세테이트 보충물을 포함하는 상응하는 세포 배양 배지, 상기 세포 배양 배지 및 림프구 및/또는 NS0 세포로 이루어진 세포 배양 및 상기 배지를 제조하기 위한 배지 농축물이 본 발명의 추가 목적이다. 전술한 설명은 본 발명의 상기 구현예에도 마찬가지로 적용된다.

명시되지는 않으나, 항체 생산성 또는 적정 농도 (titer)를 단백질 A-HPLC 로 측정하였다.

실험 1

짧은 분비 재조합 마우스/인간 키메라 IgG cB72.3 (상기 Bebbington, 1992)용 GS-NS0 세포주 6A1(100)3,6A1 을 상기 분비 하의 모든 실험적 세팅 (setting)에사용하였다. 본질적으로 [Bebbington, 1992]에 기재된 바와 같이, 세포 배양을 10 l 표준 공기부양 생물반응기 중 진탕 플라스크 배양 또는 유가식으로 수행하였다. 공급물은 고밀도 배지 및 발효용으로, 각각, 아미노산 및 전술한 바와 같은 카르보히드레이트를 필수적으로 포함하였다. 공급물 부피는 접종 후 부피의 4 % 였다. 생존가능 세포 밀도가 14 ×10⁵ 세포/ml 초과시, 0.2 ml/Lh 의 속도로 공급을 개시하였다. 온도를 36.5 ℃ 로 조절하였고; 공기부양을 위하여, 공기 포화도를 15 % 로 하였다. pH 를 pH 7.00 으로 조절하였다. 배양을 2 ×10⁵ 생존가능 세포/ml 로 접종하였다. 배지는, 50 mM 메티오닌 술폭시민 (MSX)으로 보충된 혈청- 및 본질적으로 단백질-배제 성장 배지 ProCH04-CDM (BioWhittaker)였다. 세포를 배지에 예비 적응시켰다. 98% (10 mM 아세테이트로 성장된 균주에 대한 768 mg/L 에 비한 470 mg/L 의 대조군으로부터)까지 단백질 수율이 증가되는 것이 관찰되었다. 아세테이트가 성장을 억제하지 않는다는 것이 발견되었다. 이는 성장율을 약간 감소시키나, 최대 생존가능 세포 밀도를 저하시키지 않았다. 긍정적으로, 이는 발효 시에 정지기 (stationary phase)를 연장시켰다.

누적 세포 시간 (10⁶ 세포/h ml)을, 본질적으로, Renard 등 (1988, Biotechnology Letters 10,91-96)에 기재된 바와 같이, 세포 성장 곡선을 적분하여 계산하였다.

도1 은 유가식 진탕 플라스크 배양에서의 생산성에 대한 포타슘 및 소듐 아세테이트의 효과를 나타낸다. 소듐 아세테이트 또는 포타슘 아세테이트를 중간 대수 성장기 중에 진탕 플라스크에 도 1 의 표의 각각의 섹션에 기술된 최종 농도로 첨가하였다. 배양물을 매일 Trypan 블루 방법으로 계수하고, 단백질 A 분류 및 HPLC 분석에 의한 생성물 분석을 위해 샘플을 취하였다. 10 mM 의 소듐 아세테이트가 10 mM 또는 15 mM 의 포타슘 아세테이트보다 더욱 양호한 성능을 나타내었다. CCT 는 (대조군을 포함하는) 모든 처리에서 유사하였다.

결과적으로, 단일세포 생산성 (q_p)이 증가하는 것을 발견하였다.

도 2 는 10 mM 의 소듐 아세테이트를 함유하거나 또는 함유하지 않은 유가식 생물반응기 발효에 대한 성장 프로파일을 나타낸다. 대조군 및 10 mM 소듐 아세테이트 보충된 배양물에 대한 복제 배양물을 생존가능 세포 농도에 대하여 시험하였다 (Trypan 블루 배제 표준 계수 시험으로 측정). 4 일에 공급을 개시하였다. 도 1 에서와 같이 성장기 중에 아세테이트를 공급하지 않았으나, 접종 세포가 첨가된 즉시, 세포 배양 생성 배지에 포함시켰다. 알 수 있는 바와 같이, 아세테이트의 수율 향상 효과는, 성장 양태와 같이, 매우 재생적임이 증명되었다 ( 도 3). 어떠한 유의미한 성장 억제도 달성가능한 최대 세포 밀도에 관해서 관찰할 수 없었다. 성장률은, 아세테이트 첨가의 일정 효과가 재생산적으로 발견되었다 할지라도, 실질적으로 감소하지 않았다. CCT 는 모든 배양물에 대하여 본질적으로 유사하게 잔류하였다. 주목하게도, 아세테이트는 정지 성장기의 지속성 및 안정성을 향상시켰고; 생존가능 세포 밀도 정점 후의 생존가능 세포 밀도 저하는 아세테이트의 존재 하에 더욱 느리게되었다. 대수 성장기 보다도 정지기에 항체 생성이 더욱 높다는 것이 공지되어 있다.

일군의 추가 실험에서, 대조군, 및 전 단락에 기재된 아세테이트로 처리된 배양물 모두에 대해, 공급물에 LiCl 을 추가로 첨가하여, 최종 농도가 대략 1-10 mM (데이타는 제시되지 않음) 이도록 축적하였다. Li-염의 첨가가 임의의 방식으로 아세테이트의 상기 효과를 변형시킨다는 것이 증명되지 않았다. 확실히, 배양물의 n-부티레이트 보충에 대해 보고된 바와 같이, 아세테이트 효과의 상승적인 향상을 관찰할 수 없었다.

도 4 는 유가식 진탕 플라스크 배양물 중 접종 배양물 (접종물 중)에서, 또는 생성 배지에 대한 접종 시 (접종 시), 또는 중간 대수 증식기 중 제공된 공급물 중 (공급 시), 또는 그들의 조합으로 소듐 아세테이트를 포함하는 것의 효과를 비교한다. 모든 값은 대조군에 대한 백분율 차이로서 나타낸다. 첨가된 아세테이트 함량에 관하여, 명확한 투여량 의존성을 관찰할 수 있었다. 생성 배양을 위한 아세테이트 보충된 배양 배지를 사용하는 것을 의미하는, 접종 배양물, 또는 접종 시의 아세테이트 첨가가 증가된 수율 및 최대화된 단일세포 생산성 측면에 서 가장 효과적이다는 것을 발견하였다.

실험 2

EP-435 911 A 에 기재된 지질 보충 고밀도 배지와 유사하나, 에탄올 아민을 덜 사용하고 티오글리세롤을 사용하지 않고 센서 조절되는 (seNS0r-controlled) 자동 공급기로 트립토판 농도를 19 mM 로 일정하게 유지하는 것이 구별되는, 7.5 mM 의 소듐 아세테이트 및 독점적으로 높은 밀도의 배양 배지를 이제 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2 를 본질적으로 실험 1/도 2 에 대해 기술된 바와 같이 수행하였다. 상기 배지와 함께, 7.5 mM 의 아세테이트가 항체 수율 및 방법의 견고함 (robustness)에 관해서 상기 세포주에 최적인 것을 발견하였다. 도 5 는 7.5 mM 의 아세테이트에 대한 CCT 디아그램 (diagram)을 나타내는데, 이는 아세테이트의 적용이 성장율 또는 생존가능 세포 밀도를 감소시키지 않고 항체 수율을 향상시킨다는 것을 다시 증명한다. 실험 1 에 비하여, 정지기 성장에 대한 임의의 부정적 영향 없이, 아세테이트가 없는 대조군에 비하여 아세테이트 존재하에서 동일한 최대 생존가능 세포 밀도를 달성할 수 있었다. 유사하게, 대조군을 상회하여 및 시간이 지남에 따라 생성물 농도가 꾸준하게 증가하였다 (도 6). 소듐 부티레이트와 같은 다른 생산성 향상제와는 달리, 소듐 아세테이트의 첨가는 세포 성장 파라미터 (세포 성장율 및 누적 세포 시간)의 작은 감소만을 야기하였다. 상기와 같은 소듐 아세테이트의 첨가는 항체 채취 농도를 크게 증가시킨다.

실험 3

상기 실시예는 NS0 세포주 6A1 에 대해 상이한 양의 소듐 아세테이트를 20 mM 이하 범위로 첨가하는 것에 대한 투여량-반응 연구였고, 본질적으로 실험 1/도 2 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 7 은 첨가된 아세테이트 투여량에 의존하는 CCT 를 나타내고, 도 8 은 첨가된 아세테이트의 투여량에 의존하는 단일세포 특이적 생산성 (q_p)을 나타낸다.

비교예: 실험 4

세포 배양 배지에 대한 부티레이트 첨가는 NS0-6A1 세포 내에서의 항체 생산성을 증가시키지 않고; 1 mM 을 초과하는 투여량에서, 이는 세포에 대해 매우 독성이고, 생존가능 세포 밀도를 매우 빠르게 감소시킨다. 허용가능한 범위에서도, 생산성의 증가를 전혀 찾아볼 수 없었고, 단일세포 수준에서 조차도 그러하지 않았다. 상기 실험은 아세테이트 대신에 부티레이트가 제시된 함량으로 첨가된 것을 제외하고는 본질적으로 실험 1/도 2 에 기재된 바와 같이 수행되었다. 중간대수 증식기에서 부티레이트를 늦게 첨가하는 경우에도 생산성을 향상시키지 않았다. 도 9-11 은 CCT, 채취시 항체의 적정 농도 및 단일세포 특이적 생산성 (q_p)에 대한 부티레이트 첨가의 효과를 나타낸다.

실험 5

소듐 아세테이트의 첨가에 대한 투여량 반응 연구를, VPM 8 을 시판되는 단백질 배제 배지 CD-하이브리도마 (Invitrogen/U.K.) 에서 성장시키고, GS 세포주가 아니므로 MSX 를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 본질적으로 실험 3 에 기재된 바와 같이 하이브리도마 세포주 VPM 8 (ECACC No. 93113024, European Collection of 세포 배양s, supra)에 대하여 수행하였다. VPM 8 은 비분비 골수종 세포와의 통상적인 세포 융합 방법에 의해 생성된 마우스 하이브리도마이고, 쥣과 IgGI 항체를 분비한다. 도 12 내지 14 는 CCT, 채취시 항체 적정 농도, 및 단일세포 특이적 생산성 (q_p)에 대한 아세테이트 첨가 효과를 나타낸다. 주목하게도, 부티레이트와 비교해 볼 때, 하이브리도마 VPM 8 은 부티레이트와는 다르게 (상기 실험 6) mM 범위에서 놀랍게도 아세테이트를 용이하게 허용하고, 아세테이트 처리되지 않은 대조군에 비하여 향상된 생산성을 나타낸다. 후자는 선행 기술로부터 공지된 상기 세포의 부티레이트 처리 (상기 실험 6)에 기반해서는 예상할 수 없었다.

비교예: 실험 6

도15 내지 17 은 CCT, 채취시 항체 적정 농도, 및 단일세포 특이적 생산성 (q_p) 각각에 대한 VPM 8 하이브리도마 세포의 부티레이트 처리 효과를 나타낸다. 아세테이트를 숫자로 기재된 함량으로 n-부티레이트로 대체한 것을 제외하고는, 상기 실험을 본질적으로 실험 5 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상기 세포주에 대한 부티레이트의 독성을 제외하고도, 성장율 및 생존가능 세포 밀도를 저하시키지 않고, 임의의 부티레이트를 첨가하는 것은 결코 가능하지 않다. 따라서, 부티레이트 보충은 항체 적정 농도를 증가시키는데 있어서 효과적이지 않다.

Claims (19)

1. 세포 배양 중 적어도 일정 기간의 시간 동안, 단백질이 세포 배양물 내에서 림프계 세포로부터 발현되는, 하기의 단계를 포함하는 생성 단백질을 생성하는 방법:

   e) 상기 림프계 세포 배양용 단백질-배제 세포 배양 배지를 제조하는 단계,

   f) 및 추가로 아세트산 또는 아세테이트염 또는 아세틸 에스테르를 최종 농도가 1 내지 20 mM 이 되도록 첨가하는 단계로서, 상기 첨가가 세포 배양 개시 전 또는 개시 시에 배지에 직접 수행되거나 또는 이를 세포 배양 도중 배지에 공급하는 단계,

   g) 추가로, 상기 배지 내에서 상기 세포를 배양하면서 동시에 생성 단백질을 발현시키는 단계,

   h) 및 최종적으로 세포 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 세포 배양 배지에 부티레이트가 없는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아세트산 또는 아세테이트염 또는 아세틸 에스테르를 3 내지 15 mM 의 최종 농도로 세포 배양 개시 전 또는 개시 시에 배지에 직접 첨가하거나 또는 세포 배양 도중에 배지에 공급하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아세트산 또는 아세테이트염 또는 아세틸 에스테르를 5 내지 12 mM의 최종 농도로 세포 배양 개시 전 또는 개시 시에 배지에 직접 첨가하거나 또는 세포 배양 도중에 배지에 공급하는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 아세테이트 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 세포가 NSO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 세포가 재조합 글루타민 합성효소를 발현할 수 있는 NSO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 배지가 아세트산 또는 아세테이트염 또는 생물학적으로 활성인 아세틸 에스테르를 1 내지 20 mM 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 림프계 세포 배양용 단백질-배제 세포 배양 배지.
9. 제 8 항에 있어서, 배지에 부티르산 또는 그의 염이 없는 세포 배양 배지.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 아세트산 또는 아세테이트염 또는 생물학적으로 활성인 아세틸 에스테르를 3 내지 15 mM 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
11. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 아세트산 또는 아세테이트염 또는 생물학적으로 활성인 아세틸 에스테르를 5 내지 12 mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 배지가 고밀도 세포 배양 배지인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
13. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 배지가 NSO 세포 배양에 적합한 혈청-배제 및 단백질-배제 세포 배양 배지인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
14. 제 8 항에서 정의된 배양 배지 제조를 위한, 단백질-배제 세포 배양 배지, 및 아세트산 또는 아세테이트염 또는 생물학적으로 활성인 아세틸 에스테르를 포함하는 고체 또는 액체인 배지 농축물.
15. 제 8 항에 있어서, 림프계 세포 배양용인 세포 배양 배지.
16. 제 8 항에 따른 배지 중에 림프계 세포를 포함하는 세포 배양물.
17. 제 16 항에 있어서, 세포가 NSO 세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
18. 제 4 항에 있어서, 아세트산 또는 아세테이트염 또는 아세틸 에스테르의 최종 농도가 6 내지 9.5 mM 인 방법.
19. 제 11 항에 있어서, 아세트산 또는 아세테이트염 또는 생물학적으로 활성인 아세틸 에스테르를 6 내지 9.5 mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.

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