CN118139655A - 皮肤替代组合物及其产生和使用方法 - Google Patents

皮肤替代组合物及其产生和使用方法 Download PDF

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A·L·埃斯帕扎席尔瓦
帕切科 B·A·塞古拉
B·A·塞古拉帕切科
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Abstract

本文提供了包含复层表皮的皮肤替代组合物，其中所述复层表皮的细胞产生例如分泌重组生长因子和重组胰岛素。在一些方面，本公开文本进一步涉及制造皮肤替代物的方法以及使用所述组合物用于治疗受试者如用于伤口愈合的方法。

Description

皮肤替代组合物及其产生和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月13日提交的美国临时专利申请号63/233,196的优先权，将其中每一个的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
通过引用并入序列表
将电子序列表的内容(166312000140SEQLIST.xml；大小：65,924字节；并且创建日期：2022年8月12日)通过引用以其整体并入本文。
技术领域
在一些方面，本公开文本涉及一种包含复层表皮的皮肤替代组合物，其中所述复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组生长因子和重组胰岛素。在一些方面，本公开文本进一步涉及制造皮肤替代物的方法以及使用所述组合物用于治疗受试者(如用于伤口愈合)的方法。
背景技术
皮肤替代物或皮肤等效组合物可用于在有需要的受试者中实现伤口愈合。然而，此类组合物的伤口愈合能力是有限的，并且需要高受试者依从性，如在伤口愈合过程中需要多次敷用所述组合物。需要以最少的受试者干预实现有效伤口愈合的改进的组合物。本文提供满足此类需要的组合物和方法。
发明内容
在一些方面，本文描述了皮肤替代物。在一些任何实施方案中，所述皮肤替代物包含含有基底层、棘层、颗粒层和角化层的复层表皮，其中所述复层表皮的细胞表达重组生长因子和重组胰岛素。在一些任何实施方案中，所述重组生长因子和所述重组胰岛素可从所述复层表皮的细胞分泌。在一些任何实施方案中，所述复层表皮为100-200μm厚。在一些任何实施方案中，所述复层表皮的表达所述重组生长因子和所述重组胰岛素的细胞包括所述基底层的细胞。在一些任何实施方案中，所述重组胰岛素是或包括重组人胰岛素。
在一些任何实施方案中，所述重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列；(ii)所述重组胰岛素的功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％、或至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式。在一些任何实施方案中，所述A链和所述B链通过二硫键连接。在一些任何实施方案中，所述重组胰岛素由多核苷酸编码，所述多核苷酸编码(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，或(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述重组胰岛素是AspB10胰岛素类似物，与SEQ ID NO:5中所示的野生型胰岛素相比，所述AspB10胰岛素类似物包含经修饰的人胰岛素原的B链中位置10处的组氨酸到天冬氨酸的突变。
在一些任何实施方案中，所述皮肤替代物包含编码胰岛素原的多核苷酸，所述胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点或内肽酶Lys64-Arg65切割位点。在一些任何实施方案中，所述至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点和内肽酶Lys64-Arg65切割位点。在一些任何实施方案中，所述至少一个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。在一些任何实施方案中，所述至少一个弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)或RQKR(SEQ ID NO:42)。
在一些任何实施方案中，所述重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式。在一些任何实施方案中，所述A链和所述B链通过二硫键连接。在一些任何实施方案中，所述重组胰岛素包含SEQ ID NO:6中所示的序列或者(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式。在一些任何实施方案中，所述A链和所述B链通过二硫键连接。在一些任何实施方案中，所述重组胰岛素包含SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链。在一些任何实施方案中，所述A链和所述B链通过二硫键连接。
在一些任何实施方案中，所述重组人胰岛素由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，所述重组人胰岛素包含SEQ ID NO:2中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述重组生长因子选自表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、及其任何异形体或可变剪接变体。在一些任何实施方案中，所述重组生长因子是VEGF或其异形体或可变剪接变体。
在一些任何实施方案中，所述VEGF由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与SEQID NO:4中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性。在一些任何实施方案中，所述VEGF由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ IDNO:4中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述VEGF包含与SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，所述VEGF包含SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列。
在一些任何实施方案中，所述皮肤替代物包含VEGF，并且所述VEGF包含与SEQ IDNO:44中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，所述VEGF包含SEQ ID NO:44中所示的序列。在一些任何实施方案中，所述重组生长因子和所述重组胰岛素由双顺反子表达盒编码，所述双顺反子表达盒包含编码所述重组生长因子的多核苷酸和编码重组胰岛素的多核苷酸，由双顺反子元件分开。
在一些任何实施方案中，所述双顺反子元件是IRES。在一些任何实施方案中，在一些任何实施方案中，编码所述重组生长因子和所述重组胰岛素的多核苷酸与启动子可操作地连接。在一些任何实施方案中，所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些任何实施方案中，所述启动子是CAG启动子。在一些任何实施方案中，在所述双顺反子表达盒中，编码所述重组生长因子的所述多核苷酸位于编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸的上游。
在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞以如下水平分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素，所述水平导致血管生成重组的一种或多种标记物相对于仅包含所述重组生长因子或重组胰岛素的皮肤替代物更大的改善。在一些任何实施方案中，可以在管形成测定中评价血管生成重组的一种或多种标记物的改善。在一些任何实施方案中，血管生成重组的所述标记物是节点(node)或联接头(union)的数量的增加，所述节点或联接头定义为至少三条弦带(chord)的连结位点(bond site)。在一些任何实施方案中，血管生成重组的所述标记物是网(web)的数量的增加，所述网定义为由两个或更多个节点包围的闭合回路。在一些任何实施方案中，血管生成重组的所述标记物是主节段(main segment)的数量的增加，所述主节段定义为将两个节点连结在一起的弦带。
在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞连续分泌可定量水平的所述重组生长因子和所述重组胰岛素。在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞连续分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素持续长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞连续分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素持续长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞分泌可定量水平的所述重组生长因子和C肽，所述可定量水平的重组生长因子和C肽可以被检测到长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞分泌可定量水平的所述重组生长因子和C肽，所述可定量水平的重组生长因子和C肽可以被检测到长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞以如下水平分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素，所述水平降低受试者的皮肤中晚期糖基化终末产物(AGE)的水平。在一些任何实施方案中，所述复层表皮的细胞是由角质形成细胞分化的。在一些任何实施方案中，所述角质形成细胞是人角质形成细胞。在一些任何实施方案中，所述角质形成细胞是HaCaT角质形成细胞。
在一些方面，本文提供了一种双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含编码重组人生长因子和重组胰岛素的多核苷酸。在一些任何实施方案中，所编码的重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸包含(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在一些任何实施方案中，所编码的重组胰岛素是AspB10胰岛素类似物，与SEQ IDNO:5中所示的野生型胰岛素相比，所述AspB10胰岛素类似物包含经修饰的人胰岛素原的B链中位置10处的组氨酸到天冬氨酸的突变。在一些任何实施方案中，编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸编码胰岛素原，所述胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点或内肽酶Lys64-Arg65切割位点。在一些任何实施方案中，所述至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点和内肽酶Lys64-Arg65切割位点。在一些任何实施方案中，所述至少一个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。在一些任何实施方案中，所述至少一个弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)或RQKR(SEQID NO:42)。
在一些任何实施方案中，所编码的重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所编码的重组胰岛素包含SEQ ID NO:6中所示的序列。在一些任何实施方案中，编码重组胰岛素的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
在一些任何实施方案中，编码重组胰岛素的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:2中所示的序列。在一些任何实施方案中，所编码的重组生长因子选自表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、及其任何异形体或可变剪接变体。
在一些任何实施方案中，所述重组生长因子是VEGF或其异形体或可变剪接变体。在一些任何实施方案中，编码所述生长因子的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，编码所述生长因子的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:4中所示的序列。在一些任何实施方案中，所编码的VEGF包含与SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
在一些任何实施方案中，所编码的VEGF包含SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列。在一些任何实施方案中，所编码的VEGF包含与SEQ ID NO:44中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些任何实施方案中，所编码的VEGF包含SEQ ID NO:44中所示的序列。
在一些任何实施方案中，编码所述重组生长因子的所述多核苷酸和编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸由双顺反子元件分开。在一些任何实施方案中，所述双顺反子元件是IRES。在一些任何实施方案中，编码所述重组生长因子和所述重组胰岛素的多核苷酸与启动子可操作地连接。在一些任何实施方案中，所述启动子是相同的。在一些任何实施方案中，所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。在一些任何实施方案中，所述启动子是CAG启动子。在一些任何实施方案中，在所述双顺反子表达盒中，编码所述重组生长因子的所述多核苷酸位于编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸的上游。
在一些方面，本文提供了一种载体，所述载体包含本文提供的任何实施方案的双顺反子表达盒。在一些任何实施方案中，所述载体是病毒载体。在一些任何实施方案中，所述病毒载体是腺病毒载体。在一些任何实施方案中，所述载体是非复制型5型腺病毒。在一些任何实施方案中，所述非复制型腺病毒缺乏E1和E3区或在所述区域中缺失。在一些任何实施方案中，将所述双顺反子表达盒插入所述E1区中。
在一些方面，本文提供了一种制造皮肤替代物的方法。在一些任何实施方案中，所述方法包括：1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及2)将所提供的实施方案中任一项的双顺反子表达盒或所提供的实施方案中任一项的载体引入所述复层表皮的细胞中，以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含重组生长因子和重组胰岛素。在一些任何实施方案中，所述引入是通过所提供的实施方案中任一项的病毒载体的转导进行的。
在一些方面，本文提供了一种制造皮肤替代物的方法。在一些任何实施方案中，所述方法包括：1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及2)将所提供的实施方案中任一项的病毒载体转导到所述复层表皮的细胞中，以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。
在一些方面，本文提供了一种制造皮肤替代物的方法。在一些任何实施方案中，所述方法包括：1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及2)用编码经修饰的胰岛素原和生长因子的腺病毒载体转导所述复层表皮的细胞以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。
在一些任何实施方案中，在所述引入或转导时，所述复层表皮的细胞表达闭合蛋白和密封蛋白。在一些任何实施方案中，引入或转导所述基底层的细胞。在一些任何实施方案中，在步骤1)中的所述分化之前，所述方法包括将角质形成细胞在低钙培养基中培养以培养基底层持续2周、3周、4周、5周、或6周。在一些任何实施方案中，在步骤1)中的所述分化之前，所述方法包括将角质形成细胞在低钙培养基中培养以培养基底层持续为或约4周。
在一些任何实施方案中，在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为0.01-0.1mM的钙。在一些任何实施方案中，在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为至多或约0.05mM的钙。在一些任何实施方案中，在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为约0.03mM的钙。
在一些任何实施方案中，所述低钙培养基进一步包含表皮生长因子(EGF)和牛垂体提取物(BPE)。在一些任何实施方案中，在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含多达或约1ng/ml EGF以及多达或约100μg/ml BPE。在一些任何实施方案中，在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含多达或约0.2ng/ml EGF以及多达或约30μg/ml BPE。在一些任何实施方案中，所述角质形成细胞是人角质形成细胞。在一些任何实施方案中，所述角质形成细胞是HaCaT角质形成细胞。
在一些任何实施方案中，步骤1)包括将所述角质形成细胞在细胞外基质底物上培养。在一些任何实施方案中，所述细胞外基质底物是胶原。在一些任何实施方案中，所述细胞外基质底物是经人用认证的。在一些任何实施方案中，将所述角质形成细胞以在5x 106个细胞/mL与50x 106个细胞/mL之间的细胞密度接种在所述细胞外基质底物上。在一些任何实施方案中，所述细胞密度是为或约10x 106个细胞/ml、20x 106个细胞/ml、30x 106个细胞/ml或40x 106个细胞/ml、或前述任何值之间的任何值。在一些任何实施方案中，所述细胞密度是为或约20x 106个细胞/ml。在一些任何实施方案中，将所述细胞外基质底物包被在transwell小室(insert)上。
在一些任何实施方案中，步骤(1)中的所述培养持续约23至28天。在一些任何实施方案中，步骤(1)中的所述培养包括在低钙培养基中的第一孵育和在高钙培养基中的第二孵育。在一些任何实施方案中，在低钙培养基中的第一孵育持续约3-5天，并且在高钙培养基中的第二孵育持续约20-23天。在一些任何实施方案中，所述低钙培养基包含0.01-0.1mM钙。在一些任何实施方案中，所述高钙培养基包含1.0-3.0mM。在一些任何实施方案中，所述低钙培养基包含0.03mM钙，并且所述高钙培养基包含2.4mM钙。
在一些任何实施方案中，所述低钙培养基和所述高钙培养基进一步包含EGF和BPE。在一些任何实施方案中，所述低钙培养基和所述高钙培养基包含0.05ng/mL至1ng/mlEGF以及从1μg/ml至100μg/ml BPE。在一些任何实施方案中，所述低钙培养基和所述高钙培养基包含为或约0.2ng/ml EGF以及为或约30μg/ml BPE。在一些任何实施方案中，所述高钙培养基进一步包含氢化可的松。
在一些任何实施方案中，所述高钙培养基包含从0.1至1.0μg/ml氢化可的松。在一些任何实施方案中，所述高钙培养基包含为或约0.4μg/ml氢化可的松。在一些任何实施方案中，所述低钙培养基是无血清培养基。在一些任何实施方案中，所述高钙培养基是无血清培养基。
在一些任何实施方案中，在所述第二孵育期间，在将所述角质形成细胞在所述高钙培养基中培养时引入气液界面，其中使所述基底层的细胞暴露于所述高培养基但不暴露于气态环境。在一些任何实施方案中，在所述第一孵育期间，每天更换所述低钙培养基。在一些任何实施方案中，在所述第二孵育期间，每天更换所述高钙培养基。
在一些任何实施方案中，在步骤2)之后，所述方法可以进一步包括将所述皮肤替代物用冷冻保护剂配制。在一些任何实施方案中，所述冷冻保护剂包含人白蛋白和葡萄糖。在任何实施方案中的一些实施方案中，所提供的方法进一步包括在步骤2)之后冷冻所述皮肤替代物。在一些任何实施方案中，所提供的方法可以进一步包括对所述皮肤替代物进行质量控制评估。在一些任何实施方案中，在用所述冷冻保护剂配制所述皮肤替代物之前进行所述质量控制评估。在一些任何实施方案中，在步骤2)完成与所述质量控制步骤之间经过长达或约24小时。在一些任何实施方案中，所述质量控制步骤包括检测选自以下的一种或多种多肽：胰岛素原、经修饰的胰岛素原、胰岛素、胰岛素变体、生长因子及其变体。
在一些任何实施方案中，所提供的方法可以进一步包括将所述皮肤替代物置于脱脂纱布上。在一些任何实施方案中，所述角质形成细胞包括永生化角质形成细胞。在一些任何实施方案中，所述角质形成细胞包括来自HaCaT细胞系、NM1细胞系或NIKS细胞系的细胞，和/或源自所述HaCaT细胞系、NM1细胞系或NIKS细胞系的细胞。
在一些方面，本文提供了一种通过任何所提供的方法产生的皮肤替代物。在一些方面，本文提供了一种冷冻保存的皮肤替代物，所述冷冻保存的皮肤替代物包含任何所提供的实施方案的皮肤替代物和冷冻保护剂。在一些任何实施方案中，所述冷冻保护剂包含人白蛋白(0.02g/mL)和D-葡萄糖(0.09g/mL)。
在一些方面，本文提供了一种皮肤替代物，所述皮肤替代物包含任何所提供的实施方案的皮肤替代物或任何所提供的实施方案的冷冻保存的皮肤替代物以及脱脂纱布，其中将所述冷冻保存的皮肤替代物覆盖在脱脂纱布上。在一些任何实施方案中，所述脱脂纱布是凡士林矿脂纱布。在一些任何实施方案中，所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是约40-50cm2、约40-45cm2、或约45-50cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约40-60cm2、约45-60cm2、约45-55cm2。在一些任何实施方案中，所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、为或约50cm2、为或约51cm2、为或约52cm2、为或约53cm2。在一些任何实施方案中，任何所提供的实施方案的冷冻保存的皮肤替代物或任何所提供的实施方案的皮肤替代物敷料可以是无菌的。
在一些方面，本文提供了包含皮肤替代物的容器。在一些任何实施方案中，所述容器可以包含任何所提供的实施方案的皮肤替代物、任何所提供的实施方案的冷冻保存的皮肤替代物或任何所提供的实施方案的皮肤替代物敷料。在一些任何实施方案中，其中所述容器是袋。在一些任何实施方案中，其中所述容器是无菌的和/或热封的。
在一些方面，本文提供了包括一种包装，所述包装包含任何所提供的实施方案的容器。在一些任何实施方案中，所述包装是袋。在一些任何实施方案中，所述包装是无菌的和/或热封的。
在一些方面，本文提供了一种用于制备皮肤替代物敷料的方法。在一些任何实施方案中，所述方法包括将任何所提供的实施方案的皮肤替代物或任何所提供的实施方案的冷冻保存的皮肤替代物置于脱脂纱布上。在一些任何实施方案中，所述脱脂纱布是凡士林矿脂纱布。
在一些任何实施方案中，所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是约40-50cm2、约40-45cm2、或约45-50cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约40-60cm2、约45-60cm2、约45-55cm2。在一些任何实施方案中，所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、为或约50cm2、为或约51cm2、为或约52cm2、为或约53cm2。
在一些方面，本文提供了一种促进伤口愈合的方法。在一些任何实施方案中，任何所提供的方法包括向伤口施加任何所提供的实施方案的皮肤替代物、任何所提供的实施方案的冷冻保存的皮肤替代物、或任何所提供的实施方案的皮肤替代物敷料。
在一些任何实施方案中，所述皮肤替代物预防微生物感染。在一些任何实施方案中，将所述皮肤替代物施加到急性伤口和/或慢性伤口。
在一些任何实施方案中，所述伤口选自：疮、开放性伤口、溃疡和脓肿。在一些任何实施方案中，将所述皮肤替代物施加到糖尿病患者的伤口。在一些任何实施方案中，所述伤口是糖尿病溃疡。在一些任何实施方案中，所述伤口是糖尿病足溃疡。在一些任何实施方案中，所述伤口是下肢静脉溃疡。
附图说明
图1A示出了描绘产生包含复层表皮的皮肤替代物的方法中涉及的代表性步骤的图。图1B示出了在基底上培养的第25天的石蜡包埋的苏木精和伊红染色的皮肤替代物的代表性例子，其中指示了由分化的角质形成细胞形成的角质层、颗粒层、棘层和基底层。
图2示出了病毒载体以及包含生长因子、胰岛素和调节元件的示例性表达构建体的图形表示。
图3A示出了在包含复层表皮的皮肤替代物的蛋白质释放的体外研究中，在第1天、第4天和第6天检测到的C肽的平均水平(ng/mL)。图3B示出了在包含复层表皮的皮肤替代物的蛋白质释放的体外研究中，在第1天、第4天和第7天检测到的VEGF的平均水平(ng/mL)。一式三份地进行实验(n＝3)。
图4A-图4C示出了在内皮细胞管形成测定中，响应于VEGF(MOI＝12)、胰岛素(MOI＝24)、或VEGF与胰岛素组合(分别为MOI＝12和MOI＝24)的伤口愈合的标记物。图4A示出了响应于阴性和阳性对照、VEGF、胰岛素或VEGF+胰岛素而观察到的网的数量。图4B示出了响应于阴性和阳性对照、VEGF、胰岛素或VEGF+胰岛素而观察到的节点的数量。图4C示出了响应于阴性和阳性对照、VEGF、胰岛素或VEGF+胰岛素而观察到的主节段的数量。一式三份地进行实验，并且数据以平均值±标准差显示。
图5A示出了用标准伤口敷料治疗的健康大鼠和糖尿病大鼠以及用分泌VEGF和胰岛素两者的皮肤替代物治疗的糖尿病大鼠在21天时间段中开放性伤口面积的百分比。每组共有七只大鼠，并且数据以平均值±标准差显示。图5B示出了在用标准伤口敷料治疗或用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的健康大鼠和糖尿病大鼠的皮肤中，伤口开始(第1天)和伤口闭合程度(第21天)的代表性图像。
图6示出了在用纱布敷料治疗的健康大鼠(左)、用纱布敷料治疗的糖尿病大鼠(中)和用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病大鼠(右)中，在伤口开始后21天，大鼠伤口的石蜡包埋的苏木精和伊红染色的切片的代表性图像。
图7A示出了在28天内在用纱布敷料治疗的健康猪(n＝3)和糖尿病猪(n＝3)与用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪(n＝3)之间的伤口面积(cm2)的比较。图7B示出了在52天内在用纱布敷料治疗的糖尿病猪与用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪之间的伤口面积(cm2)的比较。数据以平均值±标准差表示。
图8示出了用纱布敷料治疗的健康猪(上)和糖尿病猪(中)以及用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪(下)的伤口的代表性图像。
图9示出了在伤口开始后第1天和第7天，用纱布敷料治疗的糖尿病猪(上)和用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪(下)的伤口区域的代表性图像。
图10示出了用纱布敷料治疗的健康猪和糖尿病猪以及用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪在伤口开始之前和伤口开始之后长达11天的葡萄糖水平(mg/dL)。数据以平均值±标准差(n＝3)表示。
图11示出了在伤口开始时和伤口愈合时从用纱布敷料治疗的健康猪和糖尿病猪以及用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪收集的皮肤样品中晚期糖基化终末产物(AGE)的水平(ng/mg蛋白质)。数据以平均值±标准差(n＝3)表示。
图12描绘了对应于HaLow细胞(在不含胎牛血清的低钙培养基中生长的HaCat细胞)在培养中繁殖后的细胞遗传学分析的核型图。
图13描绘了显示用表达hEGF的腺病毒(Ad-CMV-hEGF)转导的皮肤替代物中人表皮生长因子(hEGF)表达的定量的图。包括未转导的皮肤替代物作为实验对照。结果表示为重复的平均值±SEM。*与对照相比，p<0.05。
具体实施方式
本文提供了包含复层表皮的皮肤替代物的组合物，其中重组生长因子和重组胰岛素可从所述复层表皮的细胞分泌。在一些方面，本文提供了制造包含复层表皮的皮肤替代物的方法，所述复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组生长因子和重组胰岛素。在其他方面，本文提供了治疗需要伤口愈合的受试者如糖尿病受试者的方法。
伤口愈合是一个复杂过程，这一过程在某些患者群体(例如，糖尿病受试者)中受损。糖尿病受试者血液中的高水平的葡萄糖促进晚期糖基化终末产物(AGE)的形成。AGE诱导皮肤结构和血管化两方面的变化，导致相对于非糖尿病受试者伤口愈合延迟或到伤口闭合的时间延长。糖尿病患者易于被感染，例如细菌和/或真菌感染，使伤口愈合过程进一步复杂化。
某些皮肤替代组合物被FDA批准用于伤口愈合应用，特别是用于治疗糖尿病足溃疡。目前可用的皮肤替代物的一些局限性包括高成本、需要多次敷用以及有限的有效性，如未能促进或实现足够的瘢痕形成，这是伤口愈合过程的关键部分。相比之下，本文提供的皮肤替代组合物可以以少数敷用促进糖尿病受试者的伤口愈合，包括瘢痕形成。在一些情况下，仅需要一次敷用即可实现与在非糖尿病受试者中观察到的情况相当的伤口愈合(例如，到伤口闭合的时间)。在另一个优点中，本文提供的皮肤替代物可以预防微生物感染，从而抑制伤口愈合过程的任何其他并发症。
本文提供的皮肤替代物由形成复层表皮的分化的角质形成细胞构成。将所述复层表皮的基底层的细胞用编码生长因子和胰岛素的重组多核苷酸转导，从而促进成熟形式的生长因子和胰岛素从复层表皮的细胞中分泌。由皮肤替代物分泌的VEGF和胰岛素的水平分别低于据报道导致肿瘤诱导或全身葡萄糖降低所必需的水平。代替地，可从皮肤替代物分泌的水平的VEGF和胰岛素的组合可以高于单独的VEGF或胰岛素的程度有效地促进血管生成。所述组合还可以减少受试者皮肤中AGE的量。此外，生长因子和胰岛素的分泌水平可以在至少7天的过程中持续存在，从而提供伤口愈合组合的持续释放。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
除非上下文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当将范围的描述视为已经明确公开该范围内所有可能的子范围以及单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所陈述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文提及“约”某一值或参数包括(并且描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。术语“约”还可以涵盖变化，其可以高达±5％，但也可以是±4％、3％、2％、1％等。无论是否被术语“约”修改，权利要求都包括等于所述量。
如本文所用的，术语“表达”是指借此基于核酸分子(如基因)的编码序列产生多肽的过程。该过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。
如本文所用，“受试者”包括任何活的生物体，如人和其他哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人和非人动物，包括农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。
如本文所用，“可操作地连接(operably linked)”或“可操作地连接(operativelylinked)”是指当合适的分子(例如，转录激活蛋白)与调节序列结合时，组分(如DNA序列，例如异源核酸)和调节序列以允许基因表达的方式缔合。因此，这意味着所描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系。
如本文所用，当关于核苷酸序列(参考核苷酸序列)或氨基酸序列(参考氨基酸序列)使用时，“百分比(％)序列同一性”和“百分比同一性”分别定义为在比对序列且必要时引入空位以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考序列中的残基相同的核苷酸残基或氨基酸残基的百分比。用于确定序列同一性百分比的目的比对可以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如腺病毒载体。
如本文所用，术语“皮肤替代物”是指根据组合物的特征，暂时或永久地替代和/或增强皮肤的一种或多种功能(例如，伤口愈合)的材料。皮肤替代物的结构可以包括与哺乳动物表皮和/或哺乳动物真皮在结构和功能上相似的组分。
如本文所用，术语“复层上皮”是指包含多于一层上皮细胞的上皮。所述多层上皮细胞可以是按生化组分和通过使用显微术目视检查可区分的。例如，完全复层上皮可以模拟人表皮的组成，包括基底层(表皮基底层)、刺状层或棘层(棘细胞层)、颗粒层(表皮颗粒层)和角质层(角化层)。
II.产生生长因子和胰岛素的皮肤替代物
本文提供了一种由复层表皮构成的皮肤替代物，其中的细胞产生(如分泌)生长因子和胰岛素。在一些实施方案中，生长因子和胰岛素是与复层表皮的细胞异源的重组序列。在一些实施方案中，皮肤替代物由角质形成细胞构成。在一些实施方案中，皮肤替代物由分化的角质形成细胞构成。在一些实施方案中，皮肤替代物由永生化角质形成细胞和/或分化的永生化角质形成细胞构成。
在一些实施方案中，重组生长因子和重组胰岛素可从皮肤替代物的细胞分泌。在一些实施方案中，皮肤替代物由包含基底层、棘层、颗粒层和角化层的复层表皮构成，其中所述复层表皮的细胞表达重组生长因子和重组胰岛素。在一些实施方案中，表达重组生长因子和重组胰岛素的复层表皮的细胞包括基底层的细胞。在一些实施方案中，复层表皮厚度为约50μm至约300μm。在一些实施方案中，复层表皮的厚度为约100μm至约250μm。在一些实施方案中，复层表皮为约100μm至约200μm厚。在一些实施方案中，复层表皮为至少或约50μm、75μm、100μm、125μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、或300μm厚，或具有在任何前述值之间的厚度。
A.生长因子
在所提供的皮肤替代物的实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)产生和/或分泌重组生长因子。本文描述了示例性重组生长因子。在一些实施方案中，重组生长因子可从复层表皮分泌。在一些实施方案中，重组生长因子可从复层表皮的基底细胞分泌。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)也产生和/或分泌重组胰岛素，如以下章节B所述的任一种。
生长因子是本领域已知的。生长因子包括例如骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、和血管内皮生长因子(VEGF)、及其异形体或可变剪接变体。
在一些实施方案中，生长因子是表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、及其任何异形体或可变剪接变体。
在一些实施方案中，重组生长因子由多核苷酸编码，所述多核苷酸编码含有信号肽以促进生长因子分泌的生长因子序列。在一些实施方案中，信号肽存在于前体生长因子序列中并且被切割以形成可分泌的成熟生长因子。在一些实施方案中，信号肽是生长因子的内源性或天然信号肽。在一些实施方案中，信号肽是来自不同蛋白质的异源信号肽。在一些实施方案中，当生长因子从皮肤替代物的细胞表达时，信号肽被切割。在一些实施方案中，可分泌的生长因子序列缺乏信号肽。在一些实施方案中，生长因子可从细胞分泌。在一些实施方案中，重组生长因子可从复层表皮分泌。在一些实施方案中，复层表皮的细胞分泌重组生长因子。
在一些实施方案中，生长因子是VEGF-A或者是其异形体或可变剪接变体。VEGF-A是血管生成的关键介质，经由VEGF受体(VEGFR)的IV类酪氨酸激酶受体家族进行信号传导。尽管VEGF-A配体与VEGFR1和VEGFR2二者结合，但是它们主要经由VEGFR2发出信号，导致内皮细胞增殖、存活、迁移和血管渗透性。不同的VEGF-A异形体由可变剪接产生。在所提供的皮肤替代物中涵盖保留结合VEGF-R(例如，VEGFR2)的能力的VEGF-A的任何异形体或可变剪接变体。典型地，VEGF-A异形体长度不同，并且被称为VEGFxxx，其中xxx表示最终蛋白质序列中存在的氨基酸的数量。
示例性VEGF-A异形体包括但不限于血管内皮生长因子A(VEGF-A)多肽的VEGF 206(SEQ ID NO:11)、VEGF-A的异形体VEGF 189(SEQ ID NO:19)、VEGF-A的异形体VEGF 183(SEQ ID NO:20)、VEGF-A的异形体VEGF 148(SEQ ID NO:21)、VEGF-A的异形体VEGF 145(SEQ ID NO:22)、VEGF-A的异形体VEGF 165B(SEQ ID NO:23)、VEGF-A的异形体VEGF 121(SEQ ID NO:24)、VEGF-A的异形体VEGF 111(SEQ ID NO:25)、VEGF-A的异形体VEGF 165(SEQ ID NO:7)、VEGF-A的异形体L-VEGF165(SEQ ID NO:26)、VEGF-A的异形体L-VEGF 121(SEQ ID NO:27)、VEGF-A的异形体L-VEGF 189(SEQ ID NO:28)、VEGF-A的异形体L-VEGF206(SEQ ID NO:29)、VEGF-A的异形体15(SEQ ID NO:30)、VEGF-A的异形体16(SEQ ID NO:31)、VEGF-A的异形体17(SEQ ID NO:32)、或VEGF-A的异形体18(SEQ ID NO:33)。应当理解，还包括其成熟序列，所述成熟序列当从细胞表达和产生时在其切割后缺乏信号肽。
在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码重组人VEGF-A异形体的多核苷酸，所述重组人VEGF-A异形体与SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性，并且保留与VEGFR(例如，VEGFR-2)的结合。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的重组人VEGF-A异形体的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码含有信号肽的蛋白质，所述信号肽被蛋白水解切割和去除，使得分泌缺乏信号肽的蛋白质，如经由组成型分泌途径分泌。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组VEGF-A。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人VEGF-A异形体。
在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含VEGF-A异形体，所述VEGF-A异形体具有与SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与VEGFR(例如，VEGFR-2)的结合。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的重组VEGF-A异形体。在一些实施方案中，蛋白质缺乏信号肽，所述信号肽被蛋白水解切割和去除，使得所编码的蛋白质缺乏SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的信号肽(例如，缺乏氨基酸残基1-26)。在一些实施方案中，分泌重组人VEGF-A，如经由组成型分泌途径分泌。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组VEGF-A。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人VEGF-A异形体。
在一些实施方案中，重组人VEGF-A由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO:4中所示的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，重组人VEGF-A由包含SEQ ID NO:4中所示的序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，重组人VEGF-A由SEQ ID NO:4中所示的多核苷酸编码。在一些实施方案中，重组人VEGF-A包含与SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，重组人VEGF-A包含SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列。在一些实施方案中，重组人VEGF-A示于SEQ ID NO:7中或是其缺乏信号肽的序列。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组人VEGF-A。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人VEGF-A。
在一些实施方案中，重组VEGF由多核苷酸编码，所述多核苷酸编码含有信号肽以促进VEGF分泌的生长因子序列。在一些实施方案中，信号肽存在于前体生长因子序列中并且被切割以形成可分泌的成熟生长因子。在一些实施方案中，信号肽是生长因子的内源性或天然信号肽。在一些实施方案中，信号肽是来自不同蛋白质的异源信号肽。在一些实施方案中，信号肽是如MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQA(SEQ ID NO:45)所示的序列。在一些实施方案中，当VEGF从皮肤替代物的细胞表达时，信号肽被切割。在一些实施方案中，可分泌VEGF序列缺乏信号肽。在一些实施方案中，重组人VEGF-A包含与SEQ ID NO:44中所示的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，重组人VEGF-A包含SEQ ID NO:44中所示的序列。在一些实施方案中，重组人VEGF-A示于SEQ ID NO:44中。在一些实施方案中，VEGF可从细胞分泌。在一些实施方案中，重组VEGF可从复层表皮分泌。在一些实施方案中，复层表皮的细胞分泌重组VEGF。
在一些实施方案中，生长因子是PDGF/VEGF蛋白质家族的成员。在一些实施方案中，生长因子是血管内皮生长因子B(VEGF-B)多肽(例如，SEQ ID NO:12)、c-fos诱导的生长因子(FIGF)多肽(也称为VEGF-D)(例如，SEQ ID NO:13)、血小板源性生长因子A(PDGF-A)多肽(例如，SEQ ID NO:14)、血小板源性生长因子B(PDGF-B)多肽(例如，SEQ ID NO:15)、或胎盘生长因子(PLGF)多肽(例如，SEQ ID NO:16)、及其任何异形体或可变剪接变体。
在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含重组人生长因子，所述重组人生长因子具有与SEQ ID NO:12-16中任一项所示的氨基酸序列或其可变剪接形式或异形体具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含SEQ ID NO:12-16中任一项所示的重组人生长或其可变剪接形式或异形体。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含SEQ ID NO:12-16中任一项所示的重组人生长。在一些实施方案中，蛋白质缺乏信号肽，所述信号肽被蛋白水解切割和去除，使得所编码的蛋白质缺乏SEQ ID NO:12-16中任一项所示的信号肽(参见例如序列表)。在一些实施方案中，分泌重组人生长因子，如经由组成型分泌途径分泌。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组人生长因子。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人生长因子。
B.胰岛素
在所提供的皮肤替代物的实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)产生和/或分泌重组胰岛素。本文描述了示例性重组胰岛素。在一些实施方案中，重组胰岛素可从复层表皮分泌。在一些实施方案中，重组胰岛素可从复层表皮的基底细胞分泌。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)也产生和/或分泌重组生长因子，如以上章节A所述的任一种。
胰岛素是控制葡萄糖水平的激素。根据施用途径和剂量，胰岛素可以是全身可用的或局部可用的。在一个例子中，使用全身性胰岛素作为用于血糖控制的治疗剂，如在糖尿病患者中。在另一个例子中，局部胰岛素活性不影响全身葡萄糖水平。在一些实施方案中，本文提供的皮肤替代物的细胞以影响局部葡萄糖水平的水平产生胰岛素。在一些实施方案中，本文提供的皮肤替代物的细胞以不影响全身葡萄糖水平的水平产生胰岛素。
胰岛素作为前蛋白质原产生，所述前蛋白质原当在细胞中表达时被加工成双链形式。典型地，人胰岛素被翻译为110个氨基酸的前体多肽前胰岛素原，其含有24个氨基酸的信号肽将所述蛋白质引导至内质网(ER)，其中信号序列被切割，产生胰岛素原(SEQ ID NO:5)。胰岛素原被进一步加工以释放31个氨基酸的C肽或连接链肽。对于野生型胰岛素，胰岛素原在人胰岛素原上的两个位点Arg31Arg32(B链/C链肽连接)和Lys64Arg65(C链/A链肽连接)的羧基侧被内肽酶(例如，PC-2和PC-3内肽酶)同等切割，以产生成熟胰岛素的A链和B链、C肽和游离碱性氨基酸。例如，对于野生型人胰岛素，所得胰岛素含有SEQ ID NO:36中所示的21个氨基酸的A链(对应于SEQ ID NO:5中所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基66至86)和SEQ ID NO:40中所示的30个氨基酸的B链(对应于SEQ ID NO:5中所示的胰岛素原多肽的氨基酸残基1至30)，它们通过二硫键交联。典型地，适当交联的人胰岛素含有三个二硫桥：在A链的位置7与B链的位置7之间的一个、在A链的位置20与B链的位置19之间的第二个、以及在A链的位置6与位置11之间的第三个。
在一些实施方案中，重组胰岛素由编码胰岛素原多肽的多核苷酸编码，以产生呈单链或双链形式的胰岛素多肽。在一些实施方案中，胰岛素是含有A链和B链的单链多肽。在一些实施方案中，所编码的胰岛素能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，含有A链和B链的双链形式可从复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，重组胰岛素是作为天然或野生型胰岛素多肽的常规胰岛素。这些包括人胰岛素的重组形式，以及来自牛、猪和其他物种的胰岛素。在一些实施方案中，重组胰岛素是以R、R和市售的常规人胰岛素的重组胰岛素。在一些实施方案中，重组胰岛素是以Iletin市售的常规猪胰岛素的重组胰岛素。
在一些实施方案中，胰岛素是重组人胰岛素。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码胰岛素的胰岛素原前体形式的多核苷酸。在一些实施方案中，人胰岛素的前体是人胰岛素原。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的人胰岛素原氨基酸序列。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的人胰岛素原氨基酸序列。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，含有A链和B链的双链形式可从复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码SEQ ID NO:5中所示的人胰岛素原的多核苷酸。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含SEQ ID NO:5中所示的人胰岛素原。在一些实施方案中，胰岛素是单链多肽。在一些实施方案中，胰岛素原形式被加工成含有A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:5的A链和B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:40中所示的B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:40中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，重组胰岛素是人胰岛素的变体，如功能变体或物种变体或等位基因变体，或者是人胰岛素的具有活性的截短形式。在一些实施方案中，胰岛素的变体，包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他功能变体，如胰岛素类似物或其他经衍生或修饰的形式，包括与SEQ ID NO:5中所示的人胰岛素或与其含有A链和B链的经加工的胰岛素具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的多肽，只要所述胰岛素与人胰岛素受体结合，启动信号传导级联，导致葡萄糖摄取和储存增加和/或内源性葡萄糖产生减少。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，含有A链和B链的双链形式可从复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
例如，重组胰岛素可以包括人胰岛素的物种变体。这些包括但不限于源自牛和猪的胰岛素。牛胰岛素与人胰岛素的不同之处在于A链的氨基酸8和10以及B链的氨基酸30(SEQ ID NO:17)。猪胰岛素与人胰岛素的不同之处仅在于B链的氨基酸30，其中与牛序列一样，存在丙氨酸取代替代苏氨酸(SEQ ID NO:18)。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含多核苷酸，所述多核苷酸编码牛或猪胰岛素的胰岛素原前体形式，如SEQ ID NO:17的胰岛素原形式(例如，SEQ ID NO:17的氨基酸25-105)或SEQ ID NO:18的胰岛素原形式(例如，SEQ ID NO:18的氨基酸25-105)，或者与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18中所示的胰岛素或与其含有A链和B链的经加工的胰岛素具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列，只要所述胰岛素与人胰岛素受体结合，启动信号传导级联，导致葡萄糖摄取和储存增加和/或内源葡萄糖产生减少。在一些实施方案中，B链对应于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸25-54，并且A链对应于SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的氨基酸85-105。在一些实施方案中，所编码的胰岛素是含有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18中所示的A链和B链的单链多肽。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18中所示的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的A链和B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
胰岛素的变体还包括与人胰岛素相比含有一个或多个氨基酸修饰的胰岛素类似物。示例性胰岛素类似物(A链和B链)包括速效和长效类似物形式或超活性胰岛素(参见例如，Vajo等人2001Endocrine Reviews 22:706-717)。速效胰岛素类似物是胰岛素的典型地含有一个或多个氨基酸变化的经修饰的形式。与常规胰岛素相比，所述类似物被设计为减少胰岛素分子的自缔合，以提高吸收率和起效。例如，胰岛素类似物包括但不限于谷赖胰岛素(LysB3、GluB29)、HMR-1 153(LysB3、IleB28)、HMR-1423(GlyA21、HisB32)、门冬胰岛素(AspB28)、赖脯胰岛素(LysB28、ProB29)和AspB10。在上述每种情况下，类似物的命名是基于对胰岛素的A链或B链上特定位置(从所述链的N末端编号)处的氨基酸取代的描述，其中序列的剩余部分属于天然人胰岛素。
在一些实施方案中，重组胰岛素是胰岛素AspB10。胰岛素AspB10是一种人胰岛素类似物多肽，所述人胰岛素类似物多肽含有B链的单个氨基酸变化，导致天冬氨酸(D)取代野生型胰岛素中位置10处天然存在的组氨酸(H)(例如，H到D的取代)。取代的结果是一种超活性胰岛素，其吸收速度是常规胰岛素(例如，野生型人胰岛素)的两倍。在一些方面，与常规胰岛素(例如，野生型人胰岛素)相比，胰岛素AspB10与胰岛素受体的结合亲和力增加。胰岛素AspB10的A链的序列示于SEQ ID NO:36中并且B链的序列示于SEQ ID NO:41中。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码胰岛素AspB10的胰岛素原前体形式的多核苷酸，所述胰岛素AspB10含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，重组胰岛素是甘精胰岛素。通过将两个精氨酸添加到B链的C末端，甘精胰岛素的等电点移动，使其在酸性pH下更易溶。A链中存在另外的氨基酸变化(N21G)，以防止由酸敏感性天冬酰胺引起的脱酰胺和二聚化。甘精胰岛素的A链的序列示于SEQ ID NO:34中并且B链的序列示于SEQ ID NO:35中。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码甘精胰岛素的胰岛素原前体形式的多核苷酸，所述甘精胰岛素含有SEQ ID NO:34中所示的A链和SEQ ID NO:35中所示的B链。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:34中所示的A链和SEQ ID NO:35中所示的B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:34中所示的A链和SEQ ID NO:35中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，重组胰岛素是赖脯胰岛素。人赖脯胰岛素是一种胰岛素多肽配制品，其含有在B链的位置28和29处的氨基酸变化，使得野生型胰岛素中此位置处的Pro-Lys反转为Lys-Pro。这两个氨基酸的反转的结果是具有降低的自缔合倾向的多肽，这允许更快速地起效。具体地，B链中的序列反转导致两个疏水相互作用的消除和稳定二聚体的两个β折叠片层氢键的弱化(DeFelippis等人,Insulin Chemistry andPharmacokinetics.Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus 2002第481-500页,McGraw-Hill Professional)。由于所述氨基酸修饰，与常规胰岛素相比，赖脯胰岛素作用更快。赖脯胰岛素的A链的序列示于SEQ ID NO:36中并且B链的序列示于SEQ ID NO:37中。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码赖脯胰岛素的胰岛素原前体形式的多核苷酸，所述赖脯胰岛素含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:37中所示的B链。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:37中所示的B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:37中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，重组胰岛素是门冬胰岛素。人门冬胰岛素是一种胰岛素多肽配制品，所述胰岛素多肽配制品含有人胰岛素的B链的位置28处从脯氨酸到天冬氨酸的氨基酸取代。门冬胰岛素中的修饰赋予带负电的侧链羧基，以产生电荷排斥并且使单体-单体相互作用不稳定。此外，脯氨酸的去除消除了单体之间的关键疏水性相互作用(DeFelippis等人,Insulin Chemistry and Pharmacokinetics.Ellenberg and Rifkin's DiabetesMellitus 2002第481-500页,McGraw-Hill Professional)。门冬胰岛素的A链的序列示于SEQ ID NO:36中并且B链的序列示于SEQ ID NO:38中。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码门冬胰岛素的胰岛素原前体形式的多核苷酸，所述门冬胰岛素含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:38中所示的B链。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:38中所示的B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:38中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，重组胰岛素是谷赖胰岛素。人谷赖胰岛素是一种胰岛素多肽配制品，与人胰岛素的B链的序列相比，所述胰岛素多肽配制品含有在B链中位置B3处从天冬酰胺到赖氨酸的氨基酸取代以及在氨基酸B29处从赖氨酸到谷氨酸的氨基酸取代。与人胰岛素相比，这些修饰使得多肽分子不易自缔合。谷赖胰岛素的A链的序列示于SEQ ID NO:36中并且B链的序列示于SEQ ID NO:39中。在一些实施方案中，构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)包含编码谷赖胰岛素的胰岛素原前体形式的多核苷酸，所述谷赖胰岛素含有SEQID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:39中所示的B链。在一些实施方案中，所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ IDNO:39中所示的B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQID NO:39中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些实施方案中，胰岛素的胰岛素原形式被修饰以促进胰岛素原切割成含有A链和B链的双链形式。在一些情况下，人角质形成细胞(例如，HaCaT细胞)缺乏有效切割胰岛素原以产生成熟胰岛素所必需的酶。例如，内肽酶(如PC-2和PC-3)不存在或不以高至足以切割胰岛素的水平存在。相反，角质形成细胞表达弗林蛋白酶，这是一种属于枯草杆菌蛋白酶样蛋白质原转化酶的酶家族的钙依赖性切割酶。在一些实施方案中，人胰岛素原是经修饰的人胰岛素原。在一些实施方案中，经修饰的人胰岛素原包含由在角质形成细胞(例如，HaCaT细胞)中表达的酶(例如，蛋白酶)识别的序列，这使得所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，蛋白酶是弗林蛋白酶并且经修饰的人胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列。在一些实施方案中，经修饰的人胰岛素原包含两个引入的弗林蛋白酶识别序列替代含有Arg31-Arg32切割位点(B-C连接)和Lys64-Arg65切割位点(C-A连接)的序列。在一些实施方案中，至少一个弗林蛋白酶识别序列含有共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ IDNO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点是RQKR(SEQ IDNO:42)。
在一些实施方案中，胰岛素原是含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的AspB10胰岛素，其中胰岛素原进一步含有两个弗林蛋白酶识别序列。在一些实施方案中，每个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ IDNO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，一个弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，一个弗林蛋白酶切割位点是RQKR(SEQ ID NO:42)。在一些实施方案中，经修饰的人胰岛素原包含与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列，其中胰岛素原含有弗林蛋白酶识别位点以及B链的位置10处的Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中，经修饰的人胰岛素原包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，经修饰的人胰岛素原示于SEQ ID NO:6中。在一些实施方案中，所编码的胰岛素被加工成含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些任何所提供的实施方案中，编码胰岛素原的编码多核苷酸是进一步含有信号肽以促进生长因子分泌的前胰岛素原。在一些实施方案中，信号肽从所编码的前胰岛素原被切割以形成可分泌的成熟胰岛素原。在一些实施方案中，当胰岛素从皮肤替代物的细胞表达时，信号肽被切割。在一些实施方案中，成熟胰岛素原形式被进一步加工成重组胰岛素，所述重组胰岛素为含有如所述的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，信号肽是胰岛素的内源或天然信号肽。在一些实施方案中，信号肽是来自不同蛋白质的异源信号肽。在一些实施方案中，序列编码信号肽MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA(SEQ ID NO:43)。在一些实施方案中，重组胰岛素可从细胞分泌。在一些实施方案中，可分泌的重组胰岛素序列缺乏信号肽。
在一些实施方案中，重组人胰岛素由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ IDNO:2中所示的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列，其中所编码的胰岛素原含有弗林蛋白酶识别位点以及B链的位置10处的天冬氨酸(Asp，D)的氨基酸取代。在一些实施方案中，重组人胰岛素由包含SEQ IDNO:2中所示的序列的多核苷酸编码。在一些实施方案中，重组人胰岛素由SEQ ID NO:2中所示的多核苷酸编码。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人胰岛素。在一些实施方案中，胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的双链重组形式可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
C.皮肤替代物的示例性特征
在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组人生长因子(例如，章节II.A中所述的任一种)和重组人胰岛素(例如，章节II.B中所述的任一种)，如含有A链和B链的双链胰岛素形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人生长因子(例如，章节II.A中所述的任一种)和重组人胰岛素(例如，章节II.B中所述的任一种)，如含有A链和B链的双链胰岛素形式。
在一些实施方案中，重组人生长因子是VEGF并且由SEQ ID NO:4中所示的多核苷酸编码，并且重组人胰岛素由SEQ ID NO:2中所示的多核苷酸编码。在一些实施方案中，重组人生长因子是VEGF并且示于SEQ ID NO:7中，并且重组人胰岛素示于SEQ ID NO:6中，或者是其含有A链和B链(如通过二硫键连接)的双链形式。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的细胞产生(例如，分泌)重组VEGF和重组胰岛素。在一些实施方案中，皮肤替代物的复层表皮的基底细胞产生(例如，分泌)重组人VEGF和重组人胰岛素。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7中所示的缺少其氨基酸残基1-26的VEGF以及作为胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的双链重组形式的重组人胰岛素可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。在一些实施方案中，SEQ ID NO:7中所示的缺少其氨基酸残基1-26的VEGF和作为胰岛素的含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:40中所示的B链的双链重组形式的重组人胰岛素可从构成复层表皮的细胞(例如，基底细胞)分泌。
在一些方面，本文提供了一种皮肤替代物，所示皮肤替代物以如下水平产生(例如，分泌)重组生长因子和重组胰岛素，所述水平导致血管生成重组的一种或多种标记物相对于单独的生长因子或胰岛素显著更大的改善，如在管形成测定中评价的。体外管形成测定可以提供对血管生成的深入了解，即从预先存在的血管生成新血管(DiCicco-Skinner,JVis Exp.2014；(91):51312)。血管生成是各种过程(包括器官生长、胚胎发育和伤口愈合)的重要组分。可以在管形成测定中评价的血管生成标记物或血管生成重组标记物包括但不限于节点、网和主节段的存在或相对增加。节点，也称为联接头，可以被定义为至少三条弦带的连结位点，即连接。网可以被定义为由两个或多个节点包围的闭合回路。主节段可以被定义为将两个节点连结在一起的弦带。
在一些方面，本文提供了一种包含复层表皮的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞连续分泌可定量水平的重组生长因子和重组胰岛素。在一些实施方案中，复层表皮的细胞连续分泌重组生长因子和重组胰岛素持续长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。在一些实施方案中，复层表皮的细胞连续分泌重组生长因子和重组胰岛素持续长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
在一些实施方案中，复层表皮的细胞分泌可定量水平的重组生长因子和胰岛素和/或C肽。从胰岛素原切割的C肽是胰岛素产生的副产物，也由细胞分泌。C肽以相对于内源胰岛素的等摩尔量产生。它被广泛用作胰腺β细胞功能的量度，并且用于指导糖尿病的诊断和管理(Leighton等人,Diabetes Ther.2017；8(3):475-487)。
检测和定量生长因子和胰岛素和/或C肽的方法是本领域已知的。在一个例子中，生长因子和胰岛素和/或C肽的体外检测可以包括使用酶联免疫吸附测定(ELISA)。用于检测C肽的ELISA试剂盒包括例如来自Epitope Diagnostics,Inc.的KT-881C肽ELISA试剂盒和来自Abcam的ab178641C肽ELISA试剂盒。可替代地，可以通过PCR(例如，RT-qPCR)定量基因表达。可定量水平可以被定义为大于或等于特定测定的定量限的任何水平。
在一些方面，本文提供了一种皮肤替代物，所述皮肤替代物以如下水平产生(例如，分泌)重组生长因子和重组胰岛素，所述水平减少受试者皮肤中的晚期糖基化终末产物(AGE)。在一些实施方案中，受试者是人。AGE是在暴露于糖后被糖基化的蛋白质或脂质。AGE的积累(如在皮肤中)可能干扰细胞的结构和/或功能(Goldin等人,Circulation.2006；114:597-605)。检测AGE的方法是本领域已知的。在一些例子中，AGE复合物可以使用以下方式检测：ELISA(参见例如，abx054078、晚期糖基化终末产物(AGE)ELISA试剂盒、Abexxa和STA-817、OxiSelectTM晚期糖基化终末产物(AGE)竞争性ELISA试剂盒，Cell Biolabs,Inc.)、光谱荧光测定分析(参见例如，Villa等人,Metabolism2017；71:64-69)、色谱、比色、光谱、质谱和血清学方法(Perrone等人,Oxidative Medicine and Cellular Longevity2020；第2020卷,文章ID 3818196,第18页)。
III.制备皮肤替代物的方法
本文提供了产生由复层表皮构成的皮肤替代物的方法，其中所述复层表皮的细胞产生生长因子和胰岛素。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层，以及2)将多核苷酸引入所述复层表皮以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物产生和分泌生长因子和胰岛素。在一些实施方案中，所述方法的步骤1)包括使永生化角质形成细胞分化，并且步骤2)中的多核苷酸的引入包括用病毒载体转导。
在一些实施方案中，用于产生皮肤替代物的方法可以包括：(1)系统，其中已经将培养的角质形成细胞重建成3D系统以表示人表皮；(2)系统，其中在基底上以3D方式培养角质形成细胞(原代或永生化细胞)；(3)系统，其中已经将培养的皮肤细胞重建成3D系统以表示人皮肤；和/或(4)系统，其中在基质(例如，真皮基质)上培养角质形成细胞(原代或永生化细胞)。
在一些实施方案中，使细胞分化，使得复层表皮的细胞表达紧密连接蛋白，如闭合蛋白或密封蛋白。表皮的蛋白质有助于其作为渗透性屏障的作用。例如，紧密连接和桥粒有助于表皮的屏障样功能。紧密连接是一种多蛋白质网络，其在哺乳动物表皮的细胞之间形成细胞间连接。紧密连接的链包括闭合蛋白和密封蛋白，这是一个多基因蛋白质家族。闭合蛋白是一种位于紧密连接处的整合质膜蛋白。密封蛋白(例如，密封蛋白-1、密封蛋白-2和密封蛋白-4)是整合膜蛋白。密封蛋白形成紧密连接链的骨架，并且闭合蛋白共聚化为这些链(Furuse等人,J.Cell Biol.1999；147(4):891-903)。桥粒是位于细胞间连接处并且负责维持组织的机械完整性的粘附蛋白复合物。桥粒钙粘蛋白已经被证明可以作为某些类型腺病毒的附着受体起作用。例如，发现腺病毒血清型Ad3、Ad7、Ad11和Ad14(而不是Ad2或Ad5)与桥粒粘蛋白2相互作用(Wang等人,Nat Med.2011；17(1):96-104.)。
培养条件影响决定上皮渗透性的蛋白质的定位和量。例如，使HaCaT细胞生长至汇合培养物已经被证明可促进桥粒高粘附性，从而增强细胞片层的完整性并降低渗透性(Kimura等人,J Invest Dermatol 2007；127,775-781)。关于培养物中的钙水平，钙水平的增加(例如，从0.1mM增加到2mM)已经被证明可诱导人角质形成细胞中的桥粒形成和分层(Watt等人,J Cell Biol.1984；99(6):2211-2215)。低或耗尽的钙水平(例如，0.03mM Ca2+)与紧密连接解离和渗透性增加相关。相比之下，将正常人角质形成细胞暴露于高钙水平已经被证明可诱导分层并改善屏障功能(即降低渗透性)。响应于升高的钙水平(1.8mM Ca2+)，在细胞边界处和在下层表皮层中可检测到密封蛋白-1、密封蛋白-4和闭合蛋白的定位增加，这可能有助于增强跨上皮电阻(Yuki等人,Exp Dermatol.2007；16(4):324-30)。
A.永生化角质形成细胞的分化和培养
永生化角质形成细胞细胞系的例子包括但不限于HaCaT(Boukamp等人,J CellBiol.1988；106:761-771)、NM1(Baden等人,Vitro Cell Dev Biol.1987；23:205-213)和NIKS(Allen-Hoffmann等人,J Invest Dermatol.2000；114:444-455)。如本文所述，提及“角质形成细胞”时包括提及永生化角质形成细胞。角质形成细胞可以分化为由四个形态和生物化学上不同的层(基底层、棘层、颗粒层和角化层)构成的复层表皮。角质形成细胞生长和分化可能受多种因素(包括培养物中的钙水平、细胞密度和温度)的影响。例如，高水平或浓度的钙可以诱导HaCaT细胞的分化，高细胞密度也可以如此。原代角质形成细胞与永生化角质形成细胞(例如，HaCaT细胞)之间的一个主要区别是，分化的永生化细胞保留其增殖能力，但是原代角质形成细胞停止分裂。因此，分化的永生化角质形成细胞(像HaCaT细胞)可以在特定条件下无限繁殖(Wilson,Methods Mol Biol.2014；1195:33-41)。
1.复层表皮的结构特征和生物化学组分
角质形成细胞形态可以作为未分化的细胞与分化的细胞之间的区分因素。可以使用显微术鉴定和确认复层表皮。复层表皮与仅包含一层细胞的单层上皮在视觉上不同。复层表皮与假复层上皮也在视觉上不同，后者包括延伸到上皮的基底外侧表面的单个伸长层。目视评价包含复层表皮的皮肤替代物的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以使用电子显微术使复层上皮可视化。在一些例子中，可以使用扫描电子显微术使复层上皮可视化。
某些蛋白质(例如，转谷氨酰胺酶、丝聚蛋白和层粘连蛋白)的检测也可以帮助区分分化的表皮层。检测可充当分化和/或分层标记物的某些蛋白质的方法是本领域技术人员已知的，并且可以包括例如免疫荧光显微术(参见例如，Schoop等人,J.InvestDerm1999；112(3):343-353)、RT-PCR(参见例如，Kikkawa等人,Biol Pharm Bull.2010；33(2):307-10)、和RNAseq。角质形成细胞是表皮的主要细胞组分，并且占成人皮肤细胞的约80％。所有上皮细胞都表达I型和II型角蛋白，其分子量范围为40kDa至70kDa。不同的上皮组织表达特定的角蛋白对。由分化的角质形成细胞产生的蛋白质的定位和相对量可用于区分复层表皮的不同层。在一些例子中，可以检测转谷氨酰胺酶(例如，角质形成细胞转谷氨酰胺酶同工酶，TGK)以区分复层表皮的各层。在一些例子中，可以检测丝聚蛋白(一种与角蛋白纤维结合的丝结合蛋白)以区分复层表皮的各层。在一些例子中，可以检测层粘连蛋白(细胞外基质糖蛋白)以区分复层表皮的各层。在一些例子中，可以检测角蛋白以区分复层表皮的各层。在一些例子中，可以检测内披蛋白(一种细胞包膜蛋白)以区分复层表皮的各层。在一些例子中，可以检测在屏障功能和形成中起作用的钙粘蛋白粘附分子(例如，N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白和P-钙粘蛋白)以区分复层表皮的各层(Allen-Hoffmann,US2014/0127170)。
基底层细胞的形状为圆柱形并且产生角蛋白K5和K14。在一些例子中，基底层的细胞位于称为基底膜的结构上，所述结构将真皮或真皮等效物与表皮分开。层粘连蛋白可以在基底膜的细胞外基质中发现。在不存在真皮-表皮连接的结构(如仅具有表皮组分的皮肤替代物)中，层粘连蛋白可以在基底层的内陷中发现。在一些例子中，检测层粘连蛋白(例如，层粘连蛋白5)的表达以确定是否可以形成基底膜，如在将皮肤替代物施加至受试者时。
第一上基底角质形成细胞层是棘细胞层(棘层)，因相邻细胞之间许多桥粒接触的刺状外观而得名。这一层中的角质形成细胞可能不再产生K5和K14，但是代替地可以合成分化特异性角蛋白K1和K10。角质形成细胞可以开始在上层棘细胞层中产生内披蛋白和表皮特异性转谷氨酰胺酶。在形态学上，棘细胞比基底细胞更大且更扁平(Holbrook,1994)。
随着角质形成细胞进一步分化，它们形成表皮颗粒层(颗粒层)。已在表皮的颗粒层和更深层中鉴定出紧密连接蛋白(Brandner等人,Open Dermatol.J.2010；4:14-20)。这层细胞的特征在于含有丝聚蛋白原(丝聚蛋白的蛋白质前体)的独特电子致密透明角质颗粒(Dale等人,1994)。颗粒细胞还含有充满脂质的颗粒，所述颗粒在表皮颗粒层与角化层之间的过渡区中与质膜融合，并将其内容物释放到细胞外空间中，从而赋予表皮表面以疏水性。随着分化角质形成细胞从颗粒层转变为角质化的层(即角质层或角化层)，丝聚蛋白原被切割以产生丝聚蛋白，其参与称为巨纤维的角蛋白束经由二硫键的对齐和聚集。巨纤维是角质化包膜的基本结构单元。在正常皮肤切片中，丝聚蛋白位于颗粒层中，并且可以在角质化片层中发现(Sandilands等人,J Cell Sci.2009；122(9):1285-1294)。针对丝聚蛋白的抗体检测丝聚蛋白原以及其切割产物。
最上层表皮层是角化层。可以使用内披蛋白作为角化层的分化标记物。该层细胞已经完成分化过程，且已经失去了它们的细胞核和所有代谢功能。角质化包膜是在质膜下方形成的高度稳定的不溶性蛋白质结构，其抵抗洗涤剂和还原剂，并且赋予最上层表皮层的终末分化细胞以强度和刚度。角质层的细胞(也称为角质层细胞)通过经修饰的桥粒连接在一起，并且最终以片层形式从皮肤表面脱落。对于角化层或角质化的层，引入气液界面是角质形成细胞分化所必需的(Pruniéras等人,J Invest Dermatol.1983年7月；81(1增刊):28s-33s)。
2.角质形成细胞细胞培养
在无血清条件下的低钙水平(例如，约0.3mM)促进基础未分化表型的角质形成细胞的增殖，并且补充牛垂体提取物(BPE)也可以促进增殖和细胞存活。从低钙条件到高钙条件的转换(“钙转换”)可以触发分化标记物，但是其他因素可能有助于最佳分化为表皮层。在一个例子中，发现在含血清培养基中培养细胞并降低温度(例如，从37℃到31℃)与钙转换组合可以大规模诱导分化标记物(Borowiec等人,Plos One 2013:8(10):e77507)。分化的角质形成细胞可以通过暴露于低钙培养基恢复到其基础状态。然而，高细胞密度(例如，超过75％-80％细胞汇合)和超过37℃的温度可以触发HaCaT细胞的分化，即使在低钙条件下(Wilson,Methods Mol Biol.2014；1195:33-41)。
在一些实施方案中，本文提供了一种将角质形成细胞在低钙培养基中培养以培养(例如，获得)基底层的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种将非原代角质形成细胞在低钙培养基中培养以培养(例如，获得)基底层的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种将永生化角质形成细胞在低钙培养基中培养以培养(例如，获得)基底层的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种将HaCaT角质形成细胞在低钙培养基中培养以培养(例如，获得)基底层的方法。在一些实施方案中，将角质形成细胞在低钙培养基中培养约两周至约六周以形成基底层。在一些实施方案中，在低钙培养基中培养约三周至约四周以形成基底层。在一些实施方案中，将角质形成细胞在低钙培养基中培养约两周、约三周、约四周、约五周或约六周以形成基底层。在一些实施方案中，将角质形成细胞在低钙培养基中培养约四周以形成基底层。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括如下细胞培养基，所述细胞培养基支持角质形成细胞和/或真皮成纤维细胞的生长，并且可用于形成复层表皮的基底层(也称为基底角质形成细胞)。在一些实施方案中，无血清培养基可用于培养复层表皮的基底层。在一些实施方案中，无钙培养基可用于培养复层表皮的基底层。在一些实施方案中，无血清且无钙的培养基可用作初始培养基来培养复层表皮的基底层。在一些实施方案中，可以将用于培养基底层的培养基调整至最终低钙水平(例如，约0.01mM Ca2+、约0.02mM Ca2+、约0.03mMCa2+、约0.04mM Ca2+、约0.05mM Ca2+、约0.06mM Ca2+、约0.07mM Ca2+、约0.08mM Ca2+、约0.09mM Ca2+、或约0.1mM Ca2+)，以形成复层表皮的基底层。
在一些例子中，用于培养基底层的培养基可以进一步包含内皮生长因子(EGF)和/或牛垂体提取物(BPE)。在一些实施方案中，低钙培养基进一步包含约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、或约6ng/ml EGF和/或约10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、或70μg/ml BPE。在一些实施方案中，用于培养基底层的低钙培养基进一步包含约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、或约0.3ng/ml EGF和/或约20μg/ml、30μg/ml、或40μg/ml BPE。在一些实施方案中，用于培养基底层的低钙培养基进一步包含约0.2ng/ml EGF和约30μg/ml BPE。在一些实施方案中，用于培养基底层的低钙培养基是无血清的。在一些实施方案中，用于培养基底层的低钙培养基是无血清角质形成细胞培养基。
在一些实施方案中，本文提供了一种将先前培养以形成如本文所述的基底层的基底角质形成细胞暴露于“钙转换”的方法，其中培养基中的钙水平从低水平变为高水平，以促进复层上皮的形成。在一些方面，本文提供了一种将基底角质形成细胞在低钙培养基中培养，然后将所述基底角质形成细胞在高钙培养基中培养，以形成包含复层表皮的皮肤替代物的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种将基底非原代角质形成细胞在低钙培养基中培养，然后将所述基底非原代角质形成细胞在高钙培养基中培养，以形成包含复层表皮的皮肤替代物的方法。在一些方面，本文提供了一种将基底永生化角质形成细胞在低钙培养基中培养，然后将所述基底永生化角质形成细胞在高钙培养基中培养，以形成包含复层表皮的皮肤替代物的方法。在一些方面，本文提供了一种将基底HaCaT角质形成细胞在低钙培养基中培养，然后将所述基底HaCaT角质形成细胞在高钙培养基中培养，以形成包含复层表皮的皮肤替代物的方法。
在一些方面，本文提供了一种方法，其中可以将基底角质形成细胞在基底上在低钙培养基中培养，之后进行钙转换(从低钙培养基转换到高钙培养基)。接触基底角质形成细胞的表面(即基底)可以包括侧壁，和/或可以呈小室或杯的形式。在一些实施方案中，将基底装配到孔的孔口中。在一些实施方案中，基底可以包括如下表面，所述表面的直径和孔隙具有适当尺寸，例如支持角质形成细胞生长和分化成复层表皮的尺寸。在一些实施方案中，基底可以由多个孔径和直径尺寸构成。在一些实施方案中，基底是网状物或transwell小室，例如具有至少或约50mm、至少或约75mm、至少或约100mm、或至少或约125mm的直径以及至少或约1.0μm、至少或约2.0μm、至少或约3.0μm、至少或约4.0μm、或至少或约5.0μm的孔径的transwell小室。在一些实施方案中，基底是transwell小室或环(例如，克隆环)。在一些实施方案中，基底可以包括网状物，例如金属丝网，并且所接种的基底角质形成细胞可以位于网状物上，例如在基底的上方和/或下方。在一些实施方案中，基底可以由塑料或金属制成。在一些实施方案中，可以将基底角质形成细胞接种在液体可渗透的基底上，例如在金属丝网或有孔塑料的上方和/或下方。
在一些实施方案中，基底被包被，例如用凝胶包被。在一些实施方案中，凝胶可以是胶原(即凝胶化的胶原)和/或水凝胶。在一些实施方案中，小室的表面可以用中和的经人用认证的牛胶原溶液覆盖。在一些实施方案中，可以使用溶液(例如，胶原溶液)来包被基底，然后可以将溶液包被的基底孵育足够长的时间，直到溶液凝胶化，例如形成凝胶化的胶原。在一些实施方案中，在用基底角质形成细胞接种之前，洗涤基底或包被的基底，例如用PBS洗涤。
在一些实施方案中，可以将基底角质形成细胞接种在基底上(例如，包被的基底上)的补充至最终低钙水平的无血清和/或无钙培养基中。在一些实施方案中，可以将基底角质形成细胞接种在基底上(例如，包被的基底上)的补充至最终低钙水平且没有任何另外的补充的无血清和/或无钙培养基中。在一些实施方案中，可以将基底角质形成细胞接种在基底上(例如，包被的基底上)的补充至最终低钙水平且具有另外的补充的无血清和/或无钙培养基中。在一些实施方案中，可以将基底角质形成细胞接种在基底上(例如，包被的基底上)的补充至最终低钙水平且补充有EGF和/或BPE的无血清和/或无钙培养基中。
在一些实施方案中，将低钙培养基补充至最终低Ca2+水平，所述水平是为或约0.01mM Ca2+、为或约0.02mM Ca2+、为或约0.03mM Ca2+、为或约0.04mM Ca2+、为或约0.05mMCa2+、或为或约0.06mM Ca2+。在一些实施方案中，低钙培养基进一步包含约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、约3ng/ml、约4ng/ml、约5ng/ml、或约6ng/ml EGF和/或约10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、或70μg/ml BPE。在一些实施方案中，低钙培养基进一步包含约0.1ng/ml、约0.2ng/ml、或约0.3ng/ml EGF和/或约20μg/ml、30μg/ml、或40μg/mlBPE。在一些实施方案中，低钙培养基进一步包含约0.2ng/ml EGF和约30μg/ml BPE。在一些实施方案中，用于在基底上培养角质形成细胞的低钙培养基是无血清的。在一些实施方案中，用于在基底上培养角质形成细胞的低钙培养基是无血清角质形成细胞培养基。
在一些实施方案中，可以将细胞以约1x 106个细胞/ml、10x 106个细胞/ml、20x106个细胞/ml、30x 106个细胞/ml、40x 106个细胞/ml、或50x 106个细胞/ml的密度接种以接触基底。在一些实施方案中，将细胞接种在基底下方、基底上方或基底下方和上方。在一些实施方案中，可以将细胞以约1x 106个细胞/ml、10x 106个细胞/ml、20x 106个细胞/ml、30x 106个细胞/ml、40x 106个细胞/ml、或50x 106个细胞/ml的密度接种以接触包被的基底。在一些实施方案中，将细胞接种在包被的基底下方，包被的基底上方、或包被的基底的下方和上方。
在一些实施方案中，在接种到基底上(例如，接种在包被的基底的上方和下方)之后，将基底角质形成细胞在低钙培养基中孵育约两天至约六天、约三天至约五天、或约三天至约四天。在一些实施方案中，在接种到基底上(例如，接种在包被的基底的上方和下方)之后，将基底角质形成细胞在低钙培养基中孵育约两天、约三天、约四天、约五天、约六天或约七天。在一些实施方案中，每天更换低钙培养基。在一些实施方案中，每隔一天更换低钙培养基。在一些实施方案中，低钙培养基是无血清的。在一些实施方案中，低钙培养基是无血清角质形成细胞培养基。
在一些实施方案中，本文提供了一种培养角质形成细胞的方法，其中在培养物中引入气液界面和增加钙水平刺激角质形成细胞分化为复层表皮。在一些实施方案中，可以在具有底物的低钙培养基中培养的第三天、第四天、第五天、第六天或第七天引入气液界面和增加的钙水平。在一些实施方案中，在引入气液界面后，弃去低钙角质形成细胞培养基并且更换为调节至相对高钙水平的培养基。在一些实施方案中，高钙水平是为或约1-5mM Ca2 +、1-4mM Ca2+、1-3mM Ca2+、2-4mM Ca2+、或2-3mM Ca2+。在一些实施方案中，高钙水平是为或约1.5mM Ca2+、1.6mM Ca2+、1.7mM Ca2+、1.8mM Ca2+、1.9mM Ca2+、2.0mM Ca2+、2.1mM Ca2+、2.2mM Ca2+、2.3mM Ca2+、2.4mM Ca2+、2.5mM Ca2+、2.6mM Ca2+、2.7mM Ca2+、2.8mM Ca2+、2.9mMCa2+、或3mM Ca2+。
在一些实施方案中，高钙培养基补充有EGF、牛垂体提取物(BPE)和/或氢化可的松。在一些实施方案中，高钙培养基补充有为或约0.09ng/ml EGF、为或约0.1ng/ml EGF、为或约0.2ng/ml EGF、为或约0.3ng/ml EGF、为或约0.4ng/ml EGF、或为或约0.5ng/ml EGF。在一些实施方案中，高钙培养基补充有为或约10μg/ml BPE、为或约20μg/ml BPE、为或约30μg/ml BPE、为或约40μg/ml BPE、或为或约50μg/ml BPE。在一些实施方案中，高钙培养基补充有为或约0.1μg/ml、为或约0.2μg/ml、为或约0.3μg/ml、为或约0.4μg/ml、为或约0.5μg/ml、为或约0.6μg/ml、为或约0.7μg/ml、或为或约0.8μg/ml氢化可的松。在一些实施方案中，高钙培养基补充有约0.2ng/ml EGF、30μg/ml BPE、和0.4μg/ml氢化可的松。在一些实施方案中，高钙培养基是无血清的。在一些实施方案中，高钙培养基是无血清角质形成细胞培养基。
在一些实施方案中，可以将角质形成细胞在基底上(例如，在胶原包被的基底上方和下方)在高钙培养基中培养约两周至四周、约两周至三周、或约三周，直到获得复层表皮。在一些实施方案中，可以将角质形成细胞在高钙培养基中(例如，在胶原包被的基底的上方和下方)培养14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、或28天，直到获得复层表皮。在一些实施方案中，可以每天更换高钙培养基直到获得复层表皮。在一些实施方案中，可以每隔一天更换高钙培养基直到获得复层表皮。
在引入气液界面后，位于基底(例如，胶原包被的基底)上方和/或下方的分化的角质形成细胞可被配置为使得形成皮肤替代物的细胞的最上层表面暴露于气态环境，但不暴露于组织培养基，和/或使得皮肤替代物的基底层的细胞暴露于组织培养基，但不暴露于气态环境。气液界面的引入可以有利于皮肤替代物的双相培养，即气态和液态环境。例如，培养基中的皮肤替代物可以被配置为使得在使用中角质层暴露于气态环境，但不暴露于组织培养基，和/或基底层和/或真皮或真皮等效物暴露于组织培养基，但不暴露于气态环境。这可以通过控制液体界面的高度和/或定位基底(例如，胶原包被的基底)的位置来实现。在一些实施例中，可以定位基底(例如，transwell或小室)使得transwell的底部接触液体，但液体不接触表皮/表皮等效物的顶部。
角质形成细胞培养基的温度可以为约33.0℃-37.5℃，例如约34℃-37.5℃、约35℃-37.5℃、约36℃-37.5℃或约37℃。组织培养基的pH也可以为约6.1-7.9，例如约6.2-7.7、约6.3-7.7、约6.4-7.7、约6.5-7.7、约6.6-7.7、约6.7-7.6、约6.8-7.6、约6.9-7.6、约7-7.6、约7.1-7.6、约7.1-7.5或约7.2-7.4。组织培养基可以包含约2％-10％、约2％-8％、约3％-7％、约4％-6％、或约5％ CO2。在一些实施方案中，皮肤替代物的最上层表面不暴露于组织培养基，并且皮肤替代物的最下层或基底表面不暴露于气态环境。
皮肤样品支架可以位于层流罩中，以保持无菌性。可以使用大气监测器监测气态环境中的状况。在一些实施方案中，气态环境可以具有低于或为约37℃的温度，例如约10℃-36℃、约12℃-32℃、约14℃-29℃、约15℃-25℃、约18℃-25℃、约19℃-24℃、或约20℃-22℃。气态环境也可以具有为约或低于约90％的相对湿度，例如约0-89％、约0-85％、约10％-80％、约15％-75％、约20％-74％、约23％-70％、约25％-65％、约30％-50％、约35％-50％、约40％-50％、或约40％-45％。
在一些实施方案中，用于皮肤替代物的培养的气态环境可以包含小于：5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.045％或0.04％的CO2。在一些实施方案中，气态环境可以包含0.02％-0.05％或0.035-0.045％ CO2。在一些实施方案中，气态环境可以包含18％-25％、18％-24％、18％-23％、19％-23％、19％-22％、20％-22％或约21％ O2。在一些实施方案中，气态环境可以含有约78％ N2和/或约1％氩。在一些实施方案中，气态环境可以包括大气空气、压缩空气和/或医用空气。在一些方面，医用空气可以是指无菌压缩空气，并且医用空气可以具有类似于大气空气的气体组成(例如，大约78％ N2和21％ O2)。在一些方面，气态环境可以模拟健康的内部空间或生理条件。
B.将包含复层表皮的皮肤替代物工程化以递送生长因子和胰岛素
本文提供了将核酸分子例如多核苷酸引入包含复层表皮的细胞的皮肤替代物的方法。在一些实施方案中，本文提供了引入任何所需核酸分子，含有任何核酸分子的媒介物、构建体或复合物的方法。在一些实施方案中，复层表皮的细胞可以将引入的核酸翻译成蛋白质以递送(例如，分泌)到受试者。在一些实施方案中，已经将复层表皮的角质形成细胞用具有所需功能或编码具有所需功能的选定多肽的核酸分子转导。
在一些实施方案中，可以通过病毒或非病毒方法，将编码如所述的生长因子或胰岛素的多核苷酸引入复层表皮的细胞中。在一些实施方案中，非病毒递送方法包括引入DNA(例如，双链环状或线性)、RNA、核酶或适配体。在一些实施方案中，所述引入涉及使用含有编码重组胰岛素或生长因子的多核苷酸的病毒载体。例如，可以使用腺病毒载体。在一些实施方案中，引入的核酸分子可以作为含有异源核酸分子或转基因的构建体来提供。
存在许多本领域技术人员已知的用于在体外或体内将核酸引入细胞中的构建体。在一些实施方案中，此类构建体包括基于病毒的递送系统(例如，用于转导)和基于非病毒的递送系统(例如，转染)。在一些实施方案中，引入的多核苷酸可以是含有在载体(例如，病毒载体或表达载体)、纳米颗粒(例如，靶向的纳米颗粒或放射性标记的纳米颗粒)或质粒中递送的核酸分子的构建体。此类构建体是本领域熟知的，并且容易适用于本文所述的组合物和方法。
在任何上述提供的实施方案中，可以使用重组DNA和克隆技术将编码本文提供的重组生长因子和重组胰岛素的多核苷酸引入细胞中。为此，制备编码重组分子(例如，重组生长因子或重组胰岛素)的重组DNA分子。制备此类DNA分子的方法是本领域熟知的。例如，可以使用合适的限制性酶从DNA切除肽的编码序列。可替代地，可以使用化学合成技术(如亚磷酰胺法)来合成DNA分子。同样，可以使用这些技术的组合。在一些情况下，可以通过聚合酶链式反应(PCR)来产生重组或合成核酸。如本领域技术人员已知，可以将编码重组分子的DNA插入物克隆至适当的转导/转染载体中。还提供含有核酸分子的表达载体。
在一些实施方案中，表达载体能够在适于表达和分泌蛋白质的条件下在分化的复层表皮的适当细胞中表达重组生长因子和重组胰岛素。在一些方面，核酸分子或表达载体包含编码与适当表达控制序列可操作地连接的重组分子的DNA分子。在将DNA分子插入载体中之前或之后实现这种操作性连接的方法是熟知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。
在一些实施方案中，重组分子的表达受启动子或增强子控制，以控制或调节表达。启动子与核酸分子中编码重组分子的部分可操作地连接。
使用其上具有DNA分子的所得重组表达载体来转化适当宿主。该转化可以使用本领域中熟知的方法来进行。在一些实施方案中，使用其上具有DNA分子的所得表达载体来转化(如转导)适当细胞。可使用本领域熟知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移核酸的那些方法，包括通过病毒(例如，腺病毒)、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，通过腺病毒转导方法将核酸转移至细胞中。
在一些方面，本文提供了编码生长因子和人胰岛素的前体的多核苷酸，用于引入包含复层表皮的皮肤替代物的角质形成细胞。在一些实施方案中，引入步骤包括使包含复层表皮的皮肤替代物的细胞与所述多核苷酸(例如，存在于病毒载体中)接触长达或约10分钟、长达或约20分钟、长达或约30分钟、长达或约45分钟、长达或约60分钟、长达或约75分钟、长达或约90分钟、或长达或约120分钟。在一些实施方案中，引入步骤包括使复层表皮的层(例如，基底层)与所述多核苷酸(例如，存在于病毒载体中)接触长达或约10分钟、长达或约20分钟、长达或约30分钟、长达或约45分钟、长达或约60分钟、长达或约75分钟、长达或约90分钟、或长达或约120分钟。
1.用于递送至皮肤替代物的多核苷酸和由所述多核苷酸编码的分泌多肽
在一些方面，本文提供了一种方法，所述方法包括将多核苷酸引入包含复层表皮的皮肤替代物中。在一些实施方案中，递送或引入到皮肤替代物的特定多核苷酸是或包含核酸分子，由此其表达实现当存在于局部靶区域中时和/或当分泌到血流中时有用的活性或特性。在一些实施方案中，将多核苷酸引入包含复层表皮的皮肤替代物导致产生(例如，分泌)具有所需效果或治疗效果的一种或多种所编码的多肽。在一些实施方案中，所递送或引入的核酸分子可以由复层表皮的细胞翻译以产生和/或分泌一种或多种蛋白质以实现所需反应(例如，在伤口愈合的背景下为伤口闭合)。
在一些实施方案中，核酸分子可以作为媒介物(例如，病毒载体)的一部分、作为复合物或构建体、或作为裸DNA进行递送或引入。在一些实施方案中，核酸分子可以包括含有核酸分子的载体或质粒，如病毒载体或非病毒载体。在一些实施方案中，可以将核酸分子包封在脂质体中。在一些实施方案中，核酸分子可以与其他试剂(如靶配体或其他部分)复合，并作为纳米颗粒递送。
在一些实施方案中，引入到皮肤替代物的细胞中的多核苷酸是或包含编码一种或多种所需多肽(例如，生长激素和胰岛素)或其变体的核酸分子。在一些实施方案中，所编码的多肽可以从包含复层表皮的皮肤替代物的细胞中分泌或释放。在一些实施方案中，引入到皮肤替代物的细胞中的多核苷酸可以编码生长因子(例如，VEGF)或其任何异形体，以及调节细胞生长、细胞分化或细胞代谢的激素蛋白(例如，胰岛素原和/或胰岛素)。
a.重组生长因子
本文提供了将编码重组生长因子的多核苷酸引入皮肤替代物的角质形成细胞的方法。在一些实施方案中，本文提供的方法包括将由复层表皮构成的皮肤替代物的细胞用编码重组生长因子的多核苷酸转导。在一些实施方案中，多核苷酸分子可以编码多肽，所述多肽是与受体结合的生长因子或其部分或者与配体结合的生长因子受体或其部分。
在一些实施方案中，将编码生长因子的核酸分子引入复层表皮的角质形成细胞中。在一些实施方案中，将复层表皮的角质形成细胞用多核苷酸转导，所述多核苷酸编码选自以下的生长因子：表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、及其任何异形体或可变剪接变体。在一些实施方案中，将复层表皮的细胞用多核苷酸转导，所述多核苷酸编码本发明中可用的PDGF/VEGF蛋白质家族的其他成员，例如血管内皮生长因子B(VEGF-B)多肽、血小板源性生长因子A(PDGF-A)多肽、血小板源性生长因子B(PDGF-B)多肽、c-fos诱导的生长因子(FIGF)多肽或胎盘生长因子(P1GF)多肽。
在一些实施方案中，多核苷酸编码生长因子序列，所述生长因子序列含有信号肽以促进生长因子分泌。在一些实施方案中，信号肽存在于前体生长因子序列中并且被切割以形成可分泌的成熟生长因子。在一些实施方案中，信号肽是生长因子的内源性或天然信号肽。在一些实施方案中，信号肽是来自不同蛋白质的异源信号肽。在一些实施方案中，当生长因子从皮肤替代物的细胞表达时，信号肽被切割。在一些实施方案中，可分泌的生长因子序列缺乏信号肽。在一些实施方案中，生长因子可从细胞分泌。在一些实施方案中，重组生长因子可从复层表皮分泌。在一些实施方案中，复层表皮的细胞分泌重组生长因子。
在一些实施方案中，生长因子是VEGF-A或者是其异形体或可变剪接变体。VEGF-A是血管生成的关键介质，经由VEGF受体(VEGFR)的IV类酪氨酸激酶受体家族进行信号传导。尽管VEGF-A配体与VEGFR1和VEGFR2二者结合，但是它们主要经由VEGFR2发出信号，导致内皮细胞增殖、存活、迁移和血管渗透性。不同的VEGF-A异形体由可变剪接产生。在所提供的皮肤替代物中涵盖保留结合VEGF-R(例如，VEGFR2)的能力的VEGF-A的任何异形体或可变剪接变体。典型地，VEGF-A异形体长度不同，并且被称为VEGFxxx，其中xxx表示最终蛋白质序列中存在的氨基酸的数量。
示例性VEGF-A异形体包括但不限于血管内皮生长因子A(VEGF-A)多肽的VEGF 206(SEQ ID NO:11)、VEGF-A的异形体VEGF 189(SEQ ID NO:19)、VEGF-A的异形体VEGF 183(SEQ ID NO:20)、VEGF-A的异形体VEGF 148(SEQ ID NO:21)、VEGF-A的异形体VEGF 145(SEQ ID NO:22)、VEGF-A的异形体VEGF 165B(SEQ ID NO:23)、VEGF-A的异形体VEGF 121(SEQ ID NO:24)、VEGF-A的异形体VEGF111(SEQ ID NO:25)、VEGF-A的异形体VEGF 165(SEQID NO:7)、VEGF-A的异形体L-VEGF165(SEQ ID NO:26)、VEGF-A的异形体L-VEGF 121(SEQID NO:27)、VEGF-A的异形体L-VEGF 189(SEQ ID NO:28)、VEGF-A的异形体L-VEGF 206(SEQID NO:29)、VEGF-A的异形体15(SEQ ID NO:30)、VEGF-A的异形体16(SEQ ID NO:31)、VEGF-A的异形体17(SEQ ID NO:32)、或VEGF-A的异形体18(SEQ ID NO:33)。应当理解，还包括其成熟序列，所述成熟序列当从细胞表达和产生时在其切割后缺乏信号肽。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组人VEGF-A异形体，所述重组人VEGF-A异形体与SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性，并且保留与VEGFR(例如，VEGFR-2)的结合。在一些实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的重组人VEGF-A异形体。在一些实施方案中，多核苷酸编码含有信号肽的蛋白质，所述信号肽被蛋白水解切割和去除，使得分泌缺乏信号肽的蛋白质，如经由组成型分泌途径分泌。
在一些实施方案中，多核苷酸编码VEGF-A异形体，所述VEGF-A异形体具有与SEQID NO:7、11和19-33中任一项所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与VEGFR(例如，VEGFR-2)的结合。在一些实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的重组VEGF-A异形体。在一些实施方案中，多核苷酸编码缺乏信号肽的蛋白质，所述信号肽被蛋白水解切割和去除，例如所编码的蛋白质缺乏SEQ ID NO:7、11和19-33中任一项所示的信号肽(例如，缺乏氨基酸残基1-26)。在一些实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:4中所示的序列。在一些实施方案中，多核苷酸示于SEQ ID NO:4中。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组人VEGF-A，所述重组人VEGF-A包含与SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码重组人VEGF-A，所述重组人VEGF-A包含SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:7中所示的重组人VEGF-A或其缺乏信号肽的序列。
在一些实施方案中，编码生长因子序列的多核苷酸含有信号肽以促进VEGF的分泌。在一些实施方案中，信号肽存在于前体生长因子序列中并且被切割以形成可分泌的成熟生长因子。在一些实施方案中，信号肽是生长因子的内源性或天然信号肽。在一些实施方案中，信号肽是来自不同蛋白质的异源信号肽。在一些实施方案中，信号肽是如MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQA(SEQ ID NO:45)所示的序列。在一些实施方案中，当VEGF从皮肤替代物的细胞表达时，信号肽被切割。
在一些实施方案中，生长因子是PDGF/VEGF蛋白质家族的成员。在一些实施方案中，多核苷酸编码生长因子，所述生长因子是血管内皮生长因子B(VEGF-B)多肽(例如，SEQID NO:12)、c-fos诱导的生长因子(FIGF)多肽(也称为VEGF-D)(例如，SEQ ID NO:13)、血小板源性生长因子A(PDGF-A)多肽(例如，SEQ ID NO:14)、血小板源性生长因子B(PDGF-B)多肽(例如，SEQ ID NO:15)、或胎盘生长因子(PLGF)多肽(例如，SEQ ID NO:16)、及其任何异形体或可变剪接变体。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组人生长因子，所述重组人生长因子具有与SEQ ID NO:12-16中任一项所示的氨基酸序列或其可变剪接形式或异形体具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:12-16中任一项所示的重组人生长或其可变剪接形式或异形体。在一些实施方案中，多核苷酸编码SEQ ID NO:12-16中任一项所示的重组人生长因子。在一些实施方案中，所编码的蛋白质缺乏信号肽，所述信号肽被蛋白水解切割和去除，使得所编码的蛋白质缺乏SEQ ID NO:12-16中任一项所示的信号肽(参见例如序列表)。
在一些实施方案中，皮肤替代物的包含编码生长因子的多核苷酸的角质形成细胞分泌或释放生长因子。在一些实施方案中，皮肤替代物的包含编码生长因子的多核苷酸的角质形成细胞分泌或释放成熟生长因子。在一些实施方案中，皮肤替代物的包含编码生长因子的多核苷酸分子的角质形成细胞分泌或释放成熟生长因子，其中所述生长因子包含VEGF或其任何异形体。在一些实施方案中，编码所分泌的VEGF的多核苷酸包含与SEQ IDNO:4中所示的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码VEGF的多核苷酸包含SEQ ID NO:4中所示的序列。在一些实施方案中，VEGF异形体包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，VEGF异形体包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，复层表皮的基底层的细胞分泌重组生长因子。
b.重组胰岛素
胰岛素是一种分子量为5808道尔顿的由51个氨基酸残基构成的多肽。它在胰腺中朗格汉斯的β细胞胰岛中产生。示例性人胰岛素被翻译为110个氨基酸的前体多肽，其含有到ER的24个氨基酸的信号肽，所述信号肽被切割，产生胰岛素原。随后通过蛋白水解酶(称为激素原转化酶，例如PC1/3)的作用以及通过外切蛋白酶羧肽酶E(CPE)的作用，将胰岛素原分子转化为成熟胰岛素(Ramzy等人,Diabetes 2020；69(7):1451-1462)。这种切割导致去除4个碱性氨基酸残基且剩余31个氨基酸的C肽或连接链(对应于前胰岛素原多肽的氨基酸残基57至87)。所得胰岛素含有21个氨基酸的A链(对应于胰岛素原多肽的氨基酸残基66至86)和30个氨基酸的B链(对应于胰岛素原多肽的氨基酸残基1至30)，它们通过二硫键交联。典型地，成熟胰岛素含有三个二硫桥：在A链的位置7与B链的位置7之间的一个、在A链的位置20与B链的位置19之间的第二个、以及在A链的位置6与位置11之间的第三个。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括将编码重组人胰岛素的前体的多核苷酸引入皮肤替代物的角质形成细胞中。在一些实施方案中，本文提供的方法包括将编码胰岛素原的多核苷酸引入皮肤替代物的角质形成细胞中。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组常规胰岛素，所述重组常规胰岛素是天然或野生型胰岛素多肽。这些包括人胰岛素的重组形式，以及来自牛、猪和其他物种的胰岛素。在一些实施方案中，重组胰岛素是以R、R和市售的常规人胰岛素的重组胰岛素。在一些实施方案中，重组胰岛素是以Iletin市售的常规猪胰岛素的重组胰岛素。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组人胰岛素。在一些实施方案中，多核苷酸编码胰岛素的胰岛素原前体形式。在一些实施方案中，人胰岛素的前体是人胰岛素原。在一些实施方案中，多核苷酸编码与SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的人胰岛素原氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码示于SEQ ID NO:5中的人胰岛素原。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组胰岛素，所述重组胰岛素是人胰岛素的变体，如功能变体或物种变体或等位基因变体，或者是人胰岛素的具有活性的截短形式。在一些实施方案中，编码胰岛素的变体(包括等位基因变体和物种变体、由剪接变体编码的变体和其他功能变体，如胰岛素类似物或其他经衍生或修饰的形式)的此类多核苷酸编码胰岛素，所述胰岛素与SEQ ID NO:5中所示的人胰岛素的序列或与其含有A链和B链的经加工的胰岛素具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性，只要所述胰岛素与人胰岛素受体结合，启动信号传导级联，导致葡萄糖摄取和储存增加和/或内源性葡萄糖产生减少。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组胰岛素，所述重组胰岛素是人胰岛素的物种变体。这些包括但不限于源自牛和猪的胰岛素。牛胰岛素与人胰岛素的不同之处在于A链的氨基酸8和10以及B链的氨基酸30(SEQ ID NO:17)。猪胰岛素与人胰岛素的不同之处仅在于B链的氨基酸30，其中与牛序列一样，存在丙氨酸取代替代苏氨酸(SEQ ID NO:18)。在一些实施方案中，多核苷酸编码牛或猪胰岛素的胰岛素原前体形式，如SEQ ID NO:17的胰岛素原形式(例如，SEQ ID NO:17的氨基酸25-105)或SEQ ID NO:18的胰岛素原形式(例如，SEQ ID NO:18的氨基酸25-105)，或者与SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18中所示的胰岛素或与其含有A链和B链的经加工的胰岛素具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列，只要所述胰岛素与人胰岛素受体结合，启动信号传导级联，导致葡萄糖摄取和储存增加和/或内源葡萄糖产生减少。
在一些实施方案中，多核苷酸编码人胰岛素的变体，与人胰岛素相比，所述人胰岛素的变体含有一个或多个氨基酸修饰。示例性胰岛素类似物(A链和B链)包括速效和长效类似物形式或超活性胰岛素(参见例如，Vajo等人2001Endocrine Reviews22:706-717)。速效胰岛素类似物是胰岛素的典型地含有一个或多个氨基酸变化的经修饰的形式。与常规胰岛素相比，所述类似物被设计为减少胰岛素分子的自缔合，以提高吸收率和起效。例如，胰岛素类似物包括但不限于谷赖胰岛素(LysB3、GluB29)、HMR-1153(LysB3、IleB28)、HMR-1423(GlyA21、HisB32)、门冬胰岛素(AspB28)、赖脯胰岛素(LysB28、ProB29)和AspB10。在上述每种情况下，类似物的命名是基于对胰岛素的A链或B链上特定位置(从所述链的N末端编号)处的氨基酸取代的描述，其中序列的剩余部分属于天然人胰岛素。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组胰岛素，所述重组胰岛素是胰岛素AspB10。胰岛素AspB10是一种人胰岛素类似物多肽，所述人胰岛素类似物多肽含有B链的单个氨基酸变化，导致天冬氨酸(D)取代野生型胰岛素中位置10处天然存在的组氨酸(H)(例如，H到D的取代)。取代的结果是一种超活性胰岛素，其吸收速度是常规胰岛素(例如，野生型人胰岛素)的两倍。在一些方面，与常规胰岛素(例如，野生型人胰岛素)相比，胰岛素AspB10与胰岛素受体的结合亲和力增加。在一些实施方案中，多核苷酸编码胰岛素AspB10的胰岛素原前体形式，所述胰岛素AspB10含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组胰岛素，所述重组胰岛素是甘精胰岛素。通过将两个精氨酸添加到B链的C末端，甘精胰岛素的等电点移动，使其在酸性pH下更易溶。A链中存在另外的氨基酸变化(N21G)，以防止由酸敏感性天冬酰胺引起的脱酰胺和二聚化。在一些实施方案中，多核苷酸编码甘精胰岛素的胰岛素原前体形式，所述甘精胰岛素含有SEQ ID NO:34中所示的A链和SEQ ID NO:35中所示的B链。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组胰岛素，所述重组胰岛素是赖脯胰岛素。人赖脯胰岛素是一种胰岛素多肽配制品，其含有在B链的位置28和29处的氨基酸变化，使得野生型胰岛素中此位置处的Pro-Lys反转为Lys-Pro。这两个氨基酸的反转的结果是具有降低的自缔合倾向的多肽，这允许更快速地起效。具体地，B链中的序列反转导致两个疏水相互作用的消除和稳定二聚体的两个β折叠片层氢键的弱化(DeFelippis等人,InsulinChemistry and Pharmacokinetics.Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus 2002第481-500页,McGraw-Hill Professional)。由于所述氨基酸修饰，与常规胰岛素相比，赖脯胰岛素作用更快。在一些实施方案中，多核苷酸编码赖脯胰岛素的胰岛素原前体形式，所述赖脯胰岛素含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:37中所示的B链。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组胰岛素，所述是重组胰岛素门冬胰岛素。人门冬胰岛素是一种胰岛素多肽配制品，所述胰岛素多肽配制品含有人胰岛素的B链的位置28处从脯氨酸到天冬氨酸的氨基酸取代。门冬胰岛素中的修饰赋予带负电的侧链羧基，以产生电荷排斥并且使单体-单体相互作用不稳定。此外，脯氨酸的去除消除了单体之间的关键疏水性相互作用(DeFelippis等人,Insulin Chemistry andPharmacokinetics.Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus 2002第481-500页,McGraw-Hill Professional)。在一些实施方案中，多核苷酸编码门冬胰岛素的胰岛素原前体形式，所述门冬胰岛素含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:38中所示的B链。
在一些实施方案中，多核苷酸编码重组胰岛素，所述重组胰岛素是谷赖胰岛素。人谷赖胰岛素是一种胰岛素多肽配制品，与人胰岛素的B链的序列相比，所述胰岛素多肽配制品含有在B链中位置B3处从天冬酰胺到赖氨酸的氨基酸取代以及在氨基酸B29处从赖氨酸到谷氨酸的氨基酸取代。与人胰岛素相比，这些修饰使得多肽分子不易自缔合。在一些实施方案中，多核苷酸编码谷赖胰岛素的胰岛素原前体形式，所述谷赖胰岛素含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:39中所示的B链。
在一些实施方案中，多核苷酸编码胰岛素的胰岛素原形式，所述胰岛素的胰岛素原形式被修饰以促进胰岛素原切割成含有A链和B链的双链形式。在一些情况下，人角质形成细胞(例如，HaCaT细胞)缺乏有效切割胰岛素原以产生成熟胰岛素所必需的酶。例如，内肽酶(如PC-2和PC-3)不存在或不以高至足以切割胰岛素的水平存在。相反，角质形成细胞表达弗林蛋白酶，这是一种属于枯草杆菌蛋白酶样蛋白质原转化酶的酶家族的钙依赖性切割酶。在一些实施方案中，多核苷酸编码人胰岛素原，所述人胰岛素原是经修饰的人胰岛素原。在一些实施方案中，所编码的经修饰的人胰岛素原包含由在角质形成细胞(例如，HaCaT细胞)中表达的酶(例如，蛋白酶)识别的序列，这使得所编码的胰岛素原能够在角质形成细胞中被加工成含有连接(如通过二硫键连接)的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，蛋白酶是弗林蛋白酶并且经修饰的人胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列。在一些实施方案中，所编码的经修饰的人胰岛素原包含两个引入的弗林蛋白酶识别序列替代含有Arg31-Arg32切割位点(B-C连接)和Lys64-Arg65切割位点(C-A连接)的序列。在一些实施方案中，至少一个弗林蛋白酶识别序列含有共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ IDNO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，弗林蛋白酶切割位点是RQKR(SEQ IDNO:42)。
在一些实施方案中，多核苷酸编码胰岛素原，所述胰岛素原是含有SEQ ID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链的AspB10胰岛素，其中胰岛素原进一步含有两个弗林蛋白酶识别序列。在一些实施方案中，每个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，一个弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，一个弗林蛋白酶切割位点是RQKR(SEQ ID NO:42)。在一些实施方案中，多核苷酸编码经修饰的人胰岛素原，所述经修饰的人胰岛素原包含与SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列，其中胰岛素原含有弗林蛋白酶识别位点以及B链的位置10处的Asp的氨基酸取代。在一些实施方案中，多核苷酸编码经修饰的人胰岛素原，所述经修饰的人胰岛素原包含SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码经修饰的人胰岛素原，所述经修饰的人胰岛素原示于SEQ ID NO:6中。
在一些任何所提供的实施方案中，多核苷酸是进一步含有信号肽以促进生长因子分泌的前胰岛素原。在一些实施方案中，信号肽从所编码的前胰岛素原被切割以形成可分泌的成熟胰岛素原。在一些实施方案中，当胰岛素从皮肤替代物的细胞表达时，信号肽被切割。在一些实施方案中，成熟胰岛素原形式被进一步加工成重组胰岛素，所述重组胰岛素为含有如所述的A链和B链的双链形式。在一些实施方案中，信号肽是胰岛素的内源或天然信号肽。在一些实施方案中，信号肽是来自不同蛋白质的异源信号肽。在一些实施方案中，序列编码信号肽MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA(SEQ ID NO:43)。
在一些实施方案中，多核苷酸包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列，其中所编码的胰岛素原含有弗林蛋白酶识别位点以及B链的位置10处的天冬氨酸(Asp，D)的氨基酸取代。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:2中所示的序列。在一些实施方案中，多核苷酸示于SEQ ID NO:2中。
2.表达构建体和调节元件
在一些方面，本文提供了促进重组生长因子和重组胰岛素在包含复层表皮的皮肤替代物的细胞中表达的表达构建体和调节元件。在一些实施方案中，将复层表皮的细胞(例如，基底层的细胞)用包含本文所述调节元件的表达构建体转导。在一些实施方案中，表达盒是双顺反子表达盒，其中编码生长因子的多核苷酸和编码胰岛素的多核苷酸在表达盒中被双顺反子元件分开。
a.启动子
本文所述的多核苷酸可以由启动子或增强子驱动以控制或调节其表达。在一些实施方案中，启动子与期望相对高表达的核酸的编码区可操作地连接。在一些实施方案中，启动子与在翻译后将需要翻译后修饰的核酸的编码区可操作地连接。启动子的非限制性例子包括巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、泛素C(Ubc)、人β肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角体、CaMKIIa、GALl、GAL 10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、HI、U6、SSFV、MNDU3和EFl-a(或称Efla)。
在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性的。组织特异性启动子允许在具有适当转录因子以激活启动子的特定细胞群体中产生蛋白质。许多启动子是可商购获得的并且是本领域熟知的；示例性序列可以在Entrez Gene ID 1915中发现。在一些实施方案中，启动子选自巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)或劳斯肉瘤病毒LTR启动子(RSV)。
本领域技术人员已知的任何强启动子都可用于驱动DNA的表达。启动子可以是组成型启动子，如CMV启动子、组织特异性启动子、诱导型或调节型启动子。在一些实施方案中，待引入细胞的多核苷酸含有与编码区可操作地连接的诱导型启动子，使得核酸的表达可通过控制适当转录诱导物的存在或不存在来控制。
在一些实施方案中，启动子是调节型启动子和转录因子表达系统，如已公开的四环素调节的系统或其他可调节系统(参见例如，WO 01/30843)，以允许所编码的多肽的调节表达。其他启动子的例子是组织选择型启动子，如描述于美国专利号5,998,205中的那些，包括例如甲胎蛋白、DF3、酪氨酸酶、CEA、表面活性蛋白和ErbB2启动子。示例性可调节启动子系统是例如可从Clontech(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)获得的Tet-On(和Tet-Off)系统。此启动子系统允许通过四环素或四环素衍生物(如多西环素)控制的转基因的经调节表达。其他可调节启动子系统是已知的(参见例如，美国专利公开号2002-0168714，标题为“Regulation of Gene Expression Using Single-Chain,Monomeric,Ligand DependentPolypeptide Switches”，其描述含有配体结合结构域和转录调节结构域(如来自激素受体的那些)的基因开关)。
在一些实施方案中，所述启动子为组成型启动子。示例性启动子包括但不限于CMV启动子、截短的CMV启动子、人血清白蛋白启动子或C-1-抗胰蛋白酶启动子。在一些实施方案中，启动子是截短的CMV启动子，其中已知转录阻遏物的结合位点已经缺失。CMV源启动子可以是人或猿猴来源的。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。例如，启动子是诱导型蜕皮激素启动子。启动子的其他例子包括类固醇启动子，如雌激素和雄激素启动子，以及金属硫蛋白启动子。在一些实施方案中，增强子可以是组织特异性或非特异性增强子。例如，增强子是肝特异性增强子元件。示例性增强子元件包括但不限于人血清白蛋白(HSA)增强子、人凝血酶原(HPrT)增强子、C-1-微球蛋白增强子、内含子醛缩酶(intronicaldolase)增强子和载脂蛋白E肝控制区。
在一些实施方案中，可以使用但不限于诸如动物病毒源启动子、哺乳动物细胞源启动子或两种启动子的杂合启动子等的启动子。在许多情况下，希望以相对较高的水平表达基因，包括治疗性基因。高表达启动子的例子包括CMV启动子(Foecking M.K.等人,Gene1986；45:101-105)和CAG启动子(Niwa H.等人,Gene 1991；108:193-200)等。CMV启动子由巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的增强子和启动子组成，并且CAG启动子由CMV的IE增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、剪接受体和兔β-珠蛋白的聚(A)序列组成。因此，CMV启动子和CAG启动子两者都含有CMV的IE基因的增强子(Boshart M.等人,Cell 1985；41:521-530)。如本文所用，CMV的IE基因的这种增强子可以被简单地称为“CMV增强子”。
组成型启动子的例子包括CAG启动子、CMV启动子、EF-1α启动子、SRα启动子、SV40启动子、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)等。诱导型启动子的例子包括金属硫蛋白基因启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子等。此外，可以使用其中组成型启动子的表达由四环素或蜕皮激素诱导的系统。具有这种启动子的表达载体和表达诱导系统是可商购获得的或可从公共机构获得的。如果可以，商业产品可以购自Invitrogen Inc.、ClontechInc.等。
在一些实施方案中，除了上述含有CMV增强子的启动子之外，还可以使用类似地源自病毒的启动子，如SV40启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子(Takebe Y.等人,Mol.Cell.Biol.1988；8:466-472)。
在一些方面，本文提供了一种具有CAG启动子的病毒载体，所述病毒载体表达诸如生长因子和胰岛素或其变体的基因。在一些实施方案中，编码将经历大多数翻译后修饰的蛋白质的核酸序列位于启动子(例如，CAG启动子)下游的任何其他核苷酸之前。在一些实施方案中，编码生长因子的核酸序列位于启动子下游的编码胰岛素或其变体的核酸序列的上游。这些实施方案不应被解释为限制性的，因为也可以使用具有编码其他蛋白质的不同转基因的其他特异性或泛主启动子。待插入到本发明的腺病毒载体中的基因不受具体限制，并且可以使用编码诸如生长因子和激素(例如，胰岛素)等的蛋白质的基因。
在一些实施方案中，CAG启动子的核苷酸序列可以被包含与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性或相似性的核苷酸序列的核苷酸序列替代。在一些实施方案中，优选的核苷酸序列与SEQ ID NO:1至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％相似。
在一些实施方案中，编码不同多肽链中每一条的编码序列可以与启动子可操作地连接，所述启动子可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动编码生长因子的多核苷酸和编码胰岛素的多核苷酸的表达的启动子。
b.双顺反子元件
在一些实施方案中，含有编码多核苷酸的表达盒可以是多顺反子的(双顺反子或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，转录单元可以被工程化为含有双顺反子元件的双顺反子单元，其允许通过来自单个启动子的信息共表达基因产物。在一些实施方案中，双顺反子元件是IRES(内部核糖体进入位点)。在一些实施方案中，双顺反子元件可以是自切割序列，如2A序列(例如，P2A、FTA或T2A)。
内部核糖体进入位点(IRES)是从连续多个蛋白质编码区的双顺反子或多顺反子RNA转录物内的内部起始密码子(通常为AUG)开始翻译的序列。IRES已经在脑心肌炎病毒和相关小RNA病毒中加以表征(例如，Jackson等人,RNA 1995；1:985-1000和Herman,Trendsin Biochemical Sciences 1989；14(6):219-222)。在来自其他病毒(如心脏病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、弗林德鼠白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV))的mRNA中也检测到IRES序列。IRES在细胞RNA中的存在也已有描述。含有IRES的细胞mRNA的例子包括编码以下的那些：免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2、胰岛素样生长因子、翻译起始因子eIF4G和酵母转录因子TFIID和HAP4(例如，Macejak等人,Nature1991；353:90-94；Oh等人,Genes Dev.1992；6:1643-1653；Vagner等人,Mol.Cell.Biol.1995；15:35-44；He等人,PNAS1996；93:7274-7278；He等人,Gene 1996；175:121-125；Tomanin等人,Gene 1997；193:129-140；Gambotto等人,Cancer Gene Therapy 1999；6:45-53；Qiao等人,Cancer Gene Therapy 1999；6:373-379)。含有IRES元件的表达载体已有描述。参见例如，PCT/US98/03699和PCT/EP98/07380。
在一些实施方案中，本文所述的病毒载体包含一个或多个转基因。在一个例子中，载体编码两个转基因，例如编码生长因子的转基因和编码胰岛素的转基因，或其变体。在一些实施方案中，相同的调节元件对第一和第二转基因施加转录控制，并且任选地，一个转基因在内部核糖体进入位点的翻译控制下。在一些实施方案中，不同的元件调节两个转基因中的每一个的转录，并且一个转基因任选地在IRES的翻译控制下。
c.3'非翻译区(UTR)
3'-非翻译区(3'-UTR)通常是mRNA的一部分，位于mRNA的蛋白质编码区(即，开放阅读框)与聚(A)序列之间。mRNA的3'-UTR不翻译成氨基酸序列。3'-UTR序列通常由在基因表达过程期间转录成相应的mRNA的基因编码。首先将基因组序列转录成包含任选内含子的不成熟mRNA。然后不成熟mRNA在成熟过程中被进一步加工成成熟mRNA。此成熟过程包括以下步骤：5'-加帽，剪接不成熟mRNA以切除任选的内含子和3'端的修饰(如不成熟mRNA的3'端的多腺苷酸化)，以及任选的核酸内切酶或核酸外切酶切割等。3'-UTR可以对应于成熟mRNA中位于蛋白质编码区的终止密码子的3'的序列，优选紧邻蛋白质编码区的终止密码子的3'并且延伸至聚(A)序列的5'侧，优选延伸至紧邻聚(A)序列的5'的核苷酸。术语“对应于”表示，3'-UTR序列可以是RNA序列(如在用于定义3'-UTR序列的mRNA序列中)，或对应于这个RNA序列的DNA序列。术语“基因的3'-UTR”(如“胰岛素基因的3'-UTR”)是对应于源自此基因的成熟mRNA(即通过基因转录和不成熟mRNA的成熟获得的mRNA)的3'-UTR的序列。术语“基因的3'-UTR”涵盖3'-UTR的DNA序列和RNA序列。
在一些实施方案中，合适的3'-UTR序列可以与编码一个或多个所需转基因的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，3'-UTR序列可以与编码生长因子和胰岛素或其变体的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，合适的3'-UTR区可以是与核苷酸序列天然缔合的那些，或者可以源自不同的基因，例如像牛生长激素3'-UTR区(bGH多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号和增强子序列。在本发明的背景下，当提及“SV40”时，提及SV40多腺苷酸化信号。当提及“SV40增强子序列”时，提及SV40多腺苷酸化信号和增强子序列。
在一些实施方案中，3'-UTR序列包含聚A尾，也称为3'-聚(A)尾或聚(A)序列。聚A尾是添加到RNA分子的3'端的腺苷核苷酸的长序列。多腺苷酸化是将聚(A)序列添加到核酸分子(如RNA分子)，例如添加到不成熟mRNA。多腺苷酸化可以由多腺苷酸化信号诱导。此信号优选位于待多腺苷酸化的核酸分子(如RNA分子)的3'端的核苷酸延伸段内。多腺苷酸化信号通常包含由腺嘌呤和尿嘧啶/胸腺嘧啶核苷酸组成的六聚体，优选六聚体序列AAUAAA。也可以设想其他序列，优选六聚体序列。多腺苷酸化通常发生在前体mRNA(也称为不成熟mRNA)的加工期间。典型地，RNA成熟(从前体mRNA到成熟mRNA)包括多腺苷酸化的步骤。
在一些实施方案中，本文所述的表达构建体可以包含含有聚A尾的3'-UTR区，所述聚A尾具有多达约400个腺苷核苷酸，例如从约25至约400个、从约50至约400个、从约50至约300个、从约50至约250个、从约60至约250个腺苷核苷酸、从约70至约250个腺苷核苷酸、从约80至约250个腺苷核苷酸、从约90至约250个腺苷核苷酸、从约100至约250个腺苷核苷酸、从约100至约200个腺苷核苷酸或从约100至约150个腺苷核苷酸。
3.用于转导的病毒载体
当将外源核酸序列插入病毒载体时，病毒可用作基因递送媒介物。本文提供了病毒载体，所述病毒载体含有编码重组生长因子(例如，如本文所述的任一种，如VEGF)的多核苷酸和编码重组胰岛素(如重组人胰岛素，例如如所述的任一种)的多核苷酸。本文还提供了病毒载体，所述病毒载体含有如本文所述的任何表达盒，如双顺反子表达盒。
病毒可用于在体内递送核酸分子，例如多核苷酸，因为它们能有效地将病毒DNA转移到宿主细胞中。它们可以依赖病毒吸附蛋白(例如，衣壳或糖蛋白)感染特定靶细胞并被特定靶细胞吸收，并且可以操纵它们以去除非必需基因并且添加异源核酸分子。许多病毒载体是本领域技术人员已知的。可用于本文方法的病毒的例子包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、杆状病毒、嗜肝DNA病毒、痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、正粘病毒、乳多空病毒、副粘病毒和细小病毒。病毒的选择在本领域技术人员的水平之内并且取决于多种因素，如对病毒DNA的复制或整合的需要、病毒的嗜性和/或病毒的免疫原性。
此类病毒及其衍生物是本领域技术人员熟知且可获得的。例如，许多可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，罗克维尔，马里兰州)或从商业供应商(例如，Vector Biolabs，费城，宾夕法尼亚州；Applied BiologicalMaterials,Inc.，列治文，不列颠哥伦比亚，加拿大)获得。用于产生重组病毒的病毒载体包括有复制能力的病毒和复制缺陷型病毒。在复制缺陷型病毒中，病毒通常缺乏与病毒复制相关的一个或多个基因，并且在一些情况下，在第一个感染周期之后无法复制。为了产生复制缺陷型病毒，可能需要转移载体、包装载体或辅助病毒。例如，包装载体可以作为粘粒来提供，或在提供用于包装缺陷型载体的病毒结构蛋白的细胞系中提供。病毒载体还可以含有表达盒，所述表达盒包含与所选转基因可操作地连接的调节元件，如启动子和增强子。可以使用任何合适的启动子。合适的启动子和增强子在本领域广泛可用于所选的病毒载体中。
a.腺病毒载体
腺病毒载体对于用作基因递送媒介物具有几个优点，包括对分裂和非分裂细胞的嗜性、最小的致病潜力、复制到高滴度以制备载体储库的能力以及携带大插入物的潜力(参见例如，Berkner Curr.Top.Micro.Immunol.1992；158:39-66；Jolly等人Cancer GeneTherapy 1994；1:51-64)。腺病毒是一种核DNA病毒，基因组为约36kb，已经通过经典遗传学和分子生物学方面的研究充分表征(Horwitz,M.S.,“Adenoviridae and TheirReplication in Virology,第2版,Fields,B.N.等人编辑,Raven Press,New York,1990)。基因组被分类为早期(称为E1-E4)和晚期(称为L1-L5)转录单元，涉及生成两个时间类别的病毒蛋白。这些事件之间的界限是病毒DNA复制。腺病毒展现出对呼吸道和胃肠道的上皮细胞的天然嗜性。腺病毒还可以感染肝脏细胞(如肝细胞和内皮细胞)，这可以在全身施用后病毒被清除到肝脏中时发生。病毒表面上的五邻体基底(penton base)和纤维蛋白是病毒嗜性的原因。需要腺病毒颗粒与宿主细胞之间的多种相互作用来促进有效的细胞进入(Nemerow,Virology 2000；274:1-4)。
对于亚组C腺病毒，如腺病毒2和5(Ad2或Ad5)，病毒进入途径已经被充分表征，并且被认为涉及两个单独细胞表面事件。首先，腺病毒纤维突结(fiber knob)与柯萨奇腺病毒受体(CAR)之间的高亲和力相互作用介导腺病毒颗粒附着到细胞表面。随后五邻体与细胞表面整合素αvβ3和αvβ5(它们充当辅助受体)的缔合增强病毒内化。在许多人组织(包括肺上皮细胞)中表达的CAR(Bergelson等人,Science 1997；275:1320-1323)似乎是作为大多数腺病毒亚组(亚组B除外)的细胞受体起作用(Bergelson等人,Science1997；275:1320-1323；Roelvink等人,J.Virol.1998；72:7909-7915)。在一些实施方案中，用于转导包含复层表皮的皮肤替代物的细胞的腺病毒是5型腺病毒。在一些实施方案中，用于转导包含复层表皮的皮肤替代物的基底细胞的腺病毒是5型腺病毒。
腺病毒包括超过50种血清型，分为六个不同的亚组，A至F。这些腺病毒血清型中的任一种(可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，罗克维尔，马里兰州)和其他商业和非商业供应商获得)均可用于本文的方法或被用作进一步修饰的来源，如本领域已知。此外，可以使用或进一步修饰可从任何其他来源获得的任何其他血清型的腺病毒。例如，腺病毒可以是亚组A(例如，血清型12、18、31)、亚组B(例如，血清型3、7、11a、11p、14、16、21、34、35、50)、亚组C(例如，血清型1、2、5、6)、亚组D(例如，血清型8、9、10、13、15、17、19、19p、20、22-30、32、33、36-39、42-49、51)、亚组E(例如，血清型4)、亚组F(例如，血清型40、41)或任何其他腺病毒血清型。在某些实施方案中，腺病毒是亚组C腺病毒或源自亚组C腺病毒。在优选例子中，腺病毒是亚组C 5型腺病毒。腺病毒载体是本领域可获得的(例如，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，罗克维尔，马里兰州)获得)，并且来自许多不同腺病毒血清型的野生型腺病毒蛋白的序列是本领域熟知的(参见例如，Roberts等人J.Biol.Chem.1984；259:13968-13975；Chroboczek等人Virology 1992；186:280-285；Sprengel等人J.Virol.1994；68:379-389；Chillon等人J.Virol.1999；73:2537-2540；Davison等人J.Mol.Biol.1993；234:1308-1316；www.binfgmu.edu/wiki/index.php/Human Adenovirus Genome Sequencesand Annotations)。腺病毒载体对于本领域技术人员是广泛可用的，例如来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)或其他商业和非商业供应商。腺病毒可以ATCC编号VR-1至VR-1616从ATCC获得。例如，5型野生型腺病毒可以VR-5和VR-1082获得。可以产生源自任何上述血清型的多种重组或经修饰的腺病毒中的任一种，如本领域和本文中所述，或者通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行。
用于在本文所述方法中使用的腺病毒载体可以包括含有第一早期基因区(E1-E4)中的至少一个缺失的缺陷型腺病毒载体。对腺病毒载体的修饰包括本领域已知的缺失。如可以在E1、E2a、E2b、E3或E4编码区中的一个或多个中实现缺失。例如，用于基因疗法的腺病毒载体可以通过异源核酸分子取代替代E1、E2a、E2b、E3和/或E4基因来制备。可使用限制性核酸内切酶实现缺失。例如，可以使用E1a区内的方便的限制性核酸内切酶位点来使E1a区缺失。通常，也通过限制性核酸内切酶添加而使E3的一部分缺失，以便允许插入更大段外源DNA，同时仍然满足包装到新病毒颗粒中要求的尺寸限制。由于这些区域的缺失，腺病毒载体的克隆能力可以为约8kb。由于第一病毒早期基因区(如E1，其包括E1a区和E1b区)中的至少一个缺失，此类腺病毒载体通常被称为复制缺陷型腺病毒。
在一些实施方案中，用于转导包含复层表皮的皮肤替代物的细胞的腺病毒是复制缺陷型5型腺病毒。在一些实施方案中，用于转导包含复层表皮的皮肤替代物的细胞的腺病毒是具有区域E1处的缺失的复制缺陷型5型腺病毒。在一些实施方案中，用于转导包含复层表皮的皮肤替代物的细胞的腺病毒是具有区域E3处的缺失的复制缺陷型5型腺病毒。在一些实施方案中，用于转导包含复层表皮的皮肤替代物的细胞的腺病毒是具有区域E1和E3处的缺失的复制缺陷型5型腺病毒。在一些实施方案中，用于转导包含复层表皮的皮肤替代物的基底细胞的腺病毒是具有一个或多个区域E1和/或E3处的缺失的复制缺陷型5型腺病毒。
早期基因(如病毒区域E1和E3)的缺失使得重组腺病毒是复制缺陷型的，并且不能在随后感染的靶细胞中产生感染性病毒颗粒。因此，为了允许早期基因缺失的腺病毒基因组复制(如E1缺失的腺病毒基因组复制)，并且为了产生病毒颗粒，需要提供缺失基因产物的互补系统。例如，E1互补通常由表达E1的细胞系提供。如人胚肾包装细胞系，即上皮细胞系，称为293(以登录号CRL-1573存放于ATCC)。细胞系293含有腺病毒的E1区，其提供E1基因区产物以“支持E1缺失的病毒在所述细胞系中的生长”(参见例如，Graham等人,J.Gen.Virol.36:59-71,1977)。此外，已经报道了可用于产生具有腺病毒E4区的一部分的缺陷型腺病毒的细胞系(参见例如，国际公开申请号WO 96/22378)。也可以使E3从载体中缺失，但是由于它不是载体产生所必需的，因此互补生产细胞中可以将其省略。互补生产细胞系和产生互补生产细胞系的方法是本领域已知的(参见例如，Morris等人,BMCBiotechnology 2010；10(92))。
使用复制缺陷型病毒作为载体的益处是，它们可以扩散到其他细胞类型的程度是有限的，因为它们可以在初始感染的细胞内复制，但是不能形成新的感染性病毒颗粒。多种缺陷型腺病毒载体和互补细胞系也已有描述(参见例如，国际PCT公开号WO 95/34671，美国专利号5,994,106)。复制缺陷型腺病毒的构建已有描述(Berkner等人,J.Virol.1987；61:1213-20；Massie等人,Mol.Cell.Biol.1986；6:2872-83；Haj-Ahmad等人,J.Virol.1986；57:267-74；Davidson等人,J.Virol.1987；61:1226-39；Zhang等人,BioTechniques1993；15:868-72；Berkner Nuc.Acids Res.1983；11:6003；Ghosh-ChoudhuryBiochem.Biophys.Res.Commun.,1987；147:964；Gilardi等人,FEBS1990；267:60；MittalVirus Res.1993；28:67；Yang PNAS1993；90:4601；和国际公开PCT WO 1995/026411)。
腺病毒载体还包括“无病毒基因的(gutless)”或“去除病毒基因的(gutted)”载体，其中所有病毒基因都被去除，只留下载体繁殖所必需的末端反向重复(ITR)。此类腺病毒载体被称为假腺病毒载体(PAV)，因为它们源自腺病毒的基因组且含有载体基因组复制和包装所需的最小顺式作用核苷酸序列。PAV载体包含含有复制起点的5'ITR和3'ITR核苷酸序列，以及包装PAV基因组所需的顺式作用核苷酸序列。它们可以被修饰以含有一个或多个具有适当调节元件(例如，启动子或增强子)的转基因。PAV的携带容量大小远超8kb，并且大小高达36kb，因为它们含有大多数病毒编码序列的缺失(参见例如，美国专利号5,882,887或5,670,488；PCT公开号WO 96/40955、WO 97/25466、WO 95/29993、WO 97/00326；Morral等人Hum.Gene Ther.1998；10:2709-2716；Kochanek等人PNAS1996；93:5731-5736；Parks等人PNAS1996；93:13565-13570；Lieber等人J.Virol.1996；70:8944-8960；Fisher等人J.Virol.1996；217:11-22)。
通过用“辅助”病毒(如使用E1缺失的腺病毒载体)共感染生产细胞来使PAV生长，其中包装细胞表达E1基因产物。辅助病毒反式补充缺失的腺病毒功能，包括颗粒组装所需的病毒结构蛋白的产生。例如，将辅助腺病毒载体基因组和无病毒基因的腺病毒载体基因组递送到包装细胞。将所述细胞维持在标准细胞维持或生长条件下，由此辅助载体基因组和包装细胞一起为腺病毒载体颗粒的包装提供互补蛋白质。通过标准技术回收此类无病毒基因的腺病毒载体颗粒。辅助载体基因组可以通过标准转染技术以质粒或类似构建体的形式递送，或者其可以通过用含有所述基因组的病毒颗粒感染来递送。这种病毒颗粒一般称为辅助病毒。类似地，无病毒基因的腺病毒载体基因组可以通过转染或病毒感染递送至细胞。
腺病毒还包括条件复制型腺病毒，所述条件复制型腺病毒是由于将复制所必需的腺病毒基因置于异源启动子的控制下而在某些类型的细胞或组织中复制但不在其他类型的细胞或组织中复制的病毒(如上所述；还参见美国专利号5,998.205、美国专利号5,801,029和美国申请序列号10/081,969，公开为US2003/0104625以及相应的国际PCT公开号WO2002/067861)。
腺病毒还包括如下的那些：已经被修饰以含有靶向配体，以增加表达针对靶向配体的受体(蛋白质、脂质、碳水化合物或其部分)的特定靶细胞的感染，例如以改变所述病毒的嗜性。虽然腺病毒载体和其他载体在治疗应用方面具有很大的希望，但是它们的有用性受到CAR的广泛组织分布的限制，这限制了腺病毒载体向特定细胞类型的递送。此外，体内某些细胞上缺乏CAR和/或C整合素受体限制了可以被腺病毒载体靶向的细胞或组织类型。因此，腺病毒还包括如下的那些：已经通过减少或消融与天然受体的结合和/或使衣壳蛋白(如HI环、纤维的C末端、六邻体的L1环或五邻体基底的RGD环，或衣壳蛋白IX)工程化进行修饰，以掺入所需细胞受体或组织特异性受体的靶配体(参见例如，Krasnykh等人,Mol.Ther,2000；1(5):第391-405页以及Wickham,Gene Ther.2000；7:110-4)。衣壳蛋白可以被修饰，例如通过添加靶配体或用其他类型的腺病毒纤维取代所述纤维来修饰。靶配体可以是与细胞中或细胞上的部分结合的任何蛋白质或其部分。如细胞表面蛋白、脂质、碳水化合物或其他部分。例如，靶配体包括但不限于生长因子、粘附分子、细胞因子、蛋白质激素、神经肽(神经递质)和单链抗体或其合适的部分。在其他例子中，腺病毒载体可以与衔接子分子缀合，所述衔接子分子如含有抗Ad单链抗体(sclv)或CAR的胞外结构域和靶向配体的抗体和融合蛋白；或者用含有靶向配体的聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)部分)进行化学修饰(参见例如，Mizuguchi等人(2004)Hum.Gene Ther.15:1034-44；Eto等人(2008)Int.J.Pharm.,354:3-8)。
上述腺病毒中的任一种或本领域已知的任一种可以被修饰以含有所需异源核酸分子，用作本文的递送剂。含有所需异源核酸序列的腺病毒可以通过本领域技术人员已知的任何技术来制备(Levrero等人,Gene 1991；101(2):195-201,EP185 573；Graham,EMBO.J.3(1984)2917；WO 95/26411)。特别地，此类病毒可以通过在腺病毒载体与携带异源DNA序列的质粒之间的同源重组来制备。同源重组可以在将腺病毒载体和质粒共转染到适当的细胞系中之后发生。所使用的细胞系通常是可转化的细胞系。转染可以在存在引导腺病毒颗粒进入生产细胞中的试剂的情况下进行。此类试剂包括但不限于聚阳离子和双功能试剂。
在一些实施方案中，如果腺病毒是缺陷型腺病毒(由于早期基因(例如，E1和/或E3)或纤维蛋白的缺失)，则腺病毒在其中包装或生长的细胞系含有(如以整合的形式)能够补充缺陷型腺病毒基因组部分的序列以避免重组的风险。互补细胞系的例子包括但不限于人胚胎肾系293(HEK293)(Graham等人,J Gen Virol.1977；36(1):59-74)，其含有Ad5腺病毒基因组的左侧部分。互补细胞还包括例如PER.C6细胞系的细胞，其含有腺病毒E1基因(PER.C6可以例如从Crucell，荷兰获得；以ECACC登录号96022940保藏；还参见Fallaux等人Hum Gene Ther.1998；9(13):1909-17；美国专利号5,994,128)。互补细胞系的另一个例子是A549源细胞系AE1-2a(参见例如，Gorziglia等人J Virol.1996；70(6):4173-4178和VonSeggern等人(1998)J.Gen.Virol.1998；79,1461-1468)。在一些实施方案中，根据常规分子生物学技术回收和纯化已经在互补细胞或细胞系中繁殖的腺病毒。
说明腺病毒在基因疗法中的用途的参考文献包括但不限于Vorburger和Hunt,TheOncologist 2002；7:46-59以及St.George,Gene Therapy 2003；10:1135-1141。
b.腺相关病毒(AAV)
用作递送剂的病毒载体包括腺相关病毒(AAV)。AAV是一种单链人DNA细小病毒，其基因组大小为4.6kb。AAV基因组含有两个主要基因：rep基因和cap基因。rep基因编码rep蛋白(Rep.76、Rep.68、Rep.52和Rep 40)。cap基因编码AAV复制、拯救、转录和整合，而cap蛋白形成AAV病毒颗粒。AAV因其依赖于腺病毒或其他辅助病毒(例如，疱疹病毒)提供允许AAV经历生产性感染(即在宿主细胞中自我繁殖)的必需基因产物而得名。在不存在辅助病毒的情况下，AAV作为原病毒整合到宿主细胞的染色体中，直到辅助病毒(通常是腺病毒)通过对宿主细胞的重叠感染来拯救AAV(Muzyczka,Curr.Top.Micro.Immunol.1992；158:97-129)。
AAV病毒可以整合到细胞基因组中。整合的机制是通过在AAV基因组的两端的末端反向重复(ITR)的存在来介导的，所述ITR含有病毒复制、拯救、包装和整合所需的顺式作用核苷酸序列。由rep蛋白反式介导的ITR的整合功能允许AAV基因组在不存在辅助病毒的情况下在感染后整合到细胞染色体中。AAV的整合位点已被充分确立，并且已经定位到人的19号染色体(Kotin等人,PNAS1990；87:2211-2215)。对整合位点的了解降低了细胞基因组中可能激活宿主基因或使宿主基因失活或中断编码序列的随机插入事件的风险。AAV对于基因疗法应用也很有用，因为其宿主范围广泛，对许多细胞类型展现出嗜性。AAV还可以感染非分裂细胞和分裂细胞两者。
AAV载体可以源自任何天然存在的AAV血清型，包括AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8或AAV-9。此类病毒是本领域技术人员熟知且可获得的(参见例如，Grimm等人(2003)Current Gene Therapy,3:28.1-304；Muramatsu等人(1996)Virol.,221:208-217；Chiorini等人(1997)J.Virol.71:6823-6833；Chiorini(1999)J.Virol.,73:1309-1319；Rutledge等人(1998)J.Virol,72:309-319；Xiao等人(1999).Virol.,73:3994-4003；Gao等人(2002)Proc Natl.Acad.Sci.,99:1 1854-11859；Kotin(1994)Human GeneTherapy,5:793-801)。其他血清型也是已知的且可获得的，包括AAV-8至AAV-12。例如，许多AAV载体可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，罗克维尔，马里兰州；参见例如，VR-197、VR-645、VR-646、VR-680、VR-681、VR-1449、VR-1523、VR-1616)获得。还可获得相容的宿主细胞和辅助病毒。AAV载体还包括“假型化”AAV载体，其中AAV-2载体基因组被交叉包装到其他AAV血清型的衣壳中(Burger等人,Mol Ther.2004；10(2):302-17和美国专利号7,094,604)。此类假型化AAV载体克服了AAV-2源血清型的局限性，如它们在转导某些细胞(如肝细胞或肌肉细胞)方面的低效率。
在实现全身表达的递送方法后，许多AAV载体在多个组织(如骨骼肌和心肌)中展现出广泛的转导。这些包括例如AAV血清型6、8和9。特别地，AAV载体包括腺病毒相关血清型9(AAV-9；GenBank登录号AY530629.1；Gao等人J.Virol.,2004；78:6381-6388)。AAV-9是一种可以绕过血脑屏障靶向中枢神经系统(CNS)的载体(参见例如，Foust等人,NatureBiotechnology,2009；27:59-65；Duque等人Mol.Ther:,2009；17:1187-1196)。因此，在影响脑或CNS或与其相关的神经系统变性疾病或本文的其他疾病的例子中，AAV-9可以用作递送剂以编码目的蛋白质用于全身递送(例如，递送到肝脏或其部分，以在血液中表达)。
AAV载体包括含有目的异源核酸的重组AAV载体。用于产生此类载体的程序是本领域技术人员已知的。例如，产生AAV载体的标准方法需要用含有侧接AAV ITR序列的目的核酸分子的AAV载体基因组转染宿主细胞，通过反式编码所需的AAV rep和cap蛋白的基因的质粒来转染宿主细胞，以及用辅助病毒感染所转染的细胞以反式提供所需的非AAV辅助功能(Muzyczka Curr.Top.Micro.Immunol.,1992；158:97-129和美国专利号5,139,941)。所述辅助病毒可以是腺病毒或其他辅助病毒。辅助病毒蛋白激活AAV rep基因的转录，然后rep蛋白激活AAV cap基因的转录。然后，cap蛋白利用ITR序列将AAV基因组包装到病毒颗粒中。
可替代地，可以使用含有辅助功能基因的质粒与可用作复制功能来源的熟知辅助病毒之一的感染组合来帮助AAV病毒体的重组(参见例如，美国专利号5,622,856和5,139,941)。类似地，本领域技术人员可以利用含有附加功能基因的质粒与野生型AAV的感染组合，以提供必需的复制功能。还可以使用三重转染方法来产生重组病毒体(rAAV)，这是一种不需要辅助病毒的方法(参见例如，美国专利号6,001,650)。这是通过使用三种载体进行rAAV病毒体产生来完成的：AAV辅助功能载体、附加功能载体和rAAV载体。
说明AAV病毒在基因疗法中的用途的参考文献包括但不限于Sheridan,NatureBiotechnology 2011；29:121-128。
c.逆转录病毒载体
用作递送剂的病毒载体包括逆转录病毒载体。逆转录病毒载体非常适合将核酸递送到细胞中，因为它们能够将未重排的单拷贝基因递送到众多种啮齿动物、灵长类动物和人的体细胞中。逆转录病毒载体整合到宿主细胞的基因组中。与其他病毒载体不同，它们只感染分裂细胞。逆转录病毒是RNA病毒，因此病毒基因组是RNA。当用逆转录病毒感染宿主细胞时，基因组RNA被逆转录成DNA中间体，所述中间体非常有效地整合到被感染细胞的染色体DNA中。这种整合的DNA中间体称为原病毒。原病毒的转录和组装成感染性病毒在存在适当的辅助病毒的情况下发生或在含有适当序列的细胞系中发生，所述适当序列允许在不同时产生污染性辅助病毒的情况下进行包封。如果通过与适当的载体共转染来提供用于包封的序列，则重组逆转录病毒的产生不需要辅助病毒。
逆转录病毒基因组和原病毒DNA具有三个基因：gag、pol和env，它们侧接两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白，并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。pol基因编码多种产物，所述产物包括将病毒RNA转录成双链DNA的RNA指导的DNA聚合酶逆转录酶、将逆转录酶产生的DNA整合到宿主染色体DNA中的整合酶，以及用于加工所编码的gag和pol基因的蛋白酶。5'和3'LTR用于促进病毒体RNA的转录和多腺苷酸化。LTR含有病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。
逆转录病毒载体描述于Coffin等人,Retroviruses,Cold Spring HarborLaboratory Press(1997)中。示例性逆转录病毒是莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)或鼠干细胞病毒(MSCV)。逆转录病毒载体可能是有复制能力的或复制缺陷型的。通常，逆转录病毒载体是复制缺陷型的，其中另外轮次的病毒复制和包装所需的基因编码区是缺失的或被其他基因替代。因此，一旦初始靶细胞被感染，病毒就无法继续其典型的裂解途径。此类逆转录病毒载体和产生此类病毒的必需试剂(例如，包装细胞系)是可商购获得的(参见例如，可从Clontech获得的逆转录病毒载体和系统，如目录号634401、631503、631501等，Clontech，山景城，加利福尼亚州)。
此类逆转录病毒载体可以通过用待递送的核酸分子替代复制所需的病毒基因作为递送剂来产生。所得的基因组在每端都含有LTR，之间具有一个或多个所需基因。产生逆转录病毒的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，WO 1995/26411)。逆转录病毒载体可以在含有一种或多种辅助质粒的包装细胞系中产生。包装细胞系提供载体的衣壳产生和病毒体成熟所需的病毒蛋白(例如，gag、pol和env基因)。典型地，使用至少两个单独辅助质粒(单独含有gag和pol基因；以及env基因)，使得不会发生载体质粒之间的重组。例如，可以使用标准的转染方法(如磷酸钙介导的转染)，将逆转录病毒载体转移到包装细胞系中。包装细胞系是本领域技术人员熟知的，并且是可商购获得的。示例性包装细胞系是GP2-293包装细胞系(目录号631505、631507、631512，Clontech)。在足以进行病毒体产生的时间后，收获病毒。如果需要，收获的病毒可用于感染第二包装细胞系，例如以产生具有不同宿主嗜性的病毒。最终结果是无复制能力的重组逆转录病毒，所述重组逆转录病毒包括目的核酸，但缺乏其他结构基因，使得不能在宿主细胞中形成新病毒。
说明逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的参考文献包括：Clowes等人,Clin.Invest.1994；93:644-651；Kiem等人,Blood 1994；83:1467-1473；Salmons和Gunzberg,Human Gene Therapy 1993；4:129 141；Grossman和Wilson,Curr.Opin.inGenetics and Devel.1993；3:110-114；Sheridan,Nature Biotechnology 2011；29:121；Cassani等人,Blood2009；114:3546-3556。
d.慢病毒载体
慢病毒是逆转录病毒的一个亚类。示例性慢病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。与其他逆转录病毒不同，慢病毒能够整合到非分裂细胞的基因组中。因此，例如，已经报道慢病毒载体高效且永久地将基因递送到原代肝细胞，整合到非分裂原代肝细胞的基因组中(Lewis和Emerman,J.Virol.1994；68:510-6)。慢病毒载体也不会受到与MMLV逆转录病毒载体相同的转录沉默机制。慢病毒与其他逆转录病毒的不同之处在于，它们具有包含在几种病毒体蛋白(如基质或VPR)中的亲核决定簇，所述亲核决定簇与核输入机构相互作用并且介导病毒预整合复合物通过核孔的主动转运。因此，慢病毒整合到宿主细胞的基因组中并不依赖于细胞分裂。
与其他逆转录病毒类似，慢病毒含有gag、pol和env基因，它们是编码病毒蛋白的主要基因。此外，还存在在合成调节、病毒RNA加工和其他复制功能中涉及的其他附加基因(例如，HIV中的Tat和Rev)。这些侧接两个长末端重复(LTR)序列。复制周期是通过病毒糖蛋白与宿主细胞受体结合、膜融合以及病毒进入细胞中来启动的。进入后，病毒脱壳并且发生逆转录，导致整合前复合物(PIC)的形成。其他附加基因在PIC的形成以及慢病毒经由PIC通过核包膜主动进入细胞核来感染非分裂细胞的能力方面发挥作用。一旦原病毒进入核包膜，它就会将其自身整合到宿主基因组中。
示例性慢病毒载体基于HIV-1、HIV-2、SIV或FIV。为了产生安全的慢病毒载体，产生含有几种质粒载体的包装细胞系，例如四质粒载体系统。例如，第一质粒含有缺失的附加蛋白(例如，tat、brf、vpr和nef)，使得其仅含有启动子、gag和pol以及允许转录的病毒RNA掺入新病毒组装中的Psi包装序列；第二质粒含有逆转录酶；第三质粒含有被水疱性口炎病毒包膜蛋白(VSV-G)替代的env基因；并且第四质粒是通过用待递送的核酸分子替代复制所需的病毒基因获得的目的载体。
此类慢病毒载体以及产生慢病毒的系统和方法是本领域已知的(参见例如，Buchshacher和Wong-Staal,Blood 2000；95:2499-2504；Blomer等人,J.Virol.1997；71:6641-9；Choi等人,Stem Cells 2001；19:236-46；美国专利号6,218,186)。慢病毒载体是复制缺陷型的，并且不含复制所需的基因。为了产生慢病毒，将几种包装质粒转染到包装细胞系中，所述包装细胞系通常是HEK 293的衍生物或其他类似细胞系(例如，293FT细胞，目录号R700-07，Invitrogen，Life Technologies，卡尔斯巴德，加利福尼亚州；293LTV细胞系，目录号LTV-100，Cell Biolabs,Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州；Lenti Pac 293Ta细胞系，目录号CLV-PK-01，GeneCo poeia，罗克维尔，马里兰州)。包装质粒单独编码病毒体蛋白(例如，衣壳和逆转录酶)和待由所述载体递送的核酸分子(可以将其转染到包装细胞系中)。转录单链RNA病毒基因组，将其包装到病毒体中。产生慢病毒载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如，Naldine等人,Science 1996；272:263-267)。慢病毒载体和用于产生病毒的系统是可商购获得的(参见例如，慢病毒表达载体如pSMPUW慢病毒载体及其衍生物，以及慢病毒表达和包装系统，可从Cell Biolabs,Inc.获得)。
慢病毒载体已经用于基因疗法应用中(参见例如，Manilla等人,Human GeneTherapy 2005；16:17-25；Sheridan,Nature Biotechnology 2011；29:121)。特别地，慢病毒载体已经用于递送短干扰RNA(siRNA)(Sachdeva等人,Journal of MedicalVirology2007；79:118-26)。
C.冷冻保存和储存
在一些方面，本文提供了一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及2)将多核苷酸引入所述复层表皮的细胞中以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。在一些方面，本文提供了一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及2)将包含多核苷酸的病毒载体转染到所述复层表皮的细胞中以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括冷冻保存和储存包含复层表皮的皮肤替代物的方法，所述复层表皮的细胞产生(例如，分泌)生长因子和胰岛素。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括在冷冻保存和储存之前对皮肤替代物进行质量控制评估的方法。
在一些实施方案中，将包含复层表皮的皮肤替代物冷冻保存。在一些实施方案中，在冷冻保存之前，将包含复层表皮的皮肤替代物用冷冻保护剂配制。在一些实施方案中，冷冻保护剂包含白蛋白和单糖。在一些实施方案中，冷冻保护剂包含人白蛋白和葡萄糖，例如D-葡萄糖。在一些实施方案中，冷冻保护剂不包含DMSO。
在一些实施方案中，在用冷冻保护剂配制包含复层表皮的皮肤替代物之前进行质量控制评估。质量控制评估可以包括但不限于某些蛋白质(例如，表皮分化的标记物)的鉴定和/或检测、效力评估和纯度评估。质量控制评估可以进一步包括无菌性和安全性的评估。
在一些实施方案中，质量控制评估包括鉴定和/或检测与用于转导的载体的病毒基因组相关的基因。在一些实施方案中，质量控制评估包括鉴定和/或检测与腺病毒载体相关的基因。在一些实施方案中，鉴定和/或检测腺病毒基因以区分无复制能力的病毒与有复制能力的病毒。在一些实施方案中，质量控制评估包括鉴定和/或检测腺病毒基因E1、E4的水平。在一些实施方案中，质量控制评估包括使用本领域技术人员已知的方法(如通过PCR(例如，qPCR)和/或免疫组织化学)，鉴定和/或检测与皮肤替代物相关的分子(例如，重组生长因子、重组胰岛素、丝聚蛋白、层粘连蛋白和转谷氨酰胺酶)的水平。
在一些实施方案中，质量控制评估包括检测从皮肤替代物分泌的分子，例如重组生长因子和C肽，如通过使用ELISA来检测。在一些实施方案中，质量控制评估包括评价从皮肤替代物分泌的重组生长因子和重组胰岛素的效力，如通过使用血管生成测定(例如，内皮管形成测定)来评价。在一些实施方案中，质量控制评估包括使用本领域技术人员已知的方法评估纯度，例如牛胶原的纯度。在一些实施方案中，质量控制评估包括评估无菌性，如通过使用本领域技术人员已知的方法(例如，PCR)检测内毒素。在一些实施方案中，使如本文所提供的皮肤替代物的所有组分经历感染原的筛选。在一些实施方案中，针对致瘤性和染色体异常筛选角质形成细胞(例如，HaCaT)主细胞库。
在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物的包装和储存包括使用敷料，例如吸收性材料如脱脂纱布，其中将冷冻保存的皮肤替代物覆盖在敷料上。在一些实施方案中，覆盖在敷料(例如，纱布)上的冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是约30-55cm2、约30-50cm2、约35-45cm2、约40-50cm2、约40-45cm2、或约45-50cm2。在一些实施方案中，覆盖在敷料(例如，纱布)上的冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是为或约30cm2、为或约31cm2、为或约32cm2、为或约33cm2、为或约34cm2、为或约35cm2、为或约36cm2、为或约37cm2、为或约38cm2、为或约39cm2、为或约40cm2、为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、或为或约50cm2。
在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物的包装或储存包括使用脱脂纱布，例如其中将冷冻保存的皮肤替代物覆盖在脱脂纱布上。在一些实施方案中，敷料包括脱脂纱布。在一些实施方案中，脱脂纱布是凡士林矿脂纱布。在一些实施方案中，皮肤替代物置于在其上的敷料(例如，纱布)的尺寸是约40-60cm2、约45-60cm2、约45-55cm2、或约50-60cm2。在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物置于其上的敷料(例如，纱布)的尺寸是为或约40cm2、为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、为或约50cm2、为或约51cm2、为或约52cm2、为或约53cm2、为或约54cm2、为或约55cm2、为或约56cm2、为或约57cm2、为或约58cm2、为或约59cm2、或为或约60cm2。
在一些实施方案中，敷料(例如，脱脂纱布)的尺寸与覆盖在所述敷料上的冷冻保存的皮肤替代物的尺寸的比率是约1:1至约1.5:1。在一些实施方案中，敷料(例如，脱脂纱布)的尺寸与覆盖在所述敷料上的冷冻保存的皮肤替代物的尺寸的比率是约1:1、约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、或约1.5:1。
在一些实施方案中，将冷冻保存的皮肤替代物包装或储存在容器中。在一些实施方案中，将覆盖在无菌敷料上的冷冻保存的皮肤替代物包装或储存在容器中。在一些实施方案中，容器是无菌的。在一些实施方案中，容器是使用热密封的，例如是可热封的或热封的。在一些实施方案中，容器是无菌的且可热封的或热封的。在一些实施方案中，容器是透明的。在一些实施方案中，容器包括聚酯树脂。在一些实施方案中，容器是袋。在一些实施方案中，将皮肤替代物包装或储存在由包装封闭的容器中。在一些实施方案中，容器和包装中的一者或两者是无菌和/或可热封的。在一些实施方案中，可以将冷冻保存的皮肤替代物(任选地储存于容器中)储存在约-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、或-80℃下。
在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物可以储存长达约六个月。在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物可以储存长达六个月并且保留提供(例如，分泌)有效量的重组生长因子和重组胰岛素的功能。在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物可以储存长达五个月并且保留提供(例如，分泌)有效量的重组生长因子和重组胰岛素的功能。在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物可以储存长达四个月并且保留提供(例如，分泌)有效量的重组生长因子和重组胰岛素的功能。在一些实施方案中，冷冻保存的皮肤替代物可以储存长达三个月并且保留提供(例如，分泌)有效量的重组生长因子和重组胰岛素的功能。
IV.使用皮肤替代物的方法
在一些方面，本文提供了使用包含复层表皮的皮肤替代物的方法，所述复层表皮的细胞产生(例如，分泌)生长激素和胰岛素或其变体。在一些实施方案中，可以将本文提供的皮肤替代物施加至受试者(例如，人受试者)，以改善伤口的状况和/或促进伤口愈合。在一些实施方案中，可以将本文提供的皮肤替代物施加至糖尿病受试者，以促进伤口愈合和/或预防伤口的微生物感染。
A.晚期糖基化终末产物
在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以用于改善涉及晚期糖基化终末产物(AGE)的病症，如伤口愈合受损或延长。动物(即人)的血液和细胞内环境中的还原糖(例如，葡萄糖)的浓度升高通常导致糖基化和脱水缩合复合物AGE的非酶促形成。AGE复合产物在游离氨基上、在蛋白质上、在脂质上和在DNA上形成(Bucala和Cerami,AdvPharmacol 1992；23:1-34；Bucala等人,Proc Natl Acad Sci 1993；90:6434-6438；Bucala等人,Proc Natl.Acad Sci 1984；81:105-109)。在一个例子中，糖尿病患者的AGE水平由于持续的高血糖水平而显著增加，并且通常通过各种机制(包括组织蛋白质结构和功能的改变、通过AGE特异性受体刺激细胞反应和/或活性氧(ROS)的产生)导致组织损伤(Boel等人,J Diabetes Complications 1995；9:104-29)。已经证明AGE会在患有糖尿病且经历伤口(如切口、割伤、烧伤、疮、溃疡、脓肿和/或任何其他形式的身体损伤)的患者中引起并发症。在一些实施方案中，可从如本文提供的皮肤替代物分泌的生长因子和胰岛素可以在不影响全身葡萄糖水平的情况下促进血管生成并减少受试者皮肤中AGE的量。
AGE的积累可能导致皮肤功能低下，尤其在它与糖尿病患者的伤口愈合相关时(Putte等人,Scars Burn Heal.2016；5(2):1-14)。AGE与糖尿病受试者的皮肤(Peppa等人,Diabetes 2003；52(11):2805-2813)甚至骨骼(Santana等人,Diabetes 2003；52(6):1502-10)的伤口愈合延迟或缺陷相关。在伤口愈合延迟或延长时，伤口愈合的时间(如伤口闭合所指示)在一些情况下超过在健康或非糖尿病受试者中观察到的到愈合的时间。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以将糖尿病受试者的伤口愈合时间(例如，到伤口闭合的时间)缩短到在非糖尿病受试者中实现相同效果所需的可比较的时间量。
在一些情况下，有缺陷的伤口愈合是指伤口愈合期间上皮组织中的异常，这可能包括形成瘢痕的能力降低。瘢痕形成是伤口愈合的主要部分。瘢痕是在伤口愈合过程期间形成的替代在伤口形成之前存在的正常皮肤的纤维组织区域。相对于正常皮肤，瘢痕展现出改变的细胞外基质，并且弹性蛋白纤维水平降低。在健康皮肤上，几乎每个伤口都会导致一定程度的瘢痕形成。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以诱导瘢痕形成，从而促进伤口愈合过程。
伤口可以描述为急性的或慢性的。急性伤口通常是突然发生而不是随着时间的推移发生的皮肤损伤(例如，手术伤口或创伤性伤口)的结果。在正常受试者中，急性伤口通常以符合正常伤口愈合过程的可预测的预期速率愈合。相比之下，慢性伤口是未能以有序且及时的方式进展经过伤口愈合阶段(例如，在30天内未显示朝向愈合的显著进展)的伤口。在一些实施方案中，可以将如本文提供的皮肤替代物施加至急性伤口。在一些实施方案中，可以将如本文提供的皮肤替代物施加至慢性伤口。慢性伤口的非限制性例子包括静脉溃疡、糖尿病足溃疡和压疮。非愈合伤口是一项重大的医疗保健负担。非愈合伤口可能导致住院时间延长、生活质量下降、死亡风险增加、需要截肢、以及出院后入住长期护理机构的可能性增加。
B.糖尿病足伤口和感染
糖尿病足伤口(包括溃疡、疮、病变和/或脓肿)源于糖尿病的两种常见并发症，即周围神经病和血管功能不全。糖尿病足疾病(下文称为糖尿病足)是一种发病率高的病症，其部分由于频繁住院、住院时间延长和截肢而对患者的生活质量产生负面影响(Alosaimi等人,Journal of Foot and Ankle Research 2019；12:57)。据估计，十分之一被诊断患有2型糖尿病的人有足部病变的风险因素(Boulton等人,Lancet 2005；366(9498):1719-24)。
所有糖尿病患者中约15％至25％将在疾病过程期间出现足部或腿部溃疡(Boulton等人,Lancet 2005；366(9498):1719-24；以及Pinzur和Dart,Foot AnkleClin.2001；6(2):205-142005)。风险因素包括长期糖尿病(>10年)、年龄(>50岁)、溃疡或截肢史、神经病、关节病或血管疾病的存在、其他糖尿病并发症的存在、患者的社会经济地位低下和/或社会隔离、饮食不良、缺乏足部护理教育以及与血管疾病相关的其他风险因素(Nongmaithem等人,J Family Med Prim Care 2016；5(2):399-403)。
糖尿病足诊断具有受伤和/或截肢的风险。伤口或病变尤其威胁到高风险患者，包括吸烟者和患有既往下肢血管并发症的患者。糖尿病足的早期检测是通过足部检查(包括使用单丝、触诊、视觉和灵敏度检查)进行的。如果预防措施失败并且发生损伤或确认为高风险足，则应当进行多学科管理，特别是在另一肢端有溃疡或截肢史的那些病例中。
瓦格纳分类(将病变按0至5的量表分级，其中5指示最严重的疾病)广泛用于确定针对神经性糖尿病足的管理策略。治疗的主要目标是伤口闭合。如果需要，初级不太严重水平的管理可能包括休息、足部抬高和口服抗生素疗法。如果没有观察到对这些措施的反应，则应将患者转介到更积极的干预措施中。建议具有对初始治疗无反应和/或呈现严重(高级别)伤口和/或感染的病变的受试者进行手术干预和/或静脉内抗生素疗法(Frykberg,AmFam Physician.2002；66(9):1655-1663)。
表1瓦格纳糖尿病足溃疡级别分类系统
*来自Frykberg,Am Fam Physician.2002；66(9):1655-1663
当前可用的皮肤替代物或皮肤等效物具有多种不同的组成(例如，角质形成细胞干细胞、正常永生化角质形成细胞(NIKS)和/或人成纤维细胞)和结构(例如，包含呈表皮层形式的结构的组合物或包含呈真皮层和表皮层形式的结构的组合物)。这些皮肤替代物可以分泌一系列不同的分子，例如生长因子、胶原和/或细胞外基质蛋白。例如，和是FDA批准用于治疗糖尿病患者伤口(例如，糖尿病足溃疡和/或下肢静脉溃疡)的皮肤替代物。然而，当前可用的皮肤替代物存在许多局限性，包括需要几次敷用以及高成本。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以用仅一次敷用将糖尿病受试者的伤口愈合时间缩短到在非糖尿病受试者中实现相同效果所需的可比较的时间量。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以用仅两次敷用将糖尿病受试者的伤口愈合时间缩短到在非糖尿病受试者中实现相同效果所需的可比较的时间量。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以用仅三次敷用将糖尿病受试者的伤口愈合时间缩短到在非糖尿病受试者中实现相同效果所需的可比较的时间量。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以用仅四次敷用将糖尿病受试者的伤口愈合时间缩短到在非糖尿病受试者中实现相同效果所需的可比较的时间量。
在一些实施方案中，将如本文提供的皮肤替代物施加至受试者的皮肤或伤口。在一些实施方案中，将如本文提供的覆盖在吸收性敷料(例如，纱布)的皮肤替代物施加至受试者的皮肤或伤口。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以每10天更换一次、每11天更换一次、每12天更换一次、每13天更换一次、每14天更换一次、每15天更换一次、每16天更换一次、每17天更换一次、每18天更换一次、每19天更换一次、每20天更换一次、或每21天更换一次。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以保持施加至受试者，不作更换且不受干扰持续至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、或至少21天。
在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可以提供重组生长因子和重组胰岛素的持续释放。在一些实施方案中，重组生长因子和重组胰岛素从如本文提供的皮肤替代物的持续释放持续长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。在一些实施方案中，重组生长因子和重组胰岛素从如本文提供的皮肤替代物持续释放持续长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
皮肤的微生物群系由各种病毒、细菌和真菌构成，并且糖尿病受试者的伤口特别易于感染。仅仅存在微生物并不指示感染。感染必须通过全身体征(例如，发烧、寒战和白细胞增多)、脓液或分泌物、或局部炎症症状(例如，发热、发红、疼痛或压痛、和硬结)的存在在临床上诊断。
慢性伤口还可能展现出愈合延迟、着色异常、脆性或恶臭，使感染的诊断复杂化。在首次出现足部问题以及全身感染或代谢障碍的证据时，应怀疑感染。血管异常(包括周围神经病或缺血)可能掩盖或模拟炎症(Lipsky,Clinical Infectious Diseases2004；39:S104-14)。有趣的是，在糖尿病足感染中很少报道全身性毒性的体征，例如脓毒症、全身炎症反应综合征(SIRS)或多器官功能障碍综合征(MODS)。然而，在例如SIRS明显时，糖尿病足感染有更高可能性变得不仅危及肢体，而且危及生命(Lin等人,J.Clin.Med.2019；8(10):1538)。应积极追查疑似感染，特别是考虑到严重程度可能多快地升高，有时在几个小时内发生。
在一个例子中，糖尿病足伤口可能导致范围为浅表到严重的感染，其中感染扩散到皮肤和/或骨骼的更深层。感染是手术干预(可能包括保留足部的小手术，或大手术如截肢)的风险因素。据估计，60％的截肢发生在感染性足溃疡之前(Lipsky,ClinicalInfectious Diseases 2004；39:S104-14)。鉴于对患者的严重后果，预防感染的方法至关重要。此外，预防时避免对抗生素疗法的需求，这可能是昂贵的，并且对患者产生有害的脱靶效应。
在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防微生物感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防细菌感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防病毒感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防受试者的一个或多个伤口的微生物感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防受试者的一个或多个伤口的细菌感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防受试者的一个或多个伤口的病毒感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防糖尿病受试者的一个或多个伤口的微生物感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防糖尿病受试者的一个或多个伤口的细菌感染。在一些实施方案中，如本文提供的皮肤替代物可用于预防糖尿病受试者的一个或多个伤口的病毒感染。
V.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种皮肤替代物，所述皮肤替代物包含含有基底层、棘层、颗粒层和角化层的复层表皮，其中所述复层表皮的细胞表达重组生长因子和重组胰岛素。
2.根据实施方案1所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子和所述重组胰岛素可从所述复层表皮的细胞分泌。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮为100-200μm厚。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的表达所述重组生长因子和所述重组胰岛素的细胞包括所述基底层的细胞。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素是或包括重组人胰岛素。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列；(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％、或至少95％序列同一性的序列；或(iii)(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素由多核苷酸编码，所述多核苷酸编码(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素是AspB10胰岛素类似物，与SEQ ID NO:5中所示的野生型胰岛素相比，所述AspB10胰岛素类似物包含经修饰的人胰岛素原的B链中位置10处的组氨酸到天冬氨酸的突变。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含编码胰岛素原的多核苷酸，所述胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点或内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
10.根据实施方案9所述的皮肤替代物，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点和内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
11.根据实施方案9或实施方案10所述的皮肤替代物，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。
12.根据实施方案9-11中任一项所述的皮肤替代物，其中所述至少一个弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)或RQKR(SEQ ID NO:42)。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列；(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％、或至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
14.根据实施方案1-13中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素包含SEQID NO:6中所示的序列；或(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素包含SEQID NO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组人胰岛素由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素包含SEQID NO:2中所示的序列。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子选自表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、及其任何异形体或可变剪接变体。
19.根据实施方案1-5中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子是VEGF或其异形体或可变剪接变体。
20.根据实施方案19所述的皮肤替代物，其中所述VEGF由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性。
21.根据实施方案19或实施方案20所述的皮肤替代物，其中所述VEGF由包含SEQID NO:4中所示的序列的多核苷酸序列编码。
22.根据实施方案19-21中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含与SEQ IDNO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
23.根据实施方案19-22中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含SEQ IDNO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列。
24.根据实施方案19-23中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含与SEQ IDNO:44中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
25.根据实施方案19-24中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含SEQ IDNO:44中所示的序列。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子和所述重组胰岛素由双顺反子表达盒编码，所述双顺反子表达盒包含编码所述重组生长因子的多核苷酸和编码重组胰岛素的多核苷酸，由双顺反子元件分开。
27.根据实施方案26所述的皮肤替代物，其中所述双顺反子元件是IRES。
28.根据实施方案1-27中任一项所述的皮肤替代物，其中编码所述重组生长因子和所述重组胰岛素的多核苷酸与启动子可操作地连接。
29.根据实施方案28所述的皮肤替代物，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
30.根据实施方案28或实施方案29所述的皮肤替代物，其中所述启动子是CAG启动子。
31.根据实施方案26-30中任一项所述的皮肤替代物，其中在所述双顺反子表达盒中，编码所述重组生长因子的所述多核苷酸位于编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸的上游。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞以如下水平分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素，所述水平导致血管生成重组的一种或多种标记物相对于仅包含所述重组生长因子或重组胰岛素的皮肤替代物更大的改善，任选地如在管形成测定中评价的。
33.根据实施方案32所述的皮肤替代物，其中血管生成重组的所述标记物是节点或联接头的数量的增加，所述节点或联接头定义为至少三条弦带的连结位点。
34.根据实施方案32所述的皮肤替代物，其中血管生成重组的所述标记物是网的数量的增加，所述网定义为由两个或更多个节点包围的闭合回路。
35.根据实施方案32所述的皮肤替代物，其中血管生成重组的所述标记物是主节段的数量的增加，所述主节段定义为将两个节点连结在一起的弦带。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞连续分泌可定量水平的所述重组生长因子和所述重组胰岛素。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞连续分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素持续长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。
38.根据实施方案1-37中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞连续分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素持续长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
39.根据实施方案1-38中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞分泌可定量水平的所述重组生长因子和C肽，所述可定量水平的重组生长因子和C肽可以被检测到长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。
40.根据实施方案1-39中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞分泌可定量水平的所述重组生长因子和C肽，所述可定量水平的重组生长因子和C肽可以被检测到长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
41.根据实施方案1-40中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞以如下水平分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素，所述水平降低受试者的皮肤中晚期糖基化终末产物(AGE)的水平。
42.根据实施方案1-41中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞是从角质形成细胞分化的。
43.根据实施方案42所述的皮肤替代物，其中所述角质形成细胞是人角质形成细胞。
44.根据实施方案42或实施方案43所述的皮肤替代物，其中所述角质形成细胞是HaCaT角质形成细胞。
45.一种双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含编码重组人生长因子和重组胰岛素的多核苷酸。
46.根据实施方案45所述的双顺反子表达盒，其中所述重组胰岛素是或包括重组人胰岛素。
47.根据实施方案45或实施方案46所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
48.根据实施方案45-47中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸包含(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
49.根据实施方案45-48中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素是AspB10胰岛素类似物，与SEQ ID NO:5中所示的野生型胰岛素相比，所述AspB10胰岛素类似物包含经修饰的人胰岛素原的B链中位置10处的组氨酸到天冬氨酸的突变。
50.根据实施方案45-49中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸编码胰岛素原，所述胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点或内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
51.根据实施方案50所述的双顺反子表达盒，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点和内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
52.根据实施方案50或实施方案51所述的双顺反子表达盒，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。
53.根据实施方案50-52中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所述至少一个弗林蛋白酶切割位点是RTKR(SEQ ID NO:10)或RQKR(SEQ ID NO:42)。
54.根据实施方案45-53中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
55.根据实施方案45-54中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素包含SEQ ID NO:6中所示的序列。
56.根据实施方案45-55中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码重组胰岛素的多核苷酸包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
57.根据实施方案45-56中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码重组胰岛素的多核苷酸包含SEQ ID NO:2中所示的序列。
58.根据实施方案45-57中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组生长因子选自表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、及其任何异形体或可变剪接变体。
59.根据实施方案45-58中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所述重组生长因子是VEGF或其异形体或可变剪接变体。
60.根据实施方案59中所述的双顺反子表达盒，其中编码所述生长因子的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
61.根据实施方案59或实施方案60所述的双顺反子表达盒，其中编码所述生长因子的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:4中所示的序列。
62.根据实施方案59-61中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含与SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
63.根据实施方案59-62中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列。
64.根据实施方案59-63中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含与SEQ ID NO:44中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
65.根据实施方案59-64中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含SEQ ID NO:44中所示的序列。
66.根据实施方案中45-65中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组生长因子的所述多核苷酸和编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸由双顺反子元件分开。
67.根据实施方案66所述的双顺反子表达盒，其中所述双顺反子元件是IRES。
68.根据实施方案45-67中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组生长因子和所述重组胰岛素的多核苷酸与启动子可操作地连接。
69.根据实施方案68所述的双顺反子表达盒，其中所述启动子是相同的。
70.根据实施方案68或实施方案69所述的双顺反子表达盒，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
71.根据实施方案68-70中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所述启动子是CAG启动子。
72.根据实施方案68-71中任一项所述的双顺反子表达盒，其中在所述双顺反子表达盒中，编码所述重组生长因子的所述多核苷酸位于编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸的上游。
73.一种载体，所述载体包含根据实施方案45-72中任一项所述的双顺反子表达盒。
74.根据实施方案73所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
75.根据实施方案74所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
76.根据实施方案73-75中任一项所述的载体，其中所述载体是非复制型5型腺病毒。
77.根据实施方案73-76中任一项所述的载体，其中所述非复制型腺病毒缺乏E1和E3区或在所述区域中缺失。
78.根据实施方案73-77中任一项所述的载体，其中将所述双顺反子表达盒插入所述E1区中。
79.一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：
1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及
2)将根据实施方案45-72中任一项所述的双顺反子表达盒或根据实施方案73-78中任一项所述的载体引入所述复层表皮的细胞中，以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含重组生长因子和重组胰岛素。
80.根据实施方案79所述的方法，其中所述引入是通过根据实施方案73-78中任一项所述的病毒载体的转导进行的。
81.一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：
1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及
2)将根据实施方案73-78中任一项所述的病毒载体转导到所述复层表皮的细胞中，以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。
82.一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：
1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及
2)用编码经修饰的胰岛素原和生长因子的腺病毒载体转导所述复层表皮的细胞以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。
83.根据实施方案79-81中任一项所述的方法，其中在所述引入或转导时，所述复层表皮的细胞表达闭合蛋白和密封蛋白。
84.根据实施方案79-83中任一项所述的方法，其中对所述基底层的细胞进行引入或转导。
85.根据实施方案79-84中任一项所述的方法，其中在步骤1)中的所述分化之前，所述方法包括将所述角质形成细胞在低钙培养基中培养2周、3周、4周、5周、或6周，任选地为或约4周。
86.根据实施方案85所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为0.01-0.1mM的钙。
87.根据实施方案85或实施方案86中任一项所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为至多或约0.05mM的钙。
88.根据实施方案85-87中任一项所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为约0.03mM的钙。
89.根据实施方案85-88中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基进一步包含表皮生长因子(EGF)和牛垂体提取物(BPE)。
90.根据实施方案89所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含从0.05ng/mL至1ng/ml EGF以及从1μg/ml至100μg/ml BPE。
91.根据实施方案89或实施方案90所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含为或约0.2ng/ml EGF以及为或约30μg/ml BPE。
92.根据实施方案79-91中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞是人角质形成细胞。
93.根据实施方案79-92中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞是HaCaT角质形成细胞。
94.根据实施方案79-93中任一项所述的方法，其中步骤1)包括将所述角质形成细胞在细胞外基质底物上培养。
95.根据实施方案94所述的方法，其中所述细胞外基质底物是胶原。
96.根据实施方案94或实施方案95所述的方法，其中所述细胞外基质底物是经人用认证的。
97.根据实施方案94-96中任一项所述的方法，其中将所述角质形成细胞以在5x106个细胞/mL与50x 106个细胞/mL之间的细胞密度接种在所述细胞外基质底物上。
98.根据实施方案97所述的方法，其中所述细胞密度是为或约10x 106个细胞/ml、20x 106个细胞/ml、30x 106个细胞/ml或40x 106个细胞/ml、或前述任何值之间的任何值。
99.根据实施方案97或实施方案98所述的方法，其中所述细胞密度是为或约20x106个细胞/ml。
100.根据实施方案94-99中任一项所述的方法，其中将所述细胞外基质底物包被在transwell小室上。
101.根据实施方案94-99中任一项所述的方法，其中步骤(1)中的所述培养持续约23至28天。
102.根据实施方案94-100中任一项所述的方法，其中步骤(1)中的所述培养包括在低钙培养基中的第一孵育和在高钙培养基中的第二孵育。
103.根据实施方案101所述的方法，其中在低钙培养基中的所述第一孵育持续约3-5天，并且在高钙培养基中的所述第二孵育持续约20-23天。
104.根据实施方案102或实施方案103所述的方法，其中所述低钙培养基包含0.01-0.1mM钙。
105.根据实施方案102-104中任一项所述的方法，其中所述高钙培养基包含1.0-3.0mM。
106.根据实施方案102-105中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基包含0.03mM钙，并且所述高钙培养基包含2.4mM钙。
107.根据实施方案101-106中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基和所述高钙培养基进一步包含EGF和BPE。
108.根据实施方案107所述的方法，其中所述低钙培养基和所述高钙培养基包含0.05ng/mL至1ng/ml EGF和从1μg/ml至100μg/ml BPE。
109.根据实施方案107或实施方案108中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基和所述高钙培养基包含为或约0.2ng/ml EGF以及为或约30μg/ml BPE。
110.根据实施方案102-109中任一项所述的方法，其中所述高钙培养基进一步包含氢化可的松。
111.根据实施方案110所述的方法，其中所述高钙培养基包含从0.1至1.0μg/ml氢化可的松。
112.根据实施方案110或实施方案111所述的方法，其中所述高钙培养基包含为或约0.4μg/ml氢化可的松。
113.根据实施方案85-112中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基是无血清培养基。
114.根据实施方案102-113中任一项所述的方法，其中所述高钙培养基是无血清培养基。
115.根据实施方案102-114中任一项所述的方法，其中在所述第二孵育期间，在将所述角质形成细胞在所述高钙培养基中培养时引入气液界面，其中使所述基底层的细胞暴露于所述高培养基但不暴露于气态环境。
116.根据实施方案102-114中任一项所述的方法，其中在所述第一孵育期间，每天更换所述低钙培养基。
117.根据实施方案102-116中任一项所述的方法，其中在所述第二孵育期间，每天更换所述高钙培养基。
118.根据实施方案79-117中任一项所述的方法，其中在步骤2)之后，所述方法进一步包括将所述皮肤替代物用冷冻保护剂配制。
119.根据实施方案118所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含人白蛋白和葡萄糖。
120.根据实施方案79-119中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤2)之后冷冻所述皮肤替代物。
121.根据实施方案79-120中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对所述皮肤替代物进行质量控制评估，任选地其中在将所述皮肤替代物用所述冷冻保护剂配制之前进行所述质量控制评估。
122.根据实施方案121所述的方法，其中在步骤2)完成与所述质量控制步骤之间经过长达或约24小时。
123.根据实施方案121或实施方案122所述的方法，其中所述质量控制步骤包括检测选自以下的一种或多种多肽：胰岛素原、经修饰的胰岛素原、胰岛素、胰岛素变体、生长因子及其变体。
124.根据实施方案79-123中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述皮肤替代物置于脱脂纱布上。
125.根据实施方案79-124中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞包括永生化角质形成细胞。
126.根据实施方案79-125中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞包括来自HaCaT细胞系、NM1细胞系或NIKS细胞系的细胞，和/或源自所述HaCaT细胞系、NM1细胞系或NIKS细胞系的细胞。
127.一种通过根据实施方案79-126中任一项所述的方法中的任一种产生的皮肤替代物。
128.一种冷冻保存的皮肤替代物，所述冷冻保存的皮肤替代物包含根据实施方案1-44或实施方案127中任一项所述的皮肤替代物以及冷冻保护剂。
129.根据实施方案128所述的冷冻保存的皮肤替代物，其中所述冷冻保护剂包含人白蛋白(0.02g/mL)和D-葡萄糖(0.09g/mL)。
130.一种皮肤替代物敷料，所述皮肤替代物敷料包含根据实施方案1-44或实施方案127中任一项所述的皮肤替代物或根据实施方案128或实施方案129所述的冷冻保存的皮肤替代物以及脱脂纱布，其中将所述冷冻保存的皮肤替代物覆盖在所述脱脂纱布上。
131.根据实施方案130所述的皮肤替代物敷料，其中所述脱脂纱布是凡士林矿脂纱布。
132.根据实施方案130或实施方案131所述的皮肤替代物敷料，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是约40-50cm2、约40-45cm2、或约45-50cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约40-60cm2、约45-60cm2、约45-55cm2。
133.根据实施方案130或实施方案131所述的皮肤替代物敷料，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、为或约50cm2、为或约51cm2、为或约52cm2、为或约53cm2。
134.根据实施方案1-44或127中任一项所述的皮肤替代物、根据实施方案128或实施方案129所述的冷冻保存的皮肤替代物或根据实施方案130-133中任一项所述的皮肤替代物敷料，所述皮肤替代物、所述冷冻保存的皮肤替代物或所述皮肤替代物敷料是无菌的。
135.一种容器，所述容器包含根据实施方案1-44或127中任一项所述的皮肤替代物、根据实施方案127或实施方案128所述的冷冻保存的皮肤替代物或根据实施方案130-134中任一项所述的皮肤替代物敷料。
136.根据实施方案135所述的容器，其中所述容器是袋。
137.根据实施方案135或实施方案136所述的容器，其中所述容器是无菌的和/或热封的。
138.一种包装，所述包装包含根据实施方案135-137中任一项所述的容器，其中所述包装是袋。
139.根据实施方案138所述的包装，其中所述包装是无菌的和/或热封的。
140.一种用于制备皮肤替代物敷料的方法，所述方法包括将根据实施方案1-44或127中任一项所述的皮肤替代物或根据实施方案128或129所述的冷冻保存的皮肤替代物置于脱脂纱布上。
141.根据实施方案140所述的方法，其中所述脱脂纱布是凡士林矿脂纱布。
142.根据实施方案140或实施方案141所述的方法，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是约40-50cm2、约40-45cm2、或约45-50cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约40-60cm2、约45-60cm2、约45-55cm2。
143.根据实施方案140或实施方案141所述的方法，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、为或约50cm2、为或约51cm2、为或约52cm2、为或约53cm2。
144.一种促进伤口愈合的方法，所述方法包括向伤口施加根据实施方案1-44或实施方案127中任一项所述的皮肤替代物、根据实施方案128或实施方案129所述的冷冻保存的皮肤替代物或根据实施方案130-133中任一项所述的皮肤替代物敷料。
145.根据实施方案144所述的方法，其中所述皮肤替代物预防微生物感染。
146.根据实施方案144或实施方案145所述的方法，其中将所述皮肤替代物施加到急性伤口和/或慢性伤口。
147.根据实施方案144-146中任一项所述的方法，其中所述伤口选自：疮、开放性伤口、溃疡和脓肿。
148.根据实施方案144-147中任一项所述的方法，其中将所述皮肤替代物施加到糖尿病患者的伤口。
149.根据实施方案144-148中任一项所述的方法，其中所述伤口是糖尿病溃疡。
150.根据实施方案144-149中任一项所述的方法，其中所述伤口是糖尿病足溃疡。
151.根据实施方案144-150中任一项所述的方法，其中所述伤口是下肢静脉溃疡。
VI.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：角质形成细胞向表皮的分化以及用于腺病毒转导的方法
此实施例描述了通过以下方式来产生皮肤替代物：培养来自细胞HaCaT系的人角质形成细胞(通过自发突变永生化的人角质形成细胞)并且使它们分化，直到获得所有上皮层(基底层、棘层、颗粒层和角质层)，随后用腺病毒载体转导以从分化的上皮层表达转基因。
在分化之前，将HaCaT细胞在低钙(0.03mM)培养基中保持4周，以便改变细胞特征以获得适合用5型腺病毒转导的基底层。为了分化，将HaCaT细胞接种在75mm2培养瓶中，然后一旦所述细胞达到大约80％汇合即以1:4的比例进行传代培养。将细胞在无血清且无钙的角质形成细胞培养基(ThermoFisher，目录号37010022)中培养，所述培养基通过添加钙至终浓度为0.03mM加以改良，并且补充有0.2ng/mL内皮生长因子(EGF)和30μg/mL牛垂体提取物(BPE)。
将聚酯小室(3μM孔和75mm直径)用23.5mL中和的牛胶原溶液覆盖，所述中和的牛胶原溶液含有经人用认证的牛胶原(2.5mg/mL)，已经用1M NaOH中和以达到pH7.4。将用中和的牛胶原溶液覆盖的小室在37℃下孵育45分钟。一旦胶原凝胶化，用1X PBS进行两次洗涤。在transwell小室的上方和下方添加补充有0.03mM钙、0.2ng/mL EGF和30μg/ml BPE的无血清且无钙的角质形成细胞培养基用于细胞接种。然后将培养的HaCaT细胞(20x 106)接种在低钙培养基中，每天更换所述低钙培养基持续4天。
在第5天，弃去小室上方的培养基，并且将所述低钙培养基交换为补充有0.2ng/mLEGF、30μg/mL牛垂体提取物、0.4μg/mL氢化可的松和2.4mM钙的无血清角质形成细胞培养基。引入气液界面，使得只有细胞的基底区域与培养基接触，而细胞表面的顶部暴露于空气中。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育，并且每天更换培养基持续21天。在此时间段之后，产生具有150μM厚度的完全复层表皮，如图1B中在第25天用伊红和苏木精染色所示。
增加培养基中钙的浓度(从0.01-0.1mM至2.4mM)增加了闭合蛋白和密封蛋白的存在。闭合蛋白和密封蛋白(影响横跨上皮扩散的紧密连接的主要跨膜蛋白)的表达是适当的基底-外侧转导所必需的。从第5天至第21天，皮肤替代物保持在高钙浓度中。
在第26天，用镊子将皮肤从小室脱离并且移出小室以获得皮肤替代物，之后使基底层暴露于非复制型5型腺病毒。作为转基因表达的模型，将皮肤替代物用表达GFP的非复制型5型腺病毒(Ad-CMV-GFP)转导。在用1X PBS洗涤后，在无血清培养基中进行皮肤替代物的转导。腺病毒是在37℃和5％ CO2下与皮肤替代物一起孵育后一小时之前，在角质形成细胞培养基中制备的。
用荧光显微术进行的评价表明，基底细胞对Ad-CMV-GFP转导具有渗透性，并且GFP表达共定位到皮肤替代物的基底细胞(数据未示出)。这些结果表明，皮肤替代物的基底细胞被腺病毒转导，并且皮肤替代物表皮能够产生由转导的腺病毒载体编码的蛋白质。
转导后24小时，通过以下方式来配制皮肤替代物以供包装：添加冷冻保护介质，将皮肤替代物置于凡士林纱布上并将纱布包置于容器中。冷冻保护介质由添加到无血清角质形成细胞培养基中的人白蛋白(0.02g/mL)和D-葡萄糖(0.09g/mL)构成。然后，可以将所述容器在-20℃下保存长达六个月。用于产生和转导皮肤替代物的方法描绘于图1A中。
实施例2：编码胰岛素和VEGF的腺病毒表达载体的产生
此实施例描述了用于促进工程化皮肤替代物中的蛋白质的表达的腺病毒载体的结构。转导本文所述的皮肤替代物以表达和释放胰岛素和VEGF。
用由IRES(SEQ ID NO:3)分开的编码经修饰的人胰岛素原的核苷酸(SEQ ID NO:2)和编码人VEGF的核苷酸(SEQ ID NO:4)产生被称为Ad-CAG-VEGF-INS的5型腺病毒，用于在CAG启动子(SEQ ID NO:1)的控制下进行转基因的双顺反子表达。所编码的人VEGF对应于异形体165(VEGF165；SEQ ID NO:7)。与编码SEQ ID NO:5中所示的野生型胰岛素原(野生型人胰岛素NP_000198.1的氨基酸25-110，由野生型人胰岛素NM_000207.3的核苷酸60-389编码)的前体序列相比，所编码的经修饰的人胰岛素原序列(SEQ ID NO:6，不含信号肽的成熟序列)含有突变。包括所述突变使得所述人胰岛素可以从本文所述的皮肤替代物充分分泌并在释放后具有功能，所述皮肤替代物由通过自发突变永生化的人角质形成细胞(HaCaT细胞)构成。成熟胰岛素由胰腺β细胞通过在C链与B链之间(Arg-Arg二碱基位点)切割以及在C-A链之间(Lys-Arg二碱基位点)切割来加工。这些酶切分别由内肽酶PC3和PC2进行，这些酶在形成皮肤替代物的HaCaT细胞中不存在。因此，这些修饰是通过在所需位置产生弗林蛋白酶切割位点以用于通过HaCaT驻留酶加工来实现的。具体地，将弗林蛋白酶共有序列(例如，R-X-[R/K]-R)(SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9，例如SEQ ID NO:10)引入A-C连接和B-C连接中，并且将B链的位置10从组氨酸(H)残基修饰为天冬氨酸(D)。
通过缺失E1和E3区使腺病毒复制缺陷，并且将含有CAG-VEGF-INS序列的表达盒取代到E1区中。具体地，将所述表达盒亚克隆到双碱基腺病毒穿梭载体中并且与Ad5(DE1/DE3)载体(Vector Biolabs，费城，宾夕法尼亚州)重组。将腺病毒包装在HEK293细胞中，用氯化铯超速离心纯化，并且使用常规HEK293噬斑测定进行滴定。图2示出了腺病毒载体和表达盒的结构。
实施例3：转导的表皮细胞的体外评价揭示了胰岛素和VEGF的连续表达和释放
此实施例描述了由持续释放VEGF-A和胰岛素的经基因修饰的基底角质形成细胞构成的皮肤替代物的产生。通过以下方式来产生皮肤替代物：通过增加培养基中的钙水平来使细胞HaCaT系的人角质形成细胞分化直到形成完全复层表皮，如实施例1所述，随后将所述复层表皮的细胞用实施例2中所述的Ad-CAG-VEGF-INS表达构建体转导。
在体外在一周的跨度内评价胰岛素和VEGF从皮肤替代物的释放，以确定转导的表皮细胞的蛋白质表达和释放特征。蛋白质表达的水平和持续时间是重要的因素，特别是在确定敷用频率时。
使用实施例1中所述的方法，使用实施例2中所述的腺病毒载体以12的感染复数(MOI)来转导皮肤替代物的基底细胞(n＝3)。然后将转导的皮肤替代物冷冻保存并且储存于-20℃的冷冻器中。在此实验之前，将转导的皮肤替代物解冻。通过每24小时收集100μL培养基持续七天来进行时间过程实验。根据制造商的说明(分别为Invitrogen和Cloud-Clone)，通过ELISA确定人胰岛素和VEGF的表达。一式三份地进行实验。具体地，通过检测C肽来测量胰岛素，所述C肽是在从胰岛素原切割胰岛素期间释放的由31个氨基酸构成的肽(对应于SEQ ID NO:5和6的残基33-63)。
图3A和图3B分别示出了在7天的跨度内，C肽和VEGF的平均检测水平。两种蛋白质在实验过程中均保持可检测，观察到的VEGF的水平小于4.9ng/mL并且胰岛素的水平小于0.49IU(约0.0011pmol/L，基于IU＝约2.247ng/mL胰岛素)。这些结果表明，胰岛素和VEGF从基底细胞释放，并且蛋白质的表达持续至少一周。此外，所述检测水平低于会引发全身继发效应或副作用的水平，并且甚至可将其单独视为亚治疗的。
实施例4：VEGF与胰岛素之间的协同作用的体外评价
在实施例3中测量的那些的范围内在蛋白质水平下评价VEGF与胰岛素之间的协同作用。进行该研究以确定胰岛素与VEGF的组合是否产生比单独任一种蛋白质更大的治疗益处。
进行内皮细胞管形成测定以评价VEGF和/或胰岛素对血管生成的影响。在此测定中，将内皮细胞在基底膜基质(人工基膜)上培养导致形成类似于血管生成表型的毛细血管特征的管状结构。根据实施例3中所检测蛋白质的范围，评价2ng/mL VEGF与0.1UI胰岛素组合的活性。为了准备实验，将96孔板用1:1比例稀释的30μL人工基膜(Corning目录)覆盖。将板在37℃下孵育20min，并且一旦凝胶化，用不含血清的DMEM-F12洗涤。将大约42,000个小鼠血管内皮瘤内皮细胞(EOMA细胞)接种在60μL的含有0.5％模拟体液(SBF)的DMEM-F12中。将EOMA细胞在37℃ 5％ CO2下孵育20分钟，之后在不干扰贴壁细胞的情况下弃去40μL培养基。
然后将刺激物或对照溶液(60μL)添加到细胞。刺激物包括来自以下细胞的上清液：用编码人VEGF 165(SEQ ID NO:7)的腺病毒以MOI＝12转染的NIH3T3细胞、用编码如实施例2中所述修饰的胰岛素原(SEQ ID NO:6)的腺病毒以MOI＝24转染的NIH3T3细胞以及用胰岛素原和VEGF(分别为24MOI和12MOI)的组合转染的NIH3T3细胞。阴性对照为未经转染的NIH3T3细胞的上清液，并且阳性对照为含有5％ SBF的DMEM-F12。将细胞在37℃和5％ CO2下孵育1.5小时，此时添加另外60μL的每种上清液刺激物。一式三份地进行实验。从初始刺激物暴露起总共三小时后，对每组中的每个样品拍摄至少四张照片。使用Image J的血管生成分析仪来对内皮管形成进行定量。
图4A-图4C示出了在每个实验组中观察到的多种伤口愈合特征。图4A示出了网的数量，所述网定义为由两个或更多个节点包围的闭合回路。图4B示出了节点(也称为联接头)的数量，所述节点定义为至少三条弦带的连结位点。图4C示出了主节段的数量，所述主节段是将两个节点连接在一起的弦带。在每种情况下，在组合组中观察到的伤口愈合特征的数量显著超过在单一治疗组(仅VEGF或仅胰岛素)中观察到的特征。结果显示，浓度为2ng/mL的VEGF或0.1UI的胰岛素的单独表达没有诱导伤口愈合的区段、节点或血管生成网的形成。与仅胰岛素相比，胰岛素与VEGF组合在每次评估中展现出显著更大的伤口愈合特征(网、节点和主节段)。与仅VEGF相比，所述组合在所有组中产生始终更大量的伤口愈合特征，在主节段的评价中达到了显著的水平。
总之，这些结果表明，胰岛素和VEGF的治疗益处可以在其组合递送时得到协同增强。此研究进一步支持，治疗效果可以在低水平的每种蛋白质下最大化，所述蛋白质的量不太可能引起全身效应或毒性。
实施例5：释放胰岛素和VEGF的皮肤替代物改善糖尿病大鼠和高血糖猪的伤口愈 合
使用两种动物模型(糖尿病大鼠和糖尿病猪)来评价VEGF/胰岛素皮肤替代物对伤口愈合的影响。
A.大鼠
将三十只体重在200g与250g之间的Wistar大鼠(4周龄)保持在设定湿度为53％的温度控制室(22℃)中。将大鼠圈养在具有12小时明暗循环的微型隔离室(micro-insulator)中。在实验开始前，允许大鼠在这种环境中适应一周。
为了诱导糖尿病，经由腹膜内(I.P.)途径向大鼠施用60mg/kg链脲佐菌素(也称为链脲霉素)(Sigma-Aldrich)。在即将腹膜内注射之前在0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)中制备链脲佐菌素。将注射后72小时葡萄糖浓度为350mg/dl(15mM)或更高的大鼠诊断为糖尿病。使用Accu-Instant血糖仪(Roche Corp)用反应条(reactive strip)确定血糖水平。
将在两个月内保持高血糖状态的糖尿病大鼠分为两组：糖尿病对照组(无皮肤替代物)和糖尿病治疗组(皮肤替代物)。在研究中包括健康大鼠作为第三组。使每组中的所有大鼠在背部受伤，具有1cm2的穿孔伤口。将对照糖尿病组和健康组中的伤口敷以凡士林纱布。将治疗组中的糖尿病大鼠的伤口敷以VEGF/胰岛素皮肤替代物。在研究持续时间期间，每三天更换纱布敷料。相比之下，皮肤替代物仅施加一次。每三天测量伤口，直到观察到伤口完全闭合。
图5A示出了三个实验组在21天时间段中开放性伤口面积的百分比。在健康对照组和用皮肤替代物治疗的糖尿病组两组中，从伤口开始到伤口完全闭合的时间均为21天。相比之下，在用纱布敷料治疗的糖尿病组中，到愈合的时间延长超过一周(到伤口闭合的时间＝30天)。第1天和第21天伤口的代表性图像示于图5B中。
在伤口愈合活性的进一步评估中，进行了组织学检查以确定皮肤替代物对瘢痕形成的作用。对于每个实验组，在伤口开始后第21天收集瘢痕区域的横切片进行组织病理学检查。如图6所示，真皮和表皮两者的结构和重塑在健康大鼠与用皮肤替代物治疗的糖尿病大鼠之间是可比较的。相比之下，对糖尿病样品的检查显示炎症、细胞浸润和组织增厚。总之，这些结果在体内证实了皮肤替代物的伤口愈合活性，这与实施例3和4中所述的发现一致。
B.猪
采用手术方法诱导猪中的高血糖症。使用无菌技术，暴露颈部腹筋膜上的左颈静脉，然后将18G x 30mm导管插入左颈静脉以收集15mL血液。样品收集后，通过将导管缝合到血管上来固定导管，并且连接静脉灌注设备以保持血管通路。为了获得基线血糖测量结果，从每只耳朵采集一个血液样品。使用输液泵在15分钟内通过血管通路施用一个单剂量的124mg/kg链脲佐菌素。随后在30分钟的过程内施用5％葡萄糖溶液(200mL)。一旦施用了链脲佐菌素和葡萄糖后，从每只耳朵进行新的葡萄糖测量以确认血糖水平升高。
对照组包括输注后最初48小时期间展现出正常行为且血糖水平低于180mg/dL的猪。在猪处于空腹状态和早餐后一小时，进行葡萄糖测量。当测量到葡萄糖水平超过350mg/dL时，施用门冬胰岛素低精蛋白胰岛素(insulin isophane)和甘精胰岛素以便保持约250mg/dL的高血糖水平。使猪保持在高血糖状态持续两个月，以诱导糖基化对其皮肤的影响。每组共有三头猪。
在两个月时间段后，使用脊柱为参照，在麻醉猪的背部造成三处4x 3cm的伤口。伤口位于距中线2cm处，并且这些伤口之间间隔5cm。使用基于位置的命名来标识伤口，即，伤口#1位于颅骨的左侧，伤口#2位于尾部左侧，并且伤口#3位于中央右侧。
麻醉药的作用消散后，经由肌内注射施用0.01-0.03mg/kg丁丙诺啡以缓解疼痛。在伤口开始后最初三天(第1-3天)，每八小时施用一剂丁丙诺啡。在接下来的三天(第4-6天)，每小时施用一剂。在第7-9天，每24小时给予一剂。在治疗医师的酌情决定下，在发生感染时施用抗细菌治疗，经由肌内(I.M.)途径施用3.0mg/kg恩诺沙星(每24小时)或15mg/kg 3(等份的磺胺二甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺嘧啶)(每12小时)持续8天。
在伤口开始后第0、1、4、7、11、18、21、25和28天以参考厘米标尺拍摄伤口的照片。在最初七天期间用盐水溶液清洗伤口，并且提供新的无菌纱布和敷料。在将伤口敷以皮肤替代物的情况下，仅在伤口周围进行洗涤，以避免弄湿装置或使装置移位。在最初七天后，每隔一天(包括拍照之日)更换纱布和敷料。相比之下，VEGF/胰岛素皮肤替代物仅施加一次。在镇静下对显示感染迹象的伤口进行手术清创术。使用ImageI软件通过测量以cm2计的面积来评价伤口的闭合。
图7A示出了在健康猪、糖尿病猪(无皮肤替代物)与用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪之间的伤口面积(cm2)的比较。与大鼠研究的结果可比较的，健康对照组和用表达VEGF/胰岛素的皮肤替代物治疗的组在相同时间段内观察到完全伤口闭合。健康对照和用皮肤替代物治疗的猪在第25天观察到完全伤口闭合，而糖尿病猪(无皮肤替代物)的可观察的伤口区域持续直到第28天。鉴于糖尿病组的开放性伤口持续存在，延长观察直至伤口完全闭合。如图7B所示，对于糖尿病组，直到第52天才实现伤口完全愈合，这是在皮肤替代物治疗的组中观察到愈合后近四周。图8示出了在三组猪中随着时间的推移伤口愈合的代表性图像。皮肤替代物组中拍摄的伤口在第14天开始闭合，并且在整个研究中未观察到感染迹象。如顶部小图和底部小图所示，健康对照和用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病的伤口分别在第23天闭合。在此同一天，糖尿病猪的伤口仍然开放，并且注意到存在感染(中间小图)。
图9示出了在造成伤口后第1天和第7天，用伤口清洁和纱布敷料治疗的糖尿病猪和用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪的伤口。从第3天开始，在糖尿病猪伤口(无皮肤替代物)中注意到感染。相比之下，用VEGF/胰岛素治疗的糖尿病猪没有显示感染迹象，因此不需要抗生素疗法。糖尿病猪(无皮肤替代物)中的感染的治疗由口服(例如，3)和外用抗生素(例如，外用磺胺嘧啶银)持续45天组成。
从伤口开始前一周(第-7天)到伤口后11天测量葡萄糖水平，以评估胰岛素和VEGF释放表皮的全身效应。图10示出了所有实验组中检测到的血糖水平(mg/dL)。在健康组中，水平维持在相对较低的水平(约100mg/dL)。对于两个糖尿病组，在整个研究过程中，血糖波动高达约100mg/dL。相对于糖尿病对照，用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗没有显著改变血糖水平。这些结果与如下观察结果一致，即分子之间增强的协同作用不仅允许更快和有序的愈合和瘢痕形成，而且还确保了产品的毒性缺乏和安全性。
总之，这些体内研究支持了VEGF/胰岛素皮肤替代物用于治疗糖尿病小鼠伤口的强效伤口愈合活性和安全性。在大鼠和猪两者中，用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病皮肤按与健康皮肤可比较的时间线愈合。此外，用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗与微生物感染无关，并且没有显著改变全身血糖水平，这表明胰岛素和VEGF存在的量不会对血糖产生重大影响。除了治疗益处之外，当前的研究还表明，无需频繁更换皮肤替代物，这是对患者依从性有积极影响的优势。
实施例6：胰岛素和VEGF从VEGF/胰岛素皮肤替代物的持续释放减少猪皮肤中晚期 糖基化终末产物(AGE)的存在
高血糖症引起细胞和组织的蛋白质和脂质的结构变化，如由于糖分子(葡萄糖或果糖)与蛋白质或脂质的共价附接而导致的糖基化。糖基化的蛋白质或脂质被称为AGE。糖尿病患者的皮肤中存在高AGE浓度，并且会抑制愈合过程。检查来自实施例5的猪的皮肤以确定皮肤替代物对晚期糖基化终末产物(AGE)浓度的影响。
对实施例5中的猪研究中描述的实验组进行皮肤活检：健康猪、糖尿病猪(无皮肤替代物)和用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的糖尿病猪。如实施例5所述，每个糖尿病组中的猪维持>350mg/dL的血糖水平持续两个月。对于用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗的猪，在伤口开始时和伤口明显愈合(为或约第25天)后两天收集真皮和表皮的样品。对于健康对照和糖尿病对照，在造成伤口时和21天后(健康猪)或60天后(糖尿病猪)伤口愈合时进行皮肤样品活检。
对于每次活检，分离一部分收集的样品并使用分析级秤称重。将约20mg组织在含有蛋白酶抑制剂Complete(Sigma)的500μL 1X PBS中用TissueRuptor分解。然后将样品以4,000rpm离心5分钟以实现聚集组织的沉淀，并且去除上清液。使用蛋白质估计的Bradford法(Sigma)将蛋白质浓度调节至50μg/mL。使用ELISA试剂盒用样品的1:10稀释物对AGE进行定量。根据制造商的说明进行ELISA。简言之，将50μL稀释的样品和50μL稀释的生物素化抗体(1:100)孵育45分钟。在该初始孵育之后，用约359μL的1X洗涤溶液完成三次洗涤。然后添加100μL具有HRP的二抗(1:100)并且在37℃下孵育30分钟。在此孵育结束时，用350μL的1X洗涤溶液进行五次洗涤。去除洗涤溶液后，添加90μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)并且在37℃下孵育15分钟。通过添加50μL终止溶液来终止反应。在450nm处读取吸光度，并且使用以来自标准曲线的数据获得的二阶多项式回归方程(R2＝0.99)进行计算以获得AGE浓度。
根据用AGE ELISA试剂盒获得的浓度(数据以ng/mL计)计算浓度(ng/mg蛋白质)。图11示出了如根据ELISA计算的每个实验组在伤口愈合之前和之后的AGE的量(ng/mg蛋白质)。结果显示，在健康组中，从伤口开始到愈合，AGE水平升高，并且在糖尿病(无皮肤替代物)组中，AGE水平维持相对高水平。用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗从伤口开始到愈合降低AGE的数量。值得注意的是，在伤口开始时，VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗组中的AGE与糖尿病组中的AGE类似，但是用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗将AGE降低到在健康皮肤中观察到的水平。
AGE的降低与改善血管生成以及控制感染和炎症相关。此研究支持，用VEGF/胰岛素皮肤替代物治疗能够降低AGE，即使在具有晚期糖基化的皮肤中(AGE水平为健康皮肤中存在的量的大约两倍)。这些结果表明，VEGF/胰岛素皮肤替代物的伤口愈合作用可能是通过AGE降低介导的。
实施例7：VEGF/胰岛素皮肤替代物是非致瘤性的
在将20mm2未转导的皮肤替代物(对照)或20mm2用Ad-CAG-VEFG-INS腺病毒转导的皮肤替代物皮下移植到6周龄裸小鼠(BALB/c nu/nu)的肩胛间区中后，评价肿瘤形成。以每周间隔测量肿瘤生长。用Ad-CAG-VEFG-INS腺病毒转导的皮肤替代物在移植到裸小鼠中4个月后未显示肿瘤形成(数据未显示)。注射MCF-7人乳腺癌细胞的阳性对照裸小鼠在皮下注射后一个月显示肿瘤生长(数据未显示)。
实施例8：人角质形成细胞细胞系用于产生皮肤替代物的细胞遗传学特性的评估
如以上实施例中所述，皮肤替代物的产生涉及首先将细胞HaCat系的人角质形成细胞在低钙培养基中培养，以产生适于转导的基底层，然后使其分化。HaCaT细胞在其生长和分化潜能方面与正常人角质形成细胞非常相似；然而，它们是一种具有一些染色体异常的永生化细胞系。尽管HaCaT细胞保持稳定的染色体含量并且保持非致瘤性，但是进行了实验以表征在低钙无血清培养基中培养以培养基底层后细胞的细胞遗传学特征。
在培养基底层的条件下使HaCat系在不含胎牛血清的低钙(0.03mM)培养基中生长4周，并且称为HaLow细胞(在低钙中的无血清HaCat)。从第2次传代开始，在将细胞培养总共3个月时，在繁殖期间跟踪HaLow细胞的染色体结构。将半汇合的细胞培养物在37℃下用0.08μg/ml KaryoMAXTMColcemidTM(ThermoFisher 15212012)处理2h。通过随后用重组胰蛋白酶EDTA溶液处理(Sartorius 03-079-1A 10min)来使细胞脱离，将其离心，并将细胞沉淀物重悬于75mM KC1的低渗溶液中。在室温下孵育15min后，将细胞通过三次甲醇/乙酸(3:1)变化固定，涂抹在载玻片上，并且16小时后进行G显带。通常对15个中期进行显微镜分析，并且构建至少5个核型图。
如图12所示，细胞的第7次传代细胞遗传学分析显示以下核型图：65、XXX、+1、-2、add(3)(p25)、-3、add(4)(p15)、-4、-4、-5、6、-7、+8、i(9)(q10)、-9、-10、+der(11)del11(q23)、+11、+12、+13、-14、15、+16、+17、+18、+19、+20、+21、+22、+6mar、+min。大多数细胞是亚三倍体，平均有65条染色体，得自标记染色体形成中涉及的染色体的全部或部分单体性。所有中期都具有XO性染色体结构(缺少Y染色体)。这种细胞遗传学特征表明细胞在改良培养条件下生长的适应性，但是核型图与源自HaCat细胞的细胞一致。结合实施例7中的结果，结果表明，在低钙和无血清中孵育后，细胞系HaLow具有某些细胞遗传学特征，并且当用于皮肤替代物时是非致瘤性的。
实施例9：表皮生长因子从皮肤替代物的表达和释放
表皮生长因子(EGF)是糖尿病足溃疡(DFU)中伤口修复和再生的重要促进因子。在DFU中，伤口愈合过程受到晚期糖基化终末产物(AGE)的积累的阻碍，这是由于患有糖尿病的患者的高血糖水平所致的。AGE与EGF受体竞争性结合，从而阻止EGF的结合，并且使对血管内皮细胞和成纤维细胞的初始损伤永久化。用于将生长因子(包括EGF)递送到伤口环境中的当前技术是无效的，主要是由于当直接施用到细胞外基质中时，EGF的体内半衰期非常短。
使用基本上在上述实施例中所述的方法(不同之处在于其中将表达人EGF的腺病毒转导到皮肤替代物中)，在用表达人EGF的腺病毒(Ad-CMV-hEGF)转导的皮肤替代物的培养物中评价EGF表达和释放到培养基中。将皮肤替代物用5x 106IFU(感染单位)的表达人表皮生长因子的腺病毒(Ad-CMV-hEGF，GenBank：BC113461)转导。在孵育72小时后收集来自转导的和未转导的皮肤替代物培养物的培养基，并且用市售酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems)对从皮肤替代物分泌到培养基中的hEGF蛋白进行定量。
如图13所示，与在未转导的实验对照的培养基中相比，在用表达hEGF的腺病毒(Ad-CMV-hEGF)转导的皮肤替代物的培养基中，人表皮生长因子(hEGF)的浓度显著更高。
这些结果表明，当用携带编码hEGF的多核苷酸的腺病毒转导时，本文提供的皮肤替代物可以有效地表达hEGF并将其释放到培养基中。
这些结果支持，可以通过用表达和分泌生长因子的腺病毒对来自皮肤替代物的细胞进行遗传修饰，使用其他重组生长因子(如EGF)来产生皮肤替代物，以在伤口愈合期间释放所述生长因子。不希望受理论的束缚，结果支持，其他重组生长因子可以与胰岛素组合用于皮肤替代物中，其中胰岛素从皮肤替代物释放到伤口中抑制AGE的存在并且允许EGF受体的激活。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这样的变化，并且所述变化意图落入本公开文本的范围内。
序列

Claims (151)

1.一种皮肤替代物，所述皮肤替代物包含含有基底层、棘层、颗粒层和角化层的复层表皮，其中所述复层表皮的细胞表达重组生长因子和重组胰岛素。
2.根据权利要求1所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子和所述重组胰岛素可从所述复层表皮的细胞分泌。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮为100-200μm厚。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的表达所述重组生长因子和所述重组胰岛素的细胞包括所述基底层的细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素是或包括重组人胰岛素。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素包含(i)SEQ IDNO:5中所示的氨基酸序列；(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素由多核苷酸编码，所述多核苷酸编码(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，或(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素是AspB10胰岛素类似物，与SEQ ID NO:5中所示的野生型胰岛素相比，所述AspB10胰岛素类似物包含经修饰的人胰岛素原的B链中位置10处的组氨酸到天冬氨酸的突变。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含编码胰岛素原的多核苷酸，所述胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点或内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
10.根据权利要求9所述的皮肤替代物，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点和内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的皮肤替代物，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的皮肤替代物，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列是RTKR(SEQ ID NO:10)或RQKR(SEQ ID NO:42)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素具有(i)SEQID NO:6中所示的氨基酸序列；(ii)功能变体，所述功能变体具有与SEQ ID NO:6具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列；或(iii)(i)或(ii)的包含A链和B链的双链形式，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素包含SEQ IDNO:6中所示的序列；或SEQ ID NO:6的包含A链和B链的双链形式，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素包含SEQ IDNO:36中所示的A链和SEQ ID NO:41中所示的B链，任选地其中所述A链和所述B链通过二硫键连接。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组胰岛素包含SEQ IDNO:2中所示的多核苷酸序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子选自表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、及其任何异形体或可变剪接变体。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子是VEGF或其异形体或可变剪接变体。
20.根据权利要求19所述的皮肤替代物，其中所述VEGF由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的皮肤替代物，其中所述VEGF由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO:4中所示的序列。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含与SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的多肽序列。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏所述信号肽的序列。
24.根据权利要求19-23中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含与SEQ ID NO:44中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的多肽序列。
25.根据权利要求19-24中任一项所述的皮肤替代物，其中所述VEGF包含SEQ ID NO:44中所示的多肽序列。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的皮肤替代物，其中所述重组生长因子和所述重组胰岛素由双顺反子表达盒编码，所述双顺反子表达盒包含编码所述重组生长因子的多核苷酸和编码所述重组胰岛素的多核苷酸，由双顺反子元件分开。
27.根据权利要求26所述的皮肤替代物，其中所述双顺反子元件是IRES。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的皮肤替代物，其中编码所述重组生长因子和所述重组胰岛素的多核苷酸与启动子可操作地连接。
29.根据权利要求28所述的皮肤替代物，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的皮肤替代物，其中所述启动子是CAG启动子。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的皮肤替代物，其中在所述双顺反子表达盒中，编码所述重组生长因子的所述多核苷酸位于编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸的上游。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞以如下水平分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素，所述水平导致血管生成重组的一种或多种标记物相对于仅包含所述重组生长因子或所述重组胰岛素的另一种皮肤替代物更大的改善，任选地如在管形成测定中评价的。
33.根据权利要求32所述的皮肤替代物，其中血管生成重组的所述一种或多种标记物是节点或联接头的数量的增加，所述节点或联接头定义为至少三条弦带的连结位点。
34.根据权利要求32所述的皮肤替代物，其中血管生成重组的所述一种或多种标记物是网的数量的增加，所述网定义为由两个或更多个节点包围的闭合回路。
35.根据权利要求32所述的皮肤替代物，其中血管生成重组的所述一种或多种标记物是主节段的数量的增加，所述主节段定义为将两个节点连结在一起的弦带。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞连续分泌可定量水平的所述重组生长因子和所述重组胰岛素。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞连续分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素持续长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞连续分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素持续长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞分泌可定量水平的所述重组生长因子以及胰岛素或C肽，所述可定量水平的重组生长因子以及胰岛素或C肽能够被检测到长达或约2天、长达或约3天、长达或约4天、长达或约5天、长达或约6天、长达或约7天、长达或约8天、长达或约9天、长达或约10天、长达或约11天、长达或约12天、长达或约13天、或长达或约14天。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞分泌可定量水平的所述重组生长因子以及所述胰岛素或所述C肽，所述可定量水平的重组生长因子以及胰岛素或C肽能够被检测到长达或约一周、长达或约两周、长达或约三周、长达或约一周至两周、或长达或约两周至三周。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞以如下水平分泌所述重组生长因子和所述重组胰岛素，所述水平降低受试者的皮肤中晚期糖基化终末产物(AGE)的水平。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的皮肤替代物，其中所述复层表皮的细胞是由角质形成细胞分化的。
43.根据权利要求42所述的皮肤替代物，其中所述角质形成细胞是人角质形成细胞。
44.根据权利要求42或权利要求43所述的皮肤替代物，其中所述角质形成细胞是HaCaT角质形成细胞。
45.一种双顺反子表达盒，所述双顺反子表达盒包含编码重组人生长因子和重组胰岛素的多核苷酸。
46.根据权利要求45所述的双顺反子表达盒，其中所述重组胰岛素是或包括重组人胰岛素。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQID NO:5具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素包含SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素是AspB10胰岛素类似物，与SEQ ID NO:5中所示的野生型胰岛素相比，所述AspB10胰岛素类似物包含经修饰的人胰岛素原的B链中位置10处的组氨酸到天冬氨酸的突变。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸编码胰岛素原，所述胰岛素原包含至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点或内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
51.根据权利要求50所述的双顺反子表达盒，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列替代内肽酶Arg31-Arg32切割位点和内肽酶Lys64-Arg65切割位点。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的双顺反子表达盒，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列包含共有序列R-X-R-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:8)；或R-X-K-R，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO:9)。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所述至少一个弗林蛋白酶识别序列是RTKR(SEQ ID NO:10)或RQKR(SEQ ID NO:42)。
54.根据权利要求45-53中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素具有(i)SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列，或者(ii)是功能变体，所述功能变体具有与SEQID NO:6具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组胰岛素包含SEQ ID NO:6中所示的序列。
56.根据权利要求45-55中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
57.根据权利要求45-56中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:2中所示的序列。
58.根据权利要求45-57中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的重组生长因子选自表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子α和β、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、及其任何异形体或可变剪接变体。
59.根据权利要求45-58中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所述重组生长因子是VEGF或其异形体或可变剪接变体。
60.根据权利要求59所述的双顺反子表达盒，其中编码所述生长因子的所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:4中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
61.根据权利要求59或权利要求60所述的双顺反子表达盒，其中编码所述生长因子的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:4中所示的序列。
62.根据权利要求59-61中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含与SEQ ID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
63.根据权利要求59-62中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含SEQID NO:7中所示的序列或其缺乏信号肽的序列。
64.根据权利要求59-63中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含与SEQ ID NO:44中所示的序列具有至少为或约85％、至少为或约90％、或至少为或约95％序列同一性的序列。
65.根据权利要求59-64中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所编码的VEGF包含SEQID NO:44中所示的序列。
66.根据权利要求45-65中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组生长因子的所述多核苷酸和编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸由双顺反子元件分开。
67.根据权利要求66所述的双顺反子表达盒，其中所述双顺反子元件是IRES。
68.根据权利要求45-67中任一项所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组生长因子和所述重组胰岛素的多核苷酸与启动子可操作地连接。
69.根据权利要求68所述的双顺反子表达盒，其中编码所述重组生长因子和所述重组胰岛素的多核苷酸与相同启动子可操作地连接。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的双顺反子表达盒，其中所述启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
71.根据权利要求68-70中任一项所述的双顺反子表达盒，其中所述启动子是CAG启动子。
72.根据权利要求68-71中任一项所述的双顺反子表达盒，其中在所述双顺反子表达盒中，编码所述重组生长因子的所述多核苷酸位于编码所述重组胰岛素的所述多核苷酸的上游。
73.一种载体，所述载体包含根据权利要求45-72中任一项所述的双顺反子表达盒。
74.根据权利要求73所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
75.根据权利要求74所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体。
76.根据权利要求73-75中任一项所述的载体，其中所述载体是非复制型5型腺病毒。
77.根据权利要求76所述的载体，其中所述非复制型腺病毒缺乏功能性E1和E3区或在所述区域中缺失，任选地其中所述E1和E3包含遗传破坏。
78.根据权利要求73-77中任一项所述的载体，其中将所述双顺反子表达盒插入所述E1区中。
79.一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：
1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及
2)将根据权利要求45-72中任一项所述的双顺反子表达盒或根据权利要求73-78中任一项所述的载体引入所述复层表皮的细胞中，以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含重组生长因子和重组胰岛素。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述引入是通过根据权利要求73-78中任一项所述的病毒载体的转导进行的。
81.一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：
1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及
2)将根据权利要求73-78中任一项所述的病毒载体转导到所述复层表皮的细胞中，以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。
82.一种制造皮肤替代物的方法，其中所述方法包括：
1)使角质形成细胞分化为复层表皮，其中所述复层表皮包含基底层、棘层、颗粒层和角化层；以及
2)用编码经修饰的胰岛素原和生长因子的腺病毒载体转导所述复层表皮的细胞以产生皮肤替代物，其中所述皮肤替代物包含生长因子和胰岛素。
83.根据权利要求79-82中任一项所述的方法，其中在所述引入或转导时，所述复层表皮的细胞表达闭合蛋白和密封蛋白。
84.根据权利要求79-83中任一项所述的方法，其中所述引入或所述转导是进入所述基底层的细胞中。
85.根据权利要求79-84中任一项所述的方法，其中在步骤1)中的所述分化之前，所述方法包括将所述角质形成细胞在低钙培养基中培养2周、3周、4周、5周、或6周，任选地为或约4周。
86.根据权利要求85所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为0.01-0.1mM的钙。
87.根据权利要求85或权利要求86中任一项所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为至多或约0.05mM的钙。
88.根据权利要求85-87中任一项所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含浓度为约0.03mM的钙。
89.根据权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基进一步包含表皮生长因子(EGF)和牛垂体提取物(BPE)。
90.根据权利要求89所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含从0.05ng/mL至1ng/ml EGF以及从1μg/ml至100μg/ml BPE。
91.根据权利要求89或权利要求90所述的方法，其中在接种所述细胞时或所述培养期间，所述低钙培养基包含为或约0.2ng/ml EGF以及为或约30μg/ml BPE。
92.根据权利要求79-91中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞是人角质形成细胞。
93.根据权利要求79-92中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞是HaCaT角质形成细胞。
94.根据权利要求79-93中任一项所述的方法，其中步骤1)包括将所述角质形成细胞在细胞外基质底物上培养。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述细胞外基质底物是胶原。
96.根据权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述细胞外基质底物是经人用认证的。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的方法，其中将所述角质形成细胞以在5x 106个细胞/mL与50x 106个细胞/mL之间的细胞密度接种在所述细胞外基质底物上。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述细胞密度是为或约10x 106个细胞/ml、20x106个细胞/ml、30x 106个细胞/ml或40x 106个细胞/ml、或前述任何值之间的任何值。
99.根据权利要求97或权利要求98所述的方法，其中所述细胞密度是为或约20x 106个细胞/ml。
100.根据权利要求94-99中任一项所述的方法，其中将所述细胞外基质底物包被在transwell小室上。
101.根据权利要求94-99中任一项所述的方法，其中步骤(1)中的所述培养持续约23至28天。
102.根据权利要求94-100中任一项所述的方法，其中步骤(1)中的所述培养包括在低钙培养基中的第一孵育和在高钙培养基中的第二孵育。
103.根据权利要求102所述的方法，其中在低钙培养基中的所述第一孵育持续约3-5天，并且在高钙培养基中的所述第二孵育持续约20-23天。
104.根据权利要求102或权利要求103所述的方法，其中所述低钙培养基包含0.01-0.1mM钙。
105.根据权利要求102-104中任一项所述的方法，其中所述高钙培养基包含1.0-3.0mM钙。
106.根据权利要求102-105中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基包含0.03mM钙，并且所述高钙培养基包含2.4mM钙。
107.根据权利要求102-106中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基和所述高钙培养基进一步包含EGF和BPE。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述低钙培养基和所述高钙培养基包含0.05ng/mL至1ng/ml EGF以及从1μg/ml至100μg/ml BPE。
109.根据权利要求107或权利要求108中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基和所述高钙培养基包含为或约0.2ng/ml EGF以及为或约30μg/ml BPE。
110.根据权利要求102-109中任一项所述的方法，其中所述高钙培养基进一步包含氢化可的松。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述高钙培养基包含从0.1至1.0μg/ml氢化可的松。
112.根据权利要求110或权利要求111所述的方法，其中所述高钙培养基包含为或约0.4μg/ml氢化可的松。
113.根据权利要求85-112中任一项所述的方法，其中所述低钙培养基是无血清培养基。
114.根据权利要求102-113中任一项所述的方法，其中所述高钙培养基是无血清培养基。
115.根据权利要求102-114中任一项所述的方法，其中在所述第二孵育期间，在将所述角质形成细胞在所述高钙培养基中培养时引入气液界面，其中使所述基底层的细胞暴露于所述高钙培养基但不暴露于气态环境。
116.根据权利要求102-115中任一项所述的方法，其中在所述第一孵育期间，每天更换所述低钙培养基。
117.根据权利要求102-116中任一项所述的方法，其中在所述第二孵育期间，每天更换所述高钙培养基。
118.根据权利要求79-117中任一项所述的方法，其中在步骤2)之后，所述方法进一步包括将所述皮肤替代物用冷冻保护剂配制。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述冷冻保护剂包含人白蛋白和葡萄糖。
120.根据权利要求79-119中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤2)之后，冷冻所述皮肤替代物。
121.根据权利要求79-120中任一项所述的方法，所述方法进一步包括对所述皮肤替代物进行质量控制评估，任选地其中在将所述皮肤替代物用所述冷冻保护剂配制之前进行所述质量控制评估。
122.根据权利要求121所述的方法，其中在步骤2)完成与所述质量控制步骤之间经过长达或约24小时。
123.根据权利要求121或权利要求122所述的方法，其中所述质量控制步骤包括检测选自以下的一种或多种多肽：胰岛素原、经修饰的胰岛素原、胰岛素、胰岛素变体、C肽、生长因子及其变体。
124.根据权利要求79-123中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述皮肤替代物置于脱脂纱布上。
125.根据权利要求79-124中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞包括永生化角质形成细胞。
126.根据权利要求79-125中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞包括来自HaCaT细胞系、NM1细胞系或NIKS细胞系的细胞，和/或源自所述HaCaT细胞系、NM1细胞系或NIKS细胞系的细胞。
127.一种通过根据权利要求79-126中任一项所述的方法中的任一种产生的皮肤替代物。
128.一种冷冻保存的皮肤替代物，所述冷冻保存的皮肤替代物包含根据权利要求1-44或权利要求127中任一项所述的皮肤替代物以及冷冻保护剂。
129.根据权利要求128所述的冷冻保存的皮肤替代物，其中所述冷冻保护剂包含人白蛋白(0.02g/mL)和D-葡萄糖(0.09g/mL)。
130.一种皮肤替代物敷料，所述皮肤替代物敷料包含根据权利要求1-44或权利要求127中任一项所述的皮肤替代物或根据权利要求128或权利要求129所述的冷冻保存的皮肤替代物以及脱脂纱布，其中将所述冷冻保存的皮肤替代物覆盖在所述脱脂纱布上。
131.根据权利要求130所述的皮肤替代物敷料，其中所述脱脂纱布是凡士林矿脂纱布。
132.根据权利要求130或权利要求131所述的皮肤替代物敷料，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是约40-50cm2、约40-45cm2、或约45-50cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约40-60cm2、约45-60cm2、约45-55cm2。
133.根据权利要求130或权利要求131所述的皮肤替代物敷料，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、为或约50cm2、为或约51cm2、为或约52cm2、为或约53cm2。
134.根据权利要求1-44或127中任一项所述的皮肤替代物、根据权利要求128或权利要求129所述的冷冻保存的皮肤替代物或根据权利要求130-133中任一项所述的皮肤替代物敷料，所述皮肤替代物、所述冷冻保存的皮肤替代物或所述皮肤替代物敷料是无菌的。
135.一种容器，所述容器包含根据权利要求1-44或127中任一项所述的皮肤替代物、根据权利要求128或权利要求129所述的冷冻保存的皮肤替代物或根据权利要求130-133中任一项所述的皮肤替代物敷料。
136.根据权利要求135所述的容器，其中所述容器是袋。
137.根据权利要求135或136所述的容器，其中所述容器是无菌的和/或热封的。
138.一种包装，所述包装包含根据权利要求135-137中任一项所述的容器，其中所述包装是袋。
139.根据权利要求138所述的包装，其中所述包装是无菌的和/或热封的。
140.一种用于制备皮肤替代物敷料的方法，所述方法包括将根据权利要求1-44或127中任一项所述的皮肤替代物或根据权利要求128或129所述的冷冻保存的皮肤替代物置于脱脂纱布上。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述脱脂纱布是凡士林矿脂纱布。
142.根据权利要求140或权利要求141所述的方法，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是约40-50cm2、约40-45cm2、或约45-50cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约40-60cm2、约45-60cm2、约45-55cm2。
143.根据权利要求140或权利要求141所述的方法，其中所述冷冻保存的皮肤替代物的尺寸是为或约41cm2、为或约42cm2、为或约43cm2、为或约44cm2、为或约45cm2、为或约46cm2、为或约47cm2，并且所述脱脂纱布的尺寸是约为或约47cm2、为或约48cm2、为或约49cm2、为或约50cm2、为或约51cm2、为或约52cm2、为或约53cm2。
144.一种促进伤口愈合的方法，所述方法包括向伤口施加根据权利要求1-44或权利要求127中任一项所述的皮肤替代物、根据权利要求128或权利要求129所述的冷冻保存的皮肤替代物或根据权利要求130-133中任一项所述的皮肤替代物敷料。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述皮肤替代物预防微生物感染。
146.根据权利要求144或权利要求145所述的方法，其中将所述皮肤替代物施加到急性伤口和/或慢性伤口。
147.根据权利要求144-146中任一项所述的方法，其中所述伤口选自：疮、开放性伤口、溃疡和脓肿。
148.根据权利要求144-147中任一项所述的方法，其中将所述皮肤替代物施加到糖尿病患者的伤口。
149.根据权利要求144-148中任一项所述的方法，其中所述伤口是糖尿病溃疡。
150.根据权利要求144-149中任一项所述的方法，其中所述伤口是糖尿病足溃疡。
151.根据权利要求144-150中任一项所述的方法，其中所述伤口是下肢静脉溃疡。
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