KR20090035711A - 유전자 치료를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터의 전방 심외막 관상에의 연장 주입 - Google Patents

유전자 치료를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터의 전방 심외막 관상에의 연장 주입 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심혈관 질환의 치료 요법, 특히 관상 순환 내 직접 주입에 의한 심장 조직에의 치료제 전달에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는, 심장 질환을 치료하거나 예방하기 위한 의약품 제조에 있어서 심장 세포를 형질전환하도록 처리된 치료적 폴리뉴클레오티드 조성물의 용도로, 상기 조성물은, 전신 순환으로부터 관상 순환을 분리하지 않고 적어도 약 3분의 기간 동안 관상 순환의 혈관 내로 주입된다. 추가의 바람직한 양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 AAV2/1 바이러스 벡터의 DNase 저항성 입자(DRP) 내 패키지된 SERCA2a 코딩 서열을 함유하며, 주입된 DRP의 총 개수는 1×1013 이하이고, 혈관은 좌측 또는 우측 관상 동맥이다.
폴리뉴클레오티드, AAV2/1, SERCA2a, 바이러스 벡터, DRP, 관상 동맥

Description

유전자 치료를 위한 아데노-관련 바이러스 벡터의 전방 심외막 관상에의 연장 주입{Extended antegrade epicardial coronary infusion of adeno-associated viral vectors for gene therapy}
관련된 교차-참조 출원
본 발명은 2006년 7월 25일에 출원된 미국 가출원 제60/833,324호에 우선권의 이익을 주장한다.
배경 기술
발명의 분야
본 발명은 심혈관 질환 치료를 위한 유전자요법에 관한 것으로, 특히 심장 조직에의 폴리뉴클레오티드 전달에 관한 것이다.
관련 분야에 대한 설명
심장 질환은 특히 서양에서 발현율이 매우 높은 주요 보건 이슈 중 하나이다. 심장병은 몇 개만 예로 들자면 관상동맥 질환, 허혈성 심장 질환, 심부전, 심장 판막 질환, 심부정맥 및 심장 염증(심근염)을 포함한다. 관상 동맥 질환 및 심부전은 서양에서 주요 사망 원인이 될 뿐만 아니라 가장 중증이고 만연하는 질환일 것이다. 급성 심근 경색 및 울혈성 심부전의 영향, 환자의 삶의 질에 대한 후유증의 영향 및 건강 관리 비용으로 인해 새로운 치료법을 개발할 필요가 있다.
울혈성 심부전(CHF)는 심장이 혈액을 효과적으로 펌프질하는 능력을 상실하는 중증 질환이다. NHLBI(국립 심장, 폐 및 혈액 연구소)의 데이타에 따르면, 미국에서만 약 5백만명이 심부전 환자이고, 매해 550,000명의 또 다른 새로운 환자가 심부전으로 진단된다. CHF는 년중 약 300,000명의 사망에 기여하거나 이의 원인이 된다. 이 질환은 65세 이상, 여성 및 아프리카계 미국인에게 가장 흔하다. 심부전의 가장 공통된 증상은 숨가쁨, 피곤감 및 발목, 발, 다리 및 때때로 복부 부기(swelling)이다. 울혈성 심부전을 치료하는 방법은 없으며, 효과적 치료법을 개발할 필요성이 당업계에 분명히 존재한다.
더욱 주목을 받기 시작한, CHF와 같은 심장 질환을 치료하는 한 방법은, 유전자 치료법으로, 폴리뉴클레오티드가 일반적으로 바이러스 벡터 내에서 심장 조직으로 전달된다. 바이러스 벡터를 심장에 전달하는 다수의 방법이 시도되었으며, 이러한 방법으로는 심장 근육에 직접 주입[참조: Liu et al., FASEB J. 2006; 20(2):207-16; Li et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2006 Jan 25 (electronic publication); Zhu et al, Circulation. 2005; 112(17):2650-9)], 관상 동맥 내 전달[참조: Nykanen et al., Circ. Res. 2006; 98(11): 1373-80; Kaspar et al., J. Gene Med. 2005; 7(3):316-24], 관상 정맥 차단과 함께 카테터-의거 전방(antegrade) 관상동맥 내 전달[참조: Hayase et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005; 288(6):H2995-3000], 대동맥 및 폐동맥 근위부 겸자(aortic and pulmonary artery cross clamping) 후 아데노-관련 바이러스 벡터의 근위부 대동맥 주입[참조: Kaspar et al., J. Gene Med. 2005; 7(3):316-24]을 포함한다. 레이덴 및 스벤슨(Leiden and Svensson)은 rAAV 벡터를 관상 동맥 또는 비강에 in vivo 주입하는 것에 대해 개괄적으로 언급하고 있으나, 마우스의 심장을 심장 박동이 중지되는 4℃에서 리포터(reporter) 유전자로 ex vivo 관류하는 것에 대해서만 상세히 기술하고 있을 뿐이며(WO 00/38518), 이러한 방법은 사람과 같은 큰 동물을 치료하기에는 실용적이지 않다. 따라서, 상기 방법은 임상적 환경에서 사용되기에는 모두 부적절한데, 그 이유는 예를 들어 이들 방법에는 외과적 개입이 필요하거나 심장 근육으로의 산소화된 혈액의 흐름 방해가 필요한데 이로 인해 위험도가 높아지고; 상기 방법을 실시하는 데 바이러스 벡터의 양이 필요하고; 형질전환된 조직의 백분률이 낮고; 형질도입이 주입/투여 부위에만 제한되고; 또는 상기 방법이 큰 동물 또는 사람의 질환 치료에 실용적이지 않거나 입증되지 않았기 때문이다. 질환, 특히 사람의 질환을 치료하기 위해 바이러스 벡터 내 트랜스진(transgene)을 심장 조직에 전달하는, 간단하고 최소한 침습적인, 효과적인 수단에 대한 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 심혈관 질환의 치료를 위한 요법, 특히 치료제를 관상 순환 내로 직접 심외막 주입하는 심장 조직에의 치료제 전달에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는, 전신 순환으로부터 관상 순환을 분리하지 않고 적어도 3분의 기간 동 안 치료적 폴리뉴클레오티드 조성물을 관상 순환의 혈관 내로 주입시켜 심장 질환의 치료 또는 예방용 약제의 제조에 있어서 심장 세포를 형질전환하도록 개조시킨 치료적 폴리뉴클레오티드 조성물의 용도이다.
다른 양태는 큰 포유류의 심장 세포를 형질전환시킴으로써 심혈관 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로, 당해 방법은 심혈관 질환을 치료하거나 예방할 필요가 있는 포유류를 확인하는 단계 및 관상 순환의 혈관 내 치료적 폴리뉴클레오티드를 in vivo 주입하는 단계를 포함하며, 여기서 치료적 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 3분의 기간 동안 혈관에 주입되며, 관상 순환은 포유류의 전신 순환과 분리되지 않거나 실질적으로 분리되지 않고, 치료적 폴리뉴클레오티드는 포유류의 심장 세포를 형질전환시켜 심혈관 질환을 치료하거나 예방한다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 5분의 기간 동안 혈관 내 주입되고, 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 10분의 기간 동안 혈관 내 주입되고, 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 15분의 기간 동안 혈관 내 주입된다.
특정 양태에서, 혈관 내 주입 속도는 약 6.0mL/분 이하이고, 특정 양태에서, 약 2.5mL/분 이하이고, 특정 양태에서 약 2.0mL/분 이하이고, 특정 양태에서 약 1.2mL/분 이하이고, 특정 양태에서 약 1.0mL/분 이하이고, 특정 양태에서, 약 0.6mL/분 이하이다.
특정 양태에서, 혈관은 좌측 관상 동맥이다. 특정 양태에서, 관상 순환 유출이 부자연스럽게 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 전측심실(anterior lateral ventricle), 내측심실(inferior lateral ventricle), 중격(septum) 및 우측 심실의 심장 세포 형질전환은 PCR을 사용해 검출될 수 있다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 심장 세포의 세포적 활성을 조절할 수 있는 단백질을 발현시킬 수 있다. 특정 양태에서, 세포적 활성은 심근세포의 칼슘 순환 경로이다. 특정 양태에서, 단백질은 근소포체/소포체 ATPase(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum ATPase)(SERCA)이고, 특정 양태에서, SERCA는 SERCA2a이다.
바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 아데노-관련 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 소 유두종 바이러스, 렌티바이러스, 우두 바이러스 및 폴리오마바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스 벡터 내 존재한다. 더욱 바람직한 양태에서, 바이러스 벡터는 AAV 바이러스이고, 더욱 바람직한 양태에서 바이러스 벡터는 AAV2/1 벡터이다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 CMV계 프로모터에 작동적으로 연결되고 바이러스 벡터 내 포장된다. 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SERCA2a 코딩 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 심장 세포의 형질전환은 측심실 분획 단축률(fractional shortening)을 증가시킨다. 특정 양태에서, 포유류는 사람이고, 질환은 울혈성 심부전이다.
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터의 DNase 저항성 입 자(DRP) 내 포장된다. 특정 양태에서, 주입된 DRP의 총 개수는 1×1014, 1×1013, 3×1012, 1×1012, 1×1011, 1×1010, 1×109 및 1×108로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양 이하이다. 특정 양태에서, 주입된 DRP의 총 개수는 1×1013이하이다.
한 양태에서, 주입된 DRP의 총 개수는 1×1012이하이고, 바이러스 벡터는 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드는 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 혈관은 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입은 약 2mL/분 이하의 유속으로 적어도 약 10분 동안 지속되고, 전측심실, 내측심실, 중격 및 우측 심실의 심장 세포 형질전환은 PCR을 사용하여 검출할 수 있다.
특정 양태에서, 질환은 심부전, 허혈, 부정맥, 심근 경색, 울혈성 심부전, 이식 거부, 비정상적 심장 수축성, 비-허혈 심근증, 승모판 역류, 대동맥 협착증 또는 역류, 비정상적 Ca2+ 대사 및 선천성 심장 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
한 양태에서, 바이러스 벡터는 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드는 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 혈관은 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입은 약 2.5mL/분 이하의 유속으로 적어도 약 8분 동안 지속되며, 여기서 전측심실, 내측심실, 중격 및 우측 심실의 심장 세포 형질전환은 PCR을 사용하여 검출할 수 있고, 심장 세포의 형질 전환에 의해 폴리뉴클레오티드 주입 전 측심실 분획 단축률과 비교시 주입 후 약 4개월에 측정했을 때 측심실 분획 단축률이 적어도 25% 증가된다.
한 양태에서, 포유류는 사람이고, 바이러스 벡터는 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드는 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 혈관은 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입은 적어도 약 10분 동안 지속된다. 특정 양태에서, 심혈관계 질환은 울혈성 심부전이다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 주입 속도는 약 6mL/분의 유속이다.
특정 양태에서, 심장 세포의 형질 전환에 의해, SERCA2a 단백질 발현, 분획 단축률(fractional shortening), 박출률(ejecion fraction), 심장 박출량, 심실 이완 시간 상수(time constant of ventricular relaxation) 및 역류량으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 심장 기능의 척도에 있어 개선된다.
특정 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 관상 순환의 추가적 혈관 내 주입하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 3분의 기간 동안 추가적 혈관 내 주입된다. 특정 양태에서, 포유류는 사람이고, 바이러스 벡터는 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드는 SERCA2a 코딩 서열을 포함하며, 혈관은 좌측 관상 동맥이고, 좌측 관상 동맥 내로 폴리뉴클레오티드의 주입은 적어도 약 6분 동안 지속되고, 추가적 혈관은 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 우측 관상 동맥내로의 주입은 적어도 약 3분 동안 지속된다. 특정 양태에서, 심혈관계 질환은 울혈성 심부전이다. 특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드의 좌측 관상 동맥 및 우측 관상 동맥 내로의 주입 속도는 약 6mL/분의 유속이다.
특정 양태에서, 심장 세포의 형질전환으로 SERCA2a 단백질 발현, 분획 단축 률, 박출률, 심장 박출량, 심실 이완 시간 상수 및 역류량으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 심장 기능의 척도가 개선된다.
특정 양태에서, 본 발명은, SERCA2a를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적어도 1×1011의 DRP의 AAV2/1 벡터를 포함하는 약제학적 조성물; 및 심혈관 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 환자에게, SERCA2a를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적어도 0.5×1011의 DRP의 AAV2/1 벡터를 포함하는 용액을, 관상 순환의 혈관 내로 in vivo 주입하여 투여해야 함을 지시하는 설명서를 포함하는 키트에 관한 것으로, 여기서 관상 순환은 환자의 전신 순환과 분리되지 않거나 실질적으로 분리되지 않고, 폴리뉴클레오티드는 적어도 약 3분의 기간 동안 혈관 내 주입된다. 특정 양태에서, 혈관은 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입은 적어도 약 8분의 기간 동안이다.
도 1은 AAV2/1/SERCA2a(tgABG12) DNA의 특징을 보여주는 개요도이다.
도 2는 야생형과 재조합 AAV DNA의 비교 개요도이다.
도 3은 실시예 1에 기술된 실험에서 수집된 샘플의 위치를 보여주는 심장 예시도이다.
도 4는 조직 샘플에서 AAV2/1/SERCA2a DNA의 검출에 사용된 PCR 프라이머의 위치를 보여준다.
도 5는 실시예 1에 기술된 시험 결과를 보여주는 챠트로, 동량의 AAV2/1/SERCA2a의 주입 시간 증가로 심장 조직의 샘플에서 AAV2/1/SERCA2a의 카피수가 증가되었음을 보여준다.
도 6은 실시예 2에 기술된 시험 결과를 보여주는 챠트로, AAV2/1/SERCA2a의 주입이 정맥 내 주사에 비해 AAV2/1/SERCA2a의 카피수를 용량 의존적 방식으로 증가시켰음을 보여준다.
도 7A는 비-실험 대조 동물, 제형 주입된 동물(염수) 및 실시예 3의 AAV2/1/SERCA2a 처리된 동물에서 SERCA2a 단백질(상단) 및 mRNA(하단)의 발현을 보여주는 폴리아크릴아미드 겔이고, 도 7B는 실시예 3의 3개의 치료 그룹 사이 SERCA2a의 정상화된 단백질 발현을 비교하는 그래프이다.
도 8은 실시예 3에 기술된 실험 결과를 나타내는 그래프로, AAV2/1/SERCA2a를 전방 심외막 관상 주입함으로써 심부전 모델에서 심장 기능 개선의 척도인 좌측 심실의 분획 단축률이 증가되었음을 보여준다.
도 9는 56일째와 비교해 112일째 분획 단축률의 절대 변화 플롯(plot)이다.
도 10은 56일째와 비교해 112일째 박출률의 절대 변화 플롯이다.
도 11은 56일째와 비교해 112일째 심장 박출량(mL/분)의 절대 변화 플롯이다.
도 12는 56일째와 비교해 112일째 tau(좌심실 이완 시간 상수(msec.))의 절대 변화 플롯이다.
도 13은 56일째와 비교해 112일째 역류량(mL)에서의 절대 변화를 보여주는 플롯이다.
바람직한 양태의 상세한 설명
본 발명은 심혈관 질환 치료를 위한 요법에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태는, 심장 조직을 형질 전환시켜 심근세포의 칼슘 수준을 정상화시킴으로써 울혈성 심부전(CHF) 환자의 심장 수축성을 개선시켜 심장 질환을 치료하는 의약품 제조에 있어서 심장 세포를 형질전환하도록 개조된 치료적 폴리뉴클레오티드 조성물의 신규 용도이다. 바람직한 양태는 약 3분 이상의 기간 동안 관상 순환 내 in vivo 직접 주입된 유전자 운반제, AAV2/1/SERCA2a를 사용하며, 여기서 관상 순환은 동물의 전신 순환과 분리되지 않거나 부자연스럽게 제한되지 않는다.
본원에서, "폴리뉴클레오티드"는 당업계에서의 보통의 관행적인 의미를 가지며, DNA 또는 RNA 분자와 같은 임의의 중합성 핵산 외에, 당업자에게 공지된 화학적 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 치료적 단백질을 인코딩하는 것 뿐만 아니라 당업계에 공지된 기술을 사용하여 표적 핵산 서열의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있는 서열(예: 안티센스, 중재 핵산 또는 작은 중재 핵산(small interfering nucleic acid))을 포함한다. 한 예는 포스포람반(phospholamban)의 발현을 감소시키거나 제거하는 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 또한 심혈관 시스템 세포 내 표적 핵산 서열의 발현 또는 표적 단백질의 생산을 개시하거나 증가시키는 데 사용될 수 있다. 표적 핵산 및 단백질은 표적 조직 내 정상적으로 발견되는 핵산 및 단백질, 이러한 자연 발생 핵산 또는 단백질의 유도체, 표적 조직 내 정상적 으로 발견되지 않는 자연 발생 핵산 또는 단백질, 또는 합성 핵산 또는 단백질을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 표적 핵산 또는 단백질을 증가시키고/증가시키거나 감소시키기 위해 배합되어, 동시에 및/또는 연속적으로 투여되어 사용될 수 있다.
본원에서 용어 "주입(infusion)", "주입된" 및 "주입하는"은 당업계에서의 보통의 관행적인 의미를 가지며, 당업계에 인식되어 있는 용어 "주사(injection)" 또는 "순간 주사(bolus injection)"(일반적으로 1분 이내의) 보다 실질적으로 더 긴 기간(일반적으로 1분 이상의) 동안 투여되는 것을 말한다. 주입의 유속은 투여되는 용량에 따라 적어도 부분적으로 달라질 수 있으나, "주입" 시 유속은 동일한 양을 "주사"하는 것보다 더 느리다.
"유효량"은 당업계에서의 보통의 관행적인 의미를 가지며, 유리하거나 목적하는 치료적 효과를 나타내거나 달성하기에 충분한 양을 포함한다. 예를 들어, "유효량"은 측심실 분획 단축률의 증가; 및/또는 질환 상태의 진행, 징후 또는 증상의 경감, 완화, 안정화, 반전, 속도 늦춤 또는 지연 중 어느 하나를 달성하는 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다.
본원에서, "결합하여", "배합하여", "동시의" 또는 "동시에"는 당업계에 보통의 관행적인 의미를 가지며, 하나의 치료 양식(modality)에 추가하여 다른 치료 양식을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 대상체에 주입하는 것 외에, 동일한 개체에게 당업자에게 인식된 약제학적 조성물을 투여한다. 본원에서 이들 용어는 치료 양식을 동시 투여하는 것 뿐만 아니라 후속적 으로 투여하는 것을 포함한다.
본원에서, 질환을 "치료하는" 및 "치료"는 당업계에서 보통의 관행적인 의미를 나타내며, 질환의 진행 또는 질환의 징후 또는 증상을 중지시키거나 속도를 늦추는 것을 포함하여 질환을 안정화, 치료 또는 비-완벽한 치료를 포함한다. 용어 "예방"은 당업계에서 보통의 관행적인 의미를 나타내며 질환 또는 질환의 징후나 증상의, 완벽하거나 불안전한 예방, 또는 개시의 지체를 포함한다. 용어, "치료적", "치료 효과" 또는 "임상적 효과"는 치료 및 예방을 모두 포함한다. 본 발명을 사용하여 치료하고자 하는 심혈관계 관련 질환의 예는, 심부전, 허혈, 부정맥, 심근 경색, 울혈성 심부전, 이식 거부, 비정상적 심장 수측, 비-허혈성 심근증, 승모판 역류, 대동맥 협착증 또는 역류, 비정상적 Ca2+ 대사 및 울혈성 심장 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 유리하거나 목적하는 임상 결과 또는 치료 효과는, 탐지할 수 있거나 탐지할 수 없는, 심혈관 질환의 징후 또는 증상의 경감 증가, 질환의 감소 정도의 증가, 질환 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 속도 늦춤, 질환 상태의 경감 또는 완화, 및 후퇴(부분적 또는 전체적)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료 효과의 다른 예는, 측심실 분획 단축률 증가; 세포 수준 및 손상되지 않은 동물 수준에서 심장 수축 증가, 심장 리모델링의 역전 및 세포질 칼슘의 비정상적으로 높은 심장확장기 수준의 정상화를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 양태로 치료된 대상체에서 개선될 수 있는 기타 임상적 특징은, 제한없이 생존률, 심장 대사, 심장 수축, 심박률, 심실 기능(예: 좌심실 이완기말 압력(LVEDP), 좌심실 수축기 압력(LVSP)), Ca2+ 대사(예: 세포 내 Ca2+ 농도, 피크 또는 휴지기 [Ca2+], SR Ca2+ ATPase 활성, 포스포람반의 인산화 상태), 발전(force generation), 심장의 이완 및 압력, 힘 빈도 관계(force frequency relationship), 심장세포의 생존력 또는 어팝토시스 또는 이온 채널 활성(예: 나트륨 칼슘 교환, 나트륨 채널 활성, 칼슘 채널 활성, 나트륨 칼륨 ATPase 펌프 활성), 미오신 중쇄(heavy chain) 활성, 트로포닌 I, 트로포닌 C, 트로포닌 T, 트로포미오신, 미오신 광 체인 키아제, 미오신 광 체인 1, 미오신 광 체인 2 또는 미오신 광 체인 3, IGF-1 수용체, PI3 키나제, AKT 키나제, 나트륨-칼슘 교환제, 칼슘 채널(L 및 T), 칼스퀘스트린(calsequestrin) 또는 칼레티쿨린(calreticulin)을 포함한다. 개선될 수 있는 기타 심장 질환의 척도로는, 분획 단축률, 심장 박출량, 박출률, Tau, 역류량, 감소된 병원 입원 기간, 개선된 삶의 질, 및 증가된 트레드밀(treadmill) 시간을 포함한다.
본원에서, "외인성" 핵산 또는 유전자는 예를 들어 바이러스 벡터 내 자연적으로 발견되지 않는, 핵산 전이에 사용된 벡터 내 본래는 존재하지 않는 것을 의미하지만, 환자 또는 숙주 내 자연적으로 존재하는 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 SERCA를 인코딩하는 핵산을 배제시키고자 하는 것은 아니다.
본원에서, "심장 세포"는 심장 근육 세포, 심장 혈관 세포, 또는 심장 판막 내 존재하는 세포와 같이 심장의 구조를 유지하거나 심장 기능을 제공하는 데 관련 된 심장의 모든 세포를 포함한다. 심장 세포는 심근 세포(정상 및 비정상 전기적 특성 모두를 갖는), 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 전도성(conducting) 조직 세포, 심박 조율 세포(cardiac pacemaking cell) 및 뉴런을 포함한다.
본원에서, "분리된", "실질적으로 분리된" 또는 "대체적으로 분리된" 및 이의 변이 형태는 관상 정맥, 심장, 전신 정맥 또는 전신 순환의 완벽하거나 절대적인 분리를 요구하는 것은 아닌 용어로, 이는 대다수, 바람직하게 특정 순환의 주요 부분 또는 실질적인 모든 부분이 분리됨을 나타내고자 한다. 본원에서, "부분적으로 분리된"은 특정 순환의 임의의 자명하지 않은 부분이 분리됨을 나타낸다.
본원에서, "부자연스럽게 제한된"은 혈관을 통한 유체 흐름을 예를 들어 풍선 카테터, 봉합 등으로 제한하는 임의의 방법을 포함하지만, 자연적으로 발생하는 제한, 예를 들어 플라그 형성(협착)은 포함하지 않는다. 부자연스러운 제한은 예를 들어 관상 순환의 실질적 또는 전체적 분리를 포함한다.
본원에서, "조절하는"은 통상적인 의미를 가지며, 표적의 발현이나 활성을 증가시키고 감소시키는 것 모두를 포함한다.
본원에서, 용어 "최소한 침습적인"은 심장과 밀접하게 결합된 심장 또는 혈관의 절개 수술 접근(open surgical access)을 요하지 않는 임의의 과정을 포함할 의도로 사용되었다. 이러한 과정은 심장에 접근하기 위한 내시경 수단의 사용 및 대동맥 및 대정맥, 예를 들어 대퇴 동맥을 통한 접근에 의존하는 카테터-의거 수단의 사용을 포함한다.
본원에서, 용어 "아데노-관련 바이러스" 또는 "AAV"는 모든 하위타입, 세로 타입(serotype) 및 슈도타입(pseudotype) 뿐만 아니라 자연 발생 형태 및 재조합 형태를 포함한다. 다양한 AAV 세로타입 및 균주가 당업자에게 공지되어 있으며, ATCC와 같은 공급원 및 학술적 또는 상업적 공급원으로부터 공개적으로 이용가능하다. 또는, 공개되고/공개되거나 다양한 데이타베이스로부터 이용가능한, AAV 세로타입 및 균주로부터 서열이 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
본원에서, 용어 "세로타입"은 정해진 항혈청과의 캡시드(capsid) 단백질 반응성에 기초하여 동정되고 다른 AAV와는 구별되는 AAV를 말한다. AAV1 내지 AAV12를 포함하는, 적어도 12개의 공지된 사람 AAV의 세로타입이 있으나, 추가적 세로타입이 계속해서 발견될 것이며, 새로이 발견된 세로타입의 사용이 고려된다. 예를 들어, AAV2 세로타입은 AAV2 캡 유전자로부터 인코딩된 캡시드 단백질 및 동일한 AAV 세로타입으로부터의 5' 및 3' 방향 말단 반복(ITR) 서열을 함유하는 게놈을 함유하는 AAV를 나타내기 위해 사용된다.
"슈도타입" AAV는 하나의 세로타입으로부터의 캡시드 단백질과, 상이하거나 이종의 세로타입의 5' 및 3' 방향 말단 반복(ITR)을 포함하는 바이러스 게놈을 함유하는 AAV를 나타낸다. 슈도타입 rAAV는 캡시드 세로타입의 세포 표면 결합 특성과 ITR 세로타입과 일치하는 유전적 특성을 가지는 것으로 예상될 수 있다. 슈도타입 rAAV는, 캡시드 단백질이 ITR의 세로타입과 이종인 세로타입인 경우, VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 단백질, 및 AAV1 내지 AAV12로부터의 임의의 영장류 AAV 세로타입을 포함하는 임의의 세로타입 AAV로부터의 ITR을 포함할 수 있다. 슈도타입 rAAV에서, 5' 및 3' ITR은 동일하거나 이종일 수 있다. 슈도타입 rAAV는 당업계에 기술된 표준 기술을 사용하여 제조된다.
"키메릭" rAAV 벡터는 이종의 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터를 포함하며, 즉, rAAV 벡터는 이의 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3에 대해 키메릭이어서, VP1, VP2 및 VP3가 모두 동일한 세로타입 AAV 유래가 아닐 수 있다. 본원에서 사용된 키메릭 AAV는, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만 AAV1 및 AAV2로부터의 캡시드 단백질을 포함하는, 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 세로타입이 상이한 AAV를 포함하며, 기타 파보 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물 또는 기타 바이러스 단백질 또는 기타 단백질, 예를 들어 목적하는 세포 또는 조직으로 AAV의 전달을 표적화하는 단백질을 포함한다. 본원에서 키메릭 rAAV는 또한 키메릭 5' 및 3' ITR을 포함하는 rAAV를 포함한다. 본 발명은 상이한 AAV 세로타입, 예를 들어 AAV1 및 AAV2로부터의 ITR을 포함하는 키메릭 rAAV 벡터, 또는 합성 서열을 포함할 수 있는 키메릭 rAAV를 포함한다.
rAAV 바이러스 벡터는 미국 특허 제6,001,650호 및 제6,258,595호에 기재된 바와 같은 일시적 형질전환 전략을 포함한 당업자에게 공지된 다수의 임의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, rAAV 벡터 제조는 4개의 공통적 요소를 필요로 한다: 1) 293-A, 293-S(제조원: BioReliance), VERO, 및 본원에 기술된 벡터 제조 시스템이 적용될 수 있는 Hela 세포주를 포함하고, 당업자에게 공지된 표준 숙주 세포를 포함하는, 복제를 허용하는 숙주 세포; 2) 플라스미드로서 공급되는 헬퍼(helper) 바이러스 기능, 형질도입 제조 시스템에서 사용시 아데노바이러스 타입 5(Ad5)의 E2a, E4-orf6 및 VA 유전자를 발현하는 pAd 헬퍼 4.1; 3) 트랜스펙키 징 렙-캡 구조체(transpackaging rep-cap construct); 및 4) AAV ITR 서열에 의해 플랭크(flank)되는 관심 유전자. 형질전환 제조는 문헌[Sandalon et al., J. Virology, 2004; 78(22): 12355-12365]에 기술된 바와 같이 실시할 수 있다.
치료 방법
본 발명의 바람직한 양태에서, 치료제, 예를 들어 아래 더욱 상세히 기술된 폴리뉴클레오티드/바이러스 벡터는 특정 혈관 내 적어도 약 3분의 기간 동안 in vivo로 박동 중인 심장의 관상 순환의 혈관 내로 주입함으로써 대상체에게 투여된다. 사람의 심장 및 심혈관 질환의 큰 동물 모델에서, 본 출원인은 예상외로 상대적으로 긴 주입 기간 동안의 바이러스 벡터의 투여가 더욱 효과적이며, 동일한 양의 바이러스 벡터를 일회 주사 또는 단기 주입(예: ≤ 1분)시 보다 더 우수한 유전자 전달 효능을 나타냄을 발견하였다. 주입의 개선된 효과는, 주사에 비해, 세포 당 트랜스진(transgene)의 카피수 증가, 세포나 조직에서 mRNA 및/또는 단백질 수준에서 트랜스진의 발현 증가 및/또는 특정 조직 세포, 예를 들어 형질전환된 심근세포의 백분률 증가로 측정될 수 있다. 출원인은, 큰 동물 모델에서, 사람 심혈관 질환의 모델을 성공적으로 치료할 수 있음을 밝혀내었다. 추가로, 출원인은 상대적으로 긴 주입 시간에 의해, 전신 순환으로부터 관상 순환을 분리시키거나, 치료제를 재순환시키거나, 관상 순환 내 압력을 증가시키거나 치료제의 체류 시간을 증가시키기 위한 수단으로서 관상 정맥 순환을 인위적으로 제한할 필요가 없음을 발견하였다. 심장 조직을 혈관활성제(예: 히스타민, 히스타민 효능제 또는 혈관 내 피 성장 인자)와 같은 기타 약물로 전처리하거나 심장을 냉각시키거나, 심장을 정지시키거나 관류를 위해 심장을 동물로부터 제거할 필요도 전혀 없다. 대신, 출원인의 과정은 투여에 현존하는 카테터를 사용하여 표준 카테터화 랩 환경에서 실시할 수 있다. 따라서, 출원인은 큰 동물, 예를 들어 사람의 심혈관 질환을 치료하기 위해 유전자 치료를 사용하는, 단순하고, 실용적이며 효율적인 수단을 개발하였다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 치료제는 주입을 통해 관상 순환의 혈관 내로 대상체에게 투여된다. 관상 순환은 심장 조직에 혈액을 공급한다. 다수의 관상 동맥이 있다. 정상적으로, 4개의 주요 관상 동맥, 즉, 좌측 주요 관상 동맥, 우측 관상 동맥, 좌측 전하행(anterior descending) 동맥 및 좌측 회선(circumflex) 동맥이 심장 조직을 통한 분포를 위해 심장에 산소화된 혈액을 공급한다. 이러한 동맥 중 하나 또는 이의 배합에의 주입이 고려되며, 예를 들어 좌측 및 우측 관상 동맥의 주입이 고려된다. 바람직한 양태는 좌측 및 우측 주요 관상 동맥의 전방, 심외막 주입을 사용한다. 또한 관상 동맥의 후방 주입 또는 관상 동맥이나 정맥의 하나 이상의 전방 및 후방 배합 주입이 고려된다. 관상 혈관 주입은 표준 가이드와이어(guidewire), 카테터 및 주입 펌프를 사용하여 시행된다. 바람직한 양태에서, 주입 카테터는 대퇴 동맥을 통해 형광투시 가이드 하에서 관상 동맥에 연결된다. 본원에서, "관상 순환 혈관", "관상 혈관" 또는 "심장 혈관"은 관상 혈관에의 그래프트(graft), 예를 들어 바이패스 수술에 의해 생긴 것을 포함한다. 본원에서, "심외막(epicardial)"은 심장의 외부에 위치한 혈관, 예를 들어 좌측 또는 우 측 관상 동맥을 말한다.
일단 주입 카테터가 표적 관상 혈관 내 위치하면, 치료제가 바람직하게 제어가능한(programmable) 주입 펌프를 통해 혈관내로 주입된다. 치료제를 주입하는 데 걸린 시간의 양이 효과적이고 우수한 유전자 전달 효능을 수득하는 데 있어 중요한 요소이다. 출원인은 특정 혈관 내로의 적어도 약 3분의 주입 시간이 일회 주사 또는 단기 주입 시간 보다 더 효과적임을 확인하였다. 바람직하게, 비록 적어도 약 15분의 주입 시간이 고려되지만, 주입 시간은 적어도 약 8분, 더욱 바람직하게 적어도 약 10분이다. 또한, 주입 시간으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20분이거나; 약, 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20분이거나; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20분 미만이거나; 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20분 미만이거나; 또는 이들 수치 중 임의의 2개 값에 의해 한정되는 범위 내가 고려된다.
주입에는 일반적으로 카테터 및 특정 사장 체적(dead volume)을 갖는 연결 튜빙(tubing)의 사용이 관여되기 때문에, 주입 장치는 빈번히 어떤 치료제도 함유하지 않는 담체 용액, 예를 들어 대상체로부터의 혈액으로 애벌칠(prime)된다. 따라서, 주입 펌프에 전원이 들어올 때 즉시로 치료제가 관상 순환 내로 주입되는 것이 아니다. 이와 같이, 치료제를 함유하는 주사기가 비워지면, 치료제의 양은 일반적으로 연결 튜빙 및 카테터의 사장 체적 내 잔존한다. 치료제의 주입 후 즉시, 사장 체적은 바람직하게 치료제를 투여시 사용된 동일한 유속으로 적합한 용액으로 플러쉬(flush)된다. 주입 기구에서 대체 사장 체적과는 대조적인, 치료제가 실제로 관상 순환 내로 전달되는 시간의 기간이 위에서 언급한 "주입 시간"이다. 예를 들어, 3mL의 치료제가 3mL의 사장 체적으로 주입 기구 내 적하되고 주입 속도가 1mL/분인 경우, 치료제를 관상 순환 내로 주입하는 데 필요한 시간은 오직 3분인 반면, 3mL의 치료제 및 3mL의 사장 체적을 투여하는 데 필요한 총 시간은 6분이다. 특정 양태에서, 카테터 및 임의의 연결 튜빙이 치료제로 애벌칠되어 사장 체적이 문제가 되지 않는다. 유사하게, 치료제의 유효량이 튜빙을 증수할 필요 없이 전달될 수 있다. 그러나, 이로 인해 치료제가 튜빙 내 남아 있게 되고 치료제를 낭비하게 된다.
출원인은 치료제가 유속 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0 mL/분; 약, 적어도 또는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0 mL/분; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0 mL/분 이하; 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5 또는 10.0 mL/분 이하; 또는 이들 수치 중 임의의 2개로 한정되는 범위 내 속도로 주입될 것이라 생각한다. 바람직하게, 유속은 약 0.2mL/분 내지 약 6.0mL/분, 더욱 바람직하게 약 0.2mL/분 내지 약 2.5mL/분, 더욱 바람직하게 약 0.2mL/분 내지 약 2.0mL/분이다. 당업자는 치료제의 전달이 주입 펌프없이도 가능하지만, 더욱 정확한 유속 및 균질한 전달이 주입 펌프의 사용으로 가능해짐을 인정할 것이다.
유효량을 전달하기 위해 주입에 의해 전달되는 바이러스 입자 또는 DNase 저항성 입자(DRP)의 총량은 바람직하게 1×1014 내지 약 1×1011, 더욱 바람직하게 3×1012 내지 약 1×1012, 및 더욱 바람직하게 약 1×1012이다. 그러나, 바이러스 입자 또는 DRP의 총량이 1 x 1014, 9 x 1013, 8 x 1013, 7 x 1013, 6 x 1013, 5 x 1013, 4 x 1013, 3 x 1013, 2 x 1013, 1 x lO13, 9 x 1012, 8 x 1012, 7 x 1012, 6 x 1012, 5 x 1012, 4 x 1012, 3 x 1012, 2 x 1012, 1 x 1012, 9 x l011, 8 x 1011, 7 x 1011, 6 x 1011, 5 x 1011, 4 x 1011, 3 x 1011, 2 x 1011, 1 x 1011, 9 x 1010, 8 x 1010, 7 x lO10, 6 x 1010, 5 x 1010, 4 x 1010, 3 x 1010, 2 x 1010, 1 x 1010, 9 x 109, 8 x 109, 7 x 109, 6 x 109, 5 x 109, 4 x 1O9, 3 x 109, 2 x 109, 1 x 109, 9 x 108, 8 x 108, 7 x 108, 6 x 108, 5 x 108, 4 x 108, 3 x 108, 2 x 108 또는 1 x 108이거나, 이들 값 이하; 약, 적어도 또는 적어도 약 1 x 1014, 9 x 1013, 8 x 1013, 7 x 1013, 6 x 1013, 5 x 1013, 4 x 1013, 3 x 1013, 2 x 1013, 1 x lO13, 9 x 1012, 8 x 1012, 7 x 1012, 6 x 1012, 5 x 1012, 4 x 1012, 3 x 1012, 2 x 1012, 1 x 1012, 9 x l011, 8 x 1011, 7 x 1011, 6 x 1011, 5 x 1011, 4 x 1011, 3 x 1011, 2 x 1011, 1 x 1011, 9 x 1010, 8 x 1010, 7 x lO10, 6 x 1010, 5 x 1010, 4 x 1010, 3 x 1010, 2 x 1010, 1 x 1010, 9 x 109, 8 x 109, 7 x 109, 6 x 109, 5 x 109, 4 x 1O9, 3 x 109, 2 x 109, 1 x 109, 9 x 108, 8 x 108, 7 x 108, 6 x 108, 5 x 108, 4 x 108, 3 x 108, 2 x 108 또는 1 x 108; 또는 약 1 x 1014, 9 x 1013, 8 x 1013, 7 x 1013, 6 x 1013, 5 x 1013, 4 x 1013, 3 x 1013, 2 x 1013, 1 x lO13, 9 x 1012, 8 x 1012, 7 x 1012, 6 x 1012, 5 x 1012, 4 x 1012, 3 x 1012, 2 x 1012, 1 x 1012, 9 x l011, 8 x 1011, 7 x 1011, 6 x 1011, 5 x 1011, 4 x 1011, 3 x 1011, 2 x 1011, 1 x 1011, 9 x 1010, 8 x 1010, 7 x lO10, 6 x 1010, 5 x 1010, 4 x 1010, 3 x 1010, 2 x 1010, 1 x 1010, 9 x 109, 8 x 109, 7 x 109, 6 x 109, 5 x 109, 4 x 1O9, 3 x 109, 2 x 109, 1 x 109, 9 x 108, 8 x 108, 7 x 108, 6 x 108, 5 x 108, 4 x 108, 3 x 108, 2 x 108 또는 1 x 108 이하이거나, 이들 값 중 임의의 2개 값에 의해 정해지는 범위가 또한 고려된다.
주이진 시간에 주입되는 DRP의 개수는 주입되는 용액의 농도 및 유속의 함수이다. DRP 또는 바이러스 입자 주입 속도는 바람직하게 약 1 x 108/분 내지 약 1 x 1014/분, 더욱 바람직하게 약 5 x 1010/분 내지 약 5 x 1012/분, 더욱 바람직하게 약 3 x 1010/분 내지 약 1 x 1012/분, 더욱 바람직하게 약 6 x 1010/분 내지 약 4 x 1011/분이다. 바람직한 양태에서, DRP 또는 바이러스 입자 주입 속도는 1 x 1011/분이고, 다른 바람직한 양태에서는 1.25 x 1011/분이다.
한 양태에서, 치료제는 심장의 단일 혈관 내로 주입된다. 다른 양태에서, 치료제의 총 용적 중 2/3가 심장의 특정 혈관에 전달되고, 1/3이 심장의 다른 혈관에 전달된다. 다른 양태에서, 2개 초과(예: 3개, 4개 또는 5개 이상)의 관상 혈관에 주입되고, 혈관 당 투여되는 치료제 함유 총 주입 용적비는, 적합하게 조정될 수 있다. 주입의 목표는 전방 심외막 관상 주입을 통해 AAV2/1/SERCA2a의 확산성 균질한 심근 노출을 제공하는 것이다. 재발생(collateralization) 패턴, 폐색성 질환 및 해부학적 변화(예: 수술 후 바이패스 구조)를 기준으로 하여 여러 주입 시나리오가 존재하지만, 임상의의 목표는 AAV2/1/SERCA2a의 1/3는 전측면, 1/3은 후측면, 및 1/3은 내부/내측면 심근에 전달하는 것이다. 해부(anatomy)는 관상 및 바이패스 그래프트(graft) 혈관조영술에 의해 정의되어 관류된 심근에 균질하게 전달시킨다. 추가로, 당업자는 양과 돼지가 사람의 심혈관 연구의 동물 모델로 허용되고 있지만, 양과 돼지의 90%가 좌 우선형(left dominant)임을 인식할 것이다. 이와 대조적으로 사람 인구의 대략 ~10%가 좌 우선형이고, 나머지 90%가 우 우선형 또는 동시-우선형이다[참조: Vlodaver Z. et al. Coronary Heart Disease: Clinical, Angiographic, 및 Pathologic Profiles. Spinger-Verlag, New York. 1976]. 한 병리학적 간행물은 71%의 환자가 우 우선형이고, 17%가 동시 우선형이며, 12%가 좌 우선형임을 제시한다[참조: McAlpine W. Heart 및 Coronary Arteries. Spinger Verlag, 1975]. 따라서, 돼지/양에서와 유사한 좌측 심실 관류를 사람에서 수득하기 위한 최적의 주입 시나리오는 상이할 수 있다.
용액 용적의 1/3 및 2/3 분할이 2개의 혈관에 대해 바람직하지만, 특정 혈관 내 주입된 주입 용적비는 총 용적의 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%이거나, 약, 적어도 또는 적어도 약 상기 값이거나, 상기 값 이하이거나, 약 상기 값 이하이거나, 이들 값 중 임의의 2개 값에 의해 정해지는 범위일 수 있다. 치료제를 함유하는 용액의 총 용적은 치료되는 동물의 크기에 따라 달라질 수 있다. 사람 대상체의 경우, 60mL의 총 치료제 용적이 바람직하다. 그러나, 치료제의 총 용적은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 또는 15O mL이거나, 약, 적어도 또는 적어도 약 상기 값이거나, 상기 값 이하이거나, 약 상기 값 이하이거나 상기 값 중 임의의 2개 값 사이의 범위일 수 있다.
본원에 기술된 치료제는 용액, 바람직하게 관상 순환 내로 직접 투여되기에 적합한 약제학적 조성물 형태일 수 있다. 허용되는 약제학적 조성물의 성분은 당업자에게 공지되어 있으며, 완충액 및 적합한 담체와 같은 성분을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 치료제, 예를 들어 바이러스 벡터, 더욱 바람직하게 AAV2/1/SERCA2a 벡터를 함유하는 약제학적 조성물은 키트의 일부이다. 특정 양태에서, 키트는 치료제의 저장 용액(stock solution) 및 저장 용액을 희석하기 위한 용액을 함유한다. 또한, 키트 내에는 본원에 기술된 어느 한 양태에서 개시된 바와 같이, 바람직하게 관상 순환 내로 직접 주입에 의해 바이러스 벡터를 투여하는 설명서를 포함한다. 유사하게, 본원에 기술된 치료제는 본원에 기술된 질환 치료용 약제 제조에 사용될 수 있으며, 여기서 당해 약제는 심장 순환 내로 직접 주입된다.
폴리뉴클레오티드 전달 방법
본 발명의 한 양태는 치료적 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 전이시키는 것이 고려된다. 그러한 전이에는 바이러스법 또는 비-바이러스법의 유전자 전이를 사용할 수 있다. 이번 섹션에서는 안티센스, 중재 서열 및 소 중재 서열(small interfering sequences)의 전이를 포함하는, 유전자 또는 핵산 전이의 방법 및 조성물에 대한 논의를 제공할 것이다.
한 양태에서, 치료학적으로 유의한 폴리뉴클레오티드가 바이러스 벡터 내 혼입되어 세포로의 전이를 매개한다. 본원에 기술된 기타 치료제를 인코딩하는 추가 적 발현 구조체가 또한 감염성 바이러스 입자를 사용한 바이러스 형질도입, 예를 들어 본 발명의 아데노-관련 바이러스(AAV)로 형질전환에 의해 전이될 수 있다. 또는, 레트로바이러스, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 우두 바이러스, 폴리오마 바이러스, 또는 발현되도록 설계된 감염성 바이러스가 사용될 수 있다. 유사하게, 비-바이러스법, 예를 들어 관류와 같은 DNA의 직접 전달, 네이키드(naked) DNA 형질전환, 리포솜 매개 형질전환, 캡슐화 및 수용체 매개 엔도시토시스가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기술은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 이의 세부사항은 본 발명의 핵심이 아니며, 따라서 본원에서 지나치게 상세히 기술할 필요가 없다. 그러나, 한 바람직한 예에서, 바이러스 벡터가 심장 세포의 형질전환에 사용되어 치료학적으로 중요한 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달한다. 바이러스는 수용체-매개 엔도시토시스와 같은 특이적 수단, 또는 피노시토시스와 같은 비-특이적 수단에 의해 세포의 내부로 접근할 수 있다.
다수의 예시적 벡터가 이하 기술될 것이다. 하기 기재가 본원 발명을 철저히 규명하려는 것으로 이해되어서는 안된다.
아데노-관련 바이러스 벡터
본 발명의 바람직한 양태는 정제된, 복제 불능의 슈도타입 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 사용한다. 아데노-관련 바이러스(AVV)는 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하는 파보바이러스(parvovirus)이다. 이들은 작고, 외 피(envelop) 비보유의 단일 가락 DNA 바이러스로, 복제를 위해 헬퍼 바이러스를 필요로 한다. 기능적으로 완전한 AAV 비리온을 형성하기 위해 헬퍼 바이러스(예: 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 우두 바이러스)와의 공-감염이 필요하다. in vitro에서, 헬퍼 바이러스와 공-감염의 부재시, AAV는 바이러스 게놈이 에피솜(episomal) 형태로 존재하지만, 감염성 비리온은 생성하지 않는 잠복 상태를 확립한다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염으로 게놈이 '탈출'하고, 이로써 게놈이 복제되고 바이러스 캡시드 내 포장되어 감염성 비리온을 생성하게 된다. 최근 데이타는 야생형 AAV 및 재조합 AAV 모두 in vivo에서 큰 에피솜 콘커테머(concatemer)로 우세하게 존재함을 보여준다.
어떤 공지된 사람 질환과도 관련이 없는 AAV는 일반적으로는 병원성이 아닌 것으로 간주되며, 융합시 숙주 세포의 생리학적 특성을 개질시키지 않는 것으로 보인다. AAV는 비-증식 세포를 포함한 넓은 범위의 숙주 세포를 감염시킬 수 있으며, 상이한 종 기원 세포를 감염시킬 수 있다. 세포 및 호르몬 반응 모두에 의해 신속하게 제거되거나 불활성화되는 특정 벡터와는 대조적으로, AAV 벡터는 in vivo다양한 조직에서 지속적인 발현을 나타낸다. in vivo의 비증식 세포에서 재조합 AAV 벡터의 지속성은 천연 AAV 바이러스 유전자의 결핍 및 에피솜 콘커테머 형성 능력이 원인일 수 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV)는 에피솜 콘커테머로서 높은 빈도의 지속성을 보이기 때문에 본 발명의 세포 형질도입의 용도와 관련하여 흥미로운 벡터 시스템이며, 비증식 세포를 감염시킬 수 있음으로써 유전자를 포유류 세포 내, 예를 들어 조직 배양 및 in vivo 내에 전달하는 데 유용하다. 유전자 전달에서 AAV의 사용을 보여주는 연구는 문헌[Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90:10613-17 및 Walsh et al, J. Clin. Invest., 1994; 94:1440-48]을 포함한다. 재조합 AAV 벡터는 마커 유전자 및 사람 질환과 관련된 유전자의 in vitro 및 in vivo 형질도입에 성공적으로 사용되고 있다[참조예: Walsh et al., J. Clin. Invest. 1994; 94:1440-48]. AAV는 넓은 범위의 숙주에 대해 감염능을 갖는다. rAAV 벡터의 생성 및 용도에 관한 세부 사항은 미국 특허 제5,139,941호 및/또는 미국 특허 제4,797,368호에 기술되어 있다.
일반적으로, 재조합 AAV(rAAV) 바이러스는 2개의 AAV 말단 반복 단위로 플랭크(flank)된 관심 유전자를 함유하는 플라스미드 및/또는 말단 반복 단위없이 야생형 AAV 코딩 서열, 예를 들어 pIM45를 함유하는 발현 플라스미드를 함께 형질전환시켜 제조된다. 상기 세포는 또한 아데노바이러스 및/또는 AAV 헬퍼 기능에 필요한 아데노바이러스 유전자를 함유한 플라스미드로 감염되고/감염되거나 형질전환된다. 상기 방식으로 제조된 rAAV 바이러스 스톡(stock)은, 물리적으로 rAAV 입자로부터 분리되어야 하는(예: 염화세슘 밀도 원심분리 또는 컬럼 크로마토그래피) 아데노바이러스로 오염된다. 또는, AAV 코딩 부위를 함유하는 아데노바이러스 벡터 및/또는 AAV 코딩 부위를 함유하는 세포주 및/또는, 특정 또는 모든 아데노바이러스 헬퍼 유전자가 사용될 수 있다. 융합된 프로바이러스로서 rAAV DNA를 함유하는 세포주가 또한 사용될 수 있다.
AAV의 다수의 세로타입이 자연계에 존재하며, 현재 적어도 12개의 세로타 입(AAV1-AAV12)이 공지되어 있다. 높은 정도의 상동성에도 불구하고, 상이한 세로타입이 상이한 조직에 대해 친화성(tropism)을 갖는다. AAV1의 수용체는 공지되지 있지 않지만, AAV1은 AAV2보다 더 효율적으로 골격 및 심장 근육을 형질도입하는 것으로 공지되어 있다. 대부분의 연구가, AAV2 ITR이 플랭크된 벡터 DNA가 교대의 세로타입의 캡시드 내 팩키지된 슈도타입 벡터를 사용하여 진행되었기 때문에, 생물학적 차리가 게놈보다는 캡시드와 관련이 있음이 분명하다. 최근 증거는 AAV1 캡시드로 팩키지된 DNA 발현 카셋트가 AAV2 캡시드 내 팩키지된 것 보다 심근세포를 형질전환시키는 데 있어서 적어도 1 log10 더 효과적임을 보여준다.
아데노바이러스 벡터
유전자 치료를 위해 폴리뉴클레오티드를 전달하는 다른 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용과 관련이 있다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 구조체의 패키지(package)를 지지하기에 충분하고/충분하거나, (b) 여기서 클로닝되는 조직 및/또는 세포-특이적 구조체를 궁극적으로 발현하기에 충분한, 아데노바이러스 서열을 포함하는 구조체를 포함하는 의미이다.
본 발명의 한 형태에서, 발현 벡터는 아데노바이러스의 유전자 조작된 형태를 포함한다. 36kb, 선형, 이중 가닥 DNA 바이러스의, 아데노바이러스의 유전적 구조에 대한 정보로 인해, 아데노바이러스 DNA의 큰 단편을 7kb 이하의 외래(foreign) 서열로 치환할 수 있다[참조: Grunhaus and Horwitz, Seminar in Virology, 1992; 3:237- 252]. 레트로바이러스와는 대조적으로, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은, 아데노바이러스 DNA가 잠재적인 유전자독성없이 에피솜적 방식으로 복제할 수 있기 때문에 크로모좀 융합에 이르지 않는다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고 확장 증식 후 게놈 재배열이 전혀 관찰되지 않는다.
아데노바이러스 성장 및 조작은 당업자에게 공지되어 있으며, in vitro 및 in vivo에서 넓은 숙주 범위를 나타낸다. 이러한 그룹의 바이러스는 고 역가, 예를 들어 ml 당 109 내지 1011 플라그 형성 단위로 수득될 수 있으며, 전염성이 높다. 아데노바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세포 게놈 내로의 융합을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되는 외래 유전자는 에피솜이고, 따라서 숙주 세포에 낮은 유전자독성을 가진다. 야생형 아데노바이러스로 백신화하는 연구에서 어떠한 부작용도 보고된 바 없어, in vivo 유전자 전이 벡터로서의 안정성 및/또는 치료 가능성을 입증하였다.
아데노바이러스는 진핵 세포 유전자 발현 및 백신 개발에 사용되었다. 최근에, 동물 연구는 재조합 아데노바이러스가 유전자 치료에 사용될 수 있음을 시사한다[참조예: Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene. Ther., 1991; 1:242-256; Rich et al., 1993]. 재조한 아데노바이러스를 상이한 조직에 투여하는 연구는 근육 주사, 말초 정맥 내 주사 및 뇌에 정위 접종을 포함한다. 재조합 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스는 비증식 사람 일차 세포를 감염시키고 또한 형질도입시킬 수 있다.
아데노바이러스 벡터의 사용이 고려되지만, 심혈관 유전자 치료 시험에 이러한 사용은 현재 수명이 짧은 트랜스진 발현에 의해 제한된다[참조: Vassalli G, et al, Int. J. Cardiol., 2003; 90(2-3):229-38]. 이는 아데노바이러스 항원에 대한 세포적 면역이 원인이다. 개선된 '무기력한(gutless)' 아데노바이러스 벡터가 면역원성을 감소시켰으나, 치료 효과를 위해 6개월 이상의 트랜스진의 최대 발현이 필요하거나 요망되는 경우 여전히 효과가 없다[참조: Gilbert R, et al., Hum. Mol. Genet., 2003; 12(11): 1287-99]. AAV 벡터는 장기간 발현(1년 초과)함이 입증되었고, 장기간의 발현이 요구되는 치료 효과를 위한 바람직한 벡터이다[참조: Daly TM, et al., Gene Ther., 2001; 8(17):1291-8].
레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 당해 바이러스의 유전자를 숙주 게놈내로 융합시키고, 다량의 외래 유전자 물질을 전이시키고, 넓은 스펙트럼의 종 및 세포 유형을 감염시키며, 특정 세포주 내 패키되는 능력으로 인해 유전자 전달 벡터로 선택될 수 있다.
레트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 외피 성분을 각각 코딩하는 3개의 유전자, gag, pol 및 env를 함유한다. gag 유전자로부터 업스트림 발견된 서열은 게놈을 비리온 내로 패키지하기 위한 신호를 포함한다. 2개의 긴 말단 반복 단위(LTR) 서열이 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강한 프로모터와 인핸서 서열을 함유하며, 또한 숙주 세포 게놈 내 융합에 필요 하다.
레트로바이러스 벡터를 구성하기 위해, 핵산을 인코딩하는 관심 유전자를 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제-결함 바이러스를 생산한다. 비리온을 제조하기 위해, 팩키지 세포주는 gag, pol 및/또는 env 유전자는 함유하지만 LTR 및/또는 패키지 성분은 비함유하도록 구성된다. cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 레트로바이러스 LTR 및 패키지 서열과 함께 이 세포주 내로 도입시킬 때(예를 들어 인산칼슘 침전에 의해), 패키지 서열로 인해 재조합 플라스미드의 RNA 전사가 바이러스 입자 내로 패키지되고, 다음으로 배양 배지 내로 분비된다. 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 다음으로 채집하고, 임의 농축하여 유전자 전이에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 넓은 범위의 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 융합 및 안정한 발현이 숙주 세포의 증식에 필요하다.
헤르페스 바이러스
단순 포진 바이러스(HSV)는 신경친화성이기 때문에, 신경계 장애를 치료하는 데 있어서 상당한 관심을 불러일으켰다. 더욱이, 잠복기 동안 활성인 프로모터의 존재와 함께, 비증식 신경 세포에 숙주 세포 크로모좀 내 융합됨 없이 또는 숙주 세포 대사를 변화시키지 않고 잠복 감염할 수 있는 HSV의 능력이, HSV를 흥미로운 벡터가 되게 하였다. HSV의 신경친화적 적용에 그리 많은 주의가 집중되진 않았지만, 이 벡터는 또한 넓은 숙주 범위의 조직에 사용될 수 있다.
HSV를 흥미로운 벡터가 되게 하는 다른 요인은 게놈의 크기 및 구성이다. HSV가 크기 때문에, 다수의 유전자 또는 발현 카셋트의 혼입으로 인한 문제가 다른 작은 바이러스 시스템에 비해 적다. 또한, 다양한 실행(일시적, 강도 등)과 함께 상이한 바이러스 조절 서열의 이용가능성이 다른 시스템에서보다 더 큰 정도로 발현을 조절하는 것을 가능하게 한다. 또한, 상기 바이러스가 상대적으로 적은 접합 매시지를 가지고 있고, 유전자 조작이 더 용이하기 때문에 이점이 있다.
또한, HSV는 조작이 상대적으로 용이하고, 높은 적정으로 성장할 수 있다. 따라서, 전달은, 충분한 다수의 감염(MOI)을 달성하기 위해 필요한 용적과 반복 투여의 필요성 감소의 관점 모두에서 문제점이 더 적다. 유전자 치료 벡터로서 HSV에 대해 문헌[참조예: Glorioso et al., Annu. Rev. Microbiol., 1995; 49:675-710]을 참조한다. HSV의 약독성 변이체가 개발되었고 유전자 치료 환경에의 사용을 위해 용이하게 이용할 수 있다(미국 특허 제5,672,344호).
렌티바이러스 벡터
렌티바이러스 벡터는 공통적 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 외에 조절 또는 구조 기능을 가진 다른 유전자를 함유하는 복합형 레트로바이러스이다. 높은 복잡성으로 인해 당해 바이러스는 잠복 감염 과정에서와 같이 라이프 사이클을 조절할 수 있다. 렌티바이러스의 특정 예는 사람 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2) 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 수회 약독화 HIV 독성 유전자에 의해 생성되며, 예를 들어 유전자, env, vif, vpr, vpu 및 nef가 제거되어 벡터를 생물학적으로 안정하게 만든다.
렌티바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제6,013,516호 및 5,994,136호]. 일반적으로, 벡터는 플라스미드계 또는 바이러스계로 외래 핵산을 혼입시키고, 선택하고 핵산을 숙주에게 전이시키기 위한 필수 서열을 함유하도록 배열된다. 또한, 관심 벡터의 gag, pol 및 env 유전자가 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 관련 유전자는 선택된 벡터 내에서 클로닝되고, 다음으로 관심 표적 세포를 형질전환하는 데 사용된다.
비증식 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 랜티바이러스가 미국 특허 제5,994,136호에 기술되어 있는 데, 여기서 적합한 숙주 세포가, 패키지 기능을 갖는 2개 이상의 벡터, 즉, rev 및 tat 뿐만 아니라 gag, pol 및 env로 형질전환된다. 여기서 핵산을 인코딩하는 바이러스 gag 및 pol 유전자를 제공할 수 있는 제1 벡터와, 핵산을 인코딩하는 바이러스 env를 제공하여 패키지 세포를 생산하는 수 있는 다른 벡터를 기술한다. 이종의 유전자를 제공하는 벡터를 패키지 세포에 도입시킴으로써 관심 외래 유전자를 운반하는 감염성 바이러스 입자를 방출시키는 생산자 세포를 수득한다. env는 바람직하게 사람 및 기타 종의 세포를 형질도입시키는 양친성(amphotropic) 외피 단백질이다.
우두 바이러스(Vaccinia Virus) 벡터
우두 바이러스 벡터는 제조의 용이성, 상대적으로 높은 수준으로 수득된 발현율, 넓은 숙주 범위 및 DNA 대용량 운반으로 인해 광범위하게 사용되고 있다. 우두는 현저한 "A-T" 선호도를 보이는, 선형, 약 186kb의 이중 가닥 DNA 게놈이다. 약 10.5kb의 역전된 말단 반복 단위가 게놈 측면에 위치(flank)한다. 필수 유전자의 대부분이 중앙 부위 내 위치하는 것으로 보이며, 폭스바이러스 중에서 매우 높게 보존된다. 우두 바이러스에서 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 150 내지 200으로 측정된다. 양 가락을 코딩하지만, 리딩 프레임의 광범위한 오버랩은 일반적이지 않다.
적어도 25kb가 우두 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 원형의 우두 벡터는 동종의 재조합을 통해 바이러스 티미딘 키나제 유전자 내 삽입된 트랜스진을 함유한다. 벡터는 tk-페노타입을 기준으로 선택된다. 뇌척수심근염 바이러스의 번역되지 않은 리더 서열의 봉입으로, 24시간 내 트랜스진이 감염된 세포의 단백질의 10% 이상으로 축적됨과 동시에 발현 수준이 통상적 벡터보다 높아진다.
폴리오마 바이러스 벡터
마우스 폴리오마 바이러스와 같은 파포바바이러스의 빈 캡시드가 유전자 전이를 위한 가능한 벡터로서 주목을 받아 왔다. 빈 폴리오마의 사용은 폴리오마 DNA 및 정제된 빈 캡시드가 세포 비함유 시스템에서 배양되었을 때 처음으로 기술되었다. 상기 새로운 입자의 DNA는 췌장 DNase의 작용으로부터 보호된다. 재구성된 입자는 형질전환 폴리오마 DNA 단편을 랫트 FIII 세포에 전이시키는 데 사용된다. 빈 캡시드 및 재구성된 입자는 모두 3가지 폴리오마 캡시드 항원, VP1, VP2 및 VP3로 이루어지며, 미국 특허 제6,046,173호는 소수 캡시드 항원은 배제시키고, 파포바바이러스 주요 캡시드 항원으로부터 형성된, 슈도캡시드의 사용을 기술하고 있으며, 여기에 유전자 전이를 위한 외인성 물질을 혼입한다.
기타 바이러스 벡터
본 발명의 발현 구조체로서 기타 바이러스 벡터, 예를 들어 신드비스(sindbis) 바이러스 또는 시토메갈로바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 벡터가 사용될 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 다양한 포유류 세포에 대해 몇가지 흥미로운 특징을 보유한다[참조예: Friedmann, Science, 1989; 244: 1275-1281; Horwich et al., J. Virol., 1990; 64:642-650].
결함있는 B형 간염 바이러스에 대한 인식과 함께, 사이한 바이러스 서열의 구조-기능 관계에 대한 새로운 시각이 얻어졌다. in vitro 연구는, 상기 바이러스가 당해 바이러스의 80% 이하의 게놈이 제거되었음에도 불구하고 헬퍼-의존적 패시지 및 역전사 능력을 보유할 수 있음을 보여준다[참조: Horwich et al., J. Virol. 64: 642-650(1990)]. 이는, 게놈의 대부분이 외래 유전자 물질로 대체됨을 시사한다. 장 등(Chang et al.)은 오리의 B형 감염 바이러스 게놈 내 폴리머라제, 표면 및/또는 예비-표면 코딩 서열 대신 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 도입시켰다. 이는 조류 헤파토마 세포주내로 야생형 바이러스와 함께 공-형질전환되었다. 고역가의 재조합 바이러스를 함유하는 배양 배지는 일차 오리 새끼 간세포를 감염시키는 데 사용되었다. 형질전환 후 적어도 24일에 안정한 CAT 유전자 발현이 검출되었다[참조: Chang et al., Hepatology 14:134A(1991)].
변형된 바이러스
본 발명의 추가적 양태에서, 전달되는 핵산은 특정 결합 리간드를 발현하도록 설계된 감염성 바이러스 내 하우징된다. 따라서, 바이러스 입자는 표적 세포의 동계(cognate) 수용체에 특이적으로 결합하여 내용물을 세포에 전달할 것이다. 레트로바이러스 벡터의 특이적 표적화를 허용하도록 설계된 새로운 접근법은 상기 바이러스 외피에 락토스 잔기를 화학적 첨가하여 레트로바이러스를 화학적으로 변형시키는 것에 기초하여 개발되었다. 이러한 변형에 의해 시알로글리코프로테인 수용체를 통해 간세포 특이적 감염을 일으킬 수 있다.
재조합 레트로바이러스의 표적화를 위한 다른 접근법은 레트로바이러스 외피 단백질 또는 특정 세포 수용체에 대한 비오틴화된 항체를 사용하는 것이 고안되었다. 상기 항체는 스트렙타비딘을 사용함으로써 비오틴 성분에 결합된다. 주요 조직적합성 복합형 클래스 I 및/또는 클래스 II 항원에 대한 항체를 사용함으로써, 상기 표면 항원을 함유한 다양한 사람 세포를 in vitro에서 동종숙주형(ecotropic) 바이러스로 감염시킬 수 있음을 입증하였다.
비-바이러스성 전이
본 발명의 DNA 구조체(constructs)은 일반적으로 세포에 전달된다. 그러나, 특정 양태에서, 전이되는 핵산이 비-감염성으로 비-바이러스법을 이용하여 전이될 수 있다.
발현 구조체를 배양된 포유류 세포에 전이시키기 위한 특정 비-바이러스법이 본 발명에서 고려된다. 본 발명에서 사용하는 핵산 전달을 위한 적합한 방법은 본원에 기술된 방법 또는 당업자에게 공지된 방법을 포함한다. 그러한 방법은 맥관 구조를 통한 "네이키드" DNA 플라스미드의 직접 전달(미국 특허 제6,867,196호); 리포좀 매개 형질전환(Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al, 1987; Wong et al, 1980; Kaneda et al, 1989; Kato et al, 1991) 및 수용체 매개 형질전환(Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988); 실리콘 카비드(carbide) 섬유와 함께 교반(Kaeppler et al, 1990; 미국 특허 제5,302,523호 및 제5,464,765호); 양이온 지질 사용; 네이키드 DNA; 또는 마이크로캡슐화된 DNA(미국 특허 출원 제2005/0037085호)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 위와 같은 기술을 사용하여, 표적 세포 또는 조직을 안정하게 또는 일시적으로 형질전환시킬 수 있다.
일단 구조체가 세포 내 전달되면, 핵산을 인코딩하는 치료 유전자가 상이한 부위에 위치하고 발현될 수 있다. 특정 양태에서, 핵산을 인코딩하는 치료 유전자는 안정하게 세포의 게놈 내로 융합될 수 있다. 당해 융합은 동종 재조합(유전자 대체)를 통해 동계 위치 및 방향에서 일어나거나 무작위의 비특이적 위치(유전자 증가)로 융합될 수 있다. 추가 양태에서, 핵산은 DNA의 분리된 에피솜 단편으로서 세포 내 안정하게 유지될 수 있다. 그러한 핵산 단편 또는 "에피솜"은 숙주 세포 사이클에 독립적이거나 동조된 유지 및 복제를 허용하기에 충분한 서열을 인코딩한다. 발현 구조체가 세포에 전달되는 방법 및 세포 내 어디에 핵산이 잔존하는 지는 사용된 발현 구조체의 종류에 따라 달라진다.
본 발명의 특정 양태에서, 발현 구조체는 리포솜 내 트랩핑(trapping)된다. 리포솜은 인지질 이중 막 및 내부 수성 매질이 특징인 소포성 구조체이다. 복수 라멜라 리포솜은 수성 매질에 의해 분리되는 다수의 지질 층을 갖는다. 상기 복수라멜라 리포솜은 인지질이 과량의 수성 용액 내 현탁될 때 자발적으로 생성된다. 상기 지질 성분은 닫힌 구조를 형성하기 전에 자기-재배열되어 물을 트래핑하여 지질 이중층 사이에 용매를 용해시킨다. 양이온성 리포솜에 DNA를 첨가함으로써 리포솜으로부터 임의적인 복굴절(birefringent) 액체-결정 축합된 글로블(globule)로 위상적 전이를 일으킨다.
리포솜-매개 핵산 전달 및 외래 DNA의 in vitro 발현은 매우 성공적이었다. β-락탐아제 유전자를 사용하여, 조사자들은 배양된 닭 배아, Hela, 및 헤파토마 세포에서, 리포솜 매개 전달 및 외래 DNA의 발현 가능성을 입증하였다. 정맥 주사 후 랫트에서 성공적인 리포솜-매개 유전자 전이가 또한 달성되었다. 또한, "리포펙션" 기술을 포함한 여러 상업적 접근이 포함된다.
본 발명의 특정 양태에서, 리포솜은 혈구응집성 바이러스(HVJ)와 복합체를 형성할 수 있다. 이것이 세포 막과의 융합을 용이하게 하며, 리포솜-캡슐화된 DNA의 세포 유입을 촉진하는 것으로 나타났다. 다른 양태에서, 리포솜은 핵의 비-히스톤 염색체 단백질(HMG-1)과 복합체를 형성하거나, 이와 결합하여 사용될 수 있다. 추가 양태에서, 리포솜은 HVJ 및 HMG-1 모두와 복합체를 형성하거나, 이들과 결합하여 사용될 수 있다. 그러한 발현 구조체는 in vitro 및 in vivo 핵산 전이 및 발현에 성공적으로 사용되고 있으며, 본 발명에서 또한 사용될 수 있다.
핵산을 인코딩하는 치료 유전자를 세포 내 전달하는 데 사용될 수 있는 기타 벡터 전달 시스템은 수용체 매개 전달 비히클이다. 이는 거의 모든 진핵 세포에서 수용체 매개 엔도시토시스에 의한 거대분자의 선택적 흡수라는 이점을 갖는다. 다양한 수용체의 세포 유형-특이적 분포로 인해, 전달은 매우 특이적일 수 있다(Wu and Wu, 1993). 리포솜이 사용되는 경우, 엔도시토시스와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 기타 단백질이, 예를 들어 특정 세포 유형에 친화적인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 사이클에서 내재화되는 단백질 항체 및 세포내 위치를 표적화하고 세포 내 반감기를 개선하는 단백질을 표적화하고/표적화하거나 단백질의 흡수를 돕는 데 사용될 수 있다.
수용체 매개 유전자를 표적화하는 비히클은 일반적으로 2개의 성분으로 구성된다: 세포 수용체-특이적 리간드 및 DNA-결합제. 몇몇의 리간드가 수용체 매개 유전자 전이에 사용되고 있다. 가장 광범위하게 특화된 리간드는 아시알로오로소뮤코이드(ASOR) 및 트랜스퍼링이다(참조: Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87(9):3410-14 (1990)). ASOR을 동일한 수용체로 인식하는 합성 네오글리코프로테인이 유전자 전달 비히클로 사용되고 있다. 표피 성장 인자(EGF)가 또한 평편세포암종에 유전자를 전달하는 데 사용되고 있다.
다른 양태에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포솜을 포함할 수 있다. 예를 들어, 연구자는 락토실-세라미드, 갈락토스-말단 아시알강글리오시드를 사용하여 리포솜 내 혼입시켜 간세포에 의해 인슐린 유전자의 흡수가 증가되는 것을 관찰하였다. 따라서,핵산을 인코딩하는 치료 유전자가 심장 세포와 같은 세포 유형에 리포솜 존재 또는 존재하에서 임의 개수의 수용체-리간드 시스템에 의해 특이적으로 전달될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 발현 구조체는 네이키드 재조합 DNA 또는 플라스미드로만 이루어질 수 있다. 구조체의 전이는 물리적으로 또는 화학적으로 세포 막을 투과하는 위에서 언급한 임의의 방법으로 실시될 수 있다. 이는 특히 in vitro 전이에 사용될 수 있으나, in vivo 용도를 위해서도 물론 사용될 수 있다. 치료적 DNA가 유사한 방식으로 in vivo 전이될 수 있음이 고려된다. 울프 등(Wolff et al.)(미국 특허 제6,867,196호)는 심장 조직 내로의 효과적인 유전자 전이가 플라스미드 DNA 용액을 심장의 정맥이나 동맥 내 주사함으로써 수득될 수 있음을 교시한다. 울프는 또한 RNA, 비-플라스미드 DNA 및 바이러스 벡터의 투여를 교시한다.
본 발명에 유용한 벡터는 다양한 형질전환 효율을 갖는다. 그 결과로, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 표적화된 혈관 부위 세포의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%, 또는 상기 값 초과, 또는 적어도 약 상기 값의 세포를 형질도입시킨다. 하나 이상의 벡터(바이러스 또는 비-바이러스, 또는 이의 조합)가 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 이는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 전이시키고/전이시키거나 하나 이상 유형의 세포를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 다수의 벡터 또는 다수의 유전자가 사용되는 경우, 하나 이상의 형질도입/형질전환 효율을 수득할 수 있다.
치료 성분
본 발명에 유용한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료 성분은 심혈관 질환을 치료하기 위해 사용된다. 당해 성분은 임의 양상의 심혈관 질환을 치료하는 것으로 공지된 화합물을 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 심혈관계의 공지된 임의의 핵산 또는 단백질을 표적화하여 심장 조직의 세포 활성을 조절할 수 있다. 심장 근육에서 칼슘 농도를 조절하는 핵산 및 단백질을 포함하여, 심장 근육의 수축에 필요한 핵산 및 단백질이 특히 관심 대상이다.
각각의 근육 수축은 근육 세포 세포질 내로의 Ca2+ 유입이 요구되는 반면, 이완은 활성화된 Ca2+의 제거가 필요하며, 이러한 Ca2+의 수축 조절이 사람의 체내에서 가장 광범위한 작용 중 하나가 된다. 따라서, Ca2+의 조절에 관여하는 단백질이 변이되었을 때, Ca2+ 조절 결핍과 관련된 다양한 골격 및 심장 근육 질환을 일으킬 수 있다는 것은 놀라운 일이 아니다.
근소포체(Sarcoplasmic reticulum) 칼슘-ATPase(SERCA) 펌프는 칼슘을 포유류 세포의 세포질내로부터 근육 내 근소포체 또는 비-근육 세포 내 엔도플라스믹 소포체와 같은 기관 구조물 내로 유입되도록 한다. 칼슘에 의한 활성화 역치는 100 내지 200nM 정도로, 이것이 세포질 칼슘의 휴지기 수준을 정한다. 실험적 및 사람 심부전의 특징인 비정상적 칼슘 사이클은 손상된 근소포체 칼슘 재흡수 작용과 관련이 있다.
SERCA2a, 심장/지근(slow-twitch) 이소폼(isoform)은, 포스포람반(PLN), 52 아미노산, 3개의 도메인으로 구성된 호모펜타메릭(homopentameric) 단백질에 결합하고 이에 의해 조절된다.
근육 수축 동안에, 포스포람반은 Ca2+ 펌프를 억제한다. 근육 이완 동안에, 이는 인산화되어 억제 작용이 없어지고 Ca2+이 근소포체 내로 재유입되게 한다. 상기 조절은 포스포람반 단량체와 펌프 사이의 물리적 상호작용이 일차적 원인인 것으로 생각된다. 그러나, 52 잔기 펩티드가 또한 Ca2+ 이온에 선택적인 것으로 보이는 펜타머에 연합된다.
손상된 근소포체 칼슘 흡수 작용은 cAMP-경로 시그날링의 감소 및 타입 1 포스파타제 활성 증가를 반영한다. 증가된 단백질 포스파타제 1 활성의 일부 원인은, 탈인산화의 불활성화와, 포스포람반의 탈인산화 및 근소포체 칼슘-펌프 억제를 촉진시키는 이의 억제제-1의 불활성화이다. 실제로, 구조적으로 활성인 억제제-1의 심장-특이적 발현으로, 포스포람반 인산화가 선택적으로 향상되고 세포 및 손상되지 않은 동물 수준에서 심장 수축력이 증가된다. 현저하게, 활성 억제제-1의 급성 아데노바이러스 유전자 전달로 기능을 완전히 회복하고, 기존 심부전의 세팅에서 과활성화된 p38의 정상화를 포함한 부분적으로 리모델링을 역전시킨다[참조: Pathak et al. Circ Res., 2005; 96(7):756-66].
심실성 부정맥이 정상 심장을 가진 환자와 심부전과 같은 질환을 가진 환자에서 급작스런 심장사(SCD)를 일으킬 수 있다. 심부전을 가진 동물 및 유전 형태의 운동 유도된 SCD를 가진 환자에서, 리아노딘 수용체-칼슘 방출 채널(RyR2) 복합 체로부터의 채널-안정화 단백질 칼스타빈2(FKBP12.6)의 결핍이 세포 내 Ca2+ 누수를 일으키고, 이것이 치명적 심장 부정맥을 촉발시킬 수 있다. 칼스타빈2의 수준 증가가 RyR2의 닫힌 상태를 안정화시키고, 부정맥을 촉발시키는 Ca2+ 누수를 방지한다. 따라서, 칼스타빈2의 RyR2에의 결합 개선이 일반적 심장 부정맥에 대한 치료 전략으로 생각된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 바람직한 타겟은 Ca2+에 중요한 역할을 하는 관련 핵산 및 단백질 외에, SERCA의 핵산 및 단백질, 포스포람반, 타입 1 인산화효소 억제제-1, S100A1 및 사콜리핀(sarcolipin)이다.
바람직한 바이러스 벡터 및 트랜스진은 AAV2/1/SERCA2a로, 이는, 사람 SERCA2a 발현 카셋트를 함유한 단일 가락 4486 뉴클레오티드 DNA를 감싸고 있는 AAV 세로타입 1 바이러스 캡시드를 포함하며, 여기서 SERCA2a 발현 카셋트의 측면에 AAV 세로타입 2로부터 유도된 ITR이 위치한다. 위 20면체(icosahedral) 캡시드는 3개의 관련 AAV 세로타입 1 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3으로 이루어진다. AAV2/1/SERCA2a DNA는 다음 성분을 함유한다: 3' 및 5' 말단에 AAV 세로타입2계 ITR, 플랭킹 CMV-hSERCA2a-폴리A 발현 카셋트. 발현 카셋트는 시판되는 플라스미드 pCI(프로메가-GenBank U47119), hSERCA2A cDNA(GenBank NM-001681과 동일한 코딩 서열) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날[BGHpA, (GenBank M57764)]로부터의 하이브리드 인트론을 포함하는 서열의 전사를 유도하는 시토메갈로바이러스 즉시 초기 인헨서/프로모터(CMVie)를 함유한다. 상기 하이브리드 인트론은 사람 b- 글루빈의 제1 인트론으로부터 5'-도우너 부위 및 면역글루불린 유전자 중쇄 변이 영역의 리더와 몸체 사이에 위치한 3'-수용 부위를 사용하여 디자인된다(도 1 참조).
AAV2/1/SERCA2a 벡터는 벡터 게놈 내 야생형 AAV(wtAAV) 서열의 300개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 wtAAV 서열은, SERCA2a DNA가 캡시드 내 삽입되도록 하는 cis 패키지 시그날(도 2)을 제공하는, AAV 세로타입 2 유도된 ITR이다.
특정한 작용 메카니즘에 얽매이지 않고, SERCA2a 단백질 수준은 CHF를 가진 환자의 심근 세포에서 감소되고, 심근세포에서 상기 단백질의 수준 증가가, CHF에 전형적인 비정상적으로 높아진 세포질 칼슘의 심장확장기 수준을 정상화시키고 임상적 결과를 개선할 것이라고 여겨진다.
상기 언급한 바와 같은, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 및 비-바이러스 벡터와 조합된 폴리뉴클레오티드를 포함한 치료제가 심혈관 질환 치료용 약제의 제조에 사용될 수 있으며, 여기서 상기 약제는 관상 순환 내로 직접 주입에 의해 투여된다.
치료 효과
바람직한 양태에서, 본원에 기술된 치료제의 주입은 심장 질환으로 고통받는 환자에서 치료 효과를 얻기 위해 사용된다. 치료되는 개인은 심장 장애를 수반하는 임상적 특징이 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 대상체에서 심혈관 질환 관련 해로운 징후 및 증상의 감소가 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용하여 대상체의 울혈성 심부전을 치료한 후, 다수의 임상적 파라미터, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 측심실 분획 단축률 증가; 세포 및 손상되지 않은 동물 수준에서 심장 수축력 증가; 심장 리모델링의 역전; 및 비정상적으로 높은 확장기 수준의 세포질 칼슘의 정상화의 개선에 대해 평가할 수 있다. 본 발명으로 치료된 대상체에 대해 모니터링될 수 있는 기타 임상적 특징은 제한없이, 생존률, 심장 대사, 심장 수축성, 심박률, 심실 기능(예: 좌심실 이완기말 혈압(LVEDP), 좌심실 수축기 혈압(LVSP)), Ca2+ 대사(예: 세포 내 Ca2+ 농도, 피크 또는 휴지기 [Ca2+], SR Ca2+ ATPase 활성, 포스포람반의 인산화 상태), 전기 발생, 심장의 이완 및 압력, 힘 빈도 관계(force frequency relationship), 심근세포 생존률 또는 어팝토시스 또는 이온 채널 활성(예: 나트륨 칼슘 교환, 나트륨 채널 활성, 칼슘 채널 활성, 나트륨 칼륨 ATPase 펌프 활성), 미오신 중쇄 활성, 트로포닌 I, 트로포닌 C, 트로포닌 T, 트로포미오신, 액틴, 미오신 광 쇄(light chain) 키나제, 미오신 광 쇄 1, 미오신 광 쇄 2 또는 미오신 광 쇄 3, IGF-1 수용체, PI3 키나제, AKT 키나제, 나트륨-칼슘 교환제, 칼슘 채널(L 및 T), 칼스퀘스트린 또는 칼레티쿨린을 포함한다. 평가는 치료 전, 치료 후 또는 치료 도중 실시할 수 있다. 모니터링될 수 있는 심장 질환의 기타 척도는, 분획 단축률, 심박출량, 박출률, Tau, 역류량, 입원 기간, 삶의 질 및 트래드밀(treadmill) 시간을 포함한다.
본원에 기술된 방법 및 치료제는 심장 질환에 현재 사용되는 치료, 예를 들어 약물 또는 외과적 개입과 함께 사용되어 현재 사용되는 치료 단독에 비해 향상 된 치료 효과를 제공할 수 있다. 향상된 치료 효과는 예를 들어 현재 사용되는 치료 요법에서의 평균 또는 일반적 시간 기간 보다 질환의 징후 또는 증상이 악화되는 시간 기간의 연장, 또는 표준 치료 단독에서의 평균 또는 일반적인 시간에 비해 추가적 치료가 요구되기 전에 필요한 시간의 단축에 의해 입증될 수 있다.
이하, 본 발명의 양태는 다음의 비제한적 실시예를 들어 추가로 기술될 것이다.
실시예 1: 정상 미니피그에서 AAV2/1/SERCA2a의 단기간 생체분포에 대한 주입 시간의 영향
본 연구는 정상 미니피그에 AAV2/1/SERCA2a의 전방 심외막(epicardial) 관상 주입 후 벡터-특이적 DNA의 정량화에 의한 심근육의 형질도입을 평가하기 위해 실시되었다.
그룹
본 연구를 위한 대조군(1마리 동물)은 비치료 대조군이다. 이 동물은 AAV2/1/SERCA2a 투여를 제외하고는 다른 그룹과 동일한 과정으로 진행되었다. 실험 동물에 제약가능한 주사기 펌프를 사용하여 관상 동맥 주입 카테터를 통해 좌측 관상 동맥 내(그룹 3 내지 5에서 5마리 동물) 또는 직접 근육 내(IM)(그룹 2에서 1마리 동물) 내 1×1012 DRP AAV2/1/SERCA2a를 투여하였다. 그룹들에 2개의 벡터 농 도 및 상이한 주입 속도로 AAV2/1/SERCA2a를 투여하였다. 벡터를 투여받은 모든 그룹들에 벡터 투여 후 튜빙 및 카테터의 사장 체적의 혈액을 플러쉬(flush)하였다. 상기 동물은 괴팅겐 미니피그로, 적어도 4개월령이고, 무게는 8 내지 12kg이었다. 동물을 표 1에서와 같이 5개의 그룹 중 하나에 배치하였다.
그룹 지정
치료 그룹 농도/주입 시간 총 투여량(DRP) 그룹 내 개수 벡터 주입 시간(분)
그룹 1: 비치료 대조군 N/A 1 N/A
그룹 2: 직접 IM 주입 1×1012 1 N/A
그룹 3: 순간 주사(~0.5분) 1×1012 1 0.5
그룹 4: 10분 주입 1×1012 3 10
그룹 5: 15분 주입 1×1012 1 15
마취/혈액 샘플
0일째에, 동물을 표준 방법을 사용하여 마취시켰다. 항생제를 뒷다리 근육에 예방적으로 투여하였다. 바이탈 사인(심박, 호흡 속도, 및 O2 포화도 측정기)을 모니터링하였다. ECG를 모니터링 목적을 위해 수득하였다.
AAV2/1/SERCA2a 투여
직접 IM 주입에 의한 AAV2/1/SERCA2a 투여: 그룹 2
0일째에, 표준 근육 내 주사기 및 바늘을 사용하여 후미 4분원 근육 내 AAV2/1/SERCA2a를 주사하였다. 투여된 용적 및 농도는 하기 표 2에 나타낸다. 사용 전까지 AAV2/1/SERCA2a를 -70±10℃ 이하로 냉동 보관하였다. 사용 당일에, AAV2/1/SERCA2a를 실온에서 해동시키고 동물이 투여 준비될 때까지 얼음 상 보관하였다. 역위(inversion)로 서서히 혼합한 후, 1.4 × 1012 DRP/ml에서 0.72ml의 AAV2/1/SERCA2a 저장 용액을 표준 근육 내 주사기 및 바늘 내로 무균적으로 이동시켰다. 다음으로, 총 단일 투여량 1× 1012 DRP AAV2/1/SERCA2a을 후미 4분원 근육에 근육 주사하였다.
일반적 공정: 전방 심외막 관상 주입에 의한 AAV2/1/SERCA2a 투여(그룹 3 내지 5)
직접 주입 시스템은, 통상적 유도 삽입관, 0.014'' 유도선, 5F 주입(유도) 카테터 및 2개의 제어가능한 주사기 펌프를 포함하는, 표준(시판되는) 성분으로 구성된다. 이 방법의 중요한 측면은 벡터 투여에 사용된 주입 시간이다. 정확한 용적은 출발 벡터 농도, 튜빙 및 카테터 단위 등의 사장 체적에 따라 달라질 수 있다.
0일째에, 직접 주입 과정을 대퇴동맥 접근으로 유도 삽입관을 도입함으로써 개시하였다. 다음으로 관상 주입 카테터(예: 코디스 비스타 브리테 팁 유도 카테터 또는 좌측 주요 관상 동맥의 캐뉼러화에 적합한 유사한 모델)를 형광투시법의 유도하에 좌측 주요 관상 동맥 내 위치시켰다. 카테터가 자리잡은 후, 이를 표준 튜빙(tubing) 및 퍼징(purging) 기술을 사용하여 제1 제어가능한 주사기 펌프(예: NE-1000 제어가능한 주사기 펌프, 뉴 에라 펌프 시스템)에 연결하였다. 다음으로, AAV2/1/SERCA2a를 전달한 후, 제2 제거가능한 주사기 펌프로 카테터 사장 체적의 혈액을 플러쉬하였다. 직접 주입 방법에 필요한 부재 및 과정 단계에 대한 상세한 목록을 표 3 및 표 4에 나타낸다. 희석 용적, 주입 시간, 주입 속도, 혈액만의 플러쉬 전에 전달되는 용적, 혈액만의 플러쉬를 종결하는 데 걸리는 시간을 표 2에 나타낸다.
그룹 3: AAV2/1/SERCA2a 투여(순간 주사)
역위로 서서히 혼합한 후, 1.4×1012 DRP/mL에서 0.72mL의 AAV2/1/SERCA2a 저장 용액 및 1.3mL의 제형 완충액(pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)을 무균의 프로필렌 용기 내 무균적으로 이동시켜, 농도 5.0×1011 DRP/mL가 되게 하였다. 동물에 투여하기 직전, 20mL의 희석된 AAV2/1/SERCA2a(5×1011 DRP/mL)를 실온으로 옮기고 투여대상 동물로부터의 1.0mL의 전체 원혈액(native blood)과 혼합하여 최종 희석액인 최종 용적 3.0mL 내 3.3×1011 DRP/mL의 주사기가 되게 하였다. 회선을 혈액으로 애벌칠하고 다음으로 벡터를 0.5분 동안 좌측 주요 관상 동맥 내 주사하였다. 다음으로, 카테터 사장 용적의 혈액만으로 플러쉬하였다.
그룹 4: AAV2/1/SERCA2a 투여(10분 벡터 주입)
역위로 서서히 혼합한 후, 1.4×1012 DRP/mL에서 0.72mL의 AAV2/1/SERCA2a 저장 용액 및 7.3mL의 제형 완충액을 무균의 프로필렌 용기 내 무균적으로 이동시켜, 농도 1.25×1011 DRP/mL가 되게 하였다. 동물에 투여하기 직전, 8.0mL의 희석된 AAV2/1/SERCA2a(1.25×1011 DRP/mL)를 실온으로 옮기고 투여대상 동물로부터의 4.0mL의 전체 원혈액(native blood)과 혼합하였다. 주입 회선을 혈액으로 애벌칠하고 다음으로 벡터를 제어가능한 주사기 펌프를 사용하여 10분 동안 좌측 주요 관상 동맥 내 전달한 후, 제2 제어가능한 주사기 펌프로 카테터 사장 용적의 혈액만을 플러쉬하였다.
그룹 5: AAV2/1/SERCA2a 투여(10분 벡터 주입)
역위로 서서히 혼합한 후, 1.4×1012 DRP/mL에서 0.72mL의 AAV2/1/SERCA2a 저장 용액 및 1.3mL의 제형 완충액을 무균의 프로필렌 용기 내 무균적으로 이동시켜, 농도 5.0×1011 DRP/mL가 되게 하였다. 동물에 투여하기 직전, 2.0mL의 희석된 AAV2/1/SERCA2a(5×1011 DRP/mL)를 실온으로 옮기고 투여대상 동물로부터의 1.0mL의 전체 원혈액(native blood)과 혼합하였다. 주입 회선을 혈액으로 애벌칠하고 다음으로 벡터를 제어가능한 주사기 펌프를 사용하여 15분 동안 좌측 주요 관상 동맥 내 전달한 후, 제2 제어가능한 주사기 펌프로 카테터 사장 용적의 혈액만을 플러쉬하였다.
희석/주입 계획
치료 그룹 농도/주입 시간 총 투여량(DRP) 희석된 벡터량(mL) 혈액량(mL) 투여된 벡터와 혈액의 총 용적(mL) 벡터 주입 시간(분) 주입 속도(mL/분) 혈액만의 플러쉬를 위한 시간(분)
그룹 1: 비치료 대조군 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
그룹 2: 직접 IM 주입 1×1012 0 0 0.72 N/A N/A N/A
그룹 3: 순간 주사(~0.5분) 1×1012 2.0 1.0 3.0 0.5 6.0 1
그룹 4: 10분 주입 1×1012 8.0 4.0 12.0 10 1.2 2
그룹 5: 15분 주입 1×1012 2.0 1.0 3.0 15 0.2 10
직접 주입 방법을 위한 부재들
수량 부재
1 적합한 형상을 가진 표준 유도 카테터(5F)
필요에 따라 임의의 지혈 밸브, 3-웨이 스탑쿡(stopcock) 또는 중재적 심장 과정에 사용되는 임의의 기타 부속물
1 0.014”×175cm(최소 길이) 유도 선(임의적인)
1 유도 선 안내관(임의적)
2 제어가능한 주사기 펌프(NE-1000 제어가능한 주사기 펌프, 뉴 에라 펌프 시스템)
2 내지 3 10 내지 20 cc 주사기
직접 주입 방법의 과정 단계
단계 과정
1 직접 주입 시스템을 사용하기 전, 포장으로부터 성분을 조심스럽게 분리하고 벤드, 결함(kink) 및 기타 손상을 검사. 어떠한 결함이라도 발견된다면 사용하지 말 것.
2 표준 중재 실시에 따라 동맥 접근 부위를 준비
3 표준 유도관(introducer sheath)의 배치를 통한 동맥 접근 달성
4 형광투시법의 유도하 및 표준 중재 심장 과정에 따라 표준 유도 카테터를 좌측 주요 관상 동맥 내로 도입(특정 혈관 해부도에 적합한 카테터 모양을 사용)
5 규격화된 공정에 따라 헤파린 투여
6 AAV2/1/SERCA2a 전달을 위한 제1 제어가능한 주사기 펌프 준비
7 투여대상 동물로부터의 원혈액으로 튜빙을 애벌칠하고, 튜빙로부터 모든 공기를 제거
8 튜빙의 원단(distal end)을 유도(주입) 카테터 상 지혈 밸브와 연결시킴. 모든 공기가 튜빙으로부터 제거됨을 확임
9 튜빙의 근단을 AAV2/1/SERCA2a 적재된 주사기에 연결
10 AAV2/1/SERCA2a 적재된 주사기를 주사기 펌프에 위치시킴
11 제1 예비-프로그램된 펌프를 작동시키고 프로토콜에서 정해진 시간 동안 작동시킴
12 제2 제어가능한 주사기 펌프 준비, 투여대상 동물로부터의 원혈액으로 튜빙을 애벌칠, 튜빙로부터 모든 공기를 제거
13 연구 프로토콜에서 정해진 유속으로 AAV2/1/SERCA2a 전달
14 전달 기간이 종료시, 제1 주사기 펌프를 중지하고 튜빙의 근단을 분리
15 튜빙의 근단을 투여대상 동물로부터의 원혈액으로 충전된 제2 주사기 펌프에 즉시 연결
16 제2 주사기 펌프를 재작동(AAV2/1/SERCA2a 전달에 사용된 유속과 동일한 속도)시키고 혈액을 주입
17 카테터 사장 체적 플러쉬를 종결시, 주사기 펌프를 중지
18 지혈 밸브 상 스탑콕을 오프 위치로 바꾸고 튜빙을 분리
19 표준 과정에 따라서 유도 카테터(주입) 제거
20 규격화된 공정에 따라서 튜빙 및 주사기를 처리
2일째: 말기 희생 및 PCR 조직 샘플
마취제를 투여하고 혈액 샘플을 임상 화학을 위해 채집하였다. 다음으로, 동물에 30mg/kg 염화칼륨을 정맥 투여하여 안락사시키고 도 3에 도시한 바와 같이 심장의 다음 부위로부터, 즉, 좌측 심실의 기저 및 중간 층에서 전방 벽, 후방 벽, 중격 및 프리(free) 벽; 및 우측 심실의 기저 층 및 상층부로부터 프리 벽을 표준 기술을 사용하여 PCR 조직 샘플을 채직하였다.
샘플의 PCR 분석
정량적인 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 검사를 이용하여 채집된 조직 샘플 내 AAV2/1/SERCA2a를 동정하고 정량하였다. qPCR 검사는 ABI 프리즘 7700 서열 탐지 시스템을 사용하여 AAV2/1/SERCA2a에 유일한 107 염기 쌍 서열을 탐지한다. qPCR 프라이머는 도 4의 도표에 나타낸 바와 같이 엑손 14 및 15를 신장시킨다. 각 조직 샘플로부터 추출된 1 ㎍의 게놈 DNA에서 탐지된 AAV2/1/SERCA2a의 카피수가, 표준으로서 표적 서열(pcDNA3.1_huSERCA2)을 함유하는 플라스미드의 단계적 희석을 사용하여 정량된다. 검사 검출의 하한은 AAV2/1/SERCA2a/㎍ DNA의 20개 카피이고 정량의 하한은 200개 카피/㎍ DNA이다.
결과
실험 결과는 도 5에 도시되어 있으며, 순간 주사 후(30초, 그룹 3) 얻어진 퍼센트 수준으로서 발현된 상대적 양과 함께 AAV2/1/SERCA2a/㎍ DNA 카피수가 기록되었다. 12개의 상이한 심장 샘플(도 3)로부터의 값은 각 동물에 대한 단일 값으로 평균화되었으며 당해 값은 각 동물 기준으로 기록된다. 순간 주사(0.5분)와 비교해, 10분의 주입 시간으로 평균 51.6%의 카피수(32% 내지 69%)로 증가되었고, 15분의 주입 시간으로 순간 주사에 비해 76% 이상의 카피수에 도달하였다. 출원인은 직접 IM 주사로 상당한 양의 카수 수에 도달하였으나, 이는 2일째에 동물을 희생시키고 세망내피계(모노사이트/마크로파지)에 의해 AVV 벡터의 진행된 제거의 결과임을 주목한다(참조: Brain J.D., et al., Am J Physiol. Lung Cell MoI. Physiol., 1999; 276:146-154). AAV1 벡터의 IM 주사로 유의한 심장의 장기간 형질도입에 이르지 못한다(참조: Rip J, et al., Hum. Gene Ther., 2005; 16(11): 1276-86). 대조적으로, 전방 심외막 관상 주입으로 실시예 3을 통해 증명되는 바와 같이 조직의 안정한 형질도입을 얻을 수 있다. 이러한 결과는, 각 그룹 당 동일한 양의 AAV2/1/SERCA2a(1×1012 DRP)가 투여되었음에도, 주입 시간을 연장시킴으로써, ㎍ DNA 당 AAV2/1/SERCA2a 카피수를 증가시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 2: 양에서 AAV2/1/SERCA2a의 단기 생체 분포에 대한 벡터 용량 및 투여 경로의 영향
정상 양에 정맥 주사시와 비교하여, 좌측 관상 동맥 내 주입을 통한 단일 투여 후 2일째에 3개의 상이한 용량의 AAV2/1/SERCA2a의 단기 생체 분포를 평가하는 파일럿 연구를 수행하였다.
그룹들
1마리의 동물에 제어가능한 주사기 펌프를 사용하여 좌측 관상 동맥 내 주입된 관상 동맥 내 카테터에 의해 1×1013 DRP의 AAV2/1/SERCA2a를 투여하였다. 3마리 동물의 제2 그룹에 3×1012 DRP의 AAV2/1/SERCA2a를 투여하고, 2마리 동물의 제3 그룹에 1×1012 DRP의 AAV2/1/SERCA2a를 투여하였으며, 상기 모든 투여는 제어가능한 주사기 펌프를 사용한, 좌측 관상 동맥 내 주입된 관상 동맥 내 카테터에 의해 이루어졌다. 모든 주입 그룹은 2.5mL/분의 일정한 유속으로 8분 동안 AAV2/1/SERCA2a를 투여받았으며, 후에 2분 동안 카테터 체적의 혈액만을 플러쉬하였다. 대조군의 1마리 동물에 2mL의 정맥 주사액 중 1×1012 DRP의 AAV2/1/SERCA2a를 투여하였다. 상기 그룹을 하기 표 5에 나타내었으며, 투여 계획은 표 6에 나타내었다.
그룹 지정
치료 그룹 전체 용량
그룹 1-주사기 펌프에 의한 좌측 관상 동맥 내 AAV2/SERCA2a 주입 3 1×1013 DRP
그룹 2-주사기 펌프에 의한 좌측 관상 동맥 내 AAV2/SERCA2a 주입 3 3×1012 DRP
그룹 3-주사기 펌프에 의한 좌측 관상 동맥 내 AAV2/SERCA2a 주입 2 1×1012 DRP
그룹 4-정맥 주사를 통한 AAV2/SERCA2a 주입 1 1×1012 DRP
희석/투입 계획
치료 그룹 농도/투여 경로 총 용량(DRP) 희석된 벡 터량(mL) 혈액량( mL) 투여된 벡터와 혈액의 총 용적(mL) 벡터 주 입/주사 시간(분) 주입 속 도(mL/ 분) 혈액만의 플러쉬를 위한 시간(분)
그룹 1: 1×1013 DRP 관상 내 주입 1×1013 10 10 20 8 2.5 2
그룹 2: 3×1012 DRP 관상 내 주입 3×1012 10 10 20 8 2.5 2
그룹 3: 1×1012 DRP 관상 내 주입 1×1012 10 10 20 8 2.5 2
그룹 4: 1×1012 DRP 정맥 주사 1×1012 2.0 N/A N/A ~0.5 N/A N/A
AAV2/1/SERCA2a 투여
일반 공정: 전방 심외막 관상 주입을 통한 AAV2/1/SERCA2a 투여(그룹 1 내지 3)
0일째에, 모든 동물에 전용량의 헤파린을 투여하여 ACT>300을 수득하였다. 제어가능한 주사기 펌프를 이용하여 AAV2/1/SERCA2a를 관상 동맥 주입 카테터를 통해 좌측 관상 동맥 내 주입하였다. 카테터를 이식하기 위한 부재 및 공정이 상기 실시예 1 및 표 3 및 표 4에 기술되어 있다. 본질적으로 동일한 과정이 수행되었다.
그룹 1: 1.0×10 13 AAV2/1/SERCA2a 투여(8분 벡터 주입)
역위로 서서히 혼합한 후, AAV2/1/SERCA2a 저장 용액을 무균 폴리프로필렌 튜빙에 무균적으로 이동시키고 제형 완충액(pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)으로 희석하여 총 용적 10ml로 하여 농도 1×1012 DRP/mL가 되게 하였다. 동물에 투여하기 직전, 10mL의 희석된 AAV2/1/SERCA2a(1×1012 DRP/mL)를 실온으로 옮기고 투여대상 동물로부터 10mL의 전체 원혈액(native blood)과 혼합하여 최종 용적 20.0mL가 되게 하였다. 주입 회선을 혈액으로 애벌칠하고 다음으로 벡터를 제어가능한 주사기 펌프를 사용하여 2.5mL/분의 일정한 속도로 8분 동안 좌측 주요 관상 동맥으로 전달하고 제2 제어가능한 주사기 펌프로 카테터의 사장 체적의 혈액만을 플러쉬하였다.
그룹 2: 3.0×10 12 AAV2/1/SERCA2a 투여(8분 벡터 주입)
역위로 서서히 혼합한 후, AAV2/1/SERCA2a 저장 용액을 무균 폴리프로필렌 튜빙에 무균적으로 이동시키고 제형 완충액(pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)으로 희석하여 총 용적 10ml로 하여 농도 3×1011 DRP/mL가 되게 하였다. 동물에 투여하기 직전, 10mL의 희석된 AAV2/1/SERCA2a(3×1011 DRP/mL)를 실온으로 옮기고 투여 대상 동물의 10mL의 전체 원혈액과 혼합하여 최종 용적 20.0mL가 되게 하였다. 주입 회선을 혈액으로 애벌칠하고 벡터를 제어가능한 주사기 펌프를 사용하여 2.5mL/분의 일정한 속도로 8분 동안 좌측 주요 관상 동맥으로 전달하고 제2 제어가능한 주사기 펌프로 카테터의 사장 체적의 혈액만을 플러쉬(flush)하였다.
그룹 3: 1.0×10 12 AAV2/1/SERCA2a 투여(8분 벡터 주입)
역위로 서서히 혼합한 후, AAV2/1/SERCA2a 저장 용액을 무균 폴리프로필렌 튜빙에 무균적으로 이동시키고 제형 완충액(pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)으로 희석하여 총 용적 10ml로 하여 농도 1×1011 DRP/mL가 되게 하였다. 동물에 투여하기 직전, 10mL의 희석된 AAV2/1/SERCA2a(1×1011 DRP/mL)를 실온으로 옮기고 투여 대상 동물의 10mL의 전체 원혈액과 혼합하여 최종 희석액인 최종 용적 20.0mL 내 0.5×1011 DRP/mL의 주사기가 되게 하였다. 주입 회선을 혈액으로 애벌칠하고 다음으로 벡터를 제어가능한 주사기 펌프를 사용하여 2.5mL/분의 일정한 속도로 8분 동안 좌측 주요 관상 동맥으로 전달하고 제2 제어가능한 주사기 펌프로 카테터의 사장 체적의 혈액만을 플러쉬(flush)하였다.
그룹 4: 1.0×10 12 AAV2/1/SERCA2a 투여(정맥 주사)
역위로 서서히 혼합한 후, AAV2/1/SERCA2a 저장 용액을 무균 폴리프로필렌 튜빙에 무균적으로 이동시키고 제형 완충액(pH 7.4의 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)으로 희석하여 총 용적 2.0mL로 하여 농도 1×1012 DRP/mL가 되게 하였다. 상기 용액을 표준 정맥 주사기 및 바늘을 사용하여 정맥 주사(~0.5분)로 투여하였다.
2일째: 말기 희생 및 PCR 조직 샘플
마취제 투여 후 동물에 30mg/kg 염화칼륨을 정맥 투여하여 안락사시키고 표준 기술을 사용하여 PCR 조직 샘플을 채집하였다. 샘플은 심장의 다음 부위, 즉, 좌측 심실의 전방 벽, 좌측 심실의 내부 벽, 심실내 중격 및 우측 심실 프리 벽으로부터 채집하였다.
샘플의 PCR 분석
실시예 1에 기술된 정량적 PCR 검사를 채집된 조직 샘플 내 AAV2/1/SERCA2a를 검출하고 정량하는 데 사용하였다.
결과
실험 결과를 도 6에 도시하였으며, 여기서 심장 조직의 각 샘플에서 AAV2/l/SERCA2a/ ㎍ DNA 카피수가 각 동물에 대해 기록된다. AAV2/l/SERCA2a가 매우 낮은, 정량되지 않는 수준(20 내지 200 카피수)의 결과를 보이는 정맥 주사(~0.5분)와는 달리, 8분의 주입 시간으로 1×1012, 3×1012 및 1×1013 농도에서 유의한 카피수를 나타내었다. 도 6은 총 용량 1×1013 DRP가 총 용량 3×1012 DRP보다 카피수가 더 증가하고, 차례로 총 용량 3×1012 DRP가 총 용량 1×1012 DRP보다 카피수가 더 증가함을 보여준다. 중요하게, AAV2/l/SERCA2a의 카피는, 벡터가 좌측 관상 동맥에만 투여되었음에도 불구하고 우측 심실 샘플에서 관찰되었다.
실시예 3: 심부전의 돼지 승모판 역류 모델
중증 승모판 역류(MR)에 의해 생성된 심부전의 돼지 모델에서 심기능에 대한 AAV2/l/SERCA2a 단독 투여의 효과를 비히클 대조군과 비교하여 평가하기 위해 파일럿 연구를 수행하였다. 승모판 폐쇄부전으로 또한 공지된 승모판 역류(MR)는 승모판을 통해 심장의 좌측 심실로부터 좌측 심방으로 혈액이 비정상적으로 새는 것이다. MR의 중증도를 측정하는 역류량은 좌측 심방으로 역류하는 혈액량이다.
그룹들
3개월령, 30 내지 40kg의 요크셔-랜드레이스 돼지를 본 연구에 사용하였다. 실험 그룹의 4마리의 동물에, 하바드 클리니컬 테크놀로지(HCT) 주입 펌프를 사용하여 좌측 관상 동맥 내 주입된 카테터에 의해 1×1012 DRP의 AAV2/l/SERCA2a를 투여하였다. AAV2/l/SERCA2a를 2.5mL/분의 일정한 유속으로 8분 동안 전달하였다. 주입을 종결한 후, 잔류하는 용액을, 유도 카테터 말단과 펌프를 연결하는 튜브로부터 회수하였다. 다음으로, 상기 잔류하는 용액을 대략 2분의 기간 동안 수동으로 주입하고, 10mL의 염수로 서서히 수동 플러쉬하였다. 대조군은 5마리 동물로 AAV2/l/SERCA2a 대신에 직접 주입(DI) 또는 V-포커스 장치에 의해 제형 완충액(pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)을 투여받았다[참조: Preovolos AC, et al., J. Extra Corpor. Technol. 2006; 38(l):51-2].
동물 처리 과정
0일째-MR 생성 및 회복
마취, 삽관 및 항응고
텔라졸 6.0mg/kg IM 및 아트로핀 2.0mL IM을 마취 유도를 위해 주사하였다. 주기적으로 동맥 혈액 가스를 모니터링하면서 전신 마취를 흡입된 이소플루란(1 내지 2%)으로 유지하였다. 정맥 라인을 귀바퀴 가장자리 정맥 내 무균 기술을 사용하여 위치시키고, 필요한 경우 염수를 IV 투여하였다. 동물을 적합한 크기의 기관내 튜빙로 삽관하고 새는 것을 방지하기 위해 팽창된 커프(cuff)로 위치를 묶었다. ECG 패드 및 전극을 면도된 장골 및 척골 부위에 위치시키고 기록기 상에서 레드(lead) I, II 및 III을 모니터링하고 기록하였다. 바이탈 사인(심박률, 호흡률, O2 포화도 측정기, 혈압)을 공정 내내 대략 5분 간격으로 모니터링하였다. 헤파린을 투여하여 ACT >300 초를 유지하였다.
관(sheath) 삽입
마취로 적당한 사망에 도달한 후, 목을 프로비돈-요오드 후 70% 에탄올로 준비시켰다. 일반적 무균 기술을 사용하여 절개하고, 8 Fr 관을 경동맥 및 경정맥 내 삽입하였다.
심기능 테스트
기저선 심장초음파를 실시하였다.
승모판 역류의 생성
경동맥 관을 통해, 집게를 좌측 심실(LV) 내로 진행시켰다. 형광투시 유도하에, 집게를 사용하여 후방 유두근 건색(cordae)을 절단하여 중증의 승모판 역류(MR)를 생성하였다. 0일째 좌측 심실 촬영과 함께 혈관촬영에 의해 중증도 MR을 확인한 후, 좌측 심실 챔버의 팽창, BP 저하 및 EDP의 상승으로 심부전을 정의하였다.
회복
바이탈 사인이, 공정을 종결하고 10분 동안 안정되면, 절개 부위를 닫고, 이소플루란을 중지하고 급성 심부전 예방을 위한 약물을 투여하였다. 임의의 잠재적 통증을 부프레노핀 0.005 내지 0.01 mg/kg 정맥 투여함으로써 일상적으로 경감시켰다. 또한 동물에 세파졸린을 투여하여 감염을 예방하였다(1g IV).
1일 내지 3일째-급성 심부전의 모니터링 및 약물 치료
MR 생성 후 처음 3일 동안은 매일 3회 동물을 체크하였다. 매일, 급성 심부전, 목 절개 부위에서의 상처 감염 또는 통증이나 불편의 임의의 징후에 대해 동물을 조사하였다. 급성 심부전에 대한 약물을 투여하고 기록하였다.
56일째-심부전, 무작위, 혈액 샘플 및 비히클 대조 또는 AAV2/l/SERCA2a 투여 기록
심기능 테스트
이미지는 장축, 단축, 유두근의 삽입 수준에서의 단축 M-모드 및 승모판륜의 컬러 도플러를 포함한다. 심장 박출량, Tau, 박출률, IV 분획 단축률, LV 프리 벽 및 격막 치수 및 MR 평가를 산출하고 기록하였다.
그룹 지정
56일째까지 생존한 동물(심부전의 정의를 만족하는)을 2개의 그룹 중 하나에 배치하였다: 그룹 1, 1×1012 DRP 용량의 AAV2/l/SERCA2a(n=4명), 또는 그룹 2, 비히클 대조군(n=5).
일반 공정: 전방 심외막 관상 주입에 의한 AAV2/l/SERCA2a 또는 비히클 투여(그룹 1 및 2)
56일째에, 모든 동물에 전용량의 헤파린을 투여하고 ACT>300에 도달하였다. 관상 동맥 주입 카테터를 사용하여 좌측 관상 동맥 내에 HCT 주입 펌프를 이용하여 AAV2/l/SERCA2a 또는 비히클을 주입하였다. 카테터를 이식하기 위한 부재 및 과정은 상기 실시예 2, 표 3 및 표 4에 상세히 기술되어 있다. 본질적으로 동일한 과정이 뒤따랐다.
그룹 1: 1×10 12 AAV2/1/SERCA2a 투여(8분 벡터 주입)
서서히 혼합한 후, AAV2/1/SERCA2a 저장 용액을 무균 폴리프로필렌 튜빙에 무균적으로 이동시키고 10mL의 제형 완충액(pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)으로 희석하여 농도 1×1011 DRP/mL가 되게 하였다. 동물에 투여하기 직전, 10mL의 희석된 AAV2/1/SERCA2a(1×1011 DRP/mL)를 실온으로 옮기고 투여대상 동물의 10mL의 전체 원혈액(native blood)과 혼합하여 최종 희석액으로 최종 용적 20mL 중 0.5×1011 DRP/mL의 주사기가 되게 하였다. 주입 회선을 혈액으로 애벌칠하고 다음으로 벡터를 HCT 주입 펌프를 사용하여 8분 동안 좌측 주요 관상 동맥으로 전달하였다. 주입 종료 후, 잔류하는 용액을, 유도 카터테 말단과 펌프를 연결하는 튜브로부터 회수하였다. 상기 잔류하는 용액을 다음으로 대략 2분의 기간 동안 수동으로 주입하고, 10mL의 염수로 서서히 수동으로 플러쉬하였다.
그룹 2: 비히클 투여(10분 주입)
AAV2/1/SERCA2a을 투여하지 않은 것을 제외하고는, 상기 기술된 그룹 1에 대해 사용된 동일한 과정을 비히클(제형 완충액, pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2) 대조 그룹의 특정 동물에 사용하였다. 다른 대조 그룹 동물에게 V-포커스 장치를 이용하여 좌측 관상 동맥 내에 10분 동안 제형 완충액(pH 7.4의, 130mM NaCl, 20mM HEPES 및 1mM MgCl2)을 투여하였다[참조: Preovolos AC, et al., J. Extra Corpor. Technol. 2006; 38(l):51-2]. 전방 심외막 관상 주입법 및 이전에 연구된 V-포커스 심장 시스템 모두 10분의 기간 동안 관상 동맥 내 테스트 물질 또는 비히클을 직접 전달한다. 비치료 대조군과, V-카디아 심장 전달 시스템을 통해 전달된 비히클을 투여받은 대조 동물 사이에 차이가 없다.
112일째-말기 희생 과정
마취, 삽관 및 항응고
112일째에, 생존 동물을 마취시키고, 삽관하고 항응고시켰다.
심기능 테스트
이미지는 장축, 단축, 유두근의 삽입 수준에서의 단축 M-모델 및 승모판륜의 컬러 도플러를 포함한다. 심장 박출량, Tau, 박출률, IV 분획 단축률, LV 프리 벽 및 격막 치수 및 MR 평가를 산출하고 기록하였다. 조직 도플러를 또한 실시하였다.
말기 희생
동물을 심장마비 용액을 사용하여 안락사시키고 조직 샘플을 단백질 및 mRNA 발현 검사를 위해 채집하였다.
돼지 심장 마이크로솜 분획의 제조
냉동 돼지 심장으로부터 다음 방법에 따라 SR 베시클(vesicle)을 포함한 마이크로솜 분획을 제조하였다. 지방과 결합 조직을 제거한 약 5 내지 10g의 심장 근육을 액체 질소 중 분쇄하고 5mM 트리스-HCl pH 7.4, 2mM EDTA, 및 8.5% 수크로스를 함유하는 완충액 중에서 포터(Potter) 균질기로 균질화하였다. 균질화물을 10분 동안 1000×g에서 원심분리하였다. 다음으로 상청액을 15분 동안 9000×g에서 원심분리하고, 생성된 상청액을 15분 동안 20000×g에서 2회 재원심분리하였다. 후속적으로, 상기 후자의 20000×g 상청액 중 존재하는 근소포체 베시클을 1h 110000×g 스핀으로 펠릿화하였다. 상기 펠릿을 500㎕의 균질화 완충액 중 재현탁시켰다. 모든 원심분리 단계는 0 내지 4℃에서 수행되었다.
단백질 추출물 제조 및 immunoblotting 분석
정상의 비처리된 비-실험 대조 동물의 단백질 샘플(대조군), AAV2/1/SERCA2a 형질도입된 동물(SERCE2a)의 단백질 샘플, 및 제형 완충액(염수) 처리된 동물의 단백질 샘플을 분리된 돼지의 마이크로솜 분획으로부터 제조하고 단백질 농도(브래드포드법을 사용하여)를 일치시키고 SDS-PAGE로 분리하고 니트로세룰로스 막에 위치시켰다. 막 블롯(blot)을 SERCA2a에 대한 항체(친화성 바이오시약, 1:400 희석)와 함께 4℃에서 밤새 배양시켰다. 반응 밴드가 화학 발광(PE 라이프 사이언시스)에 의해 가시화되고, 적어도 3개의 독립적 실험으로부터의 필름이 스캔되고 면역반응 밴드의 밀도를 NIH 이미지 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. GAPDH의 단백질 수준을 내부 대조군으로 사용하였다. SERCA2a의 밴드의 밀도 값은 GAPDH 값에 대해 정상화되었다.
RNA 분리 및 역 전사효소/중합효소 연쇄 반응
SERCA2a의 mRNA 수준을 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 총 RNA를, TRIzol 시약(인비트로겐)을 사용하여, 정상 비처리된 비-실험 대조 심장(대조군), AAV-SERCA2a 형질도입된 심장(SERCA2a) 및 제형 완충액(염수) 처리된 심장으로부터 분리하였다. 조직을 완전히 분쇄시킨 후, 클로로포름을 첨가하고 샘플을 실온에서 단시간 배양하기 전에 완전히 진탕하였다. 다음으로 샘플을 원심분리하고, 상청액 아래 세포 잔해를 교란시키지 않으면서 상청액(RNA를 포함)을 조심스럽게 제거하였다. 상기 상청액 중 RNA를 동일한 용적의 빙냉 이소프로판올을 첨가함으로써 침전시키고 10분 동안 4℃에서 12000g에서 원심분리하여 펠릿화하고 75% 에탄올로 세척하였다. RNA 펠릿을 RNase 비함유수(인비트로겐) 내 재현탁시켰다. cDNA를, 최종 용적 20㎕ 내 iScript 역 전사효소(바이로 라드)를 사용하여 1㎍의 총 RNA로부터 합성하였다. GAPDH mRNA의 수준을 내부 대조군으로 측정하였다. PCR 반응 주기를 위한 가열 냉각 온도(annealing temperature)는 각 특정 프라이머 셋트에 대한 최적의 가열 냉각 온도에 따라 조절되었다.
결과
실험 결과를 도 7 내지 13에 나타내었다. 도 7A는 3마리의 비-실험 대조 동물, 3마리의 제형 주입된 동물(염수) 및 3마리의 AAV2/1/SERCA2a 처리된 동물에서 SERCA2a 단백질(상단) 및 mRNA(하단)의 발현을 보여주는 폴리아크릴아미드 겔이다. 도 7B는 3개의 치료 그룹 사이 SERCA2a의 단백질 발현을 비교하는 그래프로, 여기서 단백질 발현 수준은 GAPDH 발현으로 표준화된다. 상기 실험은 AAV2/1/SERCA2a 그룹이 비-실험 대조 그룹 또는 제형 완충액 주입된 대조 그룹보다도 더 높은 SERCA2a mRNA 수준 및 단백질 발현을 나타냄을 보여준다. 추가로, 도 7B는 SERCA2a 단백질 발현의 정상화된 수준이 실험적 염수 주입 대조군보다 SERCA2a 주입 그룹에서 통계적으로 유의하게 더 높았음을 보여준다.
도 8은 심실 수축 기능의 척도인 좌측 심실의 분획 단축률 백분율을 보여준다. AAV2/1/SERCA2a 벡터 투여 후 2개월 내에 분획 단축률이 치료 그룹에서 제형 완충액 주입 대조 그룹에 비해 ~25% 증가하였으며, 이는 통계적으로 유의한 개선이다. 도 9은 56일째에 비해 112일째 분획 단축률에 있어서 절대 변화를 보여주는 플롯이다. 상기 실험적 제형 완충액 대조 그룹(V-포커스 및 직접 주입(DI) 동물 모두에서)의 분획 단축률의 중앙 변화률은 약간 -인 반면, AAV2/1/SERCA2a 주입된 그룹(약물)은 실질적 + 증가를 나타내어, 심장 기능이 개선되었음을 보여준다.
유사하게, 도 10은 56일째에 비해 112일째에 박출률에 있어서 절대 변화를 보여주는 플롯이다. 실험적 제형 완충액 대조 그룹(V-포커스 및 직접 주입(DI) 동물 모두에서)의 박출률에서의 중앙 변화값은 -5%인 반면, AAV2/1/SERCA2a 주입된 그룹(약물)은 실질적 + 증가(약 10%)를 나타내어, 심장 기능이 개선되었음을 보여준다.
도 11은 56일째에 비해 112일째에 심박출량(mL/분)에 있어서 절대 변화를 보여주는 플롯이다. 실험적 제형 완충액 대조 그룹(V-포커스 및 직접 주입(DI) 동물 모두에서)의 심박출량에서의 중앙 변화값은 3.5mL/분 미만인 반면, AAV2/1/SERCA2a 주입된 그룹(약물)은 대조 그룹의 거의 2배(약 6mL/분)로 심장 기능이 개선되었음을 보여준다.
도 12는 56일째에 비해 112일째에 tau(LV 이완의 시간 상수(msec.))에 있어서 절대 변화를 보여주는 플롯이다. Tau는 심실 내 압력 기록에 필요한 확장 실행의 정량적 측정이다. 실험적 제형 완충액 대조 그룹(V-포커스 및 직접 주입(DI) 동물 모두에서)의 이완 기간에서 중앙 변화값은 +0.01 msec 초과인 반면, AAV2/1/SERCA2a 주입된 그룹(약물)은 실질적으로 - 감소를 나타내(약 0.005 msec.초과), 심장 기능이 개선되었음을 보여준다.
마지막으로, 도 13은 56일째에 비해 112일째에 역류량(mL)에서의 절대 변화를 보여주는 플롯이다. 실험적 제형 완충액 대조 그룹(직접 주입(DI) 동물에서만)의 역류량에서의 중앙 변화값은 거의 40mL인 반면, AAV2/1/SERCA2a 주입된 그룹(약물)은 거의 변화를 나타내지 않아, 대조군에 비해 심장 기능이 개선되었음을 보여준다.
추가로, 좌측 및 우측 심실은 대조군에 비해 AAV2/1/SERCA2a 그룹에서 모두 작았으며(나타내지 않음), 이는 치료 그룹이 대조 그룹에 비해 심부전으로 인한 심장 조직의 부정적 리모델링이 더 적게 나타났음을 보여준다. 또한, 이러한 결과는 심부전의 허용된 동물 모델에서, AAV2/1/SERCA2a 벡터의 전방 심외막 연장된 주입이 심장 조직을 성공적으로 형질전환시켜, AAV2/1/SERCA2a mRNA 및 단백질 발현을 증가시키고, 심부전의 허용된 큰 동물 모델에서 심기능의 몇가지 척도에서 유의한 장기간의 개선을 나타냄을 입증한다.
실시예 4: 전방 심외막 주입
울혈성 심부전 환자를 대상으로 AAV2/1/SERCA2a의 3개 용량 수준으로 단일 관상 내 투여시 안정성, 사용가능성(feasibility) 및 효능을 1상, 무작위, 이중 맹검, 플라세보-조절된 용량 상승 시험으로 테스트하였다.
그룹
대상체 집단은 NYHA 분류 III/IV 만성 심부전 성인 환자이다. 대상체는 4개의 그룹으로 나뉘어져 3×1011 DRP AAV2/1/SERCA2a, 3×1012 DRP AAV2/1/SERCA2a, 1×1013 DRP AAV2/1/SERCA2a, 3×1012 DRP AAV2/1/SERCA2a 또는 플라세보를 투여받았다. AAV2/1/SERCA2a 투여 대상체는 12개월 동안 주시되었다. 플라세보 대상체는 6개월 후 자각시키고, AAV2/1/SERCA2a 치료를 제공하였다.
AAV2/1/SERCA2a 투여
주입 목표는 전방, 심외막 관상 주입을 통해 AAV2/1/SERCA2a의 확산의, 균질한 심근 노출을 제공하는 것이다. 다수의 주입 시나리오가 재발생(collateralization) 패턴, 폐색성 질환 및 해부학적 변화(예: 수술 후 바이패스 구조)에 따라 존재하지만, 임상의의 목표는 AAV2/1/SERCA2a의 1/3는 전측면, 1/3은 후측면, 및 1/3은 내부/내측면 심근에 전달하는 것이다.
국소 마취(일반적으로 1 내지 2%의 리도카인) 및 기관 표준에 따라 적합한 의식 진정 하, 셀딩거(Seldinger) 기술을 사용하여 6 Fr 동맥(수술자 결정에 따른 대퇴골, 요골 또는 상완) 진입로를 확보하였다. 비분획화된 헤파린을 정맥/동맥내 투여하여 250 내지 300초의 활성화된 응고 시간(ACT)을 제공한다. 2개월 전에 시행되지 않은 경우, 통상적인 방법으로 관상 및 바이패스 그래프트 혈관조영술을 실시한다. 해부도가 정해지고, AAV2/1/SERCA2a의 투여 전, 관류된 심근에 균질한 전달을 달성하기 위한 적절한 전략과 적합한 6 Fr 유도 카테터가 선택된다. 1 또는 2개 주입만이 실시되는 경우 주입을 위해 사용되는 동맥 또는 바이패스 그래프트는 심근 흐름의 가장 큰 부분을 제공하는 1개 또는 2개이다. AAV2/1/SERCA2a 제품의 2/3이 제1 주입 순서에 주입되고, 필요한 경우 제2 (최종) 주입 순서에서 1/3이 주입된다. 제1 주입을 위한 선택된 적합한 유도 카테터가 통상적 방식으로 등 출혈/플러쉬 후 제1 관상 동맥/바이패스 그래프트(가장 큰 영역을 정하는)에 연결된다.
MEDRAD 주입 시스템(시티, PA) 또는 동등물 및 60cc 주사기를 무균 필드에서 AAV2/1/SERCA2a 혼합물(아래 참조)로 충전시킨다. 유도카테터를 30”고속 압력 라인 남성-여성 튜빙 집합체 및 Medrad 전원 주입기 시스템에 연결하여 유체-유체 에어-자유 공간을 확보한다. 혈액을 흡인하여 정상 염수와 혼합하고 AAV2/1/SERCA2a을 첨가하여 Medrad 전원 주입기 주사기 내 다음 혼합물을 제공한다. 혈액/염수 용액을 주사기 내 먼저 첨가하고 다음으로 AAV2/1/SERCA2a를 첨가하는 것이 중요하다:
저용량 그룹: 3×10 11 DRP AAV2/1/SERCA2a
­ 15mL 혈액
­ 45mL 주사용 정상 염수
­ 0.3mL 1×1012 AAV2/1/SERCA2a DRP/mL 용액
중간용량 그룹: 3×10 12 DRP AAV2/1/SERCA2a
­ 15mL 혈액
­ 42mL 주사용 정상 염수
­ 3.0mL 1×1012 AAV2/1/SERCA2a DRP/mL 용액
고용량 그룹: 1×10 13 DRP AAV2/1/SERCA2a
­ 15mL 혈액
­ 35mL 주사용 정상 염수
­ 10.0mL 1×1012 AAV2/1/SERCA2a DRP/mL 용액
플라세보 그룹:
­ 15mL 혈액
­ 45mL 주사용 정상 염수
단일 주입 과정
60mL의 용액을 6mL/분의 일정한 속도로 주입한다. 주입으로 인한 중간 해부학적 변화를 평가하기 위해 최종 혈관조영술을 시행한다. 유도카테터를 제거한다. 수술자 결정에 따라 대퇴관(femoral sheath) 제거 및/또는 폐쇄를 시행한다.
이중 주입 과정
2개의 동맥/그래프 내 주입받은 대상체에서, 제1 주입은 6mL/분의 일정한 유속으로 40mL 용적이다. 목표는 AAV2/1/SERCA2a 제품의 2/3를 더 넓은 심근 부위에 주입하는 것이다. 제1 부의 주입 후, 주입으로 인한 중간 해부학적 변화를 평가하기 위해 최종 혈관조영술을 시행한다. 유도카테터를 제거한다.
다음으로, 적합한 6Fr 유도카테터를 소수(1/3)의 관류된 심근 부위에의 주입 순서를 위해 선택한다. 상기 유도카테터를 동맥/바이패스 그래프트 내에 위치시키고, 앞에서 설명한 바와 같이 Medrad 주사 집합체에 연결시켜, AAV2/1/SERCA2a 제품의 마지막 1/3을 주입한다(6mL/분의 유속으로 20mL 용적). 주입으로 인한 중간 해부학적 변화를 평가하기 위해 최종 혈관조영술을 시행한다. 유도 카테터를 제거한다. 수술자의 결정에 따라 대퇴관 제거 및/또는 폐쇄를 시행한다.
해부학적 비네트(vignettes)
제품의 2/3을 "중요" 관류된 심근 부위에 전달하고, 3/1을 '소수' 부위에 주입하기 위한 동맥 선택을 결정하는 다수의 해부학적 시나리오가 존재할 수 있다:
(1) 관상 바이패스 수술 경험이 없는, 비폐색성 관상 질환/정상 관상(CABG)- 표준 좌측 주요 관상 유도카테터 사용으로 좌측 관상(좌측 전하행 및 좌측 회선) 시스템 내 2/3 주입; 표준 우측 관상(RCA) 유도카테터 사용으로 RCA 시스템 내 1/3 주입.
(2) CABG 경험이 없는, RCA 전체 폐색, 좌측 내지 우측 관상 재발생(collateralization)-좌측 주요 유도카테터 사용, 제품의 100%가 전달되어 모든 부위(LAD, LCx, 및 RCA)에 주입된다.
(3) CABG 경험이 없는, LAD 및/또는 LCx 전체 폐색, RCA로부터 우측 내지 좌측 순환(collateral)- RCA는 이러한 환경에서 '주요' 부위가 되고 제품의 2/3이 RCA에, 1/3이 좌측 관상 시스템으로 주입된다.
(4) CABG 경험이 없는 다수혈관 폐색 질환- 2/3 제품은 심근의 대부분을 공급하는 부위에 전달되고, 1/3은 소수 부위에 전달된다.
(5) CABG 경험이 있고, 그래프트 환자- 2/3이 그래프트 내 LAD에, 1/3이 그래프트 내 RCA에 전달된다.
(6) CABG 경험이 있고, 혼합된 폐색성 바이패스 그래프트 및 선천성 관상 질환- 선천성 또는 바이패스 그래프트의 2/3을 심근의 가장 큰 부위를 공급하는 혈관에 주입하고 1/3을 소수 부위에 주입.
개인마다 해부학적 변형이 상이하지만 일반적인 개인에 대한 바람직한 양태는 제품의 2/3이 주요 관류된 부위 및 1/3이 소수 부위에 전달됨이 강조되어야 한다(예외적으로, 단일 본동맥 또는 바이패스 그래프트가 심근 혈류의 대부분을 공급하는 경우 단일 100% 제품 주입).
심기능 평가
AAV2/1/SERCA2a 투여 후 3, 6 및 12개월과 비교되는 기저선으로부터의 변화를 기준으로 한 치료 그룹 사이 및 치료 그룹 내 평가되고 비교되는 주요 활성/효능 포인트는 하나 이상의 다음 사항을 포함한다: 심폐 운동 테스트로 평가되는 최대 VO2; 좌측 심실 박출률, LV 치수, 부위별 벽 운동, 확장 기능 및 승모판 역류를 포함한 초음파 심장 검진; 6분 걸음 테스트 동안 걸은 거리; NYHA 분류; 및 B-타입 나트륨이뇨(natriuretic) 펩티드(BNP) 수준.
결과
치료 그룹이 플라세보 그룹에 비해 하나 이상의 상기한 활성/효능 포인트가 상당히 및 유의하게 개선되었다.

Claims (48)

  1. 심장 질환의 치료 또는 예방용 의약품 제조에 있어서, 전신 순환으로부터 관상 순환을 분리하지 않고 3분 이상의 기간 동안 관상 순환의 혈관 내로 폴리뉴클레오티드를 주입함으로써, 심장 세포를 형질전환하도록 처리된 치료적 약제학적 조성물의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 5분 이상의 기간 동안 혈관 내로 주입되는, 용도.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 10분 이상의 기간 동안 혈관 내로 주입되는, 용도.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 15분 이상의 기간 동안 혈관 내로 주입되는, 용도.
  5. 제1항에 있어서, 상기 혈관 내로의 주입이 6.0mL/분 이하의 속도로 주입되는, 용도.
  6. 제1항에 있어서, 상기 혈관 내로의 주입이 2.5mL/분 이하의 속도로 주입되 는, 용도.
  7. 제6항에 있어서, 상기 혈관 내로의 주입이 2.0mL/분 이하의 속도로 주입되는, 용도.
  8. 제6항에 있어서, 상기 혈관 내로의 주입이 1.2mL/분 이하의 속도로 주입되는, 용도.
  9. 제6항에 있어서, 상기 혈관 내로의 주입이 1.0mL/분 이하의 속도로 주입되는, 용도.
  10. 제6항에 있어서, 상기 혈관 내로의 주입이 0.6mL/분 이하의 속도로 주입되는, 용도.
  11. 제1항에 있어서, 상기 혈관이 좌측 관상 동맥인, 용도.
  12. 제1항에 있어서, 관상 순환 유출이 부자연스럽게 제한되지 않는, 용도.
  13. 제11항에 있어서, 전측심실(anterior lateral ventricle), 내측심실(inferior lateral ventricle), 중격(septum) 및 우측 심실의 심장 세포의 형질 전환이 PCR을 이용해 검출될 수 있는, 용도.
  14. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 심장 세포의 세포적 활성을 조절할 수 있는 단백질을 발현할 수 있는, 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 세포적 활성이 심근세포의 칼슘 사이클링(cycling) 경로인, 용도.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단백질이 근소포체/소포체 ATPase(SERCA)인, 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 SERCA가 SERCA2a인, 용도.
  18. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 아데노-관련 바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 소 유두종 바이러스, 렌티바이러스 벡터, 우두 바이러스 및 폴리오마 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 바이러스 벡터 내 존재하는, 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 AAV 바이러스인, 용도.
  20. 제18항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 AAV2/1 벡터인, 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 CMV계 프로모터에 작동적으로 연결되고 상기 바이러스 벡터 내 패키지된, 용도.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SERCA2a 코딩 서열을 포함하는, 용도.
  23. 제22항에 있어서, 심장 세포의 형질전환이 측심실 분획 단축률(fractional shortening)을 증가시키는, 용도.
  24. 제22항에 있어서, 상기 질환이 울혈성 심부전인, 용도.
  25. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 바이러스 벡터의 DNase 저항성 입자(DRP) 내 패키지되는, 용도.
  26. 제25항에 있어서, 주입된 DRP의 총 개수가 1×1014, 1×1013, 3×1012, 1×1012, 1×1011, 1×1010, 1×109 및 1×108로 이루어진 그룹으로부터 선택된 양 이하인, 용도.
  27. 제26항에 있어서, 주입된 DRP의 총 개수가 1×1013 이하인, 용도.
  28. 제27항에 있어서, 주입된 DRP의 총 개수가 1×1012 이하이고, 바이러스 벡터가 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드가 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 혈관이 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입이 2mL/분 이하의 유속으로 10분 이상 지속되고,
    여기서, 전측심실, 내측심실, 중격 및 우측 심실의 심장 세포의 형질전환이 PCR을 이용해 검출될 수 있는, 용도.
  29. 제1항에 있어서, 상기 질환이, 심부전, 허혈, 부정맥, 심근 경색, 울혈성 심부전, 이식 거부, 비정상적 심장 수축성, 비-허혈 심근증, 승모판 역류, 대동맥 협착증 또는 역류, 비정상적 Ca2+ 대사 및 선천성 심장 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
  30. 제27항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드가 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 혈관이 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입이 2.5mL/분 이하의 유속으로 8분 이상 지속되고,
    여기서, 전측심실, 내측심실, 중격 및 우측 심실의 심장 세포의 형질전환이 PCR을 이용해 검출될 수 있고,
    여기서, 심장 세포의 형질전환이, 폴리뉴클레오티드의 주입 전 측심실 분획 단축률에 비해 주입 후 4개월에 측정시 측심실 분획 단축률을 25% 이상 증가시키는, 용도.
  31. 제27항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드가 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 혈관이 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입이 10분 이상 지속되는, 용도.
  32. 제31항에 있어서, 심혈관계 질환이 울혈성 심부전인, 용도.
  33. 제31항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 주입 속도가 6mL/분의 유속인, 용도.
  34. 제31항에 있어서, 심장 세포의 형질전환으로, SERCA2a 단백질 발현, 분획 단축률, 박출률(ejection fraction), 심박출량(cardiac output), 심실 이완 시간 상수(time constant of ventricular relaxation) 및 역류량으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 심기능 척도가 개선되는, 용도.
  35. 제27항에 있어서, 상기 약물이 3분 이상의 기간 동안 관상 순환의 추가적 혈관 내 주입되는, 용도.
  36. 제35항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드가 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고,
    여기서, 상기 혈관이 좌측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 좌측 관상 동맥 내로의 주입이 6분 이상 지속되고,
    여기서, 상기 추가적 혈관이 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 우측 관상 동맥 내로의 주입이 3분 이상 지속되는, 용도.
  37. 제36항에 있어서, 심혈관계 질환이 울혈성 심부전인, 용도.
  38. 제36항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 좌측 관상 동맥 및 우측 관상 동맥 내로의 주입 속도가 6mL/분의 유속인, 용도.
  39. 제36항에 있어서, 심장 세포의 형질전환으로, SERCA2a 단백질 발현, 분획 단축률, 박출률, 심박출량, 심실 이완 시간 상수 및 역류량으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 심기능 척도가 개선되는, 용도.
  40. 심혈관 질환을 치료하거나 예방할 필요가 있는 포유류를 확인하는 단계,
    치료적 폴리뉴클레오티드를 관상 순환의 혈관 내로 in vivo 주입하는 단계를 포함하고,
    여기서 치료적 폴리뉴클레오티드가 3분 이상의 기간 동안 혈관에 주입되며,
    여기서 관상 순환은 포유류의 전신 순환으로부터 분리되지 않거나 실질적으로 분리되지 않고,
    여기서 치료적 폴리뉴클레오티드가 큰 포유류의 심장 세포를 형질전환시킴으로써 심혈관 질환을 치료하거나 예방하는, 큰 포유류의 심장 세포를 형질전환시켜 심혈관 질환을 치료하거나 예방하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 바이러스 벡터의 DNase 저항성 입자(DRP) 내 패키지(package)되고, 주입된 DRP의 총 개수가 1×1013 이하이고, 바이러스 벡터가 AAV2/1이고, 폴리뉴클레오티드가 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 혈관이 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입이 10분 이상 지속되는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 심혈관계 질환이 울혈성 심부전인, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 심장 세포의 형질전환으로, SERCA2a 단백질 발현, 분획 단축률, 박출률, 심박출량, 심실 이완 시간 상수 및 역류량으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 심기능 척도가 개선되는, 방법.
  44. 전신 순환으로부터 관상 순환을 분리하지 않고, 3분 이상의 기간 동안 관상 순환의 혈관 내로 폴리뉴클레오티드를 주입함으로써, 심장 세포를 형질전환하도록 처리된 치료적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 심장 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 AAV2/1 바이러스 벡터의 DNase 저항성 입자(DRP) 내 패키지(package)된 SERCA2a 코딩 서열을 포함하고, 주입된 DRP의 총 개수가 1×1013 이하이고, 혈관이 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 폴리뉴클레오티드의 주입이 10분 이상 지속되는, 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 심혈관계 질환이 울혈성 심부전인, 조성물.
  47. SERCA2a를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 1×1011 이상의 DRP의 AAV2/1 벡터를 포함하는 약제학적 조성물; 및
    심혈관 질환을 예방하거나 치료할 필요가 있는 환자에게, SERCA2a를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 0.5×1011 이상 DRP의 AAV2/1 벡터를 포함하는 용액을, 관상 순환의 혈관 내로 in vivo 주입하여 투여해야 함을 지시하는 설명서를 포함하는 키트로, 여기서 관상 순환은 환자의 전신 순환과 분리되지 않거나 실질적으로 분리되지 않고, 폴리뉴클레오티드는 3분 이상의 기간 동안 혈관 내 주입되는, 키트.
  48. 제47항에 있어서, 상기 혈관이 좌측 또는 우측 관상 동맥이고, 상기 폴리뉴클레오티드가 8분 이상의 기간 동안 주입되는, 키트.
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