JPS61187794A - Ｂ型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− - Google Patents
Ｂ型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ−Info
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- JPS61187794A JPS61187794A JP60027516A JP2751685A JPS61187794A JP S61187794 A JPS61187794 A JP S61187794A JP 60027516 A JP60027516 A JP 60027516A JP 2751685 A JP2751685 A JP 2751685A JP S61187794 A JPS61187794 A JP S61187794A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＢ型肝炎表面抗原（ｕＢＳＡ、ｖ）を製造する
ためのＤＮＡ組換え技術の利用に関する。
ためのＤＮＡ組換え技術の利用に関する。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）は、血清肝炎の感染因子で
ある。このウィルスによる感染は世界的問題である：
ＨＢＶの保持者（キャリヤー）は急性または慢性の感染
症に苦しみ、慢性の場合は肝臓筋へ移行する可能性もお
る。このＨＢＶ感染因子は４３ｒＬｍのゾーン（Ｄｚｒ
Ｌｇ）粒子であることがつきとめられており、これはＤ
ＮＡ Ｎリメラーゼ及び・ ３２００塩基対Ｃｂｐ）
のＤＮＡ遺伝子よりなる内部コア粒子を囲む肝炎表面抗
原のリポ蛋白コートを有する。ＨＢ、ｒＡｙはＨＢＶ保
持者の血清中に主として２２ｎｊｒＬ の球形粒子また
はフィラメントとして見出され、ＨＢＶ抗体の主要な標
的であることが観察されている。この２２ｎｍ粒子は、
見掛は分子量２２．０００および２７，０００ダルトン
の二つのポリはプチドを含有する。これらのポリスプチ
ト９は恐らく同一のものであり、大型の方のペプチドで
はグリコンル化が存在する点のみで異なっている。
ある。このウィルスによる感染は世界的問題である：
ＨＢＶの保持者（キャリヤー）は急性または慢性の感染
症に苦しみ、慢性の場合は肝臓筋へ移行する可能性もお
る。このＨＢＶ感染因子は４３ｒＬｍのゾーン（Ｄｚｒ
Ｌｇ）粒子であることがつきとめられており、これはＤ
ＮＡ Ｎリメラーゼ及び・ ３２００塩基対Ｃｂｐ）
のＤＮＡ遺伝子よりなる内部コア粒子を囲む肝炎表面抗
原のリポ蛋白コートを有する。ＨＢ、ｒＡｙはＨＢＶ保
持者の血清中に主として２２ｎｊｒＬ の球形粒子また
はフィラメントとして見出され、ＨＢＶ抗体の主要な標
的であることが観察されている。この２２ｎｍ粒子は、
見掛は分子量２２．０００および２７，０００ダルトン
の二つのポリはプチドを含有する。これらのポリスプチ
ト９は恐らく同一のものであり、大型の方のペプチドで
はグリコンル化が存在する点のみで異なっている。
ＨＢ、ｒＡｙにたいするワクチン開発の臨床学的重要性
から、多くの研究者によってＨ１３ｒＡｙ蛋白質の単離
の試みがなされている。
から、多くの研究者によってＨ１３ｒＡｙ蛋白質の単離
の試みがなされている。
ＨＢＶ遺伝子は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｒｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ） 中にクローン化されており、完全なヌクレ
オチビ配列は、例えばＢｕ、ｒｒｔｌら（１９７９）Ｎ
ａｔｕｙｇ ２７９．４３によって決定されている。Ｈ
ＢＶのＤＮＡは、一方のストラン）’（Ｌ）に−重鎖ギ
ャップを有し、第二のストランドは種々の長さを有する
部分的二重鎖分子である。このＨＢ、５′Ａダ遺伝子は
大腸菌中にクローン化されており、介在配列のない６８
０ ｈｐの開いた読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎ
ｇ ｆｒａｍｅ ）を有することが示されている。ＨＢ
ｚｋｇのＤＮＡ配列を宿主細胞に形質転換し、ＨＢ、？
Ａ！Ｉの発現をえるために種々の系が採用されている。
ｏｌｉ ） 中にクローン化されており、完全なヌクレ
オチビ配列は、例えばＢｕ、ｒｒｔｌら（１９７９）Ｎ
ａｔｕｙｇ ２７９．４３によって決定されている。Ｈ
ＢＶのＤＮＡは、一方のストラン）’（Ｌ）に−重鎖ギ
ャップを有し、第二のストランドは種々の長さを有する
部分的二重鎖分子である。このＨＢ、５′Ａダ遺伝子は
大腸菌中にクローン化されており、介在配列のない６８
０ ｈｐの開いた読み取り枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎ
ｇ ｆｒａｍｅ ）を有することが示されている。ＨＢ
ｚｋｇのＤＮＡ配列を宿主細胞に形質転換し、ＨＢ、？
Ａ！Ｉの発現をえるために種々の系が採用されている。
種々のていどのＨＢ、ｒＡｙの発現がＳＶ４０およびレ
トロウィルスなどのウィルスベクターで形質転換された
酵母およびは乳動物細胞中で検出されている。例えば、
Ｍｏｒｉａｒｔｙら、ｐｒｏｃｏＭａｔｅ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、７８゜２６０６−２６１０．１９８１及びＬｉ
ｕら、 ＤＮＡ（１）２１３−２２１．１９８２にはＨ
Ｂ、？Ａ！１遺伝子を含み培養は乳動物細胞を形質転換
することの出来るＳＶ４０ベクターが記載されている。
トロウィルスなどのウィルスベクターで形質転換された
酵母およびは乳動物細胞中で検出されている。例えば、
Ｍｏｒｉａｒｔｙら、ｐｒｏｃｏＭａｔｅ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、７８゜２６０６−２６１０．１９８１及びＬｉ
ｕら、 ＤＮＡ（１）２１３−２２１．１９８２にはＨ
Ｂ、？Ａ！１遺伝子を含み培養は乳動物細胞を形質転換
することの出来るＳＶ４０ベクターが記載されている。
Ｈａｍｔｒらの米国出願（１９８２年１２月２３日出願
：発明の名称” Ｈｕｍａｒｌ Ｑｒｏｗｔｈ ｆｌｏ
ｒｍｏｎｅ Ｐｒｏｄｔｂｃｅｄｂｙ Ｒｅｃｏｍｂ＊
ｎａｎｔ ＤＮＡ ｉｎ Ｍｏｗｓｅ （１６）１ｌｓ
−には、５ｔ、パピローマウィルス（ＢＰＶ） ベク
ターにクローン化したマウスメタロチオネイン（ＭＴ）
−ヒト成長ホルモン雑種遺伝子が開示されている。ヒト
成長ホルモンの発現はカド９ミウムまたは他の重金属、
例えば亜鉛によって誘発されている。Ｈａｍｅｒらはそ
の第５頁で「このベクターは培養細胞に他の非選択性遺
伝子、例えばワクチンとして使用可能なウィルス遺伝子
調製物（例えばＢ型肝炎表面抗原）・・・の遺伝子を導
入するために有用であると記載している。
：発明の名称” Ｈｕｍａｒｌ Ｑｒｏｗｔｈ ｆｌｏ
ｒｍｏｎｅ Ｐｒｏｄｔｂｃｅｄｂｙ Ｒｅｃｏｍｂ＊
ｎａｎｔ ＤＮＡ ｉｎ Ｍｏｗｓｅ （１６）１ｌｓ
−には、５ｔ、パピローマウィルス（ＢＰＶ） ベク
ターにクローン化したマウスメタロチオネイン（ＭＴ）
−ヒト成長ホルモン雑種遺伝子が開示されている。ヒト
成長ホルモンの発現はカド９ミウムまたは他の重金属、
例えば亜鉛によって誘発されている。Ｈａｍｅｒらはそ
の第５頁で「このベクターは培養細胞に他の非選択性遺
伝子、例えばワクチンとして使用可能なウィルス遺伝子
調製物（例えばＢ型肝炎表面抗原）・・・の遺伝子を導
入するために有用であると記載している。
Ｓαｒｖｅｒ らは、は乳動物細胞の形質転換に使用し
たとき、それぞれラットプレプロインシュリン、ヒトベ
ータダロビン及びヒトベーターインターフェロンを発現
するＢＰ■ベクターを記載している［５ａｒｖｔｒら（
１９８１） Ｍｏｌ、 ａｎｄ、 （１６）１１． Ｂ
ｉｏｌ、 ｌ。
たとき、それぞれラットプレプロインシュリン、ヒトベ
ータダロビン及びヒトベーターインターフェロンを発現
するＢＰ■ベクターを記載している［５ａｒｖｔｒら（
１９８１） Ｍｏｌ、 ａｎｄ、 （１６）１１． Ｂ
ｉｏｌ、 ｌ。
４８６−４９６ ； ＤｉＭα乙０ （１９８２） Ｐ
、 Ｎ、 Ａ、 Ｓ、 ＵＳＡ７９、４０３０−４０３
４及びＺＬｒＬｒＬら（１９８２）Ｐ、 Ｎ、 Ａ、Ｓ
。
、 Ｎ、 Ａ、 Ｓ、 ＵＳＡ７９、４０３０−４０３
４及びＺＬｒＬｒＬら（１９８２）Ｐ、 Ｎ、 Ａ、Ｓ
。
ＵＳＡ ７９．４８９７−４９０１３゜本発明は一般に
、α）ヒトＢ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子配列に
連結させた真核動物メタロチオネイン遺伝子のプロモー
ター、及びｂ）ウシパピローマウィルス遺伝子の形質転
換領域の少なくとも６９％よりなり、該Ｂ型肝炎表面抗
原をコードする遺伝子配列の発曵が該メタロチオネイン
プロモーターの支配下にある、組換えＤＮＡベクターに
関する。
、α）ヒトＢ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子配列に
連結させた真核動物メタロチオネイン遺伝子のプロモー
ター、及びｂ）ウシパピローマウィルス遺伝子の形質転
換領域の少なくとも６９％よりなり、該Ｂ型肝炎表面抗
原をコードする遺伝子配列の発曵が該メタロチオネイン
プロモーターの支配下にある、組換えＤＮＡベクターに
関する。
好ましい態様においては、該はフタ−で形質転換された
マウスＣ１２７細胞は、連続して（継代することなく）
Ｂ型肝炎の表面抗原を少なくとも６０日間、最も好まし
くは少なくとも８０日間生産可能であり、該ベクターは
マウスＣ１２７細胞中の染色体外に多数のコピーで保持
可能であり、該ベクターで形質転換されたマウスＣ１２
７細胞はＢ型肝炎表面抗原を重金属による誘発なしに少
な（とも５ｒｎ９／Ｌ（培養培地のリットル量）７２４
時間、最も好ましくは１０７＃／Ｌ／２４時間生産する
ことができるものでおり、この重金属による誘発なしの
Ｂ型肝炎表面抗原の生産は、カドミウム存在下での同じ
系におけるＢ型肝炎表面抗原の生産量と少なくとも同程
度以上であり、該ベクターはメタロチオネイン遺伝子の
全てをふくむものであり、該メタロチオネイン遺伝子は
マウスのメタロチオネイン遺伝子であり、そして宿主細
胞はげつ書類の線維芽細胞であり、ｉ＆も好ましくはマ
ウスＣ１２７細胞またはＮＩＢ ３Ｔ３細胞である。
マウスＣ１２７細胞は、連続して（継代することなく）
Ｂ型肝炎の表面抗原を少なくとも６０日間、最も好まし
くは少なくとも８０日間生産可能であり、該ベクターは
マウスＣ１２７細胞中の染色体外に多数のコピーで保持
可能であり、該ベクターで形質転換されたマウスＣ１２
７細胞はＢ型肝炎表面抗原を重金属による誘発なしに少
な（とも５ｒｎ９／Ｌ（培養培地のリットル量）７２４
時間、最も好ましくは１０７＃／Ｌ／２４時間生産する
ことができるものでおり、この重金属による誘発なしの
Ｂ型肝炎表面抗原の生産は、カドミウム存在下での同じ
系におけるＢ型肝炎表面抗原の生産量と少なくとも同程
度以上であり、該ベクターはメタロチオネイン遺伝子の
全てをふくむものであり、該メタロチオネイン遺伝子は
マウスのメタロチオネイン遺伝子であり、そして宿主細
胞はげつ書類の線維芽細胞であり、ｉ＆も好ましくはマ
ウスＣ１２７細胞またはＮＩＢ ３Ｔ３細胞である。
本発明のベクターで形質転換されたほ乳動物細胞は、継
代の必要または細胞の死滅なしに連続して長期間培養可
能であり・、したがって収穫を行うたびごとに培養を再
開することなく、 ＨＢ、？Ａ！１の連続的収穫を可能
ならしめる。従って、連続的方法によって抗原の回収を
好適ならしめ、新たな培養開始の回数を減少させる。更
に本発明のプラスミドは培養細胞中に高いコピー数で保
持して、ＨＢ、５′Ａダ遺伝子な増幅することが可能で
ある。
代の必要または細胞の死滅なしに連続して長期間培養可
能であり・、したがって収穫を行うたびごとに培養を再
開することなく、 ＨＢ、？Ａ！１の連続的収穫を可能
ならしめる。従って、連続的方法によって抗原の回収を
好適ならしめ、新たな培養開始の回数を減少させる。更
に本発明のプラスミドは培養細胞中に高いコピー数で保
持して、ＨＢ、５′Ａダ遺伝子な増幅することが可能で
ある。
ＨＢ、ｒＡｙはＭＴプロモーターの支配下に発現される
。本発明の形質転換された細胞ラインによるＨＢ、ｒＡ
ｙの生産率は犬であり、５ｍｇ／Ｌないし１０ｍｇ／Ｌ
／２４時間におよぶ。この高レベルのＨＢ、ｒＡ！Ｉの
発現は形質転換細胞をカドミウムまたは他の重金属、例
えば亜鉛で誘発することなしに得ることが出来る。従っ
て、細胞培養は毒性物質の取扱の必要なく調製でき、Ｂ
型肝炎表面抗原の精製が培養培地中の毒性物質の存在に
よって複雑化することはない。
。本発明の形質転換された細胞ラインによるＨＢ、ｒＡ
ｙの生産率は犬であり、５ｍｇ／Ｌないし１０ｍｇ／Ｌ
／２４時間におよぶ。この高レベルのＨＢ、ｒＡ！Ｉの
発現は形質転換細胞をカドミウムまたは他の重金属、例
えば亜鉛で誘発することなしに得ることが出来る。従っ
て、細胞培養は毒性物質の取扱の必要なく調製でき、Ｂ
型肝炎表面抗原の精製が培養培地中の毒性物質の存在に
よって複雑化することはない。
本発明の他の態様及び利点は、以下の好ましい態様の記
載ならびに特許請求の範囲から明確になる。
載ならびに特許請求の範囲から明確になる。
図は本発明の好ましい態様を説明するためのものであり
、プラスミド”ｐＲＦ３００及びｐＲＢ−１の製造を示
す工程図である。
、プラスミド”ｐＲＦ３００及びｐＲＢ−１の製造を示
す工程図である。
図中ｐＲＢ−１として示されるプラスミドは、マウスＭ
Ｔ遺伝子のＭＴプロモーターとＭＴ構造遺伝子の間にＨ
Ｂ、ｐ、Ａダをコードする遺伝子を挿入することによっ
て生産された雑種遺伝子を含んでいる。プラスミドｊＰ
ＲＢ−１はＢＰＶの完全遺伝子をも含み、このため、こ
のベクターはは乳動物細胞を形質転換出来る。
Ｔ遺伝子のＭＴプロモーターとＭＴ構造遺伝子の間にＨ
Ｂ、ｐ、Ａダをコードする遺伝子を挿入することによっ
て生産された雑種遺伝子を含んでいる。プラスミドｊＰ
ＲＢ−１はＢＰＶの完全遺伝子をも含み、このため、こ
のベクターはは乳動物細胞を形質転換出来る。
本発明のベクターは、当業者に公知のＤＮＡ組換え技術
によって構成できる。ＭＴ遺伝子および溶解性ウィルス
遺伝子を含有するプラスミドをエンドヌクレアーゼ制限
酵素をもちいて消化する。
によって構成できる。ＭＴ遺伝子および溶解性ウィルス
遺伝子を含有するプラスミドをエンドヌクレアーゼ制限
酵素をもちいて消化する。
次いで、ヒトＨＢ、ｒＡｙをコーＶする遺伝子を、前記
ＭＴ遺伝子のＭＴプロモーターとＭＴ構造遺伝子との間
に挿入する。このＭＴ−ＨＢ、ｒＡ！！及び溶解性ウィ
ルス遺伝子を含有する中間体プラスミドを。
ＭＴ遺伝子のＭＴプロモーターとＭＴ構造遺伝子との間
に挿入する。このＭＴ−ＨＢ、ｒＡ！！及び溶解性ウィ
ルス遺伝子を含有する中間体プラスミドを。
溶解性ウィルス遺伝子を削除するため消化し、ＢＰＶ遺
伝子に置き換える。こうして得られたプラスミドはＭＴ
−ＨＢ、？Ａｙ雑種遺伝子とＢＰＶ遺伝子とを含む。
伝子に置き換える。こうして得られたプラスミドはＭＴ
−ＨＢ、？Ａｙ雑種遺伝子とＢＰＶ遺伝子とを含む。
、ｐＲＢ −１の構成
全てのプラスミドはＥ、Ｃｏ１１ ＭＣ１０６１株中に
形質転換され、保持されているものである。図において
、マウスＭＴ遺伝子およびＳＶ４０遺伝子を含有スルプ
ラスミ）”０Ｌ２８ ＣＨａｍｅｒら、（１９８３）Ｊ
、 Ｍｏｂ、ＡｐｐｌｉｅｃＬ Ｇｅｎ、ｌ、 ２７３
においてＰＪＹＭＭＴＣの）と記載されている〕を
、Ｂ郵■エンドヌクレアーゼ制限酵素で消化し、プラス
ミドをプロモーター領域とＭＴ遺伝子の構造配列の間で
開裂させた。プラスミ）’ＳＷＡＭ １１５からのヒト
ＨＢ♂Ａｙ遺伝子を含有する１、３５ ｋｈ Ｂａｍ
ＨＩ断片［Ｍｏｒｉａｒｔｙら（１９８１） Ｐ、 Ｎ
、 Ａ、 Ｓ、 ＵＳＡ ７８゜２６０５に記載されて
いる７）ＢＲ−８Ｖ４０−ＨＢｙＡｙプラスミド〕を切
断して取り出し、ＣＬ２８のＢｔ１１■サイトに挿入し
て、Ｐ ＲＦ ３００を形成した。
形質転換され、保持されているものである。図において
、マウスＭＴ遺伝子およびＳＶ４０遺伝子を含有スルプ
ラスミ）”０Ｌ２８ ＣＨａｍｅｒら、（１９８３）Ｊ
、 Ｍｏｂ、ＡｐｐｌｉｅｃＬ Ｇｅｎ、ｌ、 ２７３
においてＰＪＹＭＭＴＣの）と記載されている〕を
、Ｂ郵■エンドヌクレアーゼ制限酵素で消化し、プラス
ミドをプロモーター領域とＭＴ遺伝子の構造配列の間で
開裂させた。プラスミ）’ＳＷＡＭ １１５からのヒト
ＨＢ♂Ａｙ遺伝子を含有する１、３５ ｋｈ Ｂａｍ
ＨＩ断片［Ｍｏｒｉａｒｔｙら（１９８１） Ｐ、 Ｎ
、 Ａ、 Ｓ、 ＵＳＡ ７８゜２６０５に記載されて
いる７）ＢＲ−８Ｖ４０−ＨＢｙＡｙプラスミド〕を切
断して取り出し、ＣＬ２８のＢｔ１１■サイトに挿入し
て、Ｐ ＲＦ ３００を形成した。
、ＰＲＦ ３００の５Ｖ４ＱおよびｐＢＲ配列の一部を
次いでＢαｍＨＩ消化で除去し、ＳαｔＩ酵素でさらに
消化してＢｔＬｒＩＬＨ工およびＳαｔ１末端を有する
線状分子をえた。
次いでＢαｍＨＩ消化で除去し、ＳαｔＩ酵素でさらに
消化してＢｔＬｒＩＬＨ工およびＳαｔ１末端を有する
線状分子をえた。
ＢＰＶの完全遺伝子を含むプラスミＦ”Ｂ２−２（図示
せず）をＢａｍ ＨＩおよびＳａｌ ｌ酵素で消化する
（ＢＰＶ遺伝子の任意の由来ものが使用でき、例えば本
例ではＮｅｗ Ｅ７ＬパαｎｄＢｉｏｌαｈｓから得た
Ｂ２−２を使用したが、これは単に好適なＳαＩＩサイ
トを持つためである）。削除処理されたＢＰＶ−含有断
片（ＰＢＲＤＮＡも含む）を前記ＨＢ５Ａｙ−ＭＴ雑種
遺伝子を含有する線状Ｂａｍ Ｈニー５ａｌＩ断片に連
結させた。こうして得られたプラスミド、ｐＲＢ−１，
は完全ＢＰＶ 遺伝子およびＭＴ遺伝子のプロモーター
とＭＴ遺伝子の残部との間に挿入されたＨＢ、ｔＡｙ配
列遺伝子よりなる。
せず）をＢａｍ ＨＩおよびＳａｌ ｌ酵素で消化する
（ＢＰＶ遺伝子の任意の由来ものが使用でき、例えば本
例ではＮｅｗ Ｅ７ＬパαｎｄＢｉｏｌαｈｓから得た
Ｂ２−２を使用したが、これは単に好適なＳαＩＩサイ
トを持つためである）。削除処理されたＢＰＶ−含有断
片（ＰＢＲＤＮＡも含む）を前記ＨＢ５Ａｙ−ＭＴ雑種
遺伝子を含有する線状Ｂａｍ Ｈニー５ａｌＩ断片に連
結させた。こうして得られたプラスミド、ｐＲＢ−１，
は完全ＢＰＶ 遺伝子およびＭＴ遺伝子のプロモーター
とＭＴ遺伝子の残部との間に挿入されたＨＢ、ｔＡｙ配
列遺伝子よりなる。
を導入するため、Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７） （１６
）１ｌ １１゜２３３のトランスフェクション技術を次
の通り変形した。鮭精子Ｄ Ｎ Ａ ＩＱμＩを担体と
して含有する２４０ ｍＭ ＣａＣ１２溶液Ｑ、５ ｒ
ｎｌに７）ＲＢ−ＩＤＮＡを５μＩ添加した。この溶液
をＰＨ７，１の２ｘＨＢＳ（２８０ｍＭＮａＣｌ 、
５Ｑ ｍＭ ヘ−ｓ ス、および１．５ ｍＭリン酸ナ
トリウム）等量中に泡立てながら添加した。室温で３０
分間リン酸カルシウムを形成させ。
）１ｌ １１゜２３３のトランスフェクション技術を次
の通り変形した。鮭精子Ｄ Ｎ Ａ ＩＱμＩを担体と
して含有する２４０ ｍＭ ＣａＣ１２溶液Ｑ、５ ｒ
ｎｌに７）ＲＢ−ＩＤＮＡを５μＩ添加した。この溶液
をＰＨ７，１の２ｘＨＢＳ（２８０ｍＭＮａＣｌ 、
５Ｑ ｍＭ ヘ−ｓ ス、および１．５ ｍＭリン酸ナ
トリウム）等量中に泡立てながら添加した。室温で３０
分間リン酸カルシウムを形成させ。
トランスフェクションの２４時間前に５に１０．５の０
１２７細胞を播種した。リン酸カルシウムの沈殿が形成
しつつあるうちに、細胞増殖培地を交換した。このリン
酸カルシウムの沈殿を細胞に添加し。
１２７細胞を播種した。リン酸カルシウムの沈殿が形成
しつつあるうちに、細胞増殖培地を交換した。このリン
酸カルシウムの沈殿を細胞に添加し。
３７°Ｃで６−８時間インキュベートした。ＤＮＡを除
去し、細胞をｐＨ７のリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）中の
２０％グリセロールに室温で１−２分間暴露した。細胞
をＰＢＳで洗浄し、 １０％牛脂児血清（ＭＡ’ｆ３ｉ
ｏ１ｏｇｉｃａ１．ｓｌ製）、ペニシリン／ストレプト
マイシンおよびグルタミン（ＧＩＢＣＯ製）１０ｍＭを
含有するダルベツコ修正培地ＩＱｍｌを添加した。２４
時間後およびその後３−４日置装培地を交換した゛。
去し、細胞をｐＨ７のリン酸緩衝塩類液（ＰＢＳ）中の
２０％グリセロールに室温で１−２分間暴露した。細胞
をＰＢＳで洗浄し、 １０％牛脂児血清（ＭＡ’ｆ３ｉ
ｏ１ｏｇｉｃａ１．ｓｌ製）、ペニシリン／ストレプト
マイシンおよびグルタミン（ＧＩＢＣＯ製）１０ｍＭを
含有するダルベツコ修正培地ＩＱｍｌを添加した。２４
時間後およびその後３−４日置装培地を交換した゛。
細胞の集落は１０−１４日後に検出され、２１日後にク
ローニングリング法で単離された。この集落を分析のた
めに増大させた。ＦＲＢ−１で形質転換されたマウスＣ
１２７細胞はＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＭＤのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴ
ＣＣ寄託番号ＡＣＲＬ ８３９９が与えられている。
ローニングリング法で単離された。この集落を分析のた
めに増大させた。ＦＲＢ−１で形質転換されたマウスＣ
１２７細胞はＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＭＤのアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴ
ＣＣ寄託番号ＡＣＲＬ ８３９９が与えられている。
有用性
形質転換された細胞は慣用技術によって培養出来、培養
培地から慣用の手段を使用して、連続的にＨＢ、？Ａ！
１を収穫出来、Ｂ型肝炎ワクチンの調製に用いまたは生
化学的アッセイに同じく公知の技術により使用できる。
培地から慣用の手段を使用して、連続的にＨＢ、？Ａ！
１を収穫出来、Ｂ型肝炎ワクチンの調製に用いまたは生
化学的アッセイに同じく公知の技術により使用できる。
ＨＢ、ｒＡ！１は２２日ｍ粒子として培養培地中に分泌
され、これは培地の電子顕微鏡により観察できる。
され、これは培地の電子顕微鏡により観察できる。
ｐＲＢ−１で形質転換されたマウスＣ１２７細胞は、培
地を２４−４８時間ごとに交換すれば８５日まではコン
フルエント状態で生存可能である。細胞はフラスコまた
はａ−ジ−ボトル中で連続的に倍増し。
地を２４−４８時間ごとに交換すれば８５日まではコン
フルエント状態で生存可能である。細胞はフラスコまた
はａ−ジ−ボトル中で連続的に倍増し。
トランスフオーム細胞としての増殖性を示す。本発明者
らは、ＢＰＶベクター中でＨＢ、？Ａ４生産を調節する
強力なメタロチオネインプロモーター（これは増幅され
たＤＮＡコピー数を可能にする）とＢＰＶ形質転換細胞
の連続増殖性との組み合わせが、ＨＢｓＡｌの大規模生
産の最適システムを提供したものと結論した。
らは、ＢＰＶベクター中でＨＢ、？Ａ４生産を調節する
強力なメタロチオネインプロモーター（これは増幅され
たＤＮＡコピー数を可能にする）とＢＰＶ形質転換細胞
の連続増殖性との組み合わせが、ＨＢｓＡｌの大規模生
産の最適システムを提供したものと結論した。
他の態様
本発明の範囲には他の態様も含まれる。例えば、ＢＰＶ
の完全遺伝子の使用が好ましいｈ′−５形質転換領域の
６９％のみを使用することも可能である。
の完全遺伝子の使用が好ましいｈ′−５形質転換領域の
６９％のみを使用することも可能である。
しかしながら、６９％の領域のみを使用したときは、プ
ラスミドと宿主細胞の染色体との間に好ましからぬ相互
作用が生じる可能性があり１例えばプラスミド＃ＤＮＡ
の多くの部分が残部エピソームではなく染色体に組み込
まれ、このためプラスミド９を細胞から回収するのが非
常に困難になることは有り得る。また、ＢＰＶの不完全
遺伝子を使用した時はトランスフェクションに先立って
、しばしばＢＰＶＫ結合しているｐＢＲ領域（ＢＰＶは
通常ｐＢＲ３２２から誘導されたプラスミドの一部とし
て提供されるから）を除去する必要がある。なぜならば
、完全ＢＰｖを使用したときは起こらないが、不完全Ｂ
ＰＶ断片中のｐＢＲ領域はトランスフェクションに阻害
的に作用する可能性もあるからである。６９％領域のみ
を使用したときは、好ましからぬ再結合が生ずる可能性
もある。
ラスミドと宿主細胞の染色体との間に好ましからぬ相互
作用が生じる可能性があり１例えばプラスミド＃ＤＮＡ
の多くの部分が残部エピソームではなく染色体に組み込
まれ、このためプラスミド９を細胞から回収するのが非
常に困難になることは有り得る。また、ＢＰＶの不完全
遺伝子を使用した時はトランスフェクションに先立って
、しばしばＢＰＶＫ結合しているｐＢＲ領域（ＢＰＶは
通常ｐＢＲ３２２から誘導されたプラスミドの一部とし
て提供されるから）を除去する必要がある。なぜならば
、完全ＢＰｖを使用したときは起こらないが、不完全Ｂ
ＰＶ断片中のｐＢＲ領域はトランスフェクションに阻害
的に作用する可能性もあるからである。６９％領域のみ
を使用したときは、好ましからぬ再結合が生ずる可能性
もある。
真核動物メタロチオネインプロモーターはは乳動物のも
のが好ましく、最も好ましくはネヅミのものであるが、
任意の適当なメタロチオネインプロモーターを使用でき
る（メタロチオネインを生産する各は乳動物は構造的に
異なる遺伝子によって生産しているようにみえる）。
のが好ましく、最も好ましくはネヅミのものであるが、
任意の適当なメタロチオネインプロモーターを使用でき
る（メタロチオネインを生産する各は乳動物は構造的に
異なる遺伝子によって生産しているようにみえる）。
本発明のベクターを製造するためには、ｐＲＢ−１の代
わりに細胞ラインＤＮＡをＭＴプロモーター及び構造遺
伝子の供給源として使用し、ＨＢｆｆｉＡｙ遺伝子及び
ＢＰ■遺伝子ならびに上記供給源からの遺伝子要素を慣
用の組換えＤＮＡ技術を使用して所望のベクターに挿入
できる。
わりに細胞ラインＤＮＡをＭＴプロモーター及び構造遺
伝子の供給源として使用し、ＨＢｆｆｉＡｙ遺伝子及び
ＢＰ■遺伝子ならびに上記供給源からの遺伝子要素を慣
用の組換えＤＮＡ技術を使用して所望のベクターに挿入
できる。
適当な任意の宿主細胞を使用してよい。例えばＢＰＶに
感染性の他のげつ菌類の線維芽細胞ライン、たとえばＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ ９２）を使用出来る
。
感染性の他のげつ菌類の線維芽細胞ライン、たとえばＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ ９２）を使用出来る
。
図はプラスミドｐＲＦ ３００及びｐＲＢ−１の製造を
示す工程図である。 図面の浄書（内容に変更なし）
示す工程図である。 図面の浄書（内容に変更なし）
Claims (19)
- （１）ａ）ヒトＢ型肝炎の表面抗原をコードする遺伝子
配列に連結させた真核動物メタロチオネイン（ｍｅｔａ
ｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）遺伝子のプロモーター、及び
ｂ）ウシパピローマウイルス遺伝子の形質転換領域の少
なくとも６９％よりなり、該Ｂ型肝炎表面抗原をコード
する遺伝子配列の発現が該メタロチオネインプロモータ
ーの支配下にある、組換えＤＮＡベクター。 - （２）前記ベクターで形質転換されたマウスＣ１２７細
胞が、前記Ｂ型肝炎表面抗原を少なくとも６０日間連続
生産可能な特許請求の範囲第１項記載のベクター。 - （３）前記、ベクターで形質転換されたマウスＣ１２７
細胞が、前記Ｂ型肝炎表面抗原を少なくとも５ｍｇ／Ｌ
／２４時間の率で生産可能である特許請求の範囲第１項
記載のベクター。 - （４）前記ベクターで形質変換されたマウスＣ１２７細
胞が、前記Ｂ型肝炎表面抗原を重金属での誘発なしに生
産可能である特許請求の範囲第１項記載のベクター。 - （５）前記ベクターが前記ウシパピローマウイルスの遺
伝子の全てを含む特許請求の範囲第１項記載のベクター
。 - （６）前記ベクタ−が形質転換マウスＣ１２７細胞内に
おいて染色体外に高コピー数で保持可能な特許請求の範
囲第１項記載のベクター。 - （７）前記細胞が少なくとも８０日間Ｂ型肝炎表面抗原
を連続生産可能な特許請求の範囲第２項記載のベクター
。 - （８）前記ベクターで形質転換されたマウスＣ１２７細
胞が、重金属による誘発なしにＢ型肝炎表面抗原を少な
くとも５ｍｇ／Ｌ／２４時間の率で生産可能な特許請求
の範囲第４項記載のベクター。 - （９）前記細胞が重金属による誘発なしに、Ｂ型肝炎表
面抗原を少なくとも１０ｍｇ／Ｌ／２４時間の率で生産
可能である特許請求の範囲第８項記載のベクター。 - （１０）前記細胞がＢ型肝炎表面抗原を重金属による誘
発なしに、カドミウムの存在する同様な系におけるＢ型
肝炎表面抗原の生産量と同等の高率で生産することが可
能である特許請求の範囲第４項記載のベクター。 - （１１）前記ベクターが前記メタロチオネインの全遺伝
子を含み、Ｂ型肝炎表面抗原をコードする遺伝子配列が
前記メタロチオネイン遺伝子の前記プロモーターと該メ
タロチオネイン遺伝子の残部との間に挿入されている特
許請求の範囲第１項記載のベクター。 - （１２）特許請求の範囲第１項記載のベクターで形質転
換されたほ乳動物細胞。 - （１３）前記細胞がげつ歯類線維芽細胞である特許請求
の範囲第１２項記載の細胞。 - （１４）前記細胞がマウスＣ１２７細胞である特許請求
の範囲第１３項記載の細胞。 - （１５）前記細胞がＮＩＨ３Ｔ３細胞である特許請求の
範囲第１３項記載の細胞。 - （１６）前記メタロチオネイン遺伝子がマウスメタロチ
オネイン遺伝子である特許請求の範囲第１２項記載の細
胞。 - （１７）特許請求の範囲第１２項記載の細胞を培養培地
中で培養し、前記ヒトＢ型肝炎表面抗原を該培養培地中
から収穫することよりなる、ヒトＢ型肝炎表面抗原の製
造方法。 - （１８）ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８３９９の性質を有する細
胞。 - （１９）ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８３９９細胞に組み込まれ
た形質転換プラスミドの性質を有するプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60027516A JPH0775545B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60027516A JPH0775545B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61187794A true JPS61187794A (ja) | 1986-08-21 |
| JPH0775545B2 JPH0775545B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=12223288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60027516A Expired - Lifetime JPH0775545B2 (ja) | 1985-02-14 | 1985-02-14 | Ｂ型肝炎表面抗原をコ−ドするベクタ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0775545B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11851643B2 (en) | 2018-05-03 | 2023-12-26 | 3M Innovative Properties Company | Selective thin-film culture device for enumerating microorganisms |
-
1985
- 1985-02-14 JP JP60027516A patent/JPH0775545B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0775545B2 (ja) | 1995-08-16 |
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