JP2610015B2 - アデノウイルスプロモーターの制御下で所定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む組換えｄｎａ - Google Patents

アデノウイルスプロモーターの制御下で所定のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む組換えｄｎａ

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアデノウイルスプロモーターの制御下で所定
のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組
換DNAと、この組換DNAを含むベクターと、この組換DNA
により形質転換された真核細胞と、これら形質転換され
た細胞からの分泌生成物と、これらの使用、特にワクチ
ン製造への使用とに係る。
ヒトアデノウイルスは少なくとも30種のタンパク質を
コードする長い線状二本鎖ゲノム（約36,000bp）を有す
る。許容細胞の感染におけるウイルスサイクルは初期及
び後期の２段階に分けられる。周知の如く、初期段階で
発現されるウイルスゲノムの４つの領域はE1領域、E2領
域、E3領域及びE4領域と称され、これら領域はウイルス
ゲノム全体の中で第１図に簡単に示した如き位置を夫々
占める。ゲノムの左端に位置するE1領域は更に２つの領
域E1A及びE1Bに分割される。初期段階から後期段階への
変化はウイルスDNAの複製によつて示され、ウイルスの
遺伝プログラムの急変を特徴とする。いくつかの初期遺
伝子の発現が抑圧されるのに対し、後期遺伝子の転写が
主として単一プロモーター即ち主要後期プロモーターか
ら実施されるのである（第１図参照）。また、宿主細胞
のタンパク質合成の大幅な抑制も観察される（１）。
２型又は５型ヒトアデノウイルス（Ad2,Ad5）の遺伝
子構成はこれらウイルスのゲノムをインビトロで操作し
得る程十分に知られており、これを培養動物細胞中の外
来遺伝子の発現ベクターとして使用することは既に試み
られている。実際、ゲノムの６％を占めるE3領域はイン
ビトロでは必須のものではなく、従つて全体的に置換し
得ることが知られている（２）。これらウイルスのゲノ
ム内に挿入し得る外来DNA断片の大きさは大きい。実
際、前記ウイルスは野生ゲノムの長さを５％上回る長さ
を持つゲノムを封入し得る。
このようにして２型又は５型アデノウイルスから誘導
される種々のベクターが構築された。これら組換体では
外来遺伝子が主要後期プロモーターの制御下で発現され
た。その結果場合によつては、外来遺伝子によりコード
されるタンパク質を後期ウイルスタンパク質に比肩し得
るレベルで合成することができた（4,5,6,7）。
以上の説明から考えると、後期プロモーターの制御下
での外来遺伝子の発現はウイルスサイクルの後期段階で
しか生起し得ないことになる。
本発明の基礎は、アデノウイルスのゲノムの初期E1A
領域のプロモーター（以後単に「E1Aプロモーター」と
称する）が、発現させたいと思うポリペプチド配列をコ
ードする異種遺伝子（即ちアデノウイルス中で通常これ
に関連する遺伝子に対して外来性のもの）又はより一般
的に言つて異種ヌクレオチド配列の発現を極めて効果的
に制御し得るという確信にある。換言すれば、E1Aプロ
モーターは強いプロモーターとして作用し、この性質は
特にE1Aプロモーターと異種コード配列とからなるアセ
ンブリがウイルスベクター中に挿入される時に発揮され
る。
従つて本発明は一般的には、アデノウイルスにより感
染し得る、又はアデノウイルスのプロモーターを認識し
得る内因性ポリメラーゼを有する真核細胞系から選択し
た特にヒト又は動物の真核細胞系を形質転換するための
組換DNAに係る。この組換DNAは前記細胞系中での発現が
望まれるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配
列を含む挿入核酸により修飾される。この組換DNAはよ
り特定的には、前記挿入配列がアデノウイルスのゲノム
のE1A領域の初期プロモーターの直接制御下におかれる
ことを特徴とする。
この組換DNAは前記細胞系内で精製し得るベクター内
に組込まれるか又は遺伝子組換によりこのようなベクタ
ーと（関係付けて）結合するのが好ましい。
ウイルスベクター、特にアデノウイルスから誘導した
ベクターであれば、アデノウイルスのE1A領域に関連す
る利点、即ち発現が構成的（constitutive）であつてウ
イルスサイクルの間中永続するという利点も得られる
（8,9）。
本発明の組換DNAの特に好ましい形態は、転写方向で
挿入核酸の下流にアデノウイルスの欠損ゲノム（ｇno
me dfectif）を有することを特徴とする。但し前記欠
損ゲノムは対応アデノウイルスの複製に必要な本質的配
列は全て有する。これら本質的配列は通常前記ゲノム内
でE1A初期プロモーターに直接制御される遺伝子の下流
に位置する。
本発明の組換DNAと結合するアデノウイルスの欠損ゲ
ノムは、アデノウイルスの完全ゲノムではあるが該ウイ
ルスゲノムのE1A領域の前部、特に０〜2.6％（アデノウ
イルスのゲノムの全体の大きさに対するパーセンテー
ジ）断片が欠けているゲノムで構成すると有利である。
本発明の組換DNAは前述の如きベクターの要素と結合
して、これら組換DNAを含むベクターを構成する。これ
に関して、本発明の組換DNAに結合するベクター要素が
アデノウイルスの欠損ゲノムから誘導される場合には、
「欠損組換ウイルス（virus recombinants dfectif
s）」が問題になろう。これら欠損組換ウイルスは高等
真核生物の形質転換し得る細胞系（特にヒト又は動物に
由来するもの）の形質転換に使用すると有利である。前
記細胞系自体は前記ベクターに欠けているアデノウイル
スゲノム部分を相補するのに適した別のヌクレオチド配
列を含む。この別の配列は好ましくは前記細胞系の細胞
のゲノムに組み込まれる。
このような細胞系の好ましい一例としては、系293が
挙げられる。これはAd5のゲノムの左端の最初の11％を
ゲノム内にとり込んだ状態で含むヒト胎児腎臓細胞系で
ある。前記ゲノム11％分はこの領域の欠失を有する欠損
組換ウイルスを相補せしめる（10）。
欠損組換ウイルスとこれらの欠損組換ウイルスを相補
し得る配列を含む細胞との前述の如きシステムは、組換
DNAの挿入核酸中に含まれるヌクレオチド配列が或るタ
ンパク質、即ち天然宿主細胞中で天然プロモーターの制
御下で発現する時にその天然宿主細胞の培地中に分泌さ
れるようなタンパク質をコードする場合に使用すると特
に有利である。
Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムのＳ遺伝子はこれに関して
特に有利なヌクレオチド配列を構成する。これには幾つ
かの理由があるがその１つは、Ｓ遺伝子を発現する細胞
内のこの遺伝子の発現産物HBsAg（11,12）が検出し易く
且つラジオイムノアツセイにより定量し易い粒子の形状
で細胞上清み中に分泌され、そのためウイルスベクター
の発現能力を正確に評価し得ることにある。別の理由と
して、本発明はHBVの遺伝子の発現を転写レベル及び翻
訳レベルの双方で調べるのに使用し得る組換ウイルスベ
クターを提供するが、これはＢ型肝炎ウイルス（HBV）
を増殖させ得る細胞培養システムが今日まで存在してい
なかつただけにより一層有利なことである。また、アデ
ノウイルム−HBV組換ウイルスによる細胞の感染は、所
定の病原体（この場合はＢ型肝炎ウイルス）に対するワ
クチンの製造法の方法論的基本を特に有利に説明する。
その他の特に有利なＢ型肝炎ウイルスゲノムヌクレオ
チド配列としては、HBs抗原とヒト重合血清アルブミン
（pHSA）のレセプタとをコードするプレ−S2領域を持つ
Ｓ遺伝子が挙げられる（25），（26）。
勿論、この組換DNAではＳ遺伝子を別の所定病原体に
対する別の保護抗原をコードする別の任意のヌクレオチ
ド配列で置換し得る。これは特に前記別の保護抗原がこ
の組換DNAによつて形質転換し得る細胞により分泌され
得る場合に可能である。またこの組換DNAでは、Ｓ遺伝
子とプレ−S2領域とを別の所定病原体に対する別の保護
抗原をコードする別の任意のヌクレオチドで置換するこ
とも勿論できる。これは特に前記別の保護抗原がこの組
換DNAにより形質転換された細胞によつて分泌され得る
場合に可能である。この別の保護抗原をコードするヌク
レオチド配列はまた、別の遺伝子例えばHBsAg抗原が前
記別の保護抗原の特にハイブリドタンパク質形態での分
泌をも促進する「リーダー（locomotive）」として使用
できれば、この別の遺伝子と同位相で組換DNA中に任意
に挿入し得る。このようにして（必要であればハイブリ
ドタンパク質形態で）産生され得る別の抗原としては、
例えばエプスタイン−バールウイルスの構造タンパクで
ある糖タンパク質が挙げられる。
所定ポリペプチド（「単純な」又はハイブリド状タン
パク質）をコードするヌクレオチド配列の最初のヌクレ
オチドは、このプロモーターにできるだけ近くに、特に
このプロモーターに特有の「TATAボツクス」のできるだ
け近くに配置されるように構築する。但しこのプロモー
ターと前記所定ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列のATGイニシエータとの間のヌクレオチド配列は、
通常前記コード配列に対応し且つ有効な翻訳に必要なリ
ボソーム結合配列を含むメツセンジヤーRNAの非翻訳
５′末端をコードするトリプレツトを通常は当然含まな
ければならない。メツセンジヤーRNAの非翻訳５′末端
は所定のコード配列に通常関連するメツセンジヤーRNA
とは別のメツセンジヤーRNAの非翻訳５′末端に替え得
る。一例としてＳ遺伝子の場合にはプレ−Ｓ遺伝子を含
むか又はこの遺伝子に接する非翻訳５′末端を、SV40の
Ｔ抗原のメツセンジヤーRNAの非翻訳５′末端で置換し
得る。しかしながら強いE1Aプロモーターの制御下にお
かれたＢ型肝炎ウイルスのゲノムのＳ及びプレ−S2領域
を含むDNA配列を使用すると、プレ−S2領域及びＳ領域
の発現が同時に生起し得ることも注意されたい。
選択した別の同様の末端に適合しさえすれば他の任意
のメツセンジヤーRNAの非翻訳５′末端も使用し得る。
プロモーターのTATAボツクスとメツセンジヤーRNAの
開始部位との間の距離は約30ヌクレオチド分にすると有
利である。
本発明の組換DNAのE1Aプロモーターと、より一般的
に、アデノウイルスのゲノムのより多くの部分を使用す
る本発明のベクターとはトウーズ（TOOZE）によつて規
定された如きＣ群に属するアデノウイルスに由来するの
が好ましい。これらのアデノウイルスは腫瘍原ではない
という公知の性質を有する。この群のアデノウイルスの
亜型Ad2又はAd5は形質転換能力が大きいことを特徴とす
る。従つて所望の発現物質を特にワクチンの有効成分と
なる保護抗原の製造に使用する場合には、前記タイプの
組換DNAの使用が特に推奨される。完全で感染性でさえ
あるアデノウイルスを特に後述の如き条件下で生ワクチ
ンの有効成分として使用する場合には特にそうである。
本発明は、前述の如き組換DNAにより形質転換され、
且つ或る種のポリペプチド、即ちこれら組換DNA中に含
まれて前記プロモーターに直接制御されるヌクレオチド
配列（又は前述の如きヌクレオチド配列）によりコード
されるポリペプチドを合成し得るようになつた細胞系、
特にヒト又は動物に由来する細胞系にも勿論係る。
本発明はより特定的には、本発明の組換DNAによつて
形質転換された細胞系であつて、これら細胞系の細胞自
体が前記ベクターに欠けているアデノウイルスゲノム部
分を相補するのに適したヌクレオチドの別の配列を含む
ことを特徴とする細胞系にも係る。前記別の配列は好ま
しくは前記細胞系の細胞のゲノムに組み込まれる。
従つて、前出の細胞系293を組換DNAで形質転換したも
のは、本発明の好ましい細胞培養物を構成する。この系
の細胞に含まれる相補配列によつて、これら細胞内部で
はウイルスが大幅に増殖し、その結果所定ポリペプチド
をコードする配列の発現も増幅される。このコード配列
がＳ遺伝子である第１の場合には、これら細胞の培地中
に分泌されるHBsAg抗原が大量に産生さる。前記コード
配列がＢ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子とプレ−S2領域とで
構成される第２の場合はpHSAのレセプタの活性を有する
HBsAg粒子が組換アデノウイルスによりインビトロで合
成される。ウサギに注射すると、この組換ウイルスは抗
HBsAg抗体及び抗pHSA抗体を産生する。これは、インビ
トロでもインビボでも組換アデノウイルスを遺伝子の発
現に使用し得ることを意味する。同じベクターを同様の
条件下でベロ（Vero）細胞の形質転換に使用し得る。
本発明の組換DNAを含むベクターは、それ自体相補配
列を有さない細胞の形質転換にも前述の条件下で使用し
得る。その場合は一方で本発明の組換DNAを含むベクタ
ーを使用し、他方で本発明の組換ベクターに欠けている
アデノウイルス配列を含む非欠損アデノウイルス又は別
の組換DNAを使用して前述タイプの細胞の同時形質転換
を行なう必要があろう。この場合にはHBsAg抗原（コー
ド配列がＳ遺伝子を含む場合）と、このようにして形質
転換された細胞により複製され且つ遊離されたアデノウ
イルスとが同時に産生され得よう。形成された保護抗原
は必要であれば、培地を抗アデノウイルス抗体、好まし
くはセフアロース（SEPHAROSE）の名称で市販されてい
る網状アガロースの如き固体サポート上に固定された抗
アデノウイルス抗体と接触させることなどにより、ウイ
ルス懸濁液から分離し得る。いずれにしろ、ワクチン製
剤中の残留ウイルス量は比較的小さな重要性しか持たな
い。実際、アデノウイルスは人体では弱い病原力しか示
さず、軽い呼吸器感染を生起するにすぎない。
アデノウイルス、より特定的にはヒトアデノウイルス
のＣ群に属するアデノウイルスの病原としての力が弱い
ため、「生ワクチン」の製造が可能になる。この生ワク
チンはアデノウイルスの非必須部分に本発明の組換DNA
を挿入することによりE3領域レベルで修飾した感染性ア
デノウイルスで構成し得る。これに関して強調すべき
は、Ｃ群のヒトアデノウイルスが動物体内で腫瘍形成性
を示すことは決してないという事実である（３）。これ
らのベクターすなわちウイルスは、今ではその非腫瘍形
成性が確証されているベロ細胞の形質転換に特に有利で
あろう。その結果これらの細胞はヒトに使用される生成
物の製造に特に有利な動物由来細胞系を構成する。
本発明の組換DNAを含むベクターの好ましい組立及び
これらのベクターを使用できる条件に関して、添付図面
に基いて以下に説明する。これらの記載より本発明の付
加的特徴がより十分に理解されよう。
本発明による組換DNAの組立て手順を記載する前に、
図面に関する以下の註釈を与えておく。
第３図〜第６図で細線部分はプラスミドpML2の配列に
対応する。
第１図〜第５図の番号はAd5,SV40及びHBVウイルスの
配列中の制限部位の位置を示す。Ad5とSV40との制限部
位の位置の番号付けはジエー・トウーゼ（J.TOOZE）
（１）の方法に従い、HBVの番号付けはペー・テイオレ
（P.TIOLLAIS）等（11）の方法に従う。
図中、部位各に抹消記号を付けた部分は、後述するDN
Aの対応部分にこれら部位が前には存在していたことを
示す。しかし乍ら、適当な制限酵素を用いるか又は以下
に記載する如く組立実験に用いたそれ以外の何らかの手
段を用いて開裂又は断片化された断片の接着端の修復に
よつて上記部位は欠失又は削除された。
1.アデノウイルスAd5（以後単にAd5で示すこともある）
のゲノムの構造及び組織の主要要素に関する復習 これらは第１図の部分1Aと1Bとから得られる。
1A: ゲノムは約36,000bpの長さをもつ直線状二本線DNA
分子である。矢印は初期領域E1a,E1b,E2,E3及びE4の転
写の位置と方向とを示す。主要後期プロモータPMt及び
該プロモータに対応する転写単位も図示されている。０
〜100までの10で区切つた番号はこのゲノム全体のサイ
ズに対する割合を％で示したものである。
1B: 領域E1A。この領域の転写物は全て、等しい５′Ｐ
末端（位置499）と３′OH末端（位置1632）とを有す
る。プロモータの要素TATAの最初のＴは位置468に存在
する。プラスミドの組立に使用した制限部位が図示され
ている。サイズは塩基対の個数で示す。
2.以後の組立に使用したＳ遺伝子又はＳ遺伝子とプレ−
S2領域とを含む断片のオリジン ケース1: Ｓ遺伝子を含むＢ型肝炎ウイルスのゲノムの
断片 これはＢ型肝炎ウイルスのゲノム（第２図）に由来す
る。Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムが部分的に一本鎖の環状
DNA分子であることを喚起されたい。分子の長さは約3,2
00bpである。この分子は、夫々Ｌ（−）及びＳ（＋）と
指称される相異なる長さの２つの鎖の対合によつて構成
されている。Ｓ遺伝子はHBsAgを担持するウイルス被膜
の主ポリペプチドのコード配列を示す。以後の組立に使
用されるDNA断片は断片Xho I127−Bgl II1984である。H
BsAgのメツセンジヤーのポリアデニル化部位は位置1916
にあつた。
ケース2: Ｓ遺伝子とプレ−S2領域とを含むＢ型肝炎ウ
イルスのゲノムの断片 DNA断片として断片Mst II3161−Bgl II1982を使用し
た。この断片はHBs抗原と重合ヒト血清アルブミン（pHS
A）の受容体との双方をコードする。Mst II部位は９個
のヌクレオチドをもつプレーS2領域の開始コドンの直前
に存在する。Bgl II部位はＳ遺伝子のポリＡ付加シグナ
ル（poly A addition signal）の64個下流のヌクレオチ
ドに存在する。
以下の記載では、Ｓ遺伝子を含む組換アデノウイルス
の組立及び増殖について説明する。Ｓ遺伝子とプレS2領
域とをもつ組換アデノウイルスの場合にも同じ操作手順
が使用される。前者ではDNA Xho I−Bgl II断片、後者
ではDNA Mst II−Bgl II断片がプラスミドpK4のHind I
II制限部位とBam HI制限部位との間に挿入される。前者
の場合について以下に説明する。
従つて以下の記載ではAd5（Ｘ−Ｂ）がＳ遺伝子をも
つ組換アデノウイルスを示し、Ad5（Ｍ−Ｂ）がＳ遺伝
子とプレS2領域とをもつ組換アデノウイルスを示す。
3.プラスミドpE1A（Taq I）の組立（第３図） プラスミドpE1A（Taq I）はAd5ゲノムの左端から始ま
る632個のヌクレオチドを含む。この断片はAd5のSac I
Ｅ（０〜5.0％）精製制限断片をTaq Iで切断して得ら
れた（第１図）。この断片をプラスミドpML2のEcoR I制
限部位とCla I制限部位との間に挿入した（第３図）。
プラスミドpML2をEcoR IとCla Iとによつて開裂した。T
aq I末端を直線化したプラスミドにAd5断片を結合し
た。末端接合Taq I−Cla IがCla I制限部位を再生す
る。組換体のEcoR I末端を大腸菌（Ｅ．coli）のDNA−
ポリメラーゼＩ（Klenow断片）で修復し、T4リガーゼで
プラスミドを再度環化した。従つてEcoR I部位が回復し
た。
4.プラスミドpAB1の製造（第４図） プラスミドpE1A（Taq I）を出発物質としE1A領域のコ
ード部分を除去してプラスミドpAB1を組立てた。このた
めには、Pvu II−Pvu II（位置452−623）断片を単離
し、この断片をHae III酵素で切断し（位置495）、プラ
スミドpE1A（Taq I）のPve II623部位にPvu II452−Hae
III495断片を再挿入した。言い換えれば、Hae III495
−Pvu623断片を欠失させた。プラスミドpAB1は領域E1A
の転写開始部位の近くにHind III部位を有し、遠くに
（pML2の）BamH I部位を含む。これら２つの制限部位を
利用すると、遺伝子融合を要せずに外来遺伝子をクロー
ニングし得る。
5.プラスミドpK4の産生（第５図） pAB1をHind IIIとBamH Iとによつて切断し、pAB1由来
のE1Aのプロモータを含む断片を、SV40ウイルスのＴ抗
原とｔ抗原とをコードする遺伝子を含むBgl I−BamH I
断片（SV40ウイルスのゲノムの位置5235−2533、以後Ａ
（SV40）と指称）のBamH I末端に結合した。組換体のBg
l I末端とHind III末端とをKlenow断片によつて修復
し、T4リガーゼを用いてプラスミドを再度環化した。Ｔ
遺伝子の過渡的発現を利用してプラスミドpK4に存在す
る構造を試験した。リン酸カルシウム法（19）を用いる
トランスフエクシヨンによつてHeLa細胞に導入される
と、プラスミドpK4はSV40のＴ抗原の合成を誘発する。
これは、免疫螢光法によつて検出された。トランスフエ
クトされた細胞の約１％が明らかな螢光を有していた。
誤つた方向に挿入されたSV40の断片を含むプラスミドに
よる細胞トランスフエクシヨンの後で螢光が存在しない
ことは、Ｔ抗原とｔ抗原との遺伝子が確実にAd5のE1Aプ
ロモータのコントロール下にあることの証明になる。
次に、断片Ａ（SV40）の位置5171のHind III部位を利
用し、Ａ（SV40）の大部分をＳ遺伝子を含む前記断片で
置換する。
6.プラスミドpK48（Ｘ−Ｂ）の製造（第６図） プラスミドpK4をHind IIIとBamH Iとによつて消化し
た。Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）（第２図）のゲノムのXho
I−Bgl II断片（位置125〜1982）をプラスミドpK4のHi
nd III制限部位とBamH I制限部位との間のＡ（SV40）の
大部分に置換挿入した。その前に夫々の末端を大腸菌の
DNAポリメラーゼＩ（Klenow断片）で修復しておく（第
３図）。制限部位Xho I、Hind III,BamH I及びBgl IIは
結合後に消滅する。
Hind III部位はＴ及びｔ抗原のATGイニシエータの上
流側８個目のヌクレオチドに存在していた。従つてこの
部位にＳ遺伝子を挿入すると、「キヤツピング（cappin
g）」部位を含むSV40の初期mRNAの５′末端とメツセン
ジヤーをリボソームに対合させる配列とを保持し得る。
HBV DNA断片は、HBsAgを担持するウイルス被膜の主要
ポリペプチドをコードする配列即ちＳ遺伝子（位置155
〜833）と、遺伝子Ｓの３′に存在し位置1916にHBsAgの
メツセンジヤーRNAのポリアデニル化部位を含む配列と
を内包する（20,21,22）。２つの向きに挿入されたHBV
断片を担持する２つのプラスミドpK4S+及びpK4S-を単離
した。細胞293を上記２種のプラスミドによつてトラン
スフエクトしトランスフエクシヨン３日後に細胞上清中
でHBsAgの合成を検査した。Ｓ遺伝子の５′末端にE1Aプ
ロモータを有するプラスミドpK4S+だけがHBsAgの合成を
誘発し得る。このことは、Ｓ遺伝子の発現が確実にAd5
のE1Aプロモータのコントロール下にあることを示す。
最後に、大腸菌中でメチル化されないCla I制限部位を
プラスミドpK4S+（Ｘ−Ｂ）の配列pML2のNru I部位に挿
入した。この部位は組換ウイルスの組立に必要である。
最後に、Pst I末端とCla I末端とによつて限定される
断片をpK4S+（Ｘ−Ｂ）から調製し、これを利用して本
発明の「欠失（欠陥）組換ウイルス（virus recombinan
t dfectif）」を製造した。
7.欠失組換ウイルスの組立（第７図） プラスミドpK4S+（Ｘ−Ｂ）を出発物質とする精製Pst
I−Cla I制限断片３μｇをシヨ糖濃度勾配中の超遠心
で精製したAd5のCla I制限断片（2.6％〜100％）20μｇ
に結合してAd5の「欠失組換ウイルス」を調製した。
8.組換ウイルスの増殖 細胞293を直径6cmのシヤーレで培養し、トランスフエ
クシヨン４時間前に培養上清を培地で置換した。リン酸
カルシウム法を用いコンフルエンスの70％の細胞293を
含む５つのシヤーレを結合混合物によつてトランスフエ
クトし、37℃で４時間インキユベートした。吸着後、各
シヤーレ内の細胞を2mlのTSバツフア（NaCl8000.0mg/
、KCl380.0mg/、Na2HPO4100.0mg/、CaCl2100.0mg
/、MgCl2,6H2O100.0mg/、トリス3000.0mg/、pH7.
4）で洗い、20％のグリセロールを含む400μの常温の
TS溶液で１分間処理し、2mlのTSバツフアで２回洗浄
し、１％の上質寒天と１％の胎仔ウシ血清とを含む4ml
のMEM培地で覆つた。４〜７日後に4mlの栄養混合物で細
胞を覆つた。10日目に、0.01％のニユートラル・レツド
を加えた4mlの栄養培地で細胞を着色した。11日目にプ
ラークを観察した。ウイルスを1mlのTSに再懸濁させ細
胞293で増幅した。培地中のHBsAgの存在をRIA（オース
トリアII、アポツト（ABBOTT）実験所）で検査した。増
幅後の組換体中のHBV配列の存在をハイブリダイゼーシ
ヨンによつて検査した。５つのプラークを分析した。唯
１つのプラークがHBsAg+組換ウイルスを含んでいた。こ
のクローンAd5（Ｘ−Ｂ）ともう１つの別のクローンと
がHBV配列の検出に陽性を示した。組換ウイルスゲノム
のサイズは2100bpの野生ウイルスのサイズより大きい。
組換ゲノムの制限断片の分析によつて欠失は全く検出さ
れなかつた。更にこの分析によれば、Pst I制限部位とA
d5配列との間に位置するpML2の配列が細胞系293の組換
ゲノムの増殖中に正しく切除されたことが判明した。
9.ベクターAd5（Ｘ−Ｂ）によつて誘発されるHBsAgの合
成 細胞293とVero細胞とをウイルスAd5（Ｘ−Ｂ）で感染
させた。合成HBsAgの発現レベルを表Ｉに示す。感染３
日後に細胞上清サンプルを採取し、ラジオイムノアツセ
イ（radio−immunoassay:R1A）でHBsAgを検定した。こ
の結果、ベクターAd5（Ｘ−Ｂ）は上記２つの細胞系に
於いてHBsAgの合成を誘発し得ること、及び各細胞系がH
BsAgを各培地中に分泌し得ることが判明した。
合成HBsAgをCsCl中の超遠心によつて精製した。密度
1.20である。22nmの典型的粒子を電子顕微鏡で観察し
た。
10.ベクターAd5（Ｍ−Ｂ）によつて誘発されるHBsAgの
合成 細胞293とVero細胞とにAd5（Ｍ−Ｂ）ウイルスを感染
させ得られた合成HBsAgの発現レベルを表Ｉに示す。
Ad5（Ｍ−Ｂ）で感染したVero細胞に於けるHBsAgの細
胞内外の分布速度から判断すると、HBsAgの合成が感染
３時間後に開始され８時間後に培地から検出できた。組
換ウイルスAd5（Ｍ−Ｂ）で感染させると、120時間後に
培地中で細胞106個当り0.5〜１μｇのHBsAgが蓄積され
る。実験を繰返した結果、プレS2領域を含む組換ウイル
スは、Ｓ遺伝子だけを含む組換ウイルスよりも多量のHB
sAgを合成することが判明した。組換アデノウイルスAd5
（Ｍ−Ｂ）に感染させた細胞の培地から精製されたHBsA
gは、平均粒径22nmの粒子の均質集団を構成していた。C
sCl中で遠心後の密度は1.21であつた。
細胞293及びVero細胞にAd5（Ｘ−Ｂ）又はAd5（Ｍ−
Ｂ）を感染させた後に産生されたHBsAgの蓄積量（ng） 11.Vero細胞由来のHBsAg粒子のpHSAに対する受容体活性 Vero細胞中で産生されたHBsAg粒子を、pHSAで被覆さ
れたヒツジ赤血球の血球凝集法とラジオイムノアツセイ
（RIA）とによつて試験しpHSAに対する受容体活性の存
在を検出した。pHSAに対する固定活性を検出できたが、
重合ウシアルブミンに対する固定活性は検出できなかつ
た（表II）。このような活性は、Ｓ遺伝子だけを含む組
換アデノウイルスAd5（Ｘ−Ｂ）を感染させたVero細胞
では検出できなかつた。
結果を固相ラジオイムノアツセイでのcpm及び血球凝
集力価（HA）で示す。
ND:測定不能 pHSA:重合ヒト血清アルブミン pHSA:重合ウシ血清アルブミン cpm:毎分カウント数 12.組換ウイルスのインビボ活性 組換アデノウイルスAd5（Ｍ−Ｂ）と野生アデノウイ
ルスとの高度に精製された調製物を静注によつてウサギ
に接種した。血清注にHBsAg抗原は検出されなかつた
が、組換ウイルスを接種した８羽中５羽のウサギに於い
て15日後に20〜270mIU/mlの抗−HBs力価が現れることが
判明した（表III）。野生型アデノウイルスを注射した
ウサギでは抗−HBs抗体は全く検出されなかつた。
第１回目の静注の４週間以内第２回目の静注接種を行
なうと試験動物のうちの１つで抗HBs応答中に440mIU/ml
に達する第２のピークが観察された。第２回目の注射の
４週間後に6mIU/ml〜360mIU/mlのの範囲の抗HBs力価の
上昇が見られた。これまでの研究によればHBVに対する
防御能力を維持し得る抗−HBsの最小レベルはヒトの場
合10mIU/mlである。抗−pHSA抗体とHBVの中和との関係
を決定するために接種ウサギ中の抗−pHSA抗体を検出し
た。血球凝集阻止により検出されるこれらの抗体は、陽
性の抗−HBs応答をもつ５匹の試験動物の全部から検出
された（表IV）。
109pfuの精製した野生アデノウイルスAd5及び109pfu
の精製した組換アデノウイルスAd5（Ｍ−Ｂ）を０週目
及び４週目に血液採取直後のウサギ（１と２）及びウサ
ギ（３〜10）に夫夫静注した。アボツト（Abbott）のRI
A AUSABのシステムで抗−HBs抗体量を測定し国際単位で
示した（3.5RIAが1mIUに相当）。（pfu＝プラーク形成
単位）。
０週目及び４週目に精製した組換アデノウイルスAd5
（Ｍ−Ｂ）109pfuをウサギに静注した。試験動物は表II
Iと同じ番号で示す。
抗−pHSA受容体活性を100％血球凝集阻止を与え得る
最も高い血清力価の逆数で示した。PhSA受容体たる血球
凝集力価1:128をもつHBsAg粒子を等容の阻害血清系列希
釈液と混合した。
従つて、組換アデノウイルスAd5（Ｍ−Ｂ）は重合さ
れたヒト血清アルブミンの受容体特性をもつHBsAg粒子
のインビボ合成を誘発し得る。
従つて、本発明は、Ｂ型肝炎（又はそれ以外の疾患）
に対するワクチンを細胞培養物中で製造するためのベー
ス的方法論を提供する。
５型アデノウイルスをベクターとして使用すると利点
が倍加する。１方では、このウイルスは人体中での病原
性が小さく、良性の呼吸器感染しか生じない。他方で
は、ヒトアデノウイルスのＣ群に属するこの血清型は動
物体内で主要発生要因にならない。また、Vero細胞で得
られるHBsAgの産生率（感染サイクル当り細胞106個毎に
約１マイクログラム、１μg/106/1cycle）は問題無く工
業化に十分である。また、この細胞系は腫瘍非発生性で
あり、このため、ヒトを使用対象とする物質の産生に最
も好ましい動物由来の細胞系であることも自明である。
言う迄もなく上記の記載より明らかな如く、本発明は
特定的に説明した使用及び製造方法に全く限定されな
い。逆に本発明は全ての変形を包含しており、特に、本
発明の組換DNAを含有する別の形態のベクター特にプラ
スミドの使用を包含することを明記しておきたい。これ
らベクターは、記載のベクターと同じタイプのウイルス
ベクターの製造に使用されてもよく、又は、高等真核細
胞特にヒト又は霊長類の培養細胞のゲノム中に組換DNA
を組込むベヒクルとして使用されてもよい。
同じく言う迄もなく、前記の細胞293に代えて、アデ
ノウイルスに感染し得るか又はアデノウイルスのE1Aプ
ロモータを認識し得るいかなる別の高等真核細胞を使用
してもよい。またこれらの細胞は、アデノウイルスのゲ
ノムから本発明の欠失組換ウイルスで脱落している部分
を含む配列をそれ自体のゲノムに予め組込むことによつ
て修飾されていてもよい。このような修飾は、これらの
細胞によつて認識される強いプロモータ、例えばチミジ
ンキナーゼプロモータ又はsv40ウイルスプロモータのコ
ントロール下になるように行なわれる。この場合、アデ
ノウイルス由来の配列が上記高等真核細胞のゲノムに組
込まれ、細胞293によつて許容された条件と同様の条件
下で本発明の欠失ウイルスを補完し得る。これらの方法
はVero細胞に特に有利に適用できる。
使用されたアデノウイルスAd5は1984年８月３日、受
託番号Ｉ−322でパリのC.N.C.M.（コレクシヨン・ナシ
ヨナル・ドウ・キユルチユール・ドウ・ミクロ−オルガ
ニスム・ドウ・ランステイテユ・パスツール（Collecti
on Nationale de Cultures de Micro−organismes de l
´INSTITUT PASTEUR）に寄託された。
細胞系293は1984年８月３日、受託番号Ｉ−323でC.N.
C.Mに寄託された。
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【図面の簡単な説明】
第１図は亜型Ad5のアデノウイルスのゲノムのいろいろ
な領域の相対位置を概略的に示す図であり、一部（Ｂ）
はこのゲノムのE1A領域の拡大図である。 第２図はＢ型肝炎ウイルスのゲノムの古典的な図であ
る。 第３図〜第６図は本発明の第１の組換えDNAを含有する
プラスミド（第６図）の製造工程を示す図である。 第７図は「欠陥組換えウイルス（virus recombinant d
fectif）」を第５図の改変プラスミドとAd5の欠陥ゲ
ノム（ｇnomes dfectifs）とから構築する工程の概
略説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (73)特許権者 999999999 アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシ ユ・メデイカル フランス国、75654・パリ・セデクス・ 13、リユ・ドウ・トルビアツク、101 (72)発明者 ミシエル・ペリコデ フランス国、75004・パリ、リユ・ド ユ・ルナール、６ (72)発明者 アニツク・バレ フランス国、78630・オルジユヴアル、 リユ・ドウ・モンタメ、646 (72)発明者 マツシモ・レヴレロ イタリー国、00198・ローマ、ヴイア・ アレツサンドリア、199 (72)発明者 ピエール・チオレ フランス国、75013・パリ、リユ・ド ウ・ラ・グラシエール、16 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．80，（Ｄｅｃｅｍ ｂｅｒ1983），Ｐ．7586−7590 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. ２．Ｎｏ．１，（Ｊａｎ．1983），Ｐ. 44−55 Ｃｅｌｌ，Ｖ33（1983），Ｐ．455− 464 Ｃｅｌｌ，Ｖ23（1981），Ｐ．825− 836

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アデノウイルスに感染し得る細胞系又は内
    因性ポリメラーゼがアデノウイルスのプロモーターを認
    識し得る細胞系から選択された真核細胞系、特にヒト又
    は動物の細胞系を形質転換することができる組換えアデ
    ノウイルスゲノムであって、前記細胞系内で発現させよ
    うとするポリペプチド配列をコードしている外来性の核
    酸挿入配列を含んでおり、この外来性の核酸挿入配列
    が、通常は初期E1Aプロモーターの制御下にある前記組
    換えアデノウイルスゲノムの領域に挿入されており、初
    期E1Aプロモーターの制御下に置かれており、前記組換
    えアデノウイルスゲノムが更に、対応するアデノウイル
    スの複製に必要で、前記ゲノム中で通常は初期E1Aプロ
    モーターの直接的な制御下にある遺伝子の下流に通常は
    位置するアデノウイルスゲノムの配列の全てを、外来性
    の核酸挿入配列の下流に含む組換えアデノウイルスゲノ
    ム。
  2. 【請求項２】ウイルスのゲノムのE1A領域の前部、特に
    その０−2.6％断片に存在するウイルスの増殖に必要な
    配列に欠陥のあることを特徴とする請求項１に記載の組
    換えアデノウイルスゲノム。
  3. 【請求項３】亜型Ad2又はAd5に属するアデノウイルスに
    由来することを特徴とする請求項１又は２に記載の組換
    えアデノウイルスゲノム。
  4. 【請求項４】Ｃ群のアデノウイルスに由来することを特
    徴とする請求項３に記載の組換えアデノウイルスゲノ
    ム。
  5. 【請求項５】前記核酸挿入配列が、天然のプロモーター
    の制御下で天然の宿主細胞で発現されるとき、天然の宿
    主細胞の培養培地に分泌される蛋白質をコードすること
    を特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載の組換
    えアデノウイルスゲノム。
  6. 【請求項６】前記核酸挿入配列が、所定の病原体に対し
    て防御する保護抗原をコードすることを特徴とする請求
    項１ないし５のいずれかに記載の組換えアデノウイルス
    ゲノム。
  7. 【請求項７】前記核酸挿入配列が、HBsAg抗原をコード
    することを特徴とする請求項６に記載の組換えアデノウ
    イルスゲノム。
  8. 【請求項８】アデノウイルスに感染し得る細胞系又は内
    因性ポリメラーゼがアデノウイルスのプロモーターを認
    識し得る細胞系から選択された真核細胞系、特にヒト又
    は動物の細胞系を形質転換することができる組換えアデ
    ノウイルスゲノムであって、前記細胞系内で発現させよ
    うとするポリペプチド配列をコードしている外来性の核
    酸挿入配列を含んでおり、この外来性の核酸挿入配列
    が、通常は初期E1Aプロモーターの制御下にある前記組
    換えアデノウイルスゲノムの領域に挿入されており、初
    期E1Aプロモーターの制御下に置かれており、前記組換
    えアデノウイルスゲノムが更に、対応するアデノウイル
    スの複製に必要で、前記ゲノム中で通常は初期E1Aプロ
    モーターの直接的な制御下にある遺伝子の下流に通常は
    位置するアデノウイルスゲノムの配列の全てを、外来性
    の核酸挿入配列の下流に含む組換えアデノウイルスゲノ
    ムで形質転換され、前記核酸挿入配列でコードされるポ
    リペプチドを生成することを特徴とするヒト又は動物に
    由来する細胞系。
  9. 【請求項９】組換えアデノウイルスゲノムが、ウイルス
    のゲノムのE1A領域の前部、特にその０−2.6％断片に存
    在するウイルスの増殖に必要な配列に欠陥のあることを
    特徴とする請求項８に記載の細胞系。
  10. 【請求項１０】組換えアデノウイルスゲノムが、亜型Ad
    2又はAd5に属するアデノウイルスに由来することを特徴
    とする請求項８又は９に記載の細胞系。
  11. 【請求項１１】組換えアデノウイルスゲノムが、Ｃ群の
    アデノウイルスに由来することを特徴とする請求項10に
    記載の細胞系。
  12. 【請求項１２】核酸挿入配列が、天然のプロモーターの
    制御下で天然の宿主細胞で発現されるとき、天然の宿主
    細胞の培養培地に分泌される蛋白質をコードすることを
    特徴とする請求項８ないし11のいずれかに記載の細胞
    系。
  13. 【請求項１３】核酸挿入配列が、所定の病原体に対して
    防御する保護抗原をコードすることを特徴とする請求項
    ８ないし12のいずれかに記載の細胞系。
  14. 【請求項１４】核酸挿入配列が、HBsAg抗原をコードす
    ることを特徴とする請求項13に記載の細胞系。
  15. 【請求項１５】アデノウイルスに感染し得る細胞又は内
    因性ポリメラーゼがアデノウイルスのE1Aプロモーター
    を認識できる細胞を有する宿主で所定のポリペプチド配
    列を発現させる方法であって、発現可能な条件下で前記
    ペプチド配列をコードする核酸配列を前記細胞にin viv
    oで移入させることを含む方法であり、コーディング核
    酸配列は、アデノウイルスゲノム中で通常は初期E1Aプ
    ロモーターの制御下にある領域で組換えアデノウイルス
    ゲノム中に含まれ、初期E1Aプロモーターの制御下に置
    かれており、前記組換えアデノウイルスゲノムが、対応
    するアデノウイルスの複製に必要で、前記ゲノム中で通
    常は初期E1Aプロモーターの直接的な制御下にある遺伝
    子の下流に通常は位置するアデノウイルスゲノムの配列
    の全てを、核酸挿入配列の下流に含むことを特徴とする
    方法。
  16. 【請求項１６】アデノウイルスゲノムが、ウイルスのゲ
    ノムのE1A領域の前部、特にその０−2.6％断片に存在す
    るウイルスの増殖に必要な配列に欠陥のあることを特徴
    とする請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】アデノウイルスゲノムが、亜型Ad2又はA
    d5に属するアデノウイルスに由来していることを特徴と
    する請求項15又は16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】アデノウイルスゲノムが、Ｃ群のアデノ
    ウイルスに由来することを特徴とする請求項17に記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】前記核酸挿入配列が、天然のプロモータ
    ーの制御下で天然の宿主細胞で発現されるとき、天然の
    宿主細胞の培養培地に分泌される蛋白質をコードするこ
    とを特徴とする請求項15ないし18のいずれかに記載の方
    法。
  20. 【請求項２０】前記核酸挿入配列が、所定の病原体に対
    して防御する保護抗原をコードすることを特徴とする請
    求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記核酸挿入配列が、HBsAg抗原をコー
    ドすることを特徴とする請求項19又は20に記載の方法。
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