JP2023552443A - ダノン病の治療 - Google Patents

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Abstract

ダノン病に罹患している若しくはダノン病のリスクがあると特定された、及び／又はＬＡＭＰ－２遺伝子の１つ以上のアイソフォームに不活性化変異を有すると特定された対象におけるダノン病を治療するための方法が提供される。本方法は、治療有効量の、カプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを対象に投与することを含んでもよく、当該ベクターゲノムが、ＬＡＭＰ－２タンパク質、好ましくはＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１２２，２４９号、表題「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄａｎｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ」に対する優先権を主張し、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子出願されており、．ｔｘｔ形式の電子的に提出された配列表を含む。この．ｔｘｔファイルには、２０２１年１２月７日に作成され、約６２キロバイトのサイズを有する「ＲＯＰＡ＿０２３＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題される配列表が含まれている。この．ｔｘｔファイルに含まれている配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、概して、ダノン病におけるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子療法の臨床使用に関する。
リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２、別名、ＣＤ１０７ｂ）は、リソソーム関連膜糖タンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の選択的スプライシングにより、３つのアイソフォーム、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、及びＬＡＭＰ－２Ｃが生成される。ＬＡＭＰ－２の機能喪失型変異は、オートファジー障害に関連する家族性心筋症であるダノン病を含むヒト疾患と関連している。
国際特許出願公開第２０１７／１２７５６５Ａ１号（特許文献1）は、Ｈａｓｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１５ Ｊｕｌ；３３（７）：２３４３－５０（非特許文献1）に記載されるように、ＬＡＭＰ－２変異を有する患者に由来するヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）におけるＬＡＭＰ－２の過剰発現により、酸化ストレスレベルの低下及びアポトーシス細胞死がもたらされることを開示しており、疾患病態生理学におけるＬＡＭＰ－２Ｂの重要性を確証している。
ヒト対象におけるダノン病の治療に関連する方法及び組成物の必要性が当該技術分野に依然として存在する。本開示は、組成物のかかる方法を提供する。
国際特許出願公開第２０１７／１２７５６５Ａ１号
Ｈａｓｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１５ Ｊｕｌ；３３（７）：２３４３－５０
一態様では、本開示は、ダノン病に罹患している若しくはダノン病のリスクがあると特定された、及び／又はＬＡＭＰ－２遺伝子の１つ以上のアイソフォームに不活性化変異を有すると特定された対象におけるダノン病を治療するための方法であって、治療有効量の、カプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを対象に投与することを含み、ベクターゲノムがＬＡＭＰ－２タンパク質、好ましくはＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたり約２×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）未満である。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇあたり約１．５×１０１４ｖｇ未満である。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇあたり約１×１０１４ｖｇ未満である。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇあたり少なくとも約１×１０１２ｖｇである。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇあたり少なくとも約１×１０１３ｖｇである。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇあたり約６．７×１０１３ｖｇである。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇあたり約１．１×１０１４ｖｇである。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、前記対象の体重１ｋｇあたり約２．０×１０１４ｖｇである。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のタクロリムスを対象に投与することを更に含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のリツキシマブを対象に投与することを更に含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のタクロリムスを対象に投与することと、有効量のリツキシマブを対象に投与することと、を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のエクリズマブを対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のリツキシマブを対象に投与すること、有効量のタクロリムスを対象に投与すること、及び／又は有効量のエクリズマブを対象に投与することを更に含む。
いくつかの実施形態では、対象は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、任意選択的に、可逆性血小板減少症及び／又は急性腎障害（ＡＫＩ）をもたらすａＨＵＳなどの補体活性化の続発症のリスクがある。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のコルチコステロイドを対象に投与することを更に含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のタクロリムスを投与する前に、有効量のコルチコステロイドを対象に投与することを更に含む。
いくつかの実施形態では、対象は、任意選択的に８～１４歳及び／又は１５～１７歳の若年対象である。
いくつかの実施形態では、対象は、任意選択的に０～８歳の小児対象である。
いくつかの実施形態では、対象は、任意選択的に１８歳以上の成人対象である。
いくつかの実施形態では、治療有効量のＡＡＶは、静脈内投与される。
いくつかの実施形態では、治療有効量のＡＡＶは、直接心臓注射、任意選択的に頸静脈内カテーテル又はスワン・ガンツカテーテルにより投与される。
いくつかの実施形態では、治療有効量のＡＡＶは、腹腔内注射により投与される。
いくつかの実施形態では、本方法により、ａ）ＡＡＶによる心筋細胞及び／若しくは骨格筋の形質導入、ｂ）任意選択的に心筋細胞及び／若しくは骨格筋における、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする外因性リボ核酸ポリヌクレオチドの発現及び／若しくは外因性ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現、ｃ）１つ以上のダノン病関連組織学的異常、任意選択的に自己貪食空胞若しくは筋原線維錯綜配列の補正若しくは改善、ｄ）心筋細胞分子マーカー発現の補正若しくは改善、並びに／又はｅ）心筋細胞組織学の補正若しくは改善のうちの１つ以上がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、プロモーターに作動可能に連結されたＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、ならびに、ポリヌクレオチド配列が配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を共有する、及び／又はＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が配列番号１に対する少なくとも９５％の同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２を含む若しくはそれからなる、及び／又はＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質は、配列番号１を含む若しくはそれからなる。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号２２に対する少なくとも９５％の同一性を共有するエンハンサー／プロモーター領域を含む。
いくつかの実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、配列番号２２を含む又はそれからなる。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、５′から３′の順に、
（ａ）配列番号２２を含むエンハンサー／プロモーター領域、
（ｂ）配列番号３を含み、当該ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードする当該ポリヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号２７を含む３′ＵＴＲ配列、及び／又は
（ｄ）配列番号７を含むポリアデニル化配列
を含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、（ｉ）配列番号１１を含む５′ＩＴＲと、（ｉｉ）配列番号１２を含む３′ＩＴＲとに隣接している。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号８を含む。
いくつかの実施形態では、カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９カプシドは、配列番号２８のアミノ酸１～７３６、配列番号２８のアミノ酸１３８～７３６、又は配列番号２８のアミノ酸２０３～７３６を含む１つ以上のカプシドタンパク質を含む。
他の態様では、本開示は、ダノン病の治療における使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物を提供する。使用のための単位用量、医薬組成物、又は使用組成物は、治療有効量の、カプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを含み、ここで、ベクターゲノムが、ＬＡＭＰ－２タンパク質、好ましくはＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたり約２×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）未満である。
いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満である。
別の態様では、本開示は、本開示の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物と、ダノン病の治療における使用のための説明書と、を含むキットを提供する。
本キットは、リツキシマブ、タクロリムス、エクリズマブ、及びコルチコステロイドのうちの１つ以上を含む１つ以上の単位用量、医薬組成物、又は組成物を更に含んでもよい。
本発明の更なる態様及び実施形態は、以下の発明を実施するための形態に開示されている。
本開示におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を生成するために使用したｐＡＡＶ－ＬＡＭＰ２Ｂトランスファープラスミドの図を示す。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２に由来する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）エレメントに隣接する発現カセットと、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ ＩＥ）エンハンサー、ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ニワトリベータ－アクチン、及びウサギグロビンイントロン（ＣＢＡ／ＲｂＧイントロン）で構成されるＣＡＧプロモーターと、ＬＡＭＰ２Ｂ導入遺伝子と、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）と、ウサギグロビンポリアデニル化シグナル（ＲＧｐＡ）とを含む。 図２Ａ～２Ｂは、ＰＢＳ又は様々な用量のＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ（１×１０１３、５×１０１３、及び１×１０１４ｖｇ／ｋｇ）を注射したＷＴ又はＬＡＭＰ２ ＫＯマウスにおける心臓組織分析のグラフを示す。図２Ａは、ｑＰＣＲを使用して決定した核あたりのベクターコピー数（ＶＣＮ／核）を示す。図２Ｂは、ＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ－ＰＣＲを示す（ＰＢＳと比較した倍率変化、ＧＡＰＤＨにより正規化）。プライマーは、ヒト及びマウスＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡの両方を検出する。値は、平均±標準誤差である。ＰＢＳを注射したＫＯマウスに対して、＃＃がｐ＜０．０１であり、＃＃＃がｐ＜０．０００１である。 図３Ａ～３Ｃは、心臓組織におけるヒトＬＡＭＰ２及びＬＣ３－ＩＩタンパク質発現のグラフを示す。図３Ａは、ＰＢＳ又は増加用量のＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ（１×１０１３、５×１０１３、及び１×１０１４ｖｇ／ｋｇ）を注射したＬａｍｐ２ ＫＯマウス、並びにローディング対照として使用したマウス（ｍＬＡＭＰ２）及びヒトＬＡＭＰ２（ｈＬＡＭＰ２）、ＬＣ３－ＩＩ（オートファジーのマーカー）、ＧＡＰＤＨに対するウェスタンブロットにより評価した未処理対照ＷＴマウスの心臓由来のタンパク質ライセートを示す。図３Ｂは、ＧＡＰＤＨに正規化したｈＬＡＭＰ２タンパク質の定量化（ＩｍａｇｅＪを使用した密度測定）を示す。図３Ｃは、ＧＡＰＤＨに正規化したＬＣ３－ＩＩの定量化（ＩｍａｇｅＪを使用した密度測定）を示す。値は、平均±標準誤差である。ＷＴに対して、＊＊がｐ＜０．０１であり、ＰＢＳを注射したＫＯマウスに対して、＃がｐ＜０．０５であり、＃＃がｐ＜０．０１である。 図３Ａの説明を参照されたい。 図３Ａの説明を参照されたい。 液胞（黄色の矢印で示すオートファジー構造）を示す心臓組織の透過電子顕微鏡画像を示す。ＰＢＳ又は５×１０１３若しくは１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂを注射したＷＴ型又はＬａｍｐ２ ＫＯマウス由来の代表的な画像。スケールバーは、上パネルでは２μｍであり、下パネルでは０．５４μｍである。 ６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂで治療した患者における二倍体ゲノムあたりのベクターＤＮＡコピーのグラフを示す。患者１００１、１００２、及び１００５を、ベースライン時点、治療後８週時点、６ヶ月時点、及び１２ヶ月時点で分析した。 心臓ＬＡＭＰ２Ｂ発現を示す患者１００２由来の心臓組織の免疫組織化学画像を示す。投与前、陽性対照、又は治療後８週時点、６ヶ月時点、及び１２ヶ月時点での６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂで治療した患者由来の代表的な画像。スケールバーは、１００μｍである。 図７Ａ～７Ｃは、患者１００１（図７Ａ）、患者１００２（図７Ｂ）、及び患者１００５（図７Ｃ）のベースラインと比較した脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）の倍率変化のグラフを示す。患者を６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂで治療し、ＢＮＰ倍率変化を、治療後８週目、６ヶ月目、及び１２ヶ月目に分析した。 ＤＬＴが特定されないシナリオにおける、研究コホートの登録順序の図を示す。 所与のコホート内での単一ＤＬＴの状況下での任意のコホートの登録順序の図を示す。コホート内の登録を、第２の患者がＤＬＴを経験した場合に停止する。三角形／感嘆符は、患者２のＤＬＴ発生を示す。 図１０Ａ～１０Ｄは、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ研究評価及び治療事象表を示すチャートである。略語：ＡＡＶ９：アデノ随伴ウイルス血清型９、ＡＤＡ：抗薬物抗体、ａＰＴＴ：活性化部分トロンボプラスチン時間、ＢＮＰ：脳性ナトリウム利尿ペプチド、Ｃ３：補体３、Ｃ４：補体４、ＣＢＣ：全血球数、ＣＫ－ＭＢ：クレアチニンキナーゼ－ＭＢ、Ｄ：日、ｄ／ｃ：中止、ＥＣＧ：心電図、ＨＢＶ：Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＣＶ：Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ：ヒト免疫不全ウイルス、ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ、ＩｇＭ：免疫グロブリンＭ、ＩＰ：治験薬、ＩＶ：静脈内注入、ＬＦＴ：肝機能検査、Ｍ：月、ＭＲＩ：磁気共鳴画像法、ＰＭＢＣ：末梢血単核細胞、ＰＲＯ：患者報告アウトカム、ＰＴ：プロトロンビン時間、ＱＯＬ：生活の質、ｓＣ５ｂ－９：血清膜侵襲複合体、ＴＡＴ：トロンビン－アンチトロンビン複合体、ＶＯ２：最大酸素消費量、Ｗ：週。 図１０Ａの説明を参照されたい。 図１０Ａの説明を参照されたい。 図１０Ａの説明を参照されたい。 図１１Ａ～１１Ｂは、ＰＢＳ若しくは増加用量のＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ（１×１０１３、５×１０１３、及び１×１０１４ｖｇ／ｋｇ）を注射したＬａｍｐ２ ＫＯマウス又は未処理対照ＷＴマウスにおける侵襲的左心室内圧（それぞれ、ｄＰ／ｄｔ最大値及びｄＰ／ｄｔ最小値）によって分析した心臓収縮性（図１１Ａ）及び心臓弛緩（図１１Ｂ）のグラフを示す。 液胞（黄色の矢印で示すオートファジー構造）を示す心臓組織の透過電子顕微鏡画像を示す。ＰＢＳ又は５×１０１３、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、若しくは２×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂを注射したＷＴ型又はＬａｍｐ２ ＫＯマウス由来の代表的な画像。スケールバーは、上パネルでは２μｍであり、下パネルでは０．６μｍである。 図１３Ａ～１３Ｂは、ＰＢＳ若しくは増加用量のＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ（１×１０１３、５×１０１３、１×１０１４、及び２×１０１４ｖｇ／ｋｇ）を注射したＬａｍｐ２ ＫＯマウス又は未処理対照ＷＴマウスにおける侵襲的左室血行動態（それぞれ、ｄＰ／ｄｔ最大値及びｄＰ／ｄｔ最小値）によって分析した心臓収縮性（図１３Ａ）及び心臓弛緩（図１３Ｂ）のグラフを示す。 図１４Ａ～１４Bは、低用量のＲＰ－Ａ５０１で治療した後の免疫組織化学（図１４Ａ）によるＬＡＭＰ２タンパク質の発現及び電子顕微鏡による細胞形態（図１４Ｂ）を示す。心室中隔の生検からの患者１００５由来の代表的な画像を示す。 図１４Ａの説明を参照されたい。 低用量患者及び高用量患者の両方における壁厚の減少又は安定化を伴う心エコー検査での心室肥大のリモデリングを示す。全ての心エコー検査パラメータは、単一の読み取り機によって行われる現地の臨床検査評価によるものである。 低線量患者及び高用量患者の両方における左室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）及び壁厚の安定化又は改善を示す。全ての心エコー検査パラメータは、単一の読み取り機によって行われる現地の臨床検査評価によるものである。 侵襲的血行動態が低線量患者及び高用量患者における肺毛細血管楔入圧によって測定した拡張機能障害（ＬＶ充満圧）の長期安定化又は改善を示したことを示す。 高用量患者及び低用量患者の両方における血行動態の安定化又は収縮機能の改善を示す。
発明の詳細な説明
本開示は、ヒト対象におけるダノン病の治療に関する方法及び組成物を提供する。本発明者らは、ＬＡＭＰ－２のＬＡＭＰ－２Ｂアイソフォームを発現するように設計されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いてヒト対象におけるダノン病の治療に成功したことを実証した。このＡＡＶは、コルチコステロイド、タクロリムス、リツキシマブ、及び／又はエクリズマブでの治療と併せて投与されてもよく、このＡＡＶは、様々な用量で投与されてもよい。本明細書に開示されるように、およそ６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下～およそ２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ以上の範囲の用量がダノン病対象において安全かつ有効であり得る。
ベクター配列
ヒトＬＡＭＰ－２Ｂの野生型ポリペプチド配列（配列番号１）及びヒトＬＡＭＰ－２Ｂをコードする野生型ポリヌクレオチド配列（配列番号２）は、それぞれ、
Figure 2023552443000002
（配列番号１）及び
Figure 2023552443000003
（配列番号２）である。
リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）のアイソフォーム又はその機能的バリアントをコードする修飾されたポリヌクレオチド配列が本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、修飾されたポリヌクレオチド配列は、ＬＡＭＰ－２のアイソフォームをコードする野生型ポリヌクレオチドと比較して、コドン最適化、ＣｐＧ枯渇、隠れたスプライス部位の除去、又は減少した数の代替オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドは、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、ＬＡＭＰ－２Ｃ、又はそれらのアイソフォームのうちのいずれかの機能的バリアントをコードする。実施形態では、本開示は、配列番号２と比較して１つ以上のヌクレオチド置換を含むＬＡＭＰ－２Ｂ又はその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチド配列若しくは導入遺伝子を提供する。実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３～５から選択される配列に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。本開示は、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする少なくとも３つの例証的なバリアント導入遺伝子配列（配列番号３～５）：
Figure 2023552443000004
（配列番号３）、
Figure 2023552443000005
（配列番号４）、及び
Figure 2023552443000006
（配列番号５）を提供する。
一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２～５から選択される配列に対する少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２～５から選択される配列に対する少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２～５から選択される配列を含む。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号４に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号５に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２～５のうちのいずれか１つの部分配列と類似している又は同一である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２～５のうちのいずれか１つの部分配列を含む。様々な実施形態では、部分配列は、少なくとも約５０ヌクレオチド（ｎｔ）、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１５０ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ、少なくとも約４５０ｎｔ、少なくとも約４００ｎｔ、少なくとも約４５０ｎｔ、少なくとも約５５０ｎｔ、少なくとも約６００ｎｔ、少なくとも約６５０ｎｔ、少なくとも約６００ｎｔ、少なくとも約６５０ｎｔ、少なくとも約７００ｎｔ、少なくとも約７５０ｎｔ、少なくとも約８００ｎｔ、少なくとも約８５０ｎｔ、少なくとも約９００ｎｔ、少なくとも約９５０ｎｔ、又は少なくとも約１０００ｎｔ長を有する完全配列に、任意の一連の連続したヌクレオチド（ｎｔ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３～５のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対する少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３～５のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対する少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２～５のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む配列を含む。実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２～５のうちのいずれか１つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、若しくはＬＡＭＰ－２Ｃ、又はそれらのアイソフォームのいずれの機能的断片若しくはバリアントのいずれも含む、ＬＡＭＰ－２の様々なアイソフォームのうちのいずれかをコードする。したがって、特定の実施形態では、発現カセットは、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、若しくはＬＡＭＰ－２Ｃをコードする導入遺伝子配列のコドン最適化、発現カセット若しくは導入遺伝子配列がその対応する野生型配列よりも少ないＣｐＧ部位を含むこと、発現カセット若しくは導入遺伝子配列がその対応する野生型配列よりも少ないＣｐＧ部位を含むこと、発現カセット若しくは導入遺伝子配列がその対応する野生型配列よりも少ない隠れたスプライス部位を含むこと、及び／又は発現カセット若しくは導入遺伝子配列がその対応する野生型配列よりも少ないオープンリーディングフレームを含むことから選択される１つ以上の修飾を含む、対応する野生型ポリヌクレオチド配列と比較して１つ以上の修飾を含むＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、若しくはＬＡＭＰ－２Ｃ、又はそれらの機能的断片若しくはバリアントのうちのいずれかをコードする最適化ポリヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、最適化配列は、ヒト細胞における発現の増加に対して最適化される。ＬＡＭＰ－２Ａアイソフォーム及びＬＡＭＰ－２Ｃアイソフォームをコードする野生型ヒトポリヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号２９及び配列番号３０に記載される。ヒトＬＡＭＰ－２Ａタンパク質及びヒトＬＡＭＰ－２Ｃタンパク質の野生型配列は、それぞれ、配列番号３４及び配列番号３５に記載される。野生型ＬＡＭＰ－２アイソフォームの配列及びコード配列も公的に入手可能である。ＬＡＭＰ－２Ｂに関する具体的な実施形態が本明細書に記載されているが、各実施形態においてＬＡＭＰ－２Ａ又はＬＡＭＰ－２Ｃを代わりに使用することができることが理解される。
野生型ＬＡＭＰ－２Ａのコード配列（配列番号２９）及び野生型ＬＡＭＰ－２Ｃのコード配列（配列番号３０）は、少なくともヌクレオチド１～１０８０にわたって野生型ＬＡＭＰ－２Ｂのコード配列（配列番号２）と１００％同一である。したがって、当業者であれば、本明細書に開示される導入遺伝子、発現カセット、及びベクターが、ＬＡＭＰ－２Ｂ（例えば、配列番号３～５のうちのいずれかの最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ）のヌクレオチド１０８１～１２３３の代わりにＬＡＭＰ－２Ａ（配列番号２９）又は野生型ＬＡＭＰ－２Ｃ（配列番号３０）のいずれかの３′末端（ヌクレオチド１０８１～末端）を置換することにより、ＬＡＭＰ－２のこれらのアイソフォームの発現のために適合され得ることを容易に認識するであろう。例えば、本発明の実施形態は、それぞれ、配列番号３１～３３である、最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子配列、配列番号３～５のヌクレオチド１～１０８０を利用する。
一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３１～３３から選択される配列に対する少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３１～３３から選択される配列に対する少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３１～３３から選択される配列を含む。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３１に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３２に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３３に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全な同一性を共有する。いくつかの事例では、導入遺伝子は、参照配列、例えば、「天然型」又は「野生型」ＬＡＭＰ－２Ｂ配列のポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、参照配列に対する最大７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号２である。例えば、配列番号３は、配列番号２に対する７８．５％の同一性を共有する。
いくつかの事例では、導入遺伝子は、参照配列、例えば、「天然型」又は「野生型」ＬＡＭＰ－２Ａ配列のポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、参照配列に対する最大７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号２９に記載される野生型ヒトＬＡＭＰ－２Ａ配列である。
いくつかの事例では、導入遺伝子は、参照配列、例えば、「天然型」又は「野生型」ＬＡＭＰ－２Ｃ配列のポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、参照配列に対する最大７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３０に記載される野生型ヒトＬＡＭＰ－２Ｃ配列である。
一実施形態では、導入遺伝子は、ヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。一実施形態では、導入遺伝子コード配列は、まれにしか提示されないコドンをより頻繁に提示されるコドンに置き換えることによって発現を増強するように修飾される又は「コドン最適化」される。このコード配列は、翻訳のためにアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の部分である。翻訳中、６１個のトリヌクレオチドコドンの各々が２０個のアミノ酸のうちの１つに翻訳され、遺伝コードに縮重性又は冗長性をもたらす。しかしながら、異なる細胞型及び異なる動物種は、異なる頻度で同じアミノ酸をコードするｔＲＮＡ（各々アンチコドンを有する）を利用する。遺伝子配列が対応するｔＲＮＡによってまれにしか提示されないコドンを含む場合、リボソーム翻訳機構は速度を緩め、効率的な翻訳を妨げる場合がある。特定の種について「コドン最適化」により発現を改善することができ、ここで、コード配列が同じタンパク質配列をコードするように改変されるが、高度に発現されたヒトタンパク質によって高度に提示される及び／又は利用されるコドンを利用する（Ｃｉｄ－Ａｒｒｅｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８）。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子のコード配列は、哺乳動物又は霊長類においてまれにしか発現されないコドンを、霊長類において頻繁に発現されるコドンに置き換えるように修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、参照ポリペプチド（例えば、野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ、配列番号３）に対する少なくとも８５％の配列同一性、例えば、参照ポリペプチドに対する少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードし、ここで、コード配列の少なくとも１つのコドンが、ヒトにおいて、上記又は本明細書に開示される配列における対応するコドンよりも高いｔＲＮＡ頻度を有する。
一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２よりも少ない代替オープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、導入遺伝子は、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終結又は除去によって発現を増強するように修飾される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンに続き、終止コドンを含まない核酸配列である。ＯＲＦは、順方向であっても逆方向であってもよく、目的とする遺伝子と比較して「インフレーム」であっても「アウトオブフレーム」であってもよい。かかるオープンリーディングフレームは、目的とする遺伝子とともに発現カセットで発現される可能性があり、望ましくない有害作用をもたらす可能性がある。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、コドン使用を更に改変することによってオープンリーディングフレームを除去するように修飾されている。これは、目的とする遺伝子にコードされたアミノ酸配列を保存し、かつ任意選択的に高度に利用されるコドンを維持しながら（すなわち、頻度２０％未満のコドンを回避しながら）、１つ以上の開始コドン（ＡＴＧ）を除去することによって、及び／又は１つ以上の終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、若しくはＴＧＡ）を所望のＯＲＦに対して逆方向に若しくはアウトオブフレームで導入することによって行われ得る。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５′側に最大１つ、最大２つ、最大３つ、最大４つ、又は最大５つの開始コドンを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５′側に開始コドンを含まない。いくつかの実施形態では、導入遺伝子の開始コドンの５′側の５′ＵＴＲ、プロモーター、エンハンス、プロモーター／エンハンサーエレメント、又は他の配列における１つ以上のＡＴＧコドンは、１つ以上の隠れた開始部位が除去された後に残る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、誤ったｍＲＮＡを生成しないように導入遺伝子の上流に隠れた開始部位を含まない。
本開示の変形例では、導入遺伝子コード配列は、コドン最適化若しくは非導入遺伝子ＯＲＦの除去のいずれかによって、又はそれらの両方の技法を使用して最適化され得る。いくつかの事例では、コドン最適化中に導入されたＯＲＦを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子ＯＲＦを除去する又は最小限に抑える。
一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２よりも少ないＣｐＧ部位を含む。理論に拘束されるものではないが、ポリヌクレオチド配列中のＣｐＧ部位の存在が、そのポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターに対する宿主の望ましくない免疫応答と関連していると考えられる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＣｐＧ部位の数を減少させるように設計される。例示的な方法は、米国特許出願公開第２００２／００６５２３６Ａ１号に提供されている。
一実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２よりも少ない隠れたスプライス部位を含む。最適化のために、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ソフトウェアを使用して、例えば、転写サイレンシングを回避するためにＧＣ含量を増加させる及び／又は隠れたスプライス部位を除去し、それ故に、導入遺伝子の発現を増加させることができる。あるいは、当該技術分野で既知の任意の最適化方法を使用してもよい。隠れたスプライス部位の除去は、例えば、国際特許出願公開第２００４／０１５１０６Ａ１号に記載されている。
ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする発現カセット及び遺伝子療法ベクターも本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、発現カセット及び遺伝子療法ベクターは、本明細書に開示されるコドン最適化又はバリアントＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド配列又は導入遺伝子配列を含む。
特定の実施形態では、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする発現カセット及び遺伝子療法ベクターは、コンセンサス最適コザック配列及び全長ポリアデニル化（ポリＡ）配列（又は全長ポリＡの切断されたポリＡによる置換）を含み、最小限の上流（すなわち、５′側）又は隠れた開始コドン（すなわち、ＡＴＧ部位）を含むか、又はそれを含まない。いくつかの実施形態では、発現カセットは、代替ｍＲＮＡを生成することができる導入遺伝子の５′側に開始部位を含まない。ある特定の実施形態では、発現カセット又は遺伝子療法ベクターは、ＬＭＡＰ－２Ｂをコードする配列、例えば、本明細書に開示されるコドン最適化又はバリアントＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド配列又は導入遺伝子配列を含む。
いくつかの事例では、発現カセットは、第１の逆位末端反復配列、エンハンサー／プロモーター領域、コンセンサス最適コザック配列、導入遺伝子（例えば、本明細書に開示されるＬＡＭＰ－２Ｂをコードする導入遺伝子）、全長ポリＡ配列を含む３′非翻訳領域、及び第２の逆位末端反復配列のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の一方又は両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、若しくはＡＡＶ９ ＩＴＲ、又は当該技術分野で既知のいずれか１つのＩＴＲである。いくつかの実施形態では、発現カセットは、正確に２つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、両方のＩＴＲが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ９ ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、両方のＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結されたコザック配列を含む。一実施形態では、コザック配列は、配列番号６：
ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号６）
を含む又はそれからなるコンセンサス最適コザック配列である。
様々な実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された代替コザック配列を含む。一実施形態では、コザック配列は、配列番号１４～１８：
（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号１４）、
ＡＧＮＮＡＵＧＮ（配列番号１５）、
ＡＮＮＡＵＧＧ（配列番号１６）、
ＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１７）、
ＧＡＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１８）
のうちのいずれか１つを含む又はそれからなる代替コザック配列である。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、コザック配列を含む。
配列番号１４において、小文字は、塩基がそれでもなお変化し得る位置で最も一般的な塩基を示し、大文字は、高度に保存された塩基を示し、Ｒは、アデニン又はグアニンを示す。配列番号１４において、括弧内の配列（ＧＣＣ）は任意選択的である。配列番号１５～１７において、「Ｎ」は、任意の塩基を示す。
翻訳開始部位としてこのコンセンサス最適コザック配列の代わりに様々な配列を使用することができ、他の配列を特定及び試験することは当業者の技能の範囲内である。Ｋｏｚａｋ Ｍ．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｉｎｔｉｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５（４）：８８７－９０３（１９９１）を参照されたい。
一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子に作動可能に連結された全長ポリＡ配列を含む。一実施形態では、全長ポリＡ配列は、配列番号７：
Figure 2023552443000007
（配列番号７）を含む。
ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）（配列番号１９）、ＳＶ４０初期／後期ポリアデニル化シグナル（配列番号２０）、及びヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号２１）を含むが、これらに限定されない、様々な代替のポリＡ配列が、本開示の発現カセットに使用されてもよい：
Figure 2023552443000008
（配列番号１９）、
Figure 2023552443000009
（配列番号２０）、
Figure 2023552443000010
（配列番号２１）。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、ポリＡ配列の活性断片を含む。特定の実施形態では、ポリＡ配列の活性断片は、例えば、本明細書に開示されるポリＡ配列のうちのいずれかの２０塩基対（ｂｐ）未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、又は１５０ｂｐ未満を含む又はそれからなる。
いくつかの事例では、発現カセットが確実に競合するＯＲＦを含まないようにすることにより、導入遺伝子の発現が増加する。一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５′側の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、又は５００塩基対以内に開始コドンを含まない。いくつかの実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５′側に開始コドンを含まない。いくつかの実施形態では、発現カセットは、代替ｍＲＮＡを生成することができる導入遺伝子の５′側に開始部位を含まない。
一実施形態では、発現カセットは、５′から３′の方向に、作動可能に連結された第１の逆位末端反復配列、エンハンサー／プロモーター領域、イントロン、コンセンサス最適コザック配列、導入遺伝子、全長ポリＡ配列を含む３′非翻訳領域、及び第２の逆位末端反復配列を含み、発現カセットは、代替ｍＲＮＡを生成することができる導入遺伝子の５′側に開始コドンを含まない。
いくつかの実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、５′から３′の方向に、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー及びニワトリベータ－アクチンプロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、ＣＡＧプロモーター（配列番号２２）を含む。本明細書で使用される場合、「ＣＡＧプロモーター」とは、ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ニワトリベータ－アクチンプロモーター、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びにウサギベータ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプターを含むポリヌクレオチド配列を指す。
Figure 2023552443000011
（配列番号２２）。
いくつかの実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、ユビキタスプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、ＣＭＶプロモーター（配列番号２３）、ＳＶ４０プロモーター（配列番号２４）、ＰＧＫプロモーター（配列番号２５）、及び／又はヒトベータ－アクチンプロモーター（配列番号２６）を含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー／プロモーター領域は、配列番号２３～２６のうちのいずれか１つに対する少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを含む：
Figure 2023552443000012
（配列番号２３）、
Figure 2023552443000013
（配列番号２４）、
Figure 2023552443000014
（配列番号２５）、
Figure 2023552443000015
（配列番号２６）。
更なる例示的なプロモーターとしては、ヒト伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦＳ）、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスロング逆位末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、目的とする遺伝子に対して異種の内因性細胞プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、３′ＵＴＲは、配列番号２７に対する少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有するポリヌクレオチド（ＷＰＲＥエレメント）を含む：
Figure 2023552443000016
（配列番号２７）。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、配列番号８～１０から選択される配列に対する少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態では、発現カセットは、配列番号８～１０から選択される配列に対する完全な同一性を共有するか、又は配列番号８～１０から選択される配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する：
Figure 2023552443000017
Figure 2023552443000018
（配列番号８）、
Figure 2023552443000019
Figure 2023552443000020
（配列番号９）、及び
Figure 2023552443000021
Figure 2023552443000022
Figure 2023552443000023
（配列番号１０）。
ある特定の実施形態では、発現カセットは、配列番号８～１０から選択される配列と比較して、本明細書に開示される修飾のうちのいずれかを含むが、これらに限定されない１つ以上の修飾を含む。特定の実施形態では、１つ以上の修飾は、１つ以上（例えば、全て）の上流ＡＴＧ配列の除去、コザック配列の最適化コンセンサスコザック配列若しくは別のコザック配列（本明細書に開示されるもののうちのいずれかを含むが、これらに限定されない）での置換、及び／又はポリアデニル化配列の全長ポリアデニル化配列又は別のポリアデニル化配列（本明細書に開示されるもののうちのいずれかを含むが、これらに限定されない）での置換のうちの１つ以上を含む。これらの例示的な発現カセット内の遺伝要素の例証的な構成が図１に示される。
一実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一実施形態では、発現カセットは、配列番号１１及び１２から選択される逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む：
Figure 2023552443000024
（配列番号１１）、
Figure 2023552443000025
（配列番号１２）。
関連実施形態では、本開示は、本明細書に開示される発現カセットを含む遺伝子療法ベクターを提供する。概して、本明細書に記載の遺伝子療法ベクターは、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）の１つ以上のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、ＬＡＭＰ－２を発現して、不十分なＬＡＭＰ－２タンパク質発現レベル及び／又はオートファジーフラックスの部分的又は完全な調整を、それを必要とする対象（例えば、ダノン病又は不十分なＬＡＭＰ－２発現に少なくとも部分的に起因する不十分なオートファジーフラックスを特徴とする別の障害を有する対象）に行うことを可能にする。特定の実施形態では、発現カセットは、本明細書に開示されるＬＡＭＰ－２をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、配列番号２～５、又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、バリアント配列は、配列番号２～５のうちのいずれかに対する少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントは、配列番号２～５のうちのいずれかの断片、例えば、配列番号２～５のうちのいずれかの配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を有する断片である。
遺伝子療法ベクター
遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターとすることができる。例証的な非ウイルスベクターとしては、例えば、ネイキッドＤＮＡ、カチオン性リポソーム複合体、カチオン性ポリマー複合体、カチオン性リポソーム－ポリマー複合体、及びエクソソームが挙げられる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示による組成物及び方法では、ウイルスベクターは、概して、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶが非病原性であり、かついずれの既知の疾患とも因果関係がないため、ＡＡＶに基づく組換えベクターは優れた臨床安全性に関連している。加えて、ＡＡＶは、多数の組織において非常に効率的な遺伝子送達能力及び持続的導入遺伝子発現能力を提供する。「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４などを含むが、これらに限定されないアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、全体的又は部分的に欠失されたＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上、例えば、ｒｅｐ遺伝子及び／又はｃａｐ遺伝子を有することができるが、隣接する機能的逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を保持することができる。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの救出、複製、及びパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる配列を少なくとも含むように本明細書で定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、それらの配列が機能的救済、複製、及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変されてもよい。ＡＡＶベクターは、１つ以上の修飾されたカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３）を含むが、これらに限定されない他の修飾を含んでもよい。例えば、カプシドタンパク質は、指向性を変化させる及び／又は免疫原性を減少させるように修飾されてもよい。
ＡＡＶに対する免疫原性が期待される。ＡＡＶ療法の投与後、ウイルスカプシド及び／又は導入遺伝子に対する抗体の発現が文献で報告されている（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７７：１７１３－１７２２（２０１７）、Ｒａｎｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７７：２５１９－２５３０（２０１７））。公開されている文献と一致して、本開示で行った研究は、投与後３０日目及び９１日目にＡＡＶ９に対する血清中和抗体の増加を同様に示した。ベクター送達により、ＡＡＶ９カプシドに対して特徴的な結合抗体応答がもたらされたが、ＬＡＭＰ２Ｂに対して有意な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は認められず、標的組織における形質導入媒介性ＬＡＭＰ２Ｂ機能に関して検出可能な結果はなかった。
野生型ＡＡＶが非病原性であり、かついずれの既知の疾患とも因果関係がないため、ＡＡＶに基づく組換えベクターは優れた臨床安全性に関連している。加えて、ＡＡＶは、多数の組織において非常に効率的な遺伝子送達能力及び持続的導入遺伝子発現能力を提供する。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４などを含むＡＡＶの様々な血清型が知られている。ＡＡＶベクターは、全体的又は部分的に欠失されたＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上、例えば、ｒｅｐ遺伝子及び／又はｃａｐ遺伝子を有することができるが、隣接する機能的逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を保持することができる。組換えＡＡＶベクターの血清型は、そのカプシドによって決定される。国際特許公開第２００３／０４２３９７Ａ２号は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びｒｈ１０のカプシド配列を含む様々なカプシド配列を開示している。国際特許公開第２０１３／０７８３１６Ａ１号は、ＡＡＶｒｈ７４由来のＶＰ１のポリペプチド配列を開示している。多数の多様な天然に存在する又は遺伝子修飾されたＡＡＶカプシド配列は、当該技術分野で既知である。
例証的かつ非限定的なカプシドは、配列番号２８の配列を有するＡＡＶ９カプシド（又はそのＶＰ１、ＶＰ２、若しくはＶＰ３断片）である。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、配列番号２８の全配列、配列番号２８のアミノ酸１３８～７３６、又は配列番号２８のアミノ酸２０３～７３６に対する少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の同一性を共有するカプシドタンパク質を含む。
Figure 2023552443000026
（配列番号２８）。
ＡＡＶ発現ベクターは、転写方向に作動可能に連結された構成要素として、転写開始領域、目的とするＤＮＡ（すなわち、ＬＡＭＰ－２遺伝子）、及び転写終結領域を含む制御エレメントを少なくとも提供するように、既知の技術を使用して構築される。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ９ベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの発現カセットは、ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。本開示のベクターの代替実施形態で使用されるＩＴＲには、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ２／９ベクターである。ＡＡＶ２／９という表記は、ＡＡＶベクターがＡＡＶ２のＩＴＲ及びＡＡＶ９のカプシドを有することを意味する。本開示の他の実施形態には、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ２／ｒｈ７４、ＡＡＶ５／９、及びＡＡＶ５／ｒｈ７４ベクターが含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知の他のＩＴＲが使用されてもよい。本開示のベクターに有用な例示的なＩＴＲ（及び他のＡＡＶ構成要素）としては、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ６９３６４６６Ｂ２、ＵＳ９１６９４９４Ｂ２、ＵＳ２００５／０２２０７６６Ａ１、ＵＳ２０１９／００２２２４９Ａ１、及びＵＳ７２８２１９９Ｂ２に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の実施に有用な遺伝子送達ウイルスベクターは、分子生物学の技術分野で周知の方法論を利用して構築することができる。典型的には、導入遺伝子を担持するウイルスベクターは、細胞形質導入を媒介する、導入遺伝子、好適な調節エレメント、及びウイルスタンパク質の産生に必要なエレメントをコードするポリヌクレオチドから構築される。かかる組換えウイルスは、当該技術分野で既知の技法によって、例えば、パッケージング細胞をヘルパープラスミド若しくはウイルスでトランスフェクトする又は一過性にトランスフェクトすることによって生成され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ９細胞（任意選択的にバキュロウイルスヘルパーベクターを有する）、２９３細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。ＵＳ２０１７／０２１８３９５Ａ１に記載されているように、ヘルペスウイルスベースの系を使用してＡＡＶベクターを産生することができる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、各々の完全な内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗ０９５／１４７８５、Ｗ０９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、及びＷ０９４／１９４７８に記載されている。
本開示は、本明細書に開示される発現カセット又はベクター（例えば、遺伝子療法ベクター）と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、本医薬組成物は、本明細書に開示される発現カセットを含むＡＡＶベクターを含み、例えば、発現カセットは、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードするコドン最適化導入遺伝子、例えば、配列番号３～５のうちのいずれか、及びそれらのバリアントを含む。治療有効量の、ＬＡＭＰ－２の１つ以上のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含むベクターを含む本明細書に開始される発現カセット又はベクターを含む、例えば、不十分なオートファジーフラックスを特徴とする障害（例えば、ダノン病）の予防又は治療における使用のための医薬組成物が提供される。
本発明の実施に有用なＡＡＶベクターは、アデノウイルスベースの系及びヘルパーを含まない系を含む様々な系を使用して、ＡＡＶビリオン（ウイルス粒子）にパッケージングすることができる。ＡＡＶ生物学における標準方法には、Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．（２００８）２５（３）：４８９－９９、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００６）１４（３）：３１６－２７、Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００４）１０（２）：３０２－１７、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００３）３（４）：２８１－３０４、Ｄｅｙｌｅ ＤＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００９）１１（４）：４４２－４４７、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００１）８（１６）：１２４８－５４、及びＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００１）４（４）：３８３－９１に記載のものが含まれる。ヘルパーを含まない系には、ＵＳ６，００４，７９７、ＵＳ７，５８８，７７２、及びＵＳ７，０９４，６０４に記載のものが含まれていた。
発現カセット又はベクターを含む医薬組成物は、選択された投与様式、例えば、脳室内、心筋内、冠動脈内、静脈内、動脈内、腎内、尿道内、硬膜外、又は筋肉内投与に好適な任意の形態であってもよい。１つ以上のＬＡＭＰ－２アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターは、動物及びヒトに、唯一の活性剤として、又は他の活性薬剤と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬支持体との混合物として投与することができる。いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、本開示の遺伝子療法ベクターのうちのいずれかがエクスビボで形質導入された細胞を含む。
ダノン病の治療
リソソーム障害及び／又はダノン病を治療する例示的な方法は、全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１７０２３９Ａ１に提供されている。
別の態様では、本開示は、ダノン病又は別のオートファジー障害の１つ以上の症状の予防、緩和、改善、軽減、抑制、排除、及び／又は逆転を必要とする対象におけるダノン病又は別のオートファジー障害の１つ以上の症状を予防する、緩和する、改善する、軽減する、抑制する、排除する、及び／又は逆転させる方法を提供し、本方法は、本開示の遺伝子療法ベクターを対象に投与することを含む。「ダノン病」という用語は、多系統臨床症状を伴うＸ連鎖優性骨格筋及び心筋障害を指す。ダノン病変異により、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）タンパク質発現の不在がもたらされる。主な臨床的特徴には、骨格筋症及び心筋症、心臓伝導異常、認知障害、並びに網膜疾患が含まれる。男性は、典型的には、女性よりも早期に、より重度に罹患する。
心臓注射は、例えば、頸静脈内などの中心静脈へのアクセスによって行われ得る。スワン・ガンツ肺動脈カテーテル（ＰＡＣ）又は他のＰＡＣを使用して、ＡＡＶを心臓に送達することができる。
一実施形態では、ベクターは、非経口、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、及び筋肉内からなる群から選択される経路を介して投与される。一実施形態では、ベクターは、複数回投与される。一実施形態では、ベクターは、ベクターの筋肉内注射により投与される。一実施形態では、ベクターは、ベクターの骨格筋への注射により投与される。一実施形態では、発現カセットは、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ／ＳＶ４０ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００７ Ｆｅｂ；１９（２）：３０９－１５に記載されるように、筋肉特異的プロモーター、任意選択的に筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター又はＭＣＫ／ＳＶ４０ハイブリッドプロモーターを含む。一実施形態では、ベクターは、心臓内注射により投与される。
一実施形態では、ベクター、例えば、ＡＡＶベクターは、全身投与される、より具体的には、静脈内投与される。有利なことに、ベクターは、本来のＬＡＭＰ－２Ｂ配列又は野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ配列を使用したときに同じ応答を観察するのに必要な用量未満の用量（ｖｇ／ｍＬ、ｖｇ／ｋｇ体重、又はｖｇ／分／ｋｇ）で投与される。特定の実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されるＬＡＭＰ－２Ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むＡＡＶ２／９ベクターである。
いくつかの実施形態では、本開示は、対象におけるＬＡＭＰ－２Ｂを発現する方法であって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを対象に全身投与することを含み、ＡＡＶベクターが、配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を共有するか、又は配列番号２と同一である導入遺伝子を含む発現カセットを含み、導入遺伝子がエンハンサー／プロモーター領域に作動可能に連結され、対象へのＡＡＶベクターの全身投与により、ＡＡＶベクターの投与前のＬＡＭＰ－２Ｂの発現又は未処理対照対象におけるＬＡＭＰ－２Ｂの発現と比較して増加したＬＡＭＰ－２Ｂの発現がもたらされる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンは、ベクターゲノム中にＡＡＶ９カプシド及びＡＡＶ２ ＩＴＲを有するベクターであるＡＡＶ２／９ベクターである。特定の実施形態では、発現カセットは、本明細書に開示されるエレメントのうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、全身投与は、静脈内投与を含む。いくつかの実施形態では、対象は、ダノン病の症状を呈している。いくつかの実施形態では、対象は、ダノン病に罹患しているか、又はダノン病のリスクがある。
いくつかの実施形態における全身（又はより具体的には静脈内）投与により、対象の１つ以上の組織（例えば、心臓、筋肉、及び／又は肝臓）に、導入遺伝子から発現されたｍＲＮＡの形態で、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現がもたらされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、心臓において、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍 少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍増加する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、心臓において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍 少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、心臓において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍 ２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍増加する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、筋肉において、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍 少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍増加する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、筋肉において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍 少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、筋肉において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍 ２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍増加する。
いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子は心臓で発現され、対象の肝臓では発現されない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、肝臓と比較して、心臓において、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍 少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍であると観察される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、肝臓と比較して、心臓において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍 少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍であると観察される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、肝臓と比較して、心臓において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍 ２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍であると観察される。
いくつかの実施形態では、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、心臓において、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍 少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍増加する。いくつかの実施形態では、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、心臓において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍 少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態では、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、未処理の対象又は対照ベクターで処理された対象における発現と比較して、心臓において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍 ２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍増加する。
いくつかの実施形態では、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、肝臓と比較して、心臓において、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍 少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、又は少なくとも約５倍であると観察される。いくつかの実施形態では、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、肝臓と比較して、心臓において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍 少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍であると観察される。いくつかの実施形態では、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、肝臓と比較して、心臓において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍 ２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍であると観察される。
いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターの投与により、未処理の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓において、最大約１．１倍、最大約１．２倍、最大約１．３倍、最大約１．４倍、最大約１．５倍、最大約１．６倍、最大約１．７倍、最大約１．８倍、最大約１．９倍、又は最大約２倍増加した野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現がもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターの投与により、未処理の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓において、最大１．１倍、最大１．２倍、最大１．３倍、最大１．４倍、最大１．５倍、最大１．６倍、最大１．７倍、最大１．８倍、最大１．９倍、又は最大２倍増加した野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現がもたらされる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターの投与により、未処理の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓において、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、又は２倍増加した野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現がもたらされる。
一実施形態では、本開示は、疾患又は障害、任意選択的にダノン病の治療を必要とする対象における疾患又は障害、任意選択的にダノン病を治療する方法であって、細胞を、本開示による遺伝子療法ベクターと接触させることと、対象に細胞を投与することと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、細胞は、幹細胞、任意選択的に多能性幹細胞である。一実施形態では、幹細胞は、心臓組織に分化することができる。一実施形態では、幹細胞は、筋肉組織、例えば、心筋組織及び／又は骨格筋組織に分化することができる。一実施形態では、幹細胞は、自家性である。一実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
一実施形態では、疾患又は障害は、オートファジー障害である。いくつかの実施形態では、オートファジー障害は、末期心不全、心筋梗塞、薬物毒性、糖尿病、末期腎不全、及び加齢からなる群から選択される。一実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。一実施形態では、対象は、ダノン病又は別のオートファジー障害の症状を呈している。一実施形態では、対象は、減少した又は検出不能なＬＡＭＰ－２発現を有すると特定されている。一実施形態では、対象は、変異型ＬＡＭＰ－２遺伝子を有すると特定されている。
本明細書に記載の方法を使用した治療に適した対象／患者には、不十分なオートファジーフラックス（例えば、ダノン病、並びに収縮期及び拡張期心不全、心筋梗塞、薬物毒性（例えば、アントラサイクリン、クロロキン、及びそれらの誘導体）、糖尿病、末期腎疾患、及び加齢を含むが、これらに限定されない他の既知の障害）を特徴とする疾患又は障害のリスクがあるが、症状を呈していない個体、並びに現在症状を呈している対象が含まれるが、これらに限定されない。かかる対象は、変異型ＬＡＭＰ－２遺伝子を有するか、又は減少した若しくは検出不能なＬＡＭＰ－２発現レベルを有すると特定された可能性がある。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、小児、青年、又は成人ヒトである。いくつかの実施形態では、患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０歳、又は２０歳以上である。いくつかの実施形態では、患者は、２０～５０歳である。いくつかの実施形態では、患者は、５０～６５歳である。いくつかの実施形態では、患者は、１～５歳、２～６歳、３～７歳、４～８歳、５～９歳、６～１０歳、７～１１歳、８～１２歳、９～１３歳、１０～１４歳、１１～１５歳、１２～１６歳、１３～１７歳、１４～１８歳、１５～１９歳、又は１６～２０歳である。いくつかの実施形態では、患者は、５～６歳、６～７歳、７～８歳、８～９歳、９～１０歳、１０～１１歳、１１～１２歳、１２～１３歳、１３～１４歳、１４～１５歳、１５～１６歳、１６～１７歳、１７～１８歳、１８～１９歳、１９～２０歳、又は２０～２１歳である。特定の実施形態では、患者は、１５～１６歳である。
いくつかの実施形態では、患者は、ヒト男性である。いくつかの実施形態では、患者は、小児、青年、又は成人ヒト男性である。いくつかの実施形態では、患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０歳の男性、又は２０歳以上の男性である。いくつかの実施形態では、患者は、２０～５０歳の男性である。いくつかの実施形態では、患者は、５０～６５歳の男性である。いくつかの実施形態では、患者は、１～５歳、２～６歳、３～７歳、４～８歳、５～９歳、６～１０歳、７～１１歳、８～１２歳、９～１３歳、１０～１４歳、１１～１５歳、１２～１６歳、１３～１７歳、１４～１８歳、１５～１９歳、又は１６～２０歳の男性である。いくつかの実施形態では、患者は、５～６歳、６～７歳、７～８歳、８～９歳、９～１０歳、１０～１１歳、１１～１２歳、１２～１３歳、１３～１４歳、１４～１５歳、１５～１６歳、１６～１７歳、１７～１８歳、１８～１９歳、１９～２０歳、又は２０～２１歳の男性である。特定の実施形態では、患者は、１５～１６歳である。
いくつかの実施形態では、患者は、ヒト女性である。いくつかの実施形態では、患者は、小児、青年、又は成人ヒト女性である。いくつかの実施形態では、患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０歳の女性、又は２０歳以上の女性である。いくつかの実施形態では、患者は、２０～５０歳の女性である。いくつかの実施形態では、患者は、５０～６５歳の女性である。
いくつかの実施形態では、対象は、不十分なオートファジーフラックス（例えば、ダノン病、並びに収縮期及び拡張期心不全、心筋梗塞、薬物毒性、糖尿病、末期腎疾患、及び加齢を含むが、これらに限定されない他の既知のオートファジー障害）を特徴とする疾患又は障害の症状を呈している。これらの症状は、能動的に現れていてもよく、又は（例えば、薬剤によって）抑制若しくは制御されていてもよく、又は寛解期にあってもよい。対象は、例えば、資格を有する医師によってその障害であると診断されていても診断されていなくてもよい。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、又はそのベクターを含む医薬組成物は、全身投与されたときに有効である。例えば、本開示のウイルスベクターは、いくつかの事例では、対象（例えば、非ヒト霊長類などの霊長類又はヒト）に静脈内投与されたときに有効性を示す。いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターは、全身投与（例えば、心臓、筋肉、及び／又は肺に投与）されたときに様々な組織にＬＡＭＰ－２Ｂの発現を誘導することができる。特定の実施形態では、配列番号２と実質的に同一の導入遺伝子又はそれと同一の導入遺伝子を含むＡＡＶ９ベクターの対象への投与により、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現がもたらされる。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ－２Ｂの発現は、対象の心臓の左室、右室、左房、及び右房のうちの１つ以上又は全てにおいて検出可能である。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ－２Ｂの発現は、対象の心臓の左室の部分領域１及び／又は部分領域２において検出可能である。
「検出可能な発現」とは、典型的には、ウイルスベクターで処理されていない対照対象又は組織と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、又はそれ以上の導入遺伝子の発現を指す。いくつかの実施形態では、検出可能な発現は、ベクターなし対照よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍高い発現を意味する。導入遺伝子の発現は、細胞内の野生型又は内因性遺伝子の発現に対する増加として決定することができる（導入遺伝子の発現が内因性遺伝子の発現に影響を及ぼし得る可能性を考慮する）。導入遺伝子の発現は、導入遺伝子のｍＲＮＡ転写物上に存在するが、内因性遺伝子のｍＲＮＡ転写物上には存在しない配列のＲＴ－ＰＣＲ検出によって決定することもできる。例えば、転写物の３′ＵＴＲを使用して、（異なる３′ＵＴＲを有し得る）内因性遺伝子の発現とは無関係の導入遺伝子の発現を決定することができる。導入遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現は、以下の実施例に記載されるように、又は当該技術分野で既知の他の方法に記載されるように、ウェスタンブロット又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価することができる。タンパク質の野生型外因性コピーに対して交差反応性の抗体を使用してもよい。いくつかの事例では、外因性タンパク質に特異的な抗体を特定し、それを使用して、導入遺伝子の発現を決定することができる。当業者であれば、標的細胞又は組織を考慮して適切な検出方法論を設計することができる。いくつかの事例では、発現は、標準曲線を使用して定量的に測定される。標準曲線は、実施例に記載される方法又は当該技術分野で既知の方法によって、精製されたＬＡＭＰ－２タンパク質を使用して生成することができる。あるいは、導入遺伝子の発現は、対応するｍＲＮＡの定量化によって評価することができる。
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」及び「ゲノムコピー」という用語は、互換的に、試料中の一本鎖ＡＡＶゲノムポリヌクレオチドの数を指す。ベクターゲノムコピーは、ゲノムのＷＰＲＥ配列に隣接するプライマーなどの組換えＡＡＶゲノムに特異的なプライマーを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はデジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）を使用して測定することができる。定量化は、使用されるプライマーの標的アンプリコンを有するプラスミドＤＮＡを含む試料などの参照試料を用いて生成された標準曲線に対して行われてもよい。ｄｄＰＣＲ法及びｑＰＣＲ法は、当該技術分野で周知である。前臨床研究の用量単位は、体重１ｋｇあたりのベクターゲノム（ｖｇ）で表される。臨床用量は、１ｋｇあたりのベクターゲノムコピー（ＧＣ）で表される。いずれの単位用語（ＧＣ／ｋｇ及びｖｇ／ｋｇ）も同じ実体を説明するよう意図されており、本開示において互換的に使用される。
いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、５×１０１４ｖｇ／ｋｇ以下、３×１０１４ｖｇ／ｋｇ以下、２×１０１４ｖｇ／ｋｇ以下、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ以下、９×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、８×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、６×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、４×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、２×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下、又は１×１０１３ｖｇ／ｋｇ以下の用量で生じる。
いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０１３ｖｇ／ｋｇ～３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ～４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～６×１０１３ｖｇ／ｋｇ、６×１０１３ｖｇ／ｋｇ～７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ～８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、８×１０１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ～２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２×１０１４ｖｇ／ｋｇ～３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は３×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で生じる。
いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ～３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は２×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で生じる。いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で生じる。いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は９×１０１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で生じる。
いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は１×１０１４ｖｇ／ｋｇ～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で生じる。
いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で生じる。いくつかの実施形態では、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で生じる。
同時投与
安全性及び／又は有効性は、いくつかの事例では、免疫調節剤を含むが、これに限定されない１つ以上の二次薬剤の同時投与によって増加し得る。
いくつかの実施形態では、本方法は、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、又はプレドニゾンを含むが、これらに限定されない、有効量のコルチコステロイドを対象に投与することを含む。ＡＡＶ療法の投与に適切なコルチコステロイドの用量及び投与レジメンは、当該技術分野で既知である。Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．＆Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，１４６－１７９（２０１７）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のタクロリムス、シクロスポリン、ラパマイシン、シロリムス、又はそれらの誘導体を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のタクロリムスを投与する前に、有効量のコルチコステロイドを対象に投与することを更に含む。本明細書に開示されるように、タクロリムスは、いくつかの事例では、対象へのＡＡＶの投与後のコルチコステロイドレベルのより急速な漸減を可能にし得る。タクロリムスは、ＡＡＶ投与の７～２１日前に投与されてもよく、例えば、ＡＡＶ投与の２１日前、１４日前、１０日前、７日前、５日前、２日前、又は１日前、好ましくは１日前に投与されてもよい。タクロリムスの投与は、ＡＡＶの投与後に継続されてもよい。タクロリムスは、ＡＡＶの投与後１２０日間、例えば、ＡＡＶの投与後１日間、５日間、１０日間、２０日間、３０日間、４０日間、５０日間、６０日間、７０日間、８０日間、９０日間、１００日間、１１０日間、又は１２０日間、好ましくは９０日間にわたって投与されてもよい。Ｔａｒｄｉｅｕ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２５（６）：５０６－５１６（２０１４）を参照されたい。
タクロリムスは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ．ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．６ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。タクロリムスは、７００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、９００ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、１１００ｍｇ／ｍ２、１２００ｍｇ／ｍ２、１３００ｍｇ／ｍ２、１４００ｍｇ／ｍ２、１５００ｍｇ／ｍ２、１６００ｍｇ／ｍ２、又は１７００ｍｇ／ｍ２のミコフェノール酸モフェチルと同時に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本方法は、０．２ｍｇ／ｋｇのタクロリムスを１２００ｍｇ／ｍ２のミコフェノール酸モフェチルと同時に対象に投与することを含む。
タクロリムスは、２分割用量で１日１回経口投与されてもよい。タクロリムスは、２ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、３．５ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、４．５ｎｇ／ｍＬ、又は５ｎｇ／ｍＬのトラフ血清レベルを維持するのに有効な量で投与されてもよい。タクロリムスの代替物には、ミコフェノール酸、シクロスポリン、シクロスポリン修飾物、シロリムス、エベロリムス、又はベラタセプトが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のリツキシマブを対象に投与することを含む。本明細書に開示されるように、リツキシマブは、いくつかの事例では、ＡＡＶに対する免疫応答を軽減する及び／又は予防することができる。リツキシマブは、ＡＡＶ投与の７～２１日前に投与されてもよく、例えば、ＡＡＶ投与の２１日前、１４日前、１０日前、７日前、５日前、２日前、又は１日前、好ましくは１日前に投与されてもよい。リツキシマブは、ＡＡＶ投与の７～２１日後に投与されてもよく、例えば、ＡＡＶ投与の２１日後、１４日後、１０日後、７日後、５日後、２日後、又は１日後、好ましくは１日後に投与されてもよい。リツキシマブは、対象に、１、２、３回、又はそれ以上の回数投与されてもよい。Ｃｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．２８（４）：２０８－２１８（２０１７）及びＣｏｒｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．１，１４０３３（２０１４）を参照されたい。
リツキシマブは、３００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、５００ｍｇ／ｍ２、６００ｍｇ／ｍ２、７００ｍｇ／ｍ２、７５０ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、９００ｍｇ／ｍ２、１０００ｍｇ／ｍ２、１１００ｍｇ／ｍ２、又は１２００ｍｇ／ｍ２、好ましくは７５０ｍｇ／ｍ２の用量で投与されてもよい。リチキシマブの代替物には、オビヌツズマブ、キシマ（リツキシマブ－ａｂｂｓ）、又はレナリドミドが挙げられるが、これらに限定されない。
タクロリムスは、リツキシマブの前に投与されてもよい。タクロリムスは、リツキシマブと同時に投与されてもよい。タクロリムスは、リツキシマブの後に投与されてもよい。リツキシマブの投与は、タクロリムスの投与が継続している間、中止されてもよい。
いくつかの実施形態では、リツキシマブは、ＡＡＶ投与の－１４日前及び－７日前に投与され、タクロリムスは、ＡＡＶ投与の－７日前からＡＶＶの投与の３ヶ月後まで投与される。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のエクリズマブ、ラブリズマブ、又は別の補体阻害剤を対象に投与することを含む。補体阻害剤で治療する方法は、当該技術分野で既知である。Ｚｉｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１９）を参照されたい。エクリズマブは、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の治療に承認されている。
いくつかの実施形態では、対象は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、任意選択的に、可逆性血小板減少症及び／又は急性腎障害（ＡＫＩ）をもたらすａＨＵＳなどの補体活性化の続発症のリスクがある。
いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のリツキシマブを対象に投与すること、有効量のタクロリムスを対象に投与すること、及び／又は、有効量のエクリズマブを対象に投与することを更に含む。
当該技術分野で既知の様々なコルチコステロイドが使用されてもよい。いくつかの実施形態では、本方法は、有効量のデキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメサゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、フルドロコルチゾン、又はそれらの組み合わせを対象に投与することを含む。
医薬組成物及び投薬量
別の態様では、本開示は、医薬組成物を提供する。様々な実施形態では、本医薬組成物は、注射することができる製剤に薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体、希釈剤、及び賦形剤）を含む。例示的な賦形剤としては、ポロキサマーが挙げられる。ウイルスベクター（ＡＡＶを含む）の製剤緩衝液は、ベクターの凝集を防止するための塩と、ベクターの粘着性を減少させるための他の賦形剤（例えば、ポロキサマー）とを含む。これらは、具体的には、等張性の滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、若しくは塩化マグネシウムなど、又はかかる塩の混合物）であってもよく、又は場合により、滅菌水若しくは生理食塩水の添加時に注射用溶液の構成を可能にする乾燥組成物、特に、凍結乾燥組成物であってもよい。有利なことに、この製剤は、凍結時（例えば、０℃未満、約－６０℃、又は約－７２℃）の保存及び使用に安定している。
いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、対象への投与に好適な濃度（例えば、２００ｍＭ）及びｐＨ（例えば、ｐＨ７．２±０．１）の緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）を含む。本医薬組成物は、好適な濃度（例えば、０．０１％）のポロキサマーを含んでもよい。本医薬組成物は、凍結製品として治療０部位に提供されてもよい。ＡＡＶの単位用量の最終体積は、患者の体重、例えば、キログラム（ｋｇ）、及び体積、例えば、１ミリリットル（ｍＬ）あたりの、又は本医薬組成物のＡＡＶのベクターゲノム（ｖｇ）コピーの計算された若しくは実験的に決定されたレベルに基づいて全体的又は部分的に決定されてもよい。本医薬組成物は、注射に望ましい濃度又は体積を得るために必要に応じて希釈されてもよい。
いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０１％のポロキサマー１８８、ｐＨ７．２±０．１を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、対象の総体重の１キログラム（ｖｇ）あたりのＡＡＶベクターの約１×１０１２～約５×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１３～約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１３～約３×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１３～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３～２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３～約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、対象の総体重の１キログラム（ｖｇ）あたりのＡＡＶベクターの約１×１０１３～５×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）（ｖｇ／ｋｇ）の用量で全身投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１３～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１３～３×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身的に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満未満、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満の用量で全身投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３～２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身的に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３～約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、対象の総体重の１キログラム（ｖｇ）あたりのＡＡＶベクターの約１×１０１３～５×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）（ｖｇ／ｋｇ）の用量で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１３～５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約５×１０１３～３×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満未満、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０１３ ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満の用量で静脈内投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３～２×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３～約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンの治療有効量は、対象の総体重の１キログラム（ｖｇ）あたりのＡＡＶビリオンの約１×１０１２～約５×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）（ｖｇ／ｋｇ）である。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１×１０１３～約５×１０１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約５×１０１３～約３×１０１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約５×１０１３～約１×１０１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンの治療有効量は、約６．７×１０１３～２×１０１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンは、約６．７×１０１３～約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンの治療有効量は、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、又は約５×１０１４ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、約６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、約１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は約２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶビリオンの治療有効量は、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０１５ｖｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、又は２．０×１０１３ｖｇ／ｋｇである。
定義
「リソソーム関連膜タンパク質２」及び「ＬＡＭＰ－２」という用語は、互換的に、（１）ＬＡＭＰ－２核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２２９４．２（アイソフォームＡ）、ＮＭ＿０１３９９５．２（アイソフォームＢ）、ＮＭ＿００１１２２６０６．１（アイソフォームＣ）を参照されたい）によってコードされるアミノ酸配列に対する、又はＬＡＭＰ－２ポリペプチド（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２２８５．１（アイソフォームＡ）、ＮＰ＿０５４７０１．１（アイソフォームＢ）、ＮＰ＿００１１１６０７８．１（アイソフォームＣ）を参照されたい）のアミノ酸配列に対する、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００個、若しくはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、又は全長にわたって、約９０％超のアミノ酸配列同一性、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、（２）ＬＡＭＰ－２ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリペプチド）のアミノ酸配列、又はＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された抗体、例えば、ポリクローナル抗体、及びその保存的に修飾されたバリアントに結合する、（３）ＬＡＭＰ－２タンパク質をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖、及びその保存的に修飾されたバリアントにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする、（４）ＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードするＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）に対する、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００個、若しくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、又は全長にわたって、約９０％超、好ましくは、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超、若しくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸及びポリペプチド多型バリアント、対立遺伝子、変異体、並びに種間相同体を指す。
「リソソーム関連膜タンパク質２Ｂ」及び「ＬＡＭＰ－２Ｂ」という用語は、互換的に、（１）ＬＡＭＰ－２Ｂ核酸（例えば、ＮＭ＿０１３９９５．２）によってコードされるアミノ酸配列に対する、又はＬＡＭＰ－２Ｂポリペプチド（例えば、ＮＰ＿０５４７０１．１）のアミノ酸配列に対する、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００個、若しくはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、又は全長にわたって、約９０％超のアミノ酸配列同一性、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、（２）ＬＡＭＰ－２Ｂポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２Ｂポリペプチド）のアミノ酸配列、又はＬＡＭＰ－２Ｂ核酸（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列を含む免疫原に対して産生された抗体、例えば、ポリクローナル抗体、及びその保存的に修飾されたバリアントに結合する、（３）ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードする核酸配列に対応するアンチセンス鎖、及びその保存的に修飾されたバリアントにストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする、（４）ＬＡＭＰ－２Ｂ核酸（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド、及び本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ＢポリペプチドをコードするＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド）に対する、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００個、若しくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、又は全長にわたって、約９０％超、好ましくは、約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超、若しくはそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸及びポリペプチド多型バリアント、対立遺伝子、変異体、並びに種間相同体を指す。
タンパク質（例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ）に関して「機能的バリアント」という用語は、タンパク質の１つ以上の機能的特性を保持する、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、又は少なくとも約８０個のアミノ酸が存在するポリペプチド配列、又はポリペプチド配列の断片を指す。例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的バリアントは、（１）ヒト心筋細胞機能の調節（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ１１６（２）５５６－５６５）、（２）ダノン病における代謝機能及び生理学的機能の改善（Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ Ｓ０７３５－１０９７（１９）３１２９５－１）、及び／又は（３）オートファジー（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（２０１６）１２９，２１３５－２１４３）などの１つ以上の機能を保持するＬＡＭＰ－２Ｂ（本明細書に定義されるとおりである）である。
ＬＡＭＰ－２Ｂは、内腔ドメイン（残基２９～３７５）、膜貫通ドメイン（残基３７６～３９９）、及び細胞質ドメイン（残基４００～４１０）を有する。ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１３４７３を参照されたい。ＬＡＭＰ－２Ｂの機能には、様々なストレスに応答し、かつ長い生物学的半減期を有するタンパク質の正常な代謝回転の一環として、タンパク質のリソソーム分解を媒介するプロセスである、シャペロン媒介性オートファジーが含まれる（Ｃｕｅｒｖｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２７３：５０１－５０３（１９９６）、Ｃｕｅｒｖｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１３：４４４１－４４５０（２０００）、Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８：５７４７－５７６３（２００８）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３２７：４８－５６（２０１４）、Ｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｐｅｎ ５：１５１６－１５２９（２０１６））。ＬＡＭＰ－２Ｂは、リソソーム分解のためにＧＡＰＤＨ及びＭＬＬＴ１１を標的とし得る。ＬＡＭＰ－２Ｂは、オートファジー中のオートファゴソームとリソソームの融合に必要とされる場合がある。ＬＡＭＰ２を欠く細胞が正常なレベルのＶＡＭＰ８を発現するが、オートファゴソーム上にＳＴＸ１７を蓄積することができないことが示唆されており、これは、オートファゴソームとリソソームとの間の融合が欠如しているという最も説得力のある説明である。ＬＡＭＰ－２Ｂは、オートファゴソームの内容物の正常な分解に必要とされる場合がある。ＬＡＭＰ－２Ｂは、リソソームタンパク質分解におけるその機能による外因性抗原の効率的なＭＨＣＩＩ媒介性提示に必要とされる場合があり、エンドソーム／リソソーム区画内のプロテアーゼによって生成された抗原性ペプチドは、新生ＭＨＣＩＩサブユニットによって捕捉される（Ｃｒｏｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３１：３１８－３３０（２０１０））。
したがって、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的バリアントには、前述の機能のうちのいずれかを媒介することができるＬＡＭＰ－２Ｂの断片が含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能断片は、ルーメンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的バリアントは、天然ＬＡＭＰ－２Ｂに対する１つ以上のＣ末端又はＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的バリアントは、天然ＬＡＭＰ－２Ｂに対する１つ以上の内部欠失を含む。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連での「同一の」又は「同一性」パーセントという用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は手作業でのアライメント及び目視検査によって測定される、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって最大一致について比較及びアライメントを行った場合、同じであるか、又は同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの特定のパーセンテージを有する（すなわち、参照配列、例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対する、特定の領域にわたって、少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する）、２つ以上の配列又は部分配列を指す。その場合、かかる配列は、「実質的に同一」であると考えられる。この定義は、試験配列の補完も指す。好ましくは、同一性は、参照配列の少なくとも約２５アミノ酸長又はヌクレオチド長の領域、例えば、５０、１００、２００、３００、４００アミノ酸長又はヌクレオチド長の領域、又は全長にわたって存在する。
配列比較の場合、典型的には、１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じて部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は代替パラメータを指定することができる。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。核酸及びタンパク質のＬＡＭＰ－２核酸及びタンパク質に対する配列比較の場合、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム及びデフォルトパラメータが使用される。
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２０～６００、通常では約５０～約２００、より通常では約１００～約１５０からなる群から選択される連続位置数のうちのいずれか１つのセグメントへの参照を含み、ここで、ある配列と同じ連続位置数の参照配列を最適に整列させた後に、これらの２つの配列が比較されてもよい。比較のための配列アライメント法は、当該技術分野で周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｌ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は手作業でのアライメント及び目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって行うことができる。配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントの決定に好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能である。
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという指示は、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第２の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生される抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換のみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指示は、２つの分子又はそれらの相補体がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるという更に別の指示は、同じプライマーを使用して配列を増幅することができることである。
本明細書で使用される場合、「投与」とは、例えば、経腸投与、非経口投与、肺投与、及び局所／経皮投与を含む、局所投与及び全身投与を指す。本明細書に記載の方法に利用される化合物（例えば、１つ以上のＬＡＭＰ－２アイソフォームをコードするポリヌクレオチド）の投与経路には、対象に対する、例えば、経口（ｐｅｒ ｏｓ（Ｐ．Ｏ．））投与、経鼻若しくは吸入投与、坐薬としての投与、局所接触、経皮送達（例えば、経皮パッチを介して）、くも膜下腔内（ＩＴ）投与、静脈内（「ｉｖ」）投与、腹腔内（「ｉｐ」）投与、筋肉内（「ｉｍ」）投与、病巣内投与、又は皮下（「ｓｃ」）投与、あるいは徐放デバイス、例えば、小型浸透圧ポンプの植込み、デポー製剤の投与などが含まれる。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、膣内、直腸、又は経皮）を含む任意の経路によるものとすることができる。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腎内、尿道内、心臓内、冠動脈内、心筋内、皮内、硬膜外、皮下、腹腔内、脳室内、イオン泳動、及び頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
「補正」という用語は、対象のベースラインレベルに対する臨床パラメータの変化であって、そのパラメータを、ダノン病を有しない者において観察されたパラメータレベルに等しい又はほぼ等しいレベルに正規化させる変化を指す。
「改善」という用語は、対象のベースラインレベルに対する臨床パラメータの変化であって、そのパラメータを、治療投与前の対象において観察されたパラメータレベルよりも実質的に高い（又は低い）レベルまで増加（又は減少）させる変化を指す。例えば、改善には、対象の心臓における自己貪食空胞のサイズの縮小又は数の減少が含まれてもよい。
「全身投与」及び「全身投与される」という用語は、化合物又は組成物が循環系を介して医薬作用の標的部位を含む体内の部位に送達されるように、化合物又は組成物を哺乳動物に投与する方法を指す。全身投与には、経口投与、鼻腔内投与、直腸投与、及び非経口投与（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮、及び皮下などの消化管以外）が含まれるが、これらに限定されない。
「同時投与する」又は「同時投与」という用語は、例えば、化合物（例えば、ＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）及び／又はその類似体並びに別の活性剤に関して使用される場合、化合物及び／又は類似体と活性剤が生理学的効果を同時に達成できるように、それらの両方の投与を指す。しかしながら、これらの２つの薬剤は一緒に投与される必要はない。ある特定の実施形態では、１つの薬剤の投与は、他方の投与に先行することができる。同時生理学的効果は、必ずしも循環中に両方の薬剤が同時に存在することを必要としない。しかしながら、ある特定の実施形態では、同時投与により、典型的には、任意の所与の用量についてそれらの最大血清濃度のかなりの割合（例えば、２０％以上、例えば、３０％若しくは４０％以上、例えば、５０％若しくは６０％以上、例えば、７０％若しくは８０％若しくは９０％以上）で両方の薬剤が体内（例えば、血漿中）に同時に存在する結果になる。
「治療有効量」という用語は、オートファジー障害又は欠損を特徴とする疾患（例えば、ダノン病）の最終重症度を軽減するのに十分な量で、所望の結果、例えば、１つ以上のＬＡＭＰ－２アイソフォームの発現の増加をもたらすのに必要な遺伝子療法ベクターの量及び／若しくは投薬量、並びに／又は投薬レジメンを指す。
「有効量」という用語は、所望の結果、例えば、免疫抑制剤の免疫抑制効果をもたらすのに必要な遺伝子療法ベクターの量及び／若しくは投薬量、並びに／又は投薬レジメンを指す。
「投与させる」という語句は、医療専門家（例えば、医師）又は対象の医療を管理する者によって行われる、問題となっている薬剤／化合物の対象への投与を管理及び／又は許可する行為を指す。投与させることには、対象に適切な治療レジメン若しくは予防レジメンの診断及び／若しくは決定、並びに／又は特定の薬剤／化合物の処方を含み得る。かかる処方には、例えば、処方箋書式の草案、医療記録の注釈付けなどが含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「治療する」及び「治療」という用語は、これらの用語が適用される疾患若しくは状態、又はかかる疾患若しくは状態の１つ以上の症状のいずれかの発症を遅延させること、その進行を遅らせる若しくは逆転させること、その重症度を軽減すること、又はそれを緩和する若しくは予防することを指す。「治療する」及び「治療」という用語は、疾患又は状態の１つ以上の症状を予防すること、緩和すること、改善すること、軽減すること、抑制すること、排除すること、及び／又は逆転させることも含む。
「緩和する」という用語は、その病理若しくは疾患の１つ以上の症状の軽減若しくは排除、及び／又はその病理若しくは疾患の１つ以上の症状の発症速度の減少若しくは発症の遅延又はその重症度の軽減、及び／又はその病理若しくは疾患の予防を指す。ある特定の実施形態では、病理又は疾患の１つ以上の症状の軽減又は排除は、例えば、ＬＡＭＰ－２の１つ以上のアイソフォームの発現レベルの測定可能な持続的増加を含み得る。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、方法又は組成物に列挙された活性医薬品の属又は種を指し、更に、単独では列挙された兆候又は目的に対して実質的な活性を有しない他の薬剤を含み得る。
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、互換的にヒト対象を指す。
「遺伝子導入」又は「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法又はシステムを指す。かかる方法により、組み込まれていない導入されたＤＮＡの一過性発現、導入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製及び発現、又は導入された遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みがもたらされ得る。
「ベクター」という用語は、（単独で出現する場合）本明細書において、別の核酸分子を導入又は輸送することができる核酸分子を指すために使用される。導入された核酸は、概して、ベクター核酸分子に連結される、例えば、挿入される。ベクターは、細胞内の自己複製又は逆転写を指示する配列を含んでもよく、又は宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。「ベクター」には、遺伝子療法ベクターが含まれる。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法ベクター」という用語は、遺伝子療法の行う際に使用することができる、例えば、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を対象に送達することができるベクター（ＡＡＶビリオンなど）を指す。遺伝子療法ベクターは、治療的に活性なポリペプチド、例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ、又は対象に導入されたときに置換遺伝子療法に有用な他の遺伝子をコードする核酸分子（「導入遺伝子」）を含み得る。有用なベクターには、ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。「ＡＡＶベクター」及び「ＡＡＶビリオン」という用語は、本明細書において、ＡＡＶカプシドにパッケージングされたベクターゲノムを指すために互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、その発現カセットに組み込まれる治療的に活性なポリペプチド（例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ）をコードするポリヌクレオチド（導入遺伝子）の発現を適切な状況下で駆動することができるＤＮＡセグメントを指す。宿主細胞に導入されると、発現カセットは、とりわけ、導入遺伝子をＲＮＡに転写するように細胞の機構に指示することができ、その後、通常、更にプロセシングされ、最終的に治療的に活性なポリペプチドに翻訳される。発現カセットは、遺伝子療法ベクターに含めることができる。概して、発現カセットという用語は、５′ＩＴＲに対して５′側及び３′ＩＴＲに対して３′側のポリヌクレオチド配列を除外する。
本明細書において参照及び特定される全ての特許、特許刊行物、及び他の刊行物は、参照によりそれらの全体が全ての目的のために個別にかつ明示的に本明細書に組み込まれる。
実施例１：ＬＡＭＰ２Ｂを発現する組換えＡＡＶ９ベクター
ＬＡＭＰ２Ｂを発現する組換えＡＡＶ９ベクターを、３プラスミド、ヘルパーウイルスフリー系により生成した。ｐＡＡＶ－ＬＡＭＰ２Ｂトランスファープラスミド、ｐＡＡＶ－２／９パッケージングプラスミド、及びｐＡｄ－ＨｅｌｐｅｒアデノウイルスヘルパープラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞への一過性トランスフェクションにより、血清型９カプシドタンパク質及びヒトＬＡＭＰ２Ｂ発現カセット（ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ）に隣接するＡＡＶ２ ＩＴＲを含む組換えＡＡＶ粒子を生成した。
ＡＡＶシストランスファープラスミド（ｐＡＡＶ－ＬＡＭＰ２Ｂ）の構造は、図１に示すように、ＡＡＶ２に由来するウイルスＩＴＲ領域に隣接する導入遺伝子発現カセットを含む。発現カセットは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサー（ＣＭＶ ＩＥＥ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、キメラニワトリβ－アクチン、及びウサギグロビンイントロンを含むキメラプロモーターによって駆動されるヒトＬＡＭＰ２Ｂコード配列を含む。発現カセットは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）も含み、ウサギグロビンポリＡシグナル（ＲＧｐＡ）によって終結される。
実施例２：前臨床インビトロ及びインビボ有効性研究
インビトロ研究を、ダノン病（ＤＤ）を有する患者由来のｉＰＳＣ由来心筋細胞に行い、ＬＡＭＰ２Ｂ発現の用量依存的増加及びＤＤにおける心筋細胞の重要な細胞特徴であるミトコンドリア膜電位に対する有益な効果を示した。インビトロ表現型補正の実証後に、ＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法のインビボ研究を、臨床的に意義のあるカロリー制限されたＬＡＭＰ２ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルに行った。
Ｌａｍｐ２ ＫＯマウスに、２ヶ月齢時点で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は１×１０１３、５×１０１３、及び１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量のＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂを静脈内注射し、６週交互絶食（６－ｗｅｅｋｓ ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｆａｓｔｉｎｇ）させた後、処理後３ヶ月時点で評価した。図２及び図３に示すように、ヒトＬＡＭＰ２Ｂの用量依存的増加及びＬＣ３－ＩＩ（オートファジーフラックスのマーカー）の減少が、ＡＡＶ９で処理したＫＯマウスの心臓、肝臓、及び骨格筋を含むＤＤに特に冒されている臓器で観察された。
図４に示すように、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ投与により、処理の３ヶ月後に５×１０１３ｖｇ／ｋｇ及び１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で処理したＬａｍｐ２ ＫＯマウスにおいて、より少ない数の目に見える自己貪食空胞を含む、心臓超微細構造の改善がもたらされた。１×１０１４ｖｇ／ｋｇで投与したＬａｍｐ２ ＫＯマウスコホート由来の心臓超微細構造が有意に改善し、対照ＷＴ動物と類似していた。逆に、ＰＢＳのみを投与したＫＯマウスは、心臓組織内に増加した数の液胞を示した。心機能を調べるために、研究終了前に侵襲的血行動態を行った。図１１に示すように、収縮性を侵襲的左心室内圧（ｄＰ／ｄｔ最大値及びｄＰ／ｄｔ最小値）により評価し、ＷＴ対照と比較して未処理のＰＢＳ対照Ｌａｍｐ２ ＫＯマウスにおいて有意に減少することが分かった。ＷＴマウスの平均ｄＰ／ｄｔ最大値及びｄＰ／ｄｔ最小値は、それぞれ、７０５０ｍｍＨｇ／ｓ及び－５５５０ｍｍＨｇ／ｓであった。ＬＡＭＰ２ ＫＯマウスでは、平均ｄＰ／ｄｔ最大値及びｄＰ／ｄｔ最小値は、ＰＢＳ（ｎ＝７）で処理した群の場合、３６５６ｍｍＨｇ／ｓ及び－３２６５ｍｍＨｇ／ｓであり、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝７）のＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂで処理した群の場合、４１９７ｍｍＨｇ／ｓ及び－３５４２ｍｍＨｇ／ｓであり、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝１２）の場合、５０７３ｍｍＨｇ／ｓ及び－３９０５ｍｍＨｇ／ｓであり、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝１１）の場合、４７２９ｍｍＨｇ／ｓ及び－３７６５ｍｍＨｇ／ｓであった。
図１２に示すように、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂは、成体Ｌａｍｐ２ ＫＯマウスの心臓の超微細構造を有意に改善した。図１３に示すように、心機能の有意な改善は、３ヶ月時点での侵襲的血行動態によって実証され、改善は、試験した最大用量２×１０１４ｖｇ／ｋｇを通して用量依存的であった。この最高用量で、心臓血行動態は野生型表現型と同等であり、それ故に、最大限度の有効性及び恐らく最適な有効量を示唆した。肝酵素の有意な減少は、肝臓異常の改善がＡＡＶ９－ｄｏｓｅ動物でも観察されたことを示唆した。この研究の結果は、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ媒介性遺伝子療法が安全であり、２×１０１４ｖｇ／ｋｇの有効用量で高齢マウスの心臓生理学、オートファジーフラックス、及び肝臓異常を改善することによって確立された疾患表現型を逆転させることに成功したことを示した。
実施例３：前臨床薬理学
臨床病理学、組織病理学、及びＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法に対する免疫応答を含む安全性測定を、Ｌａｍｐ２ ＫＯマウスに行った。血清化学パネルは、ＰＢＳ対照であるマウス又はＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂベクターを投与したマウスのいずれにも有害転帰を示さなかった。ＷＴ動物と比較して血清カリウム（Ｋ＋）レベルの有意な増加が未処理のＰＢＳ対照ＫＯマウスで認められた。ＰＢＳを注射したＬａｍｐ２ ＫＯ対照マウスと比較して、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、及び２×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂで処理したマウスにおいて、これらのＫ＋レベルは有意に減少し、予想範囲に戻った。血清クレアチンレベル及び血中尿素窒素レベルが正常である場合の血清カリウムの上昇は、過剰な筋肉破壊から生じる可能性がある（Ｌｅｈｎｈａｒｄｔ２０１１）。したがって、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ投与による血清カリウムの観察された減少は、ＤＤの重要な特徴であるＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法で処理したマウスにおけるミオパチーの軽減を示す。心臓、肝臓、及び骨格筋組織の組織病理学は、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂで処理した試料に特記すべき変化を示さなかった。ベクターの生体内分布をｑＰＣＲで調べた結果、全身の臓器にわたって有意な分布が確認され、最も高いレベルのベクターゲノム（ｖｇ）が肝臓で認められ、肝臓と比較して心臓及び骨格筋ではｖｇが１０倍低く、脳では１００倍低かった。脾臓及び生殖腺は、最小量のベクターゲノム分布を呈した。ｍＲＮＡ推定による導入遺伝子発現の定量化を、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ及び２×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂを投与したマウスに、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、組織のサブセットで検証した。平均して、心臓が最も高いレベルのヒトＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡを有し、肝臓及び骨格筋におけるレベルが密接に続いた。脳、肺、腎臓、及び生殖腺も、中程度のレベルのヒトＬＡＭＰ２Ｂ ｍＲＮＡを示し、投与後６ヶ月時点で非常に低いレベルが脾臓で検出された。
本明細書に記載の前臨床研究を、グッド・ラボラトリー・プラクティス（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＬＰ）に従って行い、最大３×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量に関連した予想外の死亡率、身体異常、行動異常、形態学的異常、血液学的異常、又は生化学的異常は示されなかった。この研究の結果は、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ媒介性遺伝子療法が、Ｌａｍｐ２ ＫＯマウスにおけるＤＤ表現型において安全性及び持続的な利益を実証したことを示した。この研究は、ＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法のＩＶ（静脈内）投与に対して安全かつ有効なプロファイルを示し、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂの最小限の有効用量が５×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲内であることを示し、ヒトにおけるダノン病の治療に対するＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法の臨床的可能性を示している。
実施例４：前臨床毒性学
加えて、１０２日間の非ＧＬＰ研究を、ＧＬＰマウス毒性研究で試験した最大用量（３×１０１４ｖｇ／ｋｇ）の治療用ベクターで処理した２歳の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）（カニクイザル）に行った。発送前に動物をＡＡＶ９中和抗体についてプレスクリーニングした。処理群及びビヒクル対照群に割り当てた全ての動物が完全な血清動態を示した（１：５、１：２０、１：８０希釈ではウイルスの中和を示さなかった）。２匹のサルを治療用ベクター群（３×１０１４ｖｇ／ｋｇ）に割り当て、２匹のサルをビヒクル対照群に割り当てた。投与（伏在静脈への静脈内注射）後、動物を、ベースライン時点、並びに３、７、１５、２１、３０、４２、５０、６０、９１、及び１０２日目に評価した。予想外の死亡率又は有意な体重の変化はなかった。臨床病理学のために、血液試料を複数の時点で両方のコホートから得た。７日目に軽度の一過性トランスアミナーゼ増加及び７日目に血小板の同時一過性減少（正常範囲内）がＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ注射群で観察され、いずれの病理学的続発症もなかった。試験５０日目のクレアチニンキナーゼ及び乳酸脱水素酵素の軽度の上昇（正常範囲内）も認められ、毒付随して起こる性の臨床徴候はなかった。実施した他の血液学的評価又は生化学的評価のいずれにも、他の有意な処理関連効果は認められなかった。
実施例５：ＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法臨床研究
６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇの初回用量を臨床研究に選択した。用量漸増のアプローチは、６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇ～２．０×１０１４ＧＣ／ｋｇの中間用量の評価を伴う。
ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂを評価する前臨床研究の用量単位を、体重１ｋｇあたりのベクターゲノム（ｖｇ）で表す。本研究で投与したＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂの臨床用量を、ベクターゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇとして表し、この命名法が製造プロセスで定量化された治験物質の最適な説明とみなされるためである。これらの単位用語（ＧＣ／ｋｇ及びｖｇ／ｋｇ）はいずれも、導入遺伝子量に関して同じ実体を説明するよう意図されている。
本研究は、高い既存の抗ＡＡＶ９血清中和抗体価（抗ＡＡＶ９中和抗体価１：４０超）を有する対象を除外する。合成又は胆汁うっ滞性肝機能障害（ＰＴ／ＩＮＲ１．５×ＵＬＮ超、ビリルビン１．５×ＵＬＮ超）の所見を有する患者も除外する（最大１０×ＵＬＮまでのトランスアミナーゼ上昇又は最大２×ＵＬＮまでのＧＧＴ上昇を許容し、これがＤＤの顕著な成分であり、主に筋異常を反映すると考えられるためである）。全身コルチコステロイド療法をＡＡＶ注入の１日前に投与し、投与後の数週間継続し、注入の８～１２週間後に漸減して中止する。
安全性モニタリングには、肝酵素（トランスアミナーゼ、ビリルビン、ＡＬＰ、及び凝固パラメータを含む）の頻繁な検査を含めた。血小板及び包括的凝固プロファイル（ＰＴ／ａＰＴＴ／フィブリノゲン／Ｄ－ダイマーを含む）も評価し、経路成分を補完する。ウイルスカプシド成分及びＬＡＭＰ－２Ｂの両方に対する液性及び細胞性免疫応答の可能性を評価するために、血清及び全血も得る。
目的及び評価項目
主要目的
・ヒトＬＡＭＰ２Ｂ導入遺伝子（治験薬）を含むｒＡＡＶ９カプシドの注入に関連する安全性及び毒性を特徴付けること。
・安全性、毒性、及び予備的有効性に関して治験薬の単回ＩＶ投与の範囲を評価すること。
・心内膜心筋生検を用いて、治験薬の注入により、心筋（及び骨格筋）の形質導入及び遺伝子発現（心筋ＬＡＭＰ２Ｂ ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の評価によって決定される）がもたらされるかを決定し、疾患関連組織学的異常（自己貪食空胞、筋原線維錯綜配列）の補正があるかを決定し、心筋細胞分子及び組織学的補正の程度の予備的特徴付けを可能にすること。
・治験薬注入のおよそ８～１２週後に、医学的パラメータ、Ｘ線パラメータ、及び心肺運動／生理学的パラメータによって決定される、臨床的安定化の予備的評価を可能にすること（後に記載するように、その後の時点で同様の評価を行い、副次的目的を評価する）。
副次的目的
・医学的評価、心臓構造及び機能のＸ線評価、並びに心肺運動／生理学的パラメータによって決定される、治験薬の注入により、心血管病態生理学における持続的（治験薬の注入後６ヶ月～３年にわたる）改善、安定化（又は歴史的対照と比較して低下した悪化率）がもたらされた患者のパーセンテージを決定すること。
・心筋細胞が補正されたＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子及び／又はタンパク質を含み、ＤＤ関連組織学的異常が改善した患者のパーセンテージを決定し、可能な場合、心筋における遺伝的及び組織学的補正の程度を定量化すること。
・液性（抗体）及び細胞性（Ｔリンパ球）抗ＡＡＶ９及び抗ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質活性の評価を含む、治験薬（免疫原性）に対する免疫応答を決定し、特徴付けること。
・その後の心臓移植、ＬＶＡＤ、植込み型除細動器若しくはペースメーカー留置、心臓伝導異常に対する電気生理学的切除術、又は、心不全によるその後の入院を必要とする及び／又はそれを受ける、治験薬を投与した患者のパーセンテージを評価すること。
・全患者、特にその後の評価のために選択された用量で治験薬を投与した患者の１年及び３年の全生存評価を含む、治験薬を投与した患者の全生存を評価すること。
探索的目的
・臨床的安定化又は改善のパラメータを用いて心筋細胞における分子補正の証拠と組織学的補正の証拠との間の潜在的相関を評価し、心筋細胞における分子／組織学的補正と骨格筋及び血液におけるＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子／タンパク質の証拠との間の潜在的相関を評価すること。
・筋肉損傷の血清学的マーカー（ＣＰＫ及びトランスアミナーゼを含む）及びうっ血性心不全の血清学的マーカー（ＢＮＰ、高感度トロポニンを含む）を評価し、これらの血液マーカーの早期（すなわち、８～１２週間）の改善が、ＤＤの臨床的、構造的、及び組織学的修正の潜在的な代用になる可能性があるかを確認すること。
・カンザスシティ心筋症質問票（ＫＣＣＱ－１２）及びＰｅｄｓＱＬを用いて評価される、治験薬を投与した患者における患者報告アウトカム／生活の質（ＰＲＯ／ＱＯＬ）を評価すること。
・神経筋機能及び眼機能の評価を含む、ＤＤの非心血管側面における改善、安定化（又は歴史的対照と比較して低下した悪化率）の有無及び程度を評価する。
評価項目
安全性評価項目
安全性及び忍容性評価項目は以下のとおりである。
・治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）及びＳＡＥの全体的及び強度別の発生率。
・治験責任医師により少なくともＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂと関連する可能性があるとみなされた、全体的及び強度別のＴＥＡＥ及びＳＡＥの発生率。
・心臓移植、植込み型除細動器若しくはペースメーカー留置、心臓伝導異常に対する電気生理学的切除術、又は、心不全によるその後の入院を含む、心臓インターベンションを必要とする患者の割合。
・ＡＡＶ－９又はＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質に反応する抗体又はＴリンパ球によって証明される、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂに対する免疫応答の特徴付け。
・肝トランスアミナーゼ（ＡＳＴ及びＡＬＴ）、ＧＧＴ、ビリルビン、及びＡＬＰのベースラインからの変化に基づく、肝毒性の所見。
・血小板数、プロトロンビン時間（ＰＴ、又は国際標準化比（ＩＮＲ））、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、フィブリノゲン、Ｄ－ダイマー、トロンビン－アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）、及び補体成分（補体３（Ｃ３）、補体４（Ｃ４）、及び血清膜侵襲複合体（ｓＣ５ｂ－９）のベースラインからの変化に基づく、凝固障害の所見。
・以下の項目のベースラインからの変化：
－バイタルサイン測定値。
－安全性臨床検査結果。
－身体検査所見。
有効性評価項目
有効性評価項目には、医学的評価、心臓構造及び機能のＸ線評価、並びに心肺運動／生理学的パラメータによって決定される、心血管病態生理学における臨床的改善の評価、安定化（又は歴史的対照と比較して低下した悪化率）の評価が含まれる。有効性評価項目の予備的評価は、最初の安全性に焦点を当てたフォローアップ期間中（治験薬投与後の最初の８～１２週間）に、かつより持続的なフォローアップ期間中（６ヶ月～３年）に行われる。
研究デザイン
これは、ＤＤを有する患者における非無作為化、非盲検、第Ｉ相試験である。
この第Ｉ相試験中、およそ１１～２３名の患者に治験薬（ＩＰ）の単回ＩＶ投与を行い、患者のコホートに以下に詳述するガイドラインに従って順次より高い用量レベルでＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂの投与を行う。ＩＰを投与していない治験実施施設は本治験に参加してもよい。これらの治験実施施設は、ＩＰ投与後に初期スクリーニング及び来院を行う。ＩＰ投与及びその直後の治験来院を、ＩＰ投与を行う治験実施施設で行う。これは、患者及び彼らの家族が広範囲にわたって移動する負担を軽減することを目的とする。
６つの異なるコホートにおいて、３つの用量レベルを調査する予定である。小児集団（８～１４歳）における所与の用量を評価するコホートの投与は、同等用量の成人コホート内の患者の３３％未満が用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験したと決定された場合にのみ実行可能である。成人患者又は小児患者により高い用量を投与するコホートの投与は、以前の低用量コホート内の患者の３３％未満がＤＬＴを経験したと決定された場合にのみ実行可能である。ＤＬＴ評価を評価することができるように、患者は、意図される用量のＩＰが投与され、ＩＰ注入後８週間にわたってフォローアップ可能な状態のままでなければならない（注入後最初の８週間の間に治験薬に関連するとみなされる致死的ＡＥを有する患者を除く）。
小児患者（８～１４歳）の所与の用量レベルでの投与は、高齢（成人及び１５～１７歳）コホートにおける用量レベルの安全性の決定を待っている間にのみ開始する。図８は、ＤＬＴが特定されていないシナリオによる、コホートにおける計画登録の全順序を示す。図９は、任意の所与のコホート内の登録順序を示す。コホートの拡大、後続コホートの開放（治験薬用量の増加又は変更を含む）、及びその後の臨床開発で評価される用量の推奨に関する決定は、先行コホートで特定された安全性プロファイル及び直接的な利益の可能性に基づいて、ＩＤＳＭＣによって行われる。ＩＤＳＭＣによる治験薬安全性の追加の定期的にスケジュールされている審査は、各試験コホートの患者について、最初の８週間のＤＬＴ評価期間後に行う。
治験薬
治験薬（ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ）は、図１に示すように、かつ実施例１に記載するように、ヒトＬＡＭＰ２Ｂ導入遺伝子と、ＩＴＲエレメント、ＣＭＶ ＩＥＥ、ＣＢＡプロモーター、ＣＢＡ、及びウサギグロビンイントロンを含むＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、並びにＲＧｐＡとを含むＡＡＶ９カプシドからなる遺伝子療法産物である。
剤形
ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂの組成は、注入に好適な緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１％（ｗ／ｖ）スクロース、０．０１％ポロキサマー１８８、ｐＨ７．２±０．１）中で製剤化された有効成分（［３．０～６．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ］の濃度であり、かつ標的細胞を形質導入して治療用タンパク質ＬＡＭＰ２Ｂを発現することができる組換えＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂウイルス粒子）からなる。ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂは、凍結製品として臨床現場に提供され、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂの用量の最終体積は、患者の体重キログラム（ｋｇ）及び１ミリリットル（ｍＬ）あたりのＡＡＶ９の計算されたベクターゲノム（ｖｇ）コピーに基づく。
調査される用量
この第Ｉ相試験中、１１～２３名の患者に治験薬の単回ＩＶ投与を行い、以下のガイドラインに従う用量レベルで成人患者及び小児患者の最大３つの特定のコホートにＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂの投与を行う。小児集団（８～１４歳）における所与の用量を評価するコホートの始動は、同等用量の成人コホート内の患者の３３％未満が用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験したと決定された場合にのみ実行可能である。３つのＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ用量レベルを、以下のように、用量漸増設計に従って調査する。
・コホート１：成人及び１５～１７歳：６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇ（ｎ＝３）＊
・コホート２：成人及び１５～１７歳：１．１×１０１４ＧＣ／ｋｇ（ｎ＝２～４）
・コホート３：成人及び１５～１７歳：２．０×１０１４ＧＣ／ｋｇ（ｎ＝２～４）
・コホート１Ａ：小児８～１４歳：６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇ（ｎ＝２～４）
・コホート２Ａ：小児８～１４歳：１．１×１０１４ＧＣ／ｋｇ（ｎ＝２～４）
・コホート３Ａ：小児８～１４歳：２．０×１０１４ＧＣ／ｋｇ（ｎ＝２～４）
・コホート１は、以前のプロトコルバージョンに従って３名の患者を登録した。
所定の用量レベルでの小児患者（８～１４歳）におけるＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂの評価は、高齢（成人及び１５～１７歳であり、一般的に同意書を提出する能力を有する者）集団における用量レベルの安全性の決定を待っている間にのみ開始する。ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂを総体重に基づく用量で投与する。患者が肥満（ボディマス指数（ＢＭＩ）８５％超）である場合、疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、ＣＤＣ）の成長チャートに従って、ＩＰを、以下のヒューム式を使用して除脂肪体重（ＬＢＭ）に基づく用量で投与してもよい。ＬＢＭ＝（０．３２８１０×Ｗ）＋（０．３３９２９×Ｈ）－２９．５３３６
この試験は、既存の抗ＡＡＶ９血清中和抗体価（１：４０超）を有する患者を除外した。患者に、リツキシマブ、タクロリムス、及びコルチコステロイドとともに抗ＡＡＶ免疫原性反応に対する予防薬を投与した。リツクマブをＩＰ注入前に投与した。タクロリムスを３ヶ月間投与し、ＩＰ投与前に開始した。コルチコステロイドは、治療用ベクター投与前日に開始し、その後、治療後８週目まで毎日投与し、その後、中止前に４週間にわたって漸減した。免疫抑制レジメンの一環としてタクロリムスとリツキシマブを組み込むことにより、全体的なコルチコステロイド投与の減少が可能になる。
コホート１の臨床安全性プロファイル
１５歳以上の３名の患者のコホート（コホート１）に、プロトコルに従ってコルチコステロイドを併用して６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量でＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法を行った。被験者特性を表１に示す。第２の患者及び第３の患者にタクロリムスも投与した。治療レジメン及びＬＡＭＰ２Ｂ相対発現を表２に示す。ＬＡＭＰ２Ｂに対して有意な抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答は認められなかった。
患者は、ＩＰ投与の数日後にいくつかの全身症状（嘔気、嘔吐、腹痛、及び微熱など）を呈した。予想どおり、患者は、ＩＰ投与後に免疫応答を発症した。この免疫応答は、血球数の減少（血小板、白血球）、トランスアミナーゼの上昇、骨格筋及び心臓関連酵素及びペプチドレベルの上昇と関連していた。治療のおよそ１～２週間後に生じた血小板数の減少は、対応するＤ－ダイマーの増加並びにＣ３及びＣ４（補体部分）の減少と関連していた。他のＡＡＶ遺伝子療法プログラムでは血小板数の減少が観察されており、ＡＡＶ９カプシドに対する急性補体媒介性免疫反応と一致している。これまでＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法で治療した患者にコルチコステロイド投与を続け、エクリズマブで治療しなかった。血小板、Ｄ－ダイマー、及びＣ３／Ｃ４レベルの観察された変化は、数日後に改善した。
アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の増加は、他のＡＡＶ遺伝子療法プログラムで実証されている。観察されたＡＳＴ／ＡＬＴの増加は、正常範囲を超えるビリルビンの増加及び肝胆道疾患の臨床徴候／症状と関連しなかった。ＧＧＴ（ＡＳＴ／ＡＬＴとは異なり、骨格筋の損傷によって影響されない肝酵素）の上昇はより軽度であり、ベースラインの５倍超のレベルを超えなかった。ＥｌｉＳｐｏｔアッセイは、コホート１における最初の３名の患者のＡＡＶ９カプシド及びＬＡＭＰ２Ｂ導入遺伝子の両方に対して陰性であった。ベースラインからのＧＧＴの増加がベースラインからのＡＳＴの増加及びＡＬＴの増加よりも相対的に低いため、これらのＡＳＴの増加及びＡＬＴの増加は主に骨格筋に由来する。これは、関連するＣＰＫの上昇にも見られる。コホート１における３名の患者のうちの２名が、ステロイド誘発性ミオパチーと一致する骨格筋の筋力低下を発症した。コルチコステロイドを漸減して中止した際に、骨格筋力の筋力低下は回復した。投与後６ヶ月、９ヶ月、及び１２ヶ月時点で、患者は自宅で安定している。
（表１）
Figure 2023552443000027
（表２）
Figure 2023552443000028
コホート１の遺伝子発現及び有効性評価項目
１５歳以上の３名の患者のコホート（コホート１）に、プロトコルに従ってコルチコステロイドを併用して６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇの用量でＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法を行った。ＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法で治療した後、図５に示すように、ベクターＤＮＡコピー数を分析した。表２に示すように、免疫抑制レジメンへのコンプライアンスが制限された第１の患者を含む、３名全ての患者が、ウェスタンブロット及び免疫組織化学による心臓ＬＡＭＰ２Ｂ発現の証拠を示した。免疫抑制レジメンに良好なコンプライアンスを示した患者１００２及び患者１００５は、高レベルの心臓ＬＡＭＰ２Ｂ発現とともに、臨床バイオマーカーの改善を示した。６．７×１０１３ｇｃ／ｋｇの全身用量で治療した患者の心臓生検では、ＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子発現が、１名の患者において、９ヶ月及び１２ヶ月時点で免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定された正常と比較して細胞の６８～９２％に存在し、かつウェスタンブロット評価によって測定された正常なＬＡＭＰ２Ｂタンパク質発現の最大６１％で存在することが示された。図６に示すように、患者１００２は、ＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法で治療した後にＬＡＭＰ２の頑強な心臓発現を示した。患者１００２及び患者１００５は、後の時点でＩＨＣ染色のパーセンテージ及びレベルの一貫した増加を示した。
図７に示すように、３名の患者のうちの２名が、心臓機能の改善と一致する主要な臨床バイオマーカーの改善を示した。心不全の重要なマーカーである脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）は、患者１００２及び患者１００５における５０％超を含む、３名全ての患者で改善し（すなわち、減少し）（図７Ｂ及び図７Ｃ）、免疫抑制レジメンコンプライアンスが確認された。クレアチンキナーゼ心筋バンド（ＣＰＫ－ＭＢ）は、患者１００２及び患者１００５で改善したか、又は安定化したかのいずれかであった。注目すべきことに、電子顕微鏡で評価した際に、ダノン病理の特徴である自己貪食空胞に目に見える改善が確認された。表３に示すように、９ヶ月及び１２ヶ月時点で免疫抑制レジメンのコンプライアンス及びフォローアップが確認された患者１００２及び患者１００５は、侵襲的血行動態によって測定された心拍出量の改善を示した。ダノン病を有する患者は独力では改善しないため、本試験において３名全ての患者で観察された利益は臨床的に意義があり、このさもなければ壊滅的な疾患に対する変革的な遺伝子療法アプローチを提供する。
（表３）
Figure 2023552443000029
用量制限毒性の定義
用量制限毒性（ＤＬＴ）を、以下のように、治験薬投与後８週間以内に生じたＡＥの任意の発生として定義する：
・Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ＡＥｓ（ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ）、第５．０版、グレード３以上の注入関連反応。
・支持療法にもかかわらず、肝臓損傷に関連して２週間超持続する、グレード４のトランスアミナーゼ上昇。
・支持レジメンでは改善も回復もしない、グレード３のトランスアミナーゼ上昇。
・７２時間以内にグレード３未満に回復するグレード３の嘔気／嘔吐、下痢、便秘、発熱、疲労、若しくは発疹、又は２週間以内にグレード３未満に回復する臨床症状に関連しないグレード３の臨床所見異常を除く、他のグレード３以上のＡＥ。
ＤＬＴを、治験責任医師に帰属する因果関係とは無関係に決定する。治験薬に関連しない可能性のある病因（例えば、自動車事故に続発するグレード３の疼痛）がある場合、事象がＤＬＴを表さないという決定を下してもよいが、ＩＤＳＭＣによる評価を必要とする。各患者のベースライン値は、ＩＰ投与前の６ヶ月以内に得られた利用可能な臨床データに基づく。
用量漸増手順
コホート内の後続の患者がＩＰを受け得る前に、最初の患者を少なくとも８週間フォローアップしなければならないように、コホート内の登録をずらす。リツキシマブ及びタクロリムスの追加により、ＩＰ投与後の免疫応答が軽減されることが期待される。免疫応答の抑制が実証された後、コホート内の後続の患者間の８週間の期間は、ＩＤＳＭＣの同意により減少されてもよい。各コホートは、少なくとも２名の患者からなる。コホートの最初の２名の患者のうちの１名がＤＬＴを経験した場合、追加の２名の患者をそのコホートに登録する。後続（高用量又は小児）コホートの始動を開始するために、先行コホートの全ての患者をＩＰ注入後少なくとも８週間フォローアップしたはずであり、ＤＬＴの回復又は安定化の証拠が存在していた。所与の用量レベルの小児患者（８～１４歳）は、コホート１、コホート２、及びコホート３（成人及び１５～１７歳）コホートにおける用量レベルの安全性の決定を待っている間にのみ開始する。
コホート１の最初の２名又は３名の患者において、６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇ（低用量）の投与により、許容可能な安全性で治療効果以下のＬＡＭＰ－２Ｂ発現がもたらされると決定された場合、コホート２を１．１×１０１４ＧＣ／ｋｇの中間用量で始動する。６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇが治療量以下とみなされる場合、６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇ用量のコホート１Ａ（小児８～１４歳）を始動しない。１．１×１０１４ＧＣ／ｋｇの中間用量のコホート２（成人及び１５～１７歳）を完了した後であり、かつＩＤＳＭＣによる安全性の審査を待っている間にのみ、１．１×１０１４ＧＣ／ｋｇの中間用量のコホート２Ａ（小児８～１４歳）の登録を開始する。図８を参照されたい。
治験薬の投与
患者に、ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子療法薬をＩＶ注入により０日目に投与し、ＩＰが単回投与として患者に注入されることを意図する。患者に、心血管障害用の治験薬の経験のある施設で、入院（ｉｎｐａｔｉｅｎｔ）（入院（ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ））状況下で治験薬を投与する。患者は４８～７２時間入院し、治験薬注入後最長１４日間入院してもよく、その後、治療を担当する治験責任医師の裁量により退院してもよい。毎日の評価を７日目まで続け、治験責任医師の裁量により延長されてもよい。
治療前薬剤及び併用療法
抗ＡＡＶ免疫原性反応に対する予防薬を、治験薬の注入前及び注入後に投与する。コルチコステロイドに加えて、リツキシマブ及びタクロリムスを投与して、ＩＰに対する免疫応答を抑制する。
治療前薬剤
リツキシマブ注入前の前投薬：
・アセトアミノフェン－１５ｍｇ／ｋｇ ＰＯ（最大１ｇ）
・ジフェンヒドラミン－１２．５～５０ｍｇ ＰＯ、又は製品添付文書に従う
・リツキシマブ：患者に、ＩＰ注入前の－１４日目及び－７日目に７５０ｍｇ／ｍ２の用量でリツキシマブを投与する。
・コルチコステロイド：患者に、治験薬注入の前日（－１日目）に１ｍｇ／ｋｇ体重の用量でプレドニゾン（経口又はＩＶ）を投与し始め、その後、治療後８週間目まで毎日投与し、その後、４週間にわたって漸減して３ヶ月目までに中止し、増強された免疫抑制療法（すなわち、リツキシマブ、タクロリムス）を予防薬として投与する場合、治験依頼者の医療モニターを用いて、治験責任医師の裁量により、コルチコステロイドの漸減を早い段階で（ＩＰ投与後最初の４週間以内を含む）開始してもよい。
－プレドニゾンにより許容できないＡＥがもたらされるか、又はプレドニゾンが利用可能ではない場合、代わりにメチルプレドニゾロン又はデキサメタゾンを等価用量で用いてもよい（メチルプレドニゾロンの場合０．８ｍｇ／ｋｇ、デキサメタゾンの場合０．１５ｍｇ／ｋｇ）。
－コルチコステロイドの漸減は、ベースラインを超える肝酵素（ビリルビン又はトランスアミナーゼ）の増加又は治験薬に起因する他のＡＥの場合、４週間よりも長い期間にわたって延長されてもよい。
－コルチコステロイドの漸減は、治験依頼者の医療モニターを用いて、治験責任医師の裁量により、上記のように、耐えられないコルチコステロイド関連ＡＥの場合又は増強された予防的免疫抑制の場合、８週目よりも前に開始してもよい。
－コルチコステロイド合併症を予防するために同時投与する薬剤を治験実施施設の基準に従って投与してもよく、ニューモシスティスジロベシ肺炎（ＰＣＰ）、胃腸潰瘍、及び便秘に対する予防薬を含むべきである。治験実施施設のガイドラインが存在しない場合、これらには、週３回のアトバコン又はトリメトプリム／スルファメトキサゾール、Ｈ２－アンタゴニスト（すなわち、ラニチジン）又はプロトンポンプ阻害剤（すなわち、オメプラゾール）のいずれか、及び下剤の有無にかかわらず便軟化剤（すなわち、ドクサート）が含まれるが、これらに限定されない。
・タクロリムス：患者に、２分割用量でタクロリムスを１日１回経口投与する。投薬量を、タクロリムストラフ血清レベルに基づいて必要に応じて調整して２～５ｎｇ／ｍＬのレベルを維持し、投与を－７日目に開始し、３ヶ月まで続ける。タクロリムスを治験責任医師の裁量により中止してもよい。
・コルチコステロイド投与過程中の支持薬：治験実施施設の慣行に従って、患者に、ニューモシスティスジロベシ肺炎（ＰＪＰ／ＰＣＰ）予防薬、胃腸潰瘍、及び便秘の予防薬を投与する。
・追加の治療前薬：治験薬の注入前には必要ではないが、ＡＡＶ治験薬の注入についての治験実施施設のガイドラインにより必要とされる場合には考慮してもよく、かかる薬剤には、アセトアミノフェン（パラセタモール）及び／又はヒスタミン作動性Ｈ１又はＨ２アンタゴニストが含まれてもよい。
併用（支持療法）薬：
追加の支持療法を、治験責任医師の裁量により、ＩＰ投与前又は投与後に投与して、有害作用を予防又は治療することができる。これらには、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
・コルチコステロイド
・補体活性化の場合、エクリズマブ。エクリズマブの投与前に、患者は、年齢及び健康状態に応じて疾患管理センターが適宜推奨する髄膜炎菌ワクチンを受けていなければならない。髄膜炎菌ワクチンは、治験薬の投与前に、治験実施施設で投与されてもよい。
・凝固異常の場合、血小板又は血漿産物の輸血
・制吐薬（オンダンセトロンなど）
・好中球減少症の場合、成長因子（Ｇ－ＣＳＦ［Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）］など）
・注入関連反応の場合、鎮痛剤及び抗炎症剤
患者の組み入れ基準
患者は、治験参加の資格を得るために、以下の基準を全て満たさなければならない（かつ除外基準のいずれも満たしてはならない）。
１．確定されたＬＡＭＰ２変異を有するＤＤ診断。
２．ＥＣＧ、心エコー図、ガドリニウム増強心臓ＭＲＩ、又は電気生理検査において少なくとも１つの異常所見によって実証された心臓障害。
３．コホート１、２、及び３の場合、１５歳以上、コホート１Ａ、２Ａ、及び３Ａの場合、８～１４歳。
４．男性。
５．ＮＹＨＡクラスＩＩ又はＩＩＩ。ＮＹＨＡクラスＩの患者は、６ＭＷＴ中に４５０メートル以上歩くことができない場合、適格である。
６．以下によって定義される適切な血液学的機能：
ａ．ヘモグロビン１０ｇ／ｄＬ以上（６．２ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ第５．０版によるグレード１の貧血）。
ｂ．絶対好中球数１，５００／ｍｍ３以上（１．５×１０９／Ｌ、グレード１以下の好中球減少症）。
ｃ．血小板数７５，０００／ｍｍ３以上（７５×１０９／Ｌ、グレード１以下の血小板減少症）。
７．以下によって定義される肝機能：
ａ．ＡＳＴ及びＡＬＴ１０．０×ＵＬＮ以下、又はＧＧＴ２×ＵＬＮ以下（ＤＤにおけるトランスアミナーゼ上昇は、広範に筋肉損傷に起因すると考えられており、それ故に、これらのトランスアミナーゼに対する比較的高い上限値、及びＧＧＴレベルの考慮、並びにビリルビン及びＰＴ／ＩＮＲの追加の肝適格性マーカーの存在）。
ｂ．血清ビリルビン１．５×ＵＬＮ以下（すなわち、グレードのビリルビン増加）。
ｃ．ＰＴ／ＩＮＲ１．５×ＵＬＮ以下（抗凝固剤の不在下）。
ｄ．肝超音波検査における肝硬変の不在。
８．以下の腎機能：クレアチニン１．５×ＵＬＮ以下（クレアチニンが１．５ＵＬＮ超である場合、修正版シュワルツ式（１８歳未満の患者）（Ｓｃｈｗａｒｔｚ２００９）である、腎疾患における食事療法の修正（ＭＤＲＤ）式（Ｓｔｅｖｅｎｓ２００６）によって計算される、５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２以上のクレアチニンクリアランス、又は２４時間採尿が必要である）。
９．インフォームドコンセント（成人患者及び小児患者の親／法的後見人の場合）及び同意書（１５～１７歳の患者の場合）を提出する能力。
１０．治験療法及びフォローアップ評価を含む治験手順を順守する能力。
１１．６ＭＷＴ中に補助なしで１５０メートル超歩くことができる。
１２．患者は、年齢及び健康状態に応じて疾患管理センターが適宜推奨する髄膜炎菌ワクチンを受けている。
患者の除外基準
以下の基準のうちのいずれかを満たす患者を治験参加から除外する。
１．登録前３０日以内の陽性変力薬、血管拡張薬、又は利尿薬のＩＶ療法（すなわち、患者は経口医療療法に安定していなければならない）。
２．心臓移植歴、又は他の臓器（肺、肝臓など）の移植歴。
３．登録前３０日以内の心臓手術、経皮的心臓インターベンション、又は弁形成術。
４．ＬＶＡＤの存在又は必要性。
５．登録前９０日以内の心筋梗塞、不安定性狭窄、脳卒中、又はＴＩＡ。
６．心エコー図上での有意な（中等度よりも高い）弁狭窄又は逆流。
７．機械的換気を必要とする。
８．抗ＡＡＶ９中和抗体価１：４０超。
９．ＣＨＦ又は心筋症の治療用の治験薬の使用を伴う任意の他の臨床試験への同時登録。
１０．活動性Ｂ型又はＣ型肝炎感染（陽性ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、又は検出可能なＨＢＶ若しくはＨＣＶウイルス量を有する患者を含む）。十分に回復したＨＢＶ又はＨＣＶの既往歴を有する患者は適格である。
１１．実証されたＨＩＶ感染、活動性ウイルス性若しくは他の肝炎、コントロール不良の高血圧若しくは糖尿病、コントロール不良の心不整脈、又はコントロール不良のウイルス性、細菌性、若しくは真菌性感染症を含む、重大な医学的状態。
１２．治験責任医師の意見により、患者が治験参加に適さない状態にするか、又は治験参加の許容されるリスクよりも高い状態にする、あらゆる随伴性医学的又は精神学的状態。
１３．非黒色腫皮膚がん又は上皮組織に侵入していない他のがんを含まない、活動性血液学的又は固形臓器悪性腫瘍。過去３年間に活動性悪性腫瘍の所見がない場合、以前に固形臓器悪性腫瘍を切除された患者又は根本的に血液悪性腫瘍を治療された患者が適格である場合がある。
１４．タクロリムス又はＨＣ－６０（ポリオキシル６０水素化ヒマシ油）に対する過敏症を含む、タクロリムスの使用の禁忌。
試験期間
患者を０日目の治験薬投与前のおよそ約６０日以内にスクリーニングし、スクリーニング評価を行う。全ての患者を、このプロトコルの援助下で、治験薬投与後３６ヶ月間フォローアップする予定である。全生存を評価し、フォローアップの他の構成要素を中止することを選択した患者（健康状態が禁忌とされるほどに重度に悪化していない限り、強く阻止される）、かかる患者には、全体的な健康状態及び生存の評価のために治験職員と連絡を取り続ける選択肢が提供される。フォローアップ期間の終了後、患者は、長期フォローアップ（ＬＴＦＵ）試験に入り、ＩＰ投与後更に２～５年間にわたるフォローアップを可能にする。
長期フォローアップ
第Ｉ相安全性評価項目評価（注入後の最初の８～１２週間）及びその後のフォローアップ（注入後の最初の３年間）後、安全性及び毒性（すなわち、ＡＥ）、全生存、心臓移植の必要性を含む全体的な健康状態、並びに他の有害な健康転帰についての継続的なフォローアップを、更に２～５年間（合計５～８年間、本試験に規定された３年間のフォローアップを含む）定期的に行う。長期フォローアップを５年間計画しているが、最初の２年間の間に治験薬に起因する重篤なＡＥが特定されない場合、再評価する。
本試験中に重篤な治験薬副作用が特定されないと決定した場合、長期フォローアップを、治験薬に関連するＡＥの程度、重症度、及び回復に応じて、更に２年間（最長５年間）計画する。
イベントスケジュール及び治験手順
イベントスケジュール
治験薬を０日目にＩＶ注入により投与する。治験薬注入後、患者は、治験責任医師の臨床的判断により、注入後少なくとも４８～７２時間及び最長１４日間入院（ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ）又は入院（ｉｎ－ｐａｔｉｅｎｔ）し続ける。ＩＰ注入後、患者は、図１０Ａ～１０Ｄに概説する頻度で治験来院に出席しなければならない。評価を治験薬注入後７日間にわたって毎日行う。毎日の評価を７日目以降も継続してもよい。
フォローアップ来院は、治験薬の注入の数日後、数週間後、数ヶ月後、数年後に行われる、一連の臨床評価、臨床検査室評価、細胞及び遺伝子評価、心臓撮像評価、並びに心臓生理学的評価を伴う。心内膜心筋生検（右室の中央静脈アクセスカテーテル挿入により行われる）及び骨格筋生検も、治験薬注入前に、かつ治験薬注入後の選択された時点で必要である。
心筋細胞における証拠ＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子及びタンパク質に関するフォローアップ（及び自己貪食空胞の定量化を含むＤＤ組織学の組織学的評価）を、心内膜心筋生検により、注入後８週目、並びに６ヶ月目、１２ヶ月目、及び３６ヶ月目に行う。以下に詳述するように、骨格筋生検、ＬＡＭＰ２Ｂ血液レベル（血漿（ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質）及び単核細胞（ＬＡＭＰ２Ｂ ＤＮＡ）、並びに心筋症及びＣＨＦの他の血清学的パラメータ及びＸ線パラメータの評価を含む、追加の低侵襲評価を、心筋における分子的及び組織学的改善の潜在的な代理マーカーを特定する探索的意図と併せて評価する。詳細なイベントスケジュールを図１０Ａ～図１０Ｄに提示し、脚注は以下のとおりである。
１．スクリーニング来院評価を６０日間にわたって行う。登録前に標準治療の一環として行った評価をスクリーニング評価として本試験に使用してもよく、（治験依頼者と協議した上で治験責任医師の判断に基づいて）評価を再び行う必要はない。
２．患者がスクリーニング来院を完了し、かつ全ての組み入れ基準及び除外基準を満たした後に、ベースライン来院評価を行ってもよい。全ての評価を－１日目及び治験薬の投与前に完了しなければならない。ベースライン来院評価をリツキシマブ及びタクロリムスでの治療の開始前に行う必要はない。
３．スクリーニング来院中、包括的既往歴には、関連する心血管系既往歴及び他の潜在的な疾患関連既往歴、例えば、入院及び心臓インターベンションが含まれ、疾患の家族歴も記録される。
４．スクリーニング来院中及び－１日目の併用薬及び処置には、過去３０日間の薬剤及び処置が含まれるものとする。フォローアップ来院中、これには、最新の事前評価後のあらゆる薬剤及び処置が含まれるべきである。
５．身長を、スクリーニング来院時に１回測定し、その後は年１回測定する。
６．生活の質／患者報告アウトカム質問票には、ＫＣＣＱ－１２及びＰｅｄｓＱＬが含まれる。
７．１日目から７日目までの毎日の臨床検査評価。８．臨床検査評価を最大週３回行う。
９．血清膜侵襲複合体（ｓＣ５ｂ－９）は、治験薬投与後のプロトコルで規定された時点で必要である。この検査を、患者の臨床状態に応じて、かつ治験責任医師の裁量により、追加の時点で、又はより頻繁に行ってもよい。
１０．スクリーニング来院中のウイルス血清学には、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶウイルス量、並びにＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、及びＨＢｓＡｂを含む包括的ＨＢＶ抗原／抗体パネルが含まれるべきである。
１１．心臓血清学には、ＢＮＰ、ＣＫ－ＭＢ、及びトロポニン－Ｉレベルを含むＣＨＦの潜在的マーカーが含まれる。
１２．治験薬（ＡＡＶ９及びＬＡＭＰ－２Ｂ）に対する免疫応答には、血清（抗薬物抗体（ＡＤＡ）、ＩｇＧ、ＩｇＭ）及び末梢血Ｔリンパ球（ＥＬＩＳｐｏｔ）における評価が含まれる。
１３．全血を採取し、血清、血漿、及びＰＢＭＣ（スクリーニング評価の場合のみ）に処理し、血清及び血液細胞におけるＬＡＭＰ２レベルの評価を含む、潜在的な探索的アッセイのために保管する。治験ＩＣＦは、プロトコルに規定されていない潜在的な追加の将来の研究のために保管した試料が利用されてもよいという同意を提出する又は保留する機会を患者に提供する。
１４．スクリーニング用の唾液、尿、便、及び血液（血漿）試料を治験薬の投与後に採取して、ベクター粒子の脱落を評価する。各体液／物質の評価を、所与の体液／物質について２つの陰性評価が得られるまで（又はベクターレベルが低レベル又は無視できるレベルで水平状態に達したときに）指示どおりに続け、その時点で、その後の評価は必要ない。
１５．ＬＡＭＰ２変異を確認及び定義するための遺伝子シーケンシングを、唾液又は血液（単核細胞）のいずれかによる不整脈及び心筋症パネルを用いて行う。ＬＡＭＰ２遺伝子型が病原性と定義されない場合、ＬＡＭＰ２欠損症を確認するために、ＬＡＭＰ２のタンパク質評価を単離された末梢血単核細胞又は生検組織を用いて行う。
１６．植込み型ペースメーカー、除細動器、他の留置デバイス、又は医学的状態（すなわち、治験実施施設のガイドラインに従って、ガドリニウム造影剤の使用を妨げる腎機能障害）の存在によって禁忌を示さない場合、ガドリニウムを用いたＭＲＩを行う。腎機能障害の場合、顧問放射線科医の裁量により、又は治験実施施設のガイドラインに従って、非ガドリニウム造影剤を利用してもよい。ＭＲＩが禁忌である場合、ＣＴスキャンを使用してもよい。
１７．可能な場合、最初の評価及びその後の評価のために、６分間の歩行を日中のほぼ同じ時間に行わなければならない。フォローアップ評価中、６分間歩行試験と心肺運動試験は、可能な限り、同じ日に行ってはならない。
１８．リツキシマブ前投薬、アセトアミノフェン、及びジフェンヒドラミンを、リツキシマブ注入の３０～６０分前に投与する。詳細については、薬局マニュアルを参照されたい。
１９．コルチコステロイドを、プレドニゾン（ＩＶ又はＰＯ）１ｍｇ／ｋｇ（又はメチルプレドニゾロン又はデキサメタゾン等価物）の用量で、－１日目から８週目まで毎日投与する。コルチコステロイド漸減を治験薬投与後８週目（５６日目）に開始し、治験薬投与後３ヶ月目までに中止（ｄ／ｃ）する予定である。５６日目よりも前の時点又はその後の時点で、より長期間の漸減又は漸減開始は、治験医療モニターを用いて治療を担当する治験責任医師の裁量により許可される。コルチコステロイド投与のための支持薬を、治験実施施設の基準に従って提供してもよい。
血清中の抗ＡＡＶ９中和抗体価
血清中の抗ＡＡＶ９中和抗体価を決定するために、血液試料を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時、－１日目、２週目、４週目、８週目、３ヶ月目、６ヶ月目、１２ヶ月目、２４ヶ月目、３６ヶ月目に採取する。抗ＡＡＶ９中和抗体価１：４０超の患者は、治験参加の資格はない。
肝超音波
ビリルビン、ＰＴ／ＩＮＲ、及びトランスアミナーゼレベルの臨床検査評価に加えて、肝臓の超音波をスクリーニング時に行い、肝硬変又は他の肝不全と一致する所見を評価する。臨床的に必要であれば、その後の（注入後の）超音波を行ってもよい。
安全性評価
バイタルサイン
測定されるバイタルサインには、収縮期／拡張期血圧、脈拍、呼吸数、パルスオキシメトリー、及び体温が含まれ、治験実施施設の基準に従って行う。バイタルサインを全ての治験来院時にイベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って測定する。
身長及び体重
身長（ｃｍ）を、スクリーニング時に測定し、その後は年１回測定する。体重（ｋｇ）を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時、－１日目、１週目から８週目まで週１回、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）測定する。－１日目に測定した体重測定値を患者の用量の計算に使用する。
臨床検査及び身体検査
完全な身体検査（全身状態、全身外観；頭、眼、耳、鼻、及び喉；心血管；皮膚、腹部；尿生殖器；リンパ節；肝臓；筋骨格；呼吸；並びに神経）を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時、－１４日目及び－７日目、－１日目、０日目、１日目から７日目まで１日１回、２週目から８週目まで週１回、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）に行う。
血液学、凝固試験、及び化学
ＣＢＣ及び分画、凝固試験、並びに化学を含む臨床検査用の血液試料を、以下及びイベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）規定されるように行う。臨床検査は、治験責任医師又は資格を有する委任された者（例えば、医師助手、診療看護師）によって行われ、審査される。以下の臨床検査パラメータを決定する。
・血液学：ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球（ＲＢＣ）数、平均細胞容積（ＭＣＶ）、平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＶＨＣ）、血小板、白血球（ＷＢＣ）数、並びに好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含む分画。
－化学：ナトリウム、カリウム、塩化物、二酸化炭素（又は重炭酸塩）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン、グルコース、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、ＧＧＴ、カルシウム、マグネシウム、及びリン。
血液学評価及び化学評価を、スクリーニング時、－１日目、１日目から７日目まで１日１回、２週目から４週目（血液学）又は８週目（化学）まで週に最大３回、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）行う。スクリーニング時に血清クレアチニンが１．５×ＵＬＮ超の場合、クレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）を計算してもよく、ＣｒＣｌが、ＭＤＲＤ式によって計算される、５０ｍＬ／分／１．７３ｍ２超の場合、患者を適格であるとみなす。
－凝固試験：ＰＴ（及び／又はＩＮＲ）、ａＰＴＴ、Ｄ－ダイマー、トロンビン－アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）、及びフィブリノゲン。評価を、スクリーニング時、－１日目、２日目、４日目、７日目、２週目から８週目まで週１回、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）行う。
－補体：Ｃ３、Ｃ４、及びｓＣ５ｂ－９膜侵襲複合体。
Ｃ３評価及びＣ４評価を、スクリーニング時、－１日目、１日目、３日目、５日目、７日目、２週目から８週目まで週に最大３回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）行う。ｓＣ５ｂ－９評価を、スクリーニング時、－１日目、１日目から７日目まで１日１回、２週目の間に週に最大３回、３週目から８ヶ月目まで１日１回、３ヶ月目、及び６ヶ月目に行う。追加の臨床検査を治験責任医師の裁量により行ってもよい。
心臓血清学
心臓血清学的検査用の血液試料をイベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って採取する。測定されるパラメータには、以下が含まれる。
・スクリーニング時；－１日目；２週目、４週目、６週目、８週目の間に１回；３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目）；及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目）に採取したＢＮＰ。
・スクリーニング時、－１日目、７日目、２週目から８週目まで週１回、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）に採取したＣＫ－ＭＢ。
・スクリーニング時、－１日目、２日目、４日目、７日目、２週目から８週目まで週１回、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）に採取した高感度トロポニンレベル。
尿検査
比重、ｐＨ、タンパク質、グルコース、ケトン、血液、尿白血球エステラーゼの尿試料を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時；７日目、４週目、８週目；１２ヶ月目、２４ヶ月目、及び３６ヶ月目の間に１回採取する。
免疫原性
免疫原性検査用の血液試料を、全血及び血清中の液性（抗体）及び細胞性（Ｔリンパ球）抗ＡＡＶ９及び抗ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質活性を決定するために採取し、ＩｇＧ及びＩｇＭもイベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って採取する。抗体評価用の血液試料を、スクリーニング時；７日目；２週目、４週目、８週目、３ヶ月目、６ヶ月目、１２ヶ月目、２４ヶ月目、及び３６ヶ月目の間に１回採取する。細胞評価用の血液試料を、スクリーニング時；４週目、８週目、３ヶ月目、６ヶ月目、１２ヶ月目、２４ヶ月目、及び３６ヶ月目の間に１回採取する。ＩｇＧ及びＩｇＭ評価用の血液試料を、スクリーニング時；－１日目、２日目、４日目、７日目；４週目、８週目、３ヶ月目、及び６ヶ月目の間に１回採取する。
ベクター脱落
ベクター粒子脱落の評価用の血液（血漿）、唾液、尿、及び糞便試料を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時；３日目；２週目、４週目、８週目、３週目、６ヶ月目、及び９ヶ月目の間に１回採取する。各体液／物質の評価を、所与の体液／物質について２つの陰性評価が得られるまで、又はベクターレベルが低レベル又は無視できるレベルで水平状態に達したときに、指示どおりに続け、その時点で、その後の評価は必要ない。
有害事象
インフォームドコンセント、及び該当する場合、同意書の提出から生じた全てのＡＥを記録する。これには、患者が自発的に報告するＡＥ、治験責任医師が観察したＡＥ、及び予定された治験実施施設来院中に自由回答形式の質問に応じて治験責任医師が導き出したＡＥが含まれる。体系的に記録される情報には、ＡＥのタイプ、発症日及び回復日、重症度、及び実験的療法との認知された関係が含まれる。各ＡＥの重症度を、ＮＣＩ ＣＴＣＡＥ第５．０版に基づいて評定する。
有効性評価
心電図検査
１２誘導ＥＣＧを、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時、－１日目、１日目、２週目から８週目まで週１回、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）行う。
心エコー図
心エコー図を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時、４週目、８週目、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）行う。心エコー図の構成要素には、左室駆出率（ＬＶＥＦ）の評価、左室及び右室の寸法（例えば、ＬＶ収縮末期及び拡張末期寸法、容積、及び指数、隔壁及び後壁の厚さ、並びにＬＶ流出路の寸法）、同心性肥大及び拡張期パターンの評価、弁狭窄及び逆流の評価、壁運動異常の評価、肺動脈圧、呼吸に伴うＩＶＣのサイズ及び変化、心膜、ＬＶ質量、左心房（ＬＡ）直径及び容積、等容弛緩時間、ドップラー速度測定値、長軸方向グローバルストレイン、並びに左室流出路（ＬＶＯＴ）の類別が含まれる。
ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類
ＮＹＨＡ分類は、表４に示すように、症状の重症度に従って心不全の程度を分類する簡単な方法を提供する。身体活動中の制限量に基づいて、患者を４つのカテゴリーのうちの１つに分類する。ＮＹＨＡ評価を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、ベースライン来院を除く全ての治験来院時に行う。
（表４）
Figure 2023552443000030
心臓磁気共鳴画像法
植込み型ペースメーカー、除細動器、他の留置デバイス、又は医学的状態（すなわち、治験実施施設のガイドラインに従って、ガドリニウム造影剤の使用を妨げる腎機能障害）の存在によって禁忌を示さない場合、ガドリニウムを用いたＭＲＩを行う。腎機能障害の場合、顧問放射線科医の裁量により、又は治験実施施設のガイドラインに従って、非ガドリニウム造影剤（すなわち、フェルモキシトール）を利用してもよい。評価を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング中、８週目、６ヶ月目、１２ヶ月目、１８ヶ月目、２４ヶ月目、３０ヶ月目、及び３６ヶ月目に行う。
心臓ＭＲＩは、推定３０～４０分の合計スキャン時間にわたるガドリニウムのＩＶ注射及び複数のシーケンスの取得を伴う。評価には、ＬＶＥＦ、体表面積（ＢＳＡ）に対して指数化されたＬＶ質量、最大ＬＶ壁厚、最大壁厚に対するｚスコア、ＬＶ拡張末期及び収縮末期容積、ＬＡ直径、容積、及び容積指数、後期ガドリニウム増強（ＬＧＥ）の評価、並びにＬＧＥパターンが含まれる（Ｒａｊａ２０１８）。追加の評価には、安静時灌流心筋血流（ＭＢＦ）、細胞外容積（ガドリニウム注射前及び注射後のＴ１マップ）、及び右室駆出率（ＲＶＥＦ）が含まれる。ＭＲＩが禁忌である場合、ＭＲＩの代わりに静脈造影剤を用いた心臓ＣＴスキャンを使用してもよい。
６分間歩行試験
６ＭＷＴは、１００フィートの廊下を必要とし、技術者向けの運動機器も高度なトレーニングも必要としない実用的で簡単な試験である。この試験は、患者が６分間で平坦な硬い表面を速く歩くことができる距離を測定するものであり、それ故に、ＤＤ患者において徐々に損なわれている重要な日々の活動の定量的評価である。スクリーニング来院中、患者は、治験参加の資格を得るために、６ＭＷＴ中に補助なしで１５０メートル超歩くことができなければならない。加えて、ロスクラスＩの患者は、６ＭＷＴ中に補助なしで少なくとも４５０メートル歩くことができない場合、適格であるとみなされる。
６ＭＷＴを、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、スクリーニング時、８週目、３ヶ月目、６ヶ月目、１２ヶ月目、１８ヶ月目、２４ヶ月目、３０ヶ月目、及び３６ヶ月目に完了する。可能な限り、試験フォローアップ中、評価した各々の時点で、１日の同じ時間に行うべきである。評価を行う各々の時点で、同一の指示を６ＭＷＴ中に指定した間隔で各々の患者に与える。両方の評価を規定する時点で、６ＭＷＴをＣＰＥＴとは異なる日に行うべきである。この評価を、各治験来院時におよそ２４時間間隔で２回行う。
心肺運動試験
酸素消費量（ＶＯ２）の評価を含む心肺運動試験（ＣＰＥＴ）を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、ベースライン時、８週目、６ヶ月目、１２ヶ月目、１８ヶ月目、２４ヶ月目、３０ヶ月目、及び３６ヶ月目に行う。ＣＰＥＴは、呼気を測定して酸素消費量及び二酸化炭素生成を決定する、８～１２分の合計運動時間をもたらすように設計された安静時無負荷運動及び増分傾斜運動を含む、サイクルエルゴメーター又はトレッドミルでの評価を伴う。測定には、バイタルサイン、肺指数（最大努力呼吸を含む）、換気閾値測定（呼吸交換比及び分時換気量の二酸化炭素生成に対する比率を含む）、ピーク運動測定（ピークバイタルサイン及びピークＶＯ２を含む）、嫌気閾値測定（ＶＯ２を含む）、及び回復評価が含まれる。両方の評価を規定する各々の時点で、ＣＰＥＴを６ＭＷＴとは異なる日に行うべきである。
肺機能検査
肺機能検査（ＰＦＴ）を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、ベースライン時、１２ヶ月目、２４ヶ月目、３６ヶ月目に評価して、肺及び横隔膜の両方の筋能力の評価を可能にする。ＰＦＴ評価には、フローボリューム（ＦＶＣ、ＦＥＶ１を含む）、肺活量、及び拡散能（ＤＬＣＯ２を含む）の測定が含まれる。最大吸気圧及び呼気圧も評価する。
右心カテーテル法及び心内膜心筋生検
右心カテーテル法及び心内膜心筋生検を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、ベースライン時、８週目、６週目、１２ヶ月目、及び３６ヶ月目に行う。カテーテル法及び生検は、この手技の専門知識を有するインターベンショナル心臓学チームにより行われる。右心カテーテル法及び心内膜心筋生検手技中の麻酔の使用は、治験実施施設のガイドライン及び治験責任医師の臨床的判断に基づく。麻酔に関連するリスクは、製品添付文書に記載されている。
血行動態評価による右心カテーテル法
右心カテーテル法を行い、心肺血行動態パラメータの評価を可能にする。評価する血行動態パラメータには、右心房圧及び肺動脈圧、肺動脈楔入圧、混合静脈酸素飽和、並びに心拍出量及び心係数（フィック式）、肺毛細血管楔入圧、肺血管抵抗、並びに肺高血圧が含まれる。
心内膜心筋生検
心内膜心筋生検を右室の中央静脈アクセスカテーテル挿入及び心室中隔のカテーテル媒介性生検により行い、１回の手技あたりおよそ３～５個の試料を必要とする。
生検により、ＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子／タンパク質発現におけるあらゆる療法関連変化、及びＤＤ関連心筋組織学（すなわち、自己貪食空胞、筋原線維錯綜配列）変化の評価が可能になる。その後の調査中の右心カテーテル法及び心内膜心筋生検に関する推奨事項を、観察された組織学的変化の程度及び第Ｉ相中のＬＡＭＰ－２Ｂ発現に基づいて、かつ骨格筋生検からのＬＡＭＰ－２Ｂ発現、血中ＬＡＭＰ－２Ｂレベル、並びに心筋症及びＣＨＦの他の血清学的パラメータ及びＸ線パラメータを含む、低侵襲評価からのパラメータの改善を伴う心筋分子と組織学的変化との潜在的な相関を含めることにより評価する。
骨格筋生検
治験薬がＤＤの筋骨格成分を予防する又は逆転させる可能性を確認することと、ＬＡＭＰ２骨格筋がＬＡＭＰ２心筋遺伝子補正及びタンパク質発現の潜在的な実行可能な代用になるかの評価を可能にすることとの両方を行うために、骨格筋生検を行い、ＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子／タンパク質発現を評価する。外側広筋の切開生検を、ベースライン時、８週目、６ヶ月目、１２ヶ月目、及び３６ヶ月目に行い、上で詳述したパラメータの評価を可能にする。連続的評価時（すなわち、ベースライン時及び治療後８週時）での生検を対側筋で交互に行い（すなわち、ベースライン時では右脚、治療後評価時では左脚）、潜在的な手技関連副作用を最小限に抑える。その後の（第ＩＩ相）試験では、筋生検の必要性を、第Ｉ相試験中に観察された組織学的変化及びＬＡＭＰ－２Ｂ発現の程度、並びに心内膜心筋と骨格筋との間の遺伝子／タンパク質発現の相関に基づいて評価する。その後の試験中に針生検を利用することも検討する。骨格筋生検手技中の麻酔の使用は、治験実施施設のガイドライン及び治験責任医師の臨床的判断に基づく。麻酔に関連するリスクは、製品添付文書に記載されている。必要に応じて、骨格筋生検を心内膜心筋生検と併せて行い、麻酔又は鎮静を制限することができる。
神経認知評価
１６歳以上であり、かつ正常又はほぼ正常な（軽度に制限された）認知機能を有するとみなされる患者の場合、神経認知評価には、以下の構成要素が含まれる。
・ウェクスラー成人知能尺度（ＷＡＩＳ－ＩＶ）。
・バインランド適応行動尺度、第３版（バインランド－３）。
認知機能がより制限された１６歳以上の患者をＷＡＩＳ－ＩＶによって評価しない。これらの患者を以下の構成要素によって評価する。
・バインランド適応行動尺度、第３版（バインランド－３）。
・差動能力尺度（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ａｂｉｌｉｔｙ Ｓｃａｌｅｓ）（ＤＡＳ－ＩＩ）。
最も適切な評価の決定は、治験責任医師とともに心理学者／神経認知評価専門家の評価により行われる。
１８歳未満の患者の場合、神経認知評価には、以下の要素が含まれる。
・ＷＡＩＳ－ＩＶ（１６歳又は１７歳であり、正常又はほぼ正常な認知機能とみなされる場合）。
・バインランド－３親／介護者評価。
・差動能力尺度（ＤＡＳ－ＩＩ）。
神経認知評価を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、ベースライン時、１２ヶ月目、２４ヶ月目、及び３６ヶ月目に評価する。これらは、可能な限り、各評価時に同じ順序で行われるべきである。各手段の簡単な説明を以下に提供する。
ウェクスラー成人知能尺度（ＷＡＩＳ－ＩＶ）
ＷＡＩＳ－ＩＶは、認知能力の簡潔で信頼性の高い尺度を提供する。個人の目的行動及び有用な行動に対する潜在能力を評価するための一連の標準化された質問及びタスクが含まれる。主要な知能を測定するために設計されたものである。この試験により、全般的認知能力、言語理解、及び非言語能力の全推定値の標準化されたスコアがもたらされる。
バインランド適応行動尺度、第３版（バインランド－３）
バインランド－３は、適応行動の標準化された尺度であり、人々が日常生活で機能するために行うものである。能力測定は、試験状況下で被験者ができることに焦点を当てており、その一方で、バインランド－３は、日常生活で実際に何をするかに焦点を当てている。これが標準に基づく手段であるため、被験者の適応機能を同年齢の他者と比較する。これは、知的障害及び発達障害の診断を支援する有力な手段である。バインランド－３親／介護者インタビューフォームは、個人のコミュニケーション、日常生活、社交性、及び運動機能の４つのドメインにわたる適応行動機能を測定する（出生から９０歳まで）。
差動能力尺度（ＤＡＳ－ＩＩ）
ＤＡＳ－ＩＩは、学習に重要な認知能力を評価するための包括的で個別に行われる臨床手段である。この試験は、２歳６ヶ月（２：６）から１７歳１１ヶ月（１７：１１）までの小児に広範な発達レベルにわたって行う。この試験により、全体的な全般的概念理解能力、言語能力（言語概念及び知識）、非言語能力（精神的処理を必要とする複雑な非言語的な帰納的推論）、及び空間認識能力（複雑な視覚的処理）に関する標準化されたスコアがもたらされる。
神経筋評価
神経筋評価を、ベースライン時、８週目、６ヶ月目、１２ヶ月目、２４ヶ月目、及び３６ヶ月目に行う。これには、以下を含む必須の神経筋活動の時限試験が含まれる。
・床からの起き上がり、
・４段階段昇降、
・１０メートル歩行／走行、
・時限アップアンドゴー（ＴＵＧ）、及び
・ノーススター歩行能力評価試験。
眼科検査
眼科検査を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、ベースライン時、１２ヶ月目、２４ヶ月目、及び３６ヶ月目に評価する。これには、直接検眼鏡検査／眼底検査、眼底撮影、光干渉、断層撮影、自己蛍光検査、及び網膜電図検査による網膜評価が含まれる。
患者報告アウトカム／生活の質（ＰＲＯ／ＱＯＬ）
本試験に用いられるＰＲＯ／ＱＯＬ尺度には、ＫＣＣＱ－１２及びＰｅｄｓＱＬが含まれる。評価を、イベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って、ベースライン時、８週目、３ヶ月に１回（３ヶ月目から１２ヶ月目まで）、及び６ヶ月に１回（１２ヶ月目から３６ヶ月目まで）収集する。
有効性評価
臨床的有効性評価項目の評価には、治験薬投与後の最初の月及び年の間にイベントスケジュール（図１０Ａ～図１０Ｄ）に従って行う以下の評価が含まれる。
・ＶＯ２の評価を含むＣＰＥＴ。
・６ＭＷＴ（距離）評価。
・ＤＤ関連組織学的異常及び心筋細胞におけるＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子／ＲＮＡ／タンパク質の存在の評価のための（右室の中央静脈アクセスカテーテル挿入により行われる）心内膜心筋生検。
・ガドリニウム増強心臓ＭＲＩ（植込み型ペースメーカー、除細動器、他の留置デバイス、又は医学的状態の存在によって禁忌を示さない場合）。
・心エコー図。
・全生存を評価し、フォローアップの他の構成要素を中止することを選択した患者（健康状態が禁忌とされるほどに重度に悪化していない限り、強く阻止される）、かかる患者には、全体的な健康状態及び生存の評価のために治験職員と連絡を取り続ける選択肢が提供される。
・その後の心臓移植、ＬＶＡＤ、植込み型除細動器若しくはペースメーカー留置、心臓伝導異常に対する電気生理学的切除術、又はＣＨＦによる入院の必要性の評価。
統計的手法
投与コホートに対して最大３名の患者の試料サイズ及び最大６名の患者への拡大（ＤＬＴの場合、３名の患者のうち１名）を、新規治験薬に対する用量評価に関する標準の安全なアプローチとみなす。真のＤＬＴ率が５％以下であると仮定して、所与のコホートに基づいて用量増加が止まる可能性は３％である（すなわち、２名以上のＤＬＴ患者に観察される）。真のＤＬＴ率が５０％であると仮定して、所与のコホートに基づいて用量増加が止まる可能性は８３％である。
登録予定の患者数
１１～２３名（コホート１は、以前のプロトコルバージョンに従って３名の患者を登録した）
試験集団
評価対象試験集団には全試験集団が含まれ、試験集団にある範囲の治験薬を投与する。追加の評価対象集団は、成人患者（１８歳以上及び１５～１７歳の両方を含む）及び８～１４歳の集団を含む小児集団である。
実施例６：第Ｉ相試験の結果
第Ｉ相試験の結果は、多くの主要な臨床バイオマーカー及び評価項目において強い傾向を示した。
ＤＤは、遺伝的に受け継がれた心筋症であり、疾患の特徴及び進行は、典型的な成人心筋症の特徴及び進行とは異なる。患者の大半は、疾患経過の後期まで機能障害に関して十分に補償されており、ＬＶＥＦ及び６ＭＷＴなどの測定値は、心筋症が進行するまで正常であるか、又は軽度に異常であり得る。疾患関連異常の軽度の改善又は安定化は、この患者集団において望ましく、新興の自然経過に対する改善を表す可能性が高く、これらは、自然経過研究において進行と相関することが示された臨床バイオマーカーの安定化及び／又は改善を伴う可能性がある。
低用量及び高用量の成人及び１５歳超の青年コホート（６．７×１０１３ＧＣ／ｋｇ及び１．１×１０１４ＧＣ／ｋｇ）の臨床データは、治療の有効性を実証した。データには、以下が含まれる。
１．一次標的臓器におけるＬＡＭＰ２の持続的なタンパク質発現の確認。
２．形態的ＤＤ特徴の改善の細胞レベルでの実証。
３．ＢＮＰを含む主要な心臓パラメータの改善及び／又は安定化（免疫抑制レジメンコンプライアンスが確認された２名の低用量患者において、ベースラインから７５％～７９％の減少を含む、長期フォローアップを伴う４名の患者の各々で減少）。
４．４名の成人のうち３名におけるＮＹＨＡクラスの改善（低用量コホート及び高用量コホートにおける免疫抑制及び他の低用量患者における安定化が確認され、４名の患者の各々で６ＭＷＴの安定化から軽度の改善が確認された）。
５．低用量で治療した全ての被験者における生活の質及び機能の自己報告による改善。
安定したＬＡＭＰ２Ｂ発現データ（図１４）は、治療前の時点及び治療後の時点での心内膜心筋生検試料の電子顕微鏡によって評価されるように、心筋構造の実証的かつ好ましい変化及び病理学的ＤＤ特徴の回復を伴っている。これらは、被験者１００５由来の心筋組織を示す図１４で説明されている。マウスノックアウトモデルにおけるこれらの所見と類似して、治療前の生検は、多数の広範な自己貪食空胞及び顕著な心筋原線維の乱れを示し、これにより、別個の筋肉要素が最小限に識別可能である。治療後８週間時点の同様の心内膜心筋生検は、自己貪食空胞の顕著な減退及び広範な明らかな条線を有する筋原線維構造の回復を示す。これらの所見は、後期の９ヶ月時点で確認され、分子的及び組織学的回復が維持されることを示唆している。
低用量コホートにおける関連する心臨床マーカーに関する更なるデータも、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）を含む重要な心機能マーカー（表５）、クレアチンキナーゼ心筋バンド（ＭＢ）、及び侵襲的血行動態によって測定される心拍出量の改善又は安定化のいずれかを示す。重要なことに、ベースラインからのＢＮＰの観察された改善（それぞれ、１８ヶ月時点及び１５ヶ月時点で、１００２の場合に７９％及び１００５の場合に７５％）は、ナトリウム利尿ペプチドが心不全の予後と強く相関するため、当該技術分野の専門家により、関連性が高く、有望なものであるとみなされた（Ｊａｎｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｍｅｄ．２０１３ Ａｕｇ；６１（６）：９５０－９５５）。
臨床的利益の最も有意義なパラメータのうちの１つは、患者の機能レベルであり、特に心不全との関連で、日常生活の一部としての身体活動に耐える能力である。したがって、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）分類などの評価項目は、全体的なグローバル患者機能状態に関連する臨床的改善の強力な尺度とみなされている（Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２００９ Ｏｃｔ；１５８（４Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ２４－Ｓ３０）。低用量コホート及び高用量コホートにおける長期フォローアップを伴う４名の被験者のうち３名がＮＹＨＡ分類のＩＩからＩへの改善（表５）を示し、残りの１名がＩＩの安定したレベルを維持したことは、有意であり、かつＤＤの自然経過と非常に矛盾している。
２０２１年１１月の最新の長期評価時点で、３名全ての患者が６ＭＷＴの結果において安定化及び／又はわずかな改善を示した（表５）。加えて、最新の来院時のＰＩのインタビューから報告されたように、全ての被験者は、全般的に具合が良いと報告しており、自身の活動に制限があるとは報告していない。被験者１００２及び被験者１００５は、ＲＰ－Ａ５０１の投与を受けてから植込み型心臓除細動器の作動は全くないことも報告している。
（表５）
Figure 2023552443000031
男性におけるダノン心筋症の特徴は、特に、肥大及びそれに伴う拡張機能障害に起因する壁厚の増加である。図１５Ａ～図１５Ｂに示すように、高用量及び低用量で評価可能な５名の患者のうち４名が、連続心エコー検査によって測定される壁厚の安定性又は減少のいずれかを示した。一部の被験者では、壁厚の減少は、駆出率の軽度の改善又は安定性を伴っており、これはダノン病の後期徴候である（図１５Ｂ）。エコーベースのパラメータに加えて、侵襲的血行動態により、拡張機能障害及び左室充満圧の尺度である肺毛細血管楔入圧の測定が可能になる。他の心臓パラメータと一致して、治療した患者の連続楔入圧及び心拍出量／１回拍出量は、改善又は安定化のいずれかを示した（図１５Ｃ～図１５Ｄ）。この疾患の自然経過を考慮すると、これは、これらの患者の正常な進行とは対照的である。
表６は、ＲＰ－Ａ５０１が安定した心臓ベクターコピー数（ＶＣＮ）を示したことを示す。
（表６）
Figure 2023552443000032
表７は、免疫組織化学（ＩＨＣ）による心内膜心筋ＬＡＭＰ２Ｂタンパク質発現を示す。
（表７）
Figure 2023552443000033
表８は、心内膜心筋ＬＡＭＰ２Ｂウェスタンブロットタンパク質発現を示す。
（表８）
Figure 2023552443000034
第Ｉ相試験の低用量コホート及び高用量コホートについて上で詳述したように、血清心不全マーカー、侵襲的血行動態拍出量測定、心エコー評価、及び全体的な機能評価を含む関連する心臓評価は全て、１９年の死亡率中央値を有する進行性及び致死性心筋症の自然経過と比較して、安定化でさえも陽性転帰を表す疾患の改善を示す。これらの臨床評価は、心筋におけるＬＡＭＰ２発現の証拠、並びにＤＤの特徴である液胞病理及び筋原線維錯綜配列の組織学的改善を伴う。これらの理由から、非臨床データ及び特に臨床データの両方を含む証拠の全体性は、ＲＰ－Ａ５０１の直接的な利益の可能性を圧倒的に示す。
ＲＰ－Ａ５０１は、概して、低用量レベル及び高用量レベルで忍容性良好であった。全ての観察された有害作用は可逆的であり、続発症は持続しなかった。トランスアミナーゼ及びクレアチニンキナーゼの早期上昇、並びに血小板及びヘモグロビンの減少は、ベースラインに戻るか、又は最終的に改善した。ＲＰ－Ａ５０１ｒ－ＡＡＶ用量依存的毒性は、高用量レベルで治療した２名の患者のうち１名で見られた。最も高い総用量を投与した罹患患者は、血栓性微小血管症（ＴＭＡ）を発症し、一過性血液透析を含む支持療法により完全に消失した。両方の用量レベルにわたって、有害事象は可逆的であり、調整した免疫抑制レジメンでの治療後３ヶ月時点でほぼ消失した。
本明細書に引用される全ての参考文献、論文、公報、特許、特許公報、及び特許出願は、全ての目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。しかしながら、本明細書に引用されるいずれの参照文献、論文、公報、特許、特許公報、及び特許出願の言及も、有効な先行技術を構成するか、又は世界中のあらゆる国で共通の一般知識の一部を形成するという承認でもいかなる形態の提案でもなく、そのようなものとしてみなされるべきではない。

Claims (58)

  1. ダノン病に罹患している若しくはダノン病のリスクがあると特定された、及び／又はＬＡＭＰ－２遺伝子の１つ以上のアイソフォームに不活性化変異を有すると特定された対象におけるダノン病を治療するための方法であって、
    治療有効量の、カプシド及びベクターゲノムを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンを、前記対象に投与することを含み、
    前記ベクターゲノムが、ＬＡＭＰ－２タンパク質、好ましくはＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、
    前記方法。
  2. 前記治療有効量が、前記対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたり約２×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）未満である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇあたり約１．５×１０１４ｖｇ未満である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇあたり約１×１０１４ｖｇ未満である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇあたり少なくとも約１×１０１２ｖｇである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇあたり少なくとも約１×１０１３ｖｇである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇあたり約６．７×１０１３ｖｇである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇあたり約１．１×１０１４ｖｇである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記治療有効量が、前記対象の体重１ｋｇあたり約２．０×１０１４ｖｇである、請求項１に記載の方法。
  10. 有効量のタクロリムスを前記対象に投与することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 有効量のリツキシマブを前記対象に投与することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 有効量のタクロリムスを前記対象に投与することと、有効量のリツキシマブを前記対象に投与することと、を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  13. 有効量のエクリズマブを前記対象に投与することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  14. 有効量のリツキシマブを前記対象に投与すること、有効量のタクロリムスを前記対象に投与すること、及び／又は有効量のエクリズマブを前記対象に投与することを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記対象は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、任意選択的に、可逆性血小板減少症及び／又は急性腎障害（ＡＫＩ）をもたらすａＨＵＳのリスクがある、請求項１３に記載の方法。
  16. 有効量のコルチコステロイドを前記対象に投与することを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 有効量のタクロリムスを投与する前に、有効量のコルチコステロイドを前記対象に投与することを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記対象が、任意選択的に８～１４歳及び／又は１５～１７歳の若年対象である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記対象が、任意選択的に０～８歳の小児対象である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記対象が、任意選択的に１８歳以上の成人対象である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記治療有効量の前記ＡＡＶが静脈内投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記治療有効量の前記ＡＡＶが直接心臓注射により投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記治療有効量の前記ＡＡＶが腹腔内注射により投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. ａ）前記ＡＡＶによる心筋細胞及び／若しくは骨格筋の形質導入、
    ｂ）任意選択的に心筋細胞及び／若しくは骨格筋における、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする外因性リボ核酸ポリヌクレオチドの発現及び／若しくは外因性ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現、
    ｃ）１つ以上のダノン病関連組織学的異常、任意選択的に自己貪食空胞若しくは筋原線維錯綜配列の補正若しくは改善、
    ｄ）心筋細胞分子マーカー発現の補正若しくは改善、並びに／又は
    ｅ）心筋細胞組織学の補正若しくは改善
    のうちの１つ以上をもたらす、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. ａ）心血管病態生理学、Ｘ線評価、及び／若しくは、心肺運動／生理学的パラメータの持続的改善若しくは安定化、
    ｂ）ＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子及び／若しくはタンパク質発現の補正、
    ｃ）ダノン病関連組織学的異常の改善、並びに／又は
    ｄ）ＡＡＶに対する耐容免疫応答
    のうちの１つ以上をもたらす、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ａ）心血管病態生理学、Ｘ線評価、及び／若しくは、心肺運動／生理学的パラメータの持続的改善若しくは安定化、
    ｂ）ＬＡＭＰ２Ｂ遺伝子及び／若しくはタンパク質発現の補正、
    ｃ）ダノン病関連組織学的異常の改善、並びに／又は
    ｄ）ＡＡＶに対する耐容免疫応答
    のうちの１つ以上をもたらす、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ａ）治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）及びＳＡＥの低い発生率及び／又は強度、
    ｂ）心臓移植、植込み型除細動器若しくはペースメーカー留置、心臓伝導異常に対する電気生理学的切除術、又は、心不全によるその後の入院を含む、心臓インターベンションの低い発生率、
    ｃ）ＡＡＶ、任意選択的にＡＡＶ及び／又はＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質に反応性の抗体又はＴリンパ球に対する低い免疫応答、
    ｄ）肝毒性の低い発生率及び／又は強度、任意選択的に肝トランスアミナーゼ（ＡＳＴ及びＡＬＴ）、ＧＧＴ、ビリルビン、及びＡＬＰの小さな変化、並びに／あるいは
    ｅ）血小板数、プロトロンビン時間（ＰＴ、若しくは国際標準化比（ＩＮＲ））、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、フィブリノゲン、Ｄ－ダイマー、トロンビン－アンチトロンビン複合体（ＴＡＴ）、及び補体成分（補体３（Ｃ３）、補体４（Ｃ４）、及び血清膜侵襲複合体（ｓＣ５ｂ－９）のベースラインからの変化に基づく、ｈ凝固障害の低い発生率及び／又は強度
    のうちの１つ以上をもたらす、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ＡＡＶが、プロモーターに作動可能に連結された前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、かつ、
    前記ポリヌクレオチド配列が配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を共有する、及び／又は前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が配列番号１に対する少なくとも９５％の同一性を共有する、
    請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ポリヌクレオチド配列が配列番号２を含む若しくはそれからなる、及び／又は前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が配列番号１を含む若しくはそれからなる、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記プロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記プロモーターが、配列番号２２に対する少なくとも９５％の同一性を共有するエンハンサー／プロモーター領域を含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記エンハンサー／プロモーター領域が配列番号２２を含む又はそれからなる、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記発現カセットが、５′から３′の順に、
    （ａ）配列番号２２を含むエンハンサー／プロモーター領域、
    （ｂ）配列番号３を含み、前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号２７を含む３′ＵＴＲ配列、及び／又は
    （ｄ）配列番号７を含むポリアデニル化配列
    を含む、請求項２８に記載の方法。
  34. 前記発現カセットが、（ｉ）配列番号１１を含む５′ＩＴＲと、（ｉｉ）配列番号１２を含む３′ＩＴＲとに隣接している、請求項２８に記載の方法。
  35. 前記発現カセットが配列番号８を含む、請求項２８に記載の方法。
  36. 前記カプシドがＡＡＶ９カプシドである、請求項２８に記載の方法。
  37. 前記ＡＡＶ９カプシドが、配列番号２８のアミノ酸１～７３６、配列番号２８のアミノ酸１３８～７３６、又は配列番号２８のアミノ酸２０３～７３６を含む１つ以上のカプシドタンパク質を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 治療有効量の、ＬＡＭＰ－２タンパク質、好ましくはＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、ダノン病の治療における使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  39. 前記治療有効量が、前記対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたり約２×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）未満である、請求項３８に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  40. 前記治療有効量が、約１．５×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満である、請求項３８に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  41. 前記治療有効量が、約１×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満である、請求項３８に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  42. 前記治療有効量が、少なくとも約１×１０１２ｖｇ／ｋｇである、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  43. 前記治療有効量が、少なくとも約１×１０１３ｖｇ／ｋｇである、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  44. 前記治療有効量が、約６．７×１０１３ｖｇ／ｋｇである、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  45. 前記治療有効量が、約１．１×１０１４ｖｇ／ｋｇである、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  46. 前記治療有効量が、約２．０×１０１４ｖｇ／ｋｇである、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  47. 前記ＡＡＶが、プロモーターに作動可能に連結された前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含み、かつ、
    前記ポリヌクレオチド配列が配列番号２に対する少なくとも９５％の同一性を共有する、及び／又は前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が配列番号１に対する少なくとも９５％の同一性を共有する、
    請求項３８～４６のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  48. 前記ポリヌクレオチド配列が配列番号２を含む若しくはそれからなる、及び／又は前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が配列番号１を含む若しくはそれからなる、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  49. 前記プロモーターがＣＡＧプロモーターである、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  50. 前記プロモーターが、配列番号２２に対する少なくとも９５％の同一性を共有するエンハンサー／プロモーター領域を含む、請求項３８～４９のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  51. 前記エンハンサー／プロモーター領域が配列番号２２を含む又はそれからなる、請求項３８～５０のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  52. 前記発現カセットが、５′から３′の順に、
    （ａ）配列番号２２を含むエンハンサー／プロモーター領域、
    （ｂ）配列番号３を含み、前記ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号２７を含む３′ＵＴＲ配列、及び／又は
    （ｄ）配列番号７を含むポリアデニル化配列
    を含む、請求項３８～５１のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  53. 前記発現カセットが、（ｉ）配列番号１１を含む５′ＩＴＲと、（ｉｉ）配列番号１２を含む３′ＩＴＲとに隣接している、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  54. 前記発現カセットが配列番号８を含む、請求項３８～５３のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  55. 前記カプシドがＡＡＶ９カプシドである、請求項３８～５４のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  56. 前記ＡＡＶ９カプシドが、配列番号２８のアミノ酸１～７３６、配列番号２８のアミノ酸１３８～７３６、又は配列番号２８のアミノ酸２０３～７３６を含む１つ以上のカプシドタンパク質を含む、請求項５５に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物。
  57. 請求項３８～５５のいずれか一項に記載の使用のための単位用量、医薬組成物、又は組成物と、ダノン病の治療における使用のための説明書と、を含む、キット。
  58. 前記キットが、リツキシマブ、タクロリムス、エクリズマブ、及びコルチコステロイドのうちの１つ以上を含む１つ以上の単位用量、医薬組成物、又は組成物を更に含む、請求項５７に記載のキット。
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