JPS61187794A - B型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− - Google Patents
B型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ−Info
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- JPS61187794A JPS61187794A JP60027516A JP2751685A JPS61187794A JP S61187794 A JPS61187794 A JP S61187794A JP 60027516 A JP60027516 A JP 60027516A JP 2751685 A JP2751685 A JP 2751685A JP S61187794 A JPS61187794 A JP S61187794A
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- hepatitis
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はB型肝炎表面抗原(uBSA、v)を製造する
ためのDNA組換え技術の利用に関する。
ためのDNA組換え技術の利用に関する。
B型肝炎ウィルス(HBV)は、血清肝炎の感染因子で
ある。このウィルスによる感染は世界的問題である:
HBVの保持者(キャリヤー)は急性または慢性の感染
症に苦しみ、慢性の場合は肝臓筋へ移行する可能性もお
る。このHBV感染因子は43rLmのゾーン(Dzr
Lg)粒子であることがつきとめられており、これはD
NA Nリメラーゼ及び・ 3200塩基対Cbp)
のDNA遺伝子よりなる内部コア粒子を囲む肝炎表面抗
原のリポ蛋白コートを有する。HB、rAyはHBV保
持者の血清中に主として22njrL の球形粒子また
はフィラメントとして見出され、HBV抗体の主要な標
的であることが観察されている。この22nm粒子は、
見掛は分子量22.000および27,000ダルトン
の二つのポリはプチドを含有する。これらのポリスプチ
ト9は恐らく同一のものであり、大型の方のペプチドで
はグリコンル化が存在する点のみで異なっている。
ある。このウィルスによる感染は世界的問題である:
HBVの保持者(キャリヤー)は急性または慢性の感染
症に苦しみ、慢性の場合は肝臓筋へ移行する可能性もお
る。このHBV感染因子は43rLmのゾーン(Dzr
Lg)粒子であることがつきとめられており、これはD
NA Nリメラーゼ及び・ 3200塩基対Cbp)
のDNA遺伝子よりなる内部コア粒子を囲む肝炎表面抗
原のリポ蛋白コートを有する。HB、rAyはHBV保
持者の血清中に主として22njrL の球形粒子また
はフィラメントとして見出され、HBV抗体の主要な標
的であることが観察されている。この22nm粒子は、
見掛は分子量22.000および27,000ダルトン
の二つのポリはプチドを含有する。これらのポリスプチ
ト9は恐らく同一のものであり、大型の方のペプチドで
はグリコンル化が存在する点のみで異なっている。
HB、rAyにたいするワクチン開発の臨床学的重要性
から、多くの研究者によってH13rAy蛋白質の単離
の試みがなされている。
から、多くの研究者によってH13rAy蛋白質の単離
の試みがなされている。
HBV遺伝子は大腸菌(Escherirchia c
oli ) 中にクローン化されており、完全なヌクレ
オチビ配列は、例えばBu、rrtlら(1979)N
atuyg 279.43によって決定されている。H
BVのDNAは、一方のストラン)’(L)に−重鎖ギ
ャップを有し、第二のストランドは種々の長さを有する
部分的二重鎖分子である。このHB、5′Aダ遺伝子は
大腸菌中にクローン化されており、介在配列のない68
0 hpの開いた読み取り枠(open readin
g frame )を有することが示されている。HB
zkgのDNA配列を宿主細胞に形質転換し、HB、?
A!Iの発現をえるために種々の系が採用されている。
oli ) 中にクローン化されており、完全なヌクレ
オチビ配列は、例えばBu、rrtlら(1979)N
atuyg 279.43によって決定されている。H
BVのDNAは、一方のストラン)’(L)に−重鎖ギ
ャップを有し、第二のストランドは種々の長さを有する
部分的二重鎖分子である。このHB、5′Aダ遺伝子は
大腸菌中にクローン化されており、介在配列のない68
0 hpの開いた読み取り枠(open readin
g frame )を有することが示されている。HB
zkgのDNA配列を宿主細胞に形質転換し、HB、?
A!Iの発現をえるために種々の系が採用されている。
種々のていどのHB、rAyの発現がSV40およびレ
トロウィルスなどのウィルスベクターで形質転換された
酵母およびは乳動物細胞中で検出されている。例えば、
Moriartyら、procoMate、Acad、
Sci、78゜2606−2610.1981及びLi
uら、 DNA(1)213−221.1982にはH
B、?A!1遺伝子を含み培養は乳動物細胞を形質転換
することの出来るSV40ベクターが記載されている。
トロウィルスなどのウィルスベクターで形質転換された
酵母およびは乳動物細胞中で検出されている。例えば、
Moriartyら、procoMate、Acad、
Sci、78゜2606−2610.1981及びLi
uら、 DNA(1)213−221.1982にはH
B、?A!1遺伝子を含み培養は乳動物細胞を形質転換
することの出来るSV40ベクターが記載されている。
Hamtrらの米国出願(1982年12月23日出願
:発明の名称” Humarl Qrowth flo
rmone Prodtbcedby Recomb*
nant DNA in Mowse (16)1ls
−には、5t、パピローマウィルス(BPV) ベク
ターにクローン化したマウスメタロチオネイン(MT)
−ヒト成長ホルモン雑種遺伝子が開示されている。ヒト
成長ホルモンの発現はカド9ミウムまたは他の重金属、
例えば亜鉛によって誘発されている。Hamerらはそ
の第5頁で「このベクターは培養細胞に他の非選択性遺
伝子、例えばワクチンとして使用可能なウィルス遺伝子
調製物(例えばB型肝炎表面抗原)・・・の遺伝子を導
入するために有用であると記載している。
:発明の名称” Humarl Qrowth flo
rmone Prodtbcedby Recomb*
nant DNA in Mowse (16)1ls
−には、5t、パピローマウィルス(BPV) ベク
ターにクローン化したマウスメタロチオネイン(MT)
−ヒト成長ホルモン雑種遺伝子が開示されている。ヒト
成長ホルモンの発現はカド9ミウムまたは他の重金属、
例えば亜鉛によって誘発されている。Hamerらはそ
の第5頁で「このベクターは培養細胞に他の非選択性遺
伝子、例えばワクチンとして使用可能なウィルス遺伝子
調製物(例えばB型肝炎表面抗原)・・・の遺伝子を導
入するために有用であると記載している。
Sαrver らは、は乳動物細胞の形質転換に使用し
たとき、それぞれラットプレプロインシュリン、ヒトベ
ータダロビン及びヒトベーターインターフェロンを発現
するBP■ベクターを記載している[5arvtrら(
1981) Mol、 and、 (16)11. B
iol、 l。
たとき、それぞれラットプレプロインシュリン、ヒトベ
ータダロビン及びヒトベーターインターフェロンを発現
するBP■ベクターを記載している[5arvtrら(
1981) Mol、 and、 (16)11. B
iol、 l。
486−496 ; DiMα乙0 (1982) P
、 N、 A、 S、 USA79、4030−403
4及びZLrLrLら(1982)P、 N、 A、S
。
、 N、 A、 S、 USA79、4030−403
4及びZLrLrLら(1982)P、 N、 A、S
。
USA 79.4897−49013゜本発明は一般に
、α)ヒトB型肝炎表面抗原をコードする遺伝子配列に
連結させた真核動物メタロチオネイン遺伝子のプロモー
ター、及びb)ウシパピローマウィルス遺伝子の形質転
換領域の少なくとも69%よりなり、該B型肝炎表面抗
原をコードする遺伝子配列の発曵が該メタロチオネイン
プロモーターの支配下にある、組換えDNAベクターに
関する。
、α)ヒトB型肝炎表面抗原をコードする遺伝子配列に
連結させた真核動物メタロチオネイン遺伝子のプロモー
ター、及びb)ウシパピローマウィルス遺伝子の形質転
換領域の少なくとも69%よりなり、該B型肝炎表面抗
原をコードする遺伝子配列の発曵が該メタロチオネイン
プロモーターの支配下にある、組換えDNAベクターに
関する。
好ましい態様においては、該はフタ−で形質転換された
マウスC127細胞は、連続して(継代することなく)
B型肝炎の表面抗原を少なくとも60日間、最も好まし
くは少なくとも80日間生産可能であり、該ベクターは
マウスC127細胞中の染色体外に多数のコピーで保持
可能であり、該ベクターで形質転換されたマウスC12
7細胞はB型肝炎表面抗原を重金属による誘発なしに少
な(とも5rn9/L(培養培地のリットル量)724
時間、最も好ましくは107#/L/24時間生産する
ことができるものでおり、この重金属による誘発なしの
B型肝炎表面抗原の生産は、カドミウム存在下での同じ
系におけるB型肝炎表面抗原の生産量と少なくとも同程
度以上であり、該ベクターはメタロチオネイン遺伝子の
全てをふくむものであり、該メタロチオネイン遺伝子は
マウスのメタロチオネイン遺伝子であり、そして宿主細
胞はげつ書類の線維芽細胞であり、i&も好ましくはマ
ウスC127細胞またはNIB 3T3細胞である。
マウスC127細胞は、連続して(継代することなく)
B型肝炎の表面抗原を少なくとも60日間、最も好まし
くは少なくとも80日間生産可能であり、該ベクターは
マウスC127細胞中の染色体外に多数のコピーで保持
可能であり、該ベクターで形質転換されたマウスC12
7細胞はB型肝炎表面抗原を重金属による誘発なしに少
な(とも5rn9/L(培養培地のリットル量)724
時間、最も好ましくは107#/L/24時間生産する
ことができるものでおり、この重金属による誘発なしの
B型肝炎表面抗原の生産は、カドミウム存在下での同じ
系におけるB型肝炎表面抗原の生産量と少なくとも同程
度以上であり、該ベクターはメタロチオネイン遺伝子の
全てをふくむものであり、該メタロチオネイン遺伝子は
マウスのメタロチオネイン遺伝子であり、そして宿主細
胞はげつ書類の線維芽細胞であり、i&も好ましくはマ
ウスC127細胞またはNIB 3T3細胞である。
本発明のベクターで形質転換されたほ乳動物細胞は、継
代の必要または細胞の死滅なしに連続して長期間培養可
能であり・、したがって収穫を行うたびごとに培養を再
開することなく、 HB、?A!1の連続的収穫を可能
ならしめる。従って、連続的方法によって抗原の回収を
好適ならしめ、新たな培養開始の回数を減少させる。更
に本発明のプラスミドは培養細胞中に高いコピー数で保
持して、HB、5′Aダ遺伝子な増幅することが可能で
ある。
代の必要または細胞の死滅なしに連続して長期間培養可
能であり・、したがって収穫を行うたびごとに培養を再
開することなく、 HB、?A!1の連続的収穫を可能
ならしめる。従って、連続的方法によって抗原の回収を
好適ならしめ、新たな培養開始の回数を減少させる。更
に本発明のプラスミドは培養細胞中に高いコピー数で保
持して、HB、5′Aダ遺伝子な増幅することが可能で
ある。
HB、rAyはMTプロモーターの支配下に発現される
。本発明の形質転換された細胞ラインによるHB、rA
yの生産率は犬であり、5mg/Lないし10mg/L
/24時間におよぶ。この高レベルのHB、rA!Iの
発現は形質転換細胞をカドミウムまたは他の重金属、例
えば亜鉛で誘発することなしに得ることが出来る。従っ
て、細胞培養は毒性物質の取扱の必要なく調製でき、B
型肝炎表面抗原の精製が培養培地中の毒性物質の存在に
よって複雑化することはない。
。本発明の形質転換された細胞ラインによるHB、rA
yの生産率は犬であり、5mg/Lないし10mg/L
/24時間におよぶ。この高レベルのHB、rA!Iの
発現は形質転換細胞をカドミウムまたは他の重金属、例
えば亜鉛で誘発することなしに得ることが出来る。従っ
て、細胞培養は毒性物質の取扱の必要なく調製でき、B
型肝炎表面抗原の精製が培養培地中の毒性物質の存在に
よって複雑化することはない。
本発明の他の態様及び利点は、以下の好ましい態様の記
載ならびに特許請求の範囲から明確になる。
載ならびに特許請求の範囲から明確になる。
図は本発明の好ましい態様を説明するためのものであり
、プラスミド”pRF300及びpRB−1の製造を示
す工程図である。
、プラスミド”pRF300及びpRB−1の製造を示
す工程図である。
図中pRB−1として示されるプラスミドは、マウスM
T遺伝子のMTプロモーターとMT構造遺伝子の間にH
B、p、Aダをコードする遺伝子を挿入することによっ
て生産された雑種遺伝子を含んでいる。プラスミドjP
RB−1はBPVの完全遺伝子をも含み、このため、こ
のベクターはは乳動物細胞を形質転換出来る。
T遺伝子のMTプロモーターとMT構造遺伝子の間にH
B、p、Aダをコードする遺伝子を挿入することによっ
て生産された雑種遺伝子を含んでいる。プラスミドjP
RB−1はBPVの完全遺伝子をも含み、このため、こ
のベクターはは乳動物細胞を形質転換出来る。
本発明のベクターは、当業者に公知のDNA組換え技術
によって構成できる。MT遺伝子および溶解性ウィルス
遺伝子を含有するプラスミドをエンドヌクレアーゼ制限
酵素をもちいて消化する。
によって構成できる。MT遺伝子および溶解性ウィルス
遺伝子を含有するプラスミドをエンドヌクレアーゼ制限
酵素をもちいて消化する。
次いで、ヒトHB、rAyをコーVする遺伝子を、前記
MT遺伝子のMTプロモーターとMT構造遺伝子との間
に挿入する。このMT−HB、rA!!及び溶解性ウィ
ルス遺伝子を含有する中間体プラスミドを。
MT遺伝子のMTプロモーターとMT構造遺伝子との間
に挿入する。このMT−HB、rA!!及び溶解性ウィ
ルス遺伝子を含有する中間体プラスミドを。
溶解性ウィルス遺伝子を削除するため消化し、BPV遺
伝子に置き換える。こうして得られたプラスミドはMT
−HB、?Ay雑種遺伝子とBPV遺伝子とを含む。
伝子に置き換える。こうして得られたプラスミドはMT
−HB、?Ay雑種遺伝子とBPV遺伝子とを含む。
、pRB −1の構成
全てのプラスミドはE、Co11 MC1061株中に
形質転換され、保持されているものである。図において
、マウスMT遺伝子およびSV40遺伝子を含有スルプ
ラスミ)”0L28 CHamerら、(1983)J
、 Mob、AppliecL Gen、l、 273
においてPJYMMTCの)と記載されている〕を
、B郵■エンドヌクレアーゼ制限酵素で消化し、プラス
ミドをプロモーター領域とMT遺伝子の構造配列の間で
開裂させた。プラスミ)’SWAM 115からのヒト
HB♂Ay遺伝子を含有する1、35 kh Bam
HI断片[Moriartyら(1981) P、 N
、 A、 S、 USA 78゜2605に記載されて
いる7)BR−8V40−HByAyプラスミド〕を切
断して取り出し、CL28のBt11■サイトに挿入し
て、P RF 300を形成した。
形質転換され、保持されているものである。図において
、マウスMT遺伝子およびSV40遺伝子を含有スルプ
ラスミ)”0L28 CHamerら、(1983)J
、 Mob、AppliecL Gen、l、 273
においてPJYMMTCの)と記載されている〕を
、B郵■エンドヌクレアーゼ制限酵素で消化し、プラス
ミドをプロモーター領域とMT遺伝子の構造配列の間で
開裂させた。プラスミ)’SWAM 115からのヒト
HB♂Ay遺伝子を含有する1、35 kh Bam
HI断片[Moriartyら(1981) P、 N
、 A、 S、 USA 78゜2605に記載されて
いる7)BR−8V40−HByAyプラスミド〕を切
断して取り出し、CL28のBt11■サイトに挿入し
て、P RF 300を形成した。
、PRF 300の5V4QおよびpBR配列の一部を
次いでBαmHI消化で除去し、SαtI酵素でさらに
消化してBtLrILH工およびSαt1末端を有する
線状分子をえた。
次いでBαmHI消化で除去し、SαtI酵素でさらに
消化してBtLrILH工およびSαt1末端を有する
線状分子をえた。
BPVの完全遺伝子を含むプラスミF”B2−2(図示
せず)をBam HIおよびSal l酵素で消化する
(BPV遺伝子の任意の由来ものが使用でき、例えば本
例ではNew E7LパαndBiolαhsから得た
B2−2を使用したが、これは単に好適なSαIIサイ
トを持つためである)。削除処理されたBPV−含有断
片(PBRDNAも含む)を前記HB5Ay−MT雑種
遺伝子を含有する線状Bam Hニー5alI断片に連
結させた。こうして得られたプラスミド、pRB−1,
は完全BPV 遺伝子およびMT遺伝子のプロモーター
とMT遺伝子の残部との間に挿入されたHB、tAy配
列遺伝子よりなる。
せず)をBam HIおよびSal l酵素で消化する
(BPV遺伝子の任意の由来ものが使用でき、例えば本
例ではNew E7LパαndBiolαhsから得た
B2−2を使用したが、これは単に好適なSαIIサイ
トを持つためである)。削除処理されたBPV−含有断
片(PBRDNAも含む)を前記HB5Ay−MT雑種
遺伝子を含有する線状Bam Hニー5alI断片に連
結させた。こうして得られたプラスミド、pRB−1,
は完全BPV 遺伝子およびMT遺伝子のプロモーター
とMT遺伝子の残部との間に挿入されたHB、tAy配
列遺伝子よりなる。
を導入するため、Wiglerら(1977) (16
)1l 11゜233のトランスフェクション技術を次
の通り変形した。鮭精子D N A IQμIを担体と
して含有する240 mM CaC12溶液Q、5 r
nlに7)RB−IDNAを5μI添加した。この溶液
をPH7,1の2xHBS(280mMNaCl 、
5Q mM ヘ−s ス、および1.5 mMリン酸ナ
トリウム)等量中に泡立てながら添加した。室温で30
分間リン酸カルシウムを形成させ。
)1l 11゜233のトランスフェクション技術を次
の通り変形した。鮭精子D N A IQμIを担体と
して含有する240 mM CaC12溶液Q、5 r
nlに7)RB−IDNAを5μI添加した。この溶液
をPH7,1の2xHBS(280mMNaCl 、
5Q mM ヘ−s ス、および1.5 mMリン酸ナ
トリウム)等量中に泡立てながら添加した。室温で30
分間リン酸カルシウムを形成させ。
トランスフェクションの24時間前に5に10.5の0
127細胞を播種した。リン酸カルシウムの沈殿が形成
しつつあるうちに、細胞増殖培地を交換した。このリン
酸カルシウムの沈殿を細胞に添加し。
127細胞を播種した。リン酸カルシウムの沈殿が形成
しつつあるうちに、細胞増殖培地を交換した。このリン
酸カルシウムの沈殿を細胞に添加し。
37°Cで6−8時間インキュベートした。DNAを除
去し、細胞をpH7のリン酸緩衝塩類液(PBS)中の
20%グリセロールに室温で1−2分間暴露した。細胞
をPBSで洗浄し、 10%牛脂児血清(MA’f3i
o1ogica1.sl製)、ペニシリン/ストレプト
マイシンおよびグルタミン(GIBCO製)10mMを
含有するダルベツコ修正培地IQmlを添加した。24
時間後およびその後3−4日置装培地を交換した゛。
去し、細胞をpH7のリン酸緩衝塩類液(PBS)中の
20%グリセロールに室温で1−2分間暴露した。細胞
をPBSで洗浄し、 10%牛脂児血清(MA’f3i
o1ogica1.sl製)、ペニシリン/ストレプト
マイシンおよびグルタミン(GIBCO製)10mMを
含有するダルベツコ修正培地IQmlを添加した。24
時間後およびその後3−4日置装培地を交換した゛。
細胞の集落は10−14日後に検出され、21日後にク
ローニングリング法で単離された。この集落を分析のた
めに増大させた。FRB−1で形質転換されたマウスC
127細胞はRockville、 MDのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、AT
CC寄託番号ACRL 8399が与えられている。
ローニングリング法で単離された。この集落を分析のた
めに増大させた。FRB−1で形質転換されたマウスC
127細胞はRockville、 MDのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、AT
CC寄託番号ACRL 8399が与えられている。
有用性
形質転換された細胞は慣用技術によって培養出来、培養
培地から慣用の手段を使用して、連続的にHB、?A!
1を収穫出来、B型肝炎ワクチンの調製に用いまたは生
化学的アッセイに同じく公知の技術により使用できる。
培地から慣用の手段を使用して、連続的にHB、?A!
1を収穫出来、B型肝炎ワクチンの調製に用いまたは生
化学的アッセイに同じく公知の技術により使用できる。
HB、rA!1は22日m粒子として培養培地中に分泌
され、これは培地の電子顕微鏡により観察できる。
され、これは培地の電子顕微鏡により観察できる。
pRB−1で形質転換されたマウスC127細胞は、培
地を24−48時間ごとに交換すれば85日まではコン
フルエント状態で生存可能である。細胞はフラスコまた
はa−ジ−ボトル中で連続的に倍増し。
地を24−48時間ごとに交換すれば85日まではコン
フルエント状態で生存可能である。細胞はフラスコまた
はa−ジ−ボトル中で連続的に倍増し。
トランスフオーム細胞としての増殖性を示す。本発明者
らは、BPVベクター中でHB、?A4生産を調節する
強力なメタロチオネインプロモーター(これは増幅され
たDNAコピー数を可能にする)とBPV形質転換細胞
の連続増殖性との組み合わせが、HBsAlの大規模生
産の最適システムを提供したものと結論した。
らは、BPVベクター中でHB、?A4生産を調節する
強力なメタロチオネインプロモーター(これは増幅され
たDNAコピー数を可能にする)とBPV形質転換細胞
の連続増殖性との組み合わせが、HBsAlの大規模生
産の最適システムを提供したものと結論した。
他の態様
本発明の範囲には他の態様も含まれる。例えば、BPV
の完全遺伝子の使用が好ましいh′−5形質転換領域の
69%のみを使用することも可能である。
の完全遺伝子の使用が好ましいh′−5形質転換領域の
69%のみを使用することも可能である。
しかしながら、69%の領域のみを使用したときは、プ
ラスミドと宿主細胞の染色体との間に好ましからぬ相互
作用が生じる可能性があり1例えばプラスミド#DNA
の多くの部分が残部エピソームではなく染色体に組み込
まれ、このためプラスミド9を細胞から回収するのが非
常に困難になることは有り得る。また、BPVの不完全
遺伝子を使用した時はトランスフェクションに先立って
、しばしばBPVK結合しているpBR領域(BPVは
通常pBR322から誘導されたプラスミドの一部とし
て提供されるから)を除去する必要がある。なぜならば
、完全BPvを使用したときは起こらないが、不完全B
PV断片中のpBR領域はトランスフェクションに阻害
的に作用する可能性もあるからである。69%領域のみ
を使用したときは、好ましからぬ再結合が生ずる可能性
もある。
ラスミドと宿主細胞の染色体との間に好ましからぬ相互
作用が生じる可能性があり1例えばプラスミド#DNA
の多くの部分が残部エピソームではなく染色体に組み込
まれ、このためプラスミド9を細胞から回収するのが非
常に困難になることは有り得る。また、BPVの不完全
遺伝子を使用した時はトランスフェクションに先立って
、しばしばBPVK結合しているpBR領域(BPVは
通常pBR322から誘導されたプラスミドの一部とし
て提供されるから)を除去する必要がある。なぜならば
、完全BPvを使用したときは起こらないが、不完全B
PV断片中のpBR領域はトランスフェクションに阻害
的に作用する可能性もあるからである。69%領域のみ
を使用したときは、好ましからぬ再結合が生ずる可能性
もある。
真核動物メタロチオネインプロモーターはは乳動物のも
のが好ましく、最も好ましくはネヅミのものであるが、
任意の適当なメタロチオネインプロモーターを使用でき
る(メタロチオネインを生産する各は乳動物は構造的に
異なる遺伝子によって生産しているようにみえる)。
のが好ましく、最も好ましくはネヅミのものであるが、
任意の適当なメタロチオネインプロモーターを使用でき
る(メタロチオネインを生産する各は乳動物は構造的に
異なる遺伝子によって生産しているようにみえる)。
本発明のベクターを製造するためには、pRB−1の代
わりに細胞ラインDNAをMTプロモーター及び構造遺
伝子の供給源として使用し、HBffiAy遺伝子及び
BP■遺伝子ならびに上記供給源からの遺伝子要素を慣
用の組換えDNA技術を使用して所望のベクターに挿入
できる。
わりに細胞ラインDNAをMTプロモーター及び構造遺
伝子の供給源として使用し、HBffiAy遺伝子及び
BP■遺伝子ならびに上記供給源からの遺伝子要素を慣
用の組換えDNA技術を使用して所望のベクターに挿入
できる。
適当な任意の宿主細胞を使用してよい。例えばBPVに
感染性の他のげつ菌類の線維芽細胞ライン、たとえばN
IH3T3細胞(ATCCCCL 92)を使用出来る
。
感染性の他のげつ菌類の線維芽細胞ライン、たとえばN
IH3T3細胞(ATCCCCL 92)を使用出来る
。
図はプラスミドpRF 300及びpRB−1の製造を
示す工程図である。 図面の浄書(内容に変更なし)
示す工程図である。 図面の浄書(内容に変更なし)
Claims (19)
- (1)a)ヒトB型肝炎の表面抗原をコードする遺伝子
配列に連結させた真核動物メタロチオネイン(meta
llothionein)遺伝子のプロモーター、及び
b)ウシパピローマウイルス遺伝子の形質転換領域の少
なくとも69%よりなり、該B型肝炎表面抗原をコード
する遺伝子配列の発現が該メタロチオネインプロモータ
ーの支配下にある、組換えDNAベクター。 - (2)前記ベクターで形質転換されたマウスC127細
胞が、前記B型肝炎表面抗原を少なくとも60日間連続
生産可能な特許請求の範囲第1項記載のベクター。 - (3)前記、ベクターで形質転換されたマウスC127
細胞が、前記B型肝炎表面抗原を少なくとも5mg/L
/24時間の率で生産可能である特許請求の範囲第1項
記載のベクター。 - (4)前記ベクターで形質変換されたマウスC127細
胞が、前記B型肝炎表面抗原を重金属での誘発なしに生
産可能である特許請求の範囲第1項記載のベクター。 - (5)前記ベクターが前記ウシパピローマウイルスの遺
伝子の全てを含む特許請求の範囲第1項記載のベクター
。 - (6)前記ベクタ−が形質転換マウスC127細胞内に
おいて染色体外に高コピー数で保持可能な特許請求の範
囲第1項記載のベクター。 - (7)前記細胞が少なくとも80日間B型肝炎表面抗原
を連続生産可能な特許請求の範囲第2項記載のベクター
。 - (8)前記ベクターで形質転換されたマウスC127細
胞が、重金属による誘発なしにB型肝炎表面抗原を少な
くとも5mg/L/24時間の率で生産可能な特許請求
の範囲第4項記載のベクター。 - (9)前記細胞が重金属による誘発なしに、B型肝炎表
面抗原を少なくとも10mg/L/24時間の率で生産
可能である特許請求の範囲第8項記載のベクター。 - (10)前記細胞がB型肝炎表面抗原を重金属による誘
発なしに、カドミウムの存在する同様な系におけるB型
肝炎表面抗原の生産量と同等の高率で生産することが可
能である特許請求の範囲第4項記載のベクター。 - (11)前記ベクターが前記メタロチオネインの全遺伝
子を含み、B型肝炎表面抗原をコードする遺伝子配列が
前記メタロチオネイン遺伝子の前記プロモーターと該メ
タロチオネイン遺伝子の残部との間に挿入されている特
許請求の範囲第1項記載のベクター。 - (12)特許請求の範囲第1項記載のベクターで形質転
換されたほ乳動物細胞。 - (13)前記細胞がげつ歯類線維芽細胞である特許請求
の範囲第12項記載の細胞。 - (14)前記細胞がマウスC127細胞である特許請求
の範囲第13項記載の細胞。 - (15)前記細胞がNIH3T3細胞である特許請求の
範囲第13項記載の細胞。 - (16)前記メタロチオネイン遺伝子がマウスメタロチ
オネイン遺伝子である特許請求の範囲第12項記載の細
胞。 - (17)特許請求の範囲第12項記載の細胞を培養培地
中で培養し、前記ヒトB型肝炎表面抗原を該培養培地中
から収穫することよりなる、ヒトB型肝炎表面抗原の製
造方法。 - (18)ATCC CRL 8399の性質を有する細
胞。 - (19)ATCC CRL 8399細胞に組み込まれ
た形質転換プラスミドの性質を有するプラスミド。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60027516A JPH0775545B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | B型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60027516A JPH0775545B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | B型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61187794A true JPS61187794A (ja) | 1986-08-21 |
JPH0775545B2 JPH0775545B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=12223288
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60027516A Expired - Lifetime JPH0775545B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | B型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0775545B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3788130A1 (en) | 2018-05-03 | 2021-03-10 | 3M Innovative Properties Company | Selective thin-film culture device for enumerating microorganisms |
-
1985
- 1985-02-14 JP JP60027516A patent/JPH0775545B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0775545B2 (ja) | 1995-08-16 |
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