CN101495627A - 用于基因疗法的延长的腺相关病毒载体的顺行性心外膜冠状动脉输注 - Google Patents

用于基因疗法的延长的腺相关病毒载体的顺行性心外膜冠状动脉输注 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗心血管疾病、具体来说将治疗剂通过直接输注到冠状循环中而递送到心脏组织的疗法。本发明的优选实施例为适于转染心脏细胞的治疗性多聚核苷酸组合物的用途，其用于制备供治疗或预防心脏病的药剂，所述治疗或预防是在不将所述冠状循环从全身循环中分离的情况下，通过将所述多聚核苷酸经至少三分钟的时间输注到所述冠状循环的血管中来实现。在另一优选实施例中，所述多聚核苷酸包含包装于AAV2/1病毒载体的脱氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)中的SERCA2a编码序列，所输注的DRP的总数小于或等于1×1013，且所述血管为左或右冠状动脉。

Description

用于基因疗法的延长的腺相关病毒载体的顺行性心外膜冠状动脉输注
相关申请案的交叉参考
本申请案主张2006年7月25日申请的美国临时申请案第60/833,324号的权利。
技术领域
本发明涉及治疗心血管疾病、具体来说将多聚核苷酸递送到心脏组织的基因疗法。
背景技术
心脏病是一种具有极高发病率(尤其在西方国家)的严重公共健康问题。心脏病状包括冠状动脉疾病、缺血性心脏病、心力衰竭、心脏瓣膜病、心律失常和心肌炎症(心肌炎)等。冠状动脉疾病和心力衰竭可能最为严重和普遍，这两种为在西方国家引起死亡的主导原因。急性心肌梗塞和充血性心力衰竭以及其后遗症对患者生活质量和卫生保健成本的影响驱动人们研究新颖疗法。
充血性心力衰竭(CHF)是心脏丧失其有效泵送血液的能力的严重病状。从美国国家心脏、肺和血液研究所(National Heart，Lung and Blood Institute)获得的数据表明，仅在美国就有约五百万人患有心力衰竭，并且每年还诊断出550,000例新病例。CHF每年会引起或导致约300,000人死亡。所述疾病在65岁或65岁以上的人、妇女和非洲裔美国人中最为常见。心力衰竭的最常见症状为呼吸浅促、感觉疲累和踝关节、脚、腿且有时腹部肿胀。尚无关于充血性心力衰竭的治愈病例，并且所属领域中迫切需要有效疗法。
已开始引起较多关注的治疗诸如CHF等心脏病的一种方法为基因疗法，其中通常在病毒载体中将多聚核苷酸递送到心脏组织。已尝试多种将病毒载体递送到心脏中的方式，包括直接注射到心肌中(刘(Liu)等人，美国实验生物学联合会会志(FASEB J.)2006；20(2)：207-16；李(Li)等人，毒理学与应用药理学(Toxicol.Appl.Pharmacol.)2006年1月25日(电子出版物)；朱(Zhu)等人，循环杂志(Circulation.)2005；112(17)：2650-9)、冠脉内递送(尼凯宁(Nykanen)等人，循环研究(Circ.Res.)2006；98(11)：1373-80；卡斯帕(Kaspar)等人，基因药物杂志(J.Gene Med.)2005；7(3)：316-24)、利用冠状静脉阻断的基于导管的顺行性冠脉内递送(早濑(Hayase)等人，美国生理学杂志：心脏和循环生理学(Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.)2005；288(6)：H2995-3000)、主动脉和肺动脉夹起后腺相关病毒载体的主动脉近端注射(卡斯帕等人，基因药物杂志，2005；7(3)：316-24)。莱顿(Leiden)和斯文森(Svensson)提及在活体内将rAAV载体输注到冠状动脉或通常冠状窦中，但只详细描述在4℃下离体利用报告基因灌注小鼠心脏，其中所述心脏已停止跳动(WO 00/38518)，这是一种不适于治疗诸如人类等大型动物的方法。因此，出于以下原因这些方法都不适用于临床环境：举例来说，这些方法因需要手术干预或中断氧合血到心肌的流动而过于危险；实践所述方法所需的病毒载体的量；经转染组织的低百分含量；转导仅局限于注射/投药部位；或所述方法对大型动物或人类的疾病的治疗不切实际或未经证实。仍需要将病毒载体中的转基因递送到心脏组织中以治疗尤其人类的疾病的简单、最小侵袭性但仍有效的方式。
发明内容
本发明涉及治疗心血管疾病、具体来说通过将治疗剂直接心外膜输注到冠状循环中来将治疗剂递送到心脏组织中的疗法。本发明的优选实施例为适于转染心脏细胞的治疗性多聚核苷酸组合物的用途，其用于制备供治疗或预防心脏病的药剂，所述治疗或预防是在不将冠状循环从全身循环中分离的情况下，通过将所述多聚核苷酸经至少三分钟的时间输注到冠状循环的血管中来实现。
另一实施例为一种通过转染大型动物的心脏细胞来治疗或预防心血管疾病的方法，所述方法包含：鉴别需要治疗或预防心血管疾病的哺乳动物；在活体内将治疗性多聚核苷酸输注到冠状循环的血管中，其中所述治疗性多聚核苷酸是经至少约三分钟的时间输注到血管中，其中所述冠状循环并未从哺乳动物的全身循环中分离或实质上分离；且其中所述治疗性多聚核苷酸转染哺乳动物的心脏细胞，从而引起对于心血管疾病的治疗或预防。
在一些实施例中，经至少约五分钟的时间将多聚核苷酸输注到血管中；在一些实施例中，经至少约十分钟的时间将多聚核苷酸输注到血管中；在一些实施例中，经至少约十五分钟的时间将其输注到血管中。
在一些实施例中，向血管中输注是以小于或等于约6.0mL/min的速率进行；在一些实施例中，其是以小于或等于约2.5mL/min的速率进行；在一些实施例中，其是以小于或等于约2.0mL/min的速率进行；在一些实施例中，其是以小于或等于约1.2mL/min的速率进行；在一些实施例中，其是以小于或等于约1.0mL/min的速率进行；在一些实施例中，其是以小于或等于约0.6mL/min的速率进行。
在一些实施例中，血管为左冠状动脉。在一些实施例中，不是通过非天然方式限制冠状循环的流出。
在一些实施例中，侧心室前端、侧心室下端、隔膜和右心室的心脏细胞的转染可使用PCR进行检测。
在一些实施例中，多聚核苷酸能够表达能调节心脏细胞的细胞活性的蛋白质。在一些实施例中，细胞活性为心肌细胞的钙循环路径。在一些实施例中，所述蛋白质为肌质网/内质网三磷酸腺苷酶(SERCA)，且在一些实施例中，SERCA为SERCA2a。
在优选实施例中，多聚核苷酸是存在于选自由以下组成的群组的病毒载体中：腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、牛乳头瘤病毒、慢病毒载体、牛痘病毒和多瘤病毒。在更优选实施例中，病毒载体为AAV病毒，且在更优选实施例中，病毒载体为AAV2/1载体。在一些实施例中，多聚核苷酸可操作性连接到基于CMV的启动子且包装于病毒载体中。在优选实施例中，多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列。
在一些实施例中，心脏细胞的转染使得侧心室节段缩短增加。在一些实施例中，哺乳动物为人类且疾病为充血性心力衰竭。
在些实施例中，将多聚核苷酸包装于病毒载体的脱氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)中。在一些实施例中，所输注的DRP总数小于或等于选自由以下组成的群组的量：1×1014、1×1013、3×1012、1×1012、1×1011、1×1010、1×109和1×108。在一些实施例中，所输注的DRP总数小于或等于1×1013。
在一个实施例中，所输注的DRP总数小于或等于1×1012，病毒载体为AAV2/1，多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，血管为左或右冠状动脉，且多聚核苷酸的输注以小于或等于约2mL/min的流速持续至少约10分钟，且侧心室前端、侧心室下端、隔膜和右心室的心脏细胞的转染可使用PCR进行检测。
在一些实施例中，疾病选自由以下组成的群组：心力衰竭、局部缺血、心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、移植物排斥、异常心脏收缩性、非缺血性心肌病、二尖瓣关闭不全、主动脉瓣狭窄或主动脉瓣关闭不全、异常Ca2+代谢和先天性心脏病。
在一个实施例中，病毒载体为AAV2/1，多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，血管为左或右冠状动脉，且多聚核苷酸的输注是以小于或等于约2.5mL/min的流速持续至少约8分钟，其中侧心室前端、侧心室下端、隔膜和右心室的心脏细胞的转染可使用PCR进行检测，且与输注多聚核苷酸之前的侧心室节段缩短相比，当在输注后约4个月测量时，心脏细胞转染使得侧心室节段缩短增加至少25％。
在一个实施例中，哺乳动物为人类，病毒载体为AAV2/1，多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，血管为左或右冠状动脉，且多聚核苷酸的输注持续至少约10分钟。在一些实施例中，心血管系统疾病为充血性心力衰竭。在一些实施例中，多聚核苷酸的输注是以约6mL/min的流速进行。
在一些实施例中，心脏细胞的转染引起选自由以下组成的群组的心脏功能量度的改进：SERCA2a蛋白的表达、节段缩短、射血分数(ejection fraction)、心输出量、心室松弛的时间常数和反流体积(regurgitant volume)。
在一些实施例中，本发明进一步包含将多聚核苷酸输注到冠状循环的另一血管中，其中将多聚核苷酸经至少约三分钟的时间输注到所述另一血管中。在一些实施例中，哺乳动物为人类，病毒载体为AAV2/1，多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，血管为左冠状动脉，且将多聚核苷酸输注到左冠状动脉中持续至少约6分钟，且所述另一血管为右冠状动脉，且将多聚核苷酸输注到右冠状动脉中持续至少约3分钟。在一些实施例中，心血管系统疾病为充血性心力衰竭。在一些实施例中，将多聚核苷酸输注到左冠状动脉和右冠状动脉中是以约6mL/min的流速进行。
在一些实施例中，心脏细胞的转染引起选自由以下组成的群组的心脏功能量度的改进：SERCA2a蛋白的表达、节段缩短、射血分数、心输出量、心室松弛的时间常数和反流体积。
在一些实施例中，本发明为试剂盒，其包含：医药组合物，其包含至少1×1011个AAV2/1载体DRP，所述载体含有编码SERCA2a的多聚核苷酸；和说明书，其说明应将包含至少0.5×1011个AAV2/1载体DRP的溶液投与需要预防或治疗心血管疾病的患者，所述载体含有编码SERCA2a的多聚核苷酸，所述预防或治疗是通过将所述溶液活体内输注到冠状循环的血管中来实现，其中所述冠状循环未从患者的全身循环中分离或实质上分离，且其中将多聚核苷酸经至少约三分钟的时间输注到血管中。在一些实施例中，血管为左或右冠状动脉，且多聚核苷酸的输注持续至少约8分钟的时间。
附图说明
图1为展示AAV2/1/SERCA2a(tgABG12)DNA的特征的示意图。
图2为野生型与重组AAV DNA的示意性比较。
图3为展示实例1中所述实验中所收集的样本的位置的心脏图解。
图4展示用于检测组织样本中的AAV2/1/SERCA2a DNA的PCR引物的位置。
图5为展示实例1中所述实验的结果的图表，其表明相同量AAV2/1/SERCA2a的输注时间的增加引起心脏组织样本中AAV2/1/SERCA2a拷贝的增加。
图6为展示实例2中所述实验的结果的图表，其表明AAV2/1/SERCA2a输注以剂量依赖性方式引起比静脉内注射多的AAV2/1/SERCA2a拷贝。
图7A为展示实例3的非实验性对照动物、调配物输注动物(生理盐水)和AAV2/1/SERCA2a治疗动物中SERCA2a蛋白(上图)和mRNA(下图)的表达的聚丙烯酰胺凝胶；图7B为比较实例3的三个治疗组之间SERCA2a的止常化蛋白质表达的图。
图8为展示实例3中所述实验的结果的图，其表明AAV2/1/SERCA2a的顺行性心外膜冠状动脉输注引起左心室节段缩短的增加，其为心力衰竭模型中心脏功能改进的一种量度。
图9为第112天与第56天节段缩短的绝对变化的图。
图10为第112天与第56天射血分数的绝对变化的图。
图11为第112天与第56天心输出量(mL/min.)的绝对变化的图。
图12为第112天与第56天τ(以msec.计的LV松弛的时间常数)的绝对变化的图。
图13为第112天与第56天反流体积(mL)的绝对变化的图。
具体实施方式
本发明涉及治疗心血管疾病的疗法。本发明的一个实施例为适于转染心脏细胞的治疗性多聚核苷酸组合物用于制备供治疗心脏病的药剂的新颖用途，所述治疗是通过转染心脏组织以通过使心肌细胞钙含量正常化来改进患有充血性心力衰竭(CHF)的患者的心肌收缩性实现。优选实施例使用基因转移剂AAV2/1/SERCA2a，其在活体内直接输注到冠状循环中持续不少于约3分钟的时间，其中所述冠状循环未自动物的全身循环中分离或另外经非天然方式限制。
如本文所使用，“多聚核苷酸”具有其在所属领域中常见且惯用的含义，并且包括诸如DNA或RNA分子等任何聚合核酸以及所属领域技术人员已知的化学衍生物。多聚核苷酸不仅包括编码治疗性蛋白质的多聚核苷酸，而且还包括可用于使用所属领域中已知的技术减少靶核酸序列的表达的序列(例如，反义核酸、干扰核酸或小干扰核酸)。一个实例为减少或消除受磷蛋白的表达的序列。多聚核苷酸还可用于起始或增加心血管系统细胞内靶核酸序列的表达或靶蛋白质的产生。靶核酸和蛋白质包括(但不限于)通常见于靶组织中的核酸和蛋白质、所述天然存在的核酸或蛋白质的衍生物、不常见于靶组织中的天然存在的核酸或蛋白质，或合成核酸或蛋白质。一种或一种以上多聚核苷酸可以组合形式使用，同时和/或依次投与以增加和/或减少一种或一种以上靶核酸序列或蛋白质。
如本文所使用，术语“输注”具有其在所属领域中常见且惯用的含义，且指投药持续实质上比技术认可的术语“注射”或“推注”(通常小于1分钟)长的时间(通常为1分钟或更长时间)。输注的流速将至少部分取决于所投与的体积，然而，对于相同体积，“输注”的流速比“注射”慢。
“有效量”具有其在所属领域中常见且惯用的含义，且包括足以实现或获得有益或所需治疗作用的量。举例来说，“有效量”为获得以下效果中任一种的量：侧心室节段缩短的增加；和/或疾病状态的进展或者病征或症状的减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟。有效量可以一次或一次以上投药投与。
如本文所使用，“与…一起”、“与…组合”、“同时”或“同时地”具有其在所属领域中常见且惯用的含义，且包括除投与一种治疗方法外还投与另一种治疗方法。举例来说，除将本发明的多聚核苷酸输注到个体外，还将技术认可的医药组合物投与同一个体。如本文所使用，这些术语包括同时投药以及依次投与治疗方法。
如本文所使用，“治疗”疾病或疾病的“治疗”具有其在所属领域中常见且惯用的含义，且包括使疾病稳定、治愈或不到完全治愈，包括疾病或者疾病病征或症状的进展的停止或减缓。术语“预防”具有其在所属领域中常见且惯用的含义，且包括完全或不完全预防疾病或者疾病病征或症状，或者延缓疾病或者疾病病征或症状的发作。术语“治疗”、“治疗作用”或“临床作用”包括治疗和预防两者。打算使用本发明治疗的与心血管系统有关的疾病的实例包括(但不限于)心力衰竭、局部缺血、心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、移植物排斥、异常心脏收缩性、非缺血性心肌病、二尖瓣关闭不全、主动脉狭窄或主动脉瓣关闭不全、异常Ca2+代谢和先天性心脏病。举例来说，有益或所需临床结果或治疗作用包括(但不限于)心血管疾病的病征或症状的较大缓和、疾病程度减少更多、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延缓或减慢、疾病状态的改善或减轻以及可检测或不可检测的缓解(部分或完全)。治疗作用的其它实例包括(但不限于)侧心室节段缩短增加、在细胞和整个动物水平上心肌收缩性增大、心脏重构逆转和细胞内钙的异常高的心舒张含量的正常化。利用本发明的实施例治疗的个体中可改进的的其它临床特征包括(不限于)存活期；心脏代谢；心脏收缩性；心率；心室功能(例如，左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP))；Ca2+代谢(例如，细胞内Ca2+浓度、峰值或静止[Ca2+]、SR Ca2+三磷酸腺苷酶活性、受磷蛋白的磷酸化状态)；心脏的力产生、松弛和压力；力-频率关系；心肌细胞存活或凋亡或者离子通道活性(例如，钠钙交换、钠通道活性、钙通道活性、钠钾三磷酸腺苷酶泵活性)；肌球蛋白重链、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌钙蛋白T、原肌球蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白轻链激酶、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链2或肌球蛋白轻链3、IGF-1受体、PI3激酶、AKT激酶、钠-钙交换蛋白、钙通道(L和T)、肌集钙蛋白(calsequestrin)或钙网蛋白(calreticulin)的活性。可改进的其它心脏病量度包括节段缩短、心输出量、射血分数、τ、反流体积、住院时间的缩短、生活质量的改进和踏车时间(treadmill time)的增加。
如本文所使用，“外源”核酸或基因为在自然界中不存在于用于核酸转移的载体中的核酸或基因，例如非天然见于病毒载体中的核酸或基因，但所述术语不打算排除编码天然存在于患者或宿主中的蛋白质或多肽(例如，SERCA)的核酸。
如本文所使用，“心脏细胞”包括涉及维持结构或提供心脏功能的心脏中的任何细胞，诸如心肌细胞、心血管细胞或存在于心脏瓣膜中的细胞。心脏细胞包括心肌细胞(具有正常和异常电特性)、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、输导组织的细胞、心脏起搏细胞(cardiac pacemaking cell)和神经元。
如本文所使用，“分离”、“实质上分离”或“在很大程度上分离”和其变化形式为不需要完全或绝对分离冠状静脉、心脏静脉、全身静脉或全身循环的术语；相反，其打算意味分离多数、优选大部分或甚至实质上全部指定循环。如本文所使用，“部分分离”是指指定循环的任何重要部分经分离。
如本文所使用，“以非天然方式限制”包括限制流体流过血管的任何方法，例如球囊导管、缝合等，但不包括天然存在的限制，例如斑块堆积(狭窄)。非天然限制包括例如冠状循环的实质或完全分离。
如本文所使用，“调节”具有其一般含义，且涵盖标靶表达或活性的增加和降低。
如本文所使用，术语“最小侵袭性”打算包括不需要对心脏或与心脏紧密关联的血管进行开放性手术接近的任何程序。所述程序包括使用内窥镜方式接近心脏，以及依赖经由诸如股动脉等大动脉和静脉接近的基于导管的方式。
如本文所使用，术语“腺相关病毒”或“AAV”涵盖所有亚型、血清型和假型(pseudotype)以及天然存在形式和重组形式。多种AAV血清型和品系已为所属领域中所知，且可从诸如ATCC和学术或商业来源等来源公开获得。或者，可使用已知技术合成已公开和/或可从各种数据库得到的AAV血清型和品系的序列。
如本文所使用，术语“血清型”是指由对指定抗血清具反应性的衣壳蛋白鉴别且基于对指定抗血清具反应性的衣壳蛋白与其它AAV相区别的AAV。存在至少十二种已知人类AAV血清型，包括AAV1到AAV12，然而，不断发现其它血清型并且涵盖新近发现的血清型的使用。举例来说，AAV2血清型用于指含有由AAV2的cap基因编码的衣壳蛋白以及含有来自相同AAV2血清型的5′和3′反向末端重复(ITR)序列的基因组的AAV。
“假型”AAV是指含有来自一种血清型的衣壳蛋白以及包括不同或异种血清型的5′和3′反向末端重复(ITR)的病毒基因组的AAV。预期假型rAAV将具有衣壳血清型的细胞表面结合特性和与ITR血清型一致的遗传特性。假型rAAV可包含AAV衣壳蛋白，包括VP1、VP2和VP3衣壳蛋白；和来自任何血清型AAV(包括AAV1到AAV12的任何灵长类动物AAV血清型)的ITR，只要所述衣壳蛋白为与ITR血清型异种的血清型。在假型rAAV中，5′和3′ITR可为同种或异种的。假型rAAV是使用所属领域中所述的标准技术产生。
“嵌合”rAAV载体涵盖包含异种衣壳蛋白的AAV载体；也就是说，rAAV载体可关于其衣壳蛋白VP1、VP2和VP3来说为嵌合的，因此VP1、VP2和VP3并非都为相同血清型AAV。如本文所使用，嵌合AAV涵盖以下AAV，其中衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的血清型不同，例如包括(但不限于)来自AAV1和AAV2的衣壳蛋白；衣壳蛋白VP1、VP2和VP3为其它细小病毒(parvo virus)衣壳蛋白的混合物或包含其它病毒蛋白或其它蛋白质，诸如以AAV到所需细胞或组织的递送为标靶的蛋白质。如本文所使用，嵌合rAAV还涵盖包含嵌合5′和3′ITR的rAAV。本发明涵盖包含来自不同AAV血清型(例如，AAV1和AAV2)的ITR的嵌合rAAV载体，或嵌合rAAV可包含合成序列。
rAAV病毒载体可通过所属领域中已知的多种方法中的任一种(包括如美国专利第6,001,650号和第6,258,595号中所述的瞬时转染策略)产生。rAAV载体产生通常需要四个常见要素：1)容许供复制的宿主细胞，其包括适用于本文所述的载体产生系统中的所属领域中已知的标准宿主细胞，包括293-A、293-S(从生物信赖公司(BioReliance)获得)、VERO和海拉(Hela)细胞系；2)辅助病毒功能，当用于转导产生系统中时，其是以表达5型腺病毒(Ad5)的E2a、E4-orf6和VA基因的质粒pAd辅助载体4.1的形式提供；3)转包装(transpackaging)rep-cap构筑体；和4)侧接AAV ITR序列的所关注基因。转染产生可如沙达隆(Sandalon)等人，病毒学杂志(J.Virology)，2004；78(22)：12355-12365的文章中所述一般执行。
治疗方法
在本发明的优选实施例中，通过将治疗剂(例如，下文较为详细地描述的多聚核苷酸/病毒载体)经至少约三分钟的时间在活体内输注到跳动心脏的冠状循环的血管中，来将所述治疗剂投与个体的特定血管中。在人类心脏和心血管疾病的大型动物模型中，申请者已发现，出人意料的是，对于投与病毒载体来说，相对较长的输注时间较为有效且引起比相同量病毒载体的推注或短时间(例如，≤1分钟)输注优良的到心脏组织中的基因转移效率。可以通过与注射相比，每个细胞较高的转基因的拷贝数、在mRNA和/或蛋白质水平上每个细胞或组织中转基因表达的增加，和/或所转染的特定组织中较高的细胞(例如，心肌细胞)百分含量来测量改进的输注效率。申请者已证实，在大型动物模型中，这引起人类心血管疾病模型的成功治疗。此外，申请者已发现，通过使用相对较长的输注时间，无需将冠状循环从全身循环中分离或另外使治疗剂再循环，或无需人工限制冠状静脉循环，其为增加冠状循环内的压力或增加治疗剂的停留时间的方式。也不需要利用诸如血管活性剂(例如组胺、组胺激动剂或血管内皮生长因子)等其它药剂预先处理心脏组织以冷却心脏、使心脏停止或将心脏从动物中取出以供灌注。相反，申请者的程序可在标准导管插入实验室环境中使用供投药的现有导管实践。因此，申请者已发现使用基因疗法治疗诸如人类等大型动物的心血管疾病的简单、实际且有效的方式。
在本发明的优选实施例中，通过将治疗剂输注到冠状循环的血管中来对个体投与治疗剂。冠状循环将血液供应提供到心脏组织。存在多个冠状动脉。以下四个主要的冠状动脉通常将氧合血提供到心脏中以使其分布遍及心脏组织：左主干和右冠状动脉、左前降支动脉和左回旋支动脉(left circumflex artery)。涵盖这些动脉中的一个或组合的输注，例如左和右冠状动脉的输注。优选实施例利用左和右主干冠状动脉的顺行性心外膜输注。还涵盖冠状动脉或者一个或一个以上顺行性和逆行性冠状动脉或静脉的组合的逆行性输注。冠状血管的输注是使用标准导线、导管和输注泵执行。在优选实施例中，在荧光镜的指导下，经由股动脉将输注导管导向冠状动脉。如本文所使用，“冠状循环的血管”、“冠状血管”或“心脏血管”包括冠状血管上的移植物，例如由旁路手术产生者。如本文所使用，“心外膜”是指位于心脏外部(例如，左或右冠状动脉)的血管。
当输注导管在靶冠状血管的适当位置后，优选借助于程序控制输注泵将治疗剂输注到血管中。输注治疗剂所耗费的时间量为获得有效且优良的基因转移效率的重要因素。申请者已测定，至少约3分钟的到特定血管的输注时间比推注或较短输注时间有效。尽管预期至少约15分钟的输注时间，但输注时间优选为至少约8分钟，更优选为至少约10分钟。申请者还预期输注时间为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约以下时间：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟，或在由这些值中任两个值所界定的范围内。
由于输注通常涉及使用具有一定死容积的导管和连接管，因此输注装置通常填装有不含任何治疗剂的载体溶液，例如来自个体的血液。因此，当输注泵开启时，治疗剂并未立即投与冠状循环。同样，当排空含有治疗剂的注射器时，一定量的治疗剂通常存留在连接管和导管的死容积中。在输注治疗剂后，立即用适当溶液优选以用于投与治疗剂的相同流速冲洗死容积。与排出输注设备中的死容积相对，将治疗剂实际递送到冠状动脉中的时间段在上文中称为“输注时间”。举例来说，如果将3mL治疗剂装载到具有3mL死容积的输注设备中，且输注速率为1mL/min.，那么将治疗剂输注到冠状循环中所需的时间仅为3分钟，而投与3mL治疗剂和3mL死容积所需的总时间为6分钟。在一些实施例中，导管和任何连接管都填装有治疗剂，以致死容积并不成为问题。类似地，可递送有效量的治疗剂而无需冲洗所述管。然而，这使得治疗剂残留于管中，从而浪费治疗剂。
申请者预期，将以一定流速输注治疗剂，所述流速为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约以下速率：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0mL/min，或在由这些值的任两个值所界定的范围内。流速优选介于约0.2mL/min与约6.0mL/min之间，更优选介于约0.2mL/min与约2.5mL/min之间，更优选介于约0.2mL/min与约2.0mL/min之间。所属领域技术人员将认识到，有可能在无输注泵的情况下递送治疗剂，但使用输注泵可能以更为精确的流速均匀地递送。
通过输注递送从而提供有效量的病毒粒子或脱氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)的总量优选介于1×1014个与约1×1011个之间，更优选介于约3×1012个与1×1012个之间且更优选为约1×1012个。然而，申请者还预期，病毒粒子或DRP的总量为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约以下量：1×1014个、9×1013个、8×1013个、7×1013个、6×1013个、5×1013个、4×1013个、3×1013个、2×1013个、1×1013个、9×1012个、8×1012个、7×1012个、6×1012个、5×1012个、4×1012个、3×1012个、2×1012个、1×1012个、9×1011个、8×1011个、7×1011个、6×1011个、5×1011个、4×1011个、3×1011个、2×1011个、1×1011个、9×1010个、8×1010个、7×1010个、6×1010个、5×1010个、4×1010个、3×1010个、2×1010个、1×1010个、9×109个、8×109个、7×109个、6×109个、5×109个、4×109个、3×109个、2×109个、1×109个、9×108个、8×108个、7×108个、6×108个、5×108个、4×108个、3×108个、2×108个或1×108个，或在由这些值中任两个值所界定的范围内。
经指定时间输注的DRP的数量随所输注的溶液的浓度和流速而变化。DRP或病毒粒子输注的速率优选介于约1×108个/min.与约1×1014个/min.之间，更优选介于约5×1010个/min.与约5×1012个/min.之间，更优选介于约3×1010个/min.与约1×1012个/min.之间，更优选介于约6×1010个/min.与约4×1011个/min之间。在优选实施例中，DRP或病毒粒子输注的速率为1×1011个/min.，且在另一优选实施例中，其为1.25×1011个/min。
在一个实施例中，将治疗剂投入心脏的单一血管中。在另一实施例中，将2/3总体积的治疗剂递送到心脏的一个血管中，且将1/3投与心脏的另一血管。在另一实施例中，输注2个以上冠状血管(例如，3、4、5个或更多)并且在适当时，可调整每个血管所投与的含有治疗剂的总输注体积的部分。输注的目的在于经由顺行性心外膜冠状动脉输注扩散AAV2/1/SERCA2a，使心肌均匀地暴露于AAV2/1/SERCA2a。存在多种基于侧支化模式、堵塞疾病和解剖变异(例如，术后旁路解剖术)的输注情形，但临床医生的目的为1/3的AAV2/1/SERCA2a递送到前外侧，1/3递送到后外侧且1/3递送到下部/下外侧心肌。解剖学是通过冠状和旁路移植血管造影术确定以实现经灌注心肌的均匀递送。此外，所属领域技术人员将认识到，尽管绵羊和猪为认可的人类心血管研究的动物模型，但绵羊和猪为90％左优势型(left dominant)。相比而言，约10％的人为左优势型，且剩余90％为右优势型或共优势型(沃尔达瓦Z.(Vlodaver Z.)等人，冠心病：临床、血管造影和病理图(Coronary Heart Disease：Clinical，Angiographic，and Pathologic Profiles.)施谱林格出版集团(Spinger-Verlag)，纽约(New York.)1976)。一个病理组表明71％的患者为右优势型，17％为共优势型，12％为左优势型(麦卡尔平W.(McAlpine W.)心脏与冠状动脉(Heart and Coronary Arteries)施谱林格出版集团(Spinger-Verlag)，1975)。因此，为实现人类与猪/绵羊的左心室的类似灌注，最适宜输注情形可不同。
对于两个血管，优选1/3和2/3的溶液体积分数，但输注到特定血管中的注射体积的部分可为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约总体积的20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％或者在由这些值中任两个值所界定的范围内的体积。含有治疗剂的溶液的总体积将根据所治疗的动物的体格而变化。对于人类个体，优选60mL的总治疗剂体积。然而，治疗剂的总体积可为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约以下体积：1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150mL，或者在由这些值中任两个值界定的范围内。
本文所述的治疗剂可为溶液、优选为适于直接投入冠状循环中的医药组合物的形式。可接受的医药组合物的成分为所属领域技术人员所知，且可包括诸如缓冲剂和适当载剂等成分。在另一实施例中，含有治疗剂、例如病毒载体且更优选AAV2/1/SERCA2a载体的医药组合物为试剂盒的部分。在一些实施例中，试剂盒含有治疗剂的储备溶液和用于稀释储备溶液的溶液。试剂盒中还包括有关投与病毒载体、优选通过直接输注到冠状循环中投与病毒载体(如本文所揭示的任何实施例中所述)的说明书。类似地，本文所述的治疗剂可用于制造供治疗本文所揭示的疾病的药剂，其中所述药剂将直接输注到心脏循环中。
多聚核苷酸递送的方法
本发明一方面涵盖将治疗性多聚核苷酸转移到细胞中。所述转移可使用基因转移的病毒或非病毒方法。这一部分将提供基因或核酸转移(包括反义序列、干扰序列和小干扰序列的转移)方法和组合物的论述。
在一个实施例中，将治疗有效的多聚核苷酸并入病毒载体中以介导向细胞的转移。编码如本文所述的其它治疗剂的其它表达构筑体还可使用感染性病毒粒子经由病毒转导(例如通过用本发明的腺相关病毒(AAV)转化)来转移。或者，可使用已经工程改造以供表达的逆转录病毒、牛乳头瘤病毒、腺病毒载体、慢病毒载体、牛痘病毒、多瘤病毒或感染病毒。类似地，可使用非病毒方法，其包括(但不限于)诸如通过灌注直接递送DNA、裸DNA转染、脂质体介导的转染、包囊和受体介导的胞吞作用。这些技术为所属领域技术人员众所周知，且其细节并非本发明的关键且因此无需在本文中详尽说明。然而，在一个优选实例中，使用病毒载体转导心脏细胞，以将治疗有效的多聚核苷酸递送到细胞。病毒可通过诸如受体介导的胞吞作用等特异方式或通过诸如胞饮作用等非特异方式进入细胞内部。
现将描述多个例示性载体。应了解以下论述并不详尽。
腺相关病毒载体
本发明的优选实施例利用经纯化、无法复制的假型重组腺相关病毒(rAAV)粒子。腺相关病毒粒子(AAV)为属于依赖病毒(Dependovirus)属的细小病毒。其为需要辅助病毒以便复制的无包膜单链小DNA病毒。为形成功能完全的AAV病毒体，需要与辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)共感染。在活体外，在不存在与辅助病毒共感染的情况下，AAV形成一种使病毒基因组以附加体形式存在但不产生感染性病毒体的潜伏状态。辅助病毒的后续感染“拯救”基因组，使得能将其复制且包装于病毒衣壳中，从而重新构成感染性病毒体。最新数据表明，野生型AAV与重组AAV在活体内主要是以大的附加体连环体(episomal concatemer)形式存在。
AAV与任何已知的人类疾病无关，通常认为其不会致病并且在整合后似乎不会改变宿主细胞的生理特性。AAV可感染包括非分裂细胞的多种宿主细胞，并且能感染来自不同物种的细胞。已展示，与经细胞和体液反应迅速清除或失活的一些载体相比，AAV载体在活体内于各种组织中持久表达。活体内非分裂细胞中重组AAV载体的持续性可由原生AAV病毒基因的缺乏以及所述载体形成附加体连环体的能力引起。
腺相关病毒(AAV)为引人注目的用于本发明的细胞转导中的载体系统，这是因为其呈附加体连环体形式而具有较高的持续频率，并且其能感染非分裂细胞，从而使其能适用于将基因递送到例如组织培养物和活体内的哺乳动物细胞中。展现AAV于基因递送中的用途的研究包括弗洛特(Flotte)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1993；90：10613-17；和威尔士(Walsh)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，1994；94：1440-48。已将重组AAV载体成功地用于标记基因和涉及人类疾病的基因的活体外和活体内转导(例如参看威尔士(Walsh)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，1994；94：1440-48)。对于感染性，AAV具有较宽的宿主范围。有关产生和使用rAAV载体的细节描述于美国专利第5,139,941号和/或美国专利第4,797,368号中。
通常，通过共转染含有侧接两个AAV末端重复的所关注基因的质粒和/或含有野生型AAV编码序列而无末端重复的表达质粒(例如pIM45)来制造重组AAV(rAAV)病毒。还利用腺病毒和/或携带AAV辅助功能所必需的腺病毒基因的质粒来感染和/或转染细胞。以所述方式制造的rAAV病毒储备液被腺病毒污染，必须将其与rAAV粒子物理分离(例如，通过氯化铯密度离心或柱层析)。或者，可使用含有AAV编码区的腺病毒载体和/或含有AAV编码区和/或一些或全部腺病毒辅助基因的细胞系。还可使用携带rAAV DNA的呈整合原病毒形式的细胞系。
自然界中存在多种AAV血清型，其中目前已知至少12种血清型(AAV1-AAV12)。尽管具有高度同源性，但不同血清型对于不同组织具有向性。AAV1的受体尚未知，但已知AAV1对于转导骨骼肌和心肌比AAV2有效。由于已利用假型载体(其中侧接AAV2ITR的载体DNA是包装于替代血清型的衣壳中)进行大部分研究，很明显，生物学差异与衣壳而非基因组有关。近来有证据表明，包装于AAV1衣壳中的DNA表达盒在转导心肌细胞方面比包装于AAV2衣壳中的DNA表达盒有效至少1 log10倍。
腺病毒载体
递送多聚核苷酸以用于基因疗法的另一种方法涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”打算包括含有足以(a)支持构筑体的包装和/或(b)最终表达其中已克隆的组织和/或细胞特异性构筑体的腺病毒序列的构筑体。
在本发明的一个形式中，表达载体包含经基因工程改造的腺病毒形式。关于腺病毒遗传构成(一种36kb的线性双链DNA病毒)的知识允许利用至多7kb的外来序列取代大段腺病毒DNA(格伦豪斯(Grunhaus)和霍维兹(Horwitz)，病毒学研究文辑(Seminarin Virology)，1992；3：237-252)。与逆转录病毒相比，腺病毒感染宿主细胞不会引起染色体整合，因为腺病毒DNA可以附加体方式复制而无潜在的遗传毒性。另外，腺病毒结构稳定，并且在广泛扩增后，不会检测到基因组重排。
腺病毒生长和操纵为所属领域技术人员所知，且其在活体外和活体内展现较宽的宿主范围。这一组病毒可以例如每毫升109到1011个空斑形成单位的高滴度获得，月其具有高感染性。腺病毒的生活周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外来基因为附加体且因此对宿主细胞具有低遗传毒性。在利用野生型腺病毒的接种研究中尚无有关副作用的报导，表明其作为活体内基因转移载体的安全性和/或治疗潜力。
已将腺病毒载体用于真核基因表达和疫苗研发中。近来，动物研究表明，可将重组腺病毒用于基因疗法中(例如参看，斯特拉特福德-皮尔卡迪特(Stratford-Perricaudet)等人，人类基因疗法(Hum.Gene.Ther.)，1991；1：242-256；瑞奇(Rich)等人，1993)。关于将重组腺病毒投与不同组织的研究包括肌肉注射、周围静脉内注射和脑立体定向接种(stereotactic inoculation)。重组腺病毒和腺相关病毒可感染和转导非分裂人类原代细胞。
尽管涵盖使用腺病毒载体，但在心血管基因疗法试验中的此种使用通常受短期转基因表达限制(瓦萨利G(Vassalli G)等人，国际心脏病学杂志(Int.J.Cardiol.)，2003；90(2-3)：229-38)。这归因于针对腺病毒抗原的细胞免疫性。改进的“无”腺病毒载体具有降低的免疫原性，但即使治疗作用需要或必需持续超过六个月的最大转基因表达，其仍然无效(吉尔伯特R(Gilbert R)等人，人类分子遗传学(Hum.Mol.Genet.)，2003；12(11)：1287-99)。AAV载体已展现长期表达(＞1年)且为其中需要长期表达的治疗作用的优选载体(达利TM(Daly TM)等人，基因疗法(Gene Ther.)，2001；8(17)：1291-8)。
逆转录病毒载体
由于逆转录病毒能将其基因整合到宿主基因组中，从而转移大量外来遗传物质，感染广谱物种和细胞类型且包装于特定细胞系中，故可将其选作基因递送载体。
逆转录病毒基因组含有三种基因gag、pol和env，其分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分。见于gag基因上游的序列含有将基因组包装于病毒体中的信号。在病毒基因组的5′和3′端存在两个长末端重复(LTR)序列。这些序列含有强启动子和增强子序列且也是整合到宿主细胞基因组中所必需的。
为构筑逆转录病毒载体，将编码所关注基因的核酸插入病毒基因组中某些病毒序列的位置处，以产生复制缺陷型病毒。为产生病毒体，将构筑含有gag、pol和/或env基因但无LTR和/或包装组分的包装细胞系。当将含有cDNA连同逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入所述细胞系(通过例如磷酸钙沉淀)中时，包装序列使得重组质粒的RNA转录物包装于病毒粒子中，病毒粒子随后分泌到培养基中。接着收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩且将其用于基因转移。逆转录病毒载体能感染多种细胞类型。然而，整合和稳定表达需要宿主细胞分裂。
疱疹病毒
由于单纯疱疹病毒(HSV)为嗜神经性的，故其在治疗神经系统病症方面引起极大关注。此外，HSV能在不整合到宿主细胞染色体中或以其它方式改变宿主细胞的代谢的情况下潜在感染非分裂神经元细胞，并且由于存在于潜伏期具活性的启动子，而使得HSV成为引人关注的载体。且尽管较多注意力集中在HSV的嗜神经应用，但已知其具有广泛宿主范围，故还可开发用于其它组织的此种载体。
使HSV成为引人关注的载体的另一因素在于基因组的大小和构成。由于HSV极大，故相比其它较小病毒系统，并入多个基因或表达盒不成问题。此外，具有不同性能(瞬时性、强度等)的不同病毒控制序列的可用性使其可能以比其它系统高的程度控制表达。病毒具有相对较少的剪接信息也极为有益，这使得基因操纵更容易。
HSV还相对易于操纵并且能生长达到较高滴度。因此，就得到足够感染复数(MOI)所必需的体积和减少重复给药的需求来说，递送不是问题。关于HSV作为基因疗法载体的综述，参看格洛里厄斯(Glorioso)等人，微生物学年度评述(Annu.Rev.Microbiol.)，1995；49：675-710。已开发出HSV的无毒变异体且其可容易地用于基因疗法情形中(美国专利第5,672,344号)。
慢病毒载体
慢病毒为复杂的逆转录病毒，其除含有常见逆转录病毒基因gap、pol和env外，还含有具有调控或结构功能的其它基因。较高复杂性使得此种病毒能例如随着潜伏感染的过程调节其生活周期。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿免疫缺陷病毒(SIV)。已通过倍增地减少HIV的毒力基因来产生慢病毒载体，举例来说，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef会使载体在生物学上安全。
慢病毒载体已为所属领域中已知，参看美国专利第6,013,516号和第5,994,136号。一般来说，载体为基于质粒或基于病毒的，且其经配置以携带用于并入外来核酸、选择和将核酸转移到宿主细胞中的必需序列。所关注载体的gag、pol和env基因也为所属领域中所知。因此，将相关基因克隆到所选载体中且随后用于转化所关注的靶细胞。
美国专利第5,994,136号中描述能感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中用两个或两个以上携带包装功能(即，gag、pol和env以及rev和tat)的载体转染适当宿主细胞。其描述能提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体，以及能提供编码病毒env的核酸从而产生包装细胞的另一载体。将提供异种基因的载体引入所述包装细胞中，得到释放携带所关注的外来基因的感染性病毒粒子的生产细胞。env优选为允许转导人类和其它物种细胞的兼嗜性包膜蛋白。
牛痘病毒载体
由于牛痘病毒载体易于构筑、能获得相对较高的表达量、具有较宽的宿主范围和较大的载运DNA的能力，故已广泛使用牛痘病毒载体。牛痘含有约186kb的线性双链DNA基因组，其展现明显的“A-T”偏好。所述基因组侧接有约10.5kb的反向术端重复。大部分必需基因似乎定位于在痘病毒中最高度保守的中心区内。预计牛痘病毒中的开放式阅读框编号为150到200。尽管两条链都为编码序列，但阅读框的大量重叠并不常见。
可将至少25kb插入牛痘病毒基因组中。原型牛痘载体含有经由同源重组插入病毒胸苷激酶基因中的转基因。载体是根据tk表型选择。包括脑心肌炎病毒的未翻译前导序列会产生高于常规载体的表达量，其中这些转基因在24小时内累积达到受感染细胞的蛋白质的10％或更多。
多瘤病毒载体
作为基因转移的可能载体，诸如小鼠多瘤病毒等乳多空病毒的空衣壳已引起广泛关注。空多瘤病毒的使用最初是在将多瘤病毒DNA和经纯化空衣壳培育于无细胞系统中时描述。保护新粒子的DNA免于受胰腺脱氧核糖核苷酸酶的作用。使用重新构成的粒子将转化多瘤病毒DNA片段转移到大鼠FIII细胞中。空衣壳和重新构成的粒子是由所有三种多瘤病毒衣壳抗原VP1、VP2和VP3组成。美国专利第6,046,173号揭示使用由乳多空病毒的主要衣壳抗原形成且排除次要衣壳抗原的假衣壳，其并入外源物质以供基因转移。
其它病毒载体
其它病毒载体可以表达构筑体形式用于本发明中，诸如由诸如辛德毕斯病毒(sindbisvirus)或巨细胞病毒等病毒衍生的载体。其向各种哺乳动物细胞提供若干引人关注的特征(例如参看弗雷德曼(Friedmann)，科学(Science)，1989；244：1275-1281；霍维奇(Horwich)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，1990；64：642-650)。
通过识别缺陷型B型肝炎病毒，新发现不同病毒序列的结构-功能关系。活体外研究表明，病毒可保持辅助病毒依赖性包装以及即使其基因组缺失多达80％也能逆转录的能力(霍维奇(Horwich)等人，病毒学杂志(J.Virol.)，64：642-650(1990))。这表明可用外来遗传物质置换大部分基因组。张(Chang)等人将氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)基因引入鸭R型肝炎病毒基因组中聚合酶、表面和/或前表面编码序列的位置处。将其与野生型病毒共转染到禽类肝癌细胞系中。使用含有高滴度重组病毒的培养基感染原代鸭肝细胞。在转染后检测稳定CAT基因表达至少24天(张(Chang)等人，肝脏病学(Hepatology)14：134A(1991))。
经修饰病毒
在本发明的其它实施例中，将待递送的核酸放入经工程改造以表达特异性结合配体的感染性病毒内。因此病毒粒子将特异性结合到靶细胞的同源受体且将内容物递送到细胞中。根据通过将乳糖残基化学添加到病毒包膜中来化学修饰逆转录病毒，研发出经设计以允许逆转录病毒载体的特异性靶向的新颖方法。这种修饰可容许经由唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。
设计靶向重组逆转录病毒的另一方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白或针对特异细胞受体的生物素化抗体。通过使用抗生蛋白链菌素经由生物素组分偶合抗体。使用针对主要组织相容性复合物I类和/或II类抗原的抗体，其展现在活体外利用同向性病毒感染具有那些表面抗原的多种人类细胞。
非病毒转移
通常将本发明的DNA构筑体递送到细胞中。然而，在某些实施例中，待转移的核酸为非感染性的，并且可使用非病毒方法转移。
本发明涵盖用于将表达构筑体转移到经培养哺乳动物细胞中的若干非病毒方法。用于本发明中的供核酸递送的适当方法包括如本文所述或如将为所属领域技术人员所知的方法。所述方法包括(但不限于)经由脉管系统直接递送“裸”DNA质粒(美国专利第6,867,196号)；通过脂质体介导的转染(尼克劳(Nicolau)和辛尼(Sene)，1982；弗拉雷(Fraley)等人，1979；尼克劳(Nicolau)等人，1987；王(Wong)等人，1980；卡尼达(Kaneda)等人，1989；卡托(Kato)等人，1991)和受体介导的转染(吴(Wu)和伍(Wu)，1987；吴(Wu)和伍(Wu)，1988)；通过利用碳化硅纤维搅动(卡普勒(Kaeppler)等人，1990；美国专利第5,302,523号和第5,464,765号)；使用阳离子脂质；裸DNA；或通过微囊化DNA(美国专利申清案第2005/0037085号)。经由应用诸如这些技术等技术，可稳定或瞬时转化靶细胞或组织。
在将构筑体递送到细胞中之后，可于不同位点定位和表达编码治疗基因的核酸。在某些实施例中，可将编码治疗基因的核酸稳定整合到细胞基因组中。此整合可经由同源重组(基因置换)而处在同源位置和定向，或可将其整合到随机、非特异性位置(基因增补)。在其它实施例中，可将核酸作为DNA的个别附加体区段稳定保持于细胞中。所述核酸区段或“附加体”编码足以容许不依赖于宿主细胞周期或与宿主细胞周期同步的维持和复制的序列。如何将表达构筑体递送到细胞中以及将核酸保持于细胞中何处都取决于所使用的表达构筑体的类型。
在本发明的特定实施例中，可将表达构筑体截留于脂质体中。脂质体为以磷脂双层膜和内层水性介质为特征的胞囊状结构。多层脂质体具有多个由水性介质分隔的脂质层。其是在将磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排，且将水和溶解的溶质截留于脂质双层之间。将DNA添加到阳离子脂质体引起从脂质体到光学双折射液晶凝集小球的拓扑学转变。这些DNA-脂质复合物为用于基因疗法中的潜在非病毒载体。
脂质体介导的核酸递送和活体外外来DNA的表达极为成功。使用β-内酰胺酶基因，研究人员证实脂质体介导的递送和经培养鸡胚胎细胞、海拉细胞和肝癌细胞中外来DNA的表达的可行性。也已实现在静脉内注射后大鼠中成功的脂质体介导的基因转移。还包括涉及“脂转染(lipofection)”技术的各种商业方法。
在本发明的某些实施例中，可将脂质体与血凝病毒(hemagglutinating virus，HVJ)复合。已证实，这将有利于与细胞膜的融合并促进脂质体封装的DNA的细胞进入。在其它实施例中，可将脂质体与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或与其一起使用。在其它实施例中，可将脂质体与HVJ和HMG-1复合或与其一起使用。由于已成功地将所述表达构筑体用于活体外和活体内核酸的转移和表达，故其适用于本发明。
可用于将编码治疗基因的核酸递送到细胞中的其它载体递送系统为受体介导的递送媒介物。其利用受体介导的胞吞作用将大分子选择性摄取到几乎所有真核细胞中。由于各种受体的细胞类型特异性分布，故所述递送可为高度特异性的(吴(Wu)和伍(Wu)，1993)。当使用脂质体时，可使用用于靶向和/或有助于摄取的结合到与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白的其它蛋白质，例如对特定细胞类型具嗜性的衣壳蛋白或其片段、在周期中经历内化的蛋白质的抗体以及靶向细胞内定位并增强细胞内半衰期的蛋白质。
受体介导的基因靶向媒介物通常是由两种组分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。已将若干配体用于受体介导的基因转移。最详尽表征的配体为脱唾液酸血清类粘蛋白(asialoorosomucoid，ASOR)和转移配体(transferring)(瓦格纳(Wagner)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)87(9)：3410-14(1990))。已将与ASOR识别相同受体的合成拟糖蛋白用作基因递送媒介物。还曾使用表皮生长因子(EGF)将基因递送到鳞状癌细胞。
在其它实施例中，递送媒介物可包含配体和脂质体。举例来说，研究人员已使用并入脂质体中的乳糖基酰基神经酰胺(即，半乳糖封端神经节苷脂)且观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加。因此，通过含有或不含脂质体的多种受体-配体系统将编码治疗基因的核酸特异性地递送到诸如心脏细胞等细胞类型中也是可行的。
在本发明的另一实施例中，表达构筑体可简单地由裸重组DNA或质粒组成。可通过上文所提及的以物理或化学方式穿透细胞膜的方法中的任一种执行构筑体的转移。这尤其适用于活体外转移，但其也应用于活体内使用。预期也可在活体内以类似方式转移治疗性DNA。伍尔夫(Wolff)等人(美国专利第6,867,196号)教示，可通过将质粒DNA溶液注射到心脏静脉或动脉中获得到心脏组织中的有效基因转移。伍尔夫还教示RNA、非质粒DNA和病毒载体的投与。
适用于本发明中的载体具有不同转导效率。因此，病毒或非病毒载体转导大于、等于或至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％的靶脉管区域的细胞。可同时或依次使用一种以上载体(病毒或非病毒载体，或其组合)。这可用于转移一种以上多聚核苷酸和/或靶向一种以上细胞类型。当使用多种载体或多种试剂时，可引起一种以上转导/转染效率。
治疗物质
利用适用于本发明中的包括多聚核苷酸的治疗物质治疗心血管疾病。这些物质包括已知可治疗心血管疾病的任何方面的化合物。多聚核苷酸可靶向心血管系统的任何已知核酸或蛋白质，从而导致调节心脏组织的细胞活性。特别值得关注的为心肌收缩所必需的核酸和蛋白质，包括调控心肌中的钙浓度的核酸和蛋白质。
每次肌肉收缩都需要Ca2+进入肌细胞细胞质中，而松弛则需要去除活性Ca2+，这使得收缩的Ca2+调控成为人体中最广泛的活性之一。因此，涉及Ca2+调控的蛋白质当突变时会引起多种与Ca2+调控缺陷有关的骨骼肌和心肌疾病也在意料之中。
肌质网钙三磷酸腺苷酶(SERCA)将钙从哺乳动物细胞的细胞质泵送到诸如肌肉中的肌质网或非肌肉细胞中的内质网等细胞器结构中。其钙活化的临界值为约100-200nM，由此其设置胞质钙的静止含量(resting level)。异常钙循环(实验和人类心力衰竭的特征)与肌质网钙摄取活性的削弱有关。
心脏/慢收缩同工型SERCA2a与受磷蛋白(PLN)(一种由三个结构域构成的52个氨基酸的均五聚体蛋白质)结合且受其调控。在肌肉收缩期间，受磷蛋白抑制Ca2+泵。在肌肉松弛期间，其可经磷酸化，此解除抑制并允许将Ca2+再泵回肌质网中。认为所述调控主要是由受磷蛋白单体与所述泵之间的物理相互作用引起。然而，具有52个残基的肽还缔合成五聚体，经证实，所述五聚体对Ca2+离子具选择性。
肌质网钙摄取活性减弱反映cAMP路径信号转导的减少以及1型磷酸酶活性的增加。蛋白磷酸酶1活性的增加部分归因于脱磷酸作用和其抑制剂-1的失活，这促进受磷蛋白的脱磷酸作用以及肌质网钙泵的抑制。实际上，组成性活性抑制剂-1的心脏特异性表达引起受磷蛋白磷酸化作用的选择性增强以及在细胞和整个动物水平上心脏收缩性的增大。值得注意的是，活性抑制剂-1的急性腺病毒基因递送完全恢复功能，并且在预先存在心力衰竭的情况下，部分地逆转重构，包括过度活化的p38的正常化(帕萨科(Pathak)等人，循环研究杂志(Circ Res.)，2005；96(7)：756-66)。
室性心律失常可引起具有正常心脏的患者以及患有诸如心力衰竭等潜在疾病的患者的心脏性猝死(SCD)。在患有心力衰竭的动物和患有遗传形式的运动诱发型SCD的患者中，雷诺定受体-钙释放通道(ryanodine receptor-calcium release channel)(RyR2)复合物中通道稳定蛋白稳钙蛋白2(calstabin2)(FKBP12.6)的耗尽引起能触发致死性心律失常的细胞内Ca2+渗漏。稳钙蛋白2的含量增加会使RyR2的关闭状态稳定且防止触发心律失常的Ca2+渗漏。因此，将增强稳钙蛋白2与RyR2的结合视为常见室性心律失常的治疗策略。
SERCA的核酸和蛋白质、受磷蛋白、1型磷酸酶抑制剂-1、S100A1和肌脂蛋白以及对Ca2+起作用的相关核酸和蛋白质都为本发明的多聚核苷酸的优选标靶。
优选的病毒载体和转基因为AAV2/1/SERCA2a，其包含AAV血清型1病毒衣壳，所述病毒衣壳封装含有人类SERCA2a表达盒且侧接得自AAV血清型2的ITR的背链4486个核苷酸的DNA。二十面体衣壳是由三个相关AAV血清型1衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成。AAV2/1/SERCA2a DNA含有以下组分：在3′和5′端的基于AAV血清型2的ITR，其侧接CMV-hSERCA2a-polyA表达盒。所述表达盒含有驱动序列转录的巨细胞病毒即刻早期增强子/启动子(CMVie)，包括来自市售质粒pCI(普洛麦格(Promega)-基因库(GenBank)U47119)的杂交内含子；hSERCA2A cDNA(与基因库NM-001681相同的编码序列)；和牛生长激素多聚腺苷酸化信号[BGHpA，(基因库M57764)]。使用来自人类b-球蛋白第一内含子的5′-供体位点和来自位于免疫球蛋白基因重链可变区的前导序列与主体之间的内含子的3′-受体位点设计杂交内含子(参看图1)。
AAV2/1/SERCA2a载体将野生型AAV(wtAAV)序列的不到300个核苷酸并入载体基因组中。wtAAV序列为源自AAV血清型2的ITR，其以顺读方式提供允许将SERCA2aDNA插入衣壳中的包装信号(图2)。
在不受特定作用机制束缚的情况下，相信CHF患者的心肌细胞中的SERCA2a蛋白质含量降低，并且心肌细胞中此种蛋白质含量的增加将使CHF的细胞内钙特性的异常高的心舒张含量正常化并改进临床结果。
如上文所论述，包括多聚核苷酸、多聚核苷酸与病毒和非病毒载体的组合在内的治疗剂可用于制备供治疗心血管疾病的药剂，其中所述药剂是通过直接输注到冠状循环中来投与。
治疗作用
在优选实施例中，使用本文所揭示的治疗剂的输注来实现对于罹患心脏病的患者的治疗作用。可监测经治疗个体的伴随心脏病症的临床特征。举例来说，可监测个体的与心血管疾病相关的不利病征和症状的减少。举例来说，在使用本发明的方法治疗个体的充血性心力衰竭后，可针对多个临床参数的改进来评估个体，所述临床参数包括(但不限于)侧心室节段缩短的增加、在细胞和整个动物水平上心脏收缩性的增大、心脏重构逆转和细胞内钙的异常高的心舒张含量的正常化。利用本发明治疗的个体中可监测的其它临床特征包括(不限于)存活期；心脏代谢；心脏收缩性；心率；心室功能(例如，左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP))；Ca2+代谢(例如，细胞内Ca2+浓度、峰值或静止[Ca2+]、SR Ca2+三磷酸腺苷酶活性、受磷蛋白的磷酸化状态)；心脏的力产生、松弛和压力；力-频率关系；心肌细胞存活或凋亡或者离子通道活性(例如，钠钙交换、钠通道活性、钙通道活性、钠钾三磷酸腺苷酶泵活性)；肌球蛋白重链、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌钙蛋白T、原肌球蛋白、肌动蛋白、肌球蛋白轻链激酶、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链2或肌球蛋白轻链3、IGF-1受体、PI3激酶、AKT激酶、钠-钙交换蛋白、钙通道(L和T)、肌集钙蛋白或钙网蛋白的活性。可在治疗之前、之后或期间执行评估。可监测的其它心脏病量度包括节段缩短、心输出量、射血分数、τ、反流体积、住院时间、生活质量和踏车时间。
所揭示的方法和本文所揭示的治疗剂可与针对心脏病的诸如药物或手术干预等现有治疗组合，从而提供与单独现有治疗相比有所增强的治疗作用。可例如通过与现有治疗方案的平均或典型时间段相比，疾病病征或症状恶化之间时间段的延长；或与单独标准治疗的平均或典型时间相比，需要额外治疗之前所需的时间变长，来证实治疗作用的增强。
现将在以下非限制性实例中进一步描述本发明的实施例。
实例1：输注时间对正常小种猪体内AAV2/1/SERCA2a的短期生物分布的影响
进行研究以通过量化在正常小种猪体内进行AAV2/1/SERCA2a的顺行性心外膜冠状动脉输注后的载体特异性DNA来评估心肌的转导。
组群
本研究的对照组(1只动物)为未治疗对照组。这只动物经历除投与AAV2/1/SERCA2a外与其它组相同的所有程序。使用程序控制注射泵经由冠状动脉输注导管输注到左冠状动脉中(第3-5组5只动物)或者经由直接肌肉内(IM)注射(第2组1只动物)来对实验动物投与1×1012个DRP AAV2/1/SERCA2a。使各组以两种载体浓度和不同输注速率接收AAV2/1/SERCA2a。投与载体后，接收载体的所有组接收管和导管的死容积的仅血液冲洗。动物为至少四个月大的重量在8-12kg之间的哥廷根小种猪(Gottingen Minipig)。如表1中所示，将动物分配到五个组中的一个中。
表1：组指派
  治疗组浓度/输注时间 总剂量(DRP) 组编号 载体输注时间(min)
  第1组：未治疗对照组   N/A   1   N/A
  第2组：直接肌肉内注射   1×1012   1   N/A
  第3组：推注(约0.5分钟)   1×1012   1   0.5
  第4组：10分钟输注   1×1012   3   10
  第5组：15分钟输注   1×1012   1   15
麻醉/血液样本
第0天时，使用标准程序使动物麻醉。将抗生素预防性地投与后腿肌肉中。监测生命指征(心率、呼吸率和O2脉搏血氧计)。获得ECG以用于监测目的。
投与AAV2/1/SERCA2a
直接肌肉内注射投与AAV2/1/SERCA2a：第2组
第0天时，使用标准肌肉内注射器和针将AAV2/1/SERCA2a注射到后方肌肉象限中。所投与的体积和浓度提供于下表2中。将AAV2/1/SERCA2a冷冻储存于-70±10℃或以下待用。使用当天，在室温下将AAV2/1/SERCA2a解冻且保存于冰上直到准备对动物给药。通过倒转小心混合后，将0.72mL每毫升1.4×1012个DRP的AAV2/1/SERCA2a储备溶液在无菌条件下转移到标准肌肉内注射器和针中。随后，将1×1012个DRPAAV2/1/SERCA2a的总剂量的单次投药经肌肉内注射到后方肌肉象限中。
通用程序：通过顺行性心外膜冠状动脉输注投与AAV2/1/SERCA2a(第3-5组)
直接输注系统是由包括常规导引套管、0.014″导线、5F输注(导引)导管以及两个程序控制注射泵在内的标准(市售)组件构成。本方法的一个重要方面在于载体投与所用的输注时间。确切体积可根据起始载体浓度、管和导管单元的死容积等而变化。
第0天时，直接输注程序是以使用股动脉法引入导引套管开始。随后，在荧光镜指导下，将冠状动脉输注导管(例如，柯蒂斯公司维斯塔布赖特提普(Cordis Vista Brite Tip)导引导管或适用于左冠状动脉主干插入导管的类似模型)放入左冠状动脉主干中。当导管处于适当位置后，使用标准装管和清洗技术将其与第一程序控制注射泵(例如，NE-1000程序控制注射泵，新时代泵系统(New Era Pump Systems))连接。随后递送AAV2/1/SERCA2a，接着利用第二程序控制注射泵仅用血液冲洗导管死容积。直接输注方法的所需材料和程序步骤的详细列表提供于表3和4中。稀释液体积、输注时间、输注速率、仅血液冲洗前所递送的体积和完成仅血液冲洗所需的时间都提供于表2中。
第3组：投与(推注)AAV2/1/SERCA2a
通过倒转小心混合后，将0.72mL每毫升1.4×1012个DRP的AAV2/1/SERCA2a储备溶液和1.3mL调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH 7.4)在无菌条件下转移到无菌聚丙烯容器中，产生每毫升5.0×1011个DRP的浓度。在即将对动物给药之前，使2.0mL稀AAV2/1/SERCA2a(5×1011个DRP/mL)达到室温，且将其与1.0mL来自经给药动物的原生全血混合，从而产生注射器中最终体积为3.0mL的3.3×1011个DRP/mL的最终稀释液。将线路用血液填装且随后历经0.5分钟时间将载体注射到左冠状动脉主干中。之后仅用血液冲洗导管死容积。
第4组：投与(10分钟载体输注)AAV2/1/SERCA2a
通过倒转小心混合后，将0.72mL每毫升1.4×1012个DRP的AAV2/1/SERCA2a储备溶液和7.3mL调配缓冲液在无菌条件下转移到无菌聚丙烯容器中，产生每毫升1.25×1011个DRP的浓度。在对动物给药之前，使8.0mL稀AAV2/1/SERCA2a(1.25×1011个DRP/mL)达到室温且将其与4.0mL来自经给药动物的原生全血混合。将输注线路用血液填装，且随后使用程序控制注射泵历经10分钟时间将载体递送到左冠状动脉主干中，随后利用第二程序控制注射泵仅用血液冲洗导管死容积。
第5组：投与(15分钟载体输注)AAV2/1/SERCA2a
通过倒转小心混合后，将0.72mL每毫升1.4×1012个DRP的AAV2/1/SERCA2a储备溶液和1.3mL调配缓冲液在无菌条件下转移到无菌聚丙烯容器中，产生每毫升5.0×1011个DRP的浓度。在即将对动物给药之前，使2.0mL稀AAV2/1/SERCA2a(5×1011个DRP/mL)达到室温且将其与1.0mL来自经给药动物的原生全血混合。将输注线路用血液填装，且随后使用程序控制注射泵历经15分钟时间将载体递送到左冠状动脉主干中，随后利用第二程序控制注射泵仅用血液冲洗导管死容积。
表2：稀释/投药方案
  治疗组   总剂量   经稀释   血液   经投与的   载体输   输注速率   仅血液
  浓度/输注时间   (DRP)   载体体积(mL)   体积(mL)  载体+血液的总体积(mL)   注时间(min)   (mL/min)   冲洗的时间(min)
  第1组：未治疗对照组  N/A   N/A   N/A   N/A   N/A   N/A   N/A
  第2组：直接肌肉内注射  1×1012   0   0   0.72   N/A   N/A   N/A
  第3组：推注(约0.5分钟)  1×1012   2.0   1.0   3.0   0.5   6.0   1
  第4组：10分钟输注  1×1012   8.0   4.0   12.0   10   1.2   2
  第5组：15分钟输注  1×1012   2.0   1.0   3.0   15   0.2   10
表3：直接输注方法的材料
  数量   材料
  1   具有适当形状的标准导引导管(5F)
  必要时   用于心脏介入程序中的任何止血阀、三通接头或任何其它附件
  1   0.014″×175cm(最小长度)导线(任选)
  1   导线导引器(任选)
2   程序控制注射泵(NE-1000程序控制注射泵，新时代泵系统(New Era PumpSystems))
  2-3   10-20cc注射器
表4：直接输注方法的程序步骤
  步骤   程序
1   在使用直接输注系统之前，小心地将各组件从其包装中取出并检查弯管、铰链和其它损坏。如果发现任何缺损，请不要使用。
  2   根据标准介入惯例，准备动脉穿刺部位。
  3   经由放置标准导引器套管获得动脉穿刺。
4   在荧光镜指导下且遵循标准心脏介入程序，将标准导引导管引入左冠状动脉主干中(使用适用于特定脉管解剖的导管形状)
  5   根据惯用程序投与肝素
  6   准备第一程序控制注射泵以递送AAV2/1/SERCA2a.
  7   将管中填装来自经给药动物的原生血且清除所述管中的所有空气。
8   将所述管的远端与导引(输注)导管的止血阀连接。确保将所有空气从所述管中去除。
  9   将所述管的近端与装载AAV2/1/1/SERCA2a的注射器连接
  10   将装载AAV2/1/SERCA2a的注射器定位于注射泵中。
  11   启动第一预先程序控制的泵且使其运行持续方案中指定的时间量。
12   准备第二程序控制注射泵且将管中填装来自经给药动物的原生血，并清除管中所有空气。
  13   以研究方案中指定的流速递送AAV2/1/SERCA2a。
  14   在完成递送期后，使第一注射泵停机并断开管的近端。
  15   将管的近端与填充有来自经给药动物的原生血的第二注射泵立即连接。
  16   再启动第二注射泵(以用于递送AAV2/1/SERCA2a的相同流速)且输注血液。
  17   在完成导管死容积冲洗后，使注射泵停机。
  18   将止血阀上的接头转向关闭位置且断开管。
  19   遵循标准程序移开导引导管(输注)
  20   遵循惯用程序处理管和注射器。
第2天：终末期处死和PCR组织样本
在投与麻醉剂后，收集血液样本以用于临床化学。随后对动物通过静脉内投与30mg/kg氯化钾实施安乐死，且使用标准技术，从如图3中所说明的心脏的以下区域收集PCR组织样本：左心室底层和中间层中的前壁、后壁、隔膜和游离壁；左心室顶层中的前壁和后壁；以及右心室底层和顶层的游离壁。
样本的PCR分析
使用定量聚合酶链式反应(qPCR)检定检测和量化所收集的组织样本中的AAV2/1/SERCA2a。qPCR检定使用ABI Prism 7700序列检测系统检测AAV2/1/SERCA2a特有的107个碱基对的序列。如图4图示中所述，qPCR引物跨越外显子14和15。使用含有靶序列的质粒(pcDNA3.1_huSERCA2)的连续稀释液作为标准物，量化从各组织样本中提取的1微克基因组DNA中检测到的AAV2/1/SERCA2a拷贝的数量。所述检定的检测下限为每微克DNA 20个AAV2/1/SERCA2a拷贝；量化的下限为每微克DNA 200个拷贝。
结果
实验结果描述于图5中，其中报导每微克DNA AAV2/1/SERCA2a的拷贝数，以及推注后(30秒，第3组)所获得的以含量百分比表示的相对量。对于各动物，将来自12个不同心脏样本(图3)的值平均为单一值，且报导每只动物的值。10分钟的输注时间产生比推注(0.5分钟)多平均51.6％的拷贝数(32％-69％)，且15分钟的输注时间产生比推注多76％的拷贝数。申请者注意到，尽管直接肌肉内注射产生相当大的拷贝数，但这是第二天处死且网内皮系统(单核细胞/巨噬细胞)正在清除AAV载体的动物的结果(布莱恩J.D.(Brain J.D.)等人，美国生理学杂志：肺细胞和分子生理学(Am J Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.)，1999；276：146-154)。AAV1载体的肌肉内注射不会引起心脏的有效长期转导(瑞普J(Rip J)等人，人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)，2005；16(11)：1276-86)。相比之下，顺行性心外膜冠状动脉输注引起如实例3中所展现的稳定的组织转导。这些结果表明，即使每组投与相同量的AAV2/1/SERCA2a(1×1012个DRP)，延长输注时间也会产生每微克DNA较多的AAV2/1/SERCA2a拷贝数。
实例2：载体剂量和投药途径对绵羊体内AAV2/1/SERCA2a的短期生物分布的影响
在正常绵羊中进行试验性研究，以评估与静脉内注射相比，在经由输注到左冠状动脉中进行单次投药后2天时三种不同剂量的AAV2/1/SERCA2a的短期生物分布。
组群
使1只动物接收使用程序控制注射泵通过冠状动脉内导管输注到左冠状动脉中的1×1013个AAV2/1/SERCA2a DRP。第2组3只动物接收3×1012个AAV2/1/SERCA2a DRP，且第3组2只动物接收1×1012个AAV2/1/SERCA2a DRP，所有物质都是使用程序控制注射泵通过冠状动脉内导管输注到左冠状动脉中。所有输注组都历经8分钟以2.5mL/min的恒定流速接收AAV2/1/SERCA2a，随后进行持续2分钟的导管容积的仅血液冲洗。对对照组的单一动物投与2mL静脉内注射液中的1×1012个DRPAAV2/1/SERCA2a。各组都展现于下表5中且投药时程展现于表6中。
表5：组指派
  治疗组   总数   剂量
  第1组-通过注射泵将AAV2/1/SERCA2A输注到左冠状动脉中   3   1×1013个DRP
  第2组-通过注射泵将AAV2/1/SERCA2A输注到左冠状动脉中   3   3×1012个DRP
  第3组-通过注射泵将AAV2/1/SERCA2A输注到左冠状动脉中   2   1×1012个DRP
  第4组-静脉内注射AAV2/1/SERCA2A   1   1×1012个DRP
表6：稀释/投药方案
治疗组浓度/投药途径   总剂量(DRP)   经稀释载体体积(mL)   血液体积(mL)   经投与载体+血液的总体积(mL) 载体输注/注射时间(min) 输注速率(mL/min) 仅血液冲洗的时间(min)
  第1组：冠状动脉内输注1×1013个DRP   1×1013   10   10   20   8   2.5   2
  第2组：冠状动脉内输注3×1012个DRP   3×1012   10   10   20   8   2.5   2
  第3组：冠状动脉内输注1×1012个DRP   1×1012   10   10   20   8   2.5   2
  第4组：静脉内注射1×1012个DRP   1×1012   2.0   N/A   N/A   约0.5   N/A   N/A
投与AAV2/1/SERCA2a
通用程序：通过顺行性心外膜冠状动脉输注投与AAV2/1/SERCA2a(第1-3组)
第0天时，对所有动物投与全剂量的肝素以获得大于300的ACT。使用程序控制注射泵，使用冠状动脉输注导管将AAV2/1/SERCA2a输注到冠状动脉中。用于植入导管的材料和程序详细描述于上文实例1以及表3和4中。遵循基本上相同的程序。
第1组：投与(8分钟载体输注)1.0×10 13 个AAV2/1/SERCA2a
在通过倒转小心混合后，将AAV2/1/SERCA2a储备溶液在无菌条件下转移到无菌聚丙烯管中，且用调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH 7.4)稀释到10mL的总体积，产生1×1012个DRP/mL的浓度。在即将对动物给药之前，使10mL稀AAV2/1/SERCA2a(1×1012个DRP/mL)达到室温且将其与10mL来自经给药动物的原生全血混合，从而产生20.0mL的最终体积。将输注线路用血液填装，且随后使用程序控制注射泵历经8分钟时间以2.5mL/min的恒定流速将载体递送到左冠状动脉主干中，随后利用第二程序控制注射泵仅用血液冲洗导管死容积。
第2组：投与(8分钟载体输注)3.0×10 12 个AAV2/1/SERCA2a
在通过倒转小心混合后，将AAV2/1/SERCA2a储备溶液在无菌条件下转移到无菌聚丙烯管中，且用调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH 7.4)稀释到10mL的总体积，产生3×1011个DRP/mL的浓度。在即将对动物给药之前，使10mL稀AAV2/1/SERCA2a(3×1011个DRP/mL)达到室温且将其与10mL来自经给药动物的原生全血混合，从而产生20.0mL的最终体积。将输注线路用血液填装，且随后使用程序控制注射泵历经8分钟时间以2.5mL/min的恒定流速将载体递送到左冠状动脉主干中，随后利用第二程序控制注射泵仅用血液冲洗导管死容积。
第3组：投与(8分钟载体输注)1.0×10 12 个AAV2/1/SERCA2a
在通过倒转小心混合后，将AAV2/1/SERCA2a储备溶液在无菌条件下转移到无菌聚丙烯管中，且用调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH 7.4)稀释到10mL的总体积，产生1×1011个DRP/mL的浓度。在即将对动物给药之前，使10mL稀AAV2/1/SERCA2a(1×1011个DRP/mL)达到室温，且将其与10mL来自经给药动物的原生全血混合，从而产生注射器中最终体积为20.0mL的0.5×1011个DRP/mL的最终稀释液。将输注线路用血液填装，且随后使用程序控制注射泵历经8分钟时间以2.5mL/min的恒定流速将载体递送到左冠状动脉主干中，随后利用第二程序控制注射泵仅用血液冲洗导管死容积。
第4组：投与(静脉内注射)1.0×10 12 个AAV2/1/SERCA2a
在通过倒转小心混合后，将AAV2/1/SERCA2a储备溶液在无菌条件下转移到无菌聚丙烯管中，且用调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH 7.4)稀释到2.0mL的总体积，产生1×1012个DRP/mL的浓度。使用标准静脉内注射器和针通过静脉内注射(约0.5分钟)投与所述溶液。
第2天：终末期处死和PCR组织样本
在投与麻醉剂后，通过静脉内投与30mg/kg氯化钾对动物实施安乐死，且使用标准技术收集PCR组织样本。从心脏的以下区域中收集样本：左心室前壁、左心室内壁、室间隔膜和右心室游离壁。
样本的PCR分析
使用实例1中所述的定量PCR检定检测和量化所收集的组织样本中的AAV2/1/SERCA2a。
结果
实验结果描述于图6中，其中对于各动物，报导各心脏组织样本中每微克DNA的AAV2/1/SERCA2a的拷贝数。与产生极低的不可量化含量(20-200个拷贝)的AAV2/1/SERCA2a的静脉内注射(约0.5分钟)不同，8分钟的输注时间在1×1012、3×1012和1×1013浓度下产生相当大的拷贝数。图6表明，1×1013个DRP的总剂量产生比3×1012个DRP的总剂量多的拷贝数，而3×1012个DRP的总剂量又产生比1×1012个DRP的总剂量多的拷贝数。重要的是，即使只将载体投与左冠状动脉，也在右心室样本中发现AAV2/1/SERCA2a拷贝。
实例3：心力衰竭的猪二尖瓣关闭不全模型
在由严重二尖瓣关闭不全(MR)所引起的心力衰竭的猪模型中进行试验性研究以评估与媒剂对照相比，单次投与AAV2/1/SERCA2a对心脏功能的影响。二尖瓣关闭不全(MR)也称为二尖瓣闭锁不全(mitral insufficiency)，其为血液从心脏的左心室通过二尖瓣异常地渗漏进入左心房。反流体积(MR严重性的量度)为反流回左心房中的血液的体积。
组群
将3个月大且重量介于30-40kg之间的约克夏-兰德瑞斯猪(Yorkshire-Landraceswine)用于本研究中。使具有4只动物的实验组接收使用哈佛临床技术(Harvard ClinicalTechnology，HCT)输注泵通过冠状动脉内导管输注到左冠状动脉中的1×1012个AAV2/1/SERCA2a DRP。以2.5mL/min的恒定流速历经8分钟时间递送AAV2/1/SERCA2a。在完成输注后，从连接导引导管末端和泵的管中抽出剩余溶液。随后历经约2分钟的时间手工输注此剩余溶液，随后用10mL生理盐水缓慢手工冲洗。对照组为5只动物，其接收通过直接输注(DI)或通过V-福克斯装置(V-Focus device)投与的调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH 7.4)而非AAV2/1/SERCA2a。普雷瓦洛斯AC(Preovolos AC)等人，体外循环技术杂志(J.ExtraCorpor.Technol.)2006；38(1)：51-2。
动物程序
第0天-MR的产生和恢复
麻醉、插管和抗凝
经肌肉内(IM)注射泰拉唑(Telazol)6.0mg/kg和阿托品(Atropine)2.0mL以引入麻醉。利用吸入性异氟烷(isoflurane)(1-2％)保持全身麻醉，且定期监测动脉血气。使用无菌技术将静脉针放入耳缘静脉中，并且在必要时，经静脉内(IV)投与生理盐水。将适当尺寸的气管导管插入动物体内，嵌入具有充气管头的位置以防止渗漏。将ECG垫和电极放于剃开的掌骨和跖骨区，以监测引线I、II和III并将其记录于记录纸上。在整个程序中，以约5分钟的间隔监测生命指征(心率、呼吸率、O2脉搏血氧计、血压)。投与肝素以保持ACT大于300秒。
插入套管
获得适当麻醉深度后，利用聚维酮碘(providone-iodine)和随后70％乙醇消毒颈部来作准备。使用通用无菌技术产生切口，且将8Fr套管插入颈动脉和静脉中。
心脏功能测试
执行基线超声波心动图。
二尖瓣关闭不全的产生
将镊子通过颈动脉套管送入左心室(LV)中。在荧光镜指导下，使用镊子切开后乳头肌的腱索以引起严重二尖瓣关闭不全(MR)。心力衰竭被定义为在利用第0天时的左心室造影照片经血管造影术确定患有严重MR后左心室腔扩张以及BP降低和EDP升高。
恢复
一旦生命指征在完成程序后稳定达10分钟，就封闭切口，关闭异氟烷且投与药剂以预防急性心力衰竭。通常利用肌肉内给与的0.005-0.01mg/kg丁丙诺啡(buprenorphine)减轻任何潜在疼痛。还给与动物头孢唑林(cefazolin)以防止感染(经静脉内1g)。
第1-3天-急性心力衰竭的监测和药物治疗
MR产生后前3天，每天三次检查动物。每天检查动物的急性心力衰竭的病征、颈部切口部位的创伤感染或者疼痛或不适的任何病征。投与针对急性心力衰竭的药物治疗并加以记录。
第56天-有关心力衰竭、随机选择、血液样本和媒剂对照或AAV2/1/SERCA2a投 与的文件编制
心脏功能测试
影像包括：长轴、短轴、在乳头肌插入物水平上的短轴M模式和二尖瓣环的彩色多普勒(Doppler)。用计算机计算心输出量、τ、射血分数、LV节段缩短、LV游离壁和隔膜尺寸以及MR评估，并加以记录。
分组
将存活到第56天(其满足心力衰竭的定义)的动物分到两个组中的一个中：第1组：1×1012个DRP剂量的AAV2/1/SERCA2a(n＝4)；或第2组：媒剂对照(n＝5)。
通用程序：通过顺行性心外膜冠状动脉输注投与AAV2/1/SERCA2a或媒剂(第1-2 组)
第56天时，对所有动物投与全剂量肝素以获得大于300的ACT。使用HCT输注泵，使用冠状动脉输注导管将AAV2/1/SERCA2a或媒剂输注到左冠状动脉中。植入导管的材料和程序详细描述于上文实例2以及表3和4中。遵循基本上相同的程序。
第1组：投与(8分钟载体输注)1.0×10 12 个AAV2/1/SERCA2a
在小心混合后，将0.56mL AAV2/1/SERCA2a储备溶液在无菌条件下转移到无菌聚丙烯管中，且用10mL调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH7.4)稀释，产生1×1011个DRP/mL的浓度。在即将对动物给药之前，使10mL稀AAV2/10/SERCA2a(1×1011个DRP/mL)达到室温，且将其与10mL来自经给药动物的原生全血混合，从而产生注射器中最终体积为20mL的0.5×1011个DRP/mL的最终稀释液。将输注线路用血液填装，且随后使用HCT输注泵历经8分钟时间将载体递送到左冠状动脉主干中。在完成输注后，从连接导引导管末端和泵的管中抽出剩余溶液。随后历经约2分钟的时间手工输注此剩余溶液，随后用10mL生理盐水缓慢手工冲洗。
第2组：投与(10分钟输注)媒剂
将用于上述第1组的相同程序用于媒剂(调配缓冲液，130mM NaCl、20mM HEPES和1mM MgCl2，pH 7.4)对照组中的一些动物，其中例外为末投与AAV2/1/SERCA2a。使用V-福克斯装置历经10分钟将调配缓冲液(130mM NaCl、20mM HEPES和1mMMgCl2，pH 7.4)投入其它对照组动物的左冠状动脉中(普雷瓦洛斯AC(Preovolos AC)等人，体外循环技术杂志(J.Extra Corpor.Technol.)2006；38(1)：51-2)。顺行性心外膜冠状动脉输注法和先前研究的V-福克斯心脏系统皆经10分钟时间将测试物或媒剂直接递送到冠状动脉中。未治疗对照组与接收经由V-卡地亚(V-Kardia)心脏递送系统投与的媒剂的对照动物之间并无差别。
第112天-终末期处死程序
麻醉、插管和抗凝
在第112天时，将存活动物麻醉，插管并防止其凝血。
心脏功能测试
影像包括：长轴、短轴、在乳头肌插入物水平上的短轴M模式和二尖瓣环的彩色多普勒。用计算机计算心输出量、τ、射血分数、LV节段缩短、LV游离壁和隔膜尺寸以及MR评估，并加以记录。还执行组织多普勒。
终末期处死
利用心停搏液(cardioplegia solution)对动物实施安乐死并且收集组织样本以供蛋白质和mRNA表达分析。
制备猪心脏微粒体部分
通过以下方法，由冷冻的猪心制备包括SR小泡的微粒体部分。在液氮中，将约5-10g清除脂肪和结缔组织的心肌磨碎，并利用波特均质器(Potter homogenizer)将其在含有5mM Tris-HCl(pH 7.4)、2mM EDTA和8.5％蔗糖的缓冲溶液中均质化。以1000×g将匀浆离心10分钟。随后，以9000×g将上清液离心15分钟，且再以20000×g将所得上清液离心2次持续15分钟。接着通过1小时的110 000×g旋转，使存在于所述后以20 000×g离心的上清液中的肌质网小泡成为球状。将小球再悬浮于500μl均质化缓冲液中。所有离心步骤都是在0-4℃下执行。
制备蛋白质提取物和免疫印迹分析
由经分离猪微粒体部分制备来自正常未治疗非实验对照动物(对照)、经AAV-SERCA2a转导的动物(SERCA2a)和经调配缓冲液(生理盐水)治疗的动物的蛋白质样本，使蛋白质浓度相配(使用布赖特福德法(Bradford method))并通过SDS-PAGE分离，且将其转移到硝酸纤维素膜上。在4℃下，利用针对SERCA2a的抗体(亲和生物试剂公司(Affinity Bioreagents)，1∶400稀释液)将膜印迹培育整夜。通过化学发光(PE生命科技公司(PE Life Sciences))检验反应性谱带，且扫描来自至少三个独立实验的薄膜，并使用NIH影像软件评估免疫反应性谱带的密度。将GAPDH的蛋白质含量用作内部对照。将SERAC2a的谱带的密度值针对GAPDH值正常化。
RNA分离和逆转录酶/聚合酶链式反应
使用RT-PCR测量SERCA2a的mRNA含量。使用TRIzol试剂(英杰公司(Invitrogen))从正常的未治疗非实验对照心脏(对照)、经AAV-SERCA2a转导的心脏(SERCA2a)和经调配缓冲液(生理盐水)治疗的心脏中分离总RNA。完成组织破碎后，添加氯仿，且充分振荡样本，随后在室温下短时间培育。接着将样本离心，且在不干扰下方的细胞碎片的情况下，小心地取出上清液(含有RNA)。通过添加等体积冰冷的异丙醇来使上清液中的RNA沉淀，且通过在4℃下以12,000g离心10分钟来使其成为小球，并用75％乙醇洗涤。将RNA小球再悬浮于无核糖核酸酶的水(英杰公司)中。使用埃斯普雷特(iScript)逆转录酶(伯乐公司(Bio Rad))以20μL最终体积自1μg总RNA合成cDNA。将GAPDH mRNA的含量评估为内部对照。根据针对各特异性引物组的最佳退火温度，调整PCR反应周期的退火温度。
结果
实验结果描述于图7-13中。图7A为展示三只非实验对照动物、三只输注调配物的动物(生理盐水)和三只经AAV2/1/SERCA2a治疗的动物中SERCA2a蛋白质(上图)和mRNA(下图)的表达的聚丙烯酰胺凝胶。图7B为比较三个治疗组之间SERCA2a的蛋白质表达的图，其中将蛋白质表达的含量正常化为GAPDH表达。本实验表明，AAV2/1/SERCA2a组具有比非实验对照组或输注调配缓冲液的对照组高的SERCA2amRNA含量和蛋白质表达量。此外，图7B还表明，SERCA2a输注组中SERCA2a蛋白质表达的正常化含量在统计学上显著高于实验生理盐水输注对照组。
图8展示左心室节段缩短百分比，其为心室收缩功能的量度。在投与AAV2/1/SERCA2a载体两个月后，与输注调配缓冲液的对照组相比，治疗组中的节段缩短增加约25％，此为统计学上显著的改进。图9为第112天与第56天节段缩短的绝对变化的图。实验调配缓冲液对照组(V-福克斯和直接输注(DI)动物)的节段缩短的中值变化为较小负数，而输注AAV2/1/SERCA2a的组(药物)展现相当大的正增加，表明心脏功能的改进。
类似地，图10为第112天与第56天射血分数的绝对变化的图。实验调配缓冲液对照组(V-福克斯和直接输注(DI)动物)的射血分数的中值变化为-5％，而输注AAV2/1/SERCA2a的组(药物)展现相当大的正增加(约10％)，表明心脏功能的改进。
图11为第112天与第56天心输出量(mL/min.)的绝对变化的图。实验调配缓冲液对照组(V-福克斯和直接输注(DI)动物)的心输出量的中值变化小于3.5mL/min，而输注AAV2/1/SERCA2a的组(药物)为对照组的约2倍(约6mL/min.)，表明心脏功能的改进。
图12为第112天与第56天τ(以msec.计的LV松弛的时间常数)的绝对变化的图。τ为需要心室内压力记录的心舒张性能的定量量度。实验调配缓冲液对照组(V-福克斯和直接输注(DI)动物)的松弛期的中值变化为大于+0.01msec，而输注AAV2/1/SERCA2a的组(药物)展现相当大的负降低(大于约0.005msec)，表明心脏功能的改进。
最终，图13为展示第112天与第56天反流体积(mL)的绝对变化的图。实验调配缓冲液对照组(仅直接输注(DI)动物)的反流体积的中值变化为约40mL，而输注AAV2/1/SERCA2a的组(药物)几乎不展现改变，表明与对照相比的心脏功能改进。
此外，左和右心室在AAV2/1/SERCA2a组中都比对照组(未展示)中小，表明与对照组相比，在治疗组中因心力衰竭而引起的心脏组织的负面重构较小。总的说来，这些结果表明，在认可的心力衰竭动物模型中，AAV2/1/SERCA2a载体的顺行性心外膜延长输注成功地转染心脏组织，从而引起AAV2/1/SERCA2a mRNA和蛋白质表达的增加，以及认可的心力衰竭大型动物模型中心脏功能的若干量度的显著长期改进。
实例4：顺行性心外膜输注
在第1期、随机、双盲、以安慰剂为对照的剂量递增试验中，测试患有充血性心力衰竭的患者体内单次冠脉内投与3个剂量浓度的AAV2/1/SERCA2a的安全性、可行性和功效。
组群
个体群为患有NYHA第III/IV类慢性心力衰竭的成年患者。将个体分为四组，且使其接收3×1011个AAV2/1/SERCA2a DRP、3×1012个AAV2/1/SERCA2a DRP、1×1013个AAV2/1/SERCA2a DRP、3×1012个AAV2/1/SERCA2a DRP或安慰剂。使个体接收AAV2/1/SERCA2a达12个月。6个月后，安慰剂个体解除盲化，且对其提供AAV2/1/SERCA2a治疗。
投与AAV2/1SERCA2a
输注的目的在于经由顺行性心外膜冠状动脉输注扩散AAV2/1/SERCA2a，使心肌均匀地暴露于AAV2/1/SERCA2a。存在多种基于侧支化模式、堵塞疾病和解剖变异(例如，术后旁路解剖术)的输注情形，但临床医生的目的为1/3的AAV2/1/SERCA2a递送到前外侧，1/3递送到后外侧且1/3递送到下部/下外侧心肌。
根据行业规范，适当时在局部麻醉(通常1-2％利多卡因(lidocaine))和清醒性镇静的情况下，使用赛丁格技术(Seldinger technique)进行6Fr动脉(根据手术人员的判断，股动脉、桡动脉或臂动脉)穿刺。经静脉内/动脉内投与普通肝素以提供250-300秒的活化凝血时间(activated clotting time，ACT)。以常用方式执行冠状和旁路移植血管造影术，否则在前2个月执行。确定解剖且选择在投与AAV2/1/SERCA2A之前实现经灌注心肌和适当6Fr导引导管的均质递送适当的策略。仅执行一或两次输注，且用于输注的动脉或旁路移植物为促进最大部分心肌流动的一个或两个移植物。在第一次输注程序中，输注2/3的AAV2/1/SERCA2A产物，且必要时在第二次(最后一次)输注程序中输注1/3。在血流入胸腔(backbleeding)/冲洗后，以常用方式将用于第一次输注的所选的适当导引导管接合到第一个冠状动脉/旁路移植物(对着最大区域)中。
在无菌区，将麦德雷德(MEDRAD)输注系统(城市，宾西法尼亚州(City，PA))或等效物和60cc注射器用AAV2/1/SERCA2A混合物(参看下文)填充。将导引导管连接到30″高流动压力管线男性-女性管道部件和麦德雷德高压注射系统(Medrad powerinjector system)以确保保证无流体-流体空气空间。将血液抽出并将其与标准生理盐水混合，随后添加AAV2/1/SERCA2A以将以下混合物提供于麦德雷德高压注射器中。重要的是，首先将血液/生理盐水溶液添加到注射器中，随后添加AAV2/1/SERCA2A：
低剂量组：3×10 11 个DRP AAV2/1/SERCA2A
15mL血液
45ml注射用标准生理盐水
0.3ml的1×1012个AAV2/1/SERCA2A DRP/毫升溶液
中等剂量组：3×10 12 个DRP AAV2/1/SERCA2A
15mL血液
42ml注射用标准生理盐水
3.0ml的1×1012个AAV2/1/SERCA2A DRP/毫升溶液
高剂量组：1×10 13 个DRP AAV2/1/SERCA2a
15mL血液
35ml注射用标准生理盐水
10.0ml的1×1012个AAV2/1/SERCA2A DRP/毫升各溶液
安慰剂组：
15mL血液
45ml注射用标准生理盐水
单次输注程序
以6mL/min的恒定流速输注60mL溶液。执行最后的血管造影术以评估利用输注的暂时解剖学改变。抽出导引导管。根据手术人员的判断，执行股动脉套管取出和/或股动脉的封闭。
两次输注程序
在接收两个动脉/图输注的个体中，第一次输注为以6mL/min的恒定流速输注40mL体积。目的在于将2/3的AAV2/1/SERCA2A产物输注到较大心肌区域中。在第一部分输注后，执行最后的血管造影术以评估利用输注的暂时解剖学改变。抽出导引导管。
接下来，选择适当的6Fr导引导管用于针对较小(1/3)灌注心肌区域的输注程序。将导引导管接合到动脉/旁路移植物中，且按照先前描述，将其与麦德雷德注射部件连接，且输注最后1/3的AAV2/1/SERCA2A产物(20mL体积，6mL/min的恒定流速)。执行最后的血管造影术以评估利用输注的暂时解剖学改变。抽出导引导管。根据手术人员的判断，执行股动脉套管取出和/或股动脉的封闭。
解剖学简介
可存在多种解剖情况，其确定输注的动脉选择以实现将2/3产物递送到“较大”灌注心肌区域且1/3输注到“较小”区域中。
(1)非阻塞性冠心病/正常冠状动脉，先前未经历冠状动脉旁路手术(CABG)-标准左冠状动脉主干导引导管接合以及2/3输注到左冠状动脉(左前降支动脉和左回旋支)系统中；标准右冠状动脉(RCA)导引导管接合以及1/3输注到RCA系统中。
(2)先前未经历CABG、RCA完全堵塞、左到右冠状动脉侧支化-左主干导引导管接合，递送100％产物以输注所有(LAD、LCx和RCA)区域。
(3)先前未经历CABG、LAD和/或LCx完全堵塞、RCA的右到左侧突-在此情况下，RCA变成“较大”区域且2/3产物递送到RCA，1/3递送到左冠状动脉系统。
(4)多血管堵塞疾病，先前未经历CABG-2/3产物递送到为大部分心肌工作的区域，1/3递送到较小区域。
(5)先前经历CABG，特许移植物-2/3递送到移植物中到达LAD，1/3递送到移植物中到达RCA。
(6)先前经历CABG，混合堵塞性旁路移植物和先天性冠心病-原生或旁路移植物2/3输注到供应最大心肌区域的血管中，1/3输注到较小区域中。
应注意，解剖学变化将随个体而不同，但对于典型个体，优选实施例是将2/3产物递送到较大灌注区域且1/3递送到较小区域(如果单一原生动脉或旁路移植物供应大部分心肌流量，那么单次100％产物输注的情形除外)。
评估心脏功能
在治疗组内和治疗组之间根据基线与投与AAV2/1/SERCA2a后3、6和12个月的变化评估和比较的主要活性/功效终点包括以下中的一个或一个以上终点：通过运动心肺测试评估的VO2最大值；超声波心动描记术评估，包括左心室射血分数、LV尺寸、局部室壁运动、心舒张功能和二尖瓣关闭不全；6分钟步行测试期间所行进的距离；NYHA分类；和B型利钠肽(BNP)含量。
结果
在治疗组中可以发现与安慰剂组相比上述活性/功效终点中一个或一个以上终点的实质且明显的改进。

Claims (48)

1.一种适于转染心脏细胞的治疗性多聚核苷酸组合物的用途，其用于制备供治疗或预防心脏病的药剂，所述治疗或预防是在不将冠状循环从全身循环中分离的情况下，通过将所述多聚核苷酸经至少3分钟的时间输注到所述冠状循环的血管中来实现。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是经至少5分钟的时间输注到所述血管中。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是经至少10分钟的时间输注到所述血管中。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是经至少15分钟的时间输注到所述血管中。
5.根据权利要求1所述的用途，其中到所述血管中的所述输注是以小于或等于6.0mL/min的速率进行。
6.根据权利要求1所述的用途，其中到所述血管中的所述输注是以小于或等于2.5mL/min的速率进行。
7.根据权利要求6所述的用途，其中到所述血管中的所述输注是以小于或等于2.0mL/min的速率进行。
8.根据权利要求6所述的用途，其中到所述血管中的所述输注是以小于或等于1.2mL/min的速率进行。
9.根据权利要求6所述的用途，其中到所述血管中的所述输注是以小于或等于1.0mL/min的速率进行。
10.根据权利要求6所述的用途，其中到所述血管中的所述输注是以小于或等于0.6mL/min的速率进行。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述血管为左冠状动脉。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述冠状循环的流出不是通过非天然方式限制。
13.根据权利要求11所述的用途，其中侧心室前端、侧心室下端、隔膜和右心室的心脏细胞的转染可使用PCR进行检测。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸能够表达能调节所述心脏细胞的细胞活性的蛋白质。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述细胞活性为心肌细胞的钙循环路径。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述蛋白质为肌质网/内质网三磷酸腺苷酶(SERCA)。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述SERCA为SERCA2a。
18.根据权利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是存在于选自由以下组成的群组的病毒载体中：腺相关病毒、腺病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、牛乳头瘤病毒、慢病毒载体、牛痘病毒和多瘤病毒。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述病毒载体为AAV病毒。
20.根据权利要求18所述的用途，其中所述病毒载体为AAV2/1载体。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述多聚核苷酸可操作性连接到基于CMV的启动子且包装于所述病毒载体中。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述心脏细胞的所述转染使得侧心室节段缩短增加。
24.根据权利要求22所述的用途，所述疾病为充血性心力衰竭。
25.根据权利要求1所述的用途，其中所述多聚核苷酸是包装于病毒载体的脱氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)中。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所输注的DRP的总数小于或等于选自由以下组成的群组的量：1×1014、1×1013、3×1012、1×1012、1×1011、1×1010、1×109和1×108。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所输注的DRP的总数小于或等于1×1013。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所输注的DRP的总数小于或等于1×1012，所述病毒载体为AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，所述血管为左或右冠状动脉，且所述多聚核苷酸的所述输注以小于或等于2mL/min的流速持续至少10分钟；且
其中侧心室前端、侧心室下端、隔膜和右心室的心脏细胞的转染可使用PCR进行检测。
29.根据权利要求1所述的用途，其中所述疾病选自由以下组成的群组：心力衰竭、局部缺血、心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、移植物排斥、异常心脏收缩性、非缺血性心肌病、二尖瓣关闭不全、主动脉瓣狭窄或主动脉瓣关闭不全、异常Ca2+代谢和先天性心脏病。
30.根据权利要求27所述的用途，其中所述病毒载体为AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，所述血管为左或右冠状动脉，且所述多聚核苷酸的所述输注以小于或等于2.5mL/min的流速持续至少8分钟；且
其中侧心室前端、侧心室下端、隔膜和右心室的心脏细胞的转染可使用PCR进行检测；且
其中与输注所述多聚核苷酸之前的侧心室节段缩短相比，当在所述输注后4个月测量时，所述心脏细胞的所述转染使得侧心室节段缩短增加至少25％。
31.根据权利要求27所述的用途，其中所述病毒载体为AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，所述血管为左或右冠状动脉，且所述多聚核苷酸的所述输注持续至少10分钟。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述心血管系统疾病为充血性心力衰竭。
33.根据权利要求31所述的用途，其中所述多聚核苷酸的所述输注是以6mL/min的流速进行。
34.根据权利要求31所述的用途，其中所述心脏细胞的所述转染引起选自由以下组成的群组的心脏功能量度的改进：SERCA2a蛋白的表达、节段缩短、射血分数、心输出量、心室松弛的时间常数和反流体积。
35.根据权利要求27所述的用途，其中所述药剂是经至少3分钟的时间输注到所述冠状循环的另一血管中。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述病毒载体为AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列；
其中所述血管为所述左冠状动脉，且所述多聚核苷酸到所述左冠状动脉中的所述输注持续至少6分钟；且
其中所述另一血管为所述右冠状动脉，且所述多聚核苷酸到所述右冠状动脉中的所述输注持续至少3分钟。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述心血管系统疾病为充血性心力衰竭。
38.根据权利要求36所述的用途，其中所述多聚核苷酸到所述左冠状动脉和所述右冠状动脉中的所述输注是以6mL/min的流速进行。
39.根据权利要求36所述的用途，其中所述心脏细胞的所述转染引起选自由以下组成的群组的心脏功能量度的改进：SERCA2a蛋白的表达、节段缩短、射血分数、心输出量、心室松弛的时间常数和反流体积。
40.一种通过转染大型动物的心脏细胞来治疗或预防心血管疾病的方法，所述方法包含：
鉴别需要治疗或预防心血管疾病的哺乳动物；
在活体内将治疗性多聚核苷酸输注到冠状循环的血管中，
其中所述治疗性多聚核苷酸是经至少3分钟的时间输注到所述血管中；
其中所述冠状循环并未从所述哺乳动物的全身循环中分离或实质上分离；且
其中所述治疗性多聚核苷酸转染所述哺乳动物的心脏细胞，从而引起所述心血管疾病的治疗或预防。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述多聚核苷酸是包装于病毒载体的脱氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)中，所输注的DRP的总数小于或等于1×1013，且所述病毒载体为AAV2/1，所述多聚核苷酸包含SERCA2a编码序列，所述血管为左或右冠状动脉，且所述多聚核苷酸的所述输注持续至少10分钟。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述心血管系统疾病为充血性心力衰竭。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述心脏细胞的所述转染引起选自由以下组成的群组的心脏功能量度的改进：SERCA2a蛋白的表达、节段缩短、射血分数、心输出量、心室松弛的时间常数和反流体积。
44.一种组合物，其包含适于转染心脏细胞的治疗性多聚核苷酸，所述组合物用于在不将冠状循环从全身循环中分离的情况下，通过将所述多聚核苷酸经至少3分钟的时间输注到所述冠状循环的血管中来治疗或预防心脏病。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述多聚核苷酸包含包装于AAV2/1病毒载体的脱氧核糖核酸酶抗性粒子(DRP)中的SERCA2a编码序列，所输注的DRP的总数小于或等于1×1013，所述血管为左或右冠状动脉，且所述多聚核苷酸的所述输注持续至少10分钟。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述心血管系统疾病为充血性心力衰竭。
47.一种试剂盒，其包含：
医药组合物，其包含至少1×1011个AAV2/1载体DRP，所述载体含有编码SERCA2a的多聚核苷酸；和
说明书，其说明应将包含至少0.5×1011个AAV2/1载体DRP的溶液投与需要预防或治疗心血管疾病的患者，所述载体含有编码SERCA2a的多聚核苷酸，所述预防或治疗是通过将所述溶液活体内输注到冠状循环的血管中来实现，其中所述冠状循环未从所述患者的全身循环中分离或实质上分离，且其中所述多聚核苷酸是经至少3分钟的时间输注到所述血管中。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述血管为左或右冠状动脉，且所述多聚核苷酸的所述输注持续至少8分钟的时间。
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