KR20080046750A - 능동 색전화용 미소구 - Google Patents

Abstract

본 발명은 색전화 약물 요법에 사용하기 위한 생물활성 치료 인자(들)를 효율적으로 전달할 수 있는 생체 적합성이고 팽윤성이며 실질적으로 친수성인 무독성의 실질적으로 구형인 중합체 물질 담체를 포함하는 주입 가능한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 주입 가능한 조성물을 사용하는, 특히 혈관형성 및 비-혈관형성 의존성 질병의 치료를 위한 색전화 유전자 요법의 방법에 관한 것이다.

혈관형성-의존성 질병, 색전화 유전자 요법

Description

능동 색전화용 미소구{MICROSPHERES FOR ACTIVE EMBOLIZATION}

본 발명은 암 및 다양한 다른 혈관형성-의존성 질병을 포함한 질병의 치료를 위한 조성물 및 방법, 및 보다 특히 생물 활성 치료 인자를, 담체로서 미소구(상기와 같은 인자로 코팅되었거나 또는 달리 이를 함유한다)와 함께 포함하는 조성물뿐만 아니라 능동 색전화 요법을 위한 상기와 같은 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.

1. 혈관형성-의존성 질병

혈관형성-의존성 질병(즉 맥관 성장을 필요로하거나 유발시키는 질병)은 의학적인 치료를 구하는 모든 질병들 중 상당 부분을 차지한다. 예를 들어, 암은 미국에서 두 번째로 손꼽히는 여전한 사망 원인이며, 전체 사망률의 1/5 이상을 차지한다. 간단히, 암은 가장 전형적으로는 하나 이상의 종양을 형성시키는 세포 집단의 통제되지 않는 분열을 특징으로 한다. 이러한 종양들은 또한 지속적인 종양 성장을 허용하는 다양한 혈액 순환 인자들에 의해 제공되는 맥관구조의 내적인 성장을 특징으로 한다. 암이 일반적으로 과거보다는 보다 쉽게 진단되지만, 많은 형태들은 조기에 발견된다 하더라도 여전히 치유 불가능하다.

예를 들어 다양한 외과적 과정을 포함하여, 다양한 암 치료 방법들이 현재 사용되고 있다. 그러나 단지 수술로만 치료되는 경우, 많은 환자들(특히 몇몇 유형의 암, 예를 들어 유방, 뇌, 결장 및 간암 환자들)은 암의 재발을 경험할 것이다. 따라서, 수술 이외에, 많은 암들을 또한 세포독성 화학요법제(예를 들어 빈크리스틴, 독소루비신, 탁셀, 빈블라스틴, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-FU 등) 및/또는 방사선 요법을 수반하는 복합 요법으로 치료한다. 그러나, 이러한 접근방식에 따른 한가지 곤란한 점은 방사선 요법 및 화학요법제가 정상적인 조직에 독성이며 종종 생명을 위협하는 부작용을 일으킨다는 것이다. 또한, 이러한 접근방식은 종종 대단히 높은 실패율/해제율을 갖는다.

외과적, 화학- 및 방사선 요법 이외에, 암 세포들을 제거하기 위해 개인 자신의 면역계를 이용하는 다른 요법들이 시도되었다. 예를 들어, 일부는 종양 세포를 파괴하도록 면역계를 자극하는 보조약으로서 세균 또는 바이러스 성분들을 사용함을 제안하였다(일반적으로 문헌["Principles of Cancer Biotherapy," Oldham(ed.), Raven Press, New York, 1987]을 참조하시오). 상기와 같은 약제들은 일반적으로 동물 종양 모델에서 보조약으로서 및 비 특이적인 자극인자로서 유용하지만, 아직 인간에게 일반적으로 유효함은 입증되지 않았다.

현재의 방법들 중 한가지 추가적인 제한은 국소적인 재발과 국소적인 질병 억제가 악성 질병의 치료에 위험한 모험으로 남아있다는 것이다. 특히, 매년 총 630,000 명의 환자(미국에서)가 공개 시에 국소성 질병(원거리의 전이성 확산 증거가 없음)을 가지며; 이는 악성(비흑색종 피부암 또는 동일 장소의 암종은 포함시키지 않음)으로 진단된 모든 환자의 64%를 차지한다. 이들 환자의 거의 대다수에 대해서, 상기 질병의 외과적 절제는 최대의 치료 기회를 제공하며 실제로 428,000 명이 초기 치료 후에 치유될 것이다. 불행하게도, 202,000 명(또는 국소성 질병을 갖는 모든 환자의 32%)은 초기 치료후에 재발할 것이다. 재발된 환자들 중, 상기 질병의 국소 재발로 인해 재발하는 수는 매년 133,000 명(또는 국소성 질병을 갖는 모든 환자의 21%)의 환자에 달한다. 질병의 원거리 전이로 인해 재발하는 수는 매년 68,000 명(국소성 질병에 걸린 모든 환자의 11%)이다. 대략 추가로 102,000 명의 환자들이 매년 상기 질병의 국소적인 성장을 억제하지 못한 직접적인 결과로서 사망할 것이다. 환자들이 직면하고 있는 문제를 나타내는 암의 예는 유방암과 간암이다.

유방암

이러한 문제는 미국에서 매년 대략 186,000 명의 여성들이 걸린 질병인 유방암에서 특히 명백하며, 이에 대한 사망률은 50 년간 바뀌지 않은채로 있다. 근치적 유방절제술, 변형된 근치적 유방절제술 또는 유방 종양 절제술을 통한 상기 질병의 외과적 절제는 여전히 상기 질병 치료의 버팀목이다. 불행하게도, 유방 종양 절제술만으로 치료된 환자의 39%는 상기 질병의 재발을 나타낼 것이며, 놀랍게도 절제 가장자리의 종양이 조직학적으로 제거된 것으로 밝혀진 환자의 25%가 그럴 것이다. 이들 국소 재발의 90% 정도로 많은 수가 선행 절제 부위의 2 ㎝ 이내에서 발생할 것이다.

간암

1999년에 120만명 이상이 1 차 간암으로 사망하였으며, 이 중 대부분이 아시아에서 발생하였다. 1 차 간암은 초기의 암 세포가 신체의 일부 다른 암 부위로부터 간으로 이동한 것이라기 보다는 간에서 형성된 간암을 지칭한다. 간에 염증을 일으키는 바이러스성 질병인 C 형 간염을 포함한 몇몇 형태의 간염을 갖는 환자들은 1 차 간암에 대해 고 위험군인 것으로 공지되어 있다. 1 차 간암의 발병률은 미국에서 극적으로 증가하고 있는 것으로 예상되며, 추정 상 현재 4 백만명 이상의 사람들이 C 형 간염 양성인 것으로 보인다.

1 차 간암의 70% 이상은 수술 불가능하며 방사선 또는 화학요법 치료를 받는다. 현재 이용 가능한 치료 옵션으로 하기의 것들이 있다:

화학요법: 화학요법은 급속하게 분열하는 암세포를 죽여 암을 억제하고자 한다. 그러나, 신체 중의 다수의 비 암성 세포들, 예를 들어 골수 세포들이 또한 급속하게 분열하며, 따라서 상기 화학요법에 의해 부당하게 죽기가 매우 쉽다. 따라서 암을 근절시키기에 충분한 용량은 종종 비 암성 세포의 파괴로 인해 생명을 위협하는 부작용을 야기시킨다.

화학적 색전술 및 개발 중인 다양한 치료들: 예를 들어, 피하 에탄올 주입은 3 내지 4 ㎝ 미만으로 제한되는 작은 종양에 대해서만 작용하는 고통스러운 과정이다.

이식법: 이식법이 또한 이용 가능한 요법인데, 이는 비용이 비싸며 기관들의 유용성에 의해 제한되고, 여전히 종양을 재발시킨다. 또한, 침해성 수술과 관련된 재발 위험성이 존재한다.

더욱이, 화학요법은 또한 인체의 자연적인 항종양 방어를 손상시킬 수도 있다.

자궁 섬유종

비 암성 종양의 적절한 예로 평활근종으로서 또한 공지된 자궁 섬유종이 있다. 이는 몇몇 유형의 근육 섬유와 섬유성 결합 조직으로 이루어진 비 암성 종양이다. 자궁 섬유종의 원인은 알려지지 않았다. 대부분의 자궁 섬유종 환자들은 초기에는 증상이 없으며 환자가 비 정상적인 출혈, 빈뇨, 통증, 팽만 및 임신의 어려움을 경험할때까지 치료하지 않은 채로 있는다. 미국에서 대략 2500만명의 여성들이 자궁 섬유종을 갖고 있으며, 이들 여성 중 대략 550만명이 매년 치료를 구하기에 충분한 증상을 나타낸다. 지금까지, 자궁 섬유종을 앓고 있는 여성들은 존립하기가 거의 힘든 옵션, 예를 들어 자궁적출, 근종 절제, 및 의료 관리 및 "보고 기다리는 것"을 갖는다. 자궁 섬유종의 치료를 위해 현재 이용 가능한 요법들은 상당한 단점들, 예를 들어 가임기 여성의 경우 일시적이거나 영구적인 불임, 긴 회복 기간, 조기 폐경을 유도할 수 있는 불리한 생리적 효과, 약물치료, 수술 과정, 빈번하고 긴 입원 비용을 포함한 고 비용, 침해적인 수술 과정 및 호르몬 요법으로부터의 불편함과 부작용, 및/또는 섬유종의 재발 위험성을 갖는다.

그 결과, 특히 유방암, 간암, 췌장암 및 자궁 섬유종을 앓는 환자에게 균일 하게 효과적인 치료 프로그램에 대한 필요성이 상당하다.

수동 색전술

제한된 성공에도 불구하고 종양의 치료에 시도되었던 한 가지 방법은 수동 색전술이다. 간단히, 종양에 양분을 주는 혈관을 상기 혈관 내에 색전 물질을 주입하여 고의로 차단시킨다. 이에 대해서 다양한 물질들, 예를 들어 지방, 혈병 및 다져진 근육 단편과 같은 자가 조직성 물질뿐만 아니라, 모, 면, 강철 구, 플라스틱 또는 유리 비드, 탄탈 분말, 실리콘 화합물, 방사성 입자, 멸균 흡수성 젤라틴 스펀지(Sterispon, Gelfoam), 산화된 셀룰로즈(Oxycel), 강철 코일, 알콜, 동결건조된 인간 경뇌막(Lyodura), 미세섬유성 콜라겐(Avitene), 콜라겐 피브릴(Tachotop), 폴리비닐 알콜 스펀지(PVA; Ivalon), 바륨-주입된 규소 구(Biss) 및 탈착성 벌룬과 같은 인공 물질이 시도되었다. 종양 전이의 크기를 상기와 같은 방법을 사용하여 일시적으로 감소시킬 수 있지만, 종양은 전형적으로 종양 내로의 새로운 혈관의 성장에 반응한다.

암성 종양 형성에 관련된 문제점은 신체 통로, 예를 들어 담관, 기관, 식도, 맥관 및 요도를 통한 물질의 흐름을 억제하는 암성 차단의 발달이다. 종양 또는 다른 물질에 의해 차단된 통로를 개방하여 유지시키기 위해서 한가지 고안품인 스텐트가 개발되었다. 통상적인 스텐트의 전형적인 예로는 월스텐트, 스트렉커 스텐트, 자이언투르코 스텐트 및 팔마즈 스텐트가 있다. 그러나, 스텐트가 갖는 주요 문제점은 상기 스텐트가 그의 간극을 통한 종양 또는 염증성 물질의 내부 성장을 막지 못한다는 것이다. 이러한 물질이 스텐트의 내부에 도달하여 스텐트의 관 광을 손상시키는 경우, 상기 스텐트가 삽입되는 신체 통로가 차단될 수도 있다. 또한, 몸 안의 스텐트의 존재는 반응성 또는 염증성 조직(예를 들어 혈관, 섬유아세포, 백혈구)이 상기 스텐트 투린에 들어가게 하여 상기 스텐트의 부분적인 또는 전적인 폐쇄를 일으킬 수 있다.

2. 치료학적 또는 능동 색전술

종양 부근 내로의 세포독성 약물의 투여는 종양 대 정상 조직 전달의 비를 증가시킨다. 상기와 같은 국소적인 투여는 약물을 그의 혈액 공급을 통해 종양 내로 또는 특정 종양이 위치하고 있는 체강 내로 직접 전달함으로써 수행될 수 있다. 국소적 약물 관류는 표적 조직으로의 절정 약물 농도의 증가 이점을 갖지만, 노출은 관류되는 기관을 통한 혈액의 처음 통과로 제한된다. 상기 처음 통과에 의해 취해지지 않는 약물의 부분은 전신적으로 순환하여 정상 조직에 용해된다.

치료학적 혈관 폐색(색전술)은 동일 장소에서 일부 병리 상태를 치료하는데 사용되는 기법이다. 상기는 일반적으로 상 조절 하에 순환계에 미립자 폐색제(색전)를 위치시키는 것을 가능하게 하는 카테터의 사용에 의해 실행된다. 상기는 또한 다양한 과정, 즉 종양, 혈관 기형, 출혈성 과정 등의 맥관에 관한 것이다. 현저하게는 종양의 경우에 혈관 폐색은 통증을 억제시키고, 색전술에 따른 수술적 중재 시의 혈액 손실을 제한하거나, 심지어는 종양 괴사를 초래하고 수술을 막을 수 있다. 혈관 기형의 경우에 상기는 정상 조직으로의 혈류를 정상화시킬 수 있고, 수술을 도우며, 출혈 위험성을 제한한다. 출혈 과정에서, 혈관 폐색은 흐름 을 감소시켜, 동맥 틈(들)이 아무는 것을 촉진시킨다.

더욱또한, 치료되는 병리 상태에 따라, 색전술을 일시적으로뿐만 아니라 영구적인 목적에 대해서도 수행할 수 있다.

상이한 유형의 색전들이 종래 기술에 공지되어 있다. 특히, 액체 제제(아크릴 아교, 젤, 점성 현탁액 등) 또는 미립자 제제(갖가지 중합체, 경뇌막, 젤라틴 스펀지, 구, 벌룬, 나선 등)가 포함될 수 있다. 공지된 액체 색전의 주요 단점은 그의 조직에 대한 독성에 있으며, 이는 괴사 현상과 카테터가 들러붙을 위험성을 일으킬 수 있다. 액체 색전에 대한 또 다른 제한은 상기가 오직 수동적인 방식으로만 작용하며 약물 전달에 사용될 수 없다는 것이다.

약물의 표적 부위로의 국소 분배 및 상기 부위로부터의 손실 최소화의 이중 작용을 미소구에 의해 성취할 수 있다. 국소 동맥을 통해 도입시키는 경우, 상기와 같은 미소구는 조직의 맥관구조 내에 포착되고, 여기에서 그의 약물 부하를 방출시킨다. 상기와 같은 이중 작용을 능동 색전술이라 칭한다. 미소구는 고체 또는 다공성 조성의 것일 수 있으며, 용액 또는 고체 형태로 분산된 약물 분자를 함유하도록 제조할 수 있다(Zimmer and Kreuter, 1995). 미소구는 단일의 도입성 동맥혈 공급에 의해 공급되는 기관, 예를 들어 간 내에 위치하는 종양의 치료에 특별한 용도를 갖는다(Chen et al. 1994). 상기는 표적 기관의 종양이 치료를 요하는 유일한 부위인 경우에 최대로 가치가 있다.

색전화 약물을 기본으로 하는 요법에 대한 미소구의 용도와 관련된 연구가 공지되어 있지만, 유전자 요법에 사용하기 위한 미소구에 대해서는 비교적 적은 수 의 연구가 수행되었다. 예를 들어, 유리 비드가 정전기력을 통해 이종 혼합물로부터 DNA를 선택적으로 추출하는데 흔히 사용된다. 하이드록시아페타이트가 또한 핵산의 정제에 대해 사용되었고(Kumazawa et al. 1992) 하이드록시아페타이트 구는 초음파 유도를 통해 간 종양 내로의 직접적인 이식에 의해 독소루비신을 서서히 방출시키는데 사용되었지만, 다른 연구들은 상기 특정의 매트릭스가 실제로는 포유동물 조직에의 노출에는 적합하지 않을 수도 있음을 밝혔다(Dass et al., 1997a, 1997b). DNA를 또한 표면에 디에틸아미노에틸(DEAE) 작용기를 갖는 PDB 미소구 상에 유지시켰다(Katz et al., 1990; Maa et al., 1990).

따라서, 유전자 전달을 위한 미소구의 추가적인 개발에 대해 입증된 필요성이 존재한다. 목적하는 주요 이점은 혈류에 의해 항암제를 종양 맥관구조에 특이적으로 표적화하는 능력이다. 더욱이, 동시적인 영양분 공급의 중단과 폐기물 제거와 함께, 종양 혈액 공급을 차단시키는 것이 추정 상 종양 세포의 파괴에 가장 바람직한 결과이다.

발명의 요약

하나의 실시태양에서, 본 발명은 약물, 백신, 폴리뉴클레오티드 및 진단 또는 영상 약제를, 상기 약제에 대한 담체로서 광범위하게 다양한 중합체성 물질을 사용하여 포유동물에게 전달하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 이들 약제의 전달을 위해 미세입자, 특히 미소구를 제공한다. 가장 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 형질감염제를 사용하는 폴리뉴클레 오티드 전달용 미세입자를 제공한다.

보다 구체적으로, 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 사용하기 위한 중합체성 물질 담체는 본 발명의 생물 활성 치료 인자 및 형질감염제를 "운반"할 수 있거나 또는 이와 관련된 임의의 입자를 포함한다. 바람직한 중합체성 물질은 색전술을 수행하고 생물활성 치료 인자를 방출하기에 충분한 크기를 갖는 실질적으로 구형인, 실질적으로 친수성이고 불활성이며 이온성인 가교결합된 중합체를 기본으로 한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 생물활성 치료 인자는 물리적으로 상기 형질감염제에 결합되며, 상기 형질감염제는 또한 미세입자에 연결된다.

하나의 실시태양에서, 본 발명은 생물활성 치료 조성물뿐만 아니라 암 및 전암성 질환을 포함한 다양한 다른 혈관형성-의존성 질병의 치료를 위해 상기와 같은 조성물을 사용하는 방법 및 장치를 제공한다. 본 발명의 하나의 태양 내에서, (a) 생물활성 치료 인자, (b) 중합체성 물질 담체, 및 (c) 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양 내에서, (a) 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (b) 중합체성 물질 담체, 및 (c) 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양 내에서, (a) 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (b) 중합체성 물질 담체, 및 (c) 리포폴리아민 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공한다.

생물활성 치료 인자로서 광범위하게 다양한 분자들, 예를 들어 비 제한적으 로 혈관형성 억제 인자, 항종양제, 펩티드 및 펩티드 동족체, 항체 또는 그의 단편, 백신, 효소, 핵산, 천연 또는 합성 기원의 RNA 및 DNA, 예를 들어 재조합 RNA 및 DNA 및 안티센스 RNA 및 DNA; 망치머리형 RNA, 리보자임, 항원 핵산, 단일 및 이중 가닥 RNA 및 DNA 및 이들의 동족체를 본 발명의 범위 내에서 사용할 수 있다.

본 발명의 중합체성 물질로는 비 제한적으로 아크릴 중합체, 비닐 알콜 중합체, 아크릴레이트 중합체, 폴리(젖산), 폴리아크릴아미드, 폴리(무수물), 폴리사카라이드, 실리콘 또는 이들의 혼합물이 있다. 보다 바람직하게는, 상기 중합체성 물질은 아크릴 계의 실질적으로 친수성인 가교결합된 공중합체, 예를 들어 폴리아크릴아미드 및 그의 유도체, 폴리아크릴레이트 및 그의 유도체뿐만 아니라 폴리알릴 및 폴리비닐 화합물이다. 이들 중합체는 모두 안정하고 비-재흡수성이도록 가교결합된다.

본 발명의 다양한 실시태양들 내에서, 생물활성 치료 인자는 물리적으로 형질감염제와 회합되며 상기 생물활성 치료 인자-형질감염제 복합체는 물리적으로 중합체 담체와 회합된다. 상기 생물활성 치료 인자는 바람직하게는 비 제한적으로 이온 교환, 소수성, 분자 인식 또는 이들의 조합과 같은 회합력을 비롯하여 액체 흡착 크로마토그래피에 대해 널리 공지된 회합력에 의해 흡착된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 생물활성 치료 인자는 형질감염제와 회합되어 복합체를 형성한 후에 본 발명의 중합체성 담체와 혼합 또는 접촉한다.

본 발명의 하나의 태양에서, 소정의 생물활성 치료 인자를 형질감염제와 혼합하여 상기 간에 복합체를 형성시키며, 이때 상기 형질감염제는 상기 복합체에 특 정한 성질, 예를 들어 증가된 소수성을 부여한다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 중합체성 물질 담체를 충분량의 형질감염성 생물활성 치료 인자와 함께 혼합한다. 상기 생물활성 치료 인자와 중합체성 물질 담체 간의 물리적 회합은 염, 예를 들어 비 제한적으로 염화 나트륨 또는 콘트라스트 매질, 예를 들어 바륨 또는 요오다이드 함유 염의 첨가에 의해 향상될 수 있는 이온 및 소수성 회합의 결과이다.

본 발명의 다양한 실시태양 내에서, 색전 물질의 표면 상에 흡착된 생물활성 치료 인자-형질감염제 복합체는 일단 적합한 부위로 전달되면 점진적으로 탈착되어 다양한 기전들, 예를 들어 비 제한적으로 자발적인 세포내 이입, 수용체-매개된 세포내 이입, 엔도솜분해 및 세포막 탈안정화 또는 이들의 조합에 의해 주변 세포로 전달된다. 상기 생물활성 치료 인자의 탈착은 상기 인자의 전적인 탈착이 달성될때까지 상기 인자와 색전 물질간의 흡착 강도를 약화시키는 생물학적 액체의 천연 성분들에 의해 유도된다. 상기 생물활성 치료 인자의 탈착은 또한 생체 내에서 가수분해성인 결합, 예를 들어 비 제한적으로 에스테르 또는 오시드 결합의 사용으로 조절될 수 있다. 다른 다양한 실시태양들에서, 생물활성 치료 인자의 탈착은 또한 상기 인자와 회합된 펩티드(이때 펩티드 결합은 세포 단백질분해 효소에 의해 절단될 수 있다)의 사용으로 조절될 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 치료가 필요한 환자의 혈관에 치료 유효량의 생물활성 치료 인자를 상기 혈관이 효과적으로 폐색되도록 투여함을 포함하는, 혈관의 색전화 방법 제공한다. 하나의 실시태양 내에서, 상기 생물활성 치료 인 자를 종양에 영양을 주는 혈관에 동시적으로 또는 순차적으로 전달한다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 환자에게 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 질병에서 혈관을 색전화시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 형질감염제와 회합되고, 상기 폴리뉴클레오티드-형질감염제는 혈관이 효과적으로 폐색되도록 중합체성 물질 담체와 추가로 회합된다.

본 발명의 또 다른 보다 바람직한 태양 내에서, 종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 환자에게 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 질병에서 혈관을 색전화시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 리포폴리아민 형질감염제와 회합되고, 상기 회합된 폴리뉴클레오티드-형질감염제는 혈관이 효과적으로 폐색되도록 실질적으로 친수성인 미소구와 추가로 회합된다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 환자에게 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 질병에서 혈관을 색전화시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자는 형질감염제와 회합되고, 상기 회합된 바이러스 벡터-형질감염제는 혈관이 효과적으로 폐색되도록 실질적으로 친수성인 미소구와 추가로 회합된다.

본 발명의 또 다른 보다 바람직한 태양 내에서, 종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 환자에게 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 질병에서 혈관을 색전화시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자는 리포폴리아민 형질감염제와 회합되고, 상기 회합된 바이러스 벡터-형질감염제는 혈관이 효과적으로 폐색되도록 실질적으로 친수성인 미소구와 추가로 회합된다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 환자에게 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 질병에서 혈관을 색전화시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자는 형질감염제와 회합되고, 상기 회합된 바이러스 벡터 또는 바이러스형 입자는 혈관이 효과적으로 폐색되도록 실질적으로 친수성인 미소구와 추가로 회합된다.

본 발명의 더욱 또 다른 태양 내에서, 비-종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 환자에게 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 약물을 치료 유효량으로 투여함을 포함하는, 상기 질병의 환자에서 혈관형성을 억제시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 형질감염제와 회합되고, 상기 회합된 폴리뉴클레오티드-형질감염제는 새로운 혈관 형성이 억제되도록 중합체성 물질 담체와 추가로 회합된다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 상기와 같 은 약물을 통시적으로 투여되는 상기 생물활성 치료 인자의 전달을 방해하지 않도록 상기 중합체성 물질 담체에 혼입시킬 수 있다.

본 발명의 더욱 또 다른 태양 내에서, 비-종양형성, 비-혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 약물을 형질감염제와 회합된 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 투여함을 포함하는, 상기 질병의 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이때 상기 약물은 상기 비-종양형성, 비-혈관형성-의존성 질병의 증상을 개선시키기 위해서, 통시적으로 투여되는 상기 중합체성 물질 담체와 회합된 생물활성 치료 인자의 전달을 방해하지 않도록 상기 중합체성 물질 담체 내에 혼입된다.

다른 바람직한 실시태양 내에서, 본 발명의 조성물은 (a) 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (b) 중합체성 물질 담체, 및 (c) 리포폴리아민 형질감염제를, 새로운 혈관의 형성을 억제하는 보다 경량의 d 그룹 전이 금속(예를 들어 바나듐 종, 몰리브덴 종, 텅스텐 종, 티탄 종, 니오브 종 또는 탄탈 종)과 함께 포함한다.

다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 (a) 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (b) 양이온성 가교결합된 미세입자, 및 (c) 리포폴리아민 형질감염제를 형질감염 촉진제와 함께 포함한다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 질병에 걸린 포유동물에게 폴리뉴클레오티드 및 형질감염제와 회합된 실질적으로 친수성인 중합체성 물질을 투여함을 포함하는, 포유동물 숙주로 폴리뉴클레오티드를 전달하는 방법을 제공한다. 이 방법의 실시태양은 상기 폴리뉴클레오티드 및 형질감염제와 회합된 실질적으로 친수성인 중합체성 물질의 투여가 유전자 요법을 위한 것이고, 상기 중합체성 물질 미소구가 투여 부위에서 혈관의 색전화에 충분한 크기를 가지며, 상기 중합체성 물질이 투여 부위에서 혈관을 색전화시키기에는 충분하지 않지만 종양에 고정시키기에는 충분한 크기를 갖는다는 것이다.

또 다른 바람직한 실시태양 내에서, 혈관형성 의존성 질병이 있는 포유동물에게 혈관형성 억제 물질을 발현시킬 수 있는 생물활성 치료 인자와 회합된 실질적으로 친수성인 중합체성 물질을 투여함을 포함하는 포유동물 숙주의 능동 색전화 방법을 제공하며, 이때 상기 생물활성 치료 인자는 형질감염제와 회합된다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 절제에 이은 종양의 절제 가장자리에 상기 부위에서의 암의 국소적 재발 및 새로운 혈관의 형성을 억제시키기 위해서 상술한 바와 같이 형질감염제와 회합된 중합체성 물질 담체 생물활성 치료 인자를 투여함을 포함하는 종양 절제 부위의 치료 방법을 제공한다.

다른 태양들 내에서, 비-종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 혈관으로 상기 혈관이 효과적으로 폐색되도록 생물활성 치료인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 약물을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 전달함을 포함하는 상기 혈관의 색전화 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 종양형성, 혈관형성-의존성 질병의 혈관으로 상기 혈관이 효과적으로 폐색되고 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현을 위한 세포 내로 전달되도록 상기 생물활성 치료인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 함께 약물을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 전달함을 포함하는 상기 혈관의 색전화 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 질병에 걸린 포유동물에게 생물활성 치료 인자와 회합된 실질적으로 친수성인 중합체성 물질을 투여함을 포함하는 포유동물 숙주의 능동 색전화 방법을 제공하며, 이때 상기 생물활성 치료 인자는 형질감염제와 회합된다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 혈관을 색전화시킬 수 있는 중합체성 물질을 포함하는 능동 색전화에 적합한 미세입자를 제공하며, 이때 상기 중합체성 물질은 형질감염제에 결합되고 상기 형질감염제는 유전 물질에 결합된다.

다른 태양들 내에서, 혈관 신생 질병의 치료가 필요한 환자에게 새로운 혈관의 형성이 억제되도록 예를 들어 눈에 치료 유효량의 생물활성 치료 인자를 투여함을 포함하는, 예를 들어 비 제한적으로 눈을 포함한 기관의 혈관신생 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 암뿐만 아니라 다른 비-종양형성 혈관형성-의존성 질병의 치료에 적합한 조성물 및 방법을 제공하며, 또한 다른 관련된 이점들을 제공한다. 상기와 같은 암으로는 비 제한적으로 간, 난소, 신장, 췌장, 전립선, 피부암, 두부 및 경부 종양, 유방 종양 및 카포시 육종, 및 피상적인 형태의 방광암이 있다. 그러나, 암 이외에 혈관의 비 정상적인 성장을 특징으로 하는 다수의 다른 비-종양형성 혈관형성-의존성 질병들을 또한 본 발명의 생물활성 치료 인자 또는 조성물로 치료할 수 있다. 상기와 같은 비 종양형성 혈관형성-의존성 질병의 전형적인 예로는 비 제한적으로 비후성 흉터 및 켈로이드, 증식성 당뇨병성 망막증, 류마티스성 관절염, 동정맥 기형, 죽상경화성 반, 지연된 상처 치유, 혈우성 관절, 비결합성 골절, 오시어 웨버(Osier-Weber) 증후군, 건선, 화농성 육아종, 경피증, 트라코마, 과다월경 및 혈관 유착이 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양 내에서, (a) 색전화에 적합한 미소구의 현탁액; 및 (b) 세포에 유전 물질을 전달하기에 적합한 형질감염제를 포함하는, 색전화 유전자 요법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 추가의 실시태양 내에서, 중합체성 물질이 하나의 바이알에 함유되어 있고 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 회합된 형질감염제가 또 다른 바이알 내에 함유되어 있으며 상기 두 바이알의 내용물을 함께 혼합시켜 약제 조성물을 제조하는 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 추가의 실시태양 내에서, 중합체성 물질이 하나의 바이알에 함유되어 있고 형질감염제가 또 다른 별도의 바이알에 함유되어 있으며, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또 다른 별도의 바이알 내에 함유되어 있고 상기 3 개 바이알 모두의 내용물을 함께 혼합시켜 약제 조성물을 제조하는 키트를 제공한다. 본 발명의 또 다른 추가의 실시태양 내에서, (a) 색전화에 적합한 미소구의 현탁액; 및 (b) 유전 물질을 세포에 전달하기에 적합한 형질감염제의 성분들이 하나의 바이알 내에 있는 키트를 제공한다.

본 발명의 상기 및 다른 태양들은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로 자명해질 것이다. 또한, 본 발명에 내용 전체가 참고로 인용된 다양한 참고문헌들을 하기에 나타낸다.

본 발명은 색전화 약물 요법에 사용하기 위한 생물활성 치료 인자(들)를 효율적으로 전달할 수 있는 생체 적합성이고 팽윤성이며 실질적으로 친수성인 무독성의 실질적으로 구형인 중합체 물질 담체를 포함하는 주입 가능한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 주입 가능한 조성물을 사용하는, 특히 혈관형성 및 비-혈관형성 의존성 질병의 치료를 위한 색전화 유전자 요법의 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 태양 내에서, (a) 생물활성 치료 인자, (b) 미소구 담체, 및 (c) 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 생물활성 치료 인자, (b) 미소구 담체, 및 (c) 형질감염제를 포함하는 주입용 조성물을 암 및 다양한 다른 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 포유동물에게 투여하는 유전자 요법의 방법을 제공한다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 생물활성 치료 인자, (b) 미소구 담체, 및 (c) 형질감염제를 포함하는 주입용 조성물을 암 및 다양한 다른 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 포유동물에게 투여하는 유전자 요법의 방법을 제공하며, 이때 상기 주입용 조성물을 적합한 눈금화된 바늘을 통해 종양 또는 병에 걸린 조직에 직접 투여한다.

더욱 또 다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 생물활성 치료 인자, (b) 미소구 담체, 및 (c) 형질감염제를 포함하는 주입용 조성물을 암 및 다양한 다른 혈관형성-의존성 질병의 치료가 필요한 포유동물에게 투여하는 유전자 요법의 방법을 제공하며, 이때 상기 주입용 조성물을 맥관 시스템 내로의 주입에 의해 종양 또는 병에 걸린 조직으로 전달한다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 항종양성 약물, 예를 들어 비 제한적으로 탁솔, 독소루비신, 시스플라틴, 패클리탁셀을 포함하는 조성물을 절제에 이은 종양의 절제 가장자리에, 상기 종양 절제 부위에서의 새로운 혈관의 형성과 암의 국소적인 재발을 억제하도록 투여함을 포함하는, 상기 부위의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 중합체성 담체 또는 바람직하게는 미소구를 또한 치료 효과, 맥관화 효과, 맥관화 억제 효과, 시각화 성질 또는 이들의 조합을 함유하도록 화학적으로 변경시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 미소구의 화학적 변경은 상기 미소구가 그의 구조 내에 다양한 성질을 갖는 화학물질을 함유하고 표면 공유 결합과 관련된 독특한 특징들을 가질 수 있도록 가교결합된 중합체들로 제조된 입자를 포함한다는 사실에 의해 가능할 수 있다. 본 발명의 미소구의 화학적 변경은 또한 투여 후의 상기 미소구들과 이웃하는 세포 및 조직간의 상호작용을 통해 일어날 수도 있다.

정의:

본 발명에 사용된 "실질적으로 구형"이란 일반적으로 완전한 구형에 가까운 모양으로, 최저의 외부 표면적을 제공하는 부피로서 한정된다. 구체적으로, 본 발명에서 "실질적으로 구형"은 상기 입자의 임의의 횡단면을 바라볼 때, 평균 대 직경과 평균 소 직경의 차이가 20% 미만임을 의미한다. 본 발명의 미소구의 표면은 1000 배 이하로 확대 시 매끄럽게 보인다. 본 발명의 미소구는 입자 이외에 본 원에 개시되고 정의된 다른 물질들을 포함할 수도 있다.

본 발명에 사용된 "세포 유착 촉진제"란 미소구 내 또는 미소구와 회합된 상기의 존재로 인해 미소구의 표면에 대한 세포의 유착성이 촉진 또는 향상되는 임의의 물질을 의미한다. 이러한 물질은 종종 공유 결합 또는 상호 침투된 중합체성 방식으로 미소구의 표면에 회합된 단백질이다.

본 발명에 사용된 "치료제"란 혈관형성-의존성 질병의 진행에 치료 효과를 제공하거나 또는 상기 혈관형성-의존성 질병에 생물학적 또는 생리학적 반응을 제공하는 임의의 물질을 지칭한다. 치료제의 예로는 혈관형성-의존성 질병과 관련된 염증의 영향을 방지 또는 감소시키는 소염제가 있다.

본 발명에 사용된 "화학적 변경"은 미소구의 생성 과정 중에 또는 다양한 약제 또는 조직과의 혼합 또는 접촉에 의해 상기 미소구가 종양 색전화 이외에 일단 체내에 주입된 다른 작용들을 수행하는 능력을 갖도록 화학적 성질 및 특성들이 변화되는 것을 의미한다.

본 발명에 사용된 "안정화 물질" 또는 "안정화 화합물"이란 본 원에 개시된 조성물, 전구약물, 표적화 리간드 및/또는 다른 생물활성 치료 인자, 예를 들어 혼합물, 현탁액, 유화액, 분산액, 소낭 등의 안정성을 개선시킬 수 있는 임의의 물질 을 지칭한다. "안정화 물질"의 정의에는 몇몇 본 발명의 생물활성 치료 인자 및 전구약물이 포함된다. 또한 "안정화 물질"의 정의에는 몇몇 본 발명의 형질감염제가 포함된다. 개선된 안정성은 예를 들어 상대적으로 균형을 이룬 상태의 유지를 수반하며, 예를 들어 파괴, 분해, 붕해 등에 대한 조성물의 증가된 내성으로 예시될 수 있다. 예를 들어, 형질감염제의 결합되어 있지 않은 양이온 헤드는 C₁₂GluPhC_nN⁺ 및 C₁₄GluPhC_nN⁺와 같은 화합물에서 볼 수 있는 바와 같이 형질감염 효율을 감소시키는 반면, 최단 이격자를 갖는 DOTB/DOSC와 같은 화합물은 최고의 표면 전하 밀도와 최상의 형질감염 효율을 생성시킨다.

생물활성 치료 인자, 전구약물 및/또는 다른 생물활성제를 갖는 미소구를 포함한 바람직한 실시태양들의 경우에, 상기 안정화 화합물은 상기 미소구로부터의 몇몇 생물활성 치료 인자, 전구약물 및/또는 생물활성제의 방출을, 상기 방출을 원할 때 까지 최소화하거나 또는 실질적으로(완전히 포함) 방지하는 식으로 상기 미소구를 형성시키거나 또는 안정화시키는 작용을 할 수 있다. 미소구로부터의 생물활성 치료인자, 전구약물 및/또는 생물활성제의 방출을 방지하는 것과 관련하여 본 발명에 사용된 "실질적으로"란 용어는 상기 내용물의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 80% 이상, 더더욱 훨씬 바람직하게는 약 90% 이상을 방출을 원할때까지 상기 미소구의 표면 상에 회합된 채로 유지하거나 또는 한편으로 치료 약물 제형의 경우에 상기 미소구 내에 함유함을 의미한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 생물활성 치료 인자, 전구약물 및/또는 생물활성제의 약 95% 이상을 방출을 원할때까지 상기 미소구의 표면 상에 회합된 채로 유지하거나 또는 한편으로 치료 약물 제형의 경우에 상기 미소구 내에 함유한다. 상기 생물활성 치료 인자, 전구약물 및/또는 생물활성제를 또한 방출을 원할 때까지 미소구의 표면 상에 회합된 채로 완전히 유지하거나 상기 미소구 내에 함유할 수도 있다(즉, 약 100%가 상기 미소구의 표면 상에 회합된 채로 유지되거나 상기 미소구 내에 함유된다).

전형적인 안정화 물질의 예로는 지질, 단백질, 중합체, 탄수화물 및 계면활성제가 있다. 생성된 혼합물, 현탁액, 유화액 등은 상기 생물활성 치료 인자 또는 생물활성제의 주변에 벽(즉, 필름, 멤브레인 등)을 차지하거나, 또는 경우에 따라 벽 또는 멤브레인이 실질적으로 없을 수도 있다. 상기 안정화 물질은 경우에 따라 소적들을 형성시킬 수도 있다. 상기 안정화 물질은 또한 염 및/또는 당을 포함할 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 안정화 물질을 실질적으로(완전히 포함) 가교결합시킬 수도 있다. 상기 안정화 물질은 중성, 양성 또는 음성 전하를 가질 수 있다.

본 발명에 사용된 "가교결합" 및 "가교결합된"이란 일반적으로 2 개 이상의 안정화 물질, 예를 들어 지질, 단백질, 중합체, 탄수화물, 계면활성제 안정화 물질, 생물활성 치료 인자 및/또는 생물활성제의 하나 이상의 가교에 의한 결합을 지칭한다. 상기 가교는 하나 이상의 원소, 그룹 또는 화합물을 포함할 수 있으며, 일반적으로는 제 1 안정화 물질 분자로부터의 원자를 제 2 안정화 물질 분자의 원자에 결합시킨다. 상기 가교결합은 공유결합 및/또는 비-공유 회합을 포함할 수 있다. 임의의 다양한 원소, 그룹 및/또는 화합물들이 가교결합에서 가교를 형성할 수 있으며, 상기 안정화 물질을 자연적으로 또는 합성 수단을 통해 가교결합시킬 수 있다. 예를 들어, 가교결합이 케라틴, 인슐린 및 다른 단백질에서와 같이 시스틴 잔기의 디설파이드 결합에 의해 결합되는 펩티드 쇄로부터 형성된 물질에서 자연적으로 발생할 수 있다. 한편으로, 가교결합을 적합한 화학적 변경에 의해, 예를 들어 안정화 물질과 같은 화합물과, 예를 들어 열, 고 에너지 조사 등에의 노출에 의해 반응을 일으킬 수 있는 가교결합제로서 작용할 수 있는 화학 물질을 결합시킴으로써 수행할 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 결합을 형성하는 황에 의한 가교결합, 유기 과산화물을 사용하는 가교결합, 고 에너지 조사에 의한 불포화된 물질의 가교결합, 디메틸올 카바메이트와의 가교결합 등이 있다. 경우에 따라, 안정화 화합물, 생물활성 치료 인자 및/또는 생물활성제를 실질적으로 가교결합시킬 수도 있다.

본 발명에 사용된 "실질적으로"란 용어는 안정화 화합물의 약 50% 이상이 가교결합 가교를 함유함을 의미한다. 경우에 따라, 안정화 화합물의 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상, 또는 심지어 100%가 상기와 같은 가교결합 가교를 함유한다. 한편으로, 상기 안정화 물질은 가교결합되지 않을 수도 있다, 즉 안정화 화합물의 약 50% 이상이 가교결합 가교가 없으며, 경우에 따라 안정화 화합물의 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상, 또는 심지어 100%가 가교결합 가교가 없다.

본 발명에 사용된 "회합된"이란 본 발명의 생물활성 치료제, 형질감염제, 및 미소구간의 결합을 지칭한다. 상기와 같은 회합은 생물활성 치료제 및 형질감염 제의 경우에 복합체를 형성시킬 수도, 또는 시키지 않을 수도 있다. 상기와 같은 회합은 비 제한적으로 공유, 비-공유뿐만 아니라 이온 상호작용, 정전기적 상호작용, 반 데르 발스력, 수소 결합, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용(이들은 각각 하기에 추가로 정의된다)인 회합들을 포함함을 의미한다.

본 발명에 사용된 "공유 회합"이란 2 개 원자의 결합 오비탈에서 전자를 공유함을 포함하는 분자간 회합 또는 결합을 지칭한다.

본 발명에 사용된 "비 공유 회합"이란 공유 결합을 포함하지 않는 2 개 이상의 별도의 분자들간의 분자간 상호작용을 지칭한다. 분자간 상호작용은 다양한 인자들, 예를 들어 관련 분자들의 극성 및 관련 분자들의 전하(양 또는 음, 존재하는 경우)에 따라 변한다. 비-공유 회합은 이온 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 반 데르 발스력 및 이들의 조합 중에서 선택된다.

본 발명에 사용된 "이온 상호작용" 또는 "정전기적 상호작용"은 2 개 이상의 분자들 간의 분자간 상호작용을 지칭하며, 상기 분자들 각각은 양 또는 음으로 하전되어 있다. 따라서, 예를 들어 "이온 상호작용" 또는 "정전기적 상호작용"은 제 1의 양 전하 분자와 제 2의 음전하 분자간의 인력을 지칭한다. 이온 또는 정전기적 상호작용의 예로는 음으로 하전된 안정화 물질, 예를 들어 유전 물질과 양으로 하전된 지질, 예를 들어 양이온 지질간의 인력이 있으며, 예를 들어 라우릴트리메틸암모늄 브로마이드가 있다.

본 발명에 사용된 "반 데르 발스력"은 양자 역학에 기인한 비-극성 분자들간의 인력을 지칭한다. 반 데르 발스력은 일반적으로 이웃하는 분자들에 의해 유도 되고 전자 분포의 변화를 수반하는 순간적인 쌍극자 모멘트와 관련있다.

본 발명에 사용된 "수소 결합"은 음전기 원자, 예를 들어 산소, 황 또는 질소에 공유적으로 결합된 수소 원자와, 또 다른 음전기 원자간에 일어날 수 있는 인력 또는 가교를 지칭한다. 상기 수소 결합은 제 1 분자의 수소 원자와 제 2 분자의 음전기 원자 사이에 일어날 수 있다(분자간 수소 결합). 또한 상기 수소 결합은 모두 단일 분자 내에 함유된 수소 원자와 음전기 전자 사이에서 일어날 수 있다(분자내 수소 결합).

본 발명에 사용된 "친수성 상호작용"은 실질적으로 물과 결합, 흡수 및/또는 용해될 수 있는 분자 또는 부분을 지칭한다. 이에 의해 팽윤되고/되거나 가역성 겔이 형성될 수 있다.

본 발명에 사용된 "소수성 상호작용"은 실질적으로 물과 결합, 흡수 및/또는 용해되지 않는 분자 또는 부분을 지칭한다.

명확한 설명을 위해 비 제한적으로 본 발명의 상세한 설명을 하기와 같은 하위 섹션들로 나눈다.

1. 중합체성 물질

1.1 미세입자

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 다른 유전 물질의 전달을 위해서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 다른 유전 물질 및 형질감염제와 회합할 수 있고 작용 부위를 표적화할 수 있는 임의의 중합체성 물질을 사용할 수 있다. 바람직한 실시태양에 서, 상기 물질은 폴리뉴클레오티드 또는 다른 유전 물질을 수반하고 색전화해야 한다. 바람직하게는, 미세입자, 가장 바람직하게는 미소구를 본 발명에 사용한다.

광범위하게 다양한 중합체성 담체, 예를 들어 비 제한적으로 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)(40% 가교결합된 것), 폴리(D,L-젖산) 올리고머 및 중합체, 폴리(L-젖산) 올리고머 및 중합체, 폴리(글리콜산), 젖산과 글리콜산의 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(발레로락톤), 폴리(무수물), 폴리(카프로락톤) 또는 폴리(젖산)과 폴리에틸렌 글리콜, 폴리사카라이드, 실리콘 및 이들의 혼합물과의 공중합체를 본 발명에 사용할 수 있다.

1.2 미소구

본 발명의 약물 전달 태양에 대해서, 바람직한 중합체성 물질은 미소구이다. 약물 전달 실시태양에서, 형질감염제의 사용은 선택적이다.

바람직하게는 본 발명에 사용하기 위한 미세비드 또는 미소구(본 발명에서는 집합적으로 미소구로서 지칭한다)는 생체적합성이고, 친수성이며, 실질적으로 구형인 무독성 중합체를 기본으로 한다. 상기 미소구는 18 게이지 이하의 바늘을 통해 주입 가능하며, 면역 또는 림프계에 의해 제거될 수 없다. 상기 중합체는 바람직하게는 세포 유착을 촉진시키는 시약들로 코팅될 수도 있다. 살아있는 세포를 또한 미소구에 부착시켜 층상화된 세포를 형성시키고 여기에서 주변의 조직들과 결합시켜 상기 비드의 장기 안정성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 미소구는 탄성중합체, 바람직하게는 아크릴 중합체, 비닐 알콜 중합체, 아크릴레이트 중합체, 폴리사카라이드, 실리콘 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 탄성중합체를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 용도에 사용될 수 있는 친수성 공중합체는 아크릴계 공중합체, 예를 들어 폴리아크릴아미드 및 그의 유도체, 폴리아크릴레이트 및 그의 유도체뿐만 아니라 폴리알릴 및 폴리비닐 화합물이다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 미소구는 또한 양이온성 소수성 중합체와 폴리비닐 아세테이트와의 조합을 기본으로 할 수 있다. 이들 중합체는 모두 안정하고 재 흡수되지 않도록 가교결합되며, 그의 구조 내에 특정 성질, 예를 들어 주화 효과, 세포 또는 조직에의 세포 유착의 촉진을 나타내는 다른 화학물질들을 함유할 수 있다.

본 발명에 따라 신체의 다양한 위치에, 바람직하게는 주입을 통해 이식시키고자하는 미소구들은 세포 유착에 적합한 물질을 함유하는 비 재흡수성의 친수성 중합체를 포함하며, 개입 전 또는 개입 중에 방사선학에 의한 국소화를 촉진시키기 위해서 방사선 불투과성 분자 또는 다른 표지 시약들을 추가로 함유할 수도 있다.

본 발명에 사용하기 위한 미소구는 조직과 세포에 무독성이고, 생체 적합하며, 이식 부위에서 상기 미소구에 의해 촉진되는 세포 성장에 의해 다양한 세포 및 조직에 대해 유착성이다. 또한, 상기 미소구는 비-재 흡수성이고 비-생분해성이며, 따라서 안정하고, 내구적이며, 일단 목적하는 부위에 이식되면 그의 일반적인 형상과 위치를 유지할 것이다. 대안적인 실시태양에서, 본 발명의 미소구는 재 흡수성이며 따라서 생분해성이다. 이러한 재 흡수성과 생분해성인 미소구들은 예를 들어 비 제한적으로 폴리사카라이드 및 폴리사카라이드 유도체를 기본으로 한다.

일반적으로, 본 발명에 사용하기 위한 미소구는 임의의 형상을 가질 수 있으며, 실질적으로 구형인 미소구가 바람직하다. 본 발명에 사용하기 위한 미소구는 약 10 ㎛ 내지 약 2000 ㎛ 범위의 직경을 가질 수 있다. 바람직하게는, 세포가 표면에 유착되는 본 발명에 사용하기 위한 미소구는 40 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 직경을 가질 것이다.

본 발명의 탄성 미소구는 바람직하게는 18 게이지 이하의 바늘을 통해 주입될 수 있으며 대식세포 또는 면역계 또는 림프계의 다른 요소들을 통해 제거된다. 이러한 경우에 바람직한 미소구의 평균 직경은 약 40 ㎛ 내지 약 400 ㎛, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 200 ㎛이다. 가장 바람직한 실시태양에서, 상기 주입성 미소구의 평균 직경은 약 70 내지 약 120 ㎛의 범위이다.

본 발명의 또 다른 태양에서, 본 발명에 사용하기 위한 미소구의 부분집합은 다양한 중합체들을 포함하는, 무독성이고, 생체적합성이며, 팽윤가능하고, 친수성인 실질적으로 구형인 입자를 기본으로 한다. 상기 팽윤성 미소구는 고 흡수성이고 따라서 특정 조건 하에서 수성 매질과 접촉 시 팽윤될 수 있는 가교결합된 중합체이다. 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 가교결합된 중합체의 팽윤 정도는 중합체 물질의 성질 및 가교결합도에 따라 변한다. 미소구가 현탁되거나 미소구와 접촉하는 용매의 성질들, 예를 들어 염 및 이온 농도 및 pH 수준이 또한 팽윤도에 영향을 미친다. 주입용으로 적합한 조성물은 미소구와 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액을 포함하여 존재할 수 있고, 상기 조성물은 바람직하게는 10 내지 90 중량%의 미소구 및 10 내지 90 중량%의 생체 적합 성 생체 적합성 용액, 현탁액 또는 유화액을 포함하는 것이고, 더 바람직하게는 10 내지 50 중량%의 미소구 및 50 내지 90 중량%의 생체 적합성 용액, 현탁액 또는 유화액을 포함하는 것이다. 또한, 상기 주입용으로 적합한 조성물은 생체 적합성 용액, 현탁액 또는 유화액이 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연 및 암모늄으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 양이온들로 구성된 염을, 0.01 M 내지 5 M의 양 포함하는 것이 바람직하다.

몇몇 가교결합되고 팽윤성인 중합체의 크기와 팽윤도를 조심스럽게 조절함으로써, 상기 미소구를 사용하여 색전화와 유전자 전달을 성취할 수 있다. 본 발명에 따라, 높은 수 흡수능을 갖는 중합체성 물질이 먼저 선택된다. 이들 중합체의 팽윤성을 가교결합도를 조절함으로써 추가로 조종할 수 있으며, 이는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같이 화학적으로 또는 조사를 통해 수행될 수 있다.

보다 중요하게는, 상기 중합체를 포함하는 미소구의 팽윤을 상기 미소구가 현탁되는 용매를 조절함으로써 추가로 조절할 수 있다. 이를 본 원에 개시된 2 개의 단계로 수행한다. 먼저, 주입 전에 미소구의 크기를 사용되는 특정 미소구에 따라 적합한 용매, 염 농도 및 pH 수준을 사용하여 조심스럽게 조절한다. 주입 전의 미소구는 원래의 크기를 갖거나 또는 용매와의 접촉으로 인해 특정한 정도로 팽윤될 수도 있다. 상기 주입-전 팽윤을 조절하여 미소구를 30 게이지 이하의 바늘을 통해 쉽게 주입할 수 있다. 두 번째로, 주입 후 및 주입 부위에서 조직과 접촉 시 미소구를 소정의 크기로 추가 팽윤시키거나 또는 그의 주입 전 크기를 유지시킬 수 있으며, 이들 크기 중 어느 하나가 미소구를 주입 부위에 고정시켜 목적 하는 색전화 유전자 치료 효과를 달성하게 된다. 주입 전 팽윤 정도 및 따라서 주입 후 팽윤은 사용되는 특정 미소구 및 치료하려는 피부 결함의 성질 및 위치에 의해 결정된다.

본 발명에 사용하기 위한 미소구는 팽윤 전에 약 10 내지 약 400 ㎛ 범위의 직경을 갖는다. 바람직하게는, 팽윤 전에, 상기 미소구의 직경은 약 10 내지 약 200 ㎛, 가장 바람직하게는 약 10 내지 약 120 ㎛이다. 주입 및 팽윤 후에, 미소구는 약 40 ㎛ 이상, 바람직하게는 약 50 ㎛ 이상, 및 보다 바람직하게는 약 70 ㎛ 이상의 평균 직경을 갖는다. 본 발명의 미소구는 원래 크기의 약 15 배까지 팽윤될 수 있다. 주입 후 미소구의 완전히 팽윤된 크기는 상기 논의된 다양한 수단에 의해 조절되며, 따라서 상기 미소구는 조직에 임의의 잠재적인 손상을 일으키지 않으면서 주입 부위에 고정된다. 더욱이, 주입 후의 미소구의 완전히 팽윤된 크기는 주입 부위의 생리적 조건, 원래의 미소구 크기, 사용된 용매 및 미소구의 주입 전 팽윤과 같은 인자를 기본으로 미리 정해진다. 따라서, 특정한 주입 계획은 사례의 특정한 색전요법 유전자 치료 필요성에 따라 구상될 수 있다. 이러한 미소구의 크기 및 성질은 미소구가 30 게이지 이하의 바늘을 통해 쉽게 주입될 수 있게 하지만, 상기 주입 부위에 고정될정도로 충분히 크며 면역계의 대식세포 또는 다른 요소들에 의해 소화되거나 제거되지 않을 것이라는 이점을 제공한다.

본 발명 미소구의 가능한 변화에는 미소구를, 세포 유착을 촉진시키는 시약으로 처리된 임의의 생체 적합하고, 무독성인 비-재 흡수성 중합체성 입자, 멤브레인, 섬유 또는 다른 고체 기질로 대체시킴이 포함된다. 본 발명은 또한 본 발명 에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,925,683 호에 개시된 액체 겔화성 용액일 수 있는 색전 물질의 사용을 포함한다. 본 발명은 또한 주입 후에 동일 위치에서 가교결합되어 고체인 세포 유착 촉진성 충전제를 구성하는 선형의 가용성 중합체를 포함한다. 앞서 제조되거나 적합한 카테터를 사용하여 적소에 생성시킨 빈 미소구(미소풍선)의 제조 및/또는 주입을 또한 본 발명에서 고려한다.

본 발명에 사용하기 위한 미소구 또는 다른 고체 기질은 가요성이며, 따라서 상기는 영구적으로 변경되지 않으면서 주입 장치와 작은 카테터내로 쉽게 통과할 수 있지만, 또한 이식 과정 동안 및 상기 과정 후에 발생한 근수축 응력에 대해 내성이다. 상기는 또한 용이하고, 편리한 살균과 냉동 보관을 허용하는 열 안정성이 있다.

본 발명에 사용하기 위한 미소구 또는 다른 고체 기질은 또한 현탁액 중에서 안정하며, 이는 상기 미소구 또는 다른 고체 기질의 현탁액 중에서의 제형화와 보관을 허용하고 상이한 액체와 함께 주입되는 것을 허용한다. 보다 구체적으로, 미소구의 친수성 성질은 상기 미소구를 응집체의 형성 또는 보관 용기 및 이식 장치, 예를 들어 카테터, 주사기, 바늘 등의 벽에의 유착을 피하면서 현탁액에, 특히 멸균 및 발열성(발열원 비 함유) 주입액의 형태로 넣을 수 있게 한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 바람직한 미소구는 친수성이고 양이온성이다. 상기 미소구는 바람직하게는 중성의 친수성 단량체, 이작용성 단량체, 양이온 전하를 갖는 하나 이상의 단량체, 및 임의로 상기 미소구를 검출할 수 있게 하는 작용화된 단량체를 포함한다. 상기 미소구는 또한 하나 이상의 세포 유착 촉 진제 및 표지 시약을 포함할 수 있다. 공중합체는 바람직하게는 약 25 내지 약 98 중량%의 중성의 친수성 아크릴 단량체, 약 2 내지 약 50 중량%의 이작용성 단량체, 및 약 0 내지 약 50 중량%의 양이온 전하를 갖는 하나 이상의 단량체를 공중합된 형태로 포함하는 친수성 아크릴 공중합체이다. 예로서, 본 발명에 참고로 인용된 프랑스 특허 제 2,378,808 호에 개시된 공중합체를 본 발명에 따라 사용하여 기본 미소구 공중합체를 제조할 수 있다. 친수성 아크릴 단량체로서, 아크릴아미드 및 그의 유도체, 메틸아크릴아미드 및 그의 유도체 또는 하이드록시메틸메타크릴레이트를 사용할 수 있다. 이작용성 단량체의 예로는 비 제한적으로 N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드, N',N'-디알릴타르티아미드 또는 글리옥살-비스-아크릴아미드가 있다. 또한, 양이온 전하를 갖는 단량체로는 비 제한적으로 3 급 또는 4 급 아민 작용기를 갖는 것들, 바람직하게는 디에틸아미노에틸 아크릴아미드, 메타크릴아미도프로필 트리메틸암모늄 또는 아크릴아미도에틸 트리에틸암모늄이 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 약 25 내지 약 98 중량%의 메타크릴아미드, 약 2 내지 약 50 중량%의 N,N-메틸렌-비스-아크릴아미드를 포함하는 공중합체를 사용한다.

본 발명의 또 다른 관련 태양에서, 색전 물질의 소수성 또는 이온 특성을 예를 들어 비 제한적으로 탄화수소 쇄 및/또는 친수성의 이온화 가능한 화학 그룹을 도입시킴으로써 필요한 것으로 간주되는 바와 같이 변경시킬 수 있다. 색전 물질의 상기와 같은 변경으로 생물활성 치료 인자와 형질감염제 간의 흡착 강도가 증가하며, 이는 생물활성 치료 인자의 전달을 위한 기간의 조절에 충분하다. 상기와 같은 생물활성 치료 인자와 형질감염제간의 흡착 강도의 상기와 같은 조절을 사용 하여 색전 물질과 회합된 생물활성 치료 인자의 절대 량을 조절할 수 있다.

*본 발명의 하나의 특히 유리한 실시태양에서, 유착제를 망상으로 만듦으로써 미소구의 안정성을 증가시키는 것도 가능하다. 예로서, 젤라틴의 경우에, 젤라틴 아민 상에서 반응하는 이작용성 화학작용제(예: 글루타르알데히드, 포름알데히드, 글리옥살 등) 중에서 망형성제를 선택할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 광원 아래서 및 신체 내에서 볼수 있는 미소구를 갖는 것이다. 예를 들어, 미소구를 합성 후에 표지하는 것도 또한 가능하다. 이를 예를 들어 형광 표지 유도체(예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민 이소티오시아네이트(RITC) 등)를 이식시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 작용화된 단량체는 일반적으로 상기 단량체와 마커(화학적 염료, 예를 들어 시바크론 블루 또는 프로시온 레드 HE-3B일 수 있으며, 이는 미소구의 직접적인 가시화를 가능하게 한다)를 화학적으로 커플링시킴으로써 수득된다(Boschetti, J. Biochem-Biophys. Meth., 19:21-36(1989)). 상기 유형의 표지에 사용될 수 있는 작용화된 단량체의 예로는 N-아크릴로일 헥사메틸렌 시바크론 블루 또는 N-아크릴로일 헥사메틸렌 프로시온 레드 HE-3B; 자기 공명 영상제(에르비움, 가돌리늄 또는 마그네타이트); 콘트라스트제, 예를 들어 바륨 또는 요오드 염(예를 들어 아크릴아미노-e-프로피온-아미도)-3-트리요오도-2,4,6-벤조산이 있으며, 문헌[Boschetti et al., Bull. Soc. Chim., No. 4 France, (1986)]에 개시된 조건 하에서 제조될 수 있다. 바륨 또는 마그네타이트 염의 경우에, 상기를 초기 단량체 용액에 분말화된 형태로 직접 도입시킬 수 있다.

당해 분야에 널리 공지된 다양한 유형의 세포 유착 촉진제들을 본 발명에 사용할 수 있다. 특히, 세포 유착 촉진제를 콜라겐, 젤라틴, 글루코스아미노글리칸, 피브로넥틴, 렉틴, 폴리양이온(예: 폴리리신, 키토산 등), 및 임의의 다른 천연 및 합성 생물학적 세포 유착제 중에서 선택할 수 있다.

*바람직하게는, 상기 세포 유착 촉진제는 미소구 또는 다른 고체 기질 중에 침전된 미소구 ㎖ 당 약 0.1 내지 1 g의 양으로 존재한다.

미소구를 현탁 중합, 드롭-바이-드롭 중합, 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 다른 방법에 의해 제조한다. 선택된 미소구의 제조 방식은 대개 생성되는 미소구에 목적하는 특성, 예를 들어 미소구 직경 및 화학적 조성에 따라 변할 것이다. 본 발명의 미소구를 당해 분야에 개시된 표준 중합 방법들에 의해 제조할 수 있다(예를 들어 본 발명에 참고로 인용된 문헌[E.Boschetti, Microspheres for Biochromatography and Biomedical Applications. Part I, Preparation of Microbeads In: Microspheres, Microencapsulation and Liposomes, John Wiley & Sons, Arshady R., Ed., vol. 2, p. 171-189(1999)]을 참조하시오). 미소구를 콜라겐(젤라틴은 변성된 콜라겐이다)과 같은 유착제를 함유하는 단량체들의 수용액으로부터 출발하여 제조한다. 이어서 상기 용액을 비 수성의 적합한 용매와 혼합하여 소적들의 현탁액을 제조하며, 이어서 상기는 적합한 촉매를 사용하는 단량체의 중합에 의해 고형 겔로 변한다. 이어서 미소구를 여과 또는 원심 분리에 의해 수거하고 세척한다.

세포 유착 촉진제 또는 표지 시약을 친화성 크로마토그래피에 대해 널리 공지된 화학적 커플링 과정("리간드 고정화"라는 용어로 지칭됨)에 의해 미소구 상에 도입시킨다. 또 다른 도입 방법은 미소구를 구성하는 겔 네트워크 내에서의 확산 및 이어서 상기 확산된 분자를 침전 또는 화학적 가교결합에 의해 적소에 포착시키는 것이다.

본 발명의 미소구를 또한 당해 분야, 예를 들어 프랑스 특허 제 2,378,808 호, 미국 특허 제 5,648,100; 5,635,215; 및 5,648,100 호(이들은 각각 본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 개시된 표준 중합 방법에 의해 수득할 수 있다. 일반적으로, 단량체들의 용액 중합을 중합 반응 개시제의 존재 하에서 약 0 내지 약 100 ℃ 및 약 40 내지 약 60 ℃ 범위의 온도에서 수행한다.

중합 개시제를 유리하게는 산화환원 시스템들 중에서 선택한다. 특히, 알칼리 금속 퍼설페이트와 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 또는 디메틸아미노프로피오니트릴, 유기 과산화물, 예를 들어 벤조일 퍼옥사이드 또는 심지어 2,2'-아조-비스-이소부티로니트릴과의 조합을 사용할 수 있다. 사용되는 개시제의 양은 추구하는 단량체의 양 및 중합 속도에 대해 당해 분야의 숙련가에 의해 선택된다. 중합을 덩어리로 또는 유화액으로 수행할 수 있다.

덩어리 중합의 경우에, 상이한 용해된 구성분과 개시제를 함유하는 수용액을 균질한 매질 중에서 중합시킨다. 이는 수성 겔 덩어리를 얻고 이어서 이를 예를 들어 스크린의 망에 통과시킴으로써 미소구로 분리시킬 수 있게 한다.

유화 또는 현탁 중합이 바람직한 제조 방법인데, 그 이유는 목적하는 크기의 미소구를 직접 얻을 수 있게 하기 때문이다. 상기를 하기와 같이 수행할 수 있다: 상이한 용해된 구성분들(예: 상이한 단량체, 세포 유착제)을 함유하는 수용액을 교반에 의해 물에 혼화되지 않는 액체 유기 상과 임의로 유화제의 존재 하에서 혼합한다. 교반 속도를 조절하여 목적하는 직경의 방울을 형성하는 유기 상 중의 수성 상 유화액을 얻는다. 이어서 중합을 개시제의 첨가에 의해 개시시킨다. 상기는 발열 반응을 수반하며, 이어서 반응 매질의 온도를 측정할 수 있다.

유기 상으로서 식물성 또는 광물성 오일, 몇몇 석유 증류 산물, 염소화된 탄화수소 또는 이들 상이한 용액들의 혼합물을 사용할 수 있다. 더욱 또한, 중합 개시제가 다수의 성분들(산화환원 시스템)을 포함하는 경우, 이들 중 하나를 유화 전에 수성 상에 가할 수 있다.

이어서 상기와 같이 수득된 미소구를 냉각, 경사분리 및 여과에 의해 회수할 수 있다. 이어서 상기를 크기 범주에 의해 분리시키고 세척하여 임의의 2 차 산물의 잔량을 제거한다.

상기 중합 단계에 이어서 세포 유착제의 망상화 단계 및 추정 상 미소구를 합성 후에 이식에 의해 식별가능하게 만드는 경우 표지 시약 단계를 수행할 수 있다.

2. 생물활성 치료 인자

본 발명의 생물활성 치료 인자는 하기 물질중 하나 이상을 포함한다: 항종양제, 혈관형성 억제제, 호르몬 및 스테로이드, 비타민, 펩티드 및 펩티드 동족체, 항체 또는 그의 단편, 세포분열 저지 인자, 백신, 효소, 알레르겐 억제제, 순환상 약물, 항결핵제, 항바이러스제, 협심증 억제제, 항균제, 및 항진균제, 소염제, 항원생동물제, 류마티스 억제제, 마취제, 강심성 글리코사이드 약제, 진정제, 국소 마취제, 항히스타민제, 방사능감수성 약제, 일반적인 마취제, 또는 이들의 조합.

3. 유전자 요법에 사용하기 위한 생물활성 치료 인자

폴리뉴클레오티드-기재 색전술 유전자 요법에 대해서, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 임의의 생물활성 치료 인자를 암호화할 수 있으며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 형질감염제와 회합된다. 본 발명의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 유전 물질로는 예를 들어 비 제한적으로 핵산, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 기원의 RNA 및 DNA, 예를 들어 재조합 RNA 및 DNA 및 안티센스 RNA 및 DNA; 망치머리형 RNA, 리보자임, 항원 핵산, 단일 및 이중 가닥 RNA 및 DNA 및 이들의 동족체, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드가 있다. 사용될 수 있는 유전 물질의 유형으로는 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 코스미드와 같은 발현 벡터 상에서 전달되는 유전자, 효모 인공 염색체(YAC), 및 결함 또는 "헬퍼" 바이러스뿐만 아니라 유전 물질을 운반하는 바이러스형 입자가 있다. 상기와 같은 폴리뉴클레오티드를 또한 다른 요소들, 예를 들어 비 제한적으로 조직 특이성 향상제, 핵 편재 신호 등과 함께 사용할 수 있다.

또한, 유전 물질을 예를 들어 단백질 또는 다른 중합체와 결합시킬 수 있다. 예를 들어 하나의 실시태양에서 본 발명은 또한 표적화 다클론성 및 단클론성 항체 를 중합체성 물질 담체, 생물활성 치료 인자 및 형질감염제와 함께 사용함을 제공한다. 본 발명의 미소구를 사용하여 적용시킬 수 있는 유전학적 치료제의 몇가지 예로서 HLA 유전자의 적어도 일부를 암호화하는 DNA, 디스트로핀의 적어도 일부를 암호화하는 DNA, 낭포성 섬유증 막통과 조절제(CFTR)의 적어도 일부를 암호화하는 DNA, IL-2의 적어도 일부를 암호화하는 DNA, TNF의 적어도 일부를 암호화하는 DNA, Ras의 적어도 일부를 암호화하는 DNA와 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 있다. 몇몇 단백질을 암호화하는 DNA를 다수의 상이한 유형의 질병들의 치료에 사용할 수 있다. 예를 들어, 종양 괴사 인자 및/또는 인터류킨-2를 진행된 암의 치료에 제공할 수 있고; HDL 수용체를 간 질환의 치료에 제공할 수 있고; 티미딘 키나제를 난소 암, 뇌 종양 또는 HIV 감염의 치료에 제공할 수 있으며; HLA-B7을 악성 흑색종의 치료에 제공할 수 있고; 인터류킨-2를 신경모세포종, 악성 흑색종 또는 신장 암의 치료에 제공할 수 있으며; 인터류킨-4를 암의 치료에 제공할 수 있고; HIV 외피를 HIV 감염의 치료에 제공할 수 있으며; 안티센스 ras/p53을 폐암의 치료에 제공할 수 있고; 아데노신 데아미나제를 ADA 결함의 치료에 제공할 수 있으며; 인자 VIII를 B 형 혈우병의 치료에 제공할 수 있다. 예를 들어 문헌[Science 258, 744-746]을 참조하시오.

4. 약물 요법에 사용하기 위한 생물활성 치료 인자

본 발명의 약물-기본 색전술 태양에 대해서, 생물활성 치료 인자는 본 발명의 미소구들과 회합된 하나 이상의 하기 약제들을 포함한다.

항종양제는 예를 들어 비 제한적으로 백금 화합물(예: 스피로플라틴, 시스플 라틴 및 카르보플라틴), 아드리아마이신, 미토마이신 c, 안사미토신, 블레오마이신, 블레오마이신 설페이트, 시토신 아라비노사이드, 아라비노실 아데닌, 머캅토폴리리신, 빈크리스틴, 부설판, 클로람부실, 멜파란(예: PAM, L-PAM 또는 페닐알라닌 겨자), 머캅토퓨린, 미토탄, 프로카르바진 하이드로클로라이드, 닥티노마이신(액티노마이신 D), 다우노루비신 하이드로클로라이드, 독소루비신 하이드로클로라이드, 탁솔, 미토마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 아미노글루테티미드, 에스트라머스틴 포스페이트 나트륨, 플루타미드, 류프롤리드 아세테이트, 메제스트롤 아세테이트, 타목시펜 시트레이트, 테스토락톤, 트리로스탄, 암사크린(m-AMSA), 아스파라기나제(L-아스파라기나제), 에르위나 아스파라기나제, 에토포시드(VP-16), 인터페론 α-2a, 인터페론 α-2b, 테니포시드(VM-26), 빈블라스틴 설페이트(VLB), 빈크리스틴 설페이트, 메토트렉세이트 및 카르젤레신을 포함한다.

혈액 제품은 예를 들어 비 제한적으로 에리쓰로포이에틴, 비 경구 철, 헤민 및 헤마토포르피린 및 그의 유도체를 포함한다.

생물학적 반응 조절제는 예를 들어 비 제한적으로 뮤라밀디펩티드, 뮤라밀트리펩티드, 림포킨(예: 세균성 내독소, 예를 들어 리포폴리사카라이드, 대식세포 활성화 인자), 세균의 서브유닛(예를 들어 마이코박테리아, 코리네박테리아), 합성 디펩티드, N-아세틸-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 및 프로스타글란딘을 포함한다.

항진균제는 예를 들어 비 제한적으로 케토코나졸, 니스타틴, 그리세오풀빈, 플루시토신(5-fc), 미코나졸, 암포테리신 B, 리신 및 베타-락탐 항생제(예: 설파제 신)를 포함한다.

호르몬 및 스테로이드는 예를 들어 비 제한적으로 성장 호르몬, 멜라닌세포 자극 호르몬, 부신피질영양성 호르몬, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 코르티손, 코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 사이피오네이트, 하이드로코르티손 나트륨 포스페이트, 하이드로코르티손 나트륨 숙시네이트, 프레드니손, 프레드니솔론, 프레드니솔론 아세테이트, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트, 프레드니솔론 테부테이트, 프레드니솔론 피발레이트, 트리암시놀론, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 헥사아세토니드, 트리암시놀론 디아세테이트, 메틸프로드니솔론, 메틸프로드니솔론 아세테이트, 메틸프로드니솔론 나트륨 숙시네이트, 플룬솔리드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 베타메타손, 베타메타손 이나트륨 포스페이트, 베타메타손 나트륨 포스페이트, 베타메타손 아세테이트, 베타메타손 이나트륨 포스페이트, 클로로프레드니손 아세테이트, 코르티코스테론, 데스옥시코르티코스테론, 데스옥시코르티코스테론 피발레이트, 데스옥시메타손, 에스트라디올, 플루드로코르티손, 플루드로코르티손 아세테이트, 디클로리손 아세테이트, 플루오로하이드로코르티손, 플루오로메쏠론, 플루프레드니솔론, 파라메타손, 파라메타손 아세테이트, 안드로스테론, 플루옥시메스테론, 알도스테론, 메트안드로스테놀론, 메틸안드로스텐디올, 메틸 테스토스테론, 노르에탄드롤론, 테스토스테론, 테스토스테론 에난테이트, 테스토스테론 프로피오네이트, 에퀼레닌, 에퀼린, 에스트라디올 벤조에이트, 에스트라디올 디프로피오네이트, 에스트리올, 에 스트론, 에스트론 벤조에이트, 아세톡시프로그네놀론, 아나제스톤 아세테이트, 클로르마디논 아세테이트, 플루로제스톤 아세테이트, 하이드록시메틸프로제스테론, 하이드록시메틸프로제스테론 아세테이트, 하이드록시프로제스테론, 하이드록시프로제스테론 아세테이트, 하이드록시프로제스테론 카프로에이트, 멜렌제스트롤 아세테이트, 노르메티스테론, 프레그네놀론, 프로제스테론, 에티닐 에스트라디올, 메스트라놀, 디메티스테론, 에티스테론, 에티노디올 디아세테이트, 노르에틴드론, 노르에틴드론 아세테이트, 노르에티스테론, 플루오시놀론 아세토니드, 플루란드레놀론, 플루니솔리드, 하이드로코르티손 나트륨 숙시네이트, 메틸프로드니솔론 나트륨 숙시네이트, 프레드니솔론 포스페이트 나트륨, 트리암시놀론 아세토니드, 하이드록시디온 나트륨 스피로노락톤, 옥산드롤론, 옥시메톨론, 프로메톨론, 테스토스테론 사이피오네이트, 테스토스테론 페닐아세테이트, 에스트라디올 사이피오네이트, 및 노르에티노드렐을 포함한다.

비타민은 예를 들어 비 제한적으로 시아노코발아민 네이노산, 레티노이드 및 그의 유도체, 예를 들어 레티놀 팔미테이트, 알파-토코페롤, 나프토퀴논, 콜레칼시페롤, 폴산 및 테트라하이드로폴레이트를 포함한다.

펩티드 및 펩티드 동족체는 예를 들어 비 제한적으로 망간 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 조직 플라스미노겐 활성인자(t-PA), 글루타치온, 인슐린, 도파민, RGD, AGE, RGE, KGD, KGE 또는 KQAGDV(GPIIBIIIa 수용체에 대한 친화성을 갖는 펩티드)를 함유하는 펩티드 리간드, 아편 펩티드, 엔케팔린, 엔돌핀 및 그의 동족체, 인간 융모막 고나도트로핀(HCG), 코르티코프로핀 방출 인자(CRF), 콜레시스토키닌 및 그 의 동족체, 브래디키닌 및 그의 동족체 및 촉진제 및 억제제, 엘라스틴, 바소프레신, 펩신, 글루카곤, 물질 P, 인테그린, 캡토프릴, 에날아프릴, 리시노프릴 및 다른 ACE 억제제, 부신피질영양성 호르몬(ACTH), 옥시토신, 칼시토닌, IgG 또는 그의 단편, IgA 또는 그의 단편, IgM 또는 그의 단편, 효과기 세포 프로테아제 수용체(모든 서브유형들)에 대한 리간드, 트롬빈, 스트렙토키나제, 유로키나제, t-PA 및 모든 활성 단편 또는 동족체, 단백질 키나제 C 및 그의 결합 리간드, 인터페론(알파-, 베타-, 감마-인터페론), 콜로니 자극 인자(CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 신경 성장 인자(NGF), 혈소판 유래된 성장 인자, 림포톡신, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈관 내피세포 성장 인자, 에리쓰로포이에틴, 형질전환 성장 인자, 온코스타틴 M, 인터류킨(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 및 12), 메탈로프로테인 키나제 리간드, 콜라게나제 및 작용물질 및 길항물질을 포함한다.

본 발명에 사용된 항체는 예를 들어 비 제한적으로 실질적으로 정제된 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 비-인간 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 다양한 실시태양에서, 본 발명의 실질적으로 정제된 항체 또는 그의 단편은 인간, 비-인간, 키메라 및/또는 인간화된 항체일 수 있다. 상기와 같인 비-인간 항체는 염소, 마우스, 양, 말, 닭, 토끼 또는 래트 항체일 수 있다. 한편으로, 본 발명의 비-인간 항체는 키메라 및/또는 인간화된 항체일 수 있다. 완전한 인간 항체가 인간 환자의 치료에 특히 바람직하다. 키메라 항체는 상이한 부분들이 상이한 동물 종들로부터 유래된 분자, 예를 들어 쥐 mAb와 인간 면역글로불린 일정 영역으로부터 유래된 가변 영역을 갖는 분자이다(본 발명에 참고로 인용된 카빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 보스(Boss) 등의 미국 특허 제 4,816,397 호를 참조하시오). 또한, 본 발명의 범위 내에서 고려되는 비-인간 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있다. 본 발명의 항체들 중 임의의 것을 치료 잔기 또는 검출가능한 물질에 결합시킬 수 있다. 본 발명의 항체에 결합시킬 수 있는 검출가능한 물질의 비 제한적인 예는 효소, 인공 보철 그룹, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질 및 방사성 물질이다.

본 발명은 중합체성 물질 담체, 생물활성 치료인자 및 형질감염제와 함께 표적화 다클론성 및 단클론성 항체의 용도를 제공한다. 상기와 같은 항체들은 본 발명의 방법에 유용하며 형질감염제에 결합된 생물활성 치료 인자 및 중합체성 물질의 작용 부위로의 표적화된 전달을 가능하게 한다. 본 발명에 사용된 "단클론성 항체" 또는 "다클론성 항체 조성물"이란 용어는 특정한 에피토프와 면역반응할 수 있는 항원 결합 부위의 오직 한가지 종만을 함유하는 항체 분자의 집단을 지칭한다. 다클론성 항체는 상술한 바와 같이 적합한 대상을 면역원으로서 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 바람직한 다클론성 항체 조성물은 예를 들어 본 발명의 조성물에 의해 치료되는 종양의 암세포 표면 상의 수용체의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들에 대한 항체들 중에서 선택된 것들이다.

세포분열 저지 인자는 비 제한적으로 에스트라무스틴 및 그의 인산화된 유도체, 에스트라무스틴-포스페이트, 독소루비신, 암페티닐, 콤브레타스타틴 A4 및 콜치신을 포함한다.

백신은 예를 들어 비 제한적으로 폐렴구균 백신, 소아마비 백신, 탄저병 백신, 결핵(BCG) 백신, A형 간염 백신, 콜레라 백신, A, C, Y형 수막구균 백신, W135 백신, 페스트 백신, 광견병(인간 2배체) 백신, 황열 백신, 일본 뇌염 백신, 장티프스(페놀 및 열-치사) 백신, B형 간염 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, 에이치 인플루엔자 b형 백신, 폴리오 백신, 홍역 백신, 유행성 이하선염 백신, 풍진 백신, 수두 백신, 스트렙토코커스 뉴모니아에 Ty(생 돌연변이 세균) 백신, Vi(Vi 캡슐형 폴리사카라이드) 백신, DT(변성독소) 백신, Td(변성독소) 백신, aP(불활성 세균 항원/악셀룰라(DtaP)) 백신, Hib(세균성 폴리사카라이드-단백질 결합물) 백신, B형 간염 바이러스(불활성 혈청 유래된 바이러스 항원/재조합 항원) 백신, 인플루엔자 백신, 로타바이러스 백신, 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 백신, 인간 아스트로바이러스 백신, 로타바이러스 백신, A형 및 B형 인간 인플루엔자 바이러스 백신, A형 간염 바이러스 백신, 생 약독화된 파라인플루엔자 바이러스 3 형 백신, 장바이러스 백신, 레트로바이러스 백신 및 피코르나바이러스 백신을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법으로 치료할 수 있는 질병으로는 예를 들어 비 제한적으로 간, 신장, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 유잉 육종, 임신성 영양모세포성 암종, 호즈킨 병, 비-호즈킨 림프종, 버키트 림프종 확산성 대세포 림프종, 모낭 혼합 림프종, 림프모세포성 림프종, 횡문근육종, 고환 암종, 윌름 종양, 항문 암종, 방광 암종 유방 암종, 만성 림프구성 백혈성, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 두부 및 경부 암종, 폐(소세포) 암종, 다발성 골수종, 비- 호즈킨 림프종, 낭성 림프종, 난소 암종, 뇌종양(성상세포종), 경부 암종, 결장직장 암종, 간세포 암종, 카포시 육종, 폐(비 소세포) 암종, 흑색종, 췌장 암종, 전립선 암종, 연조직 암종, 유방 암종, 결장직장 암종(단계 III), 골형성성 육종, 난소 암종(단계 III), 고환 암종 또는 이들의 조합들이 있다.

효소는 예를 들어 비 제한적으로 알칼리성 포스파타제, 사이클로옥시게나제 유형 I 및 길항물질 및 작용물질을 포함한다.

알레르겐 억제제는 예를 들어 비 제한적으로 아멜렉사녹스를 포함한다.

응고 억제제는 예를 들어 비 제한적으로 펜프로쿠몬 및 헤파린을 포함한다.

순환성 약물은 예를 들어 비 제한적으로 프로프라놀롤을 포함한다.

항결핵제는 예를 들어 비 제한적으로 파라-아미노살리실산, 이소니아지드, 카프레오마이신 설페이트 사이클로세린, 에탐부톨 하이드로클로라이드 에티온아미드, 피라진아미드, 리팜핀, 및 스트렙토마이신 설페이트를 포함한다.

항바이러스제는 예를 들어 비 제한적으로 아사이클로비어, 아만타딘 아지도티미딘(AZT 또는 지도뷰딘), 리바비린 및 비다라빈 일수화물(아데닌 아라비노사이드, 아라-A)을 포함한다.

협심증 치료제는 예를 들어 비 제한적으로 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 에리쓰리톨 테트라니트레이트, 이소소르바이드 디니트레이트, 니트로글리세린(글리세릴 트리니트레이트) 및 펜타에리쓰리톨 테트라니트레이트를 포함한다.

항생제는 예를 들어 댑손, 클로람페니콜, 네오마이신, 세파클로, 세파드록실, 세파렉신, 세프라딘 에르쓰로마이신, 클린다마이신, 린코마이신, 아목시실린, 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 디클록사실린, 사이클라실린, 피클록사실린, 헤타실린, 메티실린, 나프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 티카르실린, 리팜핀 및 테트라사이클린을 포함한다.

소염제 및 진통제는 예를 들어 디플루니살, 이부프로펜, 인도메타신, 메클로페나메이트, 메페남산, 나프록센, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캄, 설핀닥, 톨메틴, 아스피린 및 살리실레이트를 포함한다.

항원생동물제는 예를 들어 비 제한적으로 클로로퀸, 메트로니다졸, 하이드록시클로로퀸, 퀴닌 및 메글루민 안티모네이트를 포함한다.

류마티스 억제제는 예를 들어 비 제한적으로 레니실라민을 포함한다.

마취제는 예를 들어 비 제한적으로 진통제 및 아편양제제, 예를 들어 코데인, 헤로인, 메타돈, 모르핀 및 오피움을 포함한다.

강심성 글리코사이드 약제는 예를 들어 비 제한적으로 데스라노사이드, 디지톡신, 디곡신, 디지타린 및 디지타리스를 포함한다.

신경근 봉쇄제는 예를 들어 비 제한적으로 아트라큐리움 메실레이트, 갈라민 트리에티오다이드, 헥사플루오레늄 브로마이드, 메토큐린 요오다이드, 판큐로늄 브로마이드, 숙시닐콜린 클로라이드(숙사메토늄 클로라이드), 튜보큐라린 클로라이드 및 베큐로늄 브로마이드를 포함한다.

진정제(최면제)는 예를 들어 비 제한적으로 아모바르비탈, 아모바르비탈 나트륨, 아프로바르비탈, 부타바르비탈 나트륨, 클로랄 하이드레이트, 에트클로비놀, 에티나메이트, 플루라제팜 하이드로클로라이드, 글루테티미드, 메토트리메프라진 하이드로클로라이드, 메티프릴론, 미다졸람 하이드로클로라이드 파라알데히드, 펜토바르비탈, 펜토바르비탈 나트륨, 페노바르비탈 나트륨, 세코바르비탈 나트륨, 탈부탈, 테마제팜 및 트리아졸람을 포함한다.

국소 마취제는 예를 들어 비 제한적으로 부피바카인 하이드로클로라이드, 클로로프로카인 하이드로클로라이드, 에티도카인 하이드로클로라이드, 리도카인 하이드로클로라이드, 메피바카인 하이드로클로라이드, 프로카인 하이드로클로라이드 및 테트라카인 하이드로클로라이드를 포함한다.

일반적인 마취제는 예를 들어 비 제한적으로 드로페리돌, 에토미데이트, 드로페리돌을 갖는 펜타닐 시트레이트, 케타민 하이드로클로라이드, 메토헥시탈 나트륨 및 티오펜탈 나트륨을 포함한다.

방사성 입자 또는 방사성 이온은 예를 들어 비 제한적으로 스트론튬, 레늄, 이트륨, 테크네튬 및 코발트를 포함한다.

바람직하게는, 생물활성 치료 인자는 항종양제, 호르몬, 스테로이드, 항진균제, 펩티드 또는 펩티드 동족체이다. 보다 바람직하게는, 생물활성 치료 인자는 덱사메타손, 암포테리신 B, 아드리아마이신, 미토마이신 c, 탁솔, 독소루비신 또는 조직 플라스미노겐 활성인자(t-PA)이다. 본 발명에 사용되는 생물활성 치료 인자는 바람직하게는 저 농도에서 매우 활성이다. 본 발명의 표적화 태양은 치료 부위에서의 유효 농도를 몸 안에서 희석되지 않은 채로 유지시키므로 치료에 적용되는 용량을 보다 낮출 수 있다. 환자에게 투여되는 본 발명의 생물활성 치료 인자의 양은 예를 들어 사용되는 특정 생물활성 치료 인자, 상기 생물활성 치료 인자가 투여되는 방법, 및 환자의 연령, 성별, 체중 및 신체적 조건들에 따라 변한다. 일반적으로, 치료는 작은 용량으로 시작하며, 이어서 이를 특정 상황 하에서 목적하는 효과가 달성될때까지 작은 증분으로 증가시킬 수 있다. 또한, 당해 분야의 숙련가는 기준 물질, 예를 들어 문헌[Physician's Desk Reference, Medical Economics Company, Montvale N.J. 07645-1742]에 따라 적합한 양의 특정 생물활성 치료 인자, 및 따라서 본 발명의 방법을 사용하여 치료 약물과 유전자 요법의 경우에 환자에게 투여될 수 있는 본 발명의 상응하는 전구약물을 결정할 수 있다. 본 발명에 따라, 상기 전구약물을 예를 들어 환자의 증상(즉, 질병 상태, 질병, 질환 등)을 치료하기 위해서 상기 환자(예를 들어 환자의 국소 부위)에 전달한다. 상기 전구약물을 상기와 같이 사용하거나 또는 유화액과 같은 다른 실시태양에 혼입시킬 수 있다.

5. 폴리뉴클레오티드 전달용 형질감염제

핵산, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 기원의 RNA 및 DNA, 예를 들어 재조합 RNA 및 DNA 및 안티센스 RNA 및 DNA; 망치머리형 RNA, 리보자임, 항원 핵산, 단일 및 이중 가닥 RNA 및 DNA 및 이들의 동족체를 단독으로 또는 다른 요소들, 예를 들어 비 제한적으로 조직 특이성 향상제, 및 핵 편재화 신호와 함께 포함하는 유전 물질을 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 진핵 세포 내에 도입시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 "형질전환" 및 "형질감염"이란 용어는 외래 핵산을 숙주 세포에 도입시키기 위한 당해 분야에 인식된 다양한 기법, 예를 들어 비 제한적으로 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션, 또는 일렉트로포레이션을 지칭하는데 사용된다. 숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염에 적합한 방법들이 상기 문헌[Sambrook, et al.] 및 다른 실험용 편람에 개시되어 있다.

포유류 세포의 안정한 형질감염을 위해서, 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라 단지 작은 세포 분획들만이 외래 DNA를 그의 게놈 내로 통합시킬 수 있음이 공지되어 있다. 이들 통합물들을 동정 및 선별하기 위해서, 선별가능한 마커(예를 들어 항생제 내성에 대한)를 암호화하는 유전자를 일반적으로 관심 유전자와 함께 숙주 세포 내에 도입시킨다. 바람직한 선별가능한 마커로는 약물에 내성을 부여하는 것들, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트가 있다. 도입된 핵산에 의해 안정하게 형질감염된 세포를 약물 선별에 의해 동정할 수 있다(예를 들어 선별가능한 마커 유전자를 갖는 세포는 생존하는 반면, 다른 세포들은 죽을 것이다).

본 발명의 생물활성 치료 조성물의 효율적인 생체 내 전달을 얻기 위해서, 다양한 형질감염제들을 사용한다. 본 발명의 방법에 사용하기 적합한 형질감염제의 전형적인 예로는 비 제한적으로 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 4급 암모늄 양쪽성 DOTMA((디올레오일옥시프로필)트리메틸암모늄 브로마이드, 리포펙틴으로 GIBCO-BRL에 의해 시판됨)(Felgner et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7414; Malone et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 6077-6081); 트리메틸암모늄 헤드 펜던트를 갖는 친지성 글루타메이트 디에스테르(Ito et al.(1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); 대사성 모 지질, 예를 들어 양이온성 지질 디옥타데실아미도 글리실스페르민(DOGS, Transfectam, Promega) 및 디팔미토일포스파티딜 에탄올아밀스페르민(DPPES)(J.P. Behr(1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J.P. Behr et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986); 대사성 4 급 암모늄 염(DOTB, N-(1-[2,3-디올레오일옥시]프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸설페이트(DOTAP)(Boehringer Mannheim), 폴리에틸렌이민(PEI), 디올레오일 에스테르, ChoTB, ChoSC, DOSC)(Venentis et al.(1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)/3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤 DC-Chol(1:1 혼합물)(Gao et al.,(1991) Biochim, Biophys. Acta 1065, 8-14), 스페르민, 스페르미딘, 리포폴리아민(Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5:382-389), 친지성 폴리리신(LPLL)(Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), [[(1,1,3,3-테트라메틸부틸)크레속실]에톡시]에틸]디메틸벤질암모늄 하이드록사이드(DEBDA 하이드록사이드)(과잉량의 포스파티딜콜린/콜레스테롤 함유)(Ballas et al.,(1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)/DOPE 혼합물(Pinnaduwage et al., (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), 포스파티딜에탄올아민과 혼합된 DOPE, CTAB, DEBDA, 디도데실암모늄 브로마이드(DDAB) 및 스테아릴아민과의 글루탐산의 친지성 디에스테르(TMAG)(Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE(TransfectACE, GIBCO BRL) 및 올리고갈락토오즈 함유 지질(Remy et al., 발행될 것임)이 있다.

또한 생물활성 치료 인자의 세포 내로의 전달 효율을 증가시키기 위해 다양한 형질감염 향상제를 사용하는 것도 본 발명에 포함된다. 적합한 형질감염 향상제로는 예를 들어 비 제한적으로 DEAE-덱스트란, 폴리브렌, 리소솜-파괴성 펩티드(Ohmori N I et al., Biochem Biophys Res Commun 1997 Jun 27; 235(3):726-9), 콘드로이탄-계 프로테오글리칸, 황산화된 프로테오글리칸, 폴리에틸렌이민, 폴리리신(Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273(13):7507-11), 인테그린-결합 펩티드 CYGGRGDTP, 선형 덱스트란 노나사카라이드, 글리세롤, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드간 결합에 구속된 콜레스테릴 그룹(Letsinger, R.L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:(17):6553-6), 리소포스파티드, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 및 1-올레오일 리소포스파티딜콜린이 있다.

바람직한 적합한 형질감염제의 예로는 비 제한적으로 1992년 12월 15일자로 베어(Behr) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,171,678 호, 1995년 12월 19일자로 베어 등에게 허여된 미국 특허 제 5,476,962 호, 및 1997년 4월 1일자로 베어 등에게 허여된 미국 특허 제 5,616,745 호에 개시된 리포폴리아민이 있으며, 상기 특허들은 본 발명에 참고로 인용되어 있다.

본 발명의 특히 바람직한 형질감염제는 1992년 12월 15일자로 베어(Behr) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,171,678 호, 1995년 12월 19일자로 베어 등에게 허여된 미국 특허 제 5,476,962 호, 및 1997년 4월 1일자로 베어 등에게 허여된 미국 특허 제 5,616,745 호에 개시된 화학식 I의 리포폴리아민을 포함한다.

화학식 I의 리포폴리아민은 진핵 세포의 형질감염을 위한 벡터로서 특히 유용하다. 화학식 I의 리포폴리아민은 물에 분산 시 이온 매질에서 불안정한 단일 라멜라 나노입자를 형성하고 그의 양이온 부분을 통해 플라스미드 또는 올리고뉴클레오티드 DNA와 강하게 회합하여 이들을 충전시키고 지질 층으로 덮는 성질을 갖는다. 핵산에 비해 과잉의 양이온 전하를 사용함으로써, 상기 지질/DNA 복합체를 세포막 상에 흡착시키고, 이에 의해 상기 세포에 의한 DNA의 흡수를 촉진시킬 수 있다.

상기와 같은 화학식 I의 리포폴리아민은 추가로 약한 세포(예를 들어 비 제한적으로 뇌하수체 중엽 또는 전엽 세포, 크롬친화 세포, 말초 또는 중추 신경이 있다)를 형질감염시킬 수 있다.

6. 재조합 발현 벡터

본 발명의 또 다른 태양은 벡터를 색전화에 의해 또는 색전화 없이 전달하는 것에 관한 것이다. 바람직하게는 발현 벡터는 본 발명의 생물활성 치료 인자 또는 폴리펩티드(또는 그의 일부)를 암호화하는 핵산을 함유한다. 본 발명에 사용된 "벡터"란 용어는 또 다른 핵산을 상기가 결합된 핵산으로 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한가지 유형은 "플라스미드"로, 이는 추가적인 DNA 분절을 연결시킬 수 있는 환상의 이중 가닥 DNA 고리를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터인데, 여기에서 추가적인 DNA 분절들이 상기 바이러스 게놈 내로 연결될 수 있다. 바이러스 벡터의 구체적인 예로는 비 제한적으로 본 발명의 미소구 및 형질감염제를 사용하는 유전자 유법에 대해서 아데노바이러스 및 레 트로바이러스 벡터가 있다. 또한 생물활성 치료 인자를 함유하는 바이러스형 입자의 사용이 본 발명에서 고려되는데, 여기에서 상기 바이러스형 입자는 상기 형질감염제에 물리적으로 결합되며, 상기는 또한 미소구에 결합된다. 또한 생물활성 치료 인자를 함유하는 바이러스형 입자의 사용이 본 발명에서 고려되는데, 여기에서 상기 바이러스형 입자는 상기 형질감염제에 물리적으로 결합되며, 상기는 또한 미소구에 결합된다. 상기와 같은 바이러스형 입자들은 디설파이드 가교의 형성을 통해 인테그린-결합 펩티드 CYGGRGDTP에 결합된 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 고안될 수 있다. 상기와 같은 PEI/RGD-함유 펩티드/복합체는 크기 및 중심적으로 보호된 코어와 같은 아데노바이러스 구성 성질뿐만 아니라 인테그린 및 산-촉발된 엔도솜 이탈에 의해 매개되는 세포 침입과 같은 초기의 성질을 공유한다.

몇몇 벡터들은 상기가 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예를 들어 세균 기원의 복제를 갖는 세균 벡터와 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터들(예를 들어 비-에피솜 포유동물 벡터)은 숙주 세포에 도입 시 상기 숙주 세포의 게놈 내로 통합되며, 이에 의해 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 몇몇 벡터들, 발현 벡터들은 작용적으로 결합되는 유전자의 발현을 조종할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드(벡터)의 형태이다. 그러나, 본 발명은 상기와 같은 다른 형태의 발현 벡터들, 예를 들어 바이러스 벡터(예를 들어 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함시키고자 하며, 이들은 동등하게 작용한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함한다. 이는 상기 재조합 발현 벡터가 발현에 사용되는 숙주 세포를 기준으로 선택된, 발현되는 핵산 서열에 작용적으로 결합된 하나 이상의 조절 서열을 포함함을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작용적으로 결합된"이란 (예를 들어 생체 외 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 도입되는 숙주 세포에서) 관심의 뉴클레오티드 서열이 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 결합됨을 의미한다. "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인헨서 및 다른 발현 조절 요소들(예를 들어 폴리아데닐화 신호)을 포함하고자 한다. 상기와 같은 조절 서열들은 예를 들어 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA(1990)]에 개시되어 있다. 조절 서열은 다수 유형의 숙주 세포에서의 뉴클레오티드 서열의 구성적인 발현을 조종하고 단지 몇몇 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열(예를 들어 조직-특이적인 조절 서열)을 조종하는 것들을 포함한다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 변할 수 있음을 당해 분야의 숙련가들은 인식할 것이다. 본 발명의 발현 벡터들을 숙주 세포 내에 도입시켜 본 원에 개시된 바와 같이 핵산에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 융합 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터들을 원핵세포(예: 이 콜라이) 또는 진핵세포(예를 들어 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터), 효모 세포, 또는 포유동물 세포)에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위해 디자인할 수 있다. 적합한 숙주 세포들이 상기 고이델의 문헌에 추가로 논의되어 있다. 한편으로, 재조합 발현 벡 터를 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 생체 외에서 전사 및 번역할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 본 발명의 핵산을 포유동물 발현 벡터를 사용하여 포유동물 세포에서 발현시킨다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 pCDM8(Seed(1987) Nature 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman et al.(1987) EMBO J. 6:187-195)가 있다. 포유동물 세포에서 사용 시 상기 발현 벡터의 조절 기능은 종종 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터들은 폴리오마, 아데노바이러스 2, 세포확대 바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포 모두에 적합한 다른 발현 시스템들에 대해서 상기 문헌 [Sambrook et al., chapters 16 and 17]을 참조하시오.

또 다른 실시태양에서, 재조합 포유동물 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 핵산을 조정 발현할 수 있다(예를 들어 조직-특이적인 조절 요소들을 사용하여 핵산을 발현시킨다). 조직-특이적인 조절 요소들은 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 조직-특이적인 프로모터들의 비 제한적인 예로는 알부민 프로모터(간-특이적임; Pinkert et al.(1987) Genes Dev. 1:268-277), 림프-특이적인 프로모터(Calame and Eaton(1988) Adv. Immunol. 43:235-275), 특히 T 세포 수용체의 프로모터(Winoto and Bltimore(1989) EMBO J. 8:729-733) 및 면역글로불린(Banerji et al.(1983) Cell 33:729-740; Queen and Baltimore(1983) Cell 33:741-748), 뉴런-특이적인 프로모터(예를 들어 뉴로필라멘트 프로모터; Byrne and Ruddle(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), 췌장-특이적인 프로모터(Edlund et al.(1985) Science 230:912-916), 전립선-특이적인 프로모터 및/또는 인헨서(본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,830,686 호 및 5,871,726 호) 및 유선 특이적인 프로모터(예를 들어 유장 프로모터; 미국 특허 제 4,873,316 호 및 유럽 출원 공보 제 264,166 호)가 있다. 발생적으로 조절되는 프로모터, 예를 들어 쥐 혹스 프로모터(Kessel and Gruss(1990) Science 249:374-379) 및 α-태아 단백질 프로모터(Campes and Tilghman(1989) Genes Dev. 3:537-546)가 또한 고려된다.

본 발명은 또한 안티센스 배향으로 발현 벡터 내로 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 즉, 상기 DNA 분자가 소정의 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자의 발현을 허용하는 방식(상기 DNA 번자의 전사에 의해)으로 조절 서열에 작용적으로 결합된다.

다양한 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자의 연속적인 발현을 조종하는 안티센스 배향으로 클로닝된 핵산에 작용적으로 결합된 조절 서열을 선택할 수 있다, 예를 들어 안티센스 RNA의 구성적인, 조직 특이적이거나 세포 유형 특이적인 발현을 조종하는 바이러스 프로모터 및/또는 인헨서, 또는 조절 서열을 선택할 수 있다. 상기 안티센스 발현 벡터는 안티센스 핵산이 고도로 효율적인 조절 영역(그의 활성은 벡터가 도입되는 세포 유형에 의해 결정될 수 있다)의 통제 하에서 생산되는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 감독된 바이러스의 형태로 존재할 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하는 유전자 발현의 조절에 대한 논의를 문헌[Weintraub et al. Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]에서 찾을 수 있다.

본 발명의 하나의 태양에서, 다양한 암들을 상기 암 세포 유전자의 발현에 초점을 두기 위해서 DNA 주형 상의 독소 유전자에 조직 특이적인 인헨서 및/또는 프로모터를 공급함으로써 치료할 수 있다. 예를 들어 독소 유전자에는 비 제한적으로 디프테리아 독소 유전자가 있다. 디프테리아 독소의 세포 내 발현은 세포를 죽이는 것으로 공지되어 있다. 췌장 암에 대한 췌장-특이적인 프로모터의 사용과 같이 몇몇 프로모터의 사용은 조직-특이적일 수 있다. 따라서, 췌장 세포로 전달된 작용적인 디프테리아 독소 유전자는 이론 상 전체 췌장을 근절시킬 수 있다. 이러한 전략을 췌장 암의 치료에 사용할 수 있다. 조직 특이적인 인헨서는 디프테리아 독소의 발현을 오직 췌장 세포에서만 일어나게 한다. 조직 특이적인 인헨서의 통제 하에서 상기 디프테리아 독소 유전자를 함유하는 DNA/리포폴리아민/미소구 복합체를 췌장에 들어가는 캐뉼라를 꽂은 동맥에 직접 도입시킬 것이다. 상기 주입은 췌장 조직의 근절이 필요한 한 오랜동안 일부 투여 스케줄에 따라 수행될 것이다. 디프테리아 독소 이외에 다른 치사 유전자, 예를 들어 리신 또는 코브라 독 인자 또는 장독소에 대한 유전자를 유사한 효과로 사용할 수 있다.

또 다른 구체적인 예로는 췌장 암의 치료가 필요한 환자의 전립선에 본 발명의 생물활성 치료 인자를 보내기 위한 전립선 특이적인 항원 프로모터/인헨서의 사용이 있다. 또한 예를 들어 비 제한적으로 몇몇 암의 암 성질을 억제시키는 유전자, 예를 들어 p53 유전자, 망막모세포종 유전자( 및 상기 유전자 계열의 다른 것들)의 전달에 의해 특화된 암을 치료할 수 있다.

7. 아데노바이러스 - 매개된 유전자 전달

유전자 요법의 목적을 위해서, 결실을 수반하는 아데노바이러스가 적합한 비 히클로서 제안되었다. 아데노바이러스는 외피가 없는 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스로부터 유래된 유전자-전달 벡터(소위 아데노바이러스 벡터)는 상기를 상기와 같은 목적의 유전자 전달에 특히 유용하게 만드는 다수의 특징들을 갖는다. 예를 들어, 아데노바이러스의 생물학은, 상세하게는, 상기 아데노바이러스가 심각한 인간 병리와는 관계가 없으며, 상기 바이러스는 그의 DNA를 숙주 세포 내로 도입시킴에 있어서 대단히 효율적이고, 광범위하게 다양한 세포를 감염시킬 수 있으며, 광범위한 숙주 범위를 갖고, 상대적으로 용이하게 다량 생산될 수 있으며, 특히 바이러스 게놈의 초기-영역 1(E1)의 결실에 의해 복제 결함이 될 수 있다.

아데노바이러스 게놈은 각 DNA 스트랜드의 5' 말단에 55-kDa의 말단 단백질이 공유 결합되어 있는, 대략 36,000 염기쌍으로 된 선형의 이중 가닥 DNA 분자이다. 상기 Ad DNA는 항원형에 따라 정확한 길이를 갖는 약 100 염기 쌍의 동일한 역전된 말단 반복부(ITR)를 함유한다. 상기 바이러스의 복제 기원은 정확하게 게놈 단부에서 ITR의 내부에 위치한다. DNA 합성은 2 단계로 일어난다. 먼저, 복제는 스트랜드 치환에 의해 진행하여, 이중 딸 분자와 모 치환된 스트랜드를 생성시킨다. 상기 치환된 스트랜드는 단일 가닥이며 소위 "손잡이" 중간체를 형성할 수 있고, 이는 복제 개시와 이중 딸 분자의 생성을 허용한다. 한편으로, 복제를 게놈의 양쪽 단부에서 동시적으로 진행시켜, 상기 손잡이 구조의 형성 요구를 생략시킬 수도 있다.

생산적인 감염 주기 중에, 상기 바이러스 유전자는 2 개의 단계로 발현된다, 즉 초기 단계는 바이러스 DNA 복제까지의 기간이고, 나중 단계는 바이러스 DNA 복 제의 개시와 일치한다. 상기 초기 단계 중에는 오직 E1, E2, E3 및 E4 영역에 의해 암호화되는 초기 유전자 산물만이 발현되며, 상기 발현은 바이러스 구조 단백질의 합성을 위한 세포를 제조하는 다수의 기능을 수행한다(Berk, 1986). 나중의 단계 중에는 나중의 바이러스 유전자 산물이 상기 초기 유전자 산물 이외에 발현되며, 숙주 세포 DNA와 단백질 합성이 중단된다. 결과적으로, 상기 세포는 바이러스 DNA와 바이러스 구조 단백질의 생산에 기여하게 된다(Tooze, 1981).

구조와 성질이 다소 다른 다양한 아데노바이러스 항원형들이 존재한다. 이들 항원형 중에서, 본 발명의 구성 내에서 2 또는 5 형 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(본 발명에 참고로 인용되어 있는 WO 94/26914를 참조하시오)를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 구성 안에서 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스 중에는, 개, 소, 쥐(예: Mav1, Beard et al., Virology 75(1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 한편으로 원숭이(예: SAV) 기원의 아데노바이러스들이 고려된다. 바람직하게는 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스, 보다 바람직하게는 CAV-2 아데노바이러스[예를 들어 Manhattan 또는 A26/61 균주(ATCC VR-800)]이다. 바람직하게는, 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 결함성 재조합 아데노바이러스를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 기법에 의해 제조할 수 있다(Levrero et al., Gene 101(1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3(1984)2917). 특히, 상기를 아데노바이러스와 관심 유전자를 함유하는 플라스미드, 특히 카세트 간의 동종 재조합 에 의해 제조할 수 있다. 상기 동종 재조합은 아데노바이러스와 플라스미드의 적합한 세포 주 내로의 동시형질감염 후에 일어난다. 사용되는 세포 주는 바람직하게는 (i) 상기 요소들에 의해 형질전환 가능하고, (ii) 재조합의 위험성을 피하기 위해서 바람직하게는 통합된 형태로 상기 결함 아데노바이러스 게놈 부분을 보완할 수 있는 서열을 함유해야 한다. 세포주의 예로서, 특히 게놈에 Ad5 아데노바이러스 게놈의 왼쪽 부분(12%)이 통합된 인간 태아 신장 주 293(Graham et al., J. Gen. Virol. 36(1977)59)을 들 수 있다. 아데노바이러스로부터 유래된 벡터를 제작하기 위한 전략이 또한 본 발명에 참고로 인용된 WO94/26914 및 FR 2,707,664에 개시되어 있다.

8. 레트로바이러스 입자- 매개된 유전자 전달

레트로바이러스 벡터는 표적 세포 염색체에서 바이러스에 의해 전달된 정보의 안정한 동시-선형 통합과 높은 감염 효율과 같은 레트로바이러스 복제 주기의 특징들을 이용하는 포유동물용 유전자 전달 비히클이다. 레트로바이러스 벡터는 기본적인 생물공학 및 유전자 요법 연구에 중요한 도구가 되고 있다.

현재 사용 중인 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MLV)로부터 유래한다. MLV는 다양한 세포 유형에서의 잘 보고된 전사 패턴과 비교적 간단한 단위 유전자 구조로 인해 벡터로서 특히 적합하다.

레트로바이러스 구조: 레트로바이러스는 외피가 있는 바이러스에 속한다. 이중지질 외피는 숙주 세포막으로부터 유래하며 바이러스 표면 단백질(SU) 및 막통과 단백질(TM)의 삽입에 의해 변형된다. 매트릭스 단백질(MA)은 내부 코어를 둘 러싸는 외막 바로 아래에 위치한다. 상기 코어는 캡시드 단백질(CA)로 이루어진다. 상기 캡시드 안에는 수소 결합을 통해 5' 단부에서 서로 부착되어 있는 레트로바이러스 게놈의 2 개의 복사물이 있다. 상기 바이러스 코어 입자는 또한 바이러스 효소, 즉 역 전사효소(RT), 프로테아제(PR), 및 통합효소(IN), 및 바이러스 게놈에 결합된 뉴클레오캡시드 단백질(NC)을 함유한다. 상기 바이러스에 의해 암호화된 이들 단백질 이외에, 상기 비리온은 또한 숙주 세포 tRNA 집단으로부터 유래된 다수의 tRNA 분자를 함유한다.

쥐 백혈병 바이러스(MLV)는 간단한 레트로바이러스에 속한다. 레트로바이러스는 특징적인 게놈 지도, 즉 3 개의 구조 유전자 gag, pol 및 env의 측면에 위치한 2 개의 긴 말단 반복부(LTR)를 갖는다. 상기 LTR은 3 개의 영역, 세포 전사기에 의해 인식되는 인헨서와 프로모터 요소를 함유하는 U3 영역, 역 전사 중에 중요한 역할을 하고 더욱 또한 폴리아데닐화 신호를 함유하는 R 영역, 및 역 전사 및 레트로바이러스 게놈의 포장에 중요한 서열을 함유하는 U5 영역으로 세분될 수 있다. 또한, 상기 LTR은 통합 과정 동안 중요한 시스 요소, 역전된 반복부를 함유한다.

상기 통합된 프로바이러스는 2 개의 mRNA 전사물, 즉 gag- 및 gag-pol 폴리단백질을 암호화하는 완전한 길이의 mRNA, 및 외피 당단백질을 암호화하는 이어진 mRNA를 생성시킨다. 상기 완전한 길이의 mRNA는 또한 게놈 RNA로서 작용하며, 이미 개시된 LTR 잔기의 성분들 이외에 5' 번역되지 않은 서열에 3 개의 중요한 시스 요소를 함유한다. 상기 U5 영역으로부터 아래에 위치한 프라이머 결합 부위(PBS) 는 프라이머 tRNA 분자의 3'-단부에 상보적인 18 개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 또한, PBS와 gag 개방 판독 프레임의 발단부 사이의 5' 번역되지 않은 영역에 포장 신호(PSI)가 위치한다. 상기 5' 번역되지 않은 영역은 비리온의 2 개의 바이러스 게놈의 이량체화에 기여하는 이량체 결합 도메인을 함유한다. 상기 U3 영역의 바로 위에는 또 다른 중요한 시스 요소인 폴리퓨린 구역(PP)이 있으며, 상기는 A와 G 잔기의 신장부로 이루어진다. 상기 요소는 역 전사 중에 플러스-스트랜드 DNA 합성을 개시시키기 위한 부위로서 작용한다.

레트로바이러스 생활사: 2 개의 상이한 기전이 숙주 세포질 내로의 바이러스 입자의 침입을 설명하기 위해 제시되었다. MLV를 포함한 대부분의 레트로바이러스는 전체 외피로 싸인 바이러스 입자가 엔도솜체 내로 흡수되는 과정인 수용체-매개된 세포내이입을 통해 숙주 세포내로 들어가는 것으로 여겨진다. 동종숙주역의 쥐 백혈병 바이러스에 대한 수용체 분자가 클로닝되었고 양이온성 아미노산 운반자로서 동정되었다.

바이러스 코어 입자가 숙주 세포의 세포질 내로 들어간 후에, 통합된 이중 가닥 DNA 프로바이러스에 이르게하는 모든 효소적 기능은 선행 숙주 세포에서 합성되고 비리온 내에 수반된 바이러스 단백질에 의해 관리된다. 코어 입자 침입 후의 바이러스 단백질의 운명은 명확하지 않지만, 상기 역 전사효소, 통합효소, 및 캡시드 단백질은 역 전사가 일어나는 핵단백질 복합체를 형성하는 RNA 게놈과 함께 유지된다. 최근에, 또한 매트릭스 단백질이 상기 핵단백질 복합체와 관련하여 밝혀졌다.

역 전사에 이어서, 상기 핵단백질 복합체는 숙주 세포 핵으로 이동한다. 상기 핵 편재화에 기여하는 기전은 명확하지 않지만, 라우스 육종 바이러스(RSV)로부터의 증거는 RSV IN 단백질이 포유동물 세포에서 생산될 때 핵에 편재되므로 상기 IN 단백질이 중요함을 제시하였다. 상기 핵단백질 복합체의 핵 내로의 침입은 추정 상 상기 핵단백질 복합체가 핵 외피를 생성시킬 수 없으므로 간접 핵분열을 요한다. 일단 핵에서는 상기 IN 단백질에 의한 통합이 매개된다. 상기 IN 단백질은 LTR의 단부에서 보존된 역의 반복부를 인식하며 2 개의 스트랜드 모두의 3' 하이드록실 말단으로부터 2 개의 염기를 제거한다. 상기 IN 단백질은 또한 숙주 DNA의 절단을 촉진시키며 프로바이러스 DNA와 숙주 DNA간의 결합을 매개한다. 통합의 특이성에 대해서, 일치하는 숙주 DNA 표적 서열이 발견되지 않았지만, 근처의 DNase I-과민성 부위를 통합시키는 경향이 보고되었다.

간단한 레트로바이러스(MLV 포함)에 대해서, 전사 및 번역을 숙주 세포기로 수행한다. 복잡한 바이러스(HIV 및 HTLV 포함)는 전사 조절과 관련된 교차활성 단백질을 암호화한다. MLV 입자의 조립체는 숙주 막에서 나타나며, 상기 과정은 발아 과정과 일치한다. 포유동물 B 및 C 형 바이러스(MMTV 및 HTLV 각각)에서, 바이러스 코어 입자는 숙주 세포 세포질에서 조립된다. 바이러스 게놈 RNA의 캡시드화는 시스-작용 캡시드화 신호와 Gag- 또는 Gag-Pol 전구체 단백질의 NC 잔기의 결합을 통해 매개된다.

발아 후에, Gag- 및 Gag-Pol 폴리단백질은 바이러스 프로테아제(PR)에 의해 절단된다. 바이러스 단백질의 돌연변이에 의해 비리온 형태가 전체적으로 변한 다. 바이러스 입자의 발아에 이은 바이러스 폴리단백질의 단백질분해적 절단 이외에, 게놈 RNA는 또한 돌연변이 과정을 겪어 치밀한 이량체성 게놈을 생성시킨다.

레트로바이러스 벡터: 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스로는 비 제한적으로 몰로니 쥐 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들어 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈구증 바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 척수증식성 육종 바이러스 및 유방 종양 바이러스가 있다. 하나의 실시태양에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 쥐 백혈병 바이러스로부터 유도된다.

상기 벡터는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터로는 비 제한적으로 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터; 및 인간 세포확대 바이러스(CMV) 프로모터(Miller et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990(1989), 또는 임의의 다른 프로모터(예: 세포 프로모터, 예를 들어 진핵 세포 프로모터, 예를 들어 비 제한적으로 히스톤, pol III, 및 β-액틴 프로모터)가 있다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 프로모터로는 비 제한적으로 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 B19 파르보바이러스 프로모터가 있다. 적합한 프로모터의 선택은 본 원에 포함된 교시로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.

관심의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 핵산 서열을 적합한 프로모터의 통제 하에 둔다. 사용될 수 있는 적합한 프로모터에는 비 제한적으로 아데노바이러 스 프로모터, 예를 들어 아데노바이러스 주 말기 프로모터; 또는 이종 프로모터, 예를 들어 세포 확대 바이러스(CMV) 프로모터; 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 프로모터; 유도 프로모터, 예를 들어 MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 열쇽 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 예를 들어 헤르페스 단일 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스 LTR(상술한 변형된 레트로바이러스 LTR 포함); β-액틴 프로모터; 및 인간 성장 호르몬 프로모터가 포함된다. 상기 프로모터는 또한 관심의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 유전자를 통제하는 천연 프로모터일 수 있다.

상기 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용하여 포장 세포주를 형질도입시켜 생산자 세포주를 형성시킨다. 형질감염될 수 있는 포장 세포의 예로는 비 제한적으로 PE501, PA317.psi.-2, .psi.-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, .psi.CRE, .psi.CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DNA 세포주(Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, pg. 5-14(1990), 본 발명에 참고로 인용되어 있음)가 있다. 상기 벡터는 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 통해 포장 세포를 형질도입시킬 수 있다. 상기와 같은 수단에는 비 제한적으로 일렉트로포레이션, 리포솜의 사용, 및 CaPO₄ 침전이 포함된다.

상기 생산자 세포주는 관심의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성시킨다. 이어서 상기와 같은 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 진핵 세포를 생체 외 또는 생체 내에서 형질도입시킬 수 있다. 상기 형질도입된 진핵 세포는 관심의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 발현시킬 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포로는 비 제한적으로 태아 줄기 세포, 태아 암종 세포뿐만 아니라 조혈성 줄기 세포, 간세포, 섬유아세포, 근모세포, 각질세포, 내피 세포 및 기관지 상피 세포가 있다.

하나의 실시태양에서, 관심의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 상술한 바와 같이 지질에 커플링시키고 이어서 숙주에 투여할 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 본 발명의 리포폴리아민 형질감염제와 회합시켜 복합체를 형성하고, 이어서 이를 본 발명의 미소구와 혼합한 후에 색전화 유전자 요법이 필요한 환자에게 투여할 수 있다.

9. 안티센스 유전자 요법

본 발명은 안티센스 핵산 분자를 색전술에 의해 또는 상기 없이 전달함을 또한 포함한다. 안티센스 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 센스 핵산에 상보적인, 예를 들어 이중 가닥 cDNA 분자의 암호화 스트랜드에 상보적이거나 또는 mRNA 서열에 상보적인 분자이다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소결합할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 암호화 가닥 또는 단지 그의 일부, 예를 들어 단백질 암호화 영역(또는 개방 판독 프레임)의 전부 또는 일부에 상보적일 수 있다. 안티센스 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 스트랜드의 비-암호화 영역의 전부 또는 일부에 대한 안티 센스일 수 있다. 상기 비-암호화 영역("5' 및 3' 번역되지 않은 영역들")은 상기 암호화 영역의 측면에 위치하고 아미노산으로 번역되지 않은 5' 및 3' 서열이다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 길이가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산을 당해 분야에 공지된 과정을 사용하여 화학적 합성 및 효소적 연결 반응들을 사용하여 제작할 수 있다.

예를 들어, 안티센스 핵산(예: 안티센스 올리고뉴클레오티드)을 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 안티센스와 센스 핵산간에 형성된 중복부의 물리적 안정성을 증가시키도록 구상된 천연 뉴클레오티드 또는 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드를 사용할 수 있다.

안티센스 핵산의 제조에 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오유리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, β-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, β-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오 시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린이 있다.

한편으로, 상기 안티센스 핵산을 핵산이 안티센스 배향으로 서브클로닝된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 제조할 수 있다(즉, 삽입된 핵산으로부터 전사된 RNA는 하기 하위 섹션에서 추가로 개시된 바와 같이 관심의 표적 핵산으로의 안티센스 배향을 가질 것이다).

본 발명의 안티센스 핵산 분자를 전형적으로는 본 발명의 소정의 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 DNA 및/또는 세포 mRNA와 하이브리드를 형성하거나 또는 상기에 결합하여 예를 들어 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 발현이 억제되도록 동일반응계에서 제조하거나 환자에게 투여한다. 상기 하이브리드화는 통상적인 뉴클레오티드 상보성에 의해 안정한 중복물을 형성하거나 또는 예를 들어 DNA 중복물에 결합하는 안티센스 핵산 분자의 경우에 상기 이중 나선의 큰 홈에서의 특이적인 상호작용을 통해서 수행될 수 있다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자의 투여 경로의 예로는 특정 조직 부위에서 안티센스 핵산 분자/리포폴리아민 형질감염제 복합체의 직접적인 주입이 있다.

한편으로, 안티센스 핵산 분자를 소정의 표적 세포로의 전달을 위해 변형시키고 이어서 본 발명의 미소구 및 형질감염제를 사용하여 전신적으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 전신적 투여에 대해서 안티센스 분자를, 상기가 예를 들어 안티센스 핵산 분자를 세포 표면 수용체 또는 항원에 결합하는 항체 또는 펩티드에 결 합시킴으로써 소정의 세포 표면 상에서 발현된 항원 또는 수용체에 특이적으로 결합하도록 변형시킬 수 있다. 상기와 같은 펩티드 또는 항체는 본 발명의 미소구 및 형질감염제에 의해 수득되는 향상된 전달을 증대시킬 수 있다. 상기 안티센스 핵산 분자를 또한 상술한 벡터를 사용하여 세포에 전달할 수 있다. 상기 안티센스 분자의 충분한 세포 내 농도를 얻기 위해서는, 상기 안티센스 핵산 분자가 강한 pol II 또는 pol III 프로모터의 통제 하에 놓인 벡터 구조물이 바람직하다. 본 발명의 안티센스 핵산 분자는 α-아노머 핵산 분자일 수 있다.

α-아노머 핵산 분자는 상보적인 RNA와 특이적인 이중-가닥 하이브리드를 형성하며, 여기에서 상기 가닥들은 통상적인 β-유닛에 상반되게 서로 평행하다(Gaultier et al.(1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). 상기 안티센스 핵산 분자는 또한 2'-o-메틸리보뉴클레오티드(Inoue et al.(1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) 또는 키메라 RNA-DNA 동족체(Inoue et al.(1987) FEBS Lett. 215:327-330)를 포함한다.

본 발명은 리보자임을 추가로 포함한다. 리보자임은 상보성 영역을 갖는 단일 가닥 핵산, 예를 들어 mRNA를 절단시킬 수 있는 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA 분자이다. 따라서, 리보자임(예를 들어 망치머리형 리보자임(Haselhoff and Gerlach(1988) Nature 334:585-591))을 사용하여 mRNA 전사물을 촉매적으로 절단시켜 상기 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 번역을 억제할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 대한 특이성을 갖는 리보자임을 관심 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기본으로 구상할 수 있다. 예를 들어, 활성 부위의 뉴클레오티드 서열이 절단되는 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 테트라하이메나 L-19 IVS RNA의 유도체를 제작할 수 있다(Cech et al. 미국 특허 제 4,987,071 호; 및 Cech et al. 미국 특허 제 5,116,742 호). 한편으로, 본 발명의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 mRNA를 사용하여 RNA 분자의 풀로부터 특이적인 리보뉴클레아제 활성을 갖는 촉매적 RNA를 선택할 수 있다. 예를 들어 문헌[Bartel and Szostak(1993) Science 261:1411-1418]을 참조하시오.

본 발명은 또한 3 중 나선 구조를 형성하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 생물활성 치료 인자의 발현을 표적 세포에서 유전자의 전사를 방지하는 3 중 나선 구조를 형성하도록 폴리펩티드(예를 들어 프로모터 및/또는 인헨서)를 암호화하는 유전자의 조절 영역에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화함으로써 억제할 수 있다. 일반적으로 문헌[Helene(1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; 및 Maher(1992) Bioassays 14(12):807-15]을 참조하시오.

다양한 실시태양에서, 본 발명의 핵산 분자를 예를 들어 분자의 안정성, 하이브리드화 또는 용해도를 개선시키기 위해서 염기 잔기, 당 잔기 또는 포스페이트 주쇄에서 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 핵산의 데옥시리보오스 포스페이트 주쇄를 펩티드 핵산을 생성시키도록 변형시킬 수 있다(Hyrup et al.(1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1):5-23). 본 원에 사용된 "펩티드 핵산" 또는 "PNA"라는 용어는 데옥시리보오스 포스페이트 주쇄가 슈도펩티드 주쇄로 대체되고 단지 4 개의 천연 뉴클레오염기들만이 유지된 핵산 모방물, 예를 들어 DNA 모방물을 지칭 한다. PNA의 중성 주쇄는 낮은 이온 강도 조건 하에서 DNA와 RNA에 특이적인 하이브리드화를 허용함을 나타내었다. PNA 올리고머의 합성을 상기 문헌[Hyrup et al. (1996)] 및 [Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675]에 개시된 표준 고체 상 펩티드 합성 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있다.

PNA를 본 발명의 치료 및 진단 용도로 사용할 수 있다. 예를 들어 PNA를 전사 또는 번역 정지를 유도하거나 복제를 억제함으로써 유전자 발현의 서열-특이적인 조절에 안티센스 또는 항원으로서 사용할 수 있다. PNA를 또한 예를 들어 PNA 지시된 PCR 구속에 의한 유전자의 단일 염기쌍 돌연변이의 분석에; 다른 효소, 예를 들어 S1 뉴클레아제와 함께 사용 시 인위적인 제한 효소로서(상기 문헌[Hyrup(1996)] 참조); 또는 DNA 서열 및 하이브리드화에 대한 탐침 또는 프라이머로서(상기 문헌[Hyrup et al. (1996)] 및 [Perry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14670-675] 참조) 사용할 수 있다.

또 다른 실시태양에서, PNA를 예를 들어 친지성 또는 다른 헬퍼 그룹을 PNA에 결합시킴으로써, 또는 PNA-DNA 키메라의 형성에 의해, 또는 가장 바람직하게는 본 발명의 미소구와의 회합 전에 PNA와의 착화를 위한 형질감염제로서 리포폴리아민의 사용에 의해 그의 안정성 또는 세포 흡수가 향상되도록 개질시킬 수 있다. 예를 들어, PNA와 DNA의 유리한 성질들을 겸비할 수 있는 PNA-DNA 키메라를 제조할 수 있다. 상기와 같은 키메라는 PNA 부분이 높은 결합 친화성과 특이성을 제공하는 동안 DNA 인식 효소, 예를 들어 RNAse H 및 DNA 폴리머라제가 상기 DNA 부분과 상호작용하게 한다. PNA-DNA 키메라들을 염기 적층, 뉴클레오염기들간의 결합 수 및 배향에 대해서 선택된 적합한 길이의 링커를 사용하여 연결시킬 수 있다(상기 문헌[Hyrup(1996)] 참조). PNA-DNA 키메라의 합성을 상기 문헌[Hyrup(1996)] 및 [Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63]에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다. 예를 들어, DNA 쇄를 표준 포스포아미다이트 커플링 화학 및 변형된 뉴클레오시드 동족체를 사용하여 고체 지지체 상에서 합성할 수 있다. 5'-(4-메톡시트리틸)아미노-5'-데옥시-티미딘 포스포아미다이트를 PNA와 DNA의 5' 단부 사이의 결합물로서 사용할 수 있다(Mag et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-88). 이어서 PNA 단량체들을 단계적인 방식으로 커플링시켜 5'PNA 분절과 3'DNA 분절을 갖는 키메라 분자를 제조한다(Finn et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24(17):3357-63). 한편으로, 5'DNA 분절과 3'PNA 분절을 갖는 키메라 분자를 합성할 수 있다(Peterser et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124).

다른 실시태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 다른 추가된 그룹들, 예를 들어 펩티드(예: 생체 내에서 숙주 세포 수용체의 표적화를 위해) 또는 세포막을 통한 운반을 촉진하는 시약들(예를 들어 Letsinger et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT 공보 WO88/09810 참조) 또는 혈액-뇌 차단층(예를 들어 PCT 공보 WO89/10134 참조)을 포함할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화-촉발된 절단 시약(Krol et al.(1988) Bio/Techniques 6:958-976) 또는 삽입 시 약(Zon(1988) Pharm. Res. 5:539-549)으로 변형시킬 수 있다. 이를 위해서, 상기 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 폴리아민 형질감염제 및 미소구와의 회합 전 또는 한편으로 그 후에, 또 다른 분자, 예를 들어 펩티드, 하이브리드화 촉발된 가교결합제, 운반시약, 하이브리드화-촉발된 절단 시약 등에 결합시킬 수 있다.

10. 약물 전달 및 유전자 요법을 위한 능동 색전술

본 발명의 하나의 태양은 미소구를 사용한 약물, 백신 및 진단 또는 영상제의 포유동물에의 투여이다. 물론, 상기 실시태양은 형질감염제의 사용을 반드시 필요로하지는 않는다. 그러나, 상기와 같은 시약은 미소구 및 생물활성제와 회합하는 그의 능력, 즉 세포내 이입을 개선시키는 그의 능력 또는 링커로서 작용하는 그의 능력으로 인해 선택적이다.

본 발명의 하나의 태양 내에서 치료 유효량의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 혈관이 효과적으로 폐색되도록 상기 혈관에 전달하는 단계를 포함하는, 상기 혈관의 색전화 방법을 제공한다. 혈관 폐색에 적합한 치료 유효량은 상기 제공된 내용에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양 내에서, 상기 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 종양에 영양을 주는 혈관에 전달한다.

간단히, 기관 또는 영역에 대한 혈액 공급을 감소 또는 제거하는 것이 바람직한 다수의 임상적 상황들(예: 출혈, 종양 발달)이 존재한다. 하기에 보다 상세히 개시되는 바와 같이, 이는 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 선택적으로 배치된 바늘 또는 카테터를 통해 목적하는 혈관에 주입함으로써 성취될 수 있다. 상기 조성물은 상기가 맥관에 억지로 밀고 들어갈때까지 혈류를 통해 이동하며, 이에 의해 혈관이 물리적으로(또는 화학적으로) 폐색된다. 소정의 영역에 대한 혈류의 감소 또는 제거로 경색(산소 및 양분의 부적합한 공급으로 인한 세포 사망)이 발생하거나 손상된 혈관으로부터의 혈액 손실이 감소된다.

색전술에 사용하기 위해서, 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구는 바람직하게는 무독성이고, 색전형성성이며, 맥관 카테터를 주입하기 쉽고, 방사선 불투과성이며, 효과가 빠르고 영구적이며, 멸균성이고 상기 과정의 시기에 상이한 형상 또는 크기로 쉽게 이용 가능하다. 또한, 상기 조성물은 바람직하게는 생물활성 치료 인자를 느리게(이상적으로는 수 주에서 수 개월의 기간에 걸쳐) 방출시킨다. 특히 바람직한 생물활성 치료 인자 조성물은 맥관계에 주입 후에 15 내지 200 ㎛의 예견가능한 크기를 가져야 한다. 바람직하게는, 상기는 용액 중에서 또는 일단 주입되면 보다 큰 입자로 응집되어서는 안된다. 또한, 바람직한 조성물은 사용 전 보관 중에 물리적 성질이 변하지 않아야 한다.

본 발명의 색전술을 신생물의 처리를 돕기 위해서, 즉 (1) 종양의 한정적인 처리(대개 양성); (2) 수술 전의 색전화를 위해서; 및 (3) 완화적인 색전화를 위해서 3 가지 이상의 주요 방식으로 사용될 수 있다. 간단히, 양성 종양이 때때로 색전술 단독에 의해 성공적으로 치료될 수 있다. 이러한 종양의 예로는 맥관 기원의 종양(예: 혈관종), 내분비 종양, 예를 들어 부갑상선 선종 및 양성 골 종양이 있다.

다른 종양들(예를 들어 신장 선암종)에 대해서, 수술 시 혈액 손실을 감소시 키고, 수술 기간을 단축시키고, 종양의 외과적 조작에 의한 가시적인 악성 세포의 분산 위험성을 감소시키기 위해서 수술적 절제 전에 수시간 또는 수일 동안 수술 전 색전화를 사용할 수 있다. 다수의 종양들, 예를 들어 비강인두 종양, 결정맥구 종양, 수막종, 케모덱토마(chemodectoma) 및 미주신경성 신경종을 수술 전에 성공적으로 색전화할 수 있다.

색전화를 또한 진행된 질병에 걸린 환자의 생존 시간을 연장시키기 위해서 수술 불가능한 악성 질병의 치료에 대한 1 차 방식으로서 사용할 수 있다. 색전화는 출혈, 정맥 폐색 및 기관지 압박과 같은 불쾌한 증상들을 경감시킴으로써 악성 종양 환자의 삶의 질을 현저하게 개선시킬 수 있다. 그러나 완화성 종양 색전화로부터의 최대의 이점은 악성 내분비 종양의 체액 영향으로부터 고통받는 환자에서 찾을 수 있으며, 이때 암양종 종양 및 다른 내분비 신생물, 예를 들어 인슐리노마 및 글리코노마로부터의 전이가 느리게 진행할 수 있으나, 상기 종양들로부터 발생하는 내분비 증상들에 의해 여전히 큰 고통이 야기될 것이다.

일반적으로, 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 사용하는 색전술은 전형적으로 부위와 관계없이 유사한 방식으로 수행된다. 간단히, 색전화시킬 영역의 혈관조영을 우선 동맥 또는 정맥 내에 삽입한 카테터를 통해 방사선 불투과성 콘트라스트제를 주입시킴으로써 수행한다. 상기 카테터를 피하 또는 수술에 의해 삽입할 수 있다. 이어서 혈관을 흐름이 멈출때까지 상기 카테터를 통해 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 환류시킴으로써 색전화시킨다. 상기 혈관촬영을 반복함으로써 폐색을 확인할 수 있다.

색전술은 일반적으로 치료하려는 종양 또는 혈관 덩어리의 간극 전체를 통해 생물활성 치료 인자를 함유하는 조성물을 분배시킨다. 동맥 관강을 막는 색전 입자의 물리적 부피는 혈액 공급을 폐색시킨다. 생물활성 치료 인자(들)의 존재는 상기 효과 이외에, 종양 또는 맥관 덩어리에 공급되는 새로운 혈관의 형성을 막아 상기 혈액 공급을 차단하는 활력 상실을 향상시킨다.

따라서, 광범위하게 다양한 종양들을 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 사용하여 색전화시킬 수 있음은 자명하다. 간단히, 종양을 2 개의 군, 즉 양성과 악성으로 나눈다. 양성 종양에서, 세포는 그의 분화된 특징을 보유하며 완전히 통제되지 않는 방식으로는 분열하지 않는다. 악성 종양에서 세포는 분화되지 않으며, 신체의 성장과 호르몬 신호에 응답하지 않고, 통제되지 않는 방식으로 번식하며; 상기 종양은 침해적이고 먼 부위로 확산될 수 있다(전이).

본 발명의 하나의 태양 내에서, 간의 전이(2 차 종양)를 색전술에 의해 치료할 수 있다. 간단히, 카테터를 대퇴부 또는 기관지 동맥을 통해 삽입하고 이를 형광 유도 하에 동맥계를 통해 조종함으로써 간 동맥 내로 진행시킨다. 상기 카테터는 가능한 한 정상 조직에의 많은 동맥 가지의 공급을 아끼면서 종양(들)에 공급되는 혈관의 완전한 차단을 허용하기 위해서 필요한 한 멀리 간 동맥 나무로 진행한다. 이상적으로는 상기는 부분적인 간 동맥 가지일 것이나, 위샘창자동맥 기원에서 먼 전체 간 동맥, 또는 심지어 다수개의 분리된 동맥들을 종양의 범위 및 그의 개별적인 혈액 공급에 따라 차단시킬 필요가 있을 수 있다. 일단 목적하는 카테터 위치에 도달하면, 동맥 중의 흐름이 멈출때까지, 바람직하게는 심지어 관찰 후 5 분간 상기 동맥 카테터를 통해 혈관형성 억제 치료 조성물을 주입함으로써 상기 동맥을 색전화시킨다. 동맥의 폐색을 상기 카테터를 통해 방사선 불투과성 콘트라스트제를 주입하고 앞서 콘트라스트제로 충전시킨 혈관이 더 이상 콘트라스트제로 충전되지 않음을 형광 투시법 또는 X-선 필름에 의해 입증함으로써 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 능동 치료 색전술을 수술 중에 사용하여 종양 또는 혈관 덩어리 또는 암성 기관을 제거할 수 있다. 또한, 본 발명의 또 다른 태양은 전이를 예방 또는 개선시키기 위한 능동 치료 색전술의 용도에 관한 것이다.

상기 나타낸 바와 같이, 양성과 악성 종양을 모두 본 발명의 혈관형성 억제 치료 조성물을 사용하여 색전화시킬 수 있다. 양성 간 종양의 전형적인 예로는 간세포성 선종, 해면상 혈관종, 및 초점 결절성 과증식이 있다. 보다 희귀하고 종종 임상적 징후를 나타내지 않는 다른 양성 종양도 또한 치료될 수 있다. 여기에는 담관 선종, 담관 낭선종, 섬유종, 림프종, 평활근종, 중피종, 기형종, 점액종 및 결절 재생성 과증식이 포함된다.

악성 간 종양은 일반적으로 2 개의 범주, 즉 1 차 및 2 차로 추가분류된다. 1 차 종양은 상기가 발견되는 종양으로부터 직접 발생한다. 따라서, 1 차 간 종양은 간 조직을 구성하는 세포(예: 간세포 및 담즙 세포)로부터 기원한다. 동맥 색전화에 의해 치료될 수 있는 1 차 간 악성 종양의 전형적인 예로는 간세포성 암 종, 담관암종, 혈관육종, 세포선암종, 편평상피세포 암종 및 간세포종이 있다.

2 차 종양 또는 전이는 신체의 다른 곳에서 기원했지만 후속적으로 멀리떨어진 기관으로 확산된 종양이다. 전이의 통상적인 경로는 인접 조직으로의 직접적인 성장, 맥관계 또는 림프관계를 통한 확산, 및 조직면 또는 신체 공간(복막액, 뇌척수액 등)을 따라 간다. 2 차 간 종양은 암 환자의 가장 흔한 사망 원인 중 하나이며 가장 흔한 간 종양의 형태이다. 사실상 어떠한 악성 종양도 간으로 전이될 수 있지만, 가장 간으로 확산될 것 같은 종양은 위, 결장 및 췌장 암; 흑색종; 폐, 구강인두부 및 방광 종양; 호즈킨 및 비 호즈킨 림프종; 유방, 난소 및 전립선 종양이다. 상기 언급한 1 차 종양들은 각각 동맥 색전화에 의해 치료될 수 있는 다수의 상이한 종양 유형을 갖는다(예를 들어 비 제한적으로 난소 암에 대해서 32 개의 상이한 유형이 보고되고 있다).

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 사용하는 색전술을 또한 혈관 폐색을 목적하는 다양한 다른 임상적 상황에 적용할 수 있다. 본 발명의 하나의 태양 내에서, 동정맥 기형을 상술한 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물들 중 하나의 투여에 의해 치료할 수 있다. 간단히, 동정맥 기형(혈관 기형)은 동맥과 정맥간에 하나 이상(가장 전형적으로는 다수)의 비 정상적인 연통이 일어나 국소적인 종양형 덩어리가 혈관을 우세하게 구성하는 질병의 한 그룹을 지칭한다. 이러한 질병은 선천적이거나 후천적일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시태양 내에서, 동정맥 기형을 대퇴부 또는 기관지 동맥 을 통해 카테터를 삽입하고 이를 형광투시경 유도 하에 공급 동맥내로 진행시킴으로써 치료할 수 있다. 상기 카테터를 바람직하게는 가능한 한 정상 조직에의 많은 동맥 가지의 공급을 아끼면서 맥관 기형에 공급되는 혈관의 완전한 차단을 허용하기 위해서 필요한 한 멀리 진행시킨다(이상적으로는 상기는 단일 동맥일 것이나, 가장 흔히는 다수의 별도의 동맥들을 종양의 범위 및 그의 개별적인 혈액 공급에 따라 차단시킬 필요가 있을 수 있다). 일단 목적하는 카테터 위치에 도달하면, 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 사용하여 각 동맥을 색전화시킨다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 색전화를 과도한 출혈 상태를 치료하기 위해서 수행할 수도 있다. 예를 들어, 월경과다증(월경 중 과도한 출혈)은 자궁 동맥의 색전화에 의해 쉽게 치료될 수 있다. 간단히, 자궁 동맥은 좌우 양측에 있는 내부 장골 동맥의 가지이다. 본 발명의 하나의 실시태양 내에서, 카테터를 대퇴부 또는 기관지 동맥을 통해 삽입하고 이를 형광투시경 유도 하에 동맥계를 통해 조종함으로써 각 자궁 동맥내로 진행시킬 수 있다. 상기 카테터를 바람직하게는 가능한 한 자궁 동맥으로부터 발생하고 정상 조직에 공급되는 많은 동맥 가지의 공급을 아끼면서 자궁에 공급되는 혈관의 완전한 차단을 허용하기 위해서 필요한 한 멀리 진행시킨다. 이상적으로는 양쪽의 단일 자궁 동맥을 색전화시킬 수도 있지만, 흔히는 개별적인 혈액 공급에 따라 다수의 별도의 동맥들을 차단시킬 필요가 있을 수 있다. 일단 목적하는 카테터 위치에 도달하면, 상술한 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 투여하여 각 동맥을 색전화시킬 수 있다.

마찬가지 방식으로, 동맥 색전화를 다양한 다른 증상들, 예를 들어 비 제한적으로 급성 출혈, 맥관 기형, 중추 신경계 질환 및 비기능항진증에 대해 수행할 수 있다.

10.1. 유전자 요법과 병행되는 능동 색전화

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 사용하는 색전술을 또한 동시적인 혈관 폐색과 환자에게 유전자 요법을 수행함을 목적으로 하는 다양한 다른 임상적 상황에 적용할 수 있다.

본 발명의 하나의 바람직한 태양 내에서, (a) 생물활성 치료 인자, (b) 중합체성 담체 및 (c) 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 태양 내에서, (a) 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (b) 중합체성 물질 담체, 및 (c) 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 가장 바람직한 태양 내에서, (a) 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (b) 양이온성 가교결합된 미소구, 및 (c) 리포폴리아민 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공한다.

상기 (a) 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, (b) 양이온성 가교결합된 미소구, 및 (c) 리포폴리아민 형질감염제를 포함하는 조성물을 제공하는 본 발명의 가장 바람직한 태양에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 천연 또는 합성 기원의 RNA 및 DNA, 예를 들어 재조합 RNA 및 DNA 및 안티센스 RNA 및 DNA; 망치머리형 RNA, 리보자임, 항원 핵산, 단일 및 이중 가닥 RNA 및 DNA 및 이들의 동족체 를 포함하고; 생물활성 치료 인자는 항종양제, 혈관형성 억제제, 호르몬 및 스테로이드, 비타민, 펩티드 및 펩티드 동족체, 항체 또는 그의 단편, 백신, 효소, 알레르겐 억제제, 순환상 약물, 항결핵제, 항바이러스제, 협심증 억제제, 항원생동물제, 류마티스 억제제, 마취제, 강심성 글리코사이드 약제, 진정제, 국소 마취제, 및 일반적인 마취제를 포함하며; 양이온성 가교결합된 미소구는 무독성, 생체 적합성, 팽윤성 또는 비 팽윤성, 실질적으로 구형, 친수성, 불활성, 생물활성 치료 인자를 방출시키고 색전화에 충분한 크기를 갖는 이온성의 가교결합된 중합체를 기본으로 하고, 상기 중합체는 바람직하게는 나트륨 아크릴레이트 중합체, 아크릴아미드 및 아크릴아미드 유도체 중합체, 나트륨 아크릴레이트 및 비닐 알콜 공중합체, 비닐 아세테이트와 아크릴산 에스테르의 공중합체의 비누화 산물, 비닐 아세테이트와 아크릴산 에스테르 공중합체, 비닐 아세테이트와 메틸 말리에이트 공중합체, 이소부틸렌-말레산 무수물 가교결합된 공중합체, 전분-아크릴로니트릴 그래프트 공중합체 및 그의 비누화 산물, 가교결합된 나트륨 폴리아크릴레이트 중합체 및 가교결합된 폴리에틸렌 옥사이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; 상기 적합한 형질감염제의 바람직한 예로는 비 제한적으로 리포폴리아민과 폴리에틸렌이민(PEI)이 있다. 본 발명의 특히 바람직한 형질감염제는 1992년 12월 15일자로 베어(Behr) 등에게 허여된 미국 특허 제 5,171,678 호, 1995년 12월 19일자로 베어 등에게 허여된 미국 특허 제 5,476,962 호, 및 1997년 4월 1일자로 베어 등에게 허여된 미국 특허 제 5,616,745 호에 개시된 화학식 I의 리포폴리아민을 포함한다(상기 특허들은 각각 본 발명에 참고로 인용되어 있다).

본 발명의 상기 바람직한 실시태양과 가장 바람직한 실시태양 내에서, 생물활성 치료 인자는 형질감염제와 물리적으로 회합되어 복합체를 형성하고 상기 생물활성 치료 인자-형질감염제는 이어서 중합체성 담체와 물리적으로 회합된다. 상기 생물활성 치료 인자는 바람직하게는 액체 흡착 크로마토그래피에서 널리 공지된 회합력, 예를 들어 비 제한적으로 이온 교환, 소수성, 분자 인식 또는 이들의 조합에 의해 흡착된다. 소정의 생물활성 치료 인자를 형질감염제와 혼합하며, 상기 형질감염제는 상기 생물활성 치료 인자-형질감염제에 특정한 성질들, 예를 들어 증가된 소수성을 부여한다. 색전화 물질을 포함하는 미소구(예: Embosphere(등록상표))를 충분량의 형질감염성 생물활성 치료 인자와 함께 혼합하며, 이때 상기 형질감염성 생물활성 치료 인자와 색전 물질간의 물리적 회합은 이온과 소수성 회합의 결과이며, 이는 예를 들어 비 제한적으로 염화 나트륨과 같은 염의 첨가에 의해 추가로 향상될 수 있다.

본 발명의 상기 바람직한 실시태양과 가장 바람직한 실시태양 내에서, 색전 물질의 표면 상에 흡착되거나 또는 상기와 회합된 생물활성 치료 인자-형질감염제 복합체는 점진적으로 탈착되어 다양한 기전들, 예를 들어 비 제한적으로 자발적인 세포내 이입, 수용체-매개된 세포내 이입, 엔도솜분해 및 세포막 탈안정화 또는 이들의 조합에 의해 주변 세포로 전달된다. 상기 생물활성 치료 인자의 탈착은 상기 인자의 전적인 탈착이 달성될때까지 색전 물질과 생물활성 치료 인자간의 흡착 강도를 약화시키는 생물학적 액체의 천연 성분들에 의해 유도된다.

본 발명의 또 다른 태양 내에서, 종양형성성, 혈관형성-의존성 질병의 치료 가 필요한 환자의 혈관에 형질감염제와 회합된 생물활성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는(이때 상기 형질감염제와 회합된 생물활성 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 미소구와 추가로 회합된다) 치료 유효량의 조성물을 상기 혈관이 효과적으로 폐색되고 상기 종양형성성, 혈관형성-의존성 질병이 개선될 수 있도록 전달함을 포함하는, 상기 질병에서 상기 혈관을 색전화시키는 방법을 제공한다.

11. 진단 영상

상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물을 진단 영상, 치료 영상 및 치료 약물 전달, 예를 들어 초음파(US) 자기 공명 영상(I), 핵자기 공명(NMR), 컴퓨터화된 단층 촬영(CT), 전자 스핀 공명(ESR), 핵 의료 영상, 광학 영상, 엘라스토그래피, 초음파, 무선 주파수 및 마이크로웨이브 레이저에 의한 약물전달과 관련하여 사용할 수 있다. 본 발명의 전달 비히클 및 안정화 물질을 다양한 콘트라스트제, 예를 들어 진단 및 치료 영상용 콘트라스트제로서 유효성을 증가시키는 작용을 하는 통상적인 콘트라스트제와 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 안정화 물질과 함께 사용하기 적합한 콘트라스트제의 예로는 안정성 유리 라디칼, 예를 들어 안정성 니트록사이드뿐만 아니라 전이, 란탄계열 및 악티니드 계열 원소(이들은 경우에 따라 염의 형태로 있거나 또는 착화제, 예를 들어 그의 친지성 유도체 또는 단백질성 거대분자에 공유 또는 비 공유적으로 결합될 수도 있다)를 포함하는 화합물이 있다. 바람직한 전이, 란탄계열 및 악티니드 계열 원소들의 예로는 Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(II), Fe(III), Co(II), Er(II), Ni(II), Eu(III) 및 Dy(III)이 있다. 보다 바람직하게는, 상기 원소는 Gd(III), Mn(II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Eu(III) 및 Dy(III)이고, 가장 바람직하게는 Mn(II) 및 Gd(III)이다. 상기 원소들은 염, 예를 들어 무기 염, 예를 들어 망간 염, 예를 들어 망간 클로라이드, 망간 카보네이트, 망간 아세테이트, 및 유기 염, 예를 들어 망간 글루코네이트 및 망간 하이드록시아파타이트의 형태일 수 있다. 다른 예시적인 염으로는 철의 염, 예를 들어 철 설파이트, 및 제 2 철 염, 예를 들어 염화 제 2 철이 있다.

상기 원소들은 또한 예를 들어 공유 또는 비 공유 회합을 통해 착화제, 예를 들어 그의 친지성 유도체, 또는 단백질성 거대 분자에 결합될 수도 있다. 바람직한 착화제로는 예를 들어 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N',N"'-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-N,N',N"-트리아세트산(DOTA), 3,6,9-트리아자-12-옥사-3,6,9-트리카복시메틸렌-10-카복시-13-페닐트리데카노산(B-19036), 하이드록시벤질에틸렌디아민 디아세트산(HBED), N,N'-비스(피리독실-5-포스페이트)에틸렌 디아민, N,N'-디아세테이트(DPDP), 1,4,7-트리아자사이클로노난-N,N',N"-트리아세트산(NOTA), 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산(TETA), 크립탠드(거대환상 착체) 및 데스페리옥스아민이 있다. 보다 바람직하게는, 상기 착화제는 EDTA, DTPA, DOTA, DO3A 및 크립탠드, 가장 바람직하게는 DTPA이다. 바람직한 친지성 착체에는 착화제 EDTA, DOTA 의 알킬화된 유도체, 예를 들어 N,N'-비스-(카복시데실아미도메틸-N-2,3-디하이드록시프로필)에틸렌디아민-N,N'-디아세테이트(EDTA-DDP); N,N'-비스-(카복시옥타데실아미도메틸-N-2,3-디하이드록시프로필)에틸렌디아민-N,N'-디아세테이트(EDTA-ODP); 및 N,N'-비스(카복시-라우릴아미도메틸-N-2,3-디하이드록시프로필)에틸렌디아민-N,N'-디아세테이트(EDTA-LDP); 및 본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,312,617 호에 개시된 것들이 포함된다. 바람직한 단백질성 거대분자의 예로는 알부민, 콜라겐, 폴리아르기닌, 폴리리신, 폴리히스티딘, γ-글로불린 및 β-글로불린이 있으며, 알부민, 폴리아르기닌, 폴리리신 및 폴리히스티딘이 보다 바람직하다. 따라서 적합한 착체는 Mn(II)-DTPA, Mn(II)-EDTA, Mn(II)-DOTA, Mn(II)-DO3A, Mn(II)-크립탠드, Gd(III)-DTPA, Gd(III)-DOTA, Gd(III)-DO3A, Gd(III)-크립탠드, Cr(III)-EDTA, Cu(II)-EDTA, 또는 철-데스페리옥스아민, 보다 바람직하게는 Mn(II)-DTPA 또는 Gd(III)-DTPA를 포함한다.

니트록사이드는 상기 니트록사이드 분자 중의 짝을 짓지 않은 전자의 존재로 인해 MRI 상에서 T1과 T2 모두의 이완율을 증가시키는 상자성 콘트라스트제이다. 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, MRI 콘트라스트제로서 제공된 화합물의 상자성체 유효성은 적어도 부분적으로 상기 상자성체 핵 또는 분자 중의 짝을 짓지 않은 전자들의 수, 및 구체적으로 짝을 짓지 않은 전자 수의 제곱과 관련될 수 있다. 예를 들어, 가돌리늄은 7 개의 짝을 짓지 않은 전자를 갖는 반면, 니트록사이드 분자는 하나의 짝을 짓지 않은 전자를 갖는다. 따라서, 가돌리늄은 일반적으로 니트록사이드에 비해 훨씬 더 강력한 MRI 콘트라스트제이다. 그러나, 상기 콘트라스트제의 유효성을 평가하기 위한 또 다른 중요 변수인 유효 상관 시간은 상기 니트록사이드에 대해 잠재적인 증가된 이완성을 부여한다. 텀블링 속도가 예를 들어 상기 상자성 콘트라스트의 큰 분자에의 결합에 의해 느려지는 경우, 상기는 보다 느리게 텀블링할 것이며 이에 의해 에너지가 수 양자의 이완을 촉진하는데 보다 유효하게 전달될 것이다. 그러나, 가돌리늄에서, 전자 스핀 이완 시간은 빠르며 느린 회전 상관 시간이 이완성을 증가시킬 수 있는 정도를 제한할 것이다. 그러나, 니트록사이드에 대해서 상기 전자 스핀 상관 시간은 보다 유리하며 이들 분자의 회전상 상관 시간을 느리게함으로써 이완성의 상당한 증가가 획득될 수 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 니트록사이드를 예를 들어 그의 모든 알킬 유도체를 제조하여 미소구의 주변을 코팅시킴으로써 생성되는 상관 시간을 최적화할 수 있도록 구상할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 생성된 콘트라스트 매질을 이완성을 극대화하는 기하학적 형태인 자기 구로서 고찰할 수도 있다.

본 발명의 조성물에 사용하기 적합한 예시적인 초상자성 콘트라스트제에는 금속 산화물과 황화물이 포함되는데, 이들은 자성 영역을 경험한 것들, 제 1철 또는 제 2 철 자성 화합물, 예를 들어 순수 철, 자성 산화 철, 예를 들어 마그네타이트, γ-Fe₂O₃, O₃, Fe₃O₄, 아철산 망간, 아철산 코발트 및 아철산 니켈이 있다. 이어서 MR 전신 영상을 사용하여 예를 들어 혈전증에 대해서 몸을 신속히 스크리닝하고 경우에 따라 초음파를 혈전용해를 돕는데 적용할 수도 있다.

상술한 상자성 및 초상자성 콘트라스트제와 같은 콘트라스트제를 미소구 및/또는 안정화물질 중의 성분으로서 사용할 수 있다. 소낭과 관련하여, 상기 콘트라스트제를 그의 내부 공극 내에 포착하거나, 미소구와의 용액으로서 투여하거나, 임의의 추가적인 안정화 물질과 결합시키거나, 또는 상기 소낭의 표면 또는 막 상에 코팅시킬 수 있다. 본 발명의 조성물에 임의의 하나 이상의 상자성 시약 및/또는 초상자성 시약의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 상자성 및 초상자성 시약들을 또한 경우에 따라 별도로 함께 투여할 수도 있다.

경우에 따라, 상기 상자성 또는 초상자성 시약을 조성물, 특히 미소구의 지질 벽에 혼입된 알킬화된 또는 다른 유도체로서 전달할 수 있다. 특히, 니트록사이드 2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시 유리 라디칼 및 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 유리 라디칼은 다양한 결합, 예를 들어 아세틸옥시 결합을 통해 메틸 그룹이 차지하고 있지 않은 고리의 위치에서 장쇄 지방산과 부가물을 형성할 수 있다. 상기와 같은 부가물은 본 발명의 생물활성 치료 인자 형질감염제 미소구 조성물에 매우 혼입되기 쉽다.

본 발명의 안정화 물질 및/또는 미소구, 및 특히 미소구는 상술한 초자성 시약의 유효 담체로서 작용할 수 있을 뿐만 아니라 콘트라스트제의 자화 효과를 개선시킬 수도 있다. 초상자성 콘트라스트제에는 금속 산화물, 특히 철 산화물(망간 산화물 제외), 및 가변량의 망간, 코발트 및 니켈을 함유하는 철 산화물(자성을 겪었음)이 포함된다. 이들 시약은 나노 또는 마이크로구이며, 매우 높은 벌크 자화율과 횡단 이완율을 갖는다. 보다 큰 입자, 예를 들어 약 100 ㎚의 직경을 갖는 입자는 R₁ 이완성에 비해 훨씬 더 높은 R₂ 이완성을 갖는다. 보다 작은 입자, 예를 들어 약 10 내지 약 15 ㎚의 직경을 갖는 입자는 다소 낮은 R₂ 이완성을 갖지만, 훨씬 더 균형잡힌 R₁ 및 R₂ 값을 갖는다. 훨씬 더 작은 입자, 예를 들어 약 3 내지 약 5 ㎚의 직경을 갖는 입자는 보다 낮은 R₂ 이완성을 가지나, 추정 상 가장 균형잡힌 R₁ 및 R₂ 이완율을 갖는다. 페리틴을 또한 매우 높은 이완율의 초자성 철 코어를 캡슐화하도록 제형화할 수 있다.

철 산화물을 단순히 안정화 물질 및/또는 미소구에 혼입시킬 수도 있다. 바람직하게는 지질로부터 제형화된 미소구의 경우에 철 산화물을 예를 들어 미소구 표면 상에 흡착시키거나 또는 미소구의 내부에 포착시킴으로써 상기 미소구의 벽에 혼입시킬 수도 있다.

12. 약학 제형

치료 제형: 폴리뉴클레오티드 염: 본 원에 개시된 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 약학적으로 허용 가능한 염의 투여는 본 발명의 범위 내에 있다. 상기와 같은 염을 약학적으로 허용 가능한 무독성 염기, 예를 들어 유기 염기 및 무기 염기로부터 제조할 수 있다. 무기 염기로부터 유도된 염으로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 등이 있다. 약학적으로 허용 가능한 유기 무독성 염기로부터 유도된 염에는 1 차, 2 차 및 3 차 아민, 염기성 아미노산 등의 염이 포함된다. 약학적 염의 도움이 되는 논의에 대해서, 문헌[S.M. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66:1-19(1977)](본 발명에 참고로 인용되어 있다)을 참조하시오.

주입용으로 적합한 미소구에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 앰풀 또는 수회 용량 용기에 단위 투여 형으로 제조할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 유성 또는 바람직하게는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유화액으로서 상기와 같은 형태로 존재할 수 있다. 한편으로, 상기 폴리뉴클레오티드 염은 전달 시에 적합한 비히클, 예를 들어 멸균 발열물질 비 함유 수로 재 조성되는 동결건조된 형태일 수도 있다. 재 조성해야 하는 동결건조된 형태 및 액체 모두 주입되는 용액의 pH를 적합하게 조절하는데 필요한 양으로 약제, 바람직하게는 완충액을 포함한다. 임의의 비 경구 용도에 대해서, 특히 제형을 정맥 내로 투여하려는 경우, 용질의 총 농도를 상기 제제가 등장성, 저장성 또는 약한 고장성으로 되도록 조절해야 한다. 비 이온성 물질, 예를 들어 당이 긴장성의 조절에 바람직하며, 슈크로즈가 특히 바람직하다. 이들 형태 중 임의의 것은 적합한 제형화제, 예를 들어 전분 또는 당, 글리세롤 또는 염수를 추가로 포함할 수 있다. 단위 용량 당 조성물은 액체이건 고체이건 간에 0.1 내지 99%의 폴리뉴클레오티드 물질을 함유할 수 있다.

미소구에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 사용 전에 포장되는, 단위 용량 앰풀 또는 수회 용량 용기는 약학적 유효 용량 또는 수회의 유효 용량에 적합한, 미 소구에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 미소구 또는 용액에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 양을 담은 밀폐적으로 밀봉된 용기를 포함할 수 있다. 미소구에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 멸균 제형으로서 포장하며, 상기 밀폐적으로 밀봉된 용기를 상기 제형의 멸균성을 사용 시까지 보존하도록 디자인한다.

미소구에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포장되어 있는 용기를 표지하며, 상기 표지는 정부 기관, 예를 들어 식품 의약품 안전청이 처방한 고시를 포함하고, 이때 상기 고시는 인체 투여용으로 상기 용기 중에 함유된, 미소구에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조, 용도 또는 판매에 대한 연방 법 하의 정부기관의 승인을 반영한다. 연방 법은 인체의 치료에 대한 약제의 사용을 연방 정부 기관이 승인할 것을 요한다. 시행에 대한 책임은 식품 의약품 안전청에 있으며, 이는 21 U.S.C. 301-392에 상세히 개시된, 상기와 같은 승인을 확실히 하기 위한 적합한 규칙에서 나온다. 동물의 조직으로부터 제조된 생성물을 포함한 생물학적 물질에 대한 규정은 42 U.S.C. § 262. 하에 제시되어 있다. 유사한 승인이 대부분의 외국에 의해서도 요청된다. 규정은 나라마다 다르지만, 개별적인 절차들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

용량 및 투여 경로: 투여되는 용량은 치료하려는 환자의 증상 및 크기의 정도뿐만 아니라 치료 회수 및 투여 경로에 따라 변한다. 용량 및 회수를 포함한 계속적인 요법에 대한 섭생은 초기 반응 및 임상적 판단에 의해 좌우될 수 있다. 조직의 간극 공간 내로의 비 경구 주입 경로가 바람직하지만, 다른 비 경구 경로, 예를 들어 에어로졸 제형의 흡입이 특정한 투여, 예를 들어 코, 목구멍, 기관지 조직 또는 폐의 점막으로의 투여에 필요할 수도 있다. 바람직한 프로토콜에서, 수성 담체 중의 미소구에 결합된 본 발명의 적합한 형질감염제와 혼합되거나 회합된, 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제형을 조직에 부위 당 10 ㎕ 내지 약 1 ㎖의 양으로 주입한다. 상기 제형 중의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 농도는 약 0.1 ㎍/㎖ 내지 약 20 ㎎/㎖이다.

세포 내로의 폴리뉴클레오티드 및 펩티드의 형질감염을 위한 바람직한 제형은 유효 형질감염 촉진량의 리소포스파티드와 함께 또는 상기 없이 본 발명의 양이온성 리포폴리아민 형질감염제를 포함한다. 상기 리소포스파티드는 중성 또는 음의 헤드 그룹을 가질 수 있다. 리소포스파티딜콜린 및 리소포스파티딜에탄올아민이 바람직하며, 1-올레오일 리소포스파티딜콜린이 특히 바람직하다. 리소포스파티드 리간드는 0.5 리소지질 대 양이온 지질의 몰 비로 제형 중에 존재하는 것이 유리하다. 본 발명의 신규 양이온성 지질 DOTMA 및 DOTAP 중에서 선택된 양이온성 지질의 리소 형태를 또한 사용하여 형질감염의 유효성을 증가시킬 수 있다. 이들 리소 형태들은 본 발명의 미소구 제형에 전체 양이온 지질의 약 1/3 이하의 유효 량으로 존재하는 것이 유리하다.

본 발명의 또 다른 태양에 따라, 본 발명의 양이온성 지질을 포함하는 미소구 조성물을 제공하며, 이때 상기 양이온성 지질은 생물활성 치료 인자 조성물과 회합된 형질감염제로서 혼입된다. 상기 미소구 조성물의 지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고마이엘린 및 콜레스테롤로 이루어진 그룹 중에서 선택된 중성 지질 종을 추가로 포함할 수 있다. 이들 미소구 제형에서 양이온 대 중성 지질 종들의 바람직한 몰 비는 약 9/1 내지 1/9이며; 약 5/5의 몰비가 특히 바람직하다. 상기 미소구 제형은 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 및 양이온성 지질 종들의 리소 형태로 이루어진 그룹 중에서 선택된 리소 지질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 더욱 또 다른 태양에 따라, 약리학적 유효량의 추가의 치료제, 예를 들어 치료 약물과 함께 본 원에 개시된 양이온성 및 양쪽성 지질 중 어느 하나에 의해 생물활성 치료 인자에 결합된 미소구를 포함하는 약학 생성물을 제공한다. 이들 조성물 중에 존재하는 양이온성 또는 양쪽성 지질은 상기 생물활성 치료 인자 및/또는 추가적인 활성 치료제 모두의 세포 내 전달을 촉진시킨다. 국소, 장 및 비 경구 용도용 생성물을 제공한다. 하나의 약학 생성물에서, 추가적인 치료제는 예를 들어 비 제한적으로 스테로이드이며; 또 다른 치료제는 예를 들어 비 제한적으로 비-스테로이드성 소염제이다.

본 발명의 다른 약학 생성물에서, 추가적인 치료제는 항바이러스성 뉴클레오시드 동족체 또는 바람직하게는 항바이러스성 뉴클레오시드 동족체의 지질 유도체, 즉 포스파티딜 유도체 또는 디포스페이트 디글리세라이드 유도체이다. 상기 항바 이러스성 뉴클레오시드는 디데옥시뉴클레오시드, 디데하이드로뉴클레오시드, 뉴클레오시드의 할로겐화된 유도체 또는 아지도-유도체, 또는 비환상 뉴클레오시드일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 항바이러스성 뉴클레오시드의 지질 유도체는 (3'-아지도-3'-데옥시)티미딘-5'-디포스포-3-디아실글리세롤(AZT 디포스페이트 디글리세라이드) 및 디데옥시티미딘 디포스페이트 디글리세라이드이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 항바이러스성 뉴클레오시드의 지질 유도체는 1-(2-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도시토신(FIAC) 또는 1(2'-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노푸라노실)-5-요오도우라실(FIAU)의 아사이클로비어 또는 강사이클로비어 디포스페이트 디글리세라이드 또는 디포스페이트 디글리세라이드 유도체이다.

13. 키트

본 발명은 상기 언급한 본 발명의 조성물의 하나 이상의 성분들로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제 팩 및 키트에 관한 것이다. 상기와 같은 용기(들)와 관련하여 인체 투여용 제품의 제조, 사용 또는 판매에 정부기관의 승인을 반영하는, 상기 약제 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 조정하는 정부기관에 의해 처방된 형태의 고시가 있을 수 있다. 본 원에 개시된 임의의 분석 또는 방법에 대한 시약들을 또한 키트의 요소로서 포함시킬 수 있다.

하나의 키트 포맷에서, 본 발명의 상업적으로 입수할 수 있는 비드 또는 미소구가 본 발명의 형질감염제 및 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 생리학적으로 적합한 용액 중에 존재하며, 이때 상기 3 개의 성분들은 모두 하나의 바이알에 존재한다. 또 다른 키트 포맷에서, 본 발명의 상업적으로 입수할 수 있는 미소구를 하나의 바이알로 입수할 수 있다. 본 발명의 형질감염제와 회합된 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 바이알에 존재할 수 있으며, 이어서 상기 미소구를 상기 폴리뉴클레오티드 형질감염제 복합체와 함께 혼합한다. 마지막으로, 또 다른 키트 포맷에서, 본 발명의 상업적으로 입수할 수 있는 비드 또는 미소구가 하나의 바이알에서 생리학적으로 적합한 용액 중에 존재한다. 상기 상업적으로 입수할 수 있는 형질감염제는 또 다른 별도의 바이알에 존재할 수도 있다. 본 발명의 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 역시 또 다른 바이알에 존재할 수 있다. 이어서 상기 별도의 바이알들로부터의 3 개의 성분들을 합하여 본 발명의 형질감염제와 회합된 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 미소구를 형성할 수 있다.

더욱 또 다른 키트 포맷에서, 본 발명의 비드 또는 미소구가 형질감염 향상제와 배합된 형질감염제와 회합된 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 생리학적으로 적합한 용액 중에 존재한다. 더욱 또 다른 키트 포맷에서, 본 발명의 비드 또는 미소구가 생물활성 치료제의 흡수 촉진제와 배합된 형질감염제와 회합된 생물활성 치료 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 생리학적으로 적합한 용액 중에 존재한다.

본 발명은 색전화 유전자 요법의 안전하고 유효한 방법을 제공하며, 상기 방법은 암 및 다양한 다른 혈관형성-의존성 질병의 치료에 유용하다. 따라서 상기와 같은 색전화 유전자 요법의 방법은 내과 의사 및/또는 외과의사, 예를 들어 비 제한적으로 중간의 방사선 의사에게 유리하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 수술 전, 도중 또는 후에 외과의사에 의해 사용될 수 있다.

간단히, 유전자 요법에서 유전자를 DNA 또는 RNA의 분자로서 환자의 세포에 전달한다. 상기 유전자들은 관심 유전자를 포함하는 핵산 및 표적 세포 내에서 상기 유전자의 발현 수준을 높게 조절하는 촉진/향상 인자의 발현 제작-카세트의 일부를 형성한다. DNA는 세포 내에서 RNA 전령 분자내로 효소에 의해 전사되며, 상기 분자는 상기 유전자 서열을 단백질 산물로 번역하기 위한 주형을 형성한다. 이어서 상기 단백질은 표적 세포 내에서 또는 주변 조직 내에서 기능을 제공하여 세포 검출을 보정하거나 또는 종양 세포와 같은 세포를 죽인다.

따라서, 유전자 및 세포 요법은 유전자 정보를 세포 또는 병에 걸린 기관에 도입시킴으로써 치료 관심 단백질의 발현을 보장하거나 결핍 또는 비 정상(돌연변이, 이상 발현 등)을 보정하는 것으로 이루어진다. 이러한 유전 정보를 생체 외에서 기관으로부터 추출된 세포 내에 도입시키고, 이어서 상기 변형된 세포를 체 내에 재 도입시키거나, 또는 생체 내에서 직접 적합한 조직 내로 도입시킬 수 있다. 이러한 유전 정보의 전달을 위한 다양한 기법들, 특히 DNA와 DEAE-덱스트란의 복합체(Pagano et al., J. Virol. 1(1967)891), DNA와 핵 단백질의 복합체(Kaneda et al., Science 243(1989)375), DNA와 지질의 복합체(Felgner et al., PNAS 84(1987)7413), DNA와 폴리리신의 복합체, 리포솜의 사용(Fraley et al., J. Biol. Chem. 255(1980)10431) 등을 포함한 다양한 형질감염 기법들이 개시되어 있다.

색전술은 혈액이 넘치는 혈관의 부분적이거나 전적인 폐색이다. 치료적 색전술은 동맥 또는 정맥을 폐색시켜 기능장애, 예를 들어 동정맥 기형을 보정하거나 충실성 종양/암 성장에의 필수 요소의 공급을 멈추기 위해 혈류를 차단하는 절차이다. 가장 일반적으로는 치료적 색전술은 활성 분자들이 색전 물질이 침착되는 곳으로 수반되고/되거나 전달되지 않는다는 의미에서 "수동" 작용이다.

본 발명은 동일한 목적인 암 세포의 감소 또는 제거에 대해 작용하는 형질감염성 유전 물질의 국소성 전달에 의해 혈류의 감소와 협동하는 "능동" 색전술에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 하기의 이점들을 갖는다: (1) 주입된 물질이 원래 주입된 조직 내에서 쉽게 이동하지 않으며, 따라서 의도하는 유전자 요법이 반복적인 투여나 환자에 대한 부작용없이 성취되고; (2) 주입된 물질이 생화학적으로 또는 면역 또는 림프계를 통해 쉽게 절단, 치환 또는 제거되지 않으며, 따라서 상기 방법은 보다 유효하게 오래 지속되고; (3) 상기 물질들은 18 내지 26 게이지 또는 30 게이지 이하의 바늘을 통해 주입되기에 충분한 크기를 가지며, 따라서 상기 방법은 보다 정확하고 유효하며 환자에게 덜 침해적이고; (4) 주입된 입자들은 가요성이나 깨지기 쉽지 않아서 파괴없이 쉽게 주입되며, 따라서 용이하고 안전한 주입을 제공하고; (5) 주입된 입자들은 불규칙적인 모양이 아니고 함께 덩어리지지 않으며, 따라서 용이하고 정확한 주입을 제공한다. 이러한 이점들은 단독으로 혹은 함께 치 료 유효성을 향상시키며, 안전하고 보다 편리하며 환자에게 편안하다.

하기의 실시예는 예시로 제공되며 제한적인 것은 아니다.

실시예 1

탈염수 100 ㎖을 함유하는 비이커에, 염화 나트륨 58 g 및 아세트산 나트륨 27 g을 용해시킨다. 글리세롤 400 ㎖을 가하고 이어서 pH를 5.9 내지 6.1로 조절한다. 이어서 N-트리스-하이드록시-메틸 메틸아크릴아미드 90 g, 디에틸아미노에틸아크릴-아미드 35 ㎎ 및 N,N-메틸렌-비스-아크릴아미드 10 g을 가한다. 60 내지 70 ℃로 가열하고 고온의 100 mo의 300 ㎎/젤라틴 용액 ㎖을 가한다. 상기 혼합물의 총 부피를 고온 수를 가하여 980 ㎖로 조절하고 이어서 20 ㎖의 70 ㎎/암모늄 퍼설페이트 용액 ㎖ 및 4 ㎖의 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민을 가한다.

상기 용액을 50 내지 70 ℃에서 교반하면서 파라핀 오일에 붓는다. 수분 후에, 아크릴 단량체의 중합 반응이 온도 증가에 의해 나타난다. 이어서 미소구를 경사분리에 의해 회수하고, 조심스럽게 세척하고, 선별하고 완충 매질 중에서 오토클레이브에서 멸균한다.

상기 미소구는 선별 눈금화 후에 현저한 양이온 전하 및 유효 접착제(젤라틴 또는 변성된 콜라겐)를 포함하여 색전화에 바람직한 특성을 갖는다.

실시예 2

디에틸아미노에틸 아크릴아미드 대신에 트리에틸아미노에틸 아크릴아미드를 사용하여 실시예 1의 과정을 수행한다. 미소구를 회수한 후에, 젤라틴을 25% 글루타르알데히드 용액(모든 미소구에 대해 100 ㎖)으로 망상화시킨다. 상기 처리를 4 ℃에서 밤새 수행한다. 이어서 상기를 탈염수로 세척한다.

실시예 3 및 4

N-트리스-하이드록시메틸 메틸아크릴아미드 10 g 대신에 아크릴산 10 g을 사용하여 실시예 1 및 2의 과정을 수행한다. 수득된 미소구는 염 및 이온 농도 및 pH 수준에 의해 조절 가능한 높은 팽윤성을 갖는다. 상기 미소구는 유리하게는 취급 시 사용자가 직접 보면서 사용할 수 있다.

실시예 5 및 6

N-트리스-하이드록시메틸 메틸아크릴아미드 대신에 N-아크릴로일 헥사메틸렌 프로시온 레드 HE-3B 10g을 사용하여 실시예 1 및 2의 과정을 수행한다. 수득된 미소구는 중합체 격자 내에 아크릴 염료의 혼입으로 인해 짙은 적색을 띤다. 상기 미소구는 유리하게는 취급 시 사용자가 직접 보면서 사용할 수 있다.

실시예 7 및 8

실시예 1 내지 4에 따라 수득된 미소구 100 ㎖을 pH 8의 0.1 M 보레이트 완충액으로 세척하고 이어서 50 ㎖의 5 ㎎/로다민 이소티오시아네이트 용액 ㎖에 현탁시킨다. 이어서 상기 현탁액을 15 시간 이상 교반하고, 그 후에 중성 완충액으로 세척하여 무색 상등액을 얻는다.

실시예 9 및 10

N-트리스-하이드록시메틸 메틸아크릴아미드 10 g 대신에 X-선 불투과성인 단 량체 (아크릴아미도-3-프로피온아미도)-3-트리요오도-2,4,6-벤조산 10 g을 사용하여 실시예 1 내지 4의 과정을 수행한다.

수득된 미소구는 X-선을 흡수하는 성질을 가지며 따라서 색전화 유전자 요법에서 사용 후 생체 내에서의 상기의 추적에 특히 중요하다.

실시예 11 내지 14

초기 단량체 용액에 방사선 불투과성 가용성 선형 중합체, 아크릴아미노-3-트리요오도-2,4,6-벤조 폴리산(실시예 11 및 12) 또는 (아크릴아미노-3-프로피온아미도)-3-트리요오도-2,4,6-벤조 폴리산(실시예 13 및 14) 5 g을 가하여 실시예 1 내지 2의 과정을 수행한다.

100,000 달톤을 초과하는 분자량을 갖는 상기 중합체들이 중합체 격자 내에 감금되며, 목적하는 용도에 대한 상기 미소구의 일반적인 성질을 방해하지 않으면서 색전화 유전자 요법의 생체 내 추적에 사용될 수 있는 방사선불투과성을 얻을 수 있다.

실시예 15 및 16

초기 단량체 용액에 황산 바륨 분말 200 g을 가하여 실시예 1 및 2의 과정을 수행한다. 수득된 미소구는 가시광선과 X-선 모두에 대해 불투과성이다.

실시예 17 및 18

초기 단량체 용액에 마그네타이트(Fe3O4) 50 ㎎을 가하여 실시예 1 및 2의 과정을 수행한다.

수득된 미소구는 자기 공명 영상(MRI) 상에서 검출되는 성질을 갖는다.

실시예 21

색전화 유전자 요법에 사용하기 위한 주입 가능한 현탁액의 제조

본 발명의 추가의 실시태양은 상술한 실시예 1 내지 20의 임의의 미소구들을 사용하고 상기 미소구들을 p53 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 적합한 프로모터(이때 상기 폴리뉴클레오티드는 형질감염제, 예를 들어 Transfectam(등록상표)(Biosphere Medical)와 회합된다)의 조절 하에서 추가로 혼합함을 포함한다. 상기와 같은 미소구/p53 유전자/Tansfectam(등록상표) 조성물은 동맥 색전화 및 개선, 및 다양한 암, 예를 들어 간, 신장 및 췌장 암의 후속적인 제거에 유용하다.

실시예 22

색전화 유전자 요법과 혈관형성 억제의 복합 요법에 사용하기 위한 주입 가능한 현 탁액의 제조

본 발명의 추가의 실시태양은 상술한 실시예 1 내지 20의 임의의 미소구들을 사용하고 상기 미소구들을 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 혈관형성 억제제(이때 상기 폴리뉴클레오티드는 형질감염제, 예를 들어 Transfectam(등록상표)(Biosphere Medical)와 회합된다)와 추가로 혼합함을 포함한다. 상기와 같은 미소구/혈관형성 억제제/Tansfectam(등록상표) 조성물은 복합적인 암의 동맥 색전화 및 개선을 위한 후속적인 혈관형성 예방과, 다양한 암, 예를 들어 간, 신장 및 췌장 암의 후속적인 제거에 유용하다.

상술한 본 발명의 실시태양들은 단지 예시적인 것이며 당해 분야의 숙련가들은 본 원에 개시된 특정한 과정들과 동등한 다수의 통상적인 실험들을 사용할 수 있음을 인식하거나 확신할 것이다. 상기와 같은 모든 등가물들은 본 발명의 범위 내에 있고 하기 청구의 범위에 의해 포함되는 것으로 간주된다.

본 원에 개시된 모든 참고문헌들의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다. 다른 실시태양들은 하기 청구의 범위 내에 있다.

Claims (39)

1. 나트륨 아크릴레이트 및 비닐 알콜의 공중합체, 및

   약물, 백신 또는 이들의 조합물을 포함하여 이루어지고,

   실질적 구형(球形)인 것을 특징으로 하는 능동 색전화(active embolization)용 팽윤성 미소구.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구는 가교결합된 것임을 특징으로 하는 미소구.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 공중합체는 0.5 ~ 20 중량%의 가교결합제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미소구.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 항종양 약물, 혈관형성 억제 약물, 항진균 약물, 항바이러스 약물, 소염제, 항균제, 항히스타민제 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약물인 것을 특징으로 하는 미소구.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 항종양 약물인 것을 특징으로 하는 미소구.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 항종양 약물은 백금 화합물, 미토마이신, 안사미토신, 블레오마이신, 시토신 아라비노사이드, 아라비노실 아데닌, 머캅토폴리리신, 빈크리스틴, 부설판, 클로람부실, 멜파란, 머캅토퓨린, 미토탄, 프로카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 플리카마이신, 아미노글루테티미드, 에스트라머스틴, 플루타미드, 류프롤리드, 메제스트롤, 타목시펜, 테스토락톤, 트리로스탄, 암사크린, 아스파라기나제, 에르위나 아스파라기나제, 에토포시드, 인터페론 α-2a, 인터페론 α-2b, 테니포시드, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 메토트렉세이트, 카르젤레신, 플루오루라실(5-FU), 패클리탁셀, 조직 플라스미노겐 활성인자, 덱사메타손, 암포테리신 B, 이들의 염, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미소구.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 백금화합물은 스피로플라틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 미소구.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 멜파란은 PAM, L-PAM, 페닐알라닌 겨자, 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 미소구.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 패클리탁셀, 시스플라틴, 미토마이신, 타목시펜, 독소루비신, 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 미소구.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 약물이 상기 미소구 표면에 코팅된 것을 특징으로 하는 미소구.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 약물이 상기 미소구 내부에 포함된 것을 특징으로 하는 미소구.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 약물이 상기 미소구에 흡착 또는 흡수된 것을 특징으로 하는 미소구.
13. 제 1 항에 있어서, 형광 마커 유도체, 화학 염료, 콘트라스트제, 자기 공명 영상제, 또는 이들의 혼합물이 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 미소구.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 콘트라스트제가 상자성 또는 초상자성 콘트라스트제, 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 미소구.
15. 제 13 항에 있어서, 상기 콘트라스트제가 바륨 염, 마그네타이트 염, 요오드 염, 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 미소구.
16. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구의 직경이 10 ㎛ 내지 2000 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 미소구.
17. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구의 팽윤 이전의 직경이 10 ㎛ 내지 400 ㎛ 범 위인 것을 특징으로 하는 미소구.
18. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구의 팽윤된 직경이 10 ㎛ 내지 2000 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 미소구.
19. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구는 환자에게 주입하기 전에 팽윤된 것임을 특징으로 하는 미소구.
20. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구는 환자에게 주입한 후에 팽윤되는 것임을 특징으로 하는 미소구.
21. 제 1 항에 있어서, 상기 미소구는 원래 크기의 15배 팽윤되는 것임을 특징으로 하는 미소구.
22. 제 1 항에 있서, 상기 미소구는 비팽윤성임을 특징으로 하는 미소구.
23. 제 1 항의 미소구 및 생체 적합성 담체를 포함하는 혈관형성-의존성 질병 치료용 멸균된 약학 조성물.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 미소구의 현탁액인 것을 특징으로 하는 조성물.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 미소구가 유화액 중에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
26. 제 24 항에 있어서, 상기 미소구가 수성, 수-유기, 유성, 비수성의 용액 또는 이들의 혼합물에서 선택된 용액 중에 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
27. 제 24 항에 있어서, 상기 생체 적합성 담체가 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연 및 암모늄으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 양이온들로 구성된 염을, 0.01 M 내지 5 M의 양 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 염이 콘트라스트제의 형태로 공급되는 조성물.
29. 제 23 항에 있어서, 상기 조성물은 18 게이지 또는 그보다 작은 바늘을 통해 주입가능한 것을 특징으로 하는 조성물.
30. 제 23 항에 있어서, 상기 미소구 표면에 약물이 코팅되어 있고, 상기 약물은 방출될 때까지 상기 미소구에 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
31. 제 23 항에 있어서, 상기 미소구 내부에 약물이 포함되어 있고, 상기 약물은 방출될 때까지 상기 미소구에 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
32. 제 23 항에 있어서, 표적화 항체(targeting antibodies)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
33. 제 23 항에 있어서, 상기 혈관형성-의존성 질병은 암 또는 종양인 것을 특징으로 하는 조성물.
34. 제 33 항에 있어서, 상기 암은 간, 신장, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 유잉 육종, 임신성 영양모세포성 암종, 호즈킨 병, 비-호즈킨 림프종, 버키트 림프종 확산성 대세포 림프종, 모낭 혼합 림프종, 림프모세포성 림프종, 횡문근육종, 고환 암종, 윌름 종양, 항문 암종, 방광 암종, 유방 암종, 만성 림프구성 백혈성, 만성 골수성 백혈병, 털세포 백혈병, 두부 및 경부 암종, 폐(소세포) 암종, 다발성 골수종, 비-호즈킨 림프종, 낭성 림프종, 난소 암종, 뇌종양(성상세포종), 경부 암종, 결장직장 암종, 간세포 암종, 카포시 육종, 폐(비 소세포) 암종, 흑색종, 췌장 암종, 전립선 암종, 연조직 암종, 유방 암종, 결장직장 암종(단계 III), 골형성성 육종, 난소 암종(단계 III), 고환 암종 중에서 선택된 암인 것을 특징으로 하는 조성물.
35. 제 23 항에 있어서, 상기 혈관형성-의존성 질병은 비후성 흉터 및 켈로이드, 증식성 당뇨병성 망막증, 류마티스성 관절염, 동정맥 기형, 죽상경화성 반, 지연된 상처 치유, 혈우성 관절, 비결합성 골절, 오시어 웨버(Osier-Weber) 증후군, 건선, 화농성 육아종, 경피증, 트라코마, 과다월경 및 혈관 유착 중에서 선택된 비-종양형성 혈관형성-의존성 질병인 것을 특징으로 하는 조성물.
36. 제 1 항에 있어서, 상기 백신은 폐렴구균 백신, 소아마비 백신, 탄저병 백신, 결핵 백신, A형 간염 백신, 콜레라 백신, 수막구균 A형 백신, 수막구균 C형 백신, 수막구균 Y형 백신, W135 백신, 페스트 백신, 광견병 백신, 황열 백신, 일본 뇌염 백신, 장티프스 백신, B형 간염 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, 에이치 인플루엔자 b형 백신, 폴리오 백신, 홍역 백신, 유행성 이하선염 백신, 풍진 백신, 수두 백신, 스트렙토코커스 뉴모니아에 Ty 백신, Vi 백신, dT 백신, Td 백신, 백일해 백신, DTaP 백신, 인플루엔자 백신, 호흡기 합포체 바이러스 백신, 인간 아스트로바이러스 백신, 로타바이러스 백신, A형 인간 인플루엔자 바이러스 백신, B형 인간 인플루엔자 바이러스 백신, 생 약독화된 파라인플루엔자 바이러스 3 형 백신, 장바이러스 백신, 레트로바이러스 백신, 피코르나바이러스 백신, 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미소구.
37. 나트륨 아크릴레이트 및 비닐 알콜의 공중합체를 포함하는 실질적 구형(球形)인 것을 특징으로 하는 능동 색전화(active embolization)용 팽윤성 미소구 및 유전 물질을 포함하는 혈관형성-의존성 질병의 유전자 요법 치료용 멸균된 약학 조성물.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 유전 물질은 천연 또는 합성 폴리뉴클레오타이드 인 것을 특징으로 하는 조성물.
39. 제 38 항에 있어서, 상기 폴리뉴크레오타이드는 RNA, DNA, 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 망치머리형 RNA, 리보자임 또는 이들의 동족체인 것을 특징으로 하는 조성물.