JPS63132845A - 肝炎ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １艶皇１１ Ｂ型肝炎は、広範囲地域に亘って発症する病気であり、
ある国では人工の約１０％がＢ型肝炎のキャリアーであ
る。そのような国では、肝細胞筋と共にＢ型肝炎及び肝
硬変が、死亡の主要原因の１つになっている。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）によって肝ＷａＳ（ＨＣＣ
）が引き起こされるという強力な証拠が存在する。従っ
てかかる見地から、安全で経済的なワクチンの開発が強
く望まれている。ここで大きな問題として、ＨＢＶを組
織培養で増殖させることができないという問題がある。

今日までに、遺伝子工学技術によってワクチンを製造す
る試みが、いくつかなされている（　Ｔｉｏｌｌａｉｓ
ら、　ＴｈｅＨｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ、Ｎ
ａｔｕｒｅ３１７．４８９　（１９８５）］。

Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の感染に特徴的な免疫学的
マーカーとして、３つのコード蛋白質、即ち表面抗原Ｈ
ＢｓＡｇ，コア抗原ＨＢｃＡａ。

コア由来抗原ＨＢｅＡＱがある。ウィルス血症のＨＢＶ
キャリアーの血漿中から、２種類の粒子が見出されてい
る。即ち、ゾーン粒子として知られる２２ｎｍの粒子と
４２０−の粒子であり、後者の粒子は、コア粒子（コア
抗原及びＤＮＡポリメラーゼを有するゲノムＨＢＶ　　
ＤＮＡ）を囲む外部表面抗原から構成されている。前者
の２２ｎｍの粒子は、ＨＢＶの慢性キャリアーにおいて
産生され、またＨＢＶに関連した肝癌によっても産生さ
れる。

ト１８ｖ表面抗原に特異的な抗体は、ＨＢＶ感染に対し
て防御作用を有するため、免疫原性の非常に高い２２１
１１の粒子がＨＢＶの活性ワクチンとして提供されてき
た。ウィルス血症キャリアーから単離した２２ｒｖの粒
子は、数個のｇＡ連した蛋白質から構成されている。こ
のうちの主たる蛋白質はＰ２４であり、このグリコジル
化されたものはＧＰ２７として知られている。他のマイ
ナーな蛋白質はＰ３３であり、このグリコジル化された
ものはＧＰ３６として知られている。ゾーン粒子は、第
３のマイナーな蛋白質Ｐ３９を含んでおり、このグリコ
ジル化されたものはＧＰ４２として知られている。酵母
及びバクリチア系において合成されるＰ２４は、ＨＢＶ
に対する好適なワクチンとして期待されている。しかし
ながら、より長い蛋白質、即ちＰ３３とＧＰ３６がＰ２
４並びにＧＰ２７よりも、はるかに＾い免疫原性を有す
ることが最近になって明らかにされた。

ＨＢｓＡｏ遺伝子の転写解読枠の配列は、３つの独立し
た発現部分に分けられる。即ち、＋１）　Ｐ　３２とＧ
Ｐ４２のみに存在するプレーＳ１；１２）　Ｇ　Ｐ　３
３とＧＰ３６に存在するプレーＳ２：及び（３）すべて
の蛋白質に存在するＳである。

ＨＢｓＡｇ遺伝子の転写は、少なくとも２つの独立した
プロモーターによって調節されている。遺伝子の５′末
端のＴＡＴＡボックスプロモーターを活性化することに
より最も長い転゛写を達成することができる。この場合
の転写には、全てのＨＢＳ八〇へ白質の合成に必要な完
全な情報が含まれている。培１１１９１中に遺伝子が安
定に導入された時には、ＨＥ３ｓＡａのＴＡＴＡボック
スプロモーターはほとんど不活性である。しかしながら
、アレキサンダー（＾１ｅｘａｎｄｅｒ　）　１［１胞
においては、このプロモーターの活性が低いながら検出
されている。このｌ胞は、２２ｎｉの粒子を産生ずるこ
とが知られたヒト肝癌セルラインである。ＳＶ４０様プ
ロモーターと言われる他のプロモーターによって、短い
転写が達成される。この転写の場合には、プレー８１領
域が含まれておらず、従ってＰ３９及びＧＰ４２がコー
ドされない。ＳＶ４０様プロモーターは複数の開始部位
を有しているため、Ｐ３３とＧＰ３６あるいはＰ２４と
ＧＰ２７のいずれかをコードする２種類のＲＮＡが産生
される。

組織培養によりＨＢＶワクチンを製造する場合には、次
の如きいくつかの利点がある。

１、バクテリア系と異なり、組織培養系による場合には
、グリコジル化ＨＢｓＡｇと非グリコジル化ＨＢｓＡｇ
の両者を製造することが出来る。

２、組織培養の場合のみ、複雑なＨＢ　Ｖ表面全遺伝子
を発現せしめることができる。即ち、ＨＢＶの本物のプ
ロモーターを使用することにより、３つのＨＢｓＡｇｆ
ｌｌ連蛋白質及びそれらのグリコジル化蛋白質のすべて
をコードする転写物が得られる。

３、組織培養では、ＨＢｓＡｇは安定な２２ｎ霞の粒子
中に組み立てられ、この粒子は他の異種システムで産生
された溶解性ＨＢＳ／’Ｑよりもはるかに高い免疫原性
を示す。

４、バクテリアあるいは酵母と異なり、哺乳動物細胞に
より２２ｎＩｌの粒子が産生され分泌される。

このためワクチンの精製が簡単になる。

現在使用されている組織培養系 組織培養でＨＢｓＡｇの合成を行なう際の主たる問題点
は、ある特定の培地中に完全なスペクトルを有する８８
８７ｇ蛋白質を得ることである。

ＨＢＶ配列を細胞培養中に導入してすべての蛋白質の製
造を行なう努力がなされたが失敗に終っている。ＨＢｓ
Ａｇ蛋白賀を蛋白光現するために異種発癌ウィルス発現
ベクターを使用する試みがなされており、これによりか
なり多量のＨＢｓＡｇ蛋白質が製造されている。ＨＢｓ
Ａｇを大量生産するこのアプローチには、次の如きいく
つかの難点がある。即ち、（１）他の発癌ウィルスから
の遺伝子エレメントを直接使用するために、必ず調節機
構についての問題が生じる：（２）ウィルスの転写調節
エレメントがプレー８１領域内に挿入されるため、得ら
れるＨＢｓＡｇ生成物にはＰ３９とＧＰ４２蛋白質が含
まれない；及び（３）異なるＨＢｓＡｇ蛋白質を発現さ
せるために異種調節エレメントを使用するため、化学盪
論的最の蛋白質を得ることが難しくこのため２２ｎｍ様
粒子の組み立てが不充分になる、という難点である。

Ａ、　ｒｒｅｙｔｅｇらは、アレキサンダー細胞から単
離したＨＢｓＡｇ遺伝子をマウスＴＫ−１１１ｔｌで発
現せしめることを報告している［ＥＭＢＯＪ、４：２４
９−２５５　（１９８５）］。しかしながら、彼らの使
用したＨＢＶ配列の５′末端はｌ−１ｉｎｄ■部位で終
っていた。従って、このＨｉ　ｎｄｌｎ部位の上流のＨ
ＢＶ及び宿主配列が不足していた（第１図のクローン１
０．７及び１０．５）。

ＨｉＣｈａｅｌらは、プロトタイプのＨＢＶゲノムから
単離したＳＭ伝子を、Ｓ■４０プロモーターまたはＭＭ
ＴＶ−ＬＴＲプロモーターのコントロール下に置いてＣ
ＨＯ細胞中で発現せしめることを報告しｒいる［ＰＮＡ
Ｓ８１　：　７７０８−１２　（１９８４）］。アレキ
サンダー細胞がら単離したＨＢｓＡｏ３１１伝子につい
ては何んら記載されておらず、またＨＢＶプロモーター
でＨＢ　Ｓ　’Ａ　Ｑを発、現させることについても何
ら記載されていない。

本発明は、ＨＢｓ／ｌを構造的に過剰生産するセルライ
ンであるアレキサンダー細胞がら単離したＳ遺伝子を用
いるものである。本発明の１つの態様においては、アレ
キサンダーセルライン由来遺伝子により、新規ＨＢＳ／
’ｇポリペプチドの発現が行なわれる。本発明では、Ｔ
ＡＴＡプロモーター、ＳＶ４０様プロモーター及びプレ
ー８１コード領域、プレー８２コード領域並びにＳコー
ド領域を含むＳ遺伝子複合体を使用する。本発明によれ
ば、前記した如き問題点を克服し、ＨＢｖに対するワク
チンの活性成分として使用し得る大量のｌ−Ｉ　Ｂ　Ｓ
　Ａ　Ｑを製造するために、アレキサンダー細胞からＨ
ＢｓＡｇ転写活性遺伝子を単離し、これをＨＢｓＡｏ合
成に使用する。本発明のがかる選択は、アレキサンダー
細胞が、比較的多量の免疫原性ＨＢｓＡｇを２２ｎｍ粒
子として産生するため、それを単離した時に非ヒトセル
ラインに導入することのできるＨＢＳ八〇へ性を有する
遺伝子を、このセルラインが含んでいるに相違ないとい
う考えに基いている。ＨＢｓＡｇのｍＲＮＡの分析によ
り、ＨＢｓＡｇ遺伝子の両者のプロモーターが活性であ
ることが証明された。このことは、この遺伝子はインタ
クトであり、そして完全なスペクトルのＨＢｓＡｇ蛋白
質を合成できることを意味している。ヒト肝癌細胞であ
るアレキサンダーｍ胞はワクチン生産に使用出来ないこ
とが判った。

発明の要旨 本発明によれば、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に対する
新規ワクチンが提供される。このワクチンは遺伝子工学
技術によって製造され、比較的＾収率で活性物質が得ら
れる。セルラインＣＨＯｐ　７　、５　Ａ　Ｉ　２６及
ヒＣＨＯ””カ００Ｈｒ パスツール研究所に寄託されており、それぞれ受託番号
順１−５７４．ｌ−５７５が付与されている。

アレキサンダー細胞の染色体に組み込まれた（　ｉｎｔ
ｅｇｒａｔｅｄ）　ＨＢ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａを、分子ク
ローニング法により単離し、制限酵素マツピング及び部
分的ＤＮＡ配列分析［５ｈａｕｌ、　Ｙ、ら、　Ｊ、　
ＶｉｒＯｌ。

ｉユ、７７６−７８７　（１９８４）］によりその特徴
を明らかにした。７つの異なる組み込まれたＨＢＶ配列
が見出された。この７つの遺伝子は、染色体内に組み込
まれたＨＢＶ配列に対して完全な相補性を示した。ＨＢ
ＳＡＣ３遺伝子を発現するり０−ンを単離するため、７
つのそれぞれのクローンを、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マー
カーとしてリン酸カルシウム共沈法（ＧｒａｈａｍとＶ
ａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

ｖｉｒｏｌｏｏｙ　　１２．　４５６−４６７　（１９
７３）　］により、ＣＨＯｄｈｆｒ”セルラインに導入
した。

ｄｈｆｒ遺伝子と恐らくアレキサンダー細胞のＨＢＶ　
　ＤＮＡの両者を獲得した細胞の１０−２０コ〇ニーを
含む大量の培地について、診断用＾ｂｂｏｔｔキット（
八〇５ＲＩＡＩ［、Ａｂｂｏｔｔ）を用いたラジオイム
ノアッセイにより、ＨＢｓＡｇの合成と分泌をテストし
た。１つのりＯ−ンＡ１２６のみが、有為な量のＨＢｓ
Ａｇを産生じた。Ａ１２６のＨＢＶ部分の全配列を決定
し、以下の如き結論が得られた。即ち、（１）ＨＢＶ配
列は報告されている亜型ａｄｗ２のＨＢ　Ｖ配列と同じ
ではないがそれと関連している（第１図）：（２）プレ
ーＳ１、プレー８２及びＳ領域の全コードフレームには
、何らのフレームシフト変異、欠損あるいは挿入もなく
、全ての開始ＡＴＧコドン及び翻訳終止コドンが含まれ
ている：（３）Ａ１２６のＨＢＳＡＧ遺伝子には、ＴＡ
ＴＡボックスプロモーター、ＳＶ４０様プロモーター、
ＨＢＶエンハンサ−エレメント及びＨＢＶ配列の３′末
端から下流にこれら配列の２−３のポリアデニル化部位
が含まれている（第１図）：（４）Ａ１２６には全コア
遺伝子が存在しておらず、従ってウィルス感染は起こら
ない。Ａ１２６の構造は第１図に示す通りである。プレ
ー８２領域のＤＮＡ配列が示されており、そこで予想さ
れる蛋白質のアミノ酸配列は、これまで報告されている
全ての配列と異なるものである。この図に示されている
ように、Ａ１２６のＳ遺伝子の３′側領域に、新規なＨ
ＢＶ配列が見出される。

Ａ　１２６　（Ｃｈａｒｏｎ２８フアージに約１４ｋｂ
のアレキサンダーＤＮＡが挿入されている）は、ＣＨＯ
細胞で少量のＨＢＳＩ）を発現し産生したが、その農は
この蛋白質の大量生産を満足するものではなかった。そ
こで本発明者らは、不適当な宿主及びファージのＤＮＡ
が多く存在するために、ＨＢｓＡｇ遺伝子の発現が抑Ｉ
Ｉ）されているものと考えた。本発明者らは、全組み込
みＨＢＶ配列と、ＨＢＶ配列の３′末端の３ｋｂ宿主配
列及び５′末端の２ｋｂ宿主配列とを含む７．５ｋｂ　
　ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏ
Ｒ１部位にサブクローンした。この新しいプラスミドは
ｐ７．５ＡＩ　２６　（第１図）と命名され、ｈｆｒ− ＣＨＯＩｔ胞に導入された。ｐ７．５Ａ１２６ＤＮＡと
ｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミドの比率は、トランスフ
ェクション体において１０＝１であった。この方法によ
れば、６７．５Ａ１２６ＤＮＡの多数を、どのコロニー
に挿入するのも可能である。それぞれ、ｄｈｆｒ陽性細
胞の４−５コ〇ニーを含む３つのプレートについて、Ｈ
Ｂ！３ＡＱ発現をＡｔＪＳＲ［ＡＩＩ＾ｂｂｏｔｔ　　
ＲＩ　Ａキットによりテストした。２つのプレートが高
レベルのＨＢｓＡｇを発現し、Ａ１２６でトランスフェ
クションされたＣＨＯＩＩＩＩにより得られるＨＢｓＡ
ｇの陽よりも８−１０倍多かった。

メトトレキサート（ＭＴＸ、ｄｈｆ　ｒインヒビター）
で細胞を処理することにより、生存コロニーにおいてｄ
ｈｆｒ遺伝子の増幅が行なわれ、コトランフエクション
法により導入された遺伝子の高度発現が起こることが知
られている。そこで本発明者らは、コロニーを選択し、
５０−２００　ｎＨＭＴＸで３遺間処理した所、親コロ
ニーよりも１０倍多くのＨＢｓＡｇを、抵抗性細胞 ０Ｈｒ （ＣＨＯｐ７．５ＡＩ　２６及びＣＨＯ”””ｐ７．５
Ａ１２６）が産生ずることが判った。

このセルラインによる免疫反応性ＨＢｓＡｇの構成発現
を、集密的培養の培地をアッセイして最初ＩＣ１１＋１
　定り、　ｔｃ。ＣＨＯ”ｐ７．５ＡＩ　２６の集密的
培養培地には３−５Ｍｇ／ｊの免疫反応性のＨＢｓＡｇ
が含まれていることが、ＡｂｂｏｔｔＲＩＡ　　ＨＢｓ
Ａｇキットを用いた測定により判った。指数関数的生育
期でのこのセルラインによるＨＢｓＡｇ産生量を正確に
評価するため、本発明者らは、異なｉ数の細胞をプレー
トし、培地を毎日換えて、Ａｂｂｏｔ　　Ｔ　Ｉ　Ａキ
ットを用いてＨＢｓＡｇをアッセイした（表Ｉ）。

アッセイにより以下の如き特性が得られた。

１．０ＨＯ”Ｄ７．５Ａ１２６１１ｆｆｉから分泌され
たＨ　Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｑは、４℃あるいは一２０℃のいず
れで保存しても多数月間安定である。

２．８ＢＳＡＱの分泌が減少することなく、今日までＩ
ｔ胞は生存し５０倍以上になっている。

３、殺菌剤（フンギシン）と同様に抗生物質（ペニシリ
ン、ストレプトマイシン、ガラマイシン）によっても、
細胞の生育あるいはＨＢｓＡ。

発現は何んら影響を受けない。

４．０ＨＯ”ｐ７．５ＡＩ　２６は、液体窒素テ２．３
ケ月間凍結した（１０％グリセロール）後でも、生育し
ＨＢｓＡｇを産生した。

５、細胞は、１０％透析ＦＣ８を添加したＧｉｂＣＯｏ
ｓ　　Ａｌｐｈａ培地で生育した。しかしながら、プロ
リンと１０％透析ＦＣ３及びＦｅ２を添加したレギラー
ＤＭＥＭ培地では生育できなかった。

６、メトトレキサート（５０ｎＭ）は、すべてのＩＩ胞
生育明間中存在していた。しかしながら、少なくともい
くつかの細胞については、ＨＢｓＡｇの発現が減少する
ことなく、メトトレキサートを培地から除くことができ
る。

このセルラインにより産生され分泌されたＨ　Ｂ　Ｓ　
Ａ　Ｑの特性を更に調べるため、このｌｌｌ１１からま
たコンドロールアレキサンダー細胞からＨＢｓＡｑを部
分的に精製した、 集密的培養の培地３５０ｄを、４５％水冷飽和硫酸アン
モニウムで沈澱させた。この方法により、培養培地中に
存在するほとんどのアルブミンが除かれる。得られるベ
レットを１５ｄＴＳ（Ｔｒｉｓ７．４／生理食塩水）に
溶解し、ＴＳバッファーに対してよく透析した。

Ａｂｂｏｔｔ　　ＨＢ　Ｓ　Ａ　Ｑ　　ＲＩ　Ａテスト
の測定によると、この段階で９０％以上の）（ＢＳＡＱ
が回収さ０Ｈｒ れた。ＣＨＯｐ７．５Ａ１２６細胞により、コンドロー
ルアレキサンダー細胞の２０倍のトＩＢＳＡＣ＋　（２
ｊ１９／３５０ｔｅ培地）が産生された。

部分精製したＨＢｓＡｇペレットのアリコートを、０５
ＣＩ浮遊密度勾配に付した。ＨＢｓＡｇは、１．２２９
／ｄ密度でバンドを示し、キャリアー患者の血清から得
たトＩＢＳＡＱと同じであった。勾配から得たＨＢＳ７
’Ｑを、陰性発色法を用いた電子顕微鏡により分析した
。Ｉ−Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｑの大部分は、電子顕微鏡によ
ると球状の２２ｎｍ粒子であった。この粒子の形態及び
大きさは、ヒトの血清から単離した粒子［Ｇｅｒｉｎら
、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　　７゜５６９−５７０（１９７
１）１あるいはコンドロールアレキサンダー細胞から得
た粒子と同じであった。

図面の説明 第１図：Ａ１２６における組み込みＨＢＶＤＮＡの構成
及び部分配列を示す。

Ａ１２６の制限Ｍ素地図が示されている。用いた酵素は
、ＥｃｏＲＩ　（Ｒ）、Ｐｓ　ｔ　Ｉ　（Ｐ）。

Ｓｍａ　Ｉ　（Ｓ）、Ｈｉ　ｎｄＩ［［（Ｈ）、Ｘｂａ
　１（Ｘ）である。点を付したボックスは、／Ｍ！Ｖｌ
リピートユニットを示す。Ｌ、は、組み込まれたＨＢＶ
　　ＤＮＡの左側末端を示し、Ｒ３はも側末端を示す。

この末端は、以前は１６１の位置（ＲＪ”）に間違って
マツプ化されていた。クローン１０．７６と１０　、５
　（Ｈｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒら）の１−Ｉ　Ｂ　Ｍ部
分は、異なる宿主配列（点線）とともに示されている。

ｐ７．５を構築するためにＤＢＲ３２２にクローン化さ
れたＡ１２６部分が示されている。Ａ１２６のプレーＳ
２のＤＮＡ配列が、それらのｌ−Ｉ　Ｂ　Ｍ亜を（ａｄ
ｙｗ、ａｙｗ及びａｄｗ）のＤＮＡ配列と比較されてい
る。ＨＢＶ配列のこの部分は、他の重要な亜型にはない
４つのユニークなアミノ！！防換を含んでいる。即ち、
Ｔｈｒの代わりにＡＩＶ、ＡＳＯの代わりにＨｉＳ、Ｐ
ｒｏの代わりにＧｌ　ｕＮ、及びＬｅｕの代わりにｐｒ
ｏの置換である。図面の右側には、宿主オリジン（ＲＪ
ＩとＲＪの間）と考えられる領域のＡ１２６配列と、Ｈ
ＢＶ及び−００ｄＳｔＵＣｋ肝炎ウイルス（ＷＨＶ）の
配列が比較されている。

この比較から、Ａ１２６のこの部分は、報告されている
重要な配列とは比較的低い相同性を有する新規なＨＢＶ
　　ＤＮＡを含んでいる。またこの領域には、Ｓ遺伝子
プロモーターで始まる重要なｍＲＮＡのポリアデニル化
部位（ＰＡ）を含んでいる。

表１ ＣＨＯ２００Ｈｒｐ７．５Ａ１２６によって産生される
ＨＢｓＡｇのレベルＨＢｓＡｇの産生量間／日／４―培
地 プレー１−後の日数　　　　　　１　　　　２　　　　
３　　　　トータル叩プレートした細胞数 ２、５Ｘ１０５５３０　　５７０　　７００　　１８０
０５ｘ１０”　　　　８００　　８５０　　９００　　
２５５０４ｄ培地（１０％透析ＦＣ８及び２００　ｎＨ
メトトレキサートを添加したα−培地）を含む４０ｍｍ
皿に細胞をプレートした。培地は毎日変え、その２−１
０μｊ！を、ＡｂｂＯｔｔ　　＾ｕｓｒｉａ［キットを
用いてＲＩＡにより分析した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ａ１２６における組み込みＨＢＶＤＮＡの構
成及び部分配列を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）、クローンＡ１２３によって産生され、且つ天然
   のＨＢｓＡｇに対応するアミノ酸配列を有するＢ型肝炎
   ウィルス表面抗原ペプチド。
2. （２）、Ｓ遺伝子ＴＡＴＡプロモーター、ＳＶ４０様プ
   ロモーター及びプレーＳ１遺伝子コード領域、プレーＳ
   ２遺伝子コード領域並びにＳ遺伝子コード領域を含むＳ
   遺伝子複合体を保持した、 ＨＢｓＡｇ産生用のセルライン。
3. （３）、Ｓ遺伝子の３′末端の下流に、第１図に示した
   新規ＨＢＶ配列を更に保持している特許請求の範囲第２
   項記載のセルライン。
4. （４）、ＣＨＯ＾５＾０＾Ｍ＾ｒｐ７．５Ａ１２６、Ｃ
   ＨＯ＾２＾０＾０＾Ｍ＾ｒｐ７．５Ａ１２６と命名され
   、パスツール研究所に寄託されており、それぞれ受託番
   号Ｉ５７５、Ｉ５７４が付与されている特許請求の範囲
   第２項記載のセルライン。
5. （５）、アレキサンダー細胞から得たＳ遺伝子複合体で
   セルラインを形質転換し、Ｓ遺伝子複合体が宿主に組み
   込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）細胞を同定すること
   からなる、ＨＢｓＡｇを産生するための特許請求の範囲
   第２項記載のセルラインを得る方法。
6. （６）特許請求の範囲第２項記載のセルラインを培養し
   て、生育培地からＨＢｓＡｇを分離する、ＨＢｓＡｇの
   製造方法。
7. （７）、アレキサンダー細胞から得たＳ遺伝子複合体で
   セルラインを形質転換し、Ｓ遺伝子複合体が組み込まれ
   た（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）細胞のコロニーを同定し、
   適当な培地でその細胞を培養し、次いで培地からＨＢｓ
   Ａｇを分離することからなる、特許請求の範囲第１項記
   載のＨＢｓＡｇを製造する方法。
8. （８）、Ｓ遺伝子複合体がプラスミドＰ７．５Ａ１２６
   内に含まれている特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）、特許請求の範囲第６項記載の方法により製造さ
   れたＨＢｓＡｇ蛋白質と、薬学的に許容し得る担体とか
   らなるＨＢｓＡｇサブユニットワクチン。
10. （１０）、免疫原性のＨＢｓＡｇ２２ｎｍ粒子を産生す
    るＨＢｓＡｇ転写活性遺伝子を肝癌セルラインから単離
    し、組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ＨＢＶ配列
    に対して完全な相補性を有する個々の遺伝子を同定し、
    これらのＨＢＶインテグレイター （ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）遺伝子のそれぞれをフランキ
    ング宿主配列とともにあるいはフランキング宿主配列を
    伴なわずに適当なセルラインに導入し、有意な量のＨＢ
    ｓＡｇを産生するクローンを単離し、このクローンを培
    養し、次いで活性抗原ペプチドを回収することからなる
    、ヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に対するワクチンの
    製造方法。
11. （１１）、用いる肝癌細胞がアレキサンダー細胞である
    特許請求の範囲第１０項記載の方法。
12. （１２）、組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ＨＢ
    Ｖの全配列、ＨＢＶ配列の５′末端の２ｋｂ宿主配列及
    びＨＢＶ配列の３′末端の３ｋｂ宿主配列をｐＢＴ３２
    ２プラスミドにおいて含む７．５ｋｂＥｃｏＲ I 断片
    を、ＣＨＯｆ＾−細胞に導入するために、ＤＮＡ挿入体
    をサブクローンし、ＨＢｓＡｇを発現するクローンをテ
    ストし、高発現能を有するクローンを選択し、該クロー
    ンを活性抗原ペプチド製造のために用いる特許請求の範
    囲第１０項記載の方法。
13. （１３）、プレーＳ１、プレーＳ２及びＳ領域の全コー
    ドフレームを含み、且つＴＡＴＡボックスプロモーター
    、ＳＶ４０様プロモーター、ＨＢＶエンハンサーエレメ
    ント及びＨＢＶ配列の３′末端の下流の宿主配列に２−
    ３ポリアデニル化部位を含み、全コア遺伝子を欠いた、
    特許請求の範囲第１１項記載の方法により得られる９Ｈ
    と命名されたクローン。
14. （１４）、プラスミドＰ７．５Ａ１２６と命名された新
    規プラスミドを含むＣＨＯｄｈｆｒ細胞である、特許請
    求の範囲第１２項記載の方法により得られるセルライン
    。