ES2254042T3 - Microesferas para embolizacion activa. - Google Patents

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Abstract

Microesfera adecuada para la embolización activa que comprende un polímero biocompatible, reticulado y sustancialmente hidrófilo y uno o más componentes activos que comprenden un fármaco, una vacuna o cualquier combinación de los mismos.

Description

Microesferas para embolización activa.
1. Campo de la invención
La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para tratar enfermedades que incluyen cáncer y diferentes otras enfermedades que dependen de angiogénesis, y más particularmente con composiciones que contienen factores terapéuticos bioactivos en asociación con microesferas como portadores (que han sido recubiertas con, o bien que contienen a tales factores), así como métodos para utilizar a tales composiciones para una terapia de embolozación activa.
2. Antecedentes de la invención 2.1 Enfermedades que dependen de la angiogénesis
Las enfermedades que dependen de angiogénesis (esto es, aquellas enfermedades que requieren o inducen crecimiento vascular) representan una porción significativa de todas las enfermedades para las cuales se busca tratamiento médico. Por ejemplo, el cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en los Estados Unidos, y es responsable por una quinta parte de las muertes totales. En resumen, el cáncer se caracteriza por la división descontrolada de una población de células que, más típicamente, conduce a la formación de uno o más tumores. Tales tumores se caracterizan también por el crecimiento hacia adentro de vasculatura que suministra diferentes factores a la circulación sanguínea que permiten el crecimiento continuo del tumor. Aunque el cáncer se diagnostica generalmente más fácilmente que en el pasado, muchas formas, aún si se detectan temprano, son aún incurables.
Actualmente se utilizan una variedad de métodos para tratar el cáncer, incluidos por ejemplo, diferentes procedimientos quirúrgicos. Si se lo trata únicamente con cirugía sin embargo, muchos pacientes (particularmente aquellos con ciertos tipos de cáncer, tales como cáncer de seno, de cerebro, de colon y hepático) experimentarán recurrencia del cáncer. Por lo tanto, además de la cirugía, muchos cánceres también son tratados con una combinación de terapias que involucran drogas quimioterapéuticas citotóxicas (por ejemplo, vincristina, doxorubicina, taxol, vinblastina, cisplatina, metotrexato, 5-FU, etc.) y/o terapia de radiación. Una dificultad con esta aproximación, sin embargo, es que los agentes radioterapéuticos y quimioterapéuticos son tóxicos para los tejidos normales, y a menudo crean efectos secundarios que se constituyen en amenazas para la vida. Además, estas aproximaciones tienen a menudo tasas de falla/remisión extremadamente altas.
Además de la terapia quirúrgica, la quimioterapia y la terapia de radiación, otros han intentado utilizar el propio sistema inmunológico del individuo con el propósito de eliminar las células cancerosas. Por ejemplo, algunos han sugerido el uso de componentes bacteriales o virales como adyuvantes con el propósito de estimular al sistema inmunológico a destruir las células tumorales. (Ver generalmente "Principles of Cancer Biotherapy," Oldham (ed.), Raven Press, New York, 1987). Tales agentes han sido utilizados generalmente como adyuvantes y como estimulantes no específicos en modelos tumorales animales, pero aún no han probado ser generalmente efectivos en humanos.
Una limitación adicional de los métodos presentes es que la recurrencia local y el control local de la enfermedad permanecen como el reto principal en el tratamiento de la malignidad. En particular, un total de 630.000 pacientes anualmente (en los Estados Unidos) tienen una enfermedad localizada (sin evidencia de se haya extendido por metástasis en un sitio distante) al momento de presentarse; esto representa 64% de todos aquellos pacientes diagnosticados con malignidad (esto no incluye al cáncer de piel no causado por melanoma o al carcinoma in situ). Para la gran mayoría de estos pacientes, la resección quirúrgica de la enfermedad representa la más grande oportunidad de cura y efectivamente 428.000 se curarán después del tratamiento inicial-428.000. Infortunadamente, 202.000 (ó 32% de todos los pacientes con enfermedad localizada) recaerán después el tratamiento inicial. De aquellos que recaen, el número que recae debido a una recurrencia local de la enfermedad es de 133.000 pacientes anualmente (ó 21% de todos aquellos con enfermedad localizada). El número de aquellos que recaerán debido a metástasis a distancia de la enfermedad es de 68.000 pacientes anualmente (11% de todos aquellos con enfermedad localizada). Aproximadamente otros 102.100 morirán anualmente como resultado directo de una inhabilidad para controlar el crecimiento local de la enfermedad. Los ejemplos de cánceres que ilustran el problema con el cual tiene que vérselas los pacientes son el cáncer de seno y el cáncer de hígado.
Cáncer de Seno
Este problema es particularmente evidente para el cáncer de seno que es una enfermedad que afecta a aproximadamente a 186.000 mujeres anualmente en los Estados Unidos y para las cuales la tasa de mortalidad ha permanecido inalterada los últimos 50 años. La resección quirúrgica de la enfermedad a través de mastectomía radical, mastectomía radical modificada, o lumpectomía aún sigue siendo el soporte del tratamiento para esta enfermedad. Infortunadamente, 39% de aquellas mujeres tratadas únicamente con lumpectomía desarrollarán una recurrencia de la enfermedad, y sorprendentemente, también lo harán 25% de aquellas en las cuales se encuentra que el margen de resección está limpio histológicamente de tumor. Tanto como el 90% de estas recurrencias locales se presentarán alrededor de los 2 cm del sitio previo de la extirpación.
Cáncer de Hígado
Más de 1,2 millones de personas murieron en 1999 de cáncer primario de hígado, la mayor parte de ellos en Asia. El cáncer primario de hígado se refiere al cáncer de hígado en el cual las células cancerosas iniciales se forman en el hígado, en vez de viajar hasta el hígado a partir de algún otro sitio con cáncer en el organismo. Los pacientes con ciertas formas de hepatitis, incluida la hepatitis C, una enfermedad viral que causa inflamación del hígado, se sabe que tienen gran riesgo de padecer cáncer primario de hígado. Se espera que la incidencia de cáncer primario de hígado se incremente dramáticamente en los Estados Unidos, donde los estimativos indican que más de 4 millones de personas son actualmente positivos para hepatitis C.
Por encima del 70 porciento de los cánceres primarios de hígado son inoperables y son tratados con radiación o quimioterapia. Las opciones de tratamiento actualmente disponibles incluyen a las siguientes:
Quimioterapia: La quimioterapia busca controlar el cáncer matando a las células cancerosas que se dividen rápidamente. Sin embargo, una cantidad de células no cancerosas en el organismo, tales como las células de la médula ósea, también se dividen rápidamente y son, por lo tanto, altamente susceptibles de ser asesinadas inadvertidamente por la quimioterapia. De este modo, las dosis que son suficientes para erradicar el cáncer causan a menudo efectos secundarios que amenazan la vida debido a la destrucción de células no cancerosas.
Quimioembolización y diferentes tratamientos en etapa de desarrollo: Por ejemplo, la inyección percutánea de etanol es un procedimiento doloroso que únicamente funciona para tumores pequeños que están limitados a aquellos menores a 3-4 cm.
Trasplante: El trasplante es también una terapia disponible que es costosa y está limitada por la disponibilidad de órganos y que puede inclusive conducir a una recurrencia del tumor. También, existen peligros recurrentes asociados con cirugía invasiva.
Además, la quimioterapia puede dañar también las defensas antitumorales naturales del organismo humano.
Fibroides Uterinos
Un ejemplo relevante de tumor no canceroso sería el de los fibroides uterinos, también conocidos como leiomiomas. Estos son tumores no cancerosos compuestos de ciertos tipos de fibras musculares y de tejido conectivo fibroso. La causa de los fibroides uterinos es desconocida. La mayoría de los pacientes con fibroides uterinos no tienen inicialmente síntomas y permanecen sin tratamiento hasta que experimentan sangrado anormal, frecuencia urinaria, dolor, hinchazón y dificultad con la fertilidad. Aproximadamente 25 millones de mujeres en los Estados Unidos tienen fibroides uterinos, y aproximadamente 5,5 millones de estas mujeres experimentan síntomas suficientes para buscar tratamiento cada año. Hasta ahora, las mujeres que sufren de fibrosis uterina han tenido pocas opciones viables de tratamiento, incluidas histerectomía, miomectomía, y Evaluación Médica y "Observación y Espera". Las terapias actualmente disponibles para tratar a los fibroides uterinos tienen desventajas significativas que incluyen: perdida temporal o permanente de fertilidad para mujeres en edad fértil, períodos de recuperación lenta, efectos fisiológicos adversos que pueden conducir a menopausia temprana, altos costos, incluidos los costos de medicamentos, procedimientos quirúrgicos, permanencias largas y frecuentes en el hospital, molestias y efectos secundarios por procedimientos quirúrgicos invasivos y terapia hormonal, y/o riesgo de recurrencia de los fibroides.
Como resultado, existe una significativa necesidad por un programa de terapia uniformemente eficaz para pacientes con, entre otros, cáncer de seno, cáncer de hígado, cáncer de páncreas y fibroides uterinos.
Embolización Pasiva
Un método que ha sido intentado para el tratamiento de tumores aunque con éxito limitado es la embolización pasiva. En resumen, los vasos sanguíneos que alimentan un tumor son bloqueados en forma deliberada por medio de una inyección de un material embólico dentro de los vasos. Se han ensayado una variedad de materiales en este sentido, incluidas sustancias autólogas tales como grasa, coágulos sanguíneos, y fragmentos cortados de músculo, así como materiales artificiales tales como lana, algodón, bolas de acero, cuentas plásticas o de vidrio, polvo de tantalio, compuestos de silicona, partículas radioactivas, esponja estéril de gelatina absorbible (Sterispon, Gelfoam), celulosa oxidada (Oxycel), espirales de acero, alcohol, duramadre humana liofilizada (Lyodura), colágeno microfibrilar (Avitene), fibrillas de colágeno (Tachotop), esponja de polivinil alcohol (PVA; Ivalon), esferas de silicio impregnadas con bario (Biss) y globos desechables. El tamaño de la metástasis tumoral puede ser reducido temporalmente utilizando tales métodos, pero los tumores típicamente responden causando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos dentro del tumor.
Un problema relacionado con la formación de un tumor canceroso es el desarrollo de obstrucciones cancerosas que inhiben el flujo de material a través de pasajes corporales, tales como los ductos biliares, tráquea, esófago, vasculatura y uretra. Un dispositivo, la cánula intraluminal, ha sido desarrollado con el propósito de mantener abiertos los pasajes corporales que han sido bloqueados por tumores u otras sustancias. Los ejemplos representativos de cánulas intraluminales comunes incluyen a la Wallstent, a la cánula intraluminal de Strecker, a la cánula intraluminal de Gianturco, y a la cánula intraluminal de Palmaz. El principal problema con las cánulas intraluminales, sin embargo, es que ellas no evitan el crecimiento hacia adentro del tumor o del material inflamatorio a través de los intersticios de la cánula intraluminal. Si este material alcanza la parte interior de una cánula intraluminal y compromete al lumen de la cánula intraluminal, puede resultar en el bloqueo del pasaje corporal dentro del cual ha sido insertado. Además, la presencia de una cánula intraluminal en el organismo puede inducir un tejido reactivo o inflamatorio (por ejemplo, vasos sanguíneos, fibroblastos, glóbulos blancos) para ingresar el tureen de la cánula intraluminal, resultando en el cierre parcial o completo de la misma.
2.2 Embolización Terapéutica o Activa
La administración de una droga citotóxica en la proximidad de un tumor incrementa la proporción de suministro de tejido tumoral con respecto al normal. Tal administración regional se puede lograr suministrando drogas directamente en el tumor a través de su suministro de sangre o dentro de la cavidad corporal donde se localiza el tumor en particular. La perfusión regional de la droga tiene la ventaja de incrementar las concentraciones pico de la droga en el tejido objetivo, pero la exposición se limita al primer paso de sangre a través del órgano que está recibiendo la perfusión. La porción de la droga no recibida por el paso inicial circula sistémicamente y es luego recibida por los tejidos normales.
Las oclusiones vasculares terapéuticas (embolizaciones) son técnicas utilizadas para tratar ciertas condiciones patológicas in situ. Ellas se practican generalmente por medio de catéteres que las hacen posibles, bajo control de imágenes, para posicionar a los agentes de oclusión en forma de partículas (embolitos) en el sistema circulatorio. Ellas pueden también afectar también a los vasos de diferentes procesos: tumores, malformaciones vasculares, procesos hemorrágicos, etc. Notablemente, en el caso de tumores, una oclusión vascular puede suprimir el dolor, limitar la perdida de sangre en la intervención quirúrgica que sigue a la embolización o inclusive ocasionar una necrosis tumoral y evitar la operación. En el caso de malformaciones vasculares, permite el flujo de sangre hacia los tejidos normales para que se normalicen, ayuda en cirugía y limita el riesgo de hemorragia. En procesos hemorrágicos, una oclusión vascular produce una reducción de flujo, lo cual promueve la cicatrización de la(s) abertura(s) arterial(es).
Además, dependiendo de las condiciones patológicas tratadas, la embolización se puede llevar a cabo para objetivos tanto temporales como permanentes.
Se conocen diferentes tipos de embolitos en el estado del arte. En particular, pueden estar involucrados agentes líquidos (pegamentos acrílicos, geles, suspensiones viscosas, etc.) o agentes en forma de partículas (polímeros misceláneos, duramadre, esponjas de gelatina, esferas, balones, espirales, etc.). Las principales desventajas de los embolitos líquidos residen en su toxicidad para los tejidos, que pueden generar fenómenos de necrosis, y el riesgo de atascamiento de los catéteres. Otra limitación de los embolitos líquidos es que ellos actúan únicamente en una forma pasiva y no pueden ser utilizados para el suministro de droga.
Las funciones duales de la distribución regional de drogas y la minimización de la pérdida a partir del sitio objetivo se pueden lograr con microesferas. Cuando se introducen a través de una arteria regional, tales microesferas son atrapadas dentro de la vasculatura de los tejidos, donde ellas liberan su carga de droga. Tal acción dual es denominada como embolización activa. Las microesferas pueden ser ya sea de composición sólida o porosa, y pueden ser elaboradas para contener moléculas dispersadas de droga ya sea en forma sólida o de solución (Zimmer y Kreuter, 1995). Las microesferas tienen aplicación especial en el tratamiento de tumores localizados dentro de órganos abastecidos por un suministro único de sangre arterial aferente, por ejemplo, el hígado (Chen y colaboradores, 1994). Ellas son muy valiosas en los casos donde el tumor en el órgano objetivo es la única región que requiere terapia. WO 99/34829 divulga el uso de partículas valon® o gelfoam® que contienen un tensoactivo para embolización.
Aun cuando se conocen estudios relacionados con el uso de microesferas para terapia de embolización con base en drogas, se han llevado a cabo relativamente pocos estudios con microesferas para uso en terapia génica. Por ejemplo, se utilizan comúnmente cuentas de vidrio en la extracción selectiva de ADN de mezclas heterogéneas a través de atracción electrostática. Si bien se han utilizado también hidroxiapatitas para purificación de ácidos nucleicos (Kumazawa y colaboradores, 1992) y se han utilizado esferas de hidroxiapatita para liberación sostenida de doxorubicina por medio de implantación directa en tumores hepáticos a través de una guía ultrasónica (Kunieda y colaboradores, 1993), otros estudios revelan que esta matriz particular puede en realidad ser inadecuada para exposición a tejidos de mamífero (Dass y colaboradores, 1997a, 1997b). También se ha retenido ADN sobre microesferas de PDB con grupos funcionales de dietilaminoetilo (DEAE) en la superficie (Katz y colaboradores, 1990; Maa y colaboradores, 1990).
De este modo, existe una necesidad demostrada por el desarrollo adicional de microesferas para inserción génica. La principal ventaja deseada es la habilidad para dirigir específicamente el agente anticanceroso a la vasculatura del tumor a través del torrente sanguíneo. Además, la obstrucción del suministro de sangre al tumor, con la ruptura simultanea del suministro de nutrientes y la remoción de desechos, es quizás el resultado más deseado para la destrucción de las células tumorales.
3. Resumen de la invención
La presente invención provee el uso de una microesfera sustancialmente esférica adecuada para embolización activa en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que depende de la angiogénesis por medio de la embolización, en donde la microesfera comprende:
(a)
un polímero biocompatible e hidrofílico que contiene acrilamida o acrilato, o un polímero acrílico y
(b)
una droga y/o una vacuna.
y en donde el diámetro de la microesfera está en el rango de 10 \mum a 2000 \mum.
La invención también provee una microesfera esférica adecuada para embolización activa que comprende:
(a)
un polímero que contiene acrilamida o acrilato, o un polímero acrílico; y
(b)
una droga y/o una vacuna, en donde la droga se selecciona del grupo que consiste de drogas antineoplásicas, de drogas de antiangiogénesis, drogas antimicóticas, drogas antivirales, y combinaciones de las mismas;
en donde el diámetro de la microesfera está en el rango de 10 a 2000, o aproximadamente desde 50 \mum hasta aproximadamente 300 \mum, o aproximadamente desde 40 hasta aproximadamente 400 \mum, o aproximadamente desde 50 hasta aproximadamente 200 \mum, o aproximadamente desde 70 hasta aproximadamente 120 \mum.
En una modalidad, la invención provee composiciones y métodos para el suministro de drogas, vacunas, polinucleótidos, y agentes de diagnóstico o para representación óptica a un mamífero, utilizando una amplia variedad de materiales poliméricos como portadores para los agentes anteriormente mencionados. En una modalidad preferida, la invención provee micropartículas para el suministro de estos agentes, particularmente, microesferas. En una modalidad más preferida, la invención provee micropartículas para el suministro de polinucleótidos utilizando un agente de transfección.
Más específicamente, en la modalidad preferida, el material portador polimérico para uso en la presente invención incluye a cualquier partícula que sea capaz de "portar" o estar asociada con un factor terapéutico bioactivo y un agente de transfección de la presente invención. El material polimérico preferido se basa en polímeros sustancialmente esféricos, sustancialmente hidrofílicos, inertes, iónicos y entrelazados de un tamaño suficiente para embolizar y liberar al factor terapéutico bioactivo. En una modalidad preferida, el factor terapéutico bioactivo está físicamente enlazado al agente de transfección, que está también enlazado a la micropartícula.
En una modalidad, la presente invención provee composiciones terapéuticas bioactivas, así como métodos y dispositivos que utilizan tales composiciones para el tratamiento del cáncer y de varias otras enfermedades que dependen de angiogénesis incluidos los trastornos pancreáticos. En un aspecto de la presente invención, se proveen composiciones que contienen (a) un factor terapéutico bioactivo, (b) un portador de material polimérico, y (c) un agente de transfección.
En otro aspecto preferido de la presente invención, se proveen composiciones que contienen (a) un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, (b) un portador de material polimérico, y (c) un agente de transfección.
En otro aspecto preferido de la invención, se proveen composiciones que contienen (a) un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, (b) un portador de material polimérico, y (c) un agente de transfección de lipoliamina.
Se pueden utilizar una amplia variedad de moléculas dentro del alcance de la presente invención como factores terapéuticos bioactivos, incluyendo, por ejemplo, sin limitación, factores antiangiogénicos, agentes antineoplásicos, péptidos y análogos de péptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, vacunas, enzimas, ácidos nucleicos, ARN y ADN, ya sea de origen natural como sintético, incluidos ARN y ADN recombinantes y ARN y ADN antisentido; ARN cabeza de martillo, ribozimas, ácidos nucleicos antigénicos, ARN y ADN tanto monocatenarios como bicatenarios y análogos de los mismos.
Los materiales poliméricos de la presente invención contienen polímeros acrílicos, polímeros de acrilato, poliacrilamidas. Más preferiblemente, los materiales poliméricos son copolímeros entrelazados sustancialmente hidrofílicos de la familia de los acrílicos tal como las poliacrilamidas y sus derivados, poliacrilatos y sus derivados. Todos estos polímeros están entrelazados para ser estables y no reabsorbibles.
Dentro de las diferentes modalidades de la presente invención divulgadas aquí, el factor terapéutico bioactivo está físicamente asociado con el agente de transfección y el complejo factor terapéutico bioactivo- agente de transfección está físicamente asociado con el portador polimérico. El factor terapéutico bioactivo se adsorbe preferiblemente por medio de fuerzas de asociación que son bien conocidas en cromatografía líquida de adsorción incluidas fuerzas de asociación tales como, sin limitación, intercambio iónico, hidrofobicidad, reconocimiento molecular o combinaciones de las mismas. En una modalidad preferida el factor terapéutico bioactivo se asocia con el agente de transfección para formar un complejo antes de mezclar o poner el contacto el portador polimérico de la presente invención.
En un aspecto de la presente invención, el factor terapéutico bioactivo seleccionado se mezcla con el agente de transfección para formar un complejo entre el factor terapéutico bioactivo y el agente de transfección que imparte propiedades específicas al complejo, tales como una mayor hidrofobicidad.
El otro aspecto de la invención, el portador de material polimérico se mezcla junto con una cantidad suficiente de un factor terapéutico bioactivo transfectable. La asociación física entre el factor terapéutico bioactivo y el portador de material polimérico es el resultado de asociaciones hidrófobas y iónicas que se pueden mejorar por medio de la adición de sales tales como, por ejemplo, sin limitación, cloruro de sodio o un medio de contraste tal como las sales que contienen bario o ioduro.
Dentro de las diferentes modalidades divulgadas aquí de la presente invención, una vez suministrados en el sitio apropiado, los complejos de factor terapéutico bioactivo-agente de transfección adsorbidos sobre la superficie del material embólico son progresivamente desorbidos y suministrados dentro de las células que se encuentra a su alrededor por medio de una variedad de mecanismos que incluyen, por ejemplo, sin limitación, endocitosis espontánea, endocitosis medida por el receptor, endosomólisis, y desestabilización de la membrana celular o combinación de los mismos. La desorción de factor terapéutico bioactivo es inducida por los componentes naturales de los líquidos biológicos que sirven para debilitar la fuerza de la adsorción entre el material embólico y el factor terapéutico bioactivo hasta lograr la desorción total de este último. La desorción del factor terapéutico bioactivo puede ser modulada también por medio del uso de enlaces que son hidrolizables in vivo, incluidos, sin limitación, los enlaces éster o los osídicos. El otras modalidades diferentes la desorción del factor terapéutico bioactivo puede ser modulada también por medio del uso de péptidos en asocio con el factor terapéutico bioactivo en donde el enlace del péptido puede ser escindido con enzimas celulares proteolíticas.
En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para embolizar un vaso sanguíneo, que comprenden administrar al vaso sanguíneo de un paciente que requiera del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor terapéutico bioactivo, de tal manera que el vaso sanguíneo sea efectivamente ocluido. En una modalidad, el factor terapéuticamente efectivo es suministrado en forma simultánea o secuencial al vaso sanguíneo que nutre a un tumor.
En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para embolizar vasos sanguíneos en enfermedades tumorigénicas que dependen de angiogénesis, que comprenden la administración a un paciente que requiera del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, en donde el polinucleótido se asocia con un agente de transfección, y el donde dicho agente de transfección del polinucleótido se asocia además con un portador de material polimérico, de tal manera que el vaso sanguíneo sea efectivamente ocluido.
El otro aspecto más preferido de la presente invención, se proveen métodos para la embolización de vasos sanguíneos en enfermedades tumorigénicas que dependen de angiogénesis, que comprenden la administración a un paciente que requiera del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, en donde el polinucleótido se asocia con un agente de transfección de lipopoliamina, en donde dicho agente de transfección asociado a un polinucleótido se asocia además con una microesfera sustancialmente hidrofílica, de tal manera que el vaso sanguíneo sea efectivamente ocluido.
En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para embolización de vasos sanguíneos en enfermedades tumorigénicas que dependen de angiogénesis, que comprenden la administración a un paciente que requiera del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un vector viral o una partícula de tipo viral que contienen un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, en donde el vector viral o una partícula de tipo viral se asocia con un agente de transfección, y en donde dicho agente de transfección asociado con el vector viral está asociado además con una microesfera sustancialmente hidrofílica, de tal manera que el vaso sanguíneo sea efectivamente ocluido.
En otro aspecto más preferido de la presente invención, se proveen métodos para embolización de vasos sanguíneos en enfermedades tumorigénicas que dependen de angiogénesis, que comprenden la administración a un paciente que requiera del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un vector viral o una partícula de tipo viral que contienen un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, en donde el vector viral o una partícula de tipo viral se asocia con un agente de transfección de lipoliamina, y en donde dicho agente de transfección asociado con el vector viral está asociado además con una microesfera sustancialmente hidrofílica, de tal manera que el vaso sanguíneo sea efectivamente ocluido.
En aún otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para inhibir la angiogénesis en pacientes con enfermedades no tumorigénicas, que dependen de angiogénesis, que comprenden la administración a un paciente que lo necesite con una enfermedad no tumorigénica que depende de la angiogénesis de una cantidad terapéuticamente efectiva de una droga junto con un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, en donde dicho polinucleótido se asocia con un agente de transfección, y en donde dicho agente de transfección asociado con un polinucleótido se asocia además con un portador de material polimérico de tal manera que se inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos. En otro aspecto de la presente invención, se puede incorporar a dicha droga dentro del portador de material polimérico para que no interfiera con la transferencia del factor terapéutico bioactivo que está siendo administrado simultáneamente.
En aún otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para tratar pacientes con enfermedades no tumorigénicas, que no dependen de angiogénesis, que comprenden la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad terapéuticamente efectiva de una droga junto con un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo asociado con un agente de transfección, en donde dicha droga está contenida dentro del portador de material polimérico para no interferir con la transferencia del factor terapéutico bioactivo asociado con el portador de material polimérico que está siendo simultáneamente administrado, para mejorar los síntomas del enfermedad no tumorigénica, que no depende de la angiogénesis.
En otras modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención contienen (a) un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, (b) un portador de material polimérico, y (c) un agente de transfección de lipopoliamina junto con un metal liviano de transición del grupo d (por ejemplo, una especie de vanadio, una especie de molibdeno, una especie de tungsteno, una especie de titanio, una especie de niobio o una especie de tantalio) que inhibe la formación de nuevos vasos sanguíneos.
En otras modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención contienen (a) un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, (b) una micropartícula catiónica entrelazada, y (c) un agente de transfección de lipopoliamina junto con un agente mejorador de la transfección.
En otra modalidad preferida, se provee un método para suministro a un huésped mamífero de un polinucleótido que comprende la administración a un mamífero que tiene una enfermedad de un material polimérico sustancialmente hidrofílico asociado con un polinucleótido y un agente de transfección. Se proveen modalidades del último método en donde la administración de dicho material polimérico sustancialmente hidrofílico asociado con un polinucleótido y un agente de transfección para terapia génica, en donde la microesfera de material polimérico es de un tamaño suficiente para embolizar los vasos en el sitio de la administración, y en donde el material polimérico no es del tamaño suficiente para embolizar los vasos en el sitio de la administración pero es suficiente para anclarse en el tumor.
En otra modalidad preferida, se provee un método para embolización activa en un huésped mamífero que comprende la administración a un mamífero que tiene una enfermedad que depende de la angiogénesis, un material polimérico sustancialmente hidrofílico asociado con un factor terapéutico bioactivo capaz de expresión de un material antiangiogénico, en donde dicho factor terapéutico bioactivo está asociado con un agente de transfección.
En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para tratar los sitios de extirpación del tumor, que comprenden la administración de un factor terapéutico bioactivo portador de material polimérico asociado con una composición de un agente de transfección como se describió anteriormente a los márgenes de resección de un tumor posterior a la extirpación, de tal manera que se inhibe la recurrencia local de cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio.
En otros aspectos, se proveen métodos para embolización de vasos sanguíneos en enfermedades no tumorigénicas que dependen de angiogénesis, que comprenden el suministro al vaso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene una droga junto con un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, de tal manera que el vaso sanguíneo es efectivamente ocluido.
En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para embolización de vasos sanguíneos en enfermedades tumorigénicas que dependen de angiogénesis, que comprenden el suministro al vaso de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene una droga junto con un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, de tal manera que el vaso sanguíneo es efectivamente ocluido y el polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo se inserta en la célula para expresión.
En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para embolización activa en un huésped mamífero que comprende la administración a un mamífero que tiene una enfermedad de un material polimérico sustancialmente hidrofílico asociado con un factor terapéutico bioactivo, en donde dicho factor terapéutico bioactivo está asociado con un agente de transfección.
En otro aspecto de la presente invención, se provee una micropartícula que es adecuada para embolización activa la cual comprende un material polimérico capaz de embolizar a un vaso sanguíneo, en donde dicho material polimérico está enlazado a un agente de transfección que está enlazado a un material genético.
En otros aspectos, se proveen métodos para tratar enfermedades neovasculares de un órgano incluyendo, por ejemplo, sin limitación, al ojo, que comprende la administración a un paciente que requiera del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor terapéutico bioactivo al ojo, por ejemplo, de tal manera que se inhiba la formación de nuevos vasos sanguíneos.
La presente invención provee composiciones y métodos adecuados para tratar cánceres, así como otras enfermedades no tumorigénicas que dependen de angiogénesis, y además provee otras ventajas relacionadas. Tales cánceres incluyen, sin limitación, cáncer de hígado, de ovario, de riñón, pancreático, de próstata, de piel, tumores de cabeza y de cuello, tumores de mama, y sarcoma de Kaposi, y formas superficiales de cáncer de vejiga. Además de cáncer, sin embargo, también se pueden tratar numerosas otras enfermedades no tumorigénicas que dependen de angiogénesis, que se caracterizan por el crecimiento anormal de vasos sanguíneos, con los factores terapéuticos bioactivos o composiciones de la presente invención. Los ejemplos representativos de tales enfermedades no tumorigénicas que dependen de angiogénesis incluyen, sin limitación, cicatrices hipertróficas y queloides, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide, malformaciones arteriovenosas, placas ateroscleróticas, sanación demorada de heridas, articulaciones hemofílicas, fracturas que no sueldan, síndrome de Oiser-Weber, soriasis, granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, menorragia y adhesiones vasculares.
En otra modalidad de la invención se proveen kits para llevar a cabo la terapia génica de embolización que comprenden: (a) una suspensión de microesferas adecuadas para embolización; y (b) un agente de transfección adecuados para inserción de material genético a una célula. En otra modalidad adicional de la invención, se proveen kits en donde el material polimérico está contenido dentro de un vial y el agente de transfección asociado con un polinucleótido que codifica al factor terapéutico bioactivo está contenido dentro de otro vial, y en donde los contenidos de ambos viales se mezclan juntos para formar la composición farmacéutica. En otra modalidad adicional de la invención, se proveen kits en donde el material polimérico está contenido dentro de un vial, el agente de transfección está contenido dentro de otro vial separado, y el polinucleótido que codifica al factor terapéutico bioactivo está contenido dentro de otro vial separado, en donde los contenidos de los tres viales se mezclan juntos para formar la composición farmacéutica. En otra modalidad adicional de la invención, se proveen kits en donde los componentes de (a) una suspensión de microesferas adecuada para embolización; y (b) un agente de transfección adecuado para inserción de material genético en una célula, están en un vial.
Éstos y otros aspectos de la presente invención se harán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos anexos. Además, se exponen diferentes referencias más abajo que se incorporan aquí como referencia en su totalidad.
4. Descripción detallada de la invención Definiciones
Como se lo utiliza aquí, "sustancialmente esférica" generalmente significa una forma que es cercana a una esfera perfecta, que se define como un volumen que presenta el área superficial externa más pequeña. Específicamente, "sustancialmente esférica" en la presente invención significa, cuando se observa cualquier sección transversal de la partícula, que la diferencia entre el diámetro promedio mayor y el diámetro promedio menor es menor al 20%. Las superficies de las microesferas de la presente invención aparecen lisas bajo una magnificación de hasta 1000 veces. Las microesferas de la presente invención pueden comprender, además de las partículas, de otros materiales como se describe y se define aquí.
Como se lo utiliza aquí, "promotor de adhesión celular" en la presente invención significa cualquier material que, debido a su presencia en, o en asociación con las microesferas, promueve o mejora la adhesividad de las células a la superficie de las microesferas. Estos materiales son a menudo proteínas que están asociadas con la superficie de las microesferas a través de enlaces covalentes o en una forma polimérica penetrada en su interior.
Como se lo utiliza aquí, "agente terapéutico" en la presente invención se refiere a cualquier sustancia que provee efectos terapéuticos para los procesos de enfermedades que dependen de angiogénesis o respuestas biológicas o fisiológicas a las enfermedades que dependen de angiogénesis. Un ejemplo de un agente terapéutico es un agente antiinflamatorio que previene o reduce el efecto de inflamaciones asociadas con enfermedades que dependen de angiogénesis.
Como se lo utiliza aquí, "modificación química" en la presente invención significa los cambios de propiedades químicas y de características de las microesferas, ya sea durante su proceso de producción o por medio de mezcla o contacto de las mismas con diferentes agentes o tejidos, de tal manera que las microesferas tengan la habilidad de realizar, además de la embolización del tumor, otras funciones una vez inyectadas dentro del organismo.
Como se lo utiliza aquí, "material de estabilización" o "compuesto de estabilización" se refiere a cualquier material que sea capaz de mejorar la estabilidad de las composiciones, prodrogas, ligandos objetivo y/o otros factores terapéuticos bioactivos descritos aquí, incluyendo, por ejemplo, mezclas, suspensiones, emulsiones, dispersiones, vesículas, o similares. Abarcados dentro de la definición de "material de estabilización" se encuentran algunos de los factores terapéuticos bioactivos presentes y prodrogas. También están abarcados dentro de la definición de "material de estabilización" ciertos de los presentes agentes de transfección. La estabilidad mejorada involucra, por ejemplo, el mantenimiento de una condición relativamente balanceada, y que puede ser ejemplificada, por ejemplo, por medio de una mayor resistencia de la composición contra la destrucción, descomposición, degradación, y similares. Por ejemplo, una cabeza catiónica que pende en un agente de transfección reduce la eficiencia de la transfección, como se observa con compuestos tales como C_{12}GluPhC_{n}N^{+} mientras que compuestos tales como DOTB/DOSC que tienen los espaciadores más cortos conducen a la densidad de carga superficial más alta y a la mejor eficiencia de transfección.
En el caso de las modalidades preferidas que involucran microesferas con factores terapéuticos bioactivos, prodrogas y/o otros agentes bioactivos, los compuestos de estabilización pueden servir ya sea para formar las microesferas o para estabilizar las microesferas, en cualquier forma que sirva para minimizar o prevenir sustancialmente (inclusive completamente) la liberación de ciertos factores terapéuticos bioactivos, prodrogas y/o agentes bioactivos de las microesferas hasta el grado en que se desee dicha liberación. El término "sustancialmente", como se lo utiliza en el presente contexto de prevenir la liberación de factores terapéuticos bioactivos, prodrogas y/o agentes bioactivos de las microesferas, significa que aproximadamente por encima del 50% se mantiene asociado sobre la superficie o contenido dentro de las microesferas hasta la liberación deseada, y preferiblemente aproximadamente por encima del 60%, más preferiblemente aproximadamente por encima del 70%, aún más preferiblemente aproximadamente por encima del 80%, aún todavía más preferiblemente aproximadamente por encima del 90%, se mantiene asociado sobre la superficie o alternativamente, en el caso de formulaciones de droga terapéutica, contenidas dentro de las microesferas hasta la liberación deseada. En modalidades particularmente preferidas, aproximadamente por encima del 95% de los factores terapéuticos bioactivos, prodrogas y/o agentes bioactivos se mantiene asociados sobre la superficie o alternativamente, en el caso de formulaciones de droga terapéutica, contenidos dentro de las microesferas hasta la liberación deseada. Los factores terapéuticos bioactivos, prodrogas y/o agentes bioactivos se pueden mantener también completamente asociados sobre la superficie o contenidos dentro de las microesferas (esto es, aproximadamente 100% se mantiene asociado sobre la superficie o contenido dentro de las microesferas), hasta la liberación deseada.
Los ejemplos de materiales de estabilización incluyen, por ejemplo, lípidos, proteínas, polímeros, carbohidratos y tensoactivos. La mezcla resultante, suspensión, emulsión o similar puede comprender paredes (esto es, películas, membranas y similares) alrededor del factor terapéutico bioactivo, o agente bioactivo, o puede estar sustancialmente libre de paredes o de membranas, si se desea. El material de estabilización puede, si se desea, formar gotitas. El material de estabilización puede comprender también sales y/o azúcares. En ciertas modalidades, los materiales de estabilización pueden estar sustancialmente (incluido completamente) entrelazado. El material de estabilización puede tener carga neutra, positiva o negativa.
Como se lo utiliza aquí, "entrelazar" o "entrelazado" y "entrelazamiento" generalmente se refieren al enlazamiento de dos o más materiales de estabilización, incluidos los materiales de estabilización de lípidos, proteínas, polímeros, carbohidratos, tensoactivos, al factor terapéutico bioactivo y/o a los agentes bioactivos, por medio de uno o más puentes. Los puentes pueden estar compuestos de uno o más elementos, grupos, o compuestos, y generalmente sirven para unir un átomo de una primera molécula del material de estabilización a un átomo de una segunda molécula del material de estabilización. Los puentes de entrelazamiento pueden involucrar asociaciones covalentes y/o no covalentes. Cualquiera entre una variedad de elementos, grupos, y/o compuestos puede formar los puentes en los entrelazamientos, y los materiales de estabilización pueden ser entrelazados en forma natural o a través de un medio sintético. Por ejemplo, el entrelazamiento puede ocurrir en la naturaleza en un material formulado a partir de cadenas de péptidos que están unidos por medio de enlaces disulfuro de residuos de cisteína, como en las queratinas, insulinas y otras proteínas. Alternativamente, el entrelazamiento se puede efectuar por medio de modificaciones químicas adecuadas, tales como, por ejemplo, por medio de la combinación de un compuesto, tal como un material de estabilización, y una sustancia química que puede servir como agente de entrelazamiento, que puede provocar que reaccione, por ejemplo, por exposición al calor, radiación de alta energía, y similares. Los ejemplos incluyen entrelazamiento por medio de azufre para formar enlaces disulfuro, entrelazamiento utilizando peróxidos orgánicos, entrelazamiento de materiales insaturados por medio de radiación de alta energía, entrelazamiento con dimetiolol carbamato, y similares. Si se desea, se pueden entrelazar sustancialmente, los compuestos de estabilización, el factor terapéutico bioactivo y/o los agentes bioactivos.
Como se lo utiliza aquí, el término "sustancialmente" significa que aproximadamente más de 50% de los compuestos de estabilización contienen puentes de entrelazamiento. Si se desea, aproximadamente más del 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o aún 100% de los compuestos de estabilización contienen tales puentes de entrelazamiento. Alternativamente, Los materiales de estabilización pueden estar no entrelazados, esto es, de tal manera que aproximadamente más del 50% de los compuestos de estabilización están libres de puentes de entrelazamiento, y si se desea, aproximadamente por encima del 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o aún 100% de los compuestos de estabilización están libres de puentes de entrelazamiento.
Como se lo utiliza aquí, "asociado" se refiere a una unión entre el agente terapéutico bioactivo, el agente de transfección, y la microesfera de la invención. Tal asociación, en el caso del agente terapéutico bioactivo y del agente de transfección puede o no resultar en la formación de un complejo. Tal asociación puede incluir, sin limitación, a aquellas asociaciones que son covalentes, no covalentes, así como interacciones iónicas, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofílicas, e interacciones hidrófobas, cada una de las cuales es definida adicionalmente aquí más abajo.
Como se lo utiliza aquí, "asociación covalente" se refiere a una asociación intermolecular o enlace que involucra la compartición de electrones en los orbitales de enlazamiento de dos átomos.
Como se lo utiliza aquí, "asociación no covalente" se refiere a la interacción intermolecular entre dos o más moléculas separadas que no involucran un enlace covalente. La interacción molecular depende de una variedad de factores, que incluyen, por ejemplo, la polaridad de las moléculas involucradas, y la carga (positiva o negativa), si hay alguna, de las moléculas involucradas. Las asociaciones no covalentes se seleccionan de interacciones iónicas, interacciones dipolo-dipolo, fuerzas de Van der Waals, y combinaciones de los mismos.
Como se lo utiliza aquí, "interacción iónica" o "interacción electrostática" se refiere a una interacción intermolecular entre dos o más moléculas, cada una de las cuales está cargada en forma positiva o negativa. Así, por ejemplo, "interacción iónica" o "interacción electrostática" se refiere a la atracción entre una primera molécula cargada positivamente, y una segunda molécula cargada negativamente. Las interacciones iónicas o electrostáticas incluyen, por ejemplo, la atracción entre un material de estabilización cargado negativamente, por ejemplo, material genético, y un lípido cargado positivamente, por ejemplo, un lípido catiónico, tal como el bromuro de lauriltrimetilamonio.
Como se lo utiliza aquí, "fuerzas de Van der Waals" se refieren a las fuerzas atractivas entre moléculas no polares explicadas por la mecánica cuántica. Las fuerzas de Van der Waals se asocian generalmente con momentos de dipolo momentáneos que son inducidos por moléculas vecinas y que involucran cambios en la distribución electrónica.
Como se lo utiliza aquí, "enlace de hidrógeno" se refiere a una fuerza de atracción, o puente, que puede presentarse entre un átomo de hidrógeno que está enlazado en forma covalente a un átomo electronegativo, por ejemplo, oxígeno, azufre, o nitrógeno, y otros átomos electronegativos. El enlace de hidrógeno puede presentarse entre un átomo de hidrógeno en una primera molécula y un átomo electronegativo en una segunda molécula (enlace intermolecular de hidrógeno). También, el enlace de hidrógeno puede presentarse entre un átomo de hidrógeno y un átomo electronegativo ambos contenidos en una única molécula (enlace intramolecular de hidrógeno).
Como se lo utiliza aquí, "interacción hidrofílica" se refiere a moléculas o porciones de moléculas que pueden enlazarse sustancialmente con, ser absorbidas y/o disolverse en agua. Esto puede resultar en el hinchamiento y/o en la formación de geles reversibles.
Como se lo utiliza aquí, "interacción hidrófoba" se refiere a moléculas o porciones de moléculas que no se enlazan sustancialmente con, se absorben y/o se disuelven en agua.
Para claridad de la divulgación, y como una limitación, la descripción detallada de la presente invención se divide en las subsecciones que vienen a continuación.
La presente invención provee métodos efectivos y seguros de terapia génica de embolización, cuyos métodos son útiles para el tratamiento del cáncer y de varias otras enfermedades que dependen de angiogénesis. Tales métodos de terapia génica de embolización, son benéficos por lo tanto para médicos y/o cirujanos incluyendo, sin limitación, a radiólogos intervencionistas. Los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser utilizados por cirujanos ya sea antes, durante o después de la cirugía.
En resumen, en la terapia génica, los genes son insertados en las células de los pacientes como moléculas de ADN o de ARN. Los genes forman parte de los casetes para construcción de la expresión de los ácidos nucleicos que incluyen al gen de interés y a un elemento promotor/reforzador que dirige la expresión de alto nivel del gen dentro de las células objetivo. El ADN es transcrito por las enzimas dentro de la célula en una molécula mensajera de ARN, que forma el molde para traducción de la secuencia génica en la proteína producto. Esta proteína suministra luego una función dentro de la célula objetivo o tejido del medio ambiente ya sea para corregir un defecto celular o para matar células tales como las células tumorales.
Por lo tanto, el gen y la terapia celular consisten en la corrección de una deficiencia o de una anormalidad (mutación, expresión aberrante y similares) o en una forma para garantizar la expresión de una proteína de interés terapéutico por medio de la introducción de una información genética en la célula o el órgano afectado. Esta información genética se puede introducir ya sea in vitro dentro de una célula extraída del órgano, siendo luego reintroducida la célula modificada en el organismo, o directamente in vivo en el tejido apropiado. Se han descrito diferentes técnicas para la transferencia de esta información genética, entre las cuales están diferentes técnicas de transfección que involucran complejos de ADN y DEAE-dextrano (Pagano y colaboradores, J. Virol. 1 (1967) 891), de ADN y de proteínas nucleares (Kaneda y colaboradores, Science 243 (1989) 375), de ADN y de lípidos (Felgner y colaboradores, PNAS 84 (1987) 7413), de ADN y de polilisina, el uso de liposomas (Fraley y colaboradores, J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) y similares.
La embolización es una oclusión parcial o total de los vasos donde fluye la sangre. La embolización terapéutica es un procedimiento que permite ocluir arterias o venas ya sea para corregir una disfunción tal como una formación arterial-venosa o para detener el flujo de sangre con el propósito de detener el suministro del elemento esencial a un tumor sólido/cáncer en crecimiento. Más generalmente la embolización terapéutica es una operación "pasiva" en el sentido de que no se transportan y/o suministran moléculas activas donde se deposite el material embólico.
La presente invención está dirigida a una embolización "activa" que asocia la reducción del flujo de sangre con el suministro localizado de un material genético transfectable los cuales actúan con el mismo objetivo, la reducción o la eliminación de las células cancerosas.
En un aspecto de la presente invención, se proveen composiciones que contienen (a) un factor terapéutico bioactivo, (b) una microesfera portadora, y (c) un agente de transfección. En una modalidad preferida, la invención provee métodos de terapia génica por medio de la administración de una composición inyectable que contiene (a) un factor terapéutico bioactivo, (b) una microesfera portadora, y (c) un agente de transfección a un mamífero que necesite del tratamiento para el cáncer y para diferentes otras enfermedades que dependen de angiogénesis.
En otra modalidad preferida, la invención provee métodos de terapia génica por medio de la administración de una composición inyectable que contiene (a) un factor terapéutico bioactivo, (b) una microesfera portadora, y (c) un agente de transfección a un mamífero que necesite del tratamiento para el cáncer y para diferentes otras enfermedades que dependen de angiogénesis, en donde dicha composición inyectable se administra directamente dentro del tumor o tejido enfermo a través de una aguja de calibre adecuado.
En aún otra modalidad preferida, la invención provee métodos de terapia génica por medio de la administración de una composición inyectable que contiene (a) un factor terapéutico bioactivo, (b) una microesfera portadora, y (c) un agente de transfección a un mamífero que necesite del tratamiento para el cáncer y para diferentes otras enfermedades que dependen de angiogénesis, en donde dicha composición inyectable se suministra al tumor o tejido enfermo por medio de una inyección en el sistema vascular.
En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para tratar un sitio de extirpación de un tumor, que comprende la administración de una composición que contiene una droga antineoplásica tal como por ejemplo, sin limitación, taxol, doxorubicina, cisplatina, paclitaxel, al margen de resección de un tumor posteriormente a la extirpación, de tal manera que se inhiba la recurrencia local del cáncer y la formación de nuevos vasos sanguíneos en el sitio.
Los portadores poliméricos o preferiblemente las microesferas de la presente invención también se pueden modificar químicamente para contener así efectos terapéuticos, efectos de vascularización, efectos de antivascularización, propiedades de visualización, o combinaciones de los mismos. En una modalidad, la modificación química de las microesferas de la presente invención se hace posible por el hecho de que las microesferas comprenden partículas elaboradas a partir de polímeros que están entrecruzados para que puedan contener sustancias químicas dentro de sus estructuras que poseen diferentes propiedades y que poseen características únicas asociadas con enlaces covalentes superficiales. La modificación química de las microesferas de la presente invención puede ocurrir también a través de las interacciones entre las microesferas y las células vecinas y el tejido después de la administración.
Los métodos de la presente invención tienen las siguientes ventajas: (1) los materiales inyectados no se desplazan fácilmente dentro de los tejidos en los cuales fueron originalmente inyectados, de modo que la pretendida terapia génica se logra sin una administración repetida o causa efectos adversos al paciente, (2) los materiales inyectados no son fácilmente digeridos, desplazados, o eliminados ya sea biológicamente o a través del sistema inmunológico o linfático, por lo cual el método es más efectivo y más duradero, (3) los materiales son de tamaño suficiente para ser inyectados a través de agujas de calibre 18 a 26 o calibre 30 o agujas más pequeñas, por lo cual el método es más preciso, eficiente y menos intrusivo para el paciente, (4) las partículas inyectadas son flexibles, pero no frágiles, facilitando la inyección fácil sin romperse, proveyendo así la inyección fácil y segura, y (5) las partículas inyectadas no son moldeadas en forma irregular y no se aglutinan, proveyendo también una inyección fácil y precisa. Estos beneficios, ya sean solos o en combinación, mejoran la afectividad del tratamiento y son seguros, más convenientes y confortables para los pacientes.
4.1 Material Polimérico 4.1.1 Micropartículas
Para el suministro de los polinucleótidos o de otros materiales genéticos de la presente invención, se puede utilizar cualquier material polimérico que sea capaz de asociarse con el polinucleótido u otro material genético y al agente de transfección y que puede dirigirse al sitio de acción. En una modalidad preferida, el material debe portar los polinucleótidos u otros materiales genéticos y embolizar. Preferiblemente, se utiliza una micropartícula en la presente invención, más preferiblemente una microesfera.
Se puede utilizar una gran variedad de portadores poliméricos en la presente invención, ejemplos representativos de los cuales incluyen, sin limitación, poli(etilén-vinil-acetato) (40% entrelazado).
4.1.2 Microesferas
Para el aspecto del suministro de la droga de la invención, el material polimérico preferido es la microesfera. En la modalidad de suministro de la droga, es opcional el uso de un agente de transfección.
Preferiblemente las microcuentas o microesferas (denominadas aquí en forma colectiva como microesferas) para el uso en la presente invención se basan en polímeros biocompatibles, hidrofílicos, sustancialmente esféricos y no tóxicos. Las microesferas se pueden inyectar a través de una aguja de calibre 18 o más pequeña y no pueden ser eliminadas por medio del sistema inmunológico o linfático. Los polímeros pueden ser recubiertos preferiblemente con agentes que promueven la adhesión celular. Las células vivas se pueden unir también a las microesferas formando células en capas allí dentro que se enlazan con tejidos circundantes para mejorar la estabilidad a largo plazo de las cuentas.
Las microesferas de la presente invención comprenden elastómeros, preferiblemente elastómeros seleccionados del grupo que consiste de polímeros acrílicos, polímeros de alcohol vinílico, polímeros de acrilato, polisacáridos, siliconas, o mezclas de los mismos. Más preferiblemente, los copolímeros hidrofílicos que pueden ser utilizados para esta aplicación son aquellos de la familia de los acrílicos tales como poliacrilamidas y sus derivados, poliacrilatos y sus derivados así como compuestos polialílicos y polivinílicos. En otra modalidad, las microesferas de la presente invención se pueden basar también en la combinación de acetato de polivinilo junto con un polímero hidrófobo catiónico. Todos estos polímeros se entrelazan para ser estables y no reabsorbibles, y pueden contener dentro de su estructura otros compuestos químicos que muestran propiedades particulares, tales como efectos quimiotácticos, promoción de la adhesión celular a células y tejidos.
Las microesferas encaminadas a ser implantadas, preferiblemente a través de inyección, en diferentes sitios del organismo de acuerdo con la presente invención se componen de un polímero hidrofílico no reabsorbible que contiene el material apropiado para adhesión celular, y puede adicionalmente contener moléculas radiopacas u otros agentes marcadores, para facilitarla localización por medio de radiología antes o durante la intervención.
Las microesferas para uso en la presente invención no son tóxicas para los tejidos y las células, son biocompatibles, y se adhieren a diferentes células y tejidos en el sitio de implante por medio del crecimiento celular que ellas promueven. Además, estas microesferas no se reabsorben y no son biodegradables, y por lo tanto, son durables, y mantendrán su forma general y posición una vez implantadas en un sitio deseado. En una modalidad alternativa, las microesferas de la presente invención son reabsorbibles y por lo tanto biodegradables. Tales microesferas reabsorbibles y biodegradables se basan, por ejemplo, sin limitación, en polisacáridos y derivados de polisacáridos.
En general las microesferas para uso en la presente invención pueden tener cualquier forma, siendo referidas las microesferas que son sustancialmente esféricas en su forma. Las microesferas para uso en la presente invención pueden tener diámetros en el rango aproximadamente entre 10 \mum hasta aproximadamente en 2000 \mum. Preferiblemente, las microesferas para uso en la presente invención que tienen células adheridas a la superficie de las mismas tendrán diámetros en el rango entre 40 \mum y 1000 \mum.
Las microesferas elásticas de la presente invención preferiblemente pueden ser inyectadas a través de agujas de calibre 18 o más pequeñas y se eliminan a través de macrófagos o de otros elementos del sistema inmunológico o del sistema linfático. En tales casos, los diámetros preferidos promedio de las microesferas son aproximadamente de 40 \mum hasta aproximadamente 400 \mum y, más preferiblemente, aproximadamente desde 50 hasta aproximadamente 200 \mum. En una modalidad más preferida, los diámetros promedio de las microesferas inyectables están en el rango aproximadamente desde 70 hasta aproximadamente 120 \mum.
En otro aspecto de la invención, un subconjunto de las microesferas para uso en la presente invención se basa en partículas no tóxicas, biocompatibles, hinchables, hidrofílicas, y sustancialmente esféricas que contienen diferentes polímeros. Las microesferas hinchables son polímeros entrelazados que absorben gran cantidad de agua y, por lo tanto, son capaces de hincharse por contacto con un medio acoso bajo ciertas condiciones. Como lo entiende una persona capacitada en el arte, el grado de hinchamiento de polímeros entrelazados depende generalmente de las propiedades de los materiales poliméricos y deliberado de entrelazamiento. Propiedades, tales como la concentración de sal y la concentración iónica y el nivel de pH, del solvente en el cual se suspenden las microesferas o con el cual se ponen en contacto las microesferas, también afectan el grado de hinchamiento.
Por medio del control cuidadoso del tamaño y del grado de hinchamiento de ciertos polímeros hinchables y entrelazados, se puede lograr la inserción del gen y la embolización utilizando esas microesferas. De acuerdo con la invención, se escogen primero los materiales poliméricos que tienen la capacidad de absorber gran cantidad de agua. La capacidad de hincharse de estos polímeros se puede manipular adicionalmente controlando el grado de entrelazamiento, que, como lo sabe alguien capacitado en el arte, se puede lograr ya sea químicamente o a través de radiación.
Más importante aún, el hinchamiento de las microesferas que contienen a estos polímeros puede ser controlado adicionalmente por medio del control del solvente en el cual se suspenden las microesferas. Esto se logra a través de dos etapas como se divulga aquí. Primero, se controla cuidadosamente el tamaño de las microesferas antes en la inyección por medio del uso de solventes apropiados, de la concentración de sal y del nivel de pH de acuerdo con las microesferas específicas utilizadas. Las microesferas antes de la inyección pueden permanecer ya sea en su tamaño original o hinchadas hasta cierto grado debido a su contacto con el solvente. El hinchamiento previo a la inyección se controla para que las microesferas se puedan inyectar fácilmente a través de agujas calibre 30 o más pequeñas. Segundo, después de la inyección y por contacto con tejidos en los sitios de la inyección, las microesferas pueden hincharse adicionalmente hasta un tamaño predeterminado o retener su tamaño previo a la inyección, cualquiera de los tamaños permitirá un que las esferas sean aseguradas en el sitio de la inyección y logran el efecto deseado de terapia génica de embolización. El grado de hinchamiento previo a la inyección, y por lo tanto el hinchamiento después de la inyección, se determina por medio de las microesferas particulares utilizadas y de la naturaleza y ubicación de las deficiencias de la piel que están siendo tratadas.
Las microesferas para uso en la presente invención tienen diámetros en el rango entre aproximadamente 10 y aproximadamente 400 \mum antes del hinchamiento. Preferiblemente, antes del hinchamiento, los diámetros de las microesferas están aproximadamente entre 10 y aproximadamente 200 \mum y, más preferiblemente, aproximadamente entre 10 y aproximadamente 120 \mum. Después de la inyección y del hinchamiento, las microesferas tienen diámetros promedio aproximadamente mayores a 40 \mum, preferiblemente aproximadamente mayores a 50 \mum y, más preferiblemente, aproximadamente mayores a 70 \mum. Las microesferas en la presente invención son capaces de hincharse aproximadamente hasta 15 veces a partir de su tamaño original. El tamaño total de las microesferas hinchadas después de la inyección se controla por los diferentes medios discutidos anteriormente, para que ellas queden seguras en el sitio de la inyección mientras que no causen ninguna lesión potencial a los tejidos. Además, el tamaño total de las microesferas hinchadas después de la inyección se predetermina con base en factores tales como las condiciones fisiológicas del sitio de la inyección, el tamaño original de las microesferas, el solvente utilizado y el hinchamiento de las microesferas previo a la inyección. Por lo tanto, se puede diseñar un plan específico de inyección de acuerdo a la terapia génica particular de emboloterapia necesario en cada caso. Estos tamaños y las propiedades de las microesferas son útiles ya que permiten que las microesferas sean inyectadas fácilmente a través de agujas de calibre 30 o más pequeñas, no obstante que las microesferas son lo suficientemente grandes para que ellas sean aseguradas en el sitio de la inyección y no sean digeridas o eliminadas por macrófagos u otros elementos del sistema inmunológico.
Las posibles variaciones de las microesferas de la presente invención incluyen el reemplazo de las microesferas con cualquier partícula polimérica biocompatible, no tóxica y no reabsorbible, membrana, fibras u otros sustratos sólidos tratados con un agente que promueva la adhesión celular. La invención también abarca el uso de material embólico que puede ser una solución líquida que forma gel como se divulga en la Patente Estadounidense No. 5.925.683, cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia. La invención también incluye polímeros lineales solubles que, después de la inyección, se entrelazan in situ para constituir un sólido, un agente de relleno que promueve la adhesión celular. La preparación y/o inyección de microesferas vacías (microampollas) que se preparan por adelantado o que se generan en el sitio a través del uso de catéteres apropiados, son también contempladas en esta invención.
Las microesferas, u otros sustratos sólidos, para ser usados en la presente invención son flexibles, de manera que puedan pasar fácilmente dentro y a través de los dispositivos de la inyección y catéteres pequeños sin ser permanentemente alterados, sin embargo las microesferas son también resistentes al estrés de la contracción muscular generado durante y después del proceso de implantación. Ellos también son técnicamente estables lo que permite una esterilización fácil y conveniente, y almacenamiento bajo condiciones de congelación.
Las microesferas, u otros sustratos sólidos, para uso en la presente invención son también estables en suspensión lo que le permite a las microesferas o a otros sustratos sólidos, ser formulados y almacenados en suspensión e inyectados con líquidos diferentes. Más específicamente, la naturaleza hidrofílica de las microesferas permite ubicarlas en suspensión, y en particular, en la forma de soluciones inyectables estériles y pirogénicas (libres de pirógeno), mientras se evita la formación de agregados o de adhesión a las paredes de los contenedores de almacenamiento y de los dispositivos de implantación, tal como catéteres, jeringas, agujas y similares.
En una modalidad, las microesferas preferidas de la presente invención son tanto hidrofílicas como catiónicas. Las microesferas comprenden preferiblemente un copolímero de un monómero hidrofílico neutro, un monómero disfuncional, uno o más monómeros que tienen una carga catiónica, y opcionalmente, un monómero funcionalizado capaz de suministrar la microesfera detectable. Las microesferas pueden comprender también uno o más promotores de adhesión celular y un agente de marcación. El copolímero es preferiblemente un copolímero acrílico hidrofílico que comprende en forma copolimerizada aproximadamente de 25 hasta aproximadamente 98% en peso del monómero acrílico hidrofílico neutro, aproximadamente de 2 hasta aproximadamente 50% en peso de monómero disfuncional y aproximadamente desde 0 hasta aproximadamente 50% en peso de uno o más monómeros que tienen una carga catiónica. A manera de ejemplo, los copolímeros descritos en la Patente Francesa No. 2.378.808, que se incorpora aquí como referencia, pueden ser utilizados de acuerdo con esta invención para preparar el copolímero base de la microesfera. Como monómero acrílico hidrofílico, puede utilizar acrilamida y sus derivados, metacrilamida y sus derivados o hidroximetilenetacrilato. Los ejemplos de monómero disfuncional, incluyendo, pero no se limitan a, la N,N-metilen-bis-acrilamida, N,N-dialiltartiamida o glioxal-bis-acrilamida. Además, el monómero que tiene carga catiónica, incluye, pero no se limita a, aquellos que portan una función amina terciaria o cuaternaria, preferiblemente dietilaminoetil acrilamida, metacrilamidopropil trimetilamonio o acrilamidoetil trietilamonio. En una modalidad particularmente preferida, se utiliza un copolímero que comprende aproximadamente de 25 hasta aproximadamente 98% en peso de metacrilamida, aproximadamente desde 2 hasta aproximadamente 50% en peso de N,N-metilen-bis-acrilamida.
En otro aspecto relacionado de la presente invención, la hidrofobicidad o el carácter iónico del material embólico se puede modificar seco se considere necesario por medio de la introducción, por ejemplo, sin limitación, de cadenas de hidrocarburo y/o grupos químicos hidrofílicos ionizables. Tales modificaciones del material embólico resultan en una mayor fuerza de adsorción entre el factor terapéutico bioactivo y el agente de transfección, que es suficiente para modular el lapso de tiempo para el suministro del factor terapéutico bioactivo. Tal modulación de la fuerza de adsorción entre el factor terapéutico bioactivo y el agente de transfección puede ser utilizada también para controlar la cantidad absoluta del factor terapéutico bioactivo asociado con el material embólico.
En una modalidad particularmente ventajosa de la invención, es posible incrementar la estabilidad de las microesferas por medio de la reticulación del agente de adhesión. A manera de ejemplo, en el caso de la gelatina, el agente de reticulación puede ser escogido entre los agentes químicos disfuncionales que reaccionan sobre las aminas de gelatina (por ejemplo, glutaraldehído, formaldehido, glioxal, y similares).
Otra modalidad de la invención es tener la microesfera visible a la luz y dentro del organismo. Por ejemplo, también es posible marcar las microesferas después de su síntesis. Esto puede hacerse, por ejemplo, injertando derivados de marcadores fluorescentes (incluidos, por ejemplo, isocianato de fluoresceína (FITC), isocianato de rodamina (RITC) y similares). El monómero funcionalizado se obtiene generalmente por medio de acoplamiento químico del monómero con un marcador, que puede ser: un colorante químico, tal como Cibacron Blue o Procion Red HE-3B, haciendo posible una visualización directa de las microesferas (Boschetti, J. Biochem-Biophys. Meth., 19: 21-36 (1989)). Ejemplos de monómeros funcionalizados que pueden ser utilizados para este tipo de marcación son N-acriloil hexametilen Cibacrone Blue o N-acriloil hexametilen Procion Red HE-3B; un agente de representación óptica por resonancia magnética (erbio, gadolinio o magnetita); un agente de contrastación, tal como las sales de bario o de iodo, (incluyen, por ejemplo, ácido acilamino-e-propion-amido)-3-triyodo-2,4,6-benzóico, que puede ser preparado bajo las condiciones descritas por Boschetti y colaboradores (Bull. Soc. Chim., No. 4 Francia, (1986)). En el caso de las sales de bario o de magnetita, se las puede introducir directamente en forma de polvo en la solución inicial de monómero.
Se pueden utilizar diferentes tipos de promotores de adhesión celular bien conocidos en el arte, en la presente invención. En particular, los promotores de adhesión celular se pueden seleccionar de colágeno, gelatina, glucosaminoglicanos, fibronectinas, lectinas, policationes (tales como, polilisina, chitosan y similares), o cualquier otro agente biológico natural o sintético de adhesión celular.
Preferiblemente, el promotor de adhesión celular está presente en la microesfera, o en otro sustrato sólido, en una cantidad aproximadamente entre 0,1 y 1 g por ml de microesferas fijadas.
Las microesferas se preparan por medio de polimerización en suspensión, polimerización gota a gota o cualquier otro método conocido por la persona capacitada en el arte. La forma para preparar la microesfera seleccionada usualmente dependerá de las características deseadas, tales como el diámetro de la microesfera y la composición química, para las microesferas resultantes. Las microesferas de la presente invención se pueden elaborar por medio de métodos estándar de polimerización descritos en el estado del arte (ver, por ejemplo, E. Boschetti, Microspheres for Biochromatography and Biomedical Applications. Parte I, Preparation of Microbeads En: Microspheres, Microencapsulation and Liposomes, John Wiley & Sons, Arshady R., Ed., vol. 2, páginas 171-189 (1999)). Las microesferas se preparan comenzando con una solución acuosa de monómeros que contiene agentes de adhesión tales como colágeno (la gelatina es un colágeno desnaturalizado). Se mezclan luego la solución con un solvente compatible no acuoso para crear una suspensión de góticas, que se convierte luego en un gel sólido por polimerización de monómeros por medio de catalizadores apropiados. Las microesferas se recolectan luego por filtración o por centrifugación y se lavan.
Se introducen los promotores de adhesión celular o los agentes de marcación sobre las microesferas por medio de procedimientos de acoplamiento químico bien conocidos en cromatografía de afinidad, denominado por el término "inmovilización del ligando". Otro método para la introducción es por medio de difusión dentro de la red del gel que constituye a la microesfera y luego atrapar a las moléculas difusas en su lugar por medio de precipitación o de entrelazamiento químico.
Las microesferas de la invención se pueden obtener también por medio de métodos estándar de polimerización descritos en el arte tales como en la Patente Francesa No. 2.378.808, las Patentes Estadounidenses Nos. 5.648.100, 5.635.215 y 5.648.100. En general, la polimerización de monómeros en solución se lleva a cabo a una temperatura en el rango aproximadamente entre 0ºC y aproximadamente 100ºC, y aproximadamente entre 40ºC y aproximadamente 60ºC, en presencia de un iniciador de la reacción de polimerización.
El iniciador de polimerización se escoge convenientemente entre los sistemas de óxido reducción. Notablemente, es posible utilizar combinaciones de un persulfato de metal alcalino con N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina o con dimetilaminopropionitrilo, peróxidos orgánicos tales como peróxidos de benzoilo o incluso 2,2'-azo-bis-isobutironitrilo. La cantidad utilizada de iniciador la adapta alguien capacitado en el arte para la cantidad de monómeros y la velocidad de polimerización buscada. La polimerización se puede llevar a cabo en masa o en emulsión.
En el caso de una polimerización en masa, la solución acuosa que contiene los diferentes constituyentes disueltos y al iniciador sufre polimerización en un medio homogéneo. Esto hace posible acceder al grueso del gel acuoso que luego puede ser separado en microesferas, por medio del paso, por ejemplo, a través de la malla de un tamiz.
La polimerización en emulsión o en suspensión es el método preferido de preparación, ya que permite o tener directamente las microesferas de un tamaño deseado. Puede realizarse de la siguiente manera: se mezcla la solución acuosa que contiene a los diferentes constituyentes disueltos (por ejemplo, diferentes monómeros, al agente de adhesión celular), por medio de agitación, con una fase orgánica líquida que no es miscible en agua, y opcionalmente en presencia de un emulsificante. Se ajusta la velocidad de agitación para obtener una emulsión de la fase acuosa en la fase orgánica formando gotas el diámetro deseado. Se inicia entonces la polimerización por medio de la adición del iniciador. Esta se ve acompañada por una reacción exotérmica y se puede hacer seguimiento a su desarrollo por medio de la medición de la temperatura del medio de reacción.
Es posible utilizar como fase orgánica aceites vegetales o minerales, ciertos productos de la destilación del petróleo, hidrocarburos clorados o una mezcla de estas diferentes soluciones. Además, cuando el iniciador de la polimerización incluye diferentes componentes (sistema de óxido reducción), es posible añadir uno de ellos en la fase acuosa antes de la emulsificación.
Las microesferas obtenidas así se pueden recuperar por medio de enfriamiento, decantación y filtración. Se separan luego por categoría de tamaños y se lavan para eliminar cualquier traza de producto secundario.
La etapa de la polimerización puede ser seguida por una etapa de reticulación del agente de adhesión celular y posiblemente por una etapa del agente de marcación en el caso de las microesferas que se volvieron identificables por mezcla después de la síntesis.
4.2 Factores Terapéuticos Bioactivos
Los factores terapéuticos bioactivos de la presente invención comprenden al menos a uno o más de lo siguiente: agentes antineoplásicos, agentes antiangiogénicos, hormonas y esteroides, vitaminas, péptidos y análogos de péptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, factores antimicóticos, vacunas, enzimas, agentes antialergénicos, drogas para la circulación, agentes antituberculosos, agentes antivirales, agentes antianginales, la agentes antibacterianos, y agentes antimicóticos, agentes antiinflamatorios, agentes antiprotozoarios, agentes antirreumáticos, narcóticos, agentes glicósidos cardíacos, sedantes, agentes anestésicos locales, drogas antihistamínicas, agentes sensibles a la radiación, agentes anestésicos en general, o combinaciones de los mismos.
4.3 Factores Terapéuticos Bioactivos para Uso en la Terapia Génica
Para la terapia génica de emboloterapia con base en polinucleótidos, el polinucleótido puede codificar a cualquiera de los factores terapéuticos bioactivos de la presente invención, en donde el polinucleótido se asocia con un agente de transfección de la presente invención. Los materiales genéticos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos de la presente invención, incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácidos nucleicos, polinucleótidos, ARN y ADN, ya sea de origen natural o sintético, incluyendo ARN y ADN recombinantes y ARN y ADN antisentido; ARN cabeza de martillo, ribozimas, ácidos nucleicos antígenos, ARN y ADN tanto monocatenarios como bicatenarios y análogos de los mismos, tal como el fosforoditioato y los oligodesoxinucleótidos fosforoditioato. Los tipos de material genético que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, a los genes transportados sobre vectores de expresión tales como plásmidos, fagémidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levadura (YAC), y virus "auxiliares" o defectuosos, así como partículas de tipo viral que transportan material genético. Tales polinucleótidos también pueden ser utilizados en combinación con otros elementos tales como, por ejemplo, sin limitación, reforzadores específicos del tejido, señales nucleares de localización, etc.
Adicionalmente, el material genético se puede combinar, por ejemplo, con proteínas o con otros polímeros. Por ejemplo, en una modalidad, la invención también provee para el uso de anticuerpos policlonales y monoclonales objetivo junto con el portador del material polimérico, al factor terapéutico bioactivo y al agente de transfección. Algunos ejemplos de terapéutica genética que se puede aplicar utilizando las microesferas de la presente invención incluyen al ADN que codifica al menos una porción de un gen HLA, al ADN que codifica al menos una porción de distrofina, al ADN que codifica al menos una porción del regulador transmembrana de la fibrosis cística (CFTR), al ADN que codifica al menos una porción de IL-2, al ADN que codifica al menos una porción de TNF, a un oligonucleótido antisentido capaz de enlazar al ADN que codifica al menos una porción de Ras. Se puede utilizar al ADN que codifica a ciertas proteínas en el tratamiento de muchos tipos diferentes de enfermedades. Por ejemplo, se pueden suministrar el factor de necrosis tumoral y/o la interleuquina-2 para tratar cánceres avanzados; se puede suministrar al receptor de HDL para tratar una enfermedad del hígado; se puede suministrar timidina quinasa para tratar al cáncer de ovario, tumores de cerebro, o a la infección por el VIH; se puede suministrar HLA-B7 para tratar melanoma maligno; se puede suministrar interleuquina-2 para tratar neuroblastoma, melanoma maligno, o cáncer de riñón; se puede suministrar interleuquina-4 para tratar cáncer; se puede suministrar al gen env del VIH para tratar a la infección por el VIH; se puede suministrar ras/p53 antisentido para tratar cáncer de pulmón; se puede suministrar adenosina deaminasa para tratar la deficiencia de ADA; y se puede suministrar al Factor VIII para tratar a la Hemofilia B. Ver, por ejemplo, Science 258, 744-746.
4.4 Factores Terapéuticos Bioactivos para el Uso en Terapia con Droga
Para el aspecto de la invención relacionado con la emboloterapia con base en droga, los factores terapéuticos bioactivos contienen uno o más de los agentes siguientes asociados con una microesfera de la invención.
Los agentes antineoplásicos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, compuestos de platino (por ejemplo, espiroplatina, cisplatina, y carboplatina), adriamicina, mitomicina c, ansamitocina, bleomicina, sulfato de bleomicina, citosina arabinósida, arabinosil adenina, mercaptopolilisina, vincristina, busulfán, clorambucil, melfalán (por ejemplo, PAM, LPAM o mostaza de fenilalanina), mercaptopurina, mitotano, clorhidrato de procarbazina, dactinomicina (actinomicina D), clorhidrato de daunorubicina, clorhidrato de doxorubicina, taxol, mitomicina, plicamicina (mitramicina), aminoglutetimida, fosfato sódico de estramustina, flutamida, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, citrato de tamoxifen, testolactona, trilostano, amsacrina (m-AMSA), asparaginasa (L-asparaginasa), Erwinia asparaginasa, etoposida (VP-16), interferón \alpha-2a, interferón \alpha-2b, teniposida (VM-26), sulfato de vinblastina (VLB), sulfato de vincristina, metotrexato, y carzelesina.
Los productos sanguíneos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, eritropoyetina, hierro parenteral, hemina, y hematoporfirinas y sus derivados.
Los modificadores de respuesta biológica, incluyen, por ejemplo, sin limitación, muramildipeptido, muramiltripeptido, limfoquinas (por ejemplo, endotoxina bacteriana tal como lipopolisacárido, factor de activación de macrófagos), subunidades de bacterias (tales como Micobacteria, Corinebacteria), el dipéptido sintético, N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, y prostaglandinas.
Los agentes antimicóticos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, ketoconazol, nistatina, griseofulvina, flucitosina (5-fc), miconazol, amfotericina B, ricina, y antibióticos de beta-lactama (por ejemplo, sulfazecina).
Las hormonas y esteroides, incluyen, por ejemplo, sin limitación, hormona de crecimiento, hormona estimuladora de melanocitos, hormona adrenocorticotrópica, dexametasone, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, cortisona, acetato de cortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, prednisona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, tebutato de prednisolona, pivalato de prednisolona, triamcinolona, acetonida de triamcinolona, hexacetonida de triamcinolona, diacetato de triamcinolona, metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona, flunisolida, dipropionato de beclometasona, fosfato sódico de betametasona, betametasona, fosfato disódico de vetametasona, fosfato sódico de vetametasona, acetato de betametasona, fosfato disódico de betametasona, acetato de cloroprednisona, corticosterona, desoxicorticosterona, acetato de desoxicorticosterona, pivalato de desoxicorticosterona, desoximetasona, estradiol, fludrocortisona, acetato de fludrocortisona, acetato de diclorisona, fluorohidrocortisona, fluorometolona, fluprednisolona, parametasona, acetato de parametasona, androsterona, fluoximesterona, aldosterona, metandrostenolona, metilandrostenediol, metil testosterona, noretandrolona, testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona, equilenina, equilina, benzoato de estradiol, dipropionato de estradiol, estriol, estrona, benzoato de estrona, acetoxipregnenolona, acetato de anagestona, acetato de clormadinona, acetato de flurogestona, hidroximetilprogesterona, acetato de hidroximetilprogesterona, hidroxiprogesterona, acetato de hidroxiprogesterona, caproato de hidroxiprogesterona, acetato de melengestrol, normetisterona, pregnenolona, progesterona, etinil estradiol, mestranol, dimetisterona, etisterona, diacetato de etinodiol, noretindrona, acetato de noretindrona, noretisterona, acetonida de fluocinolona, flurandrenolona, flunisolida, succionato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de metilprednisolona, fosfato sódico de prednisolona, acetonida de triamcinolona, espironolactona sódica de hidroxidiona, oxandrolona, oximetolona, prometolona, cipionato de testosterona, fenilacetato de testosterona, cipionato de estradiol, y noretinodrel.
Las vitaminas, incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido neinóico de cianocobalamina, retinoides y derivados de los mismos tales como palmitato de retinol, alfa-tocoferol, naftoquinona, colecalciferol, ácido fólico y tetrahidrofolato.
Los péptidos y análogos de péptidos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, manganeso superóxido dismutasa, activador del plasminógeno tisular (t-PA), glutationa, insulina, dopamina, ligandos de péptido que contienen RGD, AGD, RGE, KGD, KGE o KQAGDV (péptidos con afinidad por el receptor GPIIBIIIa), peptides de opiato, encefalinas, endorfinas y sus análogos, gonadotropina coriónica humana (HCG), factor de liberación de corticotropina (CRF), colecistoquininas y sus análogos, bradiquininas y sus análogos y promotores e inhibidores, elastinas, vasopresinas, pepsinas, glucagón, sustancia P, integrinas, captopril, enalapril, lisinopril y otros inhibidores de ACE, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), oxitocina, calcitoninas, IgG o fragmentos de las mismas, IgA o fragmentos de las mismas, IgM o fragmentos de las mismas, ligandos para los Receptores de Proteasa de la Célula Efectora (todos los subtipos), trombina, estreptoquinasa, uroquinasa, t-PA y todos los fragmentos activos o análogos, Proteína Quinasa C y sus ligandos de enlazamiento, interferones (alfa-interferón, beta-interferón, gama-interferón), factores estimuladores de colonias (CSF), factores para estimulación de colonias de granulocitos (GCSF), factores para estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factores de necrosis tumoral (TNF), factores de crecimiento de nervios (NGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas, linfotoxina, factores de crecimiento de la epidermis, factores de crecimiento de fibroblasto, factores de crecimiento de células endoteliales vasculares, eritropoyetina, factores de de transformación del crecimiento, oncostatina M, interleuquinas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12), ligandos de metaloproteína quinasa, colagenasas y agonistas y antagonistas.
Como se lo utiliza aquí, los anticuerpos incluyen, por ejemplo, sin limitación, anticuerpos sustancialmente purificados o fragmentos de los mismos, incluidos anticuerpos no humanos o fragmentos de los mismos. En diferentes modalidades, los anticuerpos sustancialmente purificados de la invención, o fragmentos de los mismos, pueden ser anticuerpos humanos, no humanos, quiméricos y/o humanizados. Tales anticuerpos no humanos pueden ser anticuerpos de cabra, de ratón, de oveja, de caballo, de gallina, de conejo o de rata. Alternativamente, los anticuerpos no humanos de la invención pueden ser anticuerpos quiméricos y/o humanizados. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un mAb de múrido y una región constante de inmunoglobulina humana (Cabilly y colaboradores, Patente Estadounidense No. 4.816.567; y Boss y colaboradores, Patente Estadounidense No. 4.816.397). Además, los anticuerpos no humanos contemplados dentro del alcance de la invención pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales. Cualquier de los anticuerpos de la invención se puede conjugar con una fracción terapéutica o cual una sustancia detectable. Ejemplos no limitantes de sustancias detectables que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención son una enzima, un grupo prostético, un material fluorescente, un material luminiscente, un material bioluminscente, y un material radioactivo.
La invención prevé el uso de anticuerpos policlonales y monoclonales objetivo junto con el portador del material polimérico, el factor terapéutico bioactivo y el agente de transfección. Tales anticuerpos son útiles en los métodos de la invención y permiten el suministro dirigido del material polimérico y del factor terapéutico bioactivo enlazado al agente de transfección al sitio de acción. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se los utiliza aquí, se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen únicamente una especie de un sitio de enlazamiento de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítope particular. Los anticuerpos policlonales se pueden preparar como se describió anteriormente inmunizando a un sujeto adecuado con un polipéptido como inmunógeno. Las composiciones preferidas de anticuerpo policlonal son aquellas que han sido seleccionadas por anticuerpos dirigidos contra un polipéptido o polipéptidos, por ejemplo, de un receptor sobre la superficie de una cédula cancerosa de un tumor que va a ser tratado por las composiciones de la presente invención.
Los factores antimitóticos incluyen, sin limitación, estramustina y su derivado fosforilado, fosfato de estramustina, doxorubicina, amfetinila, combretastatina A4, y colchicina.
Las vacunas incluyen, por ejemplo, sin limitación, vacuna contra neumococo, vacuna contra la poliomielitis, vacuna contra el ántrax, vacuna contra la tuberculosis (BCG), vacuna contra la hepatitis A, vacuna contra el cólera, vacunas contra meningococo A, C, Y, vacuna contra W135, vacuna contra la plaga, vacuna contra la rabia (diploide humano), vacuna contra la fiebre amarilla, vacuna contra la encefalitis japonesa, vacuna contra la fiebre tifoidea (inactivada con fenol y calor), vacuna contra la hepatitis B, vacuna contra la difteria, vacuna contra el tétano, vacuna contra la pertussis, vacuna contra la H. influenzae tipo b, vacuna contra la polio, vacuna contra el sarampión, vacuna contra las paperas, vacuna contra la rubeola, vacuna contra la varicela, vacuna contra el estreptococo de la neumonía Ty (bacteria mutante viva), vacuna contra Vi (polisacárido capsular Vi), vacuna contra DT (toxoide), vacuna contra Td (toxoide), vacuna contra aP (antígeno bacteriano inactivo/accelular (DtaP)), vacuna contra Hib (conjugado bacteriano polisacárido-proteína), vacuna contra el virus de la hepatitis B (antígeno viral/antígeno recombinante derivado de suero inactivo), vacuna contra la influenza, vacuna contra rotavirus, vacuna contra el virus sincitial respiratorio (RSV), vacuna contra astrovirus humano, vacuna contra el virus de la influenza A y B humana, vacuna contra el virus de la hepatitis A, vacuna contra el virus tipo 3 de la parainfluenza atenuado vivo, vacunas contra enterovirus, vacunas contra retrovirus, y vacunas contra picornavirus.
Las enfermedades de pueden ser tratadas con las composiciones y los métodos de la presente invención incluyen, por ejemplo, sin limitación, a los tumores asociados con el hígado, el riñón, la leucemia linfoblástica aguda, la leucemia mieloide aguda, el sarcoma de Ewing, el carcinoma trofoblástico gestacional, la enfermedad de Hodgkin, el linfoma de Hodgkin, el linfoma que no es de Hodgkin, el linfoma de Burkitts, el linfoma de célula grande difusa, el linfoma folicular mixto, el linfoma linfoblástico, rabdomiosarcoma, carcinoma testicular, el tumor de Wilms, carcinoma anal, carcinoma de vejiga, carcinoma de seno, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de célula peluda, carcinoma de cabeza y de cuello, carcinoma de pulmón (células pequeñas), mieloma múltiple, linfoma que no es de Hodgkin, linfoma folicular, carcinoma de ovario, tumores cerebrales (astrocitoma), carcinoma cervical, carcinoma colorectal, carcinoma hepatocelular, sarcoma de Kaposi, carcinoma de pulmón (de células no pequeñas), melanoma, carcinoma pancreático, carcinoma de próstata, sarcoma de tejido blando, carcinoma de seno, carcinoma colorectal (fase III), sarcoma osteogénico, carcinoma de ovario (fase III), carcinoma testicular, o combinaciones de los mismos.
Las enzimas, incluyen, por ejemplo, sin limitación, fosfatasa alcalina, ciclooxigenasa tipo I y agonistas y antagonistas.
Los agentes antialergénicos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, amelexanox.
Los agentes de anticoagulación, incluyen, por ejemplo, sin limitación, fenprocoumon y heparina.
Las drogas para el sistema circulatorio, incluyen, por ejemplo, sin limitación, propranolol.
Los agentes antituberculosos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, ácido para-aminosalicílico, isoniazid, sulfato de capreomicina, cicloserina, clorhidrato de etambutol, etionamida, pirazinamida, rifampin, y sulfato de estreptomicina.
Los agentes antivirales, incluyen, por ejemplo, sin limitación, aciclovir, amantadina azidotimidina (AZT o Zidovudina), ribavirina, y vidarabina monohidrato (adenina arabinosida, ara-A).
Los agentes antianginales, incluyen, por ejemplo, sin limitación, diltiazem, nifedipina, verapamilo, eritritol tetranitrato, isosorbida dinitrato, nitroglicerina (gliceril trinitrato), y pentaeritritol tetranitrato.
Los antibióticos, incluyen, por ejemplo, dapsona, cloramfenicol, neomicina, cefaclor, cefadroxil, cefalexina, cefradina eritromicina, clindamicina, lincomicina, amoxicilina, ampicilina, bacampicilina, carbenicilina, dicloxacilina, ciclacilina, picloxacilina, hetacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilin V, ticarcilina, rifampina, y tetraciclina.
Los agentes antiinflamatorios y analgésicos, incluyen, por ejemplo, diflunisal, ibuprofeno, indometacina, meclofenamato, ácido mefenámico, naproxeno, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetina, aspirina y salicilatos.
Los agentes antiprotozoarios, incluyen, por ejemplo, sin limitación, cloroquina, metronidazol, hidroxicloroquina, quinina, y meglumina antimonato.
Los agentes antirreumáticos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, penicilamina.
Los narcóticos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, paregórico y opiatos, tales como codeína, heroína, metadona, morfina y opio.
Los agentes glicósidos cardíacos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, deslanosida, digitoxina, digoxina, digitalina y digitalis.
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Los agentes bloqueadores neuromusculares, incluyen, por ejemplo, sin limitación, mesilato de atracurio, galamina trietiodida, bromuro de hexafluorenio, ioduro de metocurina, bromuro de pancuronio, cloruro de succinilcolina (cloruro de suxametonio), cloruro de tubocurarina, y bromuro de vecuronio.
Los sedantes (hipnóticos), incluyen, por ejemplo, sin limitación, amobarbital, amobarbital sódico, aprobarbital, butabarbital sódico, hidrato de cloral, etclorvinol, etinam ate, clorhidrato de flurazepam, glutetimida, clorhidrato de metotrimeprazina, metiprilon, clorhidrato de midazolam paraldehído, pentobarbital, pentobarbital sódico, fenobarbital sódico, secobarbital sódico, talbutal, temazepam, y triazolam.
Los agentes anestésicos locales, incluyen, por ejemplo, sin limitación, clorhidrato de bupivacaína, clorhidrato de cloroprocaína, clorhidrato de etidocaína, clorhidrato de lidocaína, clorhidrato de mepivacaína, clorhidrato de procaína, y clorhidrato de tetracaína.
Los agentes anestésicos generales, incluyen, por ejemplo, sin limitación, droperidol, etomidato, citrato de fentanilo con droperidol, clorhidrato de ketamina, metohexital sódico, y tiopental sódico.
Las partículas radioactivas o iones radioactivos, incluyen, por ejemplo, sin limitación, estroncio, renio, ytrio, tecnecio, y cobalto.
Preferiblemente, el factor terapéutico bioactivo es un agente antineoplásico, una hormona, un esteroide, un agente antimicótico, un péptido o un análogo de péptido. Más preferiblemente, el agente bioactivo dexametasona, amfotericina B, adriamicina, mitomicina c, taxol, doxorubicina, o activador plasminógeno del tejido (t-PA). El factor terapéutico bioactivo utilizado en la presente invención es preferiblemente muy activo en bajas concentraciones. Los aspectos que son objetivo de la invención permiten además la aplicación de dosis menores para la terapia, ya que la concentración efectiva en el sitio terapéutico permanece sin diluir en el organismo. La cantidad de factor terapéutico bioactivo de la presente invención que se administra a un paciente depende, por ejemplo, del factor terapéutico bioactivo que se utilice en particular, del método por medio del cual se administre al factor terapéutico bioactivo, y de la edad, el sexo, el peso y de la condición física del paciente. Generalmente, el tratamiento se inicia con dosis pequeñas, que pueden ser incrementadas poco a poco, hasta lograr el efecto deseado de acuerdo a las circunstancias. Adicionalmente, alguien capacitado en el arte puede contar con materiales de referencia, tales como el Physician's Desk Reference, publicado por Medical Economics Company en Montvale, N.J. 07645-1742, para determinar la cantidad apropiada de un factor terapéutico bioactivo en particular, y por lo tanto la prodroga correspondiente de la invención que se le puede administrar a un paciente en el caso de la combinación de una droga terapéutica y de terapia génica utilizando los métodos de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, se le suministra la prodroga al paciente (por ejemplo, en una región del paciente) con el propósito de, por ejemplo, tratar una condición (esto es, un estado enfermizo, una enfermedad, un trastorno, etc.) en el paciente. La prodroga puede ser utilizada como anteriormente o puede ser incorporada en otras modalidades, tales como en emulsiones.
4.5 Agentes de Transfección para Suministro del Polinucleótido
El material genético comprende ácidos nucleicos, polinucleótidos, ARN y ADN, ya sea de origen natural o sintético, incluidos ARN y ADN recombinantes y ARN y ADN antisentido; ARN cabeza de martillo, ribozimas, ácidos nucleicos antigénicos, ARN y ADN tanto monocatenarios como bicatenarios y análogos de los mismos, ya sea en combinación o no con otros elementos tales como, por ejemplo, sin limitación, reforzadores específicos del tejido, señales nucleares de localización, pueden ser introducidos en células eucariotas a través de técnicas de transformación o de transfección convencionales. Como se los utiliza aquí, los términos "transformación" y "transfección" están destinados a referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para la introducción de ácido nucleico foráneo en una célula huésped, incluido, por ejemplo, sin limitación, la coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Los métodos adecuados para transformación o transfección de células huésped se pueden encontrar en Sambrook y colaboradores (más arriba), y en otros manuales de laboratorio.
Para transfección estable de células de mamífero, se sabe que dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizada, únicamente una pequeña fracción de células puede integrar al ADN foráneo dentro de su genoma. Con el propósito de identificar y seleccionar estos integrantes, se introduce generalmente un gen que codifica a un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a los antibióticos) en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen a aquellos que confieren resistencia a drogas, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas en forma estable con el ácido nucleico introducido se pueden identificar por selección de droga (por ejemplo, las células que han incorporado al gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras morirán).
Con el propósito de obtener una eficiente transferencia in vivo de las composiciones terapéuticas bioactivas de la presente invención, se emplean diferentes agentes de transfección. Los ejemplos representativos de agentes de transfección que son adecuados para el uso con los métodos de la presente invención, incluyen, sin limitación, coprecipitación de fosfato de calcio o de cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, DOTMA anfifilo de amonio cuaternario ((bromuro de dioleoiloxipropil)trimetilamonio, comercializado como Lipofectina por GIBCO-BRL)) (Felgner y colaboradores, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Malone y colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 6077-6081); diésteres de glutamato lipofílico con cabezas colgantes de trimetilamonio (Ito y colaboradores. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); los lípidos madre que pueden metabolizarse tales como el lípido catiónico dioctadecilamido glicilespermina (DOGS, Transfectam, Promega) y dipalmitoilfosfatidil etanolamilespermina (DPPES) (J.P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J.P. Behr y colaboradores. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986); las sales de amonio cuaternario que pueden metabolizarse (DOTB, metilsulfato de N-(1-[2,3-dioleoiloxi]propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) (Boehringer Mannheim), polietilenimina (PEI), ésteres de dioleoilo, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis y colaboradores. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Chol), dioleoilfosfatidil etanolamine (DOPE)/3beta[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol DC-Chol en mezclas uno a uno (Gao y colaboradores, (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), espermina, espermidina, lipopoliaminas (Behr y colaboradores, Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), polilisinas lipofílicas (LPLL) (Zhou y colaboradores, (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), hidróxido de [[(1,1,3,3-tetrametilbutil)cresoxi]etoxi]etil]dimetilbenzilamonio (hidróxido de DEBDA) con exceso de fosfatidilcolina/colesterol (Ballas y colaboradores, (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), mezclas de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)/DOPE (Pinnaduwage y colaboradores, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), diéster lipofílico de ácido glutámico (TMAG) con DOPE, CTAB, DEBDA, bromuro de didodecilamonio (DDAB), y estearilamina en mezcla con fosfatidiletanolamina (Rose y colaboradores, (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL), y lípidos que soportan oligogalactosa (Remy y colaboradores, próximo a ser publicado).
También está incluido dentro de la presente invención el uso de diferentes agentes reforzador de transfección para incrementar la eficiencia de la transferencia del factor terapéutico bioactivo dentro de las células. Los agentes adecuados reforzadores de la transfección incluyen, por ejemplo, sin limitación, DEAE-dextrano, polibreno, péptido fruto de la ruptura en el lisosoma (Ohmori N I y colaboradores, Biochem Biophys Res Commun 1997 Junio 27; 235(3): 726-9), proteoglicanos con base en condroitina, proteoglicanos sulfatados, polietilenimina, polilisina (Pollard H y colaboradores. J Biol Chem, 1998 273 (13): 7507-11), péptido CYGGRGDTP de enlazamiento a la integrina, dextrano lineal no sacárido, glicerol, grupos colesterilo anclados al enlace del internucleósido terminal 3' de un oligonucleótido (Letsinger, R.L. 1989 Proc Natl Acad Sci U S A 86: (17): 6553-6), lisofosfatido, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, y 1-oleoil lisofosfatidilcolina.
Los ejemplos preferidos de agentes de transfección adecuados incluyen, sin limitación, lipopoliaminas como se divulga en la Patente Estadounidense No. 5.171.678, expedida a Behr, y colaboradores, diciembre 15, 1992, en la Patente Estadounidense No. 5.476.962 expedida a Behr, y colaboradores, diciembre 19, 1995, y en la Patente Estadounidense No. 5.616.745 expedida a Behr, y colaboradores, abril 1, 1997.
Los agentes de transfección particularmente preferidos de la presente invención contienen lipopoliaminas de fórmula general (I) como se divulga en la Patente Estadounidense No. 5.171.678, expedida a Behr, y colaboradores, diciembre 15, 1992, en la Patente Estadounidense No. 5.476.962 expedida a Behr, y colaboradores, diciembre 19, 1995, y en la Patente Estadounidense No. 5.616.745 expedida a Behr, y colaboradores, abril 1, 1997.
Las lipopoliaminas de fórmula general (I) son especialmente útiles como vectores para la transfección de célula eucariotas. Las lipopoliaminas de fórmula general (I) tienen la propiedad, cuando se dispersan en agua, de formar nanopartículas unilamelares que son inestables en un medio iónico y que se asocian fuertemente, a través de sus porciones catiónicas, con ADN de plásmido o de oligonucleótido, compactando a éste último y cubriéndolo con una capa de lípido. Por medio del uso de un exceso de cargas catiónicas con relación al ácido nucleico, los complejos lípido/ADN pueden ser adsorbidos sobre las membranas celulares, facilitando así la incorporación del ADN por las células.
Tales lipopoliaminas de la fórmula general (I) adicionalmente le permiten a las células frágiles (ejemplos de las cuales incluyen, sin limitación, a las células intermedias o anteriores de la hipófisis, a las células de cromafina, a las neuronas periféricas o centrales), que no fue posible transfectar por medio de la aplicación de métodos clásicos (coprecipitación con fosfato de calcio o técnicas con dextrano), ser transfectadas.
4.6 Vectores de Expresión Recombinante
Otro aspecto de la invención se relaciona con el suministro de vectores ya sea con o sin embolización. Preferiblemente, los vectores de expresión contienen un ácido nucleico que codifica a un factor terapéutico bioactivo o a un polipéptido de la invención (o a una porción de los mismos). Como se lo utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar a otro ácido nucleico al cual ha sido enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos adicionales de ADN se pueden ligar en el genoma viral. Los ejemplos específicos de vectores virales, incluyen, sin limitación, vectores adenovirales y retrovirales para terapia génica utilizando las microesferas y los agentes de transfección de la invención. También se contempla dentro de la presente invención el uso de partículas de tipo viral que contienen un factor terapéutico bioactivo, en donde la partícula de tipo viral está físicamente enlazada al agente de transfección, que está también enlazado a la micropartícula. También se contempla dentro de la presente invención el uso de una partícula de tipo viral que contiene un factor terapéutico bioactivo, en donde la partícula de tipo viral está físicamente enlazada al agente de transfección, que está también enlazado a la micropartícula. Tales partículas de tipo viral pueden ser designadas utilizando polietilenimina (PEI) conjugada con el péptido CYGGRGDTP de enlazamiento a la integrina a través de la formación de un puente disulfuro. Tales complejos con el péptido que contienen PEI/RGD comparten con el adenovirus propiedades constitutivas tales como el tamaño y el núcleo centralmente protegido, así como propiedades cercanas, tales como la entrada a la célula mediada por integrinas y el escape del endosoma activado por ácido (Erbacher y colaboradores, próximo a ser publicado).
Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual ellos se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tiene origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) están integrados dentro del genoma de una célula huésped por introducción dentro de la célula huésped, y por lo tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores, vectores de expresión, son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales ellos están operativamente enlazados. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos (vectores). Sin embargo, la invención está encaminada a incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven funcione equivalentes.
Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Esto significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huésped que son utilizadas para expresión, que están operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico que va a ser expresada. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operativamente enlazado" se pretende significar que la secuencia de ácido nucleico de interés está enlazada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped donde se introduce el vector dentro de la célula huésped). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, reforzadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen a aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas del tejido). Se apreciará por parte de aquellos capacitados en el arte que el diseño del vector de expresión puede depender sobre factores tales como la escogencia de la célula huésped que va a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huésped para producir así proteínas o péptidos, incluidas proteínas de fusión o péptidos, codificadas por ácidos nucleicos como se describe aquí.
Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden diseñar para expresión de un polipéptido de la invención en células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura, o células de mamífero). Las células huésped adecuadas se discuten adicionalmente en Goeddel, ver más arriba. Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede ser transcrito y traducido in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras promotoras T7 y polimerasa T7.
En otra modalidad, se expresa un ácido nucleico de la invención en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed (1987) Nature 329: 840) y pMT2PC (Kaufman y colaboradores (1987). EMBO J. 6: 187-195). Cuando se utilizan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión son a menudo proveídas por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores comúnmente utilizados se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus Simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas ver los capítulos 16 y 17 de Sambrook y colaboradores, más arriba.
En otra modalidad, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferencialmente en un tipo particular de célula (por ejemplo, se utilizan elementos reguladores específicos del tejido para expresar al ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos del tejido son conocidos en el arte. Los ejemplos no limitantes de los promotores adecuados específicos del tejido incluyen al promotor de albúmina (específico para el hígado; Pinkert y colaboradores (1987) Genes Dev. 1: 268-277), promotores específicos linfoideos (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) e inmunoglobulinas (Banerji y colaboradores (1983) Cell 33: 729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor del neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), promotores específicos del páncreas (Edlund y colaboradores (1985) Science 230: 912-916), promotores específicos de la próstata y/o reforzadores (Patentes Estadounidenses Nos. 5.830.686, y 5.871.726, que se incorporan aquí en su totalidad como referencia) y promotores específicos de la glándula mamaria (por ejemplo, promotor del suero de la leche; la Patente Estadounidense No. 4.873.316 y la Publicación de la Solicitud Europea No. 264.166). Los promotores regulados por su desarrollo también están incluidos, por ejemplo los promotores de los genes hox de múrido (Kessel y Gruss (1990) Science 249: 374-379) y el promotor de la \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
La inversión provee y además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada dentro del vector de expresión en una orientación antisentido. Esto es, la molécula de ADN está operativamente enlazada a una secuencia reguladora en una forma que permite la expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido con el ARNm que codifica a un polipéptido dado.
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Las secuencias reguladoras operativamente enlazadas a un ácido nucleico en la orientación antisentido se pueden escoger para que dirijan la expresión continua de una molécula antisentido de ARN en una variedad de tipos de células, por ejemplo promotores virales y/o reforzadores, o se pueden escoger secuencias reguladoras para qué dirijan la expresión constitutiva específica de un tejido específico o de un tipo de célula de ADN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en los cuales se producen ácidos nucleicos antisentido bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad se puede determinar por medio del tipo de célula dentro de la cual se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido ver Weintraub y colaboradores (Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986).
En un aspecto de la presente invención, se pueden tratar diferentes cánceres por medio del suministro de un gen en produce toxina sobre un molde de ADN con un reforzador y/o promotor específico del tejido para enfocar la expresión del gen en las células cancerosas. Por ejemplo, los genes que producen toxina incluyen, sin limitación, al gen que produce la toxina de la difteria. Se sabe que la expresión intracelular de la toxina de la difteria mata células. El uso de ciertos promotores podría ser específico del tejido tal como el uso de un promotor específico del páncreas para el cáncer pancreático. Por lo tanto, un gen funcional que produce la toxina de la difteria suministrado a células pancreáticas podría, en teoría, erradicar al páncreas completo. Esta estrategia podría ser utilizada como un tratamiento para el cáncer pancreático. El reforzador específico del tejido aseguraría que la expresión de la toxina de la difteria ocurriría únicamente en células pancreáticas. Los complejos de ADN/lipopoliamina/microesfera que contienen al gen que produce la toxina de la difteria bajo el control de un reforzador específico del tejido se introducirían directamente dentro de una arteria con una cánula que alimenta al páncreas. La infusión ocurriría sobre algún programa de dosificación mientras sea necesario para erradicar el tejido pancreático. Se podrían utilizar otros genes letales además de la toxina de la difteria con efecto similar, tal como los genes para la proteína ricina o el factor del veneno de cobrar o enterotoxina.
Otro ejemplo específico sería el uso del promotor/reforzador del antígeno específico de la próstata para dirigir un factor terapéutico bioactivo de la presente invención a la próstata de un paciente que requiera del tratamiento para cáncer prostático. Se podrían tratar también cánceres especializados por medio de la transferencia de genes tales como, por ejemplo, sin limitación, el gen p53, el gen del retinoblastoma (y otros de esa familia de genes) que suprimen las propiedades cancerosas de ciertos cánceres.
4.7 Transferencia Génica Mediada por Adenovirus
Para el propósito de la terapia génica, se han propuesto adenovirus que portan supresiones como vehículos adecuados. Los adenovirus son virus con ADN sin envoltura. Los vectores de transferencia génica derivados de adenovirus (también llamados vectores adenovirales) tienen una cantidad de características que los hacen particularmente útiles para transferencia génica para tales propósitos. Por ejemplo, la biología del adenovirus está caracterizada en detalle, el adenovirus no está asociado con una patología humana severa, el virus es extremadamente eficiente en la introducción de su ADN en la célula huésped, el virus puede infectar a una gran variedad de células y tiene un amplio rango de huéspedes, el virus puede ser producido en grandes cantidades con relativa facilidad, y el virus puede producir una replicación defectuosa por supresiones en, entre otros, la región 1 temprana (E1) del genoma viral.
El genoma del adenovirus es una molécula de ADN bicatenaria lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases con una proteína terminal de 55 kDa enlazada covalentemente al terminal 5' de cada una de las cadenas del ADN. El ADN del Ad contiene Repeticiones Terminales Invertidas Idénticas (ITR) de aproximadamente 100 pares de bases donde la longitud exacta depende del serotipo. Los orígenes virales de la replicación se localizan dentro de las ITR exactamente en los extremos del genoma. La síntesis del ADN ocurre en dos etapas. Primero, la replicación se produce por desplazamiento de la cadena, generando una molécula hija doble y una cadena madre desplazada. La cadena desplazada es monocatenaria y puede formar un así llamado intermediario "angosto", que permite la iniciación de la replicación y generación de una molécula hija doble. Alternativamente, la replicación puede proceder a partir de ambos extremos del genoma en forma simultánea, obviando el requerimiento para formar una estructura angosta.
Durante el ciclo productivo de la infección, los genes virales se expresan en dos fases: la fase temprana, que es el período hasta la replicación del ADN viral, y la etapa tardía, que coincide con la iniciación de la replicación del ADN viral. Durante la fase temprana únicamente se expresan los productos del gen temprano, codificados por las regiones E1, E2, E3 y E4, que llevan a cabo un sinnúmero de funciones que preparan a la célula para la síntesis de proteínas virales estructurales (Berk, 1986). Durante la fase tardía se expresan los productos del gen viral tardío junto con los productos del gen temprano y el ADN de la célula huésped y la síntesis de proteína se detiene. Por lo tanto, la célula se dedica entonces a la producción del ADN viral y de proteínas virales estructurales (Tooze, 1981).
Existen diferentes serotipos de adenovirus cuya estructura y propiedades varían un poco. Entre estos serotipos, el uso, dentro del marco de la presente invención, de los adenovirus humanos tipo 2 ó 5 (Ad 2 ó Ad 5) o los adenovirus de origen animal (ver la Solicitud WO 94/26914) es preferible. Entre los adenovirus de origen animal que pueden ser utilizados dentro del marco de la presente invención, se contemplan los adenovirus de origen canino, bovino, múrido (ejemplo: Mav1, Beard y colaboradores, Virology 75 (1990) 81), ovino, porcino, aviar o alternativamente de simio (ejemplo: SAV). Preferiblemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus de canino, más preferiblemente un adenovirus CAV-2 [cepa Manhattan o A26/61 (ATTC VR-800), por ejemplo]. Preferiblemente, los métodos de la invención pueden utilizar adenovirus de origen humano o canino o mezclado.
Los adenovirus recombinantes defectuosos para ser utilizados en los métodos de la invención se pueden preparar por medio de cualquier técnica conocida por parte de las personas capacitadas en el arte (Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particular, pueden ser preparados por medio de recombinación homóloga entre un adenovirus y un plásmido que transporta, entre otros, un casete que contiene un gen de interés. La recombinación homóloga ocurre después de la cotransfección del adenovirus y el plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular utilizada debe ser preferiblemente (i) transformable por dichos elementos, y (ii) contener las secuencias capaces de complementar la parte defectuosa del genoma del adenovirus, preferiblemente en forma integrada con el propósito de evitar riesgos de recombinación. Como ejemplo de una línea celular, se puede mencionar a la línea 293 de riñón embrionario humano (Graham y colaboradores, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) que contiene especialmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%). Las estrategias para la construcción de vectores derivados de adenovirus han sido descritas también en las solicitudes Nos. WO 94/26914 y FR 2.707.664.
4.8 Transferencia Génica Mediada por Partículas de Retrovirus
Los vectores retrovirales son vehículos de transferencia génica para mamíferos que explotan características del ciclo de replicación del retrovirus tal como la alta eficiencia de infección y la integración colineal estable de la información viralmente trasmitida en un cromosoma de una célula objetivo. Los vectores retrovirales se convierten en herramientas importantes en investigación básica, biotecnología y terapia génica.
La mayoría de los vectores retrovirales actualmente en uso se derivan de los Virus de Leucemia de Múrido (MLV). Los MLV son particularmente adecuados como vectores debido a su patrón de transcripción bien documentado en diversos tipos de células y estructura genética modular relativamente simple.
Estructura retroviral: los retrovirus pertenecen a los virus con envoltura. La envoltura bilipídica se deriva de la membrana de la célula huésped y modificada por la inserción de la proteína en la superficie viral (SU) y la proteína transmembrana (TM). La proteína de la matriz (MA) se sitúa justo bajo la membrana exterior que rodea al núcleo interior. El núcleo consiste de proteína de la cápside (CA). Dentro de la cápside están dos copias del genoma retroviral que están unidas entre si en el extremo 5' a través de un enlace de hidrógeno. El núcleo de la partícula viral contiene también las enzimas virales: transcriptasa inversa (RT), proteasa (PR), e integrasa (IN), y la proteína de la nucleocápside (NC) que está enlazada al genoma viral. Además de estas proteínas codificadas por el virus, el virión también contiene una cantidad de moléculas de ARNt derivadas de la población de ARNt de la célula huésped.
Los virus de leucemia de múrido (MLV) pertenecen a los retrovirus simples. Los retrovirus tienen un mapa genómico característico: dos repeticiones terminales largas (LTR) que flanquean a los tres genes estructurales gag, pol y env. Las LTR se pueden subdividir en tres regiones: la región U3 que contiene los elementos reforzador y promotor reconocidos por la maquinaria de transcripción celular, la región R que juega un papel importante durante la transcripción inversa además contiene la señal de poliadenilación, y la región U5 que contiene secuencias de importancia en la transcripción inversa y el empaquetamiento del genoma retroviral. Adicionalmente, las LTR contienen elementos cis, las repeticiones invertidas, importantes durante el proceso de integración.
Los provirus integrados dan lugar a dos transcripciones de ARNm, un ARNm de longitud completa que codifica a las poliproteínas de gag-, y de gag-pol, y un ARNm empalmado que codifica a las glicoproteínas de la envoltura. El ARNm de longitud completa también sirve como el ARN genómico y, además de los componentes ya descritos de las fracciones de LTR, contiene tres importantes elementos cis en la secuencia 5' no traducida. El sitio de enlazamiento del iniciador (PBS), situado secuencia abajo de la región U5, consiste de 18 nucleótidos complementarios al extremo 3' de la molécula de ARNt del iniciador. También se localiza en la región 5' no traducida, entre el PBS y el comienzo del marco de lectura abierta de gag, la señal de empaquetamiento (PSL). La región 5' no traducida contiene además un dominio de enlace dímero responsable por la dimerización de los dos genomas virales en el virión. Inmediatamente secuencia arriba de la región U3 que está otro importante elemento cis, el tracto de polipurina (PP), que consiste de una extensión de los residuos A y G. Este elemento sirve como un sitio para la síntesis de la cadena de ADN demás del cebado durante la transcripción inversa.
El ciclo de vida retroviral: se han propuesto dos mecanismos diferentes para explicar la entrada de la partícula viral dentro del citoplasma del huésped. La mayoría de los retrovirus, incluido MVL, se piensa que entran a la célula huésped a través de endocitosis mediada por el receptor, un proceso en el cual la partícula viral con envoltura completa ingresa en el cuerpo endosomal. La molécula receptora para los virus ecotrópicos de leucemia de múrido ha sido clonada e identificada como un transportador de aminoácidos catiónicos.
Después de que el núcleo de la partícula viral ha entrado al citoplasma de la célula huésped, todas las funciones enzimáticas que conducen al provirus integrado de ADN bicatenario son manejadas por las proteínas virales sintetizadas en la célula huésped anterior y colocadas en el virión. La suerte de las proteínas virales después de la entrada del núcleo de la partícula no es clara pero la transcriptasa inversa, la integrasa y la proteína de la cápside permanecen con el genoma de ARN formando el complejo de nucleoproteína en el cual ocurre la transcripción inversa. Recientemente, se ha encontrado también a la proteína de la matriz junto con el complejo de nucleoproteína.
Después de la transcripción inversa, el complejo de nucleoproteína migra hacia el núcleo de la célula huésped. El mecanismo responsable por la localización nuclear no es claro, aunque la evidencia del virus del sarcoma de Rous (RSV) sugiere que la proteína IN es importante ya que la proteína IN del RSV, cuando es producida en célula de mamífero, se localiza en el núcleo. La entrada del complejo de nucleoproteína en el núcleo requiere de mitosis, probablemente debido a que el complejo de nucleoproteína no puede penetrar la envoltura nuclear. Una vez en el núcleo, la integración es mediada por la proteína IN. La proteína IN reconoce las repeticiones invertidas conservadas en los extremos de los LTR y remueve 2 bases de los terminales 3' hidroxilo de ambas cadenas. La proteína IN también cataliza una escisión en el ADN del huésped y media las conexiones entre el ADN proviral y el ADN de huésped. En cuanto a la especificidad de integración no se ha encontrado consenso con la secuencia objetivo de ADN del huésped, aunque se ha reportado una tendencia de integración cerca de los sitios hipersensibles a la ADNasa I.
Para los retrovirus simples (incluido MLV) la transcripción y la traducción se llevan a cabo por medio de la maquinaria de la célula huésped. Los virus complejos (incluido el VIH y el HTLV (Virus Linfotrópico que infecta células T Humanas)) codifican proteínas de transactivación involucradas en la regulación transcripcional. El ensamblaje de las partículas del MLV tiene lugar en la membrana del huésped, y el proceso coincide con el proceso de gemación. En los virus tipos B y C de mamífero (MMTV y HTLV, respectivamente) las partículas del núcleo viral se ensamblan en el citoplasma de la célula huésped. La encapsidación del ARN genómico viral es mediada a través del enlazamiento de la señal de encapsidación que actúa sobre cis y la fracción NC de la proteína precursora Gag o Gag-Pol.
Después de la gemación, las poliproteínas Gag y Gag-Pol son escindidas por la proteasa viral (PR). La maduración de las proteínas virales resulta en un cambio completo en la morfología del virión. Además de la escisión proteolítica de las poliproteínas virales después de la gemación de la partícula viral, el ARN genómico también sufre un proceso de mutación resultando en un genoma dimérico compacto.
Vectores Retrovirales: Los retrovirus a partir de los cuales se pueden derivar los vectores plásmidos retrovirales incluyen, pero no se limitan a, el Virus de Leucemia de Múrido de Moloney, el virus de necrosis del bazo, retrovirus tales como el Virus del Sarcoma de Rous, el Virus del Sarcoma de Harvey, el virus de la leucosis aviar, el virus de la leucemia del mono gibón, el virus de inmunodeficiencia humana, adenovirus, el Virus de Sarcoma Mieloproliferativo, y el virus de tumor mamario. En una modalidad, el vector plásmido retroviral se deriva del Virus de la Leucemia de Múrido de Moloney.
El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, la LTR retroviral; el promotor de SV40, y el promotor de citomegalovirus (CMV) descrito en Miller y colaboradores, Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, los promotores celulares tales como los promotores celulares eucariotas incluyen, pero no se limitan a, los promotores de la histona, pol III, y \beta-actina). Otros promotores virales que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores del adenovirus, promotores de la timidina quinasa (TK), y promotores del parvovirus B19. La selección del promotor adecuado será evidente para aquellos capacitados en el arte a partir de las enseñanzas contenidas aquí.
La secuencia de ácido nucleico que codifica al factor terapéutico bioactivo de interés se coloca bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral; o los promotores heterólogos, tales como el promotor del citomegalovirus (CMV); el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de metalotioneina; promotores de choque térmico; el promotor de albúmina; el promotor de ApoAI, promotores de globina humana; promotores de timidina quinasa viral, tales como el promotor de la timidina quinasa del Herpes Simple, las LTR retrovirales (incluidas las LTR retrovirales modificadas descritas aquí anteriormente); el promotor de la \beta-actina, y los promotores de la hormona de crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla los genes que codifican al factor terapéutico bioactivo de interés.
El vector plásmido retroviral se emplea para transducir las líneas celulares de empaquetamiento para formar las líneas celulares productoras. Los ejemplos de las células de empaquetamiento que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, las 19-17-H2, .psi.CRE, .psi.CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, y las líneas celulares de ADN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, páginas 5-14 (1990), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaquetamiento a través de cualquier método conocido en el arte. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y la precipitación del CaPO_{4}.
La línea celular productora genera partículas del vector retroviral infeccioso que incluyen la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifican al factor terapéutico bioactivo de interés. Tales partículas del vector retroviral pueden ser empleadas entonces, para transducir las células eucariotas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucariotas transducidas expresarán la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifican al factor terapéutico bioactivo de interés. Las células eucariotas que pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias, células de carcinoma embrionario, así como células madre hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células epiteliales bronquiales.
En una modalidad, el vector plásmido retroviral que incluye la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) que codifican al factor terapéutico bioactivo de interés se puede acoplar a un lípido como se describe más arriba, y luego administrarlo a un huésped. En una modalidad preferida, el vector plásmido retroviral se puede asociar con un agente de transfección de lipopoliamina de la presente invención para formar un complejo que se mezcla luego con las microesferas de la presente invención antes de la administración a un paciente que requiera de la terapia génica de embolización.
4.9 Terapia Génica Antisentido
La presente invención abarca adicionalmente el suministro de moléculas de ácido nucleico antisentido ya sea con o sin embolización. Las moléculas de ácido nucleico antisentido son aquellas moléculas que son complementarias al ácido nucleico sentido que codifica a un polipéptido de la invención, por ejemplo, complementarias a la cadena de codificación de una molécula de ADNc bicatenaria o complementarias a una secuencia de ARNm. Por lo tanto, un ácido nucleico antisentido puede unirse a través de un enlace de hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena completa de codificación, o únicamente a una porción de la misma, por ejemplo, todo o parte de la región de codificación de la proteína (o marco de lectura abierta). Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido con todo o parte de una región no codificadora de la cadena de codificación de una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido de la invención. Las regiones no codificadoras ("regiones 5' y 3' no traducidas") son las secuencias 5' y 3' que flanquean a la región de codificación y no son traducidas en aminoácidos.
Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, aproximadamente de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención pude ser construido utilizando síntesis química y reacciones enzimáticas de ligación utilizando procedimientos conocidos en el arte.
Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede ser sintetizado químicamente utilizando nucleótidos de ocurrencia natural o nucleótidos modificados en diferentes formas diseñadas para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del doblete formado entre los ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, se pueden utilizar los derivados fosforotioato y los nucleótidos sustituidos con acridina.
Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden ser utilizados para generar al ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, \beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilamino metiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, \beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina.
Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente utilizando un vector de expresión dentro del cual ha sido subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (esto es, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido a un ácido nucleico objetivo de interés, descrito además en la siguiente subsección).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a un sujeto o se generan in situ para que se hibriden con, o se enlacen a un ARNm celular y/o a un ADN genómico que codifica a un polipéptido seleccionado de la invención para inhibir así la expresión, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser por medio de complementariedad convencional de nucleótidos para forma un doblete estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se enlaza a dobletes de ADN, a través de interacciones específicas en el canal principal de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención incluye la inyección directa del complejo del agente de transfección de lipopoliamina/molécula de ácido nucleico antisentido/microesfera a un sitio particular del tejido.
Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden ser modificadas para suministrarlas a las células objetivo seleccionadas y luego administradas sistemáticamente utilizando las microesferas y los agentes de transfección de la presente invención. Por ejemplo, para administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar para que se enlacen específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, por medio del enlazamiento de moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se enlazan a receptores o antígenos de la superficie de la célula. Tales péptidos o anticuerpos pueden servir para aumentar el suministro mejorado que se obtiene con las microesferas y los agentes de transfección de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden ser suministradas también a las células utilizando los vectores descritos más arriba. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren las construcciones del vector en el cual se coloca la molécula de ácido nucleico antisentido bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III. Una molécula de ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica.
Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérico forma híbridos bicatenarios específicos con ARN complementario en los cuales, contrario a las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y colaboradores (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede contener también un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue y colaboradores (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue y colaboradores (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
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La presente invención abarca adicionalmente ribozimas. Las ribozimas son moléculas catalíticas de ARN con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir a un ácido nucleico monocatenario, tal como un ARNm, con el cual ellas tienen una región complementaria. De esta forma, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)) pueden ser usadas para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm para inhibir así la traducción de la proteína codificada por el ARNm. Una ribozima que tiene especificidad por una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido de la invención puede ser diseñada con base en la secuencia de nucleótidos de un gen objetivo de interés. Por ejemplo, se pude construir un derivado del ARN de Tetrahymena L-19 IVS en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria con la secuencia de nucleótidos que va a ser escindida en Cech y colaboradores, Patente Estadounidense No. 4.987.071; y en Cech y colaboradores, Patente Estadounidense No. 5.116.742. Alternativamente, se puede utilizar un ARNm que codifica a un factor terapéutico bioactivo de la invención para seleccionar un ARN catalítico que tenga actividad específica de ribonucleasa
a partir de una reserva de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel y Szostak (1993) Science 261: 1411-1418.
La invención también abarca a las moléculas de ácido nucleico que forma estructuras de triple hélice. Por ejemplo, la expresión de un factor terapéutico bioactivo puede ser inhibida por secuencias de nucleótidos objetivo complementarias a la región reguladora del gen que codifica al polipéptido (por ejemplo, el promotor y/o el reforzador) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen en células objetivo. Ver generalmente Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; y Maher (1992) Bioassays 14(12): 807-15.
En varias modalidades, se pueden modificar las moléculas de ácido nucleico de la invención en la fracción de la base, en la fracción del azúcar o en la columna vertebral de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, la hibridación, o la solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la columna vertebral del fosfato de desoxirribosa de los ácidos nucleicos puede ser modificada para generar ácidos nucleicos de péptido (ver Hyrup y colaboradores (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23). Como se los utiliza aquí, los términos "ácidos nucleicos de péptido" o "PNA" se refieren a imitaciones de ácido nucleico, por ejemplo, imitaciones de ADN, en las cuales la columna vertebral de fosfato de desoxirribosa es remplazada por una columna vertebral de seudopéptido y únicamente se retienen las cuatro bases nucléicas naturales. Se ha observado que la columna vertebral neutra de los PNA permite una hibridación específica hasta ADN y ARN bajo condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de los oligómeros de PNA se pude realizar utilizando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida como se describe en Hyrup y colaboradores (1996), supra; Perry-O'Keefe y colaboradores (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675.
Los PNA pueden ser utilizados en aplicaciones terapéuticas y diagnosticas de la presente invención. Por ejemplo, los PNA se pueden utilizar como agentes antisentido o antígenos para la modulación específica de la secuencia de la expresión génica, por ejemplo, induciendo la detención de la transcripción o de la traducción o inhibiendo la replicación. Los PNA pueden ser usados también, por ejemplo, en el análisis de las mutaciones de los pares de bases sencillos en un gen, por ejemplo, empalmando los PNA por PCR dirigido; como enzimas de restricción artificiales cuando se utilizan en combinación con otras enzimas, por ejemplo, las nucleasas S1(Hyrup (1996), ver más arriba; o como sondas o iniciadores para la secuencia de ADN y para hibridación (Hyrup (1996), ver más arriba; Perry-O'Keefe y colaboradores (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675).
En otra modalidad, los PNA pueden ser modificados, por ejemplo para mejorar su estabilidad o incorporación celular, uniendo grupos lipofílicos u otros auxiliares a PNA, por medio de la formación de quimeras de PNA-ADN, o más preferiblemente, por medio del uso de lipopoliaminas como agentes de transfección para formar complejo con los PNA antes de asociarse con las microesferas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden generar las quimeras de PNA-ADN que pueden combinar las ventajosas propiedades del PNA y del ADN. Tales quimeras permiten que las enzimas de reconocimiento del ADN, por ejemplo, la ARNasa H y las ADN polimerasas, interactúen con la porción de ADN mientras que la porción del PNA proveería alta afinidad y especificidad de enlazamiento. Las quimeras de PNA-ADN se pueden enlazar utilizando enlazadores de longitudes apropiadas seleccionados en términos del apilamiento de las bases, del número de enlaces entre las bases nucleótidas, y de la orientación (Hyrup (1996), ver más arriba). La síntesis de quimeras de PNA-ADN se puede formar como se describe en Hyrup (1996), ver más arriba, y Finn (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357-63. Por ejemplo, una cadena de AND puede ser sintetizada sobre un soporte sólido utilizando química estándar de acoplamiento de fosforamidita y análogos modificados de nucleósido. Se pueden utilizar compuestos tales como 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxi-timidina fosforamidita como enlace entre el PNA y el extremo 5' del ADN (Mag y colaboradores (1989) Nucleic Acids Res. 17: 5973-88). Los monómeros del PNA se acoplan luego en forma de etapas para producir una molécula quimérica con un segmento 5' de PNA y un segmento 3' de ADN (Finn y colaboradores (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357-63). Alternativamente, las moléculas quiméricas se pueden sintetizar con un segmento 5' de ADN y un segmento 3' de PNA (Peterser y colaboradores (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).
En otras modalidades, los oligonucleótidos pueden incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ejemplo, por receptores objetivo de células huésped in vivo), o agentes que faciliten el transporte a través de las membranas celulares (ver, por ejemplo, Letsinger y colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556; Lemaitre y colaboradores (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; Publicación PCT No. W0 88/09810) o la barrera sanguínea del cerebro (ver, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 89/10134). Además, se pueden modificar los oligonucleótidos con agentes de escisión activados por hibridación (ver, por ejemplo, Krol y colaboradores (1988) Bio/Techniques 6: 958-976) o por agentes de intercalación (ver, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5: 539-549). Con este propósito, se pueden conjugar los oligonucleótidos con otra molécula, por ejemplo, un péptido, un agente de entrelazamiento activado por hibridación, un agente de transporte, un agente de escisión activado por hibridación, etc., antes de o alternativamente después, de la asociación con el agente de transfección de lipoliamina y las microesferas de la presente invención.
4.10 Embolización Activa por Suministro de Droga y Terapia Génica
Un aspecto de la presente invención es la administración de drogas, vacunas, y agentes de diagnóstico o de imagenología a un mamífero utilizando microesferas. Desde luego, esta modalidad no requiere necesariamente del uso de un agente de transfección. Sin embargo, tal agente es opcional debido a su habilidad para asociarse con la microesfera y al agente bioactivo, esto es, actuar como un enlazador o su habilidad para mejorar la endocitosis.
En un aspecto de la presente invención se proveen métodos para embolización de un vaso sanguíneo, que comprenden la etapa de suministrar dentro del vaso una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo, para ocluir en forma efectiva al vaso sanguíneo. Las cantidades terapéuticamente efectivas adecuadas para ocluir un vaso sanguíneo se pueden determinar fácilmente a través de lo divulgado aquí anteriormente. En una modalidad particularmente preferida, la composición de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo es suministrada a un vaso sanguíneo que nutre a un tumor.
En resumen, existe una cantidad de situaciones clínicas (por ejemplo, sangrado, desarrollo de un tumor) en donde es deseable reducir o eliminar el suministro de sangre a un órgano o región. Como se describe con más detalle más adelante, esto se puede lograr por medio de la inyección de composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención dentro de un vaso sanguíneo deseado a través de una aguja o catéter posicionado en forma selectiva. La composición viaja a través del torrente sanguíneo hasta que queda acuñada en la vasculatura, ocluyendo así físicamente (o químicamente) al vaso sanguíneo. El flujo sanguíneo reducido o eliminado del área seleccionada resulta en un infarto (muerte celular debida a un suministro inadecuado de oxígeno y de nutrientes) o en una pérdida reducida de sangre a partir de un vaso dañado.
Para el uso en una terapia de embolización, las composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención son preferiblemente no tóxicas, trombogénicas, fáciles de inyectar a través de catéteres vasculares, opacas a la radiación, de efecto rápido y permanente, estériles, y fácilmente disponibles en diferentes formas o tamaños al momento del procedimiento. Además, las composiciones resultan preferiblemente en la liberación lenta (idealmente, durante un período de varias semanas o meses) del factor terapéutico bioactivo. Las composiciones particularmente preferidas del factor terapéutico bioactivo deben tener un tamaño predecible de 15-200 \mum después de ser inyectadas en el sistema vascular. Preferiblemente, ellas no deben aglutinarse en partículas más grandes ni en solución ni una vez inyectadas. Además las composiciones preferiblemente no deben cambiar sus propiedades físicas durante el almacenamiento antes de ser utilizadas.
La terapia de embolización de la presente invención puede ser utilizada en al menos tres formas principales para ayudar en el manejo de neoplasmas: (1) tratamiento definitivo de tumores (usualmente benignos); (2) para embolización preparativa; y (3) para embolización paliativa. En resumen los tumores benignos pueden ser tratados algunas veces exitosamente por medio únicamente de la terapia de embolización. Los ejemplos de tales tumores incluyen tumores sencillos de origen vascular (por ejemplo, hemangiomas), tumores endocrinos tales como los adenomas paratiroideos, y los tumores benignos de hueso.
Para otros tumores, (por ejemplo, adenocarcinoma renal) se puede emplear embolización preoperatoria, horas o días antes de la resección quirúrgica con el propósito de reducir la pérdida operativa de sangre, acortar la duración de la operación, y reducir el riesgo de diseminación de células malignas viables por la manipulación quirúrgica del tumor. Muchos tumores pueden ser exitosamente embolizados en etapa preoperatoria, incluyendo por ejemplo a los tumores nasofaríngeos, los tumores de glomus en la yugular, meningiomas, quimiodectomas, y neuromas vagales.
La embolización puede ser utilizada también como una forma primaria de tratamiento para malignidades que no son operables, con el propósito de extender el tiempo de vida de los pacientes con enfermedad avanzada. La embolización puede producir una marcada mejoría en la calidad de vida de los pacientes con tumores malignos, aliviando los síntomas desagradables tales como el sangrado, la obstrucción venosa y la compresión traqueal. El beneficio más grande de la embolización paliativa del tumor, sin embargo, puede ser observado en pacientes que sufren de los efectos humorales de los tumores endocrinos malignos, en donde la metástasis de los tumores carcinoides y otros neoplasmas endocrinos tales como los insulinomas y los glucagonomas pueden ser de crecimiento lento, y causar aún todavía gran angustia en virtud de los síndromes endocrinos que ellos producen.
En general, la terapia de embolización que utiliza las composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención se lleva a cabo típicamente en una forma similar, independientemente del sitio. En resumen, se lleva a cabo primero la angiografía del área que va a ser embolizada por medio de la inyección de un agente de contraste opaco a la radiación a través de un catéter insertado en una arteria o en una vena como se toma por rayos X. Se puede insertar el catéter ya sea en forma percutánea o por medio de cirugía. El vaso sanguíneo es luego embolizado por reflujo de la composición de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención a través del catéter, hasta que se observa que cesa el flujo. Se puede confirmar la oclusión repitiendo el angiograma.
La terapia de embolización generalmente resulta en la distribución de composiciones que contienen a los factores terapéuticos bioactivos a través de los intersticios del tumor o de la masa vascular que va a ser tratada. El volumen físico de las partículas embólicas que obstruyen el lumen arterial resulta en la oclusión del suministro sanguíneo. Además de este efecto, la presencia de un(os) factor(es) terapéutico(s) bioactivo(s) evita la formación de nuevos vasos sanguíneos que irriguen al tumor o a la masa vascular, mejorando el efecto que quita vitalidad de cortar el suministro sanguíneo.
Por lo tanto, debe ser evidente que se pueden embolizar una gran variedad de tumores utilizando una composición de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención. En resumen, los tumores se dividen típicamente en dos clases: los benignos y los malignos. En un tumor benigno las células retienen sus características diferenciadas y no se dividen de una forma completamente incontrolada. Además, el tumor está localizado y no produce metástasis. En un tumor maligno, las células se vuelven no diferenciadas, no responden al crecimiento corporal y a las señales hormonales, y se multiplican en una forma descontrolada; el tumor es invasivo y capaz de diseminarse hasta sitios distantes (por metástasis).
En un aspecto de la presente invención, se puede tratar la metástasis (tumores secundarios) del hígado utilizando terapia de embolización. En resumen, se inserta un catéter a través de la arteria femoral o braquial y se la hace avanzar dentro de la arteria hepática direccionándolo a través del sistema arterial bajo guía fluoroscópica. El catéter avanza dentro del árbol hepático arterial tanto como sea necesario para permitir el bloqueo completo de los vasos sanguíneos que alimentan al (los) tumor(es), mientras se evita en la medida de lo posible a las ramificaciones arteriales que abastecen a las estructuras normales. Idealmente, ésta será una ramificación segmentaria de la arteria hepática, pero podría ser que la arteria hepática entera alejada del origen de la arteria gastroduodenal, o aún de múltiples arterias separadas, necesite ser bloqueada dependiendo del tamaño del tumor y de su suministro individual de sangre. Una vez que se logra posicionar adecuadamente el catéter, se emboliza la arteria por medio de la inyección de las composiciones terapéuticas antiangiogénicas a través del catéter arterial hasta que cesa el flujo en la arteria que va a ser bloqueada, preferiblemente aún después de observación durante 5 minutos. La oclusión de la arteria se puede confirmar inyectando un medio de contraste que sea opaco a la radiación a través del catéter y demostrando por medio de fluoroscopía o de una película de rayos X que el vaso que previamente se llenó con el medio de contraste ya no lo está. Se puede repetir el mismo procedimiento con cada una de las arterias de alimentación que son
ocluidas.
En otro aspecto de la presente invención, se puede utilizar la terapia de embolización terapéuticamente activa durante una cirugía para remover un tumor o una masa vascular o un órgano canceroso. Adicionalmente, otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de una terapia de embolización terapéuticamente activa para evitar o disminuir la metástasis.
Como se observó anteriormente, tanto los tumores benignos como malignos se pueden embolizar utilizando composiciones terapéuticas antiangiogénicas de la presente invención. Los ejemplos representativos de los tumores hepáticos benignos incluyen al adenoma hepatocelular, al hemangioma cavernoso, y a la hiperplasia nodular focal. Otros tumores benignos, que son más raros y a menudo no tiene manifestaciones clínicas, pueden también ser tratados. Estos incluyen a los adenomas del ducto biliar, a los cistadenomas del ducto biliar, fibromas, lipomas, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, e hiperplasia regenerativa nodular.
Los tumores hepáticos malignos se subdividen generalmente en dos categorías: primarios y secundarios. Los tumores primarios surgen directamente del tejido en el cual se encuentran. Por lo tanto, un tumor primario de hígado se deriva originalmente de las células que integran el tejido del hígado (tales como las células hepatocitos y las células biliares). Ejemplos representativos de las malignidades hepáticas primarias que pueden ser tratadas por medio de embolización arterial incluyen al carcinoma hepatocelular, al colangiocarcinoma, al angiosarcoma, al cistadenocarcinoma, al carcinoma de células escamosas, y al hepatoblastoma.
Un tumor secundario, o metástasis, es un tumor que se origina en otra parte en el organismo pero que se ha esparcido posteriormente hasta un órgano distante. Las rutas comunes para la metástasis son el crecimiento directo dentro de estructuras adyacentes, la difusión a través de los sistemas vascular o linfático, y la localización a lo largo de los planos del tejido y de los espacios corporales (fluido peritoneal, fluido cerebroespinal, etc.). Los tumores hepáticos secundarios son una de las causas más comunes de muerte en pacientes con cáncer y son de lejos la forma más común de tumor en el hígado. Aunque virtualmente cualquier malignidad puede hacer metástasis en el hígado, los tumores que más probablemente se esparcen hacia el hígado incluyen: cáncer de estómago, de colon y de páncreas; melanoma; tumores de pulmón, de orofaringe, y de vejiga; linfoma de Hodgkin y que no es de Hodgkin; tumores de seno, de ovario, y de próstata. Cada uno de los tumores primarios anteriormente mencionados tiene numerosos tipos diferentes de tumores que pueden ser tratados por embolización arterial (por ejemplo, sin limitación, hay reportados más de 32 diferentes de cáncer de ovario).
Como se observó anteriormente, la terapia de embolización que utiliza composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención se puede aplicar también a una variedad de otras situaciones clínicas en donde se desea ocluir vasos sanguíneos. En otro aspecto de la presente invención, se puede tratar una malformación arteriovenosa por medio de la administración de una de las composiciones de las microesferas anteriormente descritas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo. En resumen, las malformaciones arteriovenosas (malformaciones vasculares) se refieren a un grupo de enfermedades en donde al menos se presenta una (y más típicamente, muchas) de las comunicaciones anormales entre arterias y venas, resultando en una masa local de tipo tumoral compuesta predominantemente de vasos sanguíneos. Tal enfermedad puede ser congénita o adquirida.
En una modalidad de la invención, una malformación arteriovenosa puede ser tratada por medio de la inserción de un catéter a través de la arteria femoral o de la arteria branquial, y avanzando dentro de la arteria alimentadora bajo guía fluoroscópica. El catéter avanza preferiblemente tanto como sea necesario para permitir el bloqueo completo de los vasos sanguíneos que alimentan la malformación vascular, mientras se evita en la medida de lo posible a las ramificaciones arteriales que abastecen a las estructuras normales (idealmente ésta será una arteria única, pero más a menudo arterias múltiples separadas pueden necesitar ser ocluidas, dependiendo del tamaño de la malformación vascular y de su suministro individual de sangre). Una vez se logra el posicionamiento deseado del catéter, cada arteria puede ser embolizada utilizando las composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención.
En otro aspecto de la invención, se puede llevar a cabo la embolización con el propósito de tratar condiciones de excesivo sangrado. Por ejemplo, la menorragia (sangrado excesivo con la menstruación) puede ser tratada fácilmente por embolización de las arterias uterinas. En resumen, las arterias uterinas son ramificaciones de las arterias iliacas internas bilaterales. En una modalidad de la invención, se puede insertar un catéter a través de la arteria femoral o de la arteria braquial, y hacerla avanzar dentro de cada arteria uterina dirigiéndola a través del sistema arterial con una guía fluoroscópica. El catéter debe avanzar lo necesario para permitir el bloqueo completo de los vasos sanguíneos que van hacia el útero, mientras se evita en la medida de lo posible a las ramificaciones arteriales que surgen de la arteria uterina y se abastece a las estructuras normales. Idealmente, se puede embolizar a una arteria uterina sencilla en cada lado, pero ocasionalmente muchas arterias separadas pueden requerir del bloqueo dependiendo del suministro sanguíneo individual. Una vez que se lleva a cabo el posicionamiento deseado del catéter, se puede embolizar cada arteria por medio de la administración de las composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo como se describió anteriormente.
De igual modo, se puede llevar a cabo la embolización arterial en una variedad de condiciones diferentes, incluyendo por ejemplo, sin limitación, sangrado agudo, anormalidades vasculares, trastornos del sistema nervioso central, e hiperesplenismo.
4.10.1 Embolización Activa con Terapia Genética
Como se observó anteriormente, la terapia de embolización que utiliza a las composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención se puede llevar a cabo también en una variedad de otras situaciones clínicas en donde se desea ocluir simultáneamente vasos sanguíneos y administrar terapia génica a un paciente que la requiera.
En un aspecto preferido de la presente invención, se proveen composiciones que contienen (a) un factor terapéutico bioactivo, (b) un portador polimérico, y (c) un agente de transfección.
En otro aspecto preferido de la presente invención, se proveen composiciones que contienen (a) un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, (b) un portador polimérico, y (c) un agente de transfección.
En un aspecto más preferido de la invención, se proveen composiciones que contienen (a) un polinucleótido de codifica a un factor terapéutico bioactivo, (b) una microesfera entrelazada en forma catiónica, y (c) un agente de transfección de lipopoliamina.
En este aspecto más preferido de la invención, se proveen composiciones que contienen (a) un polinucleótido de codifica a un factor terapéutico bioactivo, (b) una microesfera entrelazada en forma catiónica, y (c) un agente de transfección de lipopoliamina, en donde el polinucleótido comprende a un ARN y a un ADN, ya sea de origen natural o sintético, incluyendo ARN y ADN recombinantes y ARN y ADN antisentido; ARN cabeza de martillo, ribozimas, ácidos nucleicos antigénicos, ARN y ADN tanto monocatenarios como bicatenarios y análogos de los mismos; en donde el factor terapéutico bioactivo comprende agentes antineoplásicos, hormonas y esteroides, vitaminas, péptidos y análogos de péptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, vacunas, enzimas, agentes antialergénicos, drogas para la circulación, agentes antituberculosos, agentes antivirales, agentes antianginales, agentes antiprotozoarios, agentes antirreumáticos, narcóticos, agentes glicósidos cardíacos, sedantes, agentes anestésicos locales, y agentes anestésicos en general; en donde las microesferas entrelazadas en forma catiónica se basan en polímeros entrelazados no tóxicos, biocompatibles, ya sea hinchables o no hinchables, sustancialmente esféricos, hidrofílicos, inertes, iónicos de un tamaño suficiente para embolizar y liberar al factor terapéutico bioactivo y en donde las microesferas entrelazadas en forma catiónica son preferiblemente polímeros que se seleccionan del grupo que consiste de polímero acrilato de sodio, polímeros de acrilamida y derivados de acrilamida, copolímero de acrilato de sodio y alcohol vinílico, productos de saponificación del copolímero de acetato de vinilo y del éster del ácido acrílico, copolímero de acetato de vinilo y del éster del ácido acrílico, copolímero de acelato de vinilo y maleato de metilo, copolímero entrelazado de isobutileno-anhídrido maléico, copolímero de la mezcla almidón-acronitrilo y sus productos de saponificación, polímero de poliacrilato de sodio entrelazado, y óxido de polietileno entrelazado; y en donde los ejemplos preferidos de los agentes de transfección adecuados incluyen, sin limitación, lipopoliaminas, y polietilenimina (PEI). Los agentes de transfección particularmente preferidos de la presente invención comprenden lipopoliaminas de fórmula general (I) como se divulga en la Patente Estadounidense No. 5.171.678, expedida a Behr y colaboradores, diciembre 19 de 1995 y la Patente Estadounidense No. 5.616.745, expedida a Behr y colaboradores, abril 1 de 1997.
Dentro de las modalidades preferida y la más preferida divulgadas aquí de la presente invención, el factor terapéutico bioactivo está físicamente asociado con el agente de transfección para formar un complejo y el complejo del factor terapéutico bioactivo-agente de transfección está entonces físicamente asociado con el portador polimérico. El factor terapéutico bioactivo está preferiblemente adsorbido por medio de fuerzas de asociación que son bien conocidas en cromatografía líquida de adsorción, incluyendo fuerzas de asociación tales como, sin limitación, intercambio iónico, hidrofobicidad, reconocimiento molecular o combinaciones de los mismos. El factor terapéutico bioactivo seleccionado se mezcla con el agente de transfección y el agente de transfección imparte propiedades específicas al factor terapéutico bioactivo-agente de transfección, tales como una mayor hidrofobicidad. La microesfera que comprende al material de embolización (por ejemplo, Embosphere®) se mezcla junto con una cantidad suficiente de un factor terapéutico bioactivo transfectable, con la asociación física entre el factor terapéutico bioactivo transfectable y el material embólico siendo el resultado de asociaciones iónicas e hidrófobas que pueden ser mejoradas adicionalmente por medio de la adición de sales tales como, por ejemplo, sin limitación, cloruro de sodio.
En las modalidades preferida y más preferida divulgadas aquí de la presente invención, los complejos del factor terapéutico bioactivo-agente de transfección que están adsorbidos sobre, o asociados con, la superficie del material embólico son progresivamente desorbidos y suministrados dentro de las células que se encuentran a su alrededor por medio de una variedad de mecanismos que incluyen, por ejemplo, sin limitación, endocitosis espontánea, endocitosis mediada por el receptor, endosomolisis, y desestabilización de la membrana celular o combinaciones de los mismos. La desorción del factor terapéutico bioactivo es inducida por los componentes naturales de los líquidos biológicos que sirven para debilitar la fuerza de la adsorción entre el material embólico y el factor terapéutico bioactivo hasta que se logra la desorción total de éste último.
En otro aspecto de la presente invención, se proveen métodos para la embolización de los vasos sanguíneos en enfermedades tumorigénicas, que dependen de angiogénesis, que comprenden el suministro al vaso sanguíneo de un paciente que requiera del mismo, de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene a un polinucleótido que codifica a un factor bioactivo asociado con un agente de transfección en donde dicho polinucleótido que codifica a un factor bioactivo asociado con un agente de transfección está asociado además con una microesfera, para que el vaso sanguíneo sea efectivamente ocluido y se mejore la enfermedad tumorigénica que depende de la angiogénesis.
4.11 Imágenes de Diagnóstico
Como se discutió anteriormente, la composición de las microesferas con el agente de transfección que incluye al factor terapéutico bioactivo de la presente invención puede ser utilizada junto con imágenes de diagnóstico, imágenes terapéuticas y el suministro terapéutico de droga, que incluye, por ejemplo, ultrasonido (US), imágenes de resonancia magnética (I), resonancia magnética nuclear (RMN), tomografía computarizada (TC), resonancia de espín electrónico (REE), imágenes de medicina nuclear, imágenes de óptica, elastografía, suministro de drogas con ultrasonido, radiofrecuencia (RF) y láser de microondas. Los vehículos de suministro y los materiales de estabilización de la presente invención pueden ser utilizados en combinación con diferentes agentes de contraste, incluyendo agentes convencionales de contraste, que pueden servir para incrementar su efectividad como agentes de contraste para las imágenes de diagnóstico y terapéuticas.
Los ejemplos de agentes adecuados de contraste para uso en combinación con los materiales actuales de estabilización incluyen, por ejemplo, radicales libres estables, tales como, nitróxidos estables, así como compuestos que comprenden elementos de transición lantánidos y actínidos, que pueden, si se desea, estar en la forma de una sal o pueden estar enlazados en forma covalente o no covalente con los agentes de complejación, incluyendo a los derivados lipofílicos de los mismos, o a macromoléculas proteináceas. Los elementos de transición preferibles, lantánidos y actínidos incluyen, por ejemplo, Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(II), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) y Dy(III). Más preferiblemente, los elementos pueden ser Gd(III), Mn(II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Eu(III) y Dy(III), lo más preferible Mn(II) y Gd(III). Los elementos anteriores pueden esta en la forma de una sal, incluidas las sales inorgánicas, tales como una sal de manganeso, por ejemplo, cloruro de manganeso, carbonato de manganeso, acetato de manganeso, y sales orgánicas, tales como gluconato de manganeso e hidroxilapatita de manganeso. Otros ejemplos de sales incluyen sales de hierro, tales como sulfuros de hierro, y sales férricas, tales como cloruro férrico.
Los elementos anteriores se pueden enlazar también, por ejemplo, a través de asociación covalente o no covalente, con agentes complejantes, incluidos los derivados lipofílicos de los mismos, o con macromoléculas proteináceas. Los agentes complejantes preferibles incluyen, por ejemplo, al ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), al ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), al ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N,N''-tetraacético (DOTA), al ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N''-triacético (DOTA), al ácido 3,6,9-triaza-12-oxa-3,6,9-tricarboximetilen-10-carboxi-13-feniltridecanoico (B-19036), al ácido hidroxibenciletilenediamino diacético (HBED), a la N,N'-bis(piridoxil-5-fosfato)etilen diamina, N,N'-diacetato (DPDP), al ácido 1,4,7-triazaciclononan-N,N',N''-triacético (NOTA), al ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N'',N'''-tetraacético (TETA), criptandos (complejos macrocíclicos), y desferrioxamina. Más preferiblemente, los agentes complejantes son EDTA, DTPA, DOTA, DO3A y criptandos, lo más preferible DTPA. Los complejos lipofílicos preferibles incluyen derivados alquilados de los agentes complejantes EDTA, DOTA, por ejemplo, N,N-bis-(carboxidecilamidometil-N-2,3-dihidroxipropil) etilendiamina-N,N'-diacetato (EDTA-DDP); N,N'-bis-(carboxioctadecilamidometil-N-2,3-dihidroxipropil)etilenediamina-N,N'-diacetato (EDTA-ODP); y N,N'-Bis (carboxi-laurilamidometil-N-2,3-dihidroxipropil)etilendiamino-N,N'-diacetato (EDTA-LDP); incluyendo aquellos descritos en la Patente Estadounidense No. 5.312.617, cuya divulgación se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Las macromoléculas proteináceas preferibles incluyen, por ejemplo, albúmina, colágeno, poliarginina, polilisina, polihistidina, \gamma-globulina and \beta-globulina, siendo la albúmina, la poliarginina, la polilisina, y la polihistidina los más preferidos. Por lo tanto los complejos adecuados incluyen Mn(II)-DTPA, Mn(II)-EDTA, Mn(II)-DOTA, Mn(II)-DO3A, Mn(II)-criptandos, Gd(III)-DTPA, Gd(III)-DOTA, Gd(III)-DO3A, Gd(III)-criptandos, Cr(III)-EDTA, Cu(II)-EDTA, o desferrioxamina férrica, más preferiblemente Mn(II)-DTPA o Gd(III)-DTPA.
Los nitróxidos son agentes paramagnéticos de contraste que incrementan las velocidades de relajación tanto de T1 como de T2 sobre MRI en virtud de la presencia de un electrón desapareado en la molécula de nitróxido. Como es sabido por alguien normalmente capacitado en el arte, la efectividad paramagnética de un compuesto dado como un agente de contraste MRI puede estar relacionada, al menos en parte, con el número de electrones desapareados en el núcleo paramagnético o la molécula, y específicamente, con el cuadrado del número de electrones desapareados. Por ejemplo, el gadolinio tiene siete electrones desapareados mientras que una molécula de nitróxido tiene un electrón desapareado. De esta forma, el gadolinio es generalmente un agente de contraste MRI mucho más fuerte que un nitróxido. Sin embargo, el tiempo de correlación efectivo, otro parámetro importante para evaluar la efectividad de los agentes de contraste, confiere una mayor relaxividad potencial a los nitróxidos. Cuando se hace más lenta la velocidad de caída, por ejemplo, uniendo el contraste paramagnético a una molécula mayor, caerá más lentamente y por lo tanto transferirá más efectivamente la energía para acelerar la relajación de los protones del agua. En el gadolinio, sin embargo, el tiempo de relajación del espín del electrón es rápido y limitará el grado en el cual los tiempos de correlación rotacional lentos pueden incrementar la relaxividad. Para los nitróxidos, sin embargo, los tiempos de correlación del espín del electrón son más favorables y se pueden alcanzar tremendos incrementos en relaxividad disminuyendo el tiempo de correlación rotacional de estas moléculas. Aunque no se pretende estar ligado por ninguna teoría en particular de operación, se propone que ya que los nitróxidos pueden ser diseñados para recubrir los perímetros de las microesferas, por ejemplo, elaborando derivados de alquilo de los mismos, se pueden optimizar los tiempos de correlación resultantes. Además, el medio de contraste resultante de la presente invención se puede visualizar como una esfera magnética, una configuración geométrica que maximiza la relaxividad.
Los ejemplos de agentes de contraste superparamagnéticos adecuados para ser utilizados en las composiciones de la presente invención incluyen óxidos metálicos y sulfuros que experimentan un dominio magnético, compuestos ferro o ferrimagnéticos, tales como hierro puro, óxido de hierro magnético, tal como magnetita, \gamma-Fe_{2}O_{3}, Fe_{3}O_{4}, ferrita de manganeso, ferrita de cobalto y ferrita de níquel. Se pueden emplear entonces imágenes de RM del cuerpo completo para evaluar rápidamente el organismo, por ejemplo, por una trombosis, y se puede aplicar ultrasonido, si se desea, para ayudar en la trombólisis.
Los agentes de contraste, tales como los agentes de contraste paramagnéticos y superparamagnéticos descritos anteriormente, pueden ser empleados como un componente dentro de las microesferas y/o los materiales de estabilización. Con respecto a las vesículas, los agentes de contraste pueden ser atrapados dentro del hueco de las mismas, administrados como una solución con las microesferas, incorporados con cualquiera de los materiales adicionales de estabilización, o recubiertos sobre la superficie o membrana de la vesícula. Se puede utilizar mezclas de uno o más bien los agentes paramagnéticos y/o de los agentes superparamagnéticos en las composiciones actuales. Los agentes paramagnéticos y superparamagnéticos puede ser también coadministrados separadamente, si se desea.
Si se desea, los agentes paramagnéticos y superparamagnéticos se puede suministrar como derivados alquilados u otros derivados incorporados en las composiciones, especialmente en las paredes lipídicas de las microesferas. En particular, los nitróxidos 2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi, radical libre, y 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi, radical libre, pueden formar aductos con ácidos grasos de cadena larga en las posiciones del anillo que no están ocupadas por los grupos metilo a través de una variedad de enlaces, que incluyen, por ejemplo, un enlace acetiloxi. Tales aductos son muy fáciles de incorporar dentro de las composiciones de las microesferas con el agente de transfección que incluyen al factor terapéutico bioactivo de la presente invención.
Los materiales de estabilización y/o las microesferas de la presente invención, y especialmente las microesferas, pueden servir no únicamente como portadores efectivos de los agentes superparamagnéticos descritos anteriormente, sino que también pueden mejorar el efecto de la susceptibilidad de los agentes de contraste. Los agentes de contraste superparamagnéticos incluyen óxidos metálicos, particularmente óxidos de hierro pero incluyen óxidos de manganeso, y como óxidos de hierro, contienen diferentes cantidades de manganeso, cobalto y níquel que experimentan un dominio magnético. Estos agentes son nano o microesferas y tienen susceptibilidades muy altas de masa y velocidades de relajación transversal. Las partículas más grandes, por ejemplo, las partículas que tienen diámetros aproximadamente de 100 nm, tienen relaxividades mucho más altas de R_{2} comparadas con las relaxividades de R_{1}. Las partículas más pequeñas, por ejemplo, las partículas que tienen diámetros aproximadamente de 10 hasta aproximadamente 15 nm, tienen relaxividades algo inferiores de R_{2}, pero valores mucho más balanceados de R_{1} y R_{2}. Las partículas mucho más pequeñas, por ejemplo, las partículas monocristalinas de óxido de hierro que tienen diámetros aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5 nm, tienen relaxividades menores de R_{2}, pero probablemente las velocidades de relajación más balanceadas de R_{1} y R_{2}. La ferritina puede ser formulada también para encapsular un núcleo de hierro superparamagnético de muy alta velocidad de relajación.
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Los óxidos de hierro pueden simplemente ser incorporados dentro de los materiales de estabilización y/o las microesferas. Preferiblemente, en el caso de las microesferas formuladas a partir de lípidos, se pueden incorporar los óxidos de hierro dentro de las paredes de las microesferas, por ejemplo, por medio de adsorción sobre las superficies de las microesferas, o atrapados dentro del interior de las microesferas.
4.12 Formulaciones Farmacéuticas
Formulaciones Terapéuticas: Sales de polinucleótidos: la administración de sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos descritos aquí está incluida dentro del alcance de la invención. Tales sales pueden ser preparadas a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables que incluyen bases orgánicas y bases inorgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminoácidos básicos, y similares. Para una discusión útil de las sales farmacéuticas, ver, S. M. Berge y colaboradores, Journal of Pharmaceutical Sciences 66: 1-19 (1977).
Los polinucleótidos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos, mezclados o asociados con un agente de transfección adecuado de la presente invención conjugados con una micropartícula adecuada para inyección pueden ser preparados en forma de dosis unitarias en ampolletas, o en contenedores para dosis múltiples. Los polinucleótidos pueden estar presentes en formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos aceitosos o preferiblemente acosos. Alternativamente, la sal del polinucleótido puede estar en forma liofilizada para reconstitución, en el momento de suministrarla, con un vehículo adecuado, tal como el agua estéril libre de pirógenos. Tanto las formas líquidas como las liofilizadas que deben ser reconstituidas contendrán agentes, preferiblemente amortiguadores, en cantidades necesarias para ajustar adecuadamente el pH de la solución inyectada. Para cualquier uso parenteral, particularmente si la formulación se va a administrar en forma intravenosa, la concentración total de los solutos debe ser controlada para elaborar la preparación en forma isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica. Se prefieren materiales no iónicos, tales como azúcares para ajustar la tonicidad, y se prefiere particularmente la sacarosa. Cualquiera de estas formas puede contener además agentes adecuados para la formulación, tales como almidón o azúcar, glicerol o solución salina. La composición por dosis unitaria, ya sea líquida o sólida, puede contener de 0,1% a 99% de material polinucleótido.
Las ampolletas para dosis unitarias o los contenedores para dosis múltiples, en los cuales los polinucleótidos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos, mezclados o asociados con un agente de transfección adecuado de la presente invención, conjugados con una micropartícula son empacados antes de ser utilizados, muchos contienen un contenedor herméticamente sellado que incluye una cantidad de polinucleótidos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos, mezclados o asociados con un agente de transfección adecuado de la presente invención conjugado con una micropartícula o solución que contiene polinucleótidos que codifican factores terapéuticos bioactivos, mezclados o asociados con un agente de transfección adecuado de la presente invención conjugado con una micropartícula adecuada a para una dosis terapéutica efectiva de la misma, o múltiples de una dosis efectiva. Los polinucleótidos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos, mezclados o asociados con un agente de transfección adecuado de la presente invención conjugado con una micropartícula se empacan como una formulación estéril, y el contenedor herméticamente sellado está diseñado para preservar la esterilidad de la formulación hasta su uso.
El contenedor en el cual los polinucleótidos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos, mezclados o asociados con un agente de transfección adecuado de la presente invención conjugado con una micropartícula son empacados se etiqueta, y las etiquetas muestran un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental, por ejemplo la Administración de Alimentos y Drogas, cuyo aviso refleja allí la aprobación por parte de la agencia bajo las leyes Federales, de la fabricación, el uso, o la venta de los polinucleótidos que codifican a los factores terapéuticos bioactivos, mezclados o asociados con un agente de transfección adecuado de la presente invención conjugado con una micropartícula para la administración a humanos. Las leyes Federales requieren que el uso de agentes farmacológicos en la terapia de humanos sea aprobado por una agencia Federal del gobierno. La responsabilidad por la observancia de la ley es de la Administración de Drogas y Alimentos, que emite las regulaciones apropiadas para garantizar tal aprobación, detallada en la 21 U.S.C. 301-392. La regulación para material biológico, que comprende a los productos elaborados a partir de los tejidos de animales es proveída bajo 42 U.S.C. \NAK 262. Se requieren aprobaciones similares para la mayoría de los países. Las regulaciones varían de país a país, pero los procedimientos individuales son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte.
Dosificación y Vía de Administración: La dosis que se debe administrar depende en gran medida de la condición y del tamaño del sujeto que está siendo tratado así como de la frecuencia del tratamiento y de la vía de administración. Los regímenes para una terapia continua, incluida la dosis y la frecuencia se pueden guiar por la respuesta inicial y el juicio clínico. Se prefiere la vía parenteral de inyección en el espacio intersticial de los tejidos, aunque se pueden requerir de otras vías parenterales, tales como la inhalación de una formulación en aerosol en una administración específica, como por ejemplo a las membranas mucosas de la nariz, la garganta, los tejidos bronquiales o los pulmones. En los protocolos preferidos, se inyecta una formulación que contiene al polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo, mezclado o asociado con un agente de transfección adecuado de la presente invención conjugado con una micropartícula en un vehículo acuoso, dentro de un tejido en cantidades desde 10 \mul por sitio hasta 1 ml por sitio. La concentración del polinucleótido que codifica al factor terapéutico bioactivo en la formulación es aproximadamente de 0,1 \mug/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml.
Las formulaciones preferidas para transfección de polinucleótidos y de péptidos en las células comprenden agentes catiónicos de transfección de lipopoliamina de la invención, ya sea con o sin una cantidad efectiva de una lisofosfatida para promoción de la transfección. La lisofosfatida puede tener un grupo neutro o negativo en la parte superior. Se prefieren a la lisofosfatidilcolina y a la lisofosfatidiletanolamina, y se prefiere particularmente a la 1-oleil lisofosfatidilcolina. Los lípidos lisofosfatídicos están presentes convenientemente en la formulación en una proporción molar de 0,5 del lisolípido con respecto al lípido catiónico. Las liso formas de lípidos catiónicos, seleccionadas de los nuevos lípidos catiónicos de la invención, DOTMA, o DOTAP pueden ser utilizadas también para incrementar la efectividad de la transfección. Estas liso formas están convenientemente presentes en cantidades efectivas aproximadamente hasta de un tercio del lípido catiónico total en las formulaciones de la microesfera de la presente invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proveen una composición de la microesfera, que comprende a un lípido catiónico de la invención, en donde el lípido catiónico se incorpora como el agente de transfección que se asocia con la composición del factor terapéutico bioactivo. Los lípidos de la composición de la microesfera pueden contener además una especie de lípido neutro seleccionado del grupo que consiste de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina, o colesterol. Una proporción molar preferida de especie catiónica con respecto al lípido neutro en estas formulaciones de la microesfera está alrededor de 9/1 hasta 1/9; se prefiere particularmente una proporción molar aproximadamente de 5/5. La formulación de la microesfera puede contener además un liso lípido seleccionado del grupo que consiste de lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, o una liso forma de una especie de lípido catiónico.
De acuerdo aún con otro aspecto de la invención, se proveen productos farmacéuticos que comprenden a las microesferas conjugadas con un factor terapéutico bioactivo por medio de uno cualquiera de los lípidos anfifílicos o catiónicos divulgados aquí junto con una cantidad farmacológicamente efectiva de un agente terapéutico adicional, tal como una droga terapéutica. Los lípidos anfifílicos o catiónicos presentes en estas composiciones facilitan el suministro intracelular de los factores terapéuticos bioactivos y/o del agente terapéutico activo adicional. Se proveen productos para uso tópico, enteral y parenteral. En un producto farmacéutico el agente terapéutico adicional es, por ejemplo, sin limitación, un esteroide; en otro, el agente terapéutico es, por ejemplo, sin limitación, un agente antiinflamatorio no esteroidal.
En otros productos farmacéuticos de la invención, el agente terapéutico adicional es un análogo de nucleósido antiviral o preferiblemente un derivado de lípido de un análogo de nucleósido antiviral, que es un derivado de fosfatidilo, o un derivado de difosfato diglicérido. El nucleósido antiviral puede ser un didesoxinucleósido, un dideshidronucleósido, un derivado halogenado o un derivado azido de un nucleósido, o un nucleósido acílico. En modalidades preferidas, los derivados de lípido de nucleósidos antivirales son (3'-azido-3'-desoxi)timidina-5'-difosfo-3-diacilglicerol (AZT difosfato de diglicérido) y didesoxitimidina difosfato diglicérido. En modalidades particularmente preferidas, el derivado de lípido de un nucleósido antiviral es aciclovir o ganciclovir difosfato de diglicérido o derivados difosfato diglicéridos de 1-(2-desoxi-2'-fluoro-1-beta-D-arabinofuranosil)-5-iodocitosina (FIAC) o 1(2'-desoxi-2'-fluoro-1-beta-D-arabinofuranosil)5-iodouracilo (FIAU).
4.13 Kits
La invención se relaciona además con empaques farmacéuticos y kits que comprenden uno o más contenedores llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la invención anteriormente mencionadas. Asociado(s)
con tal(es) contenedor(es) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uno o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, el uso o la venta del producto para administración en humanos. Los reactivos de cualquiera de los análisis o métodos descritos aquí pueden ser incluidos también como componentes de un kit.
En el formato de un kit, las perlas o las micropartículas comercialmente disponibles de la presente invención están presentes en una solución líquida fisiológicamente compatible con un agente de transfección y un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo de la presente invención, en donde los tres componentes están presentes en un vial. En otro formato de kit, una micropartícula comercialmente disponible de la presente invención puede estar disponible en un vial. El polinucleótido que codifica al factor terapéutico bioactivo asociado con un agente de transfección de la presente invención puede estar presente en otro vial, en donde la micropartícula es mezclada luego junto con el complejo del agente de transfección del polinucleótido. Finalmente, en otro formato de kit, las perlas o las microesferas comercialmente disponibles están presentes en una solución líquida fisiológicamente compatible en un vial. El agente de transfección comercialmente disponible puede estar presente en otro vial separado. El polinucleótido que codifica al factor terapéutico bioactivo de la presente invención puede estar presente en aún otro vial. Los tres componentes de los viales separados pueden combinarse entonces para formar la micropartícula con el polinucleótido que codifica al factor terapéutico bioactivo asociado con un agente de transfección de la invención.
En aún otro formato de kit, las perlas o las micropartículas de la presente invención están presentes en una solución líquida fisiológicamente compatible con un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo asociado con un agente de transfección que está en combinación con un agente reforzador de la transfección. En aún otro formato de kit, las perlas o las micropartículas de la presente invención están presentes en una solución líquida fisiológicamente compatible con un polinucleótido que codifica a un factor terapéutico bioactivo asociado con un agente de transfección que está en combinación con un reforzador para la absorción del agente terapéutico bioactivo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración.
5. Ejemplos Ejemplo 1
En un vaso de precipitados que contiene 100 ml de agua desmineralizada, se disuelven 58 g de cloruro de sodio y 27 g de acetato de sodio. Se añaden 400 ml de glicerol y luego se ajusta el pH entre 5,9 y 6,1. Luego se añaden 90 g de N-tris-hidroxi-metil metilacrilamida, 35 mg de dietilaminoetilacril-amida y 10 g de N,N-metilen-bis-acrilamida. Se calienta a 60-70ºC y se añaden 100 moles de una solución caliente de gelatina con una concentración 300 mg/ml. Se ajusta el volumen total de la mezcla hasta 980 ml por medio de la adición de agua caliente y luego se añaden 20 ml de una solución de 70 mg/ml de persulfato de amonio y 4 ml de N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina.
Esta solución se vierte en aceite de parafina a 50-70ºC con agitación. Después de unos pocos minutos, la reacción de polimerización de los monómeros acrílicos se manifiesta por medio de un incremento de temperatura. Las microesferas se recuperan entonces por medio de decantación, se lavan cuidadosamente, se tamizan y esterilizan en una autoclave en un medio amortiguado.
Esas microesferas, después de calibración por tamizado, poseen las características deseadas para embolización, incluyendo una marcada carga catiónica y un agente de adhesión efectivo (gelatina o colágeno desnaturalizado).
Ejemplo 2
Se sigue el procedimiento del Ejemplo 1, utilizando trietilaminoetil acrilamida en vez de dietilaminoetil acrilamida. Después de la recuperación de las esferas, se reticula la gelatina por medio de una solución al 25% de glutaraldehído (100 ml de todas las microesferas). El tratamiento se lleva a cabo agitando a 4ºC durante la noche. Este es seguido por un lavado con agua desmineralizada.
Ejemplos 3 y 4
Se sigue el procedimiento de los Ejemplos 1 y 2, reemplazando 10 g de N-tris-hidroximetil metilacrilamida con 10 g de ácido acrílico. Las microesferas obtenidas poseen alta capacidad de hinchamiento que se puede controlar por medio de solución salina y concentración iónica y del nivel del pH. Esas microesferas se utilizan convenientemente pensando en el usuario en el momento de la manipulación.
Ejemplos 5 y 6
Se sigue el procedimiento de los Ejemplos 1 y 2, reemplazando la N-tris-hidroximetil metilacrilamida con 10 g de N-acriloil hexametileno Procion Red HE-3B. Las microesferas obtenidas poseen un intenso color rojo debido al a integración de la coloración acrílica en el retículo del polímero. Esas microesferas se utilizan convenientemente pensando en el usuario en el momento de la manipulación.
Ejemplos 7 y 8
Cien mililitros de las microesferas obtenidas de acuerdo con los Ejemplo 1 a 4 se lavan con un amortiguador de borato 0,1 M de pH 8 y luego se suspenden en 50 ml de una solución de isotiocianato de rodamina en una concentración de 5 mg/ml. Se agita luego la suspensión al menos durante 15 horas, después de las cuales se lava con un amortiguador neutro hasta un sobrenadante incoloro.
Las microesferas fluorescentes coloreadas de color rojo se calibran luego y se esterilizan, y se pueden utilizar en terapia génica de embolización.
Ejemplos 9 y 10
Se sigue el procedimiento de los Ejemplos 1 a 4, reemplazando 10 g de N-tris-hidroximetil metilacrilamida con 10 g de un monómero opaco a los rayos X, ácido (acrilamido-3-propionamido)-3-triyodo-2,4,6-benzoico.
Las microesferas obtenidas poseen la propiedad de absorber los rayos X y son por lo tanto de interés particular en su seguimiento in vivo después del uso en la terapia génica de embolización.
Ejemplos 11 a 14
Se sigue el procedimiento de los Ejemplos 1 y 2, añadiendo a la solución inicial del monómero 5 g de un polímero lineal soluble opaco a la radiación, el poliácido acrilamino-3-triyodo 2,4,6-benzoico (Ejemplos 11 y 12) o el poliácido (acrilamino-3-propionamido)-3-triyodo-2,4,6-benzoico (Ejemplos 13 y 14).
Esos polímeros, que tiene un peso molecular que excede los 100.000 Daltons, se aprisionan en el retículo del polímero y, sin alterar las propiedades generales de las microesferas para las aplicaciones reivindicadas, hacen posible obtener una opacidad a la radiación que puede utilizarse para hacer seguimiento in vivo de la terapia génica de embolización.
Ejemplos 15 y 16
Se sigue el procedimiento de los Ejemplos 1 y 2, añadiendo a la solución inicial de monómero 200 g de sulfato de bario en polvo. Las microesferas obtenidas son opacas tanto a la luz visible como a los rayos X.
Ejemplos 17 y 18
Se sigue el procedimiento de los Ejemplos 1 y 2, añadiendo 50 mg de magnetita (Fe_{3}O_{4}) a la solución inicial del monómero.
Las microesferas obtenidas tienen la propiedad de ser detectadas en el conjunto de Imágenes de Resonancia Magnética (IRM).
Ejemplo 21 Preparación de una suspensión inyectable para ser utilizada en terapia génica de embolización
Una modalidad adicional de la invención comprende el uso de cualquiera de las microesferas de los Ejemplos 1 a 20 descritos más arriba y además la mezcla de la microesfera con un polinucleótido que codifica para el gen p53, bajo el control de un promotor adecuado, en donde el polinucleótido se asocia con un agente de transfección tal como Transfectam® (Biosphere Medical). Tales composiciones de microesfera/gen p53/Transfectam® son útiles en la embolización de las arteriolas y en el mejoramiento, y posterior eliminación de diferentes cánceres tales como, por ejemplo, de hígado, de riñón y pancreático.
Ejemplo 22 Preparación de una suspensión inyectable para ser utilizada en combinación con terapia génica de embolización y terapia de angiogénesis
Una modalidad adicional de la invención comprende el uso de cualquiera de las microesferas de los Ejemplos 1 a 20 descritas más arriba y además la mezcla de la microesfera con un agente antiangiogénesis codificado por un polinucleótido (bajo el control de un promotor adecuado) donde el polinucleótido se asocia con un agente de transfección tal como Transfectam® (Biosphere Medical). Tales composiciones de microesfera/agente antiangiogénesis/Transfectam® son útiles en la embolización combinada de las arteriolas de un cáncer y en la prevención posterior de angiogénesis para el mejoramiento, y la posterior eliminación de diferentes cánceres tales como, por ejemplo, cáncer de próstata.
Las modalidades de la presente invención descritas anteriormente pretenden ser únicamente ejemplos y aquellos capacitados en el arte reconocerán, o serán capaces de determinar únicamente a través del uso de experimentación de retina, numerosos equivalentes para los procedimientos específicos descritos aquí. Todos estos equivalentes se considera que se encuentran dentro del alcance de la presente invención y están cubiertos por las siguientes reivindicaciones.
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Referencias citadas en la descripción
Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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Claims (36)

1. Uso de una microesfera sustancialmente esférica para embolización activa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que depende de la angiogénesis por medio de embolización, en donde la microesfera comprende:
(a)
un polímero biocompatible e hidrofílico que contiene un polímero de acrilamida, de acrilato, o acrílico y
(b)
una droga y/o una vacuna,
y en donde el diámetro de la microesfera está en el rango entre 10 \mum y 2.000 \mum.
2. El uso como el reivindicado en la reivindicación 1, en donde el polímero es un polímero de acrilato de sodio, un copolímero derivado de acrilamida, copolímero de acrilato de sodio y alcohol vinílico, copolímero de acetato de vinilo y éster de ácido acrílico, polímero entrelazado de poliacrilato de sodio.
3. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polímero está entrelazado.
4. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polímero es un copolímero de acrilato de sodio y alcohol vinílico.
5. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la droga se selecciona el grupo que consiste de drogas antitumorales, drogas antiangiogénesis, drogas antimicóticas, drogas antivirales, drogas antiinflamatorias, drogas antibacteriales, y drogas antihistamínicas, drogas antineoplásicas, enzimas, agente antialergénico.
6. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la droga es una droga antineoplásica.
7. El uso como el reivindicado en la reivindicación 6, en donde la droga antineoplásica se selecciona el grupo que consiste de un compuesto de platino, adriamicina, mitomicina c, ansamitocina, bleomicina, citosina arabinósida, arabinosil adenina, mercaptopolilisina, vincristina, busulfán, clorambucil, melfalán, mercaptopurina, mitotano, procarbazina, dactinomicina, clorhidrato de daunorubicina, doxorubicina, plicamicina, aminoglutetimida, estramustina, flutamida, leuprolida, megestrol, tamoxifen, testolactona, trilostano, amsacrina, asparaginasa, Erwinia asparaginasa, etoposida, interferón \alpha-2a, interferón \alpha-2b, teniposida, vinblastina, metotrexato, carzelesina, activador plasminógeno del tejido, dexametasona y paclitaxel.
8. El uso como el reivindicado en la reivindicación 7, en donde el compuesto de platino es espiroplatina, cisplatina, o carboplatina.
9. El uso como el reivindicado en la reivindicación 7, en donde el melfalán es PAM, L-PAM, o mostaza de fenilalanina.
10. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el donde la droga es paclitaxel, cisplatina, mitocina c, tamoxifén, o doxorubicina.
11. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la droga recubre a la microesfera o está contenida dentro de la microesfera.
12. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la droga es adsorbida por la microesfera.
13. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la vacuna se selecciona del grupo que consiste de vacuna contra neumococo, vacuna contra la poliomielitis, vacuna contra el ántrax, vacuna contra la tuberculosis (BCG), vacuna contra la hepatitis A, vacuna contra el cólera, vacunas contra meningococo A, C, Y, vacuna contra W135, vacuna contra la plaga, vacuna contra la rabia (diploide humano), vacuna contra la fiebre amarilla, vacuna contra la encefalitis japonesa, vacuna contra la fiebre tifoidea (matado con fenol y calor), vacuna contra la hepatitis B, vacuna contra la difteria, vacuna contra el tétano, vacuna contra la pertussis, vacuna contra la H. influenzae tipo b, vacuna contra la polio, vacuna contra el sarampión, vacuna contra las paperas, vacuna contra la rubeola, vacuna contra la varicela, vacuna contra el estreptococo de la neumonía Ty (bacteria mutante viva), vacuna contra Vi (polisacárido capsular Vi), vacuna contra DT (toxoide), vacuna contra Td (toxoide), vacuna contra aP (antígeno bacteriano inactivo/accelular (DtaP)), vacuna contra Hib (conjugado bacteriano polisacárido-proteína), vacuna contra el virus de la hepatitis B (antígeno viral/antígeno recombinante derivado de suero inactivo), vacuna contra la influenza, vacuna contra el virus sincitial respiratorio (RSV), vacuna contra astrovirus humano, vacuna contra rotavirus, vacuna contra el virus de la influenza A y B humana, vacuna contra el virus de la hepatitis A, vacuna contra el virus tipo 3 de
la parainfluenza atenuada viva, vacunas contra enterovirus, vacunas contra retrovirus, y vacunas contra picornavirus.
14. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un agente para imágenes o un agente de contraste.
15. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además un marcador fluorescente, colorante químico, o un agente para imágenes de resonancia magnética.
16. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polímero comprende desde 0,5% hasta 20%, por peso molecular, de entrelazadores.
17. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el diámetro de la microesfera está en el rango entre 50 \mum y 300 \mum, o entre 40 \mum y 400 \mum, o entre 50 \mum y 200 \mum, o entre 70 \mum y 120 \mum.
18. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la microesfera se hincha antes de la inyección en un paciente o en donde la microesfera se hincha adicionalmente después de la inyección en un paciente.
19. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el material embólico es inyectable y comprende la microesfera y un portador biocompatible.
20. El uso como el reivindicado en la reivindicación 19, en donde el material embólico comprende la microesfera en una cantidad entre 10% y 90% en peso y al portador biocompatible en una cantidad entre 10% y 90% en peso, preferiblemente donde el material embólico comprende las microesferas en una cantidad entre 10% y 50% en peso y el portador biocompatible en una cantidad entre 50% y 90% en peso.
21. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, en donde las microesferas se suspenden en dicho portador biocompatible.
22. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en donde el portador biocompatible es:
(a)
una emulsión;
(b)
una solución orgánica;
(c)
una solución no acuosa;
(d)
una solución con base acuosa;
(e)
una solución hidro-orgánica, o
(f)
mezclas de los mismos.
23. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en donde el portador biocompatible comprende sales compuestas de cationes seleccionados del grupo que consiste de sodio, potasio, calcio, magnesio, hierro, cinc, y amonio en una cantidad entre 0,01 M y 5 M, previamente en donde la sal se suministra en forma de un agente de contraste.
24. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 19 a 23, en donde el agente de contraste es un ácido (acrilamido-3-propionamido)-3-triyodo-2,4,6-benzóico monomérico.
25. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la microesfera comprende además un anticuerpo objetivo.
26. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento es para ser inyectado en un área de un paciente que requiera del mismo.
27. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad que depende de la angiogénesis es un cáncer o un tumor.
28. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el cáncer es un cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de riñón, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de vejiga, tumores de cabeza, tumor de cuello, tumor de mama, sarcoma de Kaposi, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, sarcoma de Ewing, carcinoma trofoblástico gestacional, enfermedad de Hodgkin, linfoma que no es de Hodgkin, linfoma de Burkitts, linfoma de célula grande difusa, linfoma folicular mixto, linfoma linfoblástico, rabdomiosarcoma, carcinoma testicular, tumor de Wilms, carcinoma anal, carcinoma de vejiga, carcinoma de seno, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de célula peluda, carcinoma de cabeza y de cuello, carcinoma de pulmón de células pequeñas, mieloma múltiple, linfoma folicular, carcinoma de ovario, tumores cerebrales, astrocitoma, carcinoma cervical, carcinoma colorectal, carcinoma hepatocelular, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, melanoma, carcinoma pancreático, carcinoma de próstata, sarcoma de tejido blando, sarcoma osteogénico, carcinoma de ovario fase III, adenoma paratiroideo, hemangioma, tumor nasofaríngeo, tumor de glomus en la yugular, meningioma, quimiodectoma, y neuroma vagal, hiperplasia nodular biliar, adenomas del ducto biliar, cistadenoma del ducto biliar, fibroma, lipoma, leiomioma, mesotelioma, teratoma, mixoma, e hiperplasia nodular regenerativa, colangiocarcinoma, angiosarcoma, cistadenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, hepatoblastoma.
29. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad que depende de la angiogénesis es un cáncer de hígado.
30. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde la enfermedad que depende de la angiogénesis es una enfermedad no tumorigénica que depende de la angiogénesis seleccionada del grupo que consiste de cicatrices hipertróficas, queloides hipertróficos, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide, malformaciones arteriovenosas, placas ateroscleróticas, sanación demorada de heridas, articulaciones hemofílicas, fracturas que no sueldan, síndrome de Oiser-Weber, soriasis, granuloma piogénico, escleroderma, tracoma, menorragia y adhesiones vasculares.
31. Una microesfera esférica adecuada para embolización activa que comprende:
(a)
un polímero que contiene acrilamida o acrilato, o un polímero acrílico; y
(b)
una droga y/o una vacuna, en donde la droga se selecciona del grupo que consiste de drogas antineoplásicas, drogas antiangiogénesis, drogas antimicóticas, drogas antivirales, y combinaciones de las mismas;
en donde el diámetro de la microesfera está en el rango entre 10 y 200, o entre 50 \mum y 300 \mum, o entre 40 y 400 \mum, o entre 50 y 200 \mum, o entre 70 y 120 \mum.
32. La microesfera como la reivindicada en la reivindicación 31, que comprende además una o más o todas las características de las microesferas definidas en las reivindicaciones 2-4, 6-18, ó 25-30.
33. La microesfera como la reivindicada en la reivindicación 31 ó 32, en donde la microesfera está en la forma de una composición inyectable que comprende un portador biocompatible.
34. Un kit que comprende a la microesfera de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 32.
35. La microesfera como la reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, en donde la microesfera comprende polímeros seleccionados del grupo que consiste del polímero acrilato de sodio, del copolímero de acrilato de sodio y alcohol vinílico, del copolímero de acetato de vinilo y del éster del ácido acrílico, del polímero de poliacrilato sódico entrelazado, o una combinación de los mismos.
36. La microesfera de las reivindicaciones 31 a 33, o el uso de las reivindicaciones 1 a 30 o el kit de las reivindicaciones 34 a 36 en donde la microesfera se puede hinchar.
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