JPS61500971A

JPS61500971A - Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原と重合ヒト血清アルブミンレセプタ−とを有する粒子を含むワクチン製造に有用な組成物、前記の如き粒子を産生し得る動物細胞、並びにこれら細胞を得るための方法

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Publication number: JPS61500971A
Application number: JP60501078A
Authority: JP
Inventors: ソブザキ，エリアンヌ; マルピエス，イヴ; ミシエル・マリールイーズ; チオレ，ピエール; ストレーク，ロルフ・ウー
Original assignee: アンステイテユ・パストウ−ル; アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル; サントル・ナシオナル・ドウ・ラ・ルシエルシユ・シアンテイフイク
Priority date: 1984-03-07
Filing date: 1985-03-07
Publication date: 1986-05-15
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: SU1625332A3; ATE141168T1; FR2560890A1; JPH08839B2; KR850700214A; KR930003609B1; EP0156712A1; DE3588117D1; AU4061085A; AU598181B2; WO1985003876A1; EP0156712B1; FR2560890B1; CA1262532A; DE3588117T2; EP0732104A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１７、通常プレーＳ領域内で開始さｎるＳ及びプレーＳ領域の転写の粕来得られるようなＬｌｋｂのオーダーの大きさを有する特異的ＨＢＶ−ＲＮＡの存在も同時に検出され得ることを特徴とする請求の範囲１５又ｔ′ｉ１６に記載のｌＩａ鞄系。

ｉａ　ＨＢｓＡｇ抗原の特徴をなす免疫厘的８：質及び免疫学的性質を有する粒子であって少なくともその一部が、ＨＢＳＡｇの抗原部位とｐＨ８人レセプターの抗原部位と全双方共有する分子量約３４０００のタンパク質で構成される粒子を分泌し得ることを特徴とする請求の範囲１３かも１７のいずれかに記載の細胞系。

１９Ｌ培養維持し得るヒト又は動物に由来する細胞系を請求の範囲５から１１のいずれかに記載のベクターによって形質転換し且つＢ型肝炎ウィルスのゲノムのＳ及びプレーＳ領域を発現する培養株を分離することを特徴とする請求の範囲１４つ）ら１８のいずれかに記載の細胞系の製造方法。

２αベクターが請求の範囲９から１１のいずれかに記載のものであり、形質転換した細胞系の培養が当該マーカーのインヒビターの存在下で行なわれ、このインヒビターの培地中の含量が培養されるコロニーの少なくとも一部分において当該マーカーをコードしている遺伝子のコピーｔｆ増幅せしめるに足る８夏に調整され、前記マーカーをコードしている遺伝子の数の増幅によって耐性コロニーの選択と、前記粒子の分酪童が多い＃ｌ胞クローンの取得とが双方共可能になることを特徴とする請求の範囲１９に記載の方法。

２Ｌ　前記マーカーがジヒドロホレートレダクターゼをコードしている配列又は遺伝子からなり、前記インヒビターがメトトレキセートからなることを特徴とする請求の範囲２０に記載の方法。

２７−請求の範囲１から４のいずｎかに記載の組成物を有効量で、選択した投与法に適した薬剤用ベヒクルと共に含むワクチン。

明細書ワクチン製造に有用な組成物、前記の如き校本発明は、少なくとも大部分かほぼ球形で会壬；Ｂ　型ウィルス性肝炎のウィルスの表面抗原の特徴をなす免疫学的性質及び免疫学的性質を有するポリペプチド粒子を含む力・又ＧＸこれら粒子で構成された、ワクチン製造に有用な組成物に係る。前記抗原はしばしばＨＢｓＡｇ又はより簡単にヨＢｓの略字で示されろＯ本発明はま飢培地中に前述の如きポリペプチド°粒子乞扁産生率で分泌し得る好ましくは動物の真核細胞系（ｌｉｇｎｅｅｓｃｅＬｌｕｌａｉｒｓｓ　ｅｕｃａｒｙｏｔｅｓ　）と、このような細胞系を得ろことＹ可能にてろ手段、特に改良ベクターとにも係る。

ここで先ず、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ’）の慢性的保持者の血清は直径２２ｎｍの粒子状又はフィラメント状の中空ウィルスエンベロープを含み、時には４２ｎｍの球形粒子たる伝染性の完全ウィルス粒子（ピリオン）乞含むことを思（・出された（・。

ウィルスエンベロープは表面抗原（ＨＢｓＡｇ）’ｉｑし、伝染性ウィルス粒子の存在は抗原（ＨＢｅＡｇ）と称する可溶性抗原ｔ伴うのが普通である。

ウィルスエンベロープのポリペプチド組成は既に深く研究されている（ロビンノン　ダブル・ニス（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　Ｗ、Ｓ、　）（１９７７年）、微生物字詰（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）、　３１　。

３５７−３７７参照）。この組成には糖付加（グリコジル化）し定形状（ＧＰ２９）および糖付加していない形状（Ｐ２５）で存在する主ポリペプチド、ならびにＧＰ３３、Ｇｐ３６およびＰ４１と坏される少なくとも３ｍの副ポリペプチドが含まれている。ポリペプチドＧＰ３３及びＣ）ｐ３６は同一のアミノ酸配列を有すると考えられ３−、Ｇｐ３６は補足糖質残基な１個しか有さないと考えられろ（ステイブ、ダブル（５ｔｉｂｂｅ　ｖｒ、　）及びゲルリヒ、ダブル・エッチ（Ｇａｒｌｉｃｈ　Ｗ、Ｈ，）　、ウィルス字詰（、ＬＶｉｒｏｌｏｇｙ　）　（ｔ　９８３年）４６，６２６−６２８参ノ□ 照）。主ポリペプチドに対する前記副タンノくり質の相対量は血漿毎に異なる。

この量はウィルス粒子に富んだＩ（ＢｅＡｇ陽性の血清中では極めて多い。この場合ポリペプチドＧＰ３３及びＧｐ３６は前記エンベロープのタンノ（り質の数％を占め得るが、ＨＢｅＡ４陰性の非伝染性血清中では１％以下を占めるにすぎない（スチイブ、ダブル及びゲルリヒ、ダブル・エッチ着ウィルスｇ　（ＶｉｒＯＩＯｇ’ｙ　）　（１９８２年）１２３，４３６−４４２参７□ 照）。

前記エンベａ−プの主ポリペプチドは２２６個のアミノ酸からなり、Ｓ遺伝子によりコードされている。ＧＰ３３及びＧｐ３６のポリペプチド配列はＳ遺伝子及びプレーＳ領域（ｒｅｇｉｏｎｐｒＳ−８）の一部によりコードされていると考えられろ、。この仮定に立ては前記ポリペプチド配列は主ポリペプチドと同じＣ末端を有することになり、Ｎ末端に５５個のアミノ酸Ｄ１らなる補足配列を有することになる（ステイブ、ダブル及びゲルリヒ、ダブル・エッチ著つィルス字詰（１９ｓ３牟）、土」、６２６−６２８参照）。

近年になって、ＨＢｅＡｇ陽性の血清から単離しにウィルス粒子は重合ヒトアルブミン（１’ａｌｌ）ｕｍｉｎｅ　ｈｕｍａｉｎｅ　ｐｏｌｙｍ４ｒｉｓ６ｅ。

１）ＦｉＳＡ　）のレセプターを含むことが判明した（マチダ、ニー（Ｍａｃｈｉｄａ　Ａ−）他著胃腸病学（ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇＹ　）（１９８３年）８５，２６８−２７４参照）、このレセプター２□ はポリペプチドＧｐ３３及びｆ：、Ｐ３６に保持されると考えられろ。このレセプターによってｐＨ３Ａ、？！ｌ’ウィルス粒子と肝細胞との間で架橋を形成し、その結果ウィルスが肝細胞（付着し且つその中に侵入するのであろう。抗レセプター抗体の出現はウィルス除去プロセス（クリアランス）において不可欠とも考えられろ。実際、治癒の初段階−るＨＢｅＡｇ／抗−ＨＢｅ血清変換にはこれら抗体の出現が伴うが、これら抗体に慢性に向かう変化の過程では存在しない（ボンテイツン、ピー（Ｐｏｎｔｉｓｓｏ　Ｐ　）他層ピ０ロジカルメソド誌（、Ｌｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　）（１９８３年）、１５．１５１−１５９参照）。

これと平行して、ｐＨ３Ａのレセプターに対応する抗原の消失が観察される。このことは、対応遺伝子の発現が通常は定められた生物学的状況（％にウィルスの複製ステップの間）でしＤ）生起しないこと乞意味すると思われる。このことはまた、過去にＢ型肝炎ウィルスに感染したことのあるドナーの血清から得られり現在市販されているワクチン製剤中に含まれているｊ５なり型肝炎ウィルスの天然中空エンベロープの分析によっても裏付けられる。実際、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下１００℃で５分間天然粒子の解離７行なって得１こポリペプチド乞、ドデシルｈａナト１７ウム（ＳＤＳ）の存在下ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分析″ｆると１分子量の大きい、特［３４，０００のオーダーの分子量を狩りポリペプチドの存在は観察されない。このような分子量の大きいポリペプチドの存在はまた、例えば欧州特許出願第３８，７６５号に記載のベクターを用いて遺伝子工学の技術により形質転換した動物細粗のトランスホーメーションによって得りような、ＨＢｓ抗原の免疫学的及び免疫原的性質を有する粒子β）らなる組成物中でも観察されなり）つにＯ本発明の１而はＢ型肝炎ウィルスに対する保護性か強化されにワクチン組成物を提供することにある。本発明の別の目的は、培養維持し得且つ培地中にこれら強化ワクチン組成物の活性成分を現在入手し得る遺伝子的に形質転換された培養物の大部分によって得られるより遥かに高い産生収率で分泌し得る、遺伝子工学的技術により形質転換された細胞系を提供することにある。本発明は更に、培養維持できろ種類の特に哺乳類の真核細胞系から前述の如き細胞系７得るための手段（ベクター及び方法）乞提供することも目的とする。

本発明は、Ｂｆｆｉ肝炎ウィルスのゲノム中でｐＩ（ＳＡのレセプターをコードする遺伝子配列の発現乞、前述の足められた生物学的状況において優位を占めろ条件とは著しく異なる条件下で誘起することができるという確認に基つくものである。また、同一ワクチン組成物中でＨＢｓ抗原と前記レセプターに対応すると思われる抗原決定基を有するポリペプチド断片とｔ結合させろと、前述の如き強化され定ワクチン組成物が得られろことも確認された。

（全部ではな（ても）少なくとも大部分がほぼ球形であり、ＨＢＳＡｇ抗原の特徴ｔなす免疫原的性質及び免役学的性質を有し　Ｄ％つ１８〜２５　ｎｍ　１％に２０〜２２　ｎ７７１の大きさと、Ｃ５Ｃ１をベースとする密度勾配の１．２　ｏ　〜１．２２　ｉ　／ａｌノ密度ゾーン内で！点できるような密度と、あらゆるディン粒子９ｆｖ”ＨＢｃを含めたＨＢｅ抗原抗原存在しないという完全な純度レベルとを有するポリペプチド粒子を含む（又はこれら粒子で構成さ几た）１本発明のワクチン製造に有用な組成物は、より特定的には、前記球形粒子が賞金ヒトアルブミンに対するレセプターをも有することを特徴とする。さらに特定的には、本発明のポリペプチド粒子＋！　３４．０００ダルトンのオーダーの分子量を有するポリペプチドをかなりの割合で含む。好ましくは、これらのポリペプチドは前記粒子を構成するポリペプチド総量の１０％より大ぎい割合を占め、好ましくは２０％より多くを占める。本発明の組成物はまた、ヒト血清中に見出されるようなヒト由来成分を一切含んでいないことが好ましい。ここで本質的に問題にするのは、適切なコード配列を含むベクターによって予め形質転換され培養維時された細胞系により培地中に分泌されたＨＢ５Ａｇ抗原及びｐＨ８Ａレセプターの免疫原的性質を有する粒子ρ・らなる組成物である。尚前記形質転換はｐＨ８Ａのレセプターの免疫原部位と同様にＨＢｓ抗原の免疫原部位も有するペプチド配列の有効発現を可能にする条汗下で実施する。

本発明にまた真核細胞系、より特定的にはヒト又を工動物の培養細胞を前述の免疫原性粒子の産主に適したものにτべ（形質転換するのに適したベクターにも係る。これらのベクターはＢ型つィルス性肝炎のウィルスのゲノムのＳ及びプレーＳ領域をコードしているＤＮＡ配列を含み、このＤＮＡ配列が該ベクター内で外因性プロモーターのＩ接制御下におρ・れることな％徴とする。前記プロモーターは前記ベクターを導入する真核細胞。

特にヒト又は動物の細＠円でその制御下で直接遺伝子の転写を有効に開始せしめ得る能力が知られているようなプロモーターである。前記ＤＮＡ配列に関しては例えばネーチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ　）　第２　ｓ　１巻、１９７９年、６４６ −６５０ページに記載のガリバート（Ｃ）ａｌｉｂｅｒｔ　）他の論文を参照されたい。

このＤＮＡ配列は所謂プレーＳ配列の後のＳ遺伝子を特に含む。

このプレーＳ配列は約１６５個のトリブレットを有し、最初の複数個のヌクレオチドが前記配列の下記部分構造誕セ現われる。

使用される外因性プロモーターは、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノム内でＳ遺伝子及びプレーＳ遺伝子と正常に関連する「同図性」プロモーターに対して異質または外来のプロモーターである。

細胞がサルに由来する場合には、これらサル細胞内で隣凄し合う遺伝子の転写を有効に開姑イじめ得ろ能力が知られているＳ　Ｖ　４０ウイルス由来のプロモーターを使用すると有利である。

このプロモーターは有利にはＳ’Ｖ４０ウイルスの「初期（ｐｒ６ｃｏｃｅ　）　Ｊプロモーターに対応する。これは通常「スモールＴ　（ｓｍａＬＬ　Ｔ　）Ｊ抗原及び同時に「ラージＴ　（ｉａｒｇａ　Ｔ　）　Ｊ抗原の発現を１夜する。

この特定のプロモーターＱ’：ｊＨＢｓ抗原及びｐＨ８Ａレセプターの特徴をなす免疫原決定￥８１−有するポリペプチドの乞質転換細胞による産生と、使用培地中への前記ポリペプチドの分泌とに関して特に好ましい結果をもたらしたが、本発明はこのブロモ−１−の使用に限定はされない。例えばＳＶ４０の後期プロモーター（Ｖｐｌ、Ｖｐ２及びＶ　ｐ　３タンパク質の発現を制御）も使用し得る。これらプロモーターと、これらに関連した種々の抗原をコードしている遺伝子との相対位置を理解するために）ｊ、３Ｖ、４０ウイルスの制限地図を参照し得る（ジエー・トウーズ（Ｊ　、Ｔｏｏｚｅ　）　ｆｉｊ４　Ｄ　Ｎ　Ａ　唾瘍ウィルス（、Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｔｖｍｏｒｖｉｒｕｓｅｓ　）　、ニューヨーク州コールドスプリングト−バー。

コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｔ）ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）、１９８０年、第２〜ｇ５章）。

勿論ＳＶ４０プロモーターに代えて、前記Ｓ及びプレーＳ領域をコードしている前記配列の転写を、使用する細胞系内で、前記配列がその制御下におかれるや否や促進しその結果受容細胞のゲノム内で前記配列が当該プロモーターと統合されるようにする能力及び／又はこのようにして形質転換された受容細胞に与えられろ能力であって、ｐＨ８Ａレセプター及びＨＢｓＡｇの免疫原特炸を有するポリペプチドをかなりの量で合成及び分泌する能力を有するとして知られているρ・又はこのような能力が見出され得るような別タイプの任意のプロモーターも使用し得る。尚後者の能力はこれら細＠に由来する後の世代に順次伝達され得る。

前記の形質転換された系は、本発明の細胞系が獲得した前記ポリペプチドを合成する性質が成る世代の細胞から次の世代の細胞へと少なくとも１０世代に亘って伝達されれば「安定している」と称されよう。

使用可能な別のプロモーターとしては、例えばポリオーマの初期プロモーター、種々のレトロウィルスのＬＴＦＩブロモータ−又はアデノウィルスのＥＡプロモーターなどが挙げられる。

周矧の如く、由来源たるウィルス゛のゲノムから採取されるプロモーターは、通常これらプロモーターよっ前（通常これらプロモーターの制御下におり）れる遺伝子配列の転写の方向Ｄ）ら見て）に配置される活性化用「配列Ｊ　（”５ｓｑｕｅｎｃｅｓ″ａｃ　ｔｉｖａｔｒ　１ｃｅｓ　’。

を伴うのが好ましい。このような活性化用配列の例に関してはサイエンス誌（５ｃｉｅｎｃｅ　）　％１９８３年、第２１９巻、６２６−６３１ページ、及びネーチャー誌（ＩＪａｔｕｒｅ　）　、１９８２年、第２９５％、５６８−５７２ページに記載の論文を参照し得る。

有利には、前記プレーＳ及びＳ領域をコードする前記ＤＮＡ配列がプレーＳもしくはＳ配列の正常な転写を可能にするプロモーターと活性化用配列とρ）らなろＤＮＡ断片の直ぐ後に配置される。前記断片はプロモーター及び使用される活性化用配列の種類に応じて特に３００ｎ）ら４００対の塩基を含む。

また１本発明のベクター・は更にあるＤＮＡ配列又はマーカー、例えば酵素を含むのが好まし、い。このマーカー自体は前述の第１のプロモーターより弱い別のプロモーターの制御下におかれる。このマーカーは好ましくはジヒドロホレートレダクターゼ（ａｈｆｒ）％−コードしている遺伝子又はＤＮＡ配列で構成される。このマーカーは後述の条件下で、当該ベクターによって形質転換し得る細胞中での該ベクターのコピー数の増幅に極めて有利に役立つ。

前記第２のプロモーターも通常は外因性プロモーターである。

但しこのプロモーターはＢ型つィルス性肝炎のゲノム内に含まれる天然プロモーターの１つによっても構成し得る。特に好ましいプロモーターはマウス乳癌ウィルス（ＭＭＴＶ）のＬＴＲ（ネーチャー誌、１９８１年、２９４．２２８−２３２に記載の「長い末端繰り返し構造（Ｌｏｎｇ　Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｐｅａｔ）　Ｊと称する配列）から得られるプロモーターである。

本発明は培地中に前述の免疫原粒子を分泌し得る。同様に前述した如きベクターによって形質転換した細胞系にも係る。本発明は特に、ＨＢｓＡｇ抗原を１０６個の細胞に付き２４時間当り少な（とも１ｕｆｉ、好ましくは少なくともｌｏａｇｐｌ生する能力を持つ細胞系に係る。より特定的には本発明は、２．１　ｋｂよつ太き（、特ｉ’ｃ２．２β）ら２−８ｋｂのオーダー、好ましくは２．６　ｋｂの大きさを持ち１通常プレーＳ領域円で開始されろＳ及びプレーＳ領域の転写が生起するとそこに見出され得るような特異的ＨＢＶ−ＲＮＡ（人ＲＮ　−ＨＢ　Ｖ　−５ｐｅｃ　１ｆｉｑｕｅｓ　）によって特徴付けられる細胞系に係る。好ましい系は、２．１ｋｂより大きく、！！＃に２．２から２．８　ｋｂのオーダー、好ましくは２．４から２．６ｋｂのオーダーのサイズを持つ特異的ＨＢＶ−ＲＮＡもその中に検出され得るような細胞系である。通常は、前述の特定の生物学的条件下で（特にＢｆｆｉ肝炎ワイルスの複製の過程で）、外因性プロモーターの制御下で通常プレーＳ領域内で開始されるＳ及びプレーＳ領域の転写の結果得られるような２−１ｋｌ：＋のオーダーのサイズを有する特異的ＨＢＶ− ＲＮＡと、前述の如きより大きい値に対応するサイズを有する特異的ｈＢＶ−ＲＮＡとが同時に検出されよう。

本発明の細胞系は哺乳類の細胞、特にＣＨＯ細胞ρ）らなるのが好ましい。

本発明はまた、培養維持し得る前述の如き細胞系の製造方法にも係り、この方法は前述の如きベクターによるこれら細胞系の形質転換と、Ｂｆｉ肝炎ウィルスのゲノムのＳ及びプレーＳｉ域をコードする配列を同時に発現する培養物からのこれら細胞系の単離とを含む。

好ましくは、第２のベクターの制御下におり）れたマーカーを含んだ完全ベクターを用いる。この場合形質転換された細胞系の培養は当該マーカーのインヒビター（阻害剤）の存在下で行ない、培地中の前記インヒビター含量は培養中のコロニーの少なくとも一部分において前記マーカーをコードする遺伝子のコピー数を増幅せしめるに足る十分な濃度に調整する。このコピー数の増幅によって、耐性コロニーの選択と、ＨＥｓＡｇ及びｐ　ＨＳ　Ａレセプターに特有な免疫原活性を有する粒子をより多く分泌する細胞クローンの取得とが同時に可能になる。

前記マーカーをｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列（又は遺伝子）で構成し、前記インヒビターをメトトレキセートで構成すると有利である。

第１のプロモーターより弱い第２のプロモーターを使用すると、ＨＢｓＡｇとｐＨ３，ＡのレセプターとをコードするＤＮＡ配列のコピー数が増１し易くなる。

笑際、インヒビターな含む培地中で生存し得るのは、通常、マーカーをコードする配列のコピー数が最大のクローン、従って本発明の好ましい細胞系ではプレーＳ及びＳ領域をコードする配列の数が最大のクローンである。

有効なりローンはメトトレキセートを０．５β）ら４０ｕｆ１．特に１から２５　ｕｉ含む培地中で選択すると有利である。望ましくは、インヒビター含量のより少ない、特にメトトレキセートを５〜１５０ｎＭ含む培地中で予増幅処理（ｐｒｙ−ａｓｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　）を行ない、この第１ステツプの最後に選択したクローンを前述の如きメトトレキセート含量のより高い培地中で培養する。

本発明の他の一４徴は、動物に由来する細胞系の形質転換に使用したベクターの好ましい構築と　本発明の粒子を高収率で分泌する細胞系の形成と、得られる結果と１＜ズ関する次の説明力１ら明らかにさｎよう。また添付図面も参照さｎたい。図面中、−第１図及び第２図はＯＨＯ系の廻き動物細胞の有効な形質転換に特に通して（・る不発明のプラスミドの形成の主要連続ステップを示し、一第３図はＣＨＯ細胞における本発明の免役原性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の増曙操作″ＦＣ概略的に示し、−第４図及び第５図は本発明の方法の条件下で予め形質転換した細胞の遺伝子増幅の結果を示す。

−第６図は産生細胞において観察さｎ得る特異的ＨＢＶ−凡ＮＡの含量に対する産生されたＨＢｓＡｇ抗原量の変化を示す曲縁であり、一第７図は定常期の細胞に関して連続的に行なった複数の回収の結果を模式的に示す。

１−ベ　ター　屓ｈ−ｙ’＞、＜ユニ１扱り辷工乳色ふ夷ユ３つこのプラスミドＶｉｓｖ４ｏウィルスの初期プロモーターの制御下でＳ領域（プレーＳ領域＋Ｓ遺伝子）の発現を可能にする。

欧州脣計出頴第８１４００６３４号に記載のプラスミドρＣＰＩＯからλ３ｋｂのＢｇｔ　ｌ断片を切除した。プラスミドｐＯＰ１０は第１図に簡略に示されている。厚みのある斜線部分ｔ／１ＨＢＶ−ＤＮ人に由来し、より細い線の部分はプラスミドルＢａ３２２から得たものであるっ孤立に対応する部分は前記Ｚ３　ｋｂ断片に該当する。ｐｃｐｉｏばＨＢＶゲノムの頭ヒ尾パ゛つき合わｆｇてタンダムに連なるダイマーを含む。この断片はプレーＳ領域のＡＴＧの前の１０個のヌクレオチドから始まり、Ｓ遺伝子のストップコドンＴＡＡの後１１　ｋｂで終わｂｏこの断片はＨＢｓＡ９のｍ　ＲＮＡの推定ポリアデニル化部位とＳ遺伝子の転写開始部位とを有する。

大腸菌（旦（支）」）のｇｐｔの遺伝子がＳＶ４０の初期領域の３４８ｂｐ　Ｐｖｕｊ　Ｈｉｎｄｕ　Ｗｒ片に６合されているプラスミドｐｓＶ２ｇｐｔ（ＡＴＣｉ（３３７１４５）に含２ｎるＳＶ４０初期プ初期−０モーターするっこの断片は５ｖ４０複裏起点（ＳＶ４０　ｏｒｉ）以外に、タンデムに並ぶ初期プロモーター、後期プロモーター、初期メツセンジャー（ｒｎｅｓｓａｇｅｒｓ　ｐｒｅｃｏｃｅｓ　）の転写開始部位及び７２ｂｐの繰り返しを含む。第１図にｐｓＶ２　ｇｐｔを間単に示す。

厚くて黒い部分はＳＶ４０を起源とし、より細（・線の部分はｐＢＦＬ３２２に由来する。厚くて白い部分はプレーＳ及びＳ領域を含む−Ｆｆ＋線部分は使用されないＨＢＶの配列に譲当する。

ｐｃｐｉｏに由来するλ３ｋｂのＢりｔｘ断片を、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）　）により自由（平滑端）にしたＤＮＡ断片の先端を互に連結することによってプラスミドｐ８Ｖ２ｇｐｔの単−ＨｉｎｄＩ部位に挿入した。岨換えプラスミドを調べてＨＢＳ’！ｉコードする領域がＳＶ４０プロモーターに対してその発現を可能にすべく配向されているクローンを選択した（　ｐ　８　ＶＨ４）。制限地図によって構築を確認し、た５ｅ番井Ｓ■３つのプラスミドに由来する下記の３つの断片を連結することによりプラスミドｐｓｉｓ　ｋ形成した〜１）　ｐｓＶＨ４に由来するＺ５　ｋｂのＰｖｕ　Ｉ　Ｘｈｏ　ｌ断片（孤立）、３）ｐＢＲ３２２に由来するＬＯｋｂのｂａｍＨＩ　Ｐｖｕ　ｌ断片（孤立）、得うレルプラスミ）’ｐｓＶｓ（５，４ｋｂ）ｉ、ｇｐｔ４４トコノｇｐｔ配列ノ下流の隣接５Ｖ４ＯＤＮＡ配列とが無く、ｐＢＲ３２２ＯＢｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌ断片が存在するという点でｐ　Ｓ　ＶＨ，とは異なる。

Ｂ−７’二ｌユ」」Ａ兄船」朝ｒＱ、笠！工男１１０下記のａ）及びｂ）に規定さｎる断片の遺伝子組換え乃）ら操作を始める。

ａ）　組匡１１立斯盈分子遺伝学及び応用遺伝字詰（Ｊ、　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓ　）　１．　（１９８１年）、１６５−１７０　にジー・リンゴールド（Ｇ、　Ｒｉａｇｏｌｄ　）他によって開示されているプラスミドｐＭＴＶ　ｄｈｆｒ（１９８４年３月７日０−　Ｎ、　Ｃ，Ｍに番号１− ２８６で寄託）をＰｖｕ　Ｉ　＃素で直線化した後、Ｈｉｎｄｕ酵素によって６分的に消化し、複数の断片を遊離させた。これら断片のうち４４００　ｂｐの一断片（弧りは、 −ＭＭＴＶ　ＯＬ　Ｔ　ＦＬ、 −ｄｈｆｒのｃＤＮＡ。

一８Ｖ４０のｔＡｇのイントロン、 −８Ｖ４０の初期遺伝子のポリアデニル化部位、−ｐＢＲ３２２のＥｃｏ　Ｒ１ −Ｐｖｕ　１断片プラスミドｐｓｉｓをＰｖｕ　Ｉ及びＨｉｎｄｕで順次消化し、それによって下記のものを含む４６７６ｂｐ断片（弧工）全遊離さぜた。

−ｐＢＲ３２２の複製起点を含むＰｖｕ　Ｉ　−Ｐｖｕ　ｌ断片、−８Ｖ４０ウイルスの複製起点及び初期プロモーター、−プレーｓｌコードする部分及びＳ遺伝子とこの遺伝子のボリアデニル化信号とを含むＨＢＶのλ３ｋｂ　Ｂｇｔ＠　１ｒｌｒ片、−ｐＢＦＬ３２２のＢａｍＨＩ　Ｈｉｎｄ　Ｉ断片。

Ｃ）前記断片の連結精製後これら２つの断片をｐｖｕ＋及びＨｉｎｄ　Ｉ相同部位（ｓｉｔｅｓｈｎｍｏｌｏｇａｅｓ　）を介して結合し、このようにしてｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性を回復させる。

組換えベクター内でＶ′ｉＳ領域及びｄｈｆｒ遺伝子の転写ユニットが互に同一の方向に配向し且つ約３００ｂｐのｐＢＲ３２２により分離される。

ｄｈｆｒ　ｆ　：！−ドするｃＤＮＡはｐｓＶ２　ｄｈｆｒ（ＡＴＯＯ３７１４６）、ｐｓＶ３　ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４７）又はｐ　ｓｖｓ　ｄｈｆｒ　（ＡＴＯＯ３Ｌ１４８）からも得られる。

ｄｈｆｒの遺伝子を弱いプロモーター（Ｍ　Ｍ　Ｔ　ＶのＬＴＲ）の制御下におき、ＨＢＶ遺伝子を強（・プロモーター（ＳＶ４０の初期プロモーター）の制御下におくと、遺伝子増幅の効率が増大する。プレーＳ領域とＳＶ４０の初期プロモーター・の接合部のヌクレオチド配列を調べた（第２図参照）。

ＯＨＯｄｈｆｒ″″細胞（アーローブ、ジー（Ｕｒｌａｕｂ　Ｇ−）及びチェイシン、エル、ニー（Ｃｈａｓｉｎ　Ｌ−人。）、（１９８０年）ビー、エヌ。

ニー、ニス（Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、）　７７、４２１６〜４２２０）　（１９８４年３月７日Ｃ，Ｎ、Ｏ，Ｍ　Ｋ番号１−２８７で寄託）をパーカー（Ｐａｒｋｅｒ　）及びスターク（５ｔａｒｋ）によって改変された（１９７９年ウィルス学誌（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）、　ＬＬ、　３６０−３６９　）グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）及びパンデルニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　）の技術（１９７３年、ウイ／ｌ／ス誌（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　５２．４５６−４６７）にエリトランスフェクション処理した。ＣＨＯｄｈｆｒ　クローンによるＨＢＳＡ９の産生を培養細胞株の上清中でラジオイムノアッセイ（ＦＬＩ人）によ勺テストした。

前記ｄＭｒ”ｉローンの６０％がＨＥ　ｓ　Ａｇ　であった。ＨＢｓＡｇ産生率は比較的低く、１〜２０ｎｇ／１０−細胞／２４時間であった。

この増幅は、葉酸のアナログであり且つｄｈｆｒのインヒビターであるメトトレキセー）　（ＭＴＸ）の存在下でＣＨＯＨＢｓＡ９Ｂｓ−ンを繁殖させることにより実現した。実際ＭＴＸに対する耐性は、ｄｈｆｒ酵素の増量につながるｄｈｆｒ遺伝子のコピー数の増幅に主として起因する。ＨＢＶ配列及びｄｈｆｒ遺伝子は而−プラスミドに担持され、従って宿主細胞のＤＮＡＰ′３に一緒に組込まれるため、前記ＨＢＶ配列はＭＴＸに対して耐性を示すクローン内でｄｈｆｒ配列と一緒に増幅さｎる。ｄｈ、ｆｒの場合と同様にＨＢｖ配列のコピー数が増加すると細胞によるＨＢｓＡｇの合成が増加する。

遺伝子増幅は第３図に示した方法により２つのステップで実施した。第４図は第１増幅ステップの結果を示し、第５図は第２増幅ステップの落果を示すっ渠２ステップの増幅操作！″ｉ第１ステップで得た最も埋生量の大きいクローンを用いて行なった。

第４図及び第５図では、点線が増幅前の、実線が１幅後の、ＨＢＳＡｇ合成率を表わす。これらの図面にはＭ　Ｔ　Ｘ濃度が示されている。こｎらの濃度は第１ステツプでは５０，１００又は１４０ｎＭ、第２ステツプではｌ、５．１０又は２５／ＪＭであった。合計すると約１５０４！！のＭＴＸ耐性クローンのＨＢｓＡｇ産生をスクリーニングした。第４図及び＄５図７１）も明らかなように、ＨＢｓＡｇ浬生増偏に第１ステツプでも第２ステツプでもクローン毎に著しく異なっていた。

種々のクローン中に存在するＨＢＶ配列の細胞当りコピー数を、・セＰ・で標識されたクローン化ＨＢＶ−ＤＮＡをグローブとして使用し、いわゆる「ドツト　プロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　）Ｊの技術によりセルロースフィルター又は頌似のフィルター上のハイブリダイゼーション技術に従い評１曲し之。同−用量のＭＴＸを用いた場合前記コピー数Ｆ′１１００かも５００までの範囲でクローン毎に著しく異なっていた。

ｍ胞りローン内のＨＢＶ配列の薄酸をサザン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）の技術によって分析した。これらＨＢ　Ｖ配列は一体化された形態で存在していた。電気泳動プロフィルはクローン毎に十分類似していた。同一用量のＭ　Ｔ　Ｘ　’ｒ用いた場合の選択されたクローン相互間に見られる差異はＨＢＶ　ＤＮＡのコピー数とＨＢｓｋｇ合成レベル（蕗果は示さない）との間の不調和を説明し得るようなものではなかった。ｄｈｆｒ遺伝子についても同様の分析を行なった。ＭＴＸ用量を同一にした場合、細胞当りコピー数はや（はりクローン毎に著しく異なっていた（結果は示さない）。所定クローンに関してはＨＢＶ配列及びｄｈｆｒ配列が平行してｎ＝して（・た。

ＨＢＶの特異市ＲＮ人の量も分子ハイブリダイゼーションによって分析した。ＤＮＡＫ関して得られた結果とは逆に、特異臼ＨＢＶ−ＦＬＮＡＯ量（グＨＢｓ人り産生率に比例していた（第６図参照）。また、ＭＴＸ用量が同一の場合（５０ｎＭ）、ｄｈｆｒ％異的ＲＮ　Ａの量ハ分析した種々のクローンの間で一定していた（第６図参照）、＠ｇ的ＨＢＶ−ＲＮＡをノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　）の技術で分析した。２つのＲＮＡ、即ちＺｌ　ｋｂの主ＲＮＡ及び１５　ｋｂの副ＲＮ　Ａが明らかにさ′ｎ念。８１ヌクレアーゼマツピングによりこれらＲＮＡを調べた４果、プレーＳ領域内の３１５７位にＺｌｋｂＲＮＡに対応す６主開始（ｕｎｅ　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｏｍａｊｅｕｒｅ　）が存在し、ＳＶ４０のプロモータ内に１５ｋｂＲＮＡに対応するもう一方の副開始が存在していた。

この分析は３７Ｂ人５クローンによって産生した粒子に関して行なった。定常期に得らｎる複数の２４時間回収分に対応する上清を一緒にした。Ｃｓ０Ｌ密度勾配起遠心分離を２夏連続して行ない、次いでショ糖勾配速度超遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｄｅｖみＩｏｃｉｔｅ　）を行なうことによシＨＢｓｋｇ粒子をｎ裂した。これらＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ粒子の密度はＬ２０であった。電子顕微鏡で観察すると、これら粒子は平均直径２２ｎｍの球形粒子のように見え、形態学的に（１ヒトに白米する粒子に類似していた。管状形態は全く観察されなかった。

Ｓｎ２の存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動にょシこれらのポリペプチドを分析した。前記ゲルを銀塩で着色することにより可視化した。２２．３０Ｑ、２６，１００及び３４，０００ダルトンのポリペプチドに夫々対応する３つのバンドが観察された。これら３つのバンドの着色の相対張度によってこれら３種のタンパク質の割合は５４１，１９チ及び柁７チと計算された　ＩＪメチオニンによりインビボで標識した後、これら精製粒子を抗ＨＢｓ血清によって免疫沈降処理し、次いでこれらタンパク質を電気泳動で分析した。前記３種のポリペプチドはオートラジオグラムにより前記と同様の割合で検出された。

これら粒子の表面におけるｐＨ８人に対するレセプターの存在を、ボンティラン（Ｆｏｎｔｉｓｓｏ　）他により改変された（ビロロジカルメンド誌（Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　）　６．１５１−１５９）−” ンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ　）及びバーセル（Ｐｕｒｃｅｌｌ　）の方法（インフエクト・イム）　（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　）誌２６．１２５（１９７９年））に従い固相でのラジオイムノアッセイによって検査した。このレセプターの検出は細胞の上清中でも絹製粒子上でも陽性であると判明した（表１参照）。

マチダ（Ｍａｃｈｉｄａ　）他による孜術（胃腸病字詰（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ〕８５．２６８−２７４．１９８３年）も使用し得る。

１−免疫テスト水酸化アルミニウムＡｊ（ＯＨ）、　ｉ　０．１％の濃度で添加した後、粒子製剤を用いてＢａ１ｂ　／　０マウスを免疫処理した。表１から明らかなように、これら細胞粒子の免疫原性ζヘバク（ＨＥＶＡＣりＢという商標で市販されている対Ｂ型肝炎ワクチン（天然ＨＢｓＡｑを含むヒトドナーの血清から得られる）と同様であった。５０チ有効投与量（ｄｏｓｅ　ｅｆｆｉｃａｃｅ　５０　％　）は細胞粒子の場合がαｅ４μり、ヘバクＢ（パスツール研究所（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ　）の商標）の場合がα０３μｑである。

ｕＲＩＡ−アボツ）　（ＡＢＢＯＴＴ　）によジ市販されている人ＵＳＡＢテストで規定される単位。

従って以上の説明から、ベクターｐｓｉｓ　ｄｈｆｒｆｉ細胞ＤＮＡ中に組込まれた後、ＨＢＶウィルスの中空エンベロープｉ２２ｎｍの粒子の形状で合成及び分泌せしめるという結論が得られる。

ＨＢＶのゲノムの大部分、特にカプシドのタンパク質をコードする遺伝子を除去することによって伝染性完全ウィルス粒子の産生が妨害される。このベクターはまたマウスｄｂｆｒの遺伝子の転写ユニットも有する。これはｄｈｆｒ−細胞内に導入されるとＭＴＸの存在下で遺伝子増幅現象によりこれらｄｈｆｒ−細胞を増殖させる。

ここで使用したＭＴＸ耐性による増幅法は、ＨＢＳＡｇ粒子を高レベルで産生ずるＣＨＯ細胞のクローンを取得せしめた。この増幅はクローン毎に異なっていた。場合によっては合成率は１５００倍になった。当該クローンに関しては産生率は１５μり／１０６細胞／２４時間でちった。ＨＢｓＡｇを細胞１ｏ６１同に付き２４時間当り１から１０μり産生する複数のクローンが得られた。−当９２４時間で発現されるＨ　Ｂ　ｓ　Ａｇｌ産生率は培養条件によって異なる。通常は１０かＩｌ：）２０μ９／ｐｉ／２＋時間の１直を得ることができたつこの値）剌を性保持者の血清中のＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ濃度に匹敵する。ＨＢｓＡｐ産土の動力学的研究の結果、この合成は定常期で数週間に亘って安定していることが判明した。第７図は定期的に培地を交替しながら３週間に亘り定常期の細胞に関して行なった連続的回収の繕果全示している。これらの回収には無血清培地？使用し得る。無血清培地を用いると原価への影響以外に、細胞上清からの粒子の精製が遥かに容易になり、且つ血清に起因する汚染の危険が回避されるという利点が得られる。ＣＨＯクローンによるＨＢｓＡｇの合成ばＭＴＸを用（゛ずとも極めて安定していることが判明した。これは６ケ月間、即ち約３００世代に亘って待伏する。場合によっては、産生ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇが自然に少し増加することさえあった。遺伝子増幅中のＨＢｓｋｇ産生の低下又は消失は、テストした約１５０個のクローンに関しては全く観察さｎなかった。こｎら最後の２つの観察結果は、ＨＢＶ配列とｄｈｆｒ遺伝子とが約３００ｂｐ（７）Ｉ）ＢＲ３２２によって分離されているにすぎないという当該ベクターの構造に起因し得る。

従って本発明を用いれば、極めて優れた遺伝子安定性を有する免疫原粒子産生クローンが得られる。

ＨＢＶ配列のコピー数とＨＢｓＡｐ合成率との闇の関連性は観察されなかった。

使用した技術（「ドツトプロット」）では全体的量化（ｑｕａｎｔｉｆｉｅａｔｉｏｏ　ｇｌｏｂａｌｅ　）は可能でろるが、機能配列（５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｏｎｃｔｉｏｎｎｅｌｌｅｓ　）の判別は不可能であるつ得られた結果はトランスフェクション及び増幅の間のベクターにおゆる欠失及び再配列（転位、ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ　）の出現によって説明され得よう。この仮定は組込まれたＨＢＶ及びｄｈｆｒ配列の電気泳動プロフィルの複雑性によって裏打ちさｎるっこれら配列の多くは恐らく非機能的である。一方、ＨＢｓｋｇ合成レベルと特異的）ＪＢ’Ｖ−１’ＬＮＡＯ量とは完全に比例する。これは、観察されたＨＢｓＡｇ合成の増加がＨＢＶ配列の転写の増加に起因すｂことを立証するものである。この転写の増加の原因の一部分は機能コピー数の増加でちる可能性が唖めて高い。この結果はまた、増幅された遺伝子のコピー数の評価がドツトプロットによるものでちれ又は電気泳動分析によるものであｎ、細胞クローン中の有効コピー数を評価するための最良のテストではないことも示している。これに対し、特異ＲＮＡの量化は機能コピーを完全に反映する。この量化は、産生されるタンパク質の量を容易に測定し得ないようなシステムで有利に使用さｎる。

従って本発明はよシ特定的には、１０’　ｃｐｍ　／μりの比活性を有するプローブ（１３Ｐで標識）に対して前述した如き測定システムで少なくとも２　Ｘ　Ｉ　Ｑ’ｃｐｍ／　１０’　ｄＢ胞の重のＨＢＶ−ＲＮＡを含むクローンに係る、２つの特異的ＨＢＶ−４Ｎ人が明らかにされた。１１　ｋｂの主転写の開始はプレーＳ領域内の３１５７位に位置付ゆられた。

これはＳ遺伝子の転写開始をこの位置に位置付けたネーチャー誌（１９８３年）籠ｌ且土層、３３６−３３８のカッチネオ（Ｃａｔｔｅｏｅｏ　）他の結果と合致する。Ｚ５ｋｂの副ＲＮ人はＳＶ４０のプロモーター内で開始される。この几ＮＡは前記粒子中に存＝−ｉる３４，０００のポリペプチド（ＧＰ３４）のｍＲＮＡであり得る。

従ってＧＰ３４の大量合成（これら粒子のポリペプチドの２７チ）は７２ｂｐ繰返ケ答みブレーＳ領域の上流に配置されたＳＶ４０の初期プロモーターの使用に起因するものと考えられる。

ラジオイムノアッセイを使用した結果、ＯＨＯ細胞により合成される粒子はｐＨ８人のレセプターを有することが判明した。

胃腸病字詰８５（１９８３年）、２６８−２７４のマチダ他の記述によれば、このレセプターはポリペプチドＧＰ３１及びＧＰ３５に担持されると考えられる。

従って我々のシステムではこのレセプターは恐う（ＧＰ　３４に担持されると考えられる。細胞に由来する粒子中にｐＨ８Ａレセプターを有するポリペプチドが２つではなく１つしか存在していないという観察については説明されていなｔ・。血清粒子と異なりＣＨＯ細胞内でのグリコシレージョンは均質的なの７１）もしｎない。

ＯＨＯ細胞によって合成された２２ｎｍのＨＢｓＡｇ粒子は血清に由来する粒子からなる裂創でろるへ／（りＢと同じ免疫原性を有する。得られるＨＢｓｋｇ産生率は工業的使用に匹敵するような値である。これら粒子の表面にｐＨ８人レセプターが存在することも対Ｂ型肝炎ワクチンの製造にこのシステムを使用することの更なる論拠をなす。

このような理由から、本発明は有効量、特に３〜６μｑタンパク質／−１好ましくは５μｑタンノくり質／Ｍｔ（単位用量）の割合の本発明の粒子を、選択した投与法、特に非経口投与に適した薬剤用ベヒクルと共に含む総ての対Ｂ型つィルス性肝炎ワクチン組成物に係る。

目 ■ す曽　中畠　１１ステヅフ゛量子×もＤ破ｓ　ＨＢｓＡｇ　４４主　１１ステップ間丁×井加９支ｎＨＢｓＡＢの彦三　１２スチッグＨＢｓΔ９　Ｐ９／２５　ａｍ２７ラスコ／Ｂ国際１Ａを報告１曲、−一−＾−一−１−ＰＣｒｒ　Ｆ　Ｒ８５ＬＣＩＸ）μＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＰ＝　ＩＮτＥＲＮＡτｒＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥ？ＯＲ丁０ＮＴｈ＠Ｅｕｒｏｐ＠ａｎ　Ｐａｔ＠ｎｔ　０ｆｆｉｃｅ　ｉｓ　ｉｎ　ｎｏ　ｗａｙ　１ｉａｂｌｅ　ｆｆ口ｒ　ｔｈｅｓａｐａｒｔｉｃｕｌａｒｓ　ｗｈｚｃｈ　ａｒｅ　ｍｅｒｅｌｙ　ｇｉｖｅｎ　ｆｏｒ　２＠　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ。

Ｐａｔｅｎｔ　ｄｏｃｕｍｅｎｔ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　：’ａｔｅｎｔ　ｆａｕｉｌｙ　Ｐｕ！：＋１ｉｃｘｔｉｏｎｃｉｔ＠ｄ　ｉｎ　５ａａｒｃｈ　ｄａｔａ　ｍｅｍｂｅｒ（ｓ）　ｄａｔｅｒ＠ｐｏｒｔ

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも大部分がほぼ球形であり、ＨＢｓＡｇ抗原に特有の免疫原的性質及び免疫学的性質を有し、１８から２５ｎｍ、特に２０から２２ｎｍの大きさと、ＣｓＣｌベースの密度勾配のＬ２０−Ｌ２２ｇ／ｍｌの密度ゾーン内で単離できる密度と、ちらゆるテイ粒子およびＨＢｃを含めたＨＢｅ抗原を含まないという完全純度レベルとを有しているポリペプチド粒子を含むか又はこれら粒子で構成され、前記球形粒子が重合ヒトアルブミンに対するレセプタも含むことを特徴とするワクチン製造に有用な組成物。
２．３４，０００ダルトンのオーダーの分子量を有するポリペプチドが存在することを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。
３．３４，０００ダルトンのオーダーの前記ポリペプチドが前記粒子を構成するポリペプチドの合計量の１０％を越える割合、好ましくは２０％を越える割合で存在することを特徴とする請求の範囲１に記載の組成物。
４．ヒトに由来する血清成分を全く含まないことを特徴とする請求の範囲１から３のいずれかに記載の組成物。
５．真核細胞、より特定的にはヒト又は動物の培養細胞の形質転換に適し、且つＢ型ウイルス性肝炎のウイルスのゲノムのＳ及びプレーＳ領域をコードしているＤＮＡ配列を含むベクターであって、前記ＤＮＡ配列が該ベクター内において、該ベクターを導入する前記動物細胞内で直接的制御の下に遺伝子の転写を有効に開始せしめる能力が知られている外因性プロモーターの直後制御の下におかれていることを特徴とするベクター。
６．前記第１のプロモーターがＳＶ４０ウイルスに由来し、特にＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターに該当することを特徴とする請求の範囲５に記載のベクター。
７．前記Ｓ及びプレーＳ領域をコードしている前記ＤＮＡ配列が前記プロモーターとこの第二のプロモーターに関連する活性化用配列とを含むＤＮＡ断片の直ぐ後に位相を合わせて配置されていることを特徴とする請求の範囲５又は６に記載のベクター。
８．前記断片が３００から４００の塩基対を含むことを特徴とする請求の範囲７に記載のベクター。
９．酵素の如きマーカーをコードしているＤＮＡ配列をも含み、該配列が前記第１のプロモーターより弱い別の第２のプロモーターの制御下におかれていることを特徴とする請求の範囲５から８のいずれかに記載のベクター。
１０．前記マーカーがジヒドロホレートレダクターゼをコードしている遺伝子で構成されていることを特徴とする請求の範囲９に記載のベクター。
１１．前記第２のプロモーターがマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）に由来していることを特徴とする請求の範囲９又は１０に記載のベクター。
１２．請求の範囲５から１１のいずれかに記載のベクターにより形質転換されていることを特徴とする培養維持し得る動物細胞系。
１３．哺乳類、特にＣＨＯ細胞に由来することを特徴とする請求の範囲１２に記載の細胞系。
１４．請求の範囲１から４のいずれかに記載の如き粒子を細胞１０６個に付き２４時間当り少なくとも１μｇ、好ましくは少なくとも１０μｇのＨＢｓＡｇ抗原の割合で培地中に分泌し得ることを特徴とする請求の範囲１２又は１３に記載の形成細胞系。
１５．２１ｋｂを上回り、特に２２から２８ｋｂのオーダーの大きさを有する特異的ＨＢＶ−ＲＮＡの存在が検出され得ることを特徴とする細胞系。
１６．２４−２５ｋｂのオーダーの大きさを有するＨＢＶ−ＲＮＡの存在が検出され得ることを特徴とする請求の範囲１５に記載の細胞系。
１７．通常プレーＳ領域内で開始されるＳ及びプレーＳ領域の転写の結果得られるような２１ｋｂのオーダーの大きさを有する特異的ＨＢＶ−ＲＮＡの存在も同時に検出され得ることを特徴とする請求の範囲１５又は１６に記載の細胞系。
１８．ＨＢｓＡｇ抗原の特徴をなす免疫原的性質及び免疫学的性質を有する粒子であって少なくともその一部が、ＨＢｓＡｇの抗原部位とｐＨＳＡレセプターの抗原部位とを双方共有する分子量約３４，０００のタンパク質で構成される粒子を分泌し得ることを特徴とする請求の範囲１３から１７のいずれかに記載の細胞系。
１９．培養維持し得るヒト又は動物に由来する細胞系を請求の範囲５から１１のいずれかに記載のベクターによつて形質転換し、且つＢ型肝炎ウイルスのゲノムのＳ及びプレーＳ領域を発現する培養株を分離することを特徴とする請求の範囲１４から１８のいずれかに記載の細胞系の製造方法。
２０．ベクターが請求の範囲９から１１のいずれかに記載のものであり、形質転換した細胞系の培養が当該マーカーのインヒビターの存在下で行なわれ、このインヒビターの培地中の含量が培養されるコロニーの少なくとも一部分において当該マーカーをコードしている遺伝子のコピー数を増幅せしめるに足る濃度に調整され、前記マーカーをコードしている遺伝子の数の増幅によって耐性コロニーの選択と、前記粒子の分泌量が多い細胞クローンの取得とが双方共可能になることを特徴とする請求の範囲１９に記載の方法。
２１．前記マーカーがジヒドロホレートレダクターゼをコードしている配列又は遺伝子からなり、前記インヒビターがメトトレキセートからなることを特徴とする請求の範囲２０に記載の方法。
２２．請求の範囲１から４のいずれかに記載の組成物を有効量で、選択した投与法に適した薬剤用ベヒクルと共に含むワクチン。