JP2024504085A - 筋ジストロフィーを治療するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）2aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた、骨格筋ジストロフィーの治療、抑制または改善に関する。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）またはベッカー型筋ジストロフィー（BMD）を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターなどのウイルスベクターを含む。より多くの実施形態は、骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する治療剤をスクリーニングする方法および組成物を含み、このスクリーニングは、in vitro心室筋組織モデルを含む。

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１９．１２．０１１ ウェブサイトの掲載日 令和２（２０２０）年１月９日

連邦政府の助成による研究開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所より交付された助成番号AR-70517およびAR-69107の助成に基づき、米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を有する。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）2aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた、骨格筋ジストロフィーの治療、抑制（予防）または改善に関する。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）またはベッカー型筋ジストロフィー（BMD）を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターなどのウイルスベクターを含む。より多くの実施形態は、骨格筋ジストロフィーを治療、抑制（予防）または改善する治療剤をスクリーニングする方法および組成物を含み、このスクリーニングは、in vitro心室筋組織モデルを含む。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、筋細胞膜下に存在する細胞骨格タンパク質の1つであるジストロフィンの欠損により引き起こされる、心筋と骨格筋の変性、壊死、脂肪・線維化を特徴とする慢性疾患である。ジストロフィンの発現を回復させるために、遺伝子置換や遺伝子修復の研究が数多く行われている。前臨床データは有望であるものの、新たに発現するジストロフィンの潜在的な免疫原性が懸念されている。また、ジストロフィン遺伝子には何千もの病因変異が存在するという複雑性も、ジストロフィン修復遺伝子治療を困難にしている。ジストロフィンに依存しない疾患修飾遺伝子治療が開発されれば、ジストロフィン免疫の合併症を伴うことなく、すべてのDMD患者を治療できるようになる。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する方法であって、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを対象に投与する工程を含む方法を含む。

いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、前記対象における全身性のジストロフィン欠損を含む。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）およびベッカー型筋ジストロフィー（BMD）から選択される。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、DMDを含む。

いくつかの実施形態において、前記骨格筋ジストロフィーは、心筋リモデリングおよび／または線維化を含む。

いくつかの実施形態において、前記治療、前記抑制または前記改善により、前記対象における心筋リモデリングおよび／または線維化が、前記ポリヌクレオチドを投与していない対象より抑えられる。

いくつかの実施形態において、前記SERCAポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV血清型1～12型のいずれかから選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV血清型1型（AAV1）およびAAV血清型9型（AAV9）から選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドに包含されている。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む。

いくつかの実施形態は、前記対象におけるAAV血清型に対する抗体の有無を判定する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、全身投与を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、静脈内投与を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、冠動脈内注入を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、子宮内投与を含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、前記ポリヌクレオチドの単回投与からなる。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを含み、前記投与は、約1×10⁸ウイルスゲノム数～約1×10¹⁵ウイルスゲノム数の前記ポリヌクレオチドの投与を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10¹³ウイルスゲノム数～約9×10¹³ウイルスゲノム数である。

いくつかの実施形態は、血管拡張剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与前に投与する。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与と同時に投与する。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤は、ニトログリセリンを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドを筋組織損傷の発症前に投与する。いくつかの実施形態において、前記骨格筋ジストロフィーによる筋組織損傷の発症が予測される。いくつかの実施形態において、前記筋組織損傷は、筋組織学的検査により測定可能である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、子宮内に存在する。

いくつかの実施形態において、前記対象は、新生児である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、少なくとも3歳である。いくつかの実施形態において、前記対象は、少なくとも5歳である。いくつかの実施形態において、前記対象は、少なくとも10歳である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、20歳以下または15歳以下である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、10歳以上20歳以下である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、歩行不能である。

いくつかの実施形態において、前記対象の心機能は、筋ジストロフィーでない対象の心機能と比べて低下している。

いくつかの実施形態において、前記対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、前記対象は、雄性である。

いくつかの実施形態において、前記治療により、未治療の対象の骨格筋ジストロフィーの症状または指標と比べて、前記ポリヌクレオチドの投与後、少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月または12ヶ月の期間にわたって、前記対象の骨格筋ジストロフィーの症状または指標に改善が見られる。いくつかの実施形態において、前記期間は、少なくとも1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年または10年である。

いくつかの実施形態において、前記治療により、未治療の対象の心組織または心機能と比べて、前記対象の心組織または心機能に改善が見られる。

いくつかの実施形態において、前記治療により、未治療の対象の骨格筋組織または骨格筋機能と比べて、前記対象の骨格筋組織または骨格筋機能に改善が見られる。

いくつかの実施形態において、前記治療により、未治療の対象の心室機能と比べて、前記対象の心室機能に改善が見られる。いくつかの実施形態において、前記心室機能の改善は、ガドリニウム遅延造影（LGE）心臓MRIによって評価される左室構造ならびに左室機能として、左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、1回拍出量および／または円周方向ストレイン、局所壁厚、左室心筋重量に対する左室LGEのパーセント値、左室生存心筋重量、LGEが認められる左室セグメント数などのベースラインからの変化；ならびに左室機能（LVESV）のベースラインからの変化における複合アウトカムからなる群から選択されるパラメータの改善を含む。

いくつかの実施形態において、前記改善は、
ガドリニウム遅延造影（LGE）心臓MRIによって評価される左室構造ならびに左室機能として、左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、1回拍出量および／または円周方向ストレイン、局所壁厚、左室心筋重量に対する左室LGEのパーセント値、左室生存心筋重量、LGEが認められる左室セグメント数などのベースラインからの変化；
左室機能（LVESV）、上肢機能評価尺度バージョン2.0（PUL2.0）、選択した肺機能、QOLおよび最終事象のベースラインからの変化における複合アウトカム；ならびに
以下の項目：
（a）PUL2.0、握力、鍵つまみ力と指尖つまみ力、肘屈曲力、歩行可能な場合は10m歩行／走行時間（10MWRT）、10MWRT>30秒と定義される歩行不能の発生率、およびノーススター歩行能力評価（NSAA）により評価される骨格筋機能；
（b）安静時肺活量（SVC）、1秒間の努力呼気量（FEV1）、努力肺活量（FVC）、最大呼気流量（PEF）、最大吸気圧（MIP）、最大呼気圧（MEP）、咳嗽時最大呼気流量（PCF）および予備吸気量（IFR）により評価される肺機能；または
（c）DMDの上肢に関する患者報告アウトカム尺度（DMD UL-PROM）と小児のアウトカムデータ収集質問紙（PODCI）により評価されるQOL
のベースラインからの変化
からなる群から選択されるパラメータの改善を含む。

いくつかの実施形態は、前記期間後に、前記対象の改善の程度を測定する工程をさらに含む。

本明細書に提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善するための、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドの使用を含む。

本明細書に提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善するための医薬の製造における、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドの使用を含む。

いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、前記対象における全身性のジストロフィン欠損を含む。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）およびベッカー型筋ジストロフィー（BMD）から選択される。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、DMDを含む。いくつかの実施形態において、前記骨格筋ジストロフィーは、心筋リモデリングおよび／または線維化を含む。

いくつかの実施形態において、前記SERCAポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV血清型1～12型のいずれかから選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV血清型1型（AAV1）およびAAV血清型9型（AAV9）から選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドに包含されている。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、全身投与用に調整されたものである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、静脈内投与用に調整されたものである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、冠動脈内注入による投与用に調整されたものである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、子宮内投与用に調整されたものである。

いくつかの実施形態は、血管拡張剤と組み合わせた上記の使用のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤は、ニトログリセリンを含む。

いくつかの実施形態において、前記対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、ヒトである。

いくつかの実施形態において、前記対象は、子宮内に存在する。

いくつかの実施形態において、前記対象は、乳児である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、新生児である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、少なくとも3歳である。いくつかの実施形態において、前記対象は、少なくとも5歳である。いくつかの実施形態において、前記対象は、少なくとも10歳である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、20歳以下または15歳以下である。

いくつかの実施形態において、前記対象は、雄性である。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、患者における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する治療剤をスクリーニングする方法であって、
（a）試験薬剤を心室筋組織片に接触させる工程；
（b）前記試験薬剤と接触させた心室筋組織片の収縮振幅を測定する工程；
（c）前記試験薬剤と接触させた心室筋組織片の収縮振幅を、前記試験薬剤と接触させていない心室筋組織片の収縮振幅と比較する工程；および
（d）前記比較に基づいて、前記試験薬剤が前記治療剤を含むと判定する工程
を含む方法を含む。

いくつかの実施形態において、前記心室筋組織片を得るために、
（i）人工多能性幹細胞の集団を分化誘導して、複数個の心室筋細胞を含む複数個の心筋球を得る工程；
（ii）前記複数個の心筋球を単一細胞に分散させて、複数個の心筋細胞を得る工程；および
（iii）心室筋組織片が得られる条件下で、前記複数個の心筋細胞をコラーゲンの存在下、線維芽細胞の集団と接触させる工程
を行う。

いくつかの実施形態は、前記心室筋組織片を得る工程をさらに含み、該心室筋組織片を得る工程は、
（i）人工多能性幹細胞の集団を分化誘導して、複数個の心室筋細胞を含む複数個の心筋球を得る工程；
（ii）前記複数個の心筋球を単一細胞に分散させて、複数個の心筋細胞を得る工程；および
（iii）心室筋組織片が得られる条件下で、前記複数個の心筋細胞をコラーゲンの存在下、線維芽細胞の集団と接触させる工程
を含む。

いくつかの実施形態において、前記人工多能性幹細胞の集団は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）の対象から得られたものである。

いくつかの実施形態において、工程（a）は、少なくとも1時間かけて行われる。いくつかの実施形態において、工程（a）は、少なくとも1日間かけて行われる。

いくつかの実施形態において、前記心室筋組織片に一定の周波数の電場刺激を与える。いくつかの実施形態において、工程（b）は、複数の周波数を用いて行われる。

いくつかの実施形態において、工程（b）は、発生力、標準化した発生力、速度変動、力変動、力-頻度関係およびβアドレナリン作動性応答から選択されるパラメータの測定を含む。

いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、前記患者における全身性のジストロフィン欠損を含む。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）およびベッカー型筋ジストロフィー（BMD）から選択される。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、DMDを含む。

いくつかの実施形態において、前記試験薬剤は、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、SERCAポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記SERCAポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV血清型1～12型のいずれかから選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、AAV血清型1型（AAV1）およびAAV血清型9型（AAV9）から選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、誘導性プロモーターを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドにパッケージされている。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む。

CMV（サイトメガロウイルス）プロモーターを有するAAVベクターによってコードされるヒトSERCA2aの概略図である。i：イントロン。

SERCA2aをコードするAAV9（AAV血清型9型）ベクターを3ヶ月齢のマウスに、マウス1匹あたり6×10¹²vgで尾静脈投与する実験計画を示した図である。11ヶ月齢時に握力とトレッドミルのパフォーマンスを評価した。マウスが21ヶ月齢に達した時点で、血清CK値、握力、トレッドミル走行距離、心電図および左心室血行動態の評価を行った。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの心臓のラミニンおよびFlagの免疫染色顕微鏡写真である。ラミニン染色により、基底膜の存在が示される。Flag染色により、ヒトSERCA2aの発現の有無が示される。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの心臓全体から調製した溶解液のウェスタンブロットの結果（左パネル）と、デンシトメトリーによる測定結果（右パネル）である。Flagシグナルにより、ヒトSERCA2aの発現の存在が示される。ビンキュリンは、ローディングコントロールである。* p<0.05。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの筋小胞体／小胞体（SR）調製物のウェスタンブロットの結果である。

心筋SRへのカルシウム取り込み量の変化（* p<0.05：野生型マウスおよびAAV9.SERCA2a投与マウスとの比較）（左パネル）と、カルシウム取り込み最大速度（V_max）（* p<0.05）（右パネル）を示したグラフである。

SERCA2a、PLNおよびCSQのウェスタンブロット画像である。グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）は、ローディングコントロールである。

nNOSのウェスタンブロット画像とその定量結果を示したグラフである。

非投与mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの4種類の異なる骨格筋のSERCA2aを検出した免疫ブロット（ウェスタンブロット）の結果である。Flagタグ抗体により、ヒトSERCA2aの存在が示される。ビンキュリンは、ローディングコントロールである。

AAV9.SERCA2a投与mdxマウスの4種類の異なる骨格筋のラミニンおよびFlagの免疫染色顕微鏡写真である。ラミニン染色により、基底膜の存在が示される。Flagシグナルにより、ヒトSERCA2aの発現の存在が示される。

骨格筋SRへのカルシウム取り込み量の変化（* p<0.05：野生型マウスおよびAAV9.SERCA2a投与マウスとの比較、^$ p<0.05：野生型マウスと非投与mdxマウスとの比較、^# p<0.05：野生型マウスとすべてのmdxマウス（AAV投与の有無に依らず）との比較）（左パネル）と、カルシウム取り込み最大速度（V_max）（* p<0.05）（右パネル）を示したグラフである。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの心臓のヘマトキシリンエオジン（H&E）染色とマッソントリクローム染色の顕微鏡写真（線維化組織はマッソントリクローム染色で青く染色されている）（左パネル）と、心臓の線維化面積の測定結果（右パネル）である。

心拍数、PR間隔、QRS持続時間、QTc間隔、Q振幅および心筋症指数を示したECG評価結果である。

左室の収縮末期容積、dP/dt max、最高血圧、拡張末期容積、dP/dt minおよび駆出率を示した心臓カテーテル評価結果である。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの圧容積ループを示した図である。* p<0.05。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの心臓（全体）断面のマッソントリクローム染色顕微鏡写真である。

前肢握力の測定結果である。

トレッドミルでの絶対走行距離（左パネル）と、体重で標準化した走行距離（右パネル）を示したグラフである。* p<0.05。データは、平均値±平均値の標準誤差で示した。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの前肢握力を示したグラフである。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスのトレッドミル走行距離を示したグラフである。* p<0.05。データは平均値±平均値の標準誤差で示した。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの血清クレアチンキナーゼ（CK）の測定結果である。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの全断面のマッソントリクローム染色顕微鏡写真である。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスのヘマトキシリンエオジン（HE）染色およびマッソントリクローム染色の高倍率顕微鏡写真である。

線維化面積の測定結果である。サンプルサイズは、試験に用いた動物の数を表す。

中心核を有する筋線維数を測定した結果である。サンプルサイズは、試験に用いた動物の数を表す。

筋線維のサイズ分布を測定したグラフである。サンプルサイズは、測定した筋線維の数を表す。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスの全断面のマッソントリクローム染色顕微鏡写真である。

21ヶ月齢の野生型マウス、mdxマウスおよびAAV9.SERCA2a投与mdxマウスのヘマトキシリンエオジン（HE）染色およびマッソントリクローム染色の高倍率顕微鏡写真である。

線維化面積の測定結果である。サンプルサイズは、試験に用いた動物の数を表す。

中心核を有する筋線維数を測定した結果である。サンプルサイズは、試験に用いた動物の数を表す。

筋線維のサイズ分布を測定したグラフである。サンプルサイズは、測定した筋線維の数を表す。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV.SERCA2a投与mdxマウスの前脛骨筋の免疫染色顕微鏡写真（上パネル）とその定量結果（下パネル）である。* p<0.05。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV.SERCA2a投与mdxマウスの大腿四頭筋の免疫染色顕微鏡写真（上パネル）とその定量結果（下パネル）である。* p<0.05。

野生型マウス、mdxマウスおよびAAV.SERCA2a投与mdxマウスの腓腹筋の免疫染色顕微鏡写真（上パネル）とその定量結果（下パネル）である。* p<0.05。

第2相試験計画の一実施形態の概略図である。略語：Pre-Scr：事前スクリーニング、Scr：スクリーニング、Rand：ランダム化、vg：ウイルスゲノム数、D：日、W：週、M：月。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、SERCA2aポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いた、骨格筋ジストロフィーおよび心筋ジストロフィーの治療、抑制（予防）または改善に関する。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）またはベッカー型筋ジストロフィー（BMD）を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターなどのウイルスベクターを含む。より多くの実施形態は、骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する治療剤をスクリーニングする方法および組成物を含み、このスクリーニングは、in vitro心室筋組織モデルを含む。

DMDは、ジストロフィンの欠損により引き起こされる。DMDの病因的特徴の1つは、細胞質カルシウムの顕著な上昇である。超生理的なレベルの細胞内カルシウムにより、タンパク質の分解、膜の損傷、そして最終的には筋肉の壊死と機能障害が引き起こされる。筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）は、興奮収縮連関時に細胞質カルシウムを筋小胞体に輸送するカルシウムポンプである。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、カルシウムリサイクルを改善し、DMDに長期にわたる効果をもたらすことを目的とした、AAVによるSERCA2aの全身性送達を含む。いくつかの実施形態において、前記送達は、単回投与である。本明細書に開示されるように、3ヶ月齢のDMDモデルであるmdxマウスに、AAV9ヒトSERCA2aベクター（6×10¹²ウイルスゲノム数／マウス）を静脈内投与したところ、心臓と骨格筋においてヒトSERCA2aの強力な発現が18ヶ月間にわたって持続することが免疫染色とウェスタンブロットにより確認された。同時に、心臓と骨格筋における筋小胞体／小胞体へのカルシウムの取り込みにおいても有意な改善が見られた。SERCA2a療法により、握力とトレッドミルのパフォーマンスが有意に向上し、心筋の線維化が完全に阻止され、心電図（ECG）も正常化した。心臓カテーテル検査では、投与したマウスにおいて、収縮期および拡張期の複数の血行動態パラメータの正常化が確認された。また、心室拡張が完全に阻止され、駆出率が野生型レベルに回復したことは重要な結果である。これらの結果から、AAV9 SERCA2aの単回全身投与により、当該技術分野で認められているDMD動物モデルにおいて、長期にわたって効果が持続することが明らかとなった。

細胞質内へのカルシウムの過剰流入がDMD発症に極めて重要な役割を担うことを示唆する証拠が次々と得られている^1-4。具体的には、高レベルの細胞内カルシウムは、カルシウム感受性のカルパインプロテアーゼとホスホリパーゼA2を活性化する。これらの酵素は、タンパク質分解と膜損傷を引き起こす。また、カルシウムの調節異常により、フリーラジカルの産生が誘導され、ミトコンドリアの機能が低下する。最終的に、このようなカルシウムの上昇により、筋線維の壊死と筋機能障害が生じる。したがって、特定の理論に縛られるものではないが、カルシウムホメオスタシスの回復により、本明細書の開示によって示されるように、DMDにおける筋疾患が軽減されると予想される。

SERCAは、濃度勾配に逆らってカルシウムを細胞質からSR内腔に輸送するカルシウムポンプである^5,6。心筋細胞では、SERCAが細胞質からのカルシウム排出の70%以上を担っている。様々なSERCAアイソフォームが存在する中で、SERCA1aとSERCA2aは、成人の筋肉で天然に発現するアイソフォームである⁵。SERCA1aは、骨格筋で選択的に発現するのに対して、SERC2aは、骨格筋と心筋の両方で発現する。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、SERCA2aの発現を上昇させることでカルシウムの過剰流入を是正し、DMDにおける骨格筋疾患および心筋症の両方を緩和することを含む。

アデノ随伴ウイルス血清型9型（AAV9）は、全身の骨格筋や心臓への遺伝子導入に用いられるベクターである⁷。全身性のAAV9療法は、ヒト患者の神経筋疾患の治療で成功を収めている⁸。また、DMD患者を対象とした全身性のAAV9遺伝子治療の臨床試験も、2件開始されている^9,10。本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、DMDモデルであるmdxマウスが生涯にわたり疾患から解放されることを目的とした、ヒトSERCA2a AAV9ベクターの単回静脈内投与を含む。3ヶ月齢のマウスに治療を行い、寿命が尽きるまで追跡した^11,12。AAV9の投与により、ヒトSERCA2aが全身の筋肉に発現し、SRへのカルシウムの取り込みが有意に促進された。また、投与により、全身の筋力が有意に改善され、致死的な拡張型心筋症が改善されたことは重要な結果である。本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、SERCA2a AAVベクター（例えば、AAV9）の投与に基づく、DMDに対するジストロフィン非依存性遺伝子治療の開発を含む。

本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、米国特許公開第2008/0076730号、米国特許第8221738号および米国特許公開第2017/0296790号に開示の態様を含み、これらの文献は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される。本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、Wasala N.B.ら、(2019) Molecular Therapy 28: 845-854に開示の態様を含み、この文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

定義
本明細書において、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）で構成されるポリマー、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により得られる断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより得られる断片などを意味する場合がある。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（DNAやRNAなど）、天然のヌクレオチドの類似体（例えば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、例えば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による1つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、例えば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれに類似した結合により連結することができる。ホスホジエステル結合に類似した結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含する。ペプチド核酸は、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列が提供される。いくつかの実施形態において、前記核酸は、RNAまたはDNAである。

本明細書において、「コードする」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、遺伝子、cDNA、mRNAなどのポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列が有する特性として、所定のアミノ酸配列などの別の巨大分子を合成するための鋳型として機能することを意味する場合がある。したがって、特定の遺伝子に対応するmRNAの転写・翻訳により、細胞またはその他の生物系でタンパク質が産生される場合、当該遺伝子はこのタンパク質をコードすると表現される。

本明細書において、「ベクター」、「発現ベクター」または「コンストラクト」は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸であって、様々な調節エレメントを含み、細胞で異種核酸を発現させることができる核酸を意味する。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル、酵母およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、ヒトなどの哺乳動物系におけるタンパク質発現用のベクターである。

本明細書において、「プロモーター」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、特定の遺伝子の転写を開始するDNAの領域を意味する。前記プロモーターは、遺伝子の転写開始点の近傍で、同じDNA鎖の上流（センス鎖の5’領域）に位置していてもよい。前記プロモーターは、条件的かつ誘導性プロモーターであってもよく、構成的プロモーターであってもよい。前記プロモーターは、細菌細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞におけるタンパク質発現に特異的なものであってもよい。

本明細書において、「条件的」または「誘導性」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、誘導因子の存在下で遺伝子を発現させるが、誘導因子の非存在下では実質的に遺伝子を発現させないように機能するプロモーターなどの核酸コンストラクトを意味する。哺乳動物における発現コンストラクト用の誘導性プロモーターとしては、テトラサイクリン、エクジソン、ストレプトグラミン系抗生物質、マクロライド系抗生物質またはドキシサイクリンにより誘導可能なプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、「構成的」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、継続的に産生されるポリペプチドを発現させるように構成的に機能するプロモーターなどの核酸コンストラクトを意味する。

本明細書において、「注入」、「注入される」および「注入する」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、「注射」または「ボーラス注射」という当該技術分野で認知されている用語の投与時間（通常、1分未満）よりも実質的に長い時間（通常、1分以上）の投与を意味する。注入する際の流速は、少なくとも部分的には投与量の影響を受けるものであるが、「注入」の流速は、同じ量であれば「注射」の流速よりも遅い。

本明細書において、「併用して」、「組み合わせて」、「同時」または「同時に」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、ある治療法による投与に加えて別の治療法による投与を行うことを含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドの対象への注入に加えて、同じ個体への当該技術分野で認められている医薬組成物の投与を行うことが想定される。本明細書において、上記の用語には、複数の治療法による同時投与および順次投与が含まれる。

本明細書において、疾患を「治療する」または疾患の「治療」とは、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、疾患の安定化、治癒または完治未満を含み、疾患または疾患の徴候もしくは症状の進行の抑止または遅延を含む。「予防」という用語は、本明細書全体に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、疾病または疾病の徴候もしくは症状の完全または不完全な予防、あるいは発症または疾病の徴候もしくは症状の出現の遅延、あるいは疾病の経過の変化を含む。「治療用」、「治療効果」または「臨床効果」という用語には、治療と予防の両方が含まれる。

本明細書において、「アデノ随伴ウイルス」または「AAV」という用語は、すべての亜型、血清型およびシュードタイプ、ならびにすべての天然型および組換え体を包含する。様々なAAVの血清型および株が当該技術分野で知られており、ATCCなどの学術的情報源または商業的情報源から公的に入手可能である。また、公開されているAAVの血清型や株の配列および／または様々なデータベースから入手可能なAAVの血清型や株の配列を、既知の技術を用いて合成することもできる。

本明細書において、「血清型」という用語は、カプシドタンパク質と所定の抗血清との反応性により規定される、AAV同士を区別する特徴を意味する。ヒトAAVには、AAV1～AAV12を含む少なくとも12種類の血清型が知られているが、さらなる血清型が発見され続けており、新たに発見された血清型の使用も想定される。例えば、「AAV2血清型」とは、AAV2のcap遺伝子にコードされるカプシドタンパク質と、同じAAV2血清型の5’逆方向末端反復（ITR）配列および3’逆方向ITR配列を含むゲノムとを含有するAAVを意味する。

「シュードタイプ」AAVという用語は、ある血清型由来のカプシドタンパク質と、異なる血清型または異種血清型の5’逆方向末端反復（ITR）配列および3’逆方向ITR配列を含むウイルスゲノムとを含有するAAVを意味する。シュードタイプrAAVは、カプシド血清型の細胞表面結合特性と、ITR血清型に一致した遺伝的特性とを有すると考えられる。シュードタイプrAAVは、カプシドタンパク質の血清型とITRの血清型が異種であれば、AAV1～AAV12の霊長類AAV血清型を含む任意の血清型AAV由来のVP1、VP2およびVP3を含むAAVカプシドタンパク質とITRとを含んでいてもよい。シュードタイプrAAVにおいて、5’ITRと3’ITRは同じ血清型に由来するものであってもよく、異種の血清型に由来するものであってもよい。シュードタイプrAAVは、当該技術分野に記載されている標準的な技術を用いて作製される。

「キメラ」rAAVベクターは、異種カプシドタンパク質を含むAAVベクターを包含する。このAAVベクターは、カプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3がキメラであるrAAVベクター、すなわち、これらがすべて同じ血清型とは限らないrAAVベクターである。本明細書におけるキメラAAVは、カプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3の血清型が異なるAAVを包含する。例えば、以下に限定されないが、カプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3が、AAV1とAAV2のカプシドタンパク質であってもよく、他のパルボウイルスカプシドタンパク質の混合物であってもよい。また、キメラAAVは、他のウイルスタンパク質または他のタンパク質、例えば、所望の細胞もしくは組織にAAVを標的送達するタンパク質を含んでいてもよい。本明細書におけるキメラrAAVは、5’ITRと3’ITRがキメラであるrAAVも包含する。本発明は、AAV血清型の異なるITR、例えばAAV1とAAV2のITRを含むキメラrAAVベクターを包含する。また、キメラrAAVは、合成配列を含んでいてもよい。

rAAVウイルスベクターは、米国特許第6,001,650号および第6,258,595号に記載されているような一過性トランスフェクションの手法などの、当該技術分野で知られている多くの方法を用いて作製することができる。これらの文献は、参照により本明細書に援用される。通常、rAAVベクターの作製には4つの共通要素が必要である：
1）複製のための寛容な宿主細胞。これには、本明細書に記載のベクター作製システムに適用可能な、293-A細胞株、293-S細胞株（BioReliance社から入手）、VERO細胞株、HeLa細胞株など、当該技術分野で既知の標準的な宿主細胞が含まれる；
2）ヘルパーウイルス機能：形質導入による作製システムで利用する場合、アデノウイルス5型（Ad5）のE2a遺伝子、E4-orf6遺伝子およびVA遺伝子を発現するプラスミドpAd Helper 4.1として供給される；
3）トランスパッケージング機能を有するrep-capコンストラクト；ならびに
4）AAV ITR配列に挟まれた目的の遺伝子。
トランスフェクションによる作製は、Sandalonらによる文献、J. Virology, 2004; 78(22):12355-12365に記載の方法と同様にして行ってもよい。なお、この文献は、参照により本明細書に援用される。

治療方法および治療用組成物
本明細書に提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、対象における筋ジストロフィーを治療、抑制または改善するための治療方法および治療剤を含む。本明細書で提供される特定の実施形態に有用な態様、例えば、キットなどの治療用組成物および治療方法ならびに送達経路および送達方法は、米国特許第8221738号および米国特許公開第2017／0252462号に開示されており、これらの文献は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、骨格筋に含まれる。例えば、前記筋ジストロフィーは、心筋以外の筋肉に含まれる。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー（BMD）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィーまたは筋強直性ジストロフィーを含む。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異を含む。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、対象における全身性ジストロフィン欠損を含む。例えば、前記筋ジストロフィーの対象の骨格筋で発現されているジストロフィンのレベルまたはジストロフィンの機能は、前記筋ジストロフィーでない対象の骨格筋で発現されているジストロフィンのレベルまたはジストロフィンの機能と比べて低下している。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、DMDおよびBMDから選択される。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、DMDを含む。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、心筋リモデリングおよび／または線維化を含む。

いくつかの実施形態は、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記SERCAポリペプチドは、SERCA2ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記SERCA2ポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドおよびSERCA2cポリペプチドから選択されるSERCA2アイソフォームを含む。いくつかの実施形態において、前記SERCA2ポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドに包含されている。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、特定の血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、ウイルスカプシドタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV血清型1型（AAV1）、AAV血清型2型（AAV2）、AAV血清型3型（AAV3）、AAV血清型4型（AAV4）、AAV血清型5型（AAV5）、AAV血清型6型（AAV6）、AAV血清型7型（AAV7）、AAV血清型8型（AAV8）、AAV血清型9型（AAV9）、AAV血清型10型（AAVrh10）、AAV血清型11型（AAV11）およびAAV血清型12型（AAV12）から選択される血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1およびAAV9から選択される血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV9血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、前記血清型のうちの1つ以上からなるハイブリッド血清型を含んでいてもよい。

いくつかの実施形態は、前記対象におけるAAV血清型に対する抗体の有無を判定する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドによりコードされるAAVまたはその断片は、前記対象で同定された抗体で認識されるAAV血清型とは異なる血清型を有するように選択してもよい。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、全身投与を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、注射、注入または移植を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、静脈内投与を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、子宮内投与を含む。例えば、前記筋ジストロフィーの発症が予測される胎内対象への子宮内投与が挙げられる。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、前記対象への前記ポリヌクレオチドの1回以上の投与を含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、前記対象への前記ポリヌクレオチドの単回投与からなる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、前記対象への前記ポリヌクレオチドの2回の投与からなる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、前記対象への前記ポリヌクレオチドの3回の投与からなる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、前記対象への前記ポリヌクレオチドの4回の投与からなる。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与は、前記対象への前記ポリヌクレオチドの5回の投与からなる。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドまたはその機能的断片に包含されている。そのようないくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、ウイルスゲノム数（vg）として、またはDNase耐性粒子数（DRP）として測定することができる。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、少なくとも1×10⁸vg、1×10⁹vg、1×10¹⁰vg、1×10¹¹vg、1×10¹²vg、1×10¹³vg、1×10¹⁴vg、1×10¹⁵vg、1×10¹⁶vg、1×10¹⁷vg、1×10¹⁸vg、1×10¹⁹vg、1×10²⁰vg、またはこれらの量のいずれか2つを上下限値とする範囲の量である。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、少なくとも1×10⁸DRP、1×10⁹DRP、1×10¹⁰DRP、1×10¹¹DRP、1×10¹²DRP、1×10¹³DRP、1×10¹⁴DRP、1×10¹⁵DRP、1×10¹⁶DRP、1×10¹⁷DRP、1×10¹⁸DRP、1×10¹⁹DRP、1×10²⁰DRP、またはこれらの量のいずれか2つを上下限値とする範囲の量である。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10⁸vg～約1×10²⁰vg、約1×10⁹vg～約1×10¹⁷vg、約1×10¹⁰vg～約1×10¹⁶vg、約1×10¹¹vg～約1×10¹⁵vgまたは約1×10¹²vg～約1×10¹⁴vgである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10¹³vg～約9×10¹³vgである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10⁸DRP～約1×10²⁰DRP、約1×10⁹DRP～約1×10¹⁷DRP、約1×10¹⁰DRP～約1×10¹⁶DRP、約1×10¹¹DRP～約1×10¹⁵DRPまたは約1×10¹²DRP～約1×10¹⁴DRPである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10¹³DRP～約9×10¹³DRPである。

いくつかの実施形態は、血管拡張剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与前に投与する。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与と同時に投与する。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤は、ニトログリセリンを含む。

いくつかの実施形態において、前記対象は、ヒトなどの哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記対象は、雄性である。いくつかの実施形態において、前記対象は、乳児である。本明細書において、「乳児」には、4歳未満のヒトの子供が含まれる。いくつかの実施形態において、前記対象は、新生児である。本明細書において、「新生児」には、生後1ヶ月未満のヒトの乳児が含まれる。いくつかの実施形態において、前記対象は、子宮内に存在する。いくつかの実施形態において、前記対象は、筋ジストロフィーの実質的な身体的症状が認められない対象である。例えば、前記対象が、ジストロフィン遺伝子などの遺伝子に変異を有する対象など、筋ジストロフィーの発症が予測される対象であってもよい。いくつかの実施形態において、前記対象は、クレアチニンキナーゼの上昇、腓腹筋仮性肥大、または近位筋の筋力低下を示すガワーズ徴候などの筋ジストロフィーの身体的症状が認められない対象である。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドを筋組織損傷の発症前に投与する。いくつかの実施形態において、前記骨格筋ジストロフィーによる筋組織損傷の発症が予測される。いくつかの実施形態において、前記筋組織損傷は、筋組織学的検査により測定可能な場合もあるが、測定できない場合もある。いくつかの実施形態において、前記対象は、少なくとも1ヶ月齢、2ヶ月齢、3ヶ月齢、4ヶ月齢、5ヶ月齢、6ヶ月齢、7ヶ月齢、8ヶ月齢、9ヶ月齢、10ヶ月齢、11ヶ月齢、1歳、2歳、3歳、4歳、5歳、6歳、7歳、8歳、9歳、10歳、11歳、12歳、13歳、14歳、15歳、16歳、17歳、18歳、19歳もしくは20歳、または、1ヶ月齢以下、2ヶ月齢以下、3ヶ月齢以下、4ヶ月齢以下、5ヶ月齢以下、6ヶ月齢以下、7ヶ月齢以下、8ヶ月齢以下、9ヶ月齢以下、10ヶ月齢以下、11ヶ月齢以下、1歳以下、2歳以下、3歳以下、4歳以下、5歳以下、6歳以下、7歳以下、8歳以下、9歳以下、10歳以下、11歳以下、12歳以下、13歳以下、14歳以下、15歳以下、16歳以下、17歳以下、18歳以下、19歳以下もしくは20歳以下、または、これらの年齢のいずれか2つを上下限値とする範囲の年齢、例えば、1ヶ月齢～20歳、1ヶ月齢～15歳、1ヶ月齢～12歳、1ヶ月齢～10歳、3歳～20歳、3歳～15歳、3歳～10歳、8歳～20歳もしくは8歳～15歳である。

いくつかの実施形態において、前記治療により、治療を受けた対象の、DMDなどの骨格筋ジストロフィーの1つ以上の症状または指標に、未治療の骨格筋ジストロフィーの対象の1つ以上の該症状と比べて長期的な改善が見られる。いくつかの実施形態において、前記改善は、前記治療による投与後、少なくとも3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月または12ヶ月の期間にわたって認められる。いくつかの実施形態において、前記改善は、前記治療による投与後、少なくとも1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年または10年の期間にわたって認められる。いくつかの実施形態において、前記改善は、心機能または心組織の1つ以上の指標の改善である。いくつかの実施形態において、前記改善は、骨格筋機能または骨格筋組織の1つ以上の指標の改善である。いくつかの実施形態において、前記改善は、心機能および骨格筋機能または心組織および骨格筋組織の1つ以上の指標の改善である。前記改善は、本明細書に記載の改善を含み、例えば、後述の実施例に記載の指標の改善を含む。例えば、心機能および／もしくは骨格筋機能または心組織および／もしくは骨格筋組織の改善は、以下の1つ以上の改善を含む：
ガドリニウム遅延造影（LGE）心臓MRIによって評価される左室構造ならびに左室機能として、左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、1回拍出量および／または円周方向ストレイン、局所壁厚、左室LGEを左室心筋重量に対するパーセント値とグラム単位で表したもの、左室生存心筋重量をグラム単位で表したもの、LGEが認められる左室セグメント数などのベースラインからの変化；
左室機能（LVESV）、PUL2.0、肺機能（パラメータを1つ選択）、QOLおよび最終事象のベースラインからの変化における複合アウトカム；ならびに
以下の項目：
（a）PUL2.0、握力、鍵つまみ力と指尖つまみ力、肘屈曲力、歩行可能な場合は10m歩行／走行時間（10MWRT）、10MWRT>30秒と定義される歩行不能の発生率、およびノーススター歩行能力評価（NSAA）により評価される骨格筋機能；
（b）安静時肺活量（SVC）、1秒間の努力呼気量（FEV1）、努力肺活量（FVC）、最大呼気流量（PEF）、最大吸気圧（MIP）、最大呼気圧（MEP）、咳嗽時最大呼気流量（PCF）および予備吸気量（IFR）により評価される肺機能；ならびに
（c）DMD UL-PROMとPODCIにより評価されるQOL
のベースラインからの変化。

いくつかの実施形態は、DMDなどの骨格筋ジストロフィーにより生じることが予測される筋組織損傷の発症前に、ヒト男性などの対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する方法を含み、該方法は、SERCA2aポリペプチドをコードする核酸と、これに作動可能に連結されたCMVプロモーターとを含むポリヌクレオチドを含むAAV1ベクターの含有量が約3×10¹³vgである投与量を単回静脈内投与することを含む。いくつかの実施形態は、ニトログリセリンなどの血管拡張剤と組み合わせて投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態は、DMDなどの骨格筋ジストロフィーにより生じることが予測される筋組織損傷の発症前に、ヒト男性などの対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する方法を含み、該方法は、SERCA2aポリペプチドをコードする核酸と、これに作動可能に連結されたCMVプロモーターとを含むポリヌクレオチドを含むAAV1ベクターの含有量が約3×10¹³vgである投与量を冠動脈内注入により単回投与することを含む。いくつかの実施形態は、ニトログリセリンなどの血管拡張剤と組み合わせて投与することをさらに含む。

いくつかの実施形態は、DMDなどの骨格筋ジストロフィーにより生じることが予測される筋組織損傷の発症前に、ヒト男性などの対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する方法を含み、該方法は、SERCA2aポリペプチドをコードする核酸と、これに作動可能に連結されたCMVプロモーターとを含むポリヌクレオチドを含むAAV1ベクターの含有量が約3×10¹³vgである投与量を冠動脈内注入により単回投与することを含み、該投与が、市販のガイドカテーテルまたは診断用心臓カテーテルとB. Braun Perfusor（登録商標） Spaceシリンジポンプを用い、流速300mL/hrで10分間かけて行う、左冠動脈および／または右冠動脈への順行性心外膜冠動脈内注入である。いくつかの実施形態において、ニトログリセリンの静脈内注入は、AAV1ベクターの注入前および注入と同時に、最大耐量で少なくとも10分間行われる。

治療剤のスクリーニング
本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、患者の骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する治療剤のスクリーニングを含む。いくつかの実施形態において、前記骨格筋ジストロフィーは、前記患者における全身性のジストロフィン欠損を含む。いくつかの実施形態において、前記骨格筋ジストロフィーは、DMDおよびBMDから選択される。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、DMDを含む。いくつかの実施形態において、前記筋ジストロフィーは、心筋リモデリングおよび／または線維化を含む。

そのようないくつかの実施形態は、
（a）試験薬剤を心室筋組織片に接触させる工程；
（b）前記試験薬剤と接触させた心室筋組織片の収縮振幅を測定する工程；
（c）前記試験薬剤と接触させた心室筋組織片の収縮振幅を、前記試験薬剤と接触させていない心室筋組織片の収縮振幅と比較する工程；および
（d）前記比較に基づいて、前記試験薬剤が前記治療剤を含むと判定する工程
を含む。

いくつかの実施形態において、前記心室筋組織片を得るために、
（i）人工多能性幹細胞の集団を分化誘導して、複数個の心室筋細胞を含む複数個の心筋球を得る工程；
（ii）前記複数個の心筋球を単一細胞に分散させて、複数個の心筋細胞を得る工程；および
（iii）心室筋組織片が得られる条件下で、前記複数個の心筋細胞をコラーゲンの存在下、線維芽細胞の集団と接触させる工程
を行う。
いくつかの実施形態は、前記心室筋組織片を得る工程をさらに含み、該心室筋組織片を得る工程は、
（i）人工多能性幹細胞の集団を分化誘導して、複数個の心室筋細胞を含む複数個の心筋球を得る工程；
（ii）前記複数個の心筋球を単一細胞に分散させて、複数個の心筋細胞を得る工程；および
（iii）心室筋組織片が得られる条件下で、前記複数個の心筋細胞をコラーゲンの存在下、線維芽細胞の集団と接触させる工程
を含む。
いくつかの実施形態において、前記人工多能性幹細胞の集団は、DMDまたはBMDなどの筋ジストロフィーの対象から得られたものである。

いくつかの実施形態において、前記試験薬剤を、少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、10時間、12時間、18時間、24時間、またはこれらの数字のいずれか2つを上下限値とする範囲の時間、前記心室筋組織片と接触させる。いくつかの実施形態において、前記試験薬剤を、少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、20日、25日、30日、またはこれらの数値のいずれか2つを上下限値とする範囲の時間、前記心室筋組織片と接触させる。

いくつかの実施形態において、前記試験薬剤と接触させた心室筋組織片の収縮振幅の測定に際して、前記心室筋組織片に電場刺激を与える。いくつかの実施形態において、前記電場の周波数は、測定中一定としてもよい。いくつかの実施形態において、前記電場の周波数は、測定中に変調してもよい。いくつかの実施形態において、測定中にパラメータが決定される。いくつかの実施形態において、前記パラメータは、発生力、標準化した発生力、速度変動、力変動、力-頻度関係およびβアドレナリン作動性応答から選択される。

いくつかの実施形態において、前記試験薬剤は、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、SERCAポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、前記SERCAポリペプチドは、SERCA2ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記SERCA2ポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドおよびSERCA2cポリペプチドから選択されるSERCA2アイソフォームを含む。いくつかの実施形態において、前記SERCA2ポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、CMVプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、誘導性プロモーターを含む。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドに包含されている。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、特定の血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、ウイルスカプシドタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11およびAAV12から選択される血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1およびAAV9から選択される血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV9血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、前記血清型のうちの1つ以上からなるハイブリッド血清型を含んでいてもよい。

システムおよびキット
本明細書に提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善するためのシステムおよびキットを含む。そのようないくつかの実施形態は、SERCA2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態は、前記ポリヌクレオチドと薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、前記SERCAポリペプチドは、SERCA2ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記SERCA2ポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドおよびSERCA2cポリペプチドから選択されるSERCA2アイソフォームを含む。いくつかの実施形態において、前記SERCA2ポリペプチドは、SERCA2aポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、CMVプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、AAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドに包含されている。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記AAVベクターは、特定の血清型を有するAAVまたはその断片をコードする。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、ウイルスカプシドタンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11およびAAV12から選択される血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1およびAAV9から選択される血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV1血清型を有する。いくつかの実施形態において、前記AAVまたはその断片は、AAV9血清型を有する。

より多くの実施形態は、対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善するための、前記ポリヌクレオチドの単回投与量を含む、滅菌バイアルのような容器を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドまたはその機能的断片に包含されている。そのようないくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、ウイルスゲノム数（vg）として、またはDRPとして測定することができる。

いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、少なくとも1×10⁸vg、1×10⁹vg、1×10¹⁰vg、1×10¹¹vg、1×10¹²vg、1×10¹³vg、1×10¹⁴vg、1×10¹⁵vg、1×10¹⁶vg、1×10¹⁷vg、1×10¹⁸vg、1×10¹⁹vg、1×10²⁰vg、またはこれらの量のいずれか2つを上下限値とする範囲の量である。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、少なくとも1×10⁸DRP、1×10⁹DRP、1×10¹⁰DRP、1×10¹¹DRP、1×10¹²DRP、1×10¹³DRP、1×10¹⁴DRP、1×10¹⁵DRP、1×10¹⁶DRP、1×10¹⁷DRP、1×10¹⁸DRP、1×10¹⁹DRP、1×10²⁰DRP、またはこれらの量のいずれか2つを上下限値とする範囲の量である。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10⁸vg～約1×10²⁰vg、約1×10⁹vg～約1×10¹⁷vg、約1×10¹⁰vg～約1×10¹⁶vg、約1×10¹¹vg～約1×10¹⁵vgまたは約1×10¹²vg～約1×10¹⁴vgである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10¹³vg～約9×10¹³vgである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10⁸DRP～約1×10²⁰DRP、約1×10⁹DRP～約1×10¹⁷DRP、約1×10¹⁰DRP～約1×10¹⁶DRP、約1×10¹¹DRP～約1×10¹⁵DRPまたは約1×10¹²DRP～約1×10¹⁴DRPである。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドの投与量は、約1×10¹³DRP～約9×10¹³DRPである。

いくつかの実施形態は、ニトログリセリンのような血管拡張剤をさらに含む。

特定の実施形態
本明細書に提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、血管拡張剤の使用を含む。本明細書で提供される特定の実施形態に有用な態様は、米国特許第8221738号に開示されており、組成物、キットおよび送達経路／送達方法に関するものである。なお、この文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドを、血管拡張剤と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与前に対象に投与してもよい。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与前または前記ポリヌクレオチドの投与と同時に対象に投与してもよい。前記血管拡張剤としては、例えば、アデノシン、ヒスタミン（またはヒスタミン誘導剤）、α遮断薬、テオブロミン、パパベリン、エタノール、テトラヒドロカンナビノール（THC）、ミノキシジル、一酸化窒素（一酸化窒素増加物質を含む）、ニトログリセリンなどが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記血管拡張剤は、例えば、経口投与、経皮投与、静脈内注射または静脈内注入により全身に投与される。いくつかの実施形態において、前記注入は、冠動脈内注入を含む。

実施例1：DMDモデルへのSERCA2aのin vivo投与
若齢mdxマウスへのAAV9 SERCA2aベクターの単回静脈内投与により、21ヶ月齢でSRへのカルシウムの取り込みが改善した
DMDの疾患修飾遺伝子治療法としてのSERCA2aの試験を行うため、Flagタグを付加したヒトSERCA2a遺伝子をAAV9にパッケージし、3ヶ月齢のmdxマウスに6×10¹²ウイルスゲノム（vg）／マウスの用量で尾静脈投与した（図1A、図1B）。mdxマウスの平均寿命は、およそ21.5ヶ月である^11,12。したがって、投与マウスが21ヶ月齢に達した時点で、最終機能測定を行い、心臓と骨格筋を摘出した。

Flag抗体を用いた免疫蛍光染色により、投与マウスの心臓でヒトSERCA2aの強力な発現が確認された（図1C）。全細胞溶解物のウェスタンブロットにより、心臓のSERCA2aの総量の有意な増加が確認された（図1D、図1G、図1H）。心臓のSR調製物を用いたウェスタンブロットにより、AAV投与マウスのSRにFlagタグ付加ヒトSERCA2aが正しく局在化し、濃縮されていることが確認された（図1E）。ホスホランバンやカルセクエストリンなどの他のカルシウム調節タンパク質の発現においては、実質的な変化は観察されなかった（図1G）。mdxの心臓におけるSRへのカルシウムの取り込みは、有意に低下していた（図1F）。このカルシウムの取り込み障害は、AAV9を投与したmdxマウスの心臓では完全に正常化された（図1F）。

また、骨格筋におけるAAV9によるSERCA2aの発現とカルシウムの取り込みについても調べた（図2）。Flagタグを利用したウェスタンブロットおよび免疫染色により、前肢筋、上側後肢筋（大腿四頭筋）ならびに下側後肢筋（前脛骨筋および腓腹筋）にわたりヒトSERCA2aの広範な発現が確認された（図2A、図2B）。心臓で見られた結果と同様に、SERCA2a投与により骨格筋におけるSRへのカルシウムの取り込みも有意に増強された。投与マウスのカルシウムの取り込みの最大速度は、正常マウスと同等レベルであった（図2C）。

SERCA2aや他のカルシウム調節タンパク質に加えて、神経型一酸化窒素合成酵素（nNOS）の発現も調べた（図1H）。正常心臓とmdxの心臓のnNOSレベルに有意差は見られなかった。また、AAV.SERCA2aを投与した場合の心臓のnNOSレベルにも有意な変化は見られなかった（図1H）。mdxマウスの骨格筋のnNOSレベルは、BL10マウスより有意に低く、過去の研究結果^14,15とも一致していた。AAV.SERCA2a投与マウスの骨格筋のnNOSレベルは、非投与mdxマウスと有意な差はなかった（図1H）。

若齢mdxマウスへのSERCA2aの全身投与により、終生期mdxマウスの拡張型心筋症の発症が抑制された
非投与mdxマウスでは、21ヶ月齢で拡張型心筋症に特有の特徴が見られた（図3A-E）^16,17。拡張型心筋症に特有の特徴としては、心筋線維化、心室拡張、ECG異常、血行動態障害などが挙げられる（図3A-3E）。心臓カテーテル検査において、mdxマウスでは、収縮末期と拡張末期における心室容積の有意な増加、心臓収縮性の有意な低下、圧容積ループの右向き／下向きシフトが確認された（図3C-3E；表1）。SERCA2aの全身投与により、心筋の線維化が完全に阻止され、PR間隔、QRS持続時間、補正QT（QTc）間隔、Q振幅、心筋症指数、収縮末期容積、拡張末期容積、最高血圧、収縮末期圧、心室圧の最大変化率と最小変化率（dP/dt maxとdP/dt min）、dP/dt maxにおける血圧、dP/dt maxとdP/dt minにおける容積、前負荷調整最大パワーおよび駆出率が正常化した（図3A-3E；表1）。投与により、1回仕事量の有意な改善が見られた（表1）。また、心拍数、左室弛緩時定数（Tau）、1回拍出量指数、心臓指数、拡張末期圧および最大パワーに改善傾向が見られた（図3A-D；表1）。投与マウスの心臓の解剖学的パラメータ（重量および重量比）について、特記すべきものはなかった（表2）。

3ヶ月齢のmdxマウスへのSERCA2a投与により、11ヶ月齢時と21ヶ月齢時における前肢握力とトレッドミル走力が有意に向上した
骨格筋機能と全身パフォーマンスを11ヶ月齢時と21ヶ月齢時に、非侵襲的握力測定とトレッドミル走力測定により評価した（図4A-4B、図5A-5C）。SERCA2a投与mdxマウスの前肢握力は、非投与mdxマウスと比べて有意に高かった（図4Aおよび図5A）。トレッドミル測定では、絶対走行距離と、体重で正規化した走行距離の両方とも、11ヶ月齢で野生型レベルまで回復した（図4B）。投与mdxマウスの走行距離は、21ヶ月齢まで、非投与mdxマウスの走行距離を有意に上回った（図5B）。21ヶ月齢の投与マウスでは、血清クレアチンキナーゼ（CK）レベルの低下傾向も認められた（p=0.09）（図5C）。また、骨格筋の組織学的検査をヘマトキシリンエオジン染色、マッソントリクローム染色および筋線維型免疫染色により行った（図6A-6E、図7A-7E、図8A-8C）。握力と走力は改善したものの、骨格筋の組織学的検査で認められた改善はわずかであった（図6A-6E、図7A-7E）。

本明細書に開示される実施形態において、ヒトSERCA2aの単回全身投与により、DMDモデルであるmdxマウスにおいて筋肉と心臓の機能が生涯にわたって改善した。3ヶ月齢のmdxマウスに、Flagタグ付加ヒトSERCA2aを発現するAAV9ベクターを静脈内投与した。マウスが21ヶ月齢に達した時点で、ヒトSERCA2aの持続的かつ広範な発現が全身の横紋筋で認められた。投与により、心臓と骨格筋におけるSRへのカルシウムの取り込み障害が正常化した（図1A-1H、図2A-2C）。生理学的アッセイでは、SERCA2a投与により、前肢筋握力とトレッドミル走行距離が有意に増加した（図4A-4B、図5A-5C）。驚くべきことに、SERCA2aの全身投与により、心筋の線維化が完全に阻止され、心臓の電気生理機能が正常化した（図3A-3E）。収縮期および拡張期の主要な血行動態パラメータは、野生型レベルまで回復した（図3A-3E；表1）。これらの結果から、疾患修飾因子（DMDの細胞質カルシウムホメオスタシスを回復させるSERCA2aなど）を用いたメカニズムベースの遺伝子治療は、少なくとも筋ジストロフィーを効果的に治療する重要な方法であることが示された。

DMDは、ジストロフィンの欠損によって引き起こされる疾患である。したがって、ジストロフィンの発現の回復に焦点をあてて、DMD遺伝子治療の実験的研究が行われている。ジストロフィン遺伝子置換療法やジストロフィン遺伝子修復療法により、マウスやイヌのDMDモデルで非常に有望な結果が得られている^18-20。現在、全身性AAVマイクロジストロフィン遺伝子治療による臨床試験が複数進行中である¹⁰。このような進展がある一方で、ジストロフィンを用いた遺伝子治療には限界があるのも事実である。例えば、新たに再生されたジストロフィンは、免疫系に新たな抗原として認識され、免疫反応を引き起こす可能性がある²¹。変異を標的としたエクソンスキッピングやゲノム編集による手法は、変異に応じた個別の調整が必要である。DMD患者で天然に発現する遺伝子を利用する新しい治療法が開発されれば、こうした問題を克服できる可能性がある。

細胞内カルシウムの異常な上昇は、DMDにおける筋壊死の主要な原因の1つである。正常な筋肉では、細胞質カルシウムレベルは、細胞外腔、細胞質、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラの間でカルシウムの流入と再利用が協調的に制御されることにより、生理的レベルに維持されている。ジストロフィーを発症した筋肉では、カルシウムのホメオスタシスが破綻している。機能不全に陥ったカルシウムチャネルおよびカルシウムの漏出が生じるリアノジン受容体（RyR）を介して、細胞質に流入するカルシウム量が増加する^22,23。また、SERCA活性の低下により、細胞質から排出されるカルシウム量も減少する。

カルシウム調節は、1980年代初頭からDMDの治療標的とされてきた²⁴。しかし、カルシウムチャネルを遮断する薬剤の臨床的効果は、ヒト臨床試験で確認されていない²⁵。最近、カルシウムの漏出が生じるRyRが細胞質への過剰なカルシウムの流入の主要な原因であると認識されるようになり、研究者らはRyRを安定化する化学物質の探索を始めている^22,26。

カルシウムのホメオスタシスを回復させるもう1つの方法として、SERCAによるカルシウムの取り込みを促進することが挙げられる。これは、SERCA活性を調節するか、SERCAをより多く発現させることによって達成できると考えられる。抑制性SERCA制御因子（ホスホランバンやサルコリピンなど）を抑制すると、ハムスターの肢帯型筋ジストロフィーモデルにおいては心不全が抑制され、マウスのDMDモデルにおいてはジストロフィー表現型が改善されることが示されている^27-29。また、SERCAの過剰発現については、SERCA1aまたはSERCA2aを用いた試験が行われている。3つの別々の研究グループで、トランスジェニック技術または新生仔へのAAV遺伝子導入により、マウスのDMDモデルにおけるSERCA1aの発現上昇の検討が行われた^30-32。これらの研究で、骨格筋におけるカルシウムの取り込み、組織学的検査および機能に有意な改善が認められた。ヒトSERCA2aベクターを12ヶ月齢のmdxマウスに投与したところ、20ヶ月齢時のECGパラメータのいくつかに有意な改善が認められた³³。また、同じヒトSERCA2aベクターを用いて肢帯型筋ジストロフィー新生仔マウスの骨格筋で試験を行ったところ、筋変性と筋再生の繰り返しの有意な抑制が確認された³⁰。

しかし、このような結果が得られているものの、現在進行中のDMD遺伝子治療試験で標的とする年齢と同等の月齢で治療を開始した場合、SERCA投与により、骨格筋と心臓の両方に長期的な保護がもたらされるかについては不明であった¹⁰。このことを念頭に置き、本明細書で開示される実験では、ヒトの10代男児と同等の月齢のmdxマウスを対象とした³⁴。投与マウスに対しては、予想される寿命を迎えるまで追跡調査を行い、骨格筋と心筋の両方のアウトカムを評価した。効果的なDMD治療として確立されるためには、骨格筋と心筋の両方が生涯保護されることが必要であるため、すべての横紋筋の長期的な追跡調査は重要である³⁵。さらに、DMD患者の拡張型心筋症を完全に再現したモデルを使用した³⁶。医療と呼吸支援の改善に伴い、多くの患者が以前よりも長生きできるようになっており、心臓合併症は、DMD患者の主な死亡原因となっている³⁷。本明細書に開示される実施形態は、表現型モデルにおける心臓への効果（特に血液ポンプ機能）に焦点を当てている。さらに、SERCA1は野生型動物の心臓では発現していないため、SERCA1の代わりにSERCA2aを使用した。SERCA2aは、骨格筋と心筋の両方の治療に用いることができるため、治療標的としてより優れている。また、数百人のヒト心不全患者で優れた安全性プロファイルが確認されているヒトSERCA2aベクターを使用した^38-40。

全身の筋機能（前腕握力とトレッドミルのパフォーマンス）、心臓電気生理（ECG）、および心臓収縮性（血行動態）に有意な改善が認められた。さらに、SERCA2a投与により、骨格筋病態は抑制されなかったが、心筋リモデリングと線維化は効果的に抑制された。この矛盾を明らかにするためにはさらなる研究が必要であるが、おそらくAAV投与のタイミングによるものであると考えられる。3ヶ月齢のmdxマウスでは、骨格筋疾患は顕著に見られるが、心臓病態は認められない^41,42。SERCA2a投与は、組織損傷の発症後よりもむしろ発症前に、より効果的に作用する可能性がある。この考えを裏付けるように、トランスジェニックマウスの子宮内でSERCAの発現を開始した実験、あるいは新生仔マウスにAAV SERCAベクターを送達した実験において、骨格筋の組織学的検査で有意な改善が見られている^30,31。また、12ヶ月齢のmdxマウスにSERCA2aを投与しても、心筋の線維化は抑制されなかったという結果もある³³。

握力およびトレッドミル走力は改善したものの（図4A-4B、図5A-5C）、骨格筋の組織学的検査における改善は認められなかった（図6A-6E、図7A-7E）。しかし、筋機能の改善は、筋肉病態の改善とは無関係に起こりうる⁴⁷。

方法および材料
実験動物
すべての動物実験は、「動物の管理と使用に関する委員会（IACUC）」の承認を得ており、NIHガイドラインに準拠するものである。C57/BL10（野生型コントロール、stock no. 000476）およびジストロフィン欠損mdxマウス（stock no. 001801）は、The Jackson Laboratory社（米国ミネソタ州バーハーバー）から繁殖用マウスを購入して、バリア施設内で作出した。

DMD心疾患の典型的な症状は、拡張型心筋症である。心筋障害は、mdx、mdx4cv、mdx5cv、D2-mdx、ユートロフィン／ジストロフィンダブルノックアウトマウス、ユートロフィンヘテロ接合型mdxマウス、Cmah／ジストロフィンダブルノックアウトマウス、MyoD／ジストロフィンダブルノックアウトマウス、インテグリン／ジストロフィンダブルノックアウトマウスなど、さまざまなDMDマウスモデルで認められている。しかし、拡張型心筋症は、老齢雌性mdxマウス¹⁷、老齢雌性mdx4cvマウス⁴⁸、MyoD／ジストロフィンダブルノックアウトマウス⁴⁹でのみ報告されている。MyoD／ジストロフィンダブルノックアウトマウスは、DMD患者とは遺伝的に異なる。このマウスには、ジストロフィン遺伝子のヌル変異に加えて、MyoD遺伝子のヌル変異もある。さらに、MyoD／ジストロフィンダブルノックアウトマウスは入手不可である。老齢雌性mdxマウスと老齢雌性mdx4cvマウスの心疾患の重症度は同程度であることから、老齢雌性mdxマウスを使用した^16,17。雌性マウスを使用しても、この研究のトランスレーショナルな意義が低下することはないと考える。両方のX染色体に存在するジストロフィン遺伝子の活性が失われた女児では、DMDに特徴的な表現型が現れる。罹患した男児を治療するために開発された治療法は、罹患した女児にも同様に有効であると考えられ、その逆もまた然りである。機能測定のサンプルサイズの概要を表3に示す。

AAVの作製および送達
cis SERCA2aパッケージングプラスミドは、既報のコンストラクトを改変したものである^33,39。具体的には、FlagタグをヒトSERCA2a cDNAのC末端にインフレームで融合させたコンストラクトを作製した。SERCA2aの発現は、サイトメガロウイルスプロモーター、ハイブリッドイントロン、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルによって制御される。我々が公開したプロトコールに従って、AAV9ベクターを作製・精製し、力価測定を行った⁵⁰。1匹あたり合計6×10¹²vgのAAV9 SERCA2aベクターを、3ヶ月齢のmdxマウスに意識下で尾静脈投与した。

形態学的検査
Flagタグ付加ヒトSERCA2aは、Flagタグに対するモノクローナル抗体（1：500、Sigma-Aldrich、Cat. No. F1804、クローンM2）を用いて、免疫染色で確認した。ラミニンは、ポリクローナル抗体（1：200、Sigma-Aldrich、Cat. No. L9393）で検出した。一般組織学的検査は、ヘマトキシリンエオジン染色により行った。線維化は、マッソントリクローム染色で調べた⁵¹。スライドの観察は、Nikon E800蛍光顕微鏡を用い、同一の露光設定で行った。顕微鏡写真は、QImaging Retiga 1300カメラで撮影した⁵¹。心臓（全体）の切片の線維化面積と筋線維の断面積（CSA）は、マッソントリクローム染色した画像からPhotoshopソフトウェアの自由選択ツールを用いて定量化した³⁵。以下方法を簡単に説明する。Photoshopの計測スケールの設定オプションでマイクロメートルスケールを選択した。線維化領域にクイック選択ツールで印をつけた。すべての線維化領域の面積の合計を、心臓全体の断面積（CSA）に対するパーセント値で表した。筋線維CSAの測定では、マイクロメートルスケールを選択し、クイック選択ツールで個々の線維の外周に印をつけた。次いで、CSAをPhotoshopで計算した。

SRへのカルシウムの取り込み
SRへのカルシウムの取り込みは、ミリポアろ過法により測定した²⁸。以下方法を簡単に説明する。約150mgの全タンパク質抽出物を、1.5mLのCa²⁺取り込み培地（40mmol/Lイミダゾール[pH7.0]、100mmol/L KCl、5mmol/L MgCl₂、5mmol/L NaN₃、5mmol/Lシュウ酸カリウム、0.5mmol/L EGTA）に加え、様々な濃度のCaCl₂（0.03～3mmol/L遊離Ca²⁺（1mCi/mmol ⁴⁵Ca²⁺を含む））の存在下、37℃でインキュベートした。SRへのCa²⁺取り込みの最大刺激を得るために、ルテニウムレッドを最終濃度1mmolになるように添加した後に基質を添加して、Ca²⁺取り込みを開始させた。ATPを最終濃度5mmolになるように添加して反応を開始した。1分後に反応液をろ過して反応を停止させた。アッセイは、N=2で行った。SRへのCa²⁺取り込み速度と50%有効濃度に必要なCa²⁺濃度（EC50）は、GraphPad Prismソフトウェアバージョン7.0を用いて、非線形曲線フィッティング解析により求めた。

SR分画
SR分画は、特に指定がない限り、4℃で調製した。以下方法を簡単に説明する。1mLの氷冷したバッファーA（pH7.0；10mMイミダゾール、0.3Mスクロース、0.5Mジチオスレイトール[DTT]、40mM CaCl₂、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル；Roche、米国インディアナ州インディアナポリス）に摘出した組織（約25～40mg）を加え、ホモジナイズした。得られた粗溶解液を3,000×gで20分間遠心した。再度、ホモジナイズと遠心分離を行った。上清を10,000×gで20分間遠心した。得られた上清を5mLのベックマンチューブに移し、KClをバッファーA中で最終濃度が0.5mMになるように加えた。溶解液を氷上で20～30分間、時々攪拌しながらインキュベートした。次いで、各サンプルを245,419×gで40分間遠心した。得られたペレットをバッファーB（pH7.5；20mM Tris、0.3Mスクロース、0.6M KCl、0.5mM DTT、40mM CaCl₂）に再懸濁し、245,419×gで40分間遠心した。さらに、ペレットを再懸濁バッファー（pH7.0；10mMイミダゾール、0.3Mスクロース、0.25mM DTT、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁した。タンパク質濃度は、DCプロテインアッセイキット（Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュレス）を用いて測定した。

ウェスタンブロット法
心臓と筋肉の全溶解液は、既報の方法と同様にして調製した¹⁴。以下方法を簡単に説明する。各組織を液体窒素中で瞬間凍結した後、凍結組織サンプルを液体窒素中で細かく粉砕し、10%ドデシル硫酸ナトリウム、5mMエチレンジアミン四酢酸、62.5mM Tris-HCl（pH6.8）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche、米国インディアナ州インディアナポリス）を含むバッファーを加えてホモジナイズした。粗溶解液を95℃で3分間加熱し、氷上で2分間冷却した後、16,000×gで2分間遠心した。上清を全筋肉溶解液として回収した。タンパク質濃度は、DCプロテインアッセイキット（Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュレス）を用いて測定した。SERCA2aポリクローナル抗体（1：2,500、Badrilla、英国リーズ、Cat. No. A010-23S）は、内因性SERCA2aとヒトSERCA2aの両方を検出する。ヒトSERCA2aの発現は、抗Flag抗体（1：500、Sigma、米国ミズーリ州セントルイス、Cat. No. F1804、クローンM2）を用いて確認した。ウェスタンブロットの定量は、LI-COR Biosciences Image Studioソフトウェアバージョン5.0.21（https://www.licor.com）を用いて行った。それぞれのタンパク質のバンド強度は、同様にブロットした対応するローディングコントロールに対して標準化した。さらに、このバンド相対強度を野生型コントロールに対して標準化した。まず、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（1：3,000、Millipore、米国マサチューセッツ州ビレリカ、Cat. No. MAB374、クローン6C5）をローディングコントロールとして用いて、心臓全溶解液のウェスタンブロットを行った（図1G、図1H）。この実験の定量データを図1D（右パネル）に示す。また、心臓のSERCA2に対するウェスタンブロットを、ローディングコントロールとしてビンキュリン（1：2,000、Abcam、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、Cat. No. Ab155120）を用いて再度行った。この実験の代表的なデータを図1D（左パネル）に示す。骨格筋全溶解液のウェスタンブロットを、ローディングコントロールとしてビンキュリンを用いて行った（図2A）。

トレッドミル走行試験
トレッドミル持久力測定は、既報の方法と同様にして行った⁵²。以下方法を簡単に説明する。まず、マウスを7°の上り傾斜のあるトレッドミル（Columbus Instruments、米国オハイオ州コロンバス）で5日間馴化させた。毎日、馴化プロトコールとして、まず、マウスを動いていない平坦なトレッドミルに2分間載せた後、7°の上り傾斜のトレッドミルに5分間載せた。走行馴化は、すべて7°の傾斜トレッドミルのみで行った。初日は、5m/minで15分間、続いて10m/minで5分間走行させた。2日目は、5m/minで5分間、10m/minで15分間、12m/minで5分間の順でマウスを走行させた。3日目は、5m/minで5分間、10m/minで15分間、12m/minで10分間、マウスを走行させた。4日目と5日目は、5m/minで5分間、10m/minで20分間、12m/minで5分間、15m/minで5分間、マウスを走行させた。走行距離は6日目に測定した。距離測定当日、マウスを動いていないトレッドミルに2分間載せた後、5m/minで5分間走行させた。その後、5分ごとにトレッドミルの速度を1m/minずつ上げた。総走行距離は、マウスが疲労困憊した時点で算出した。疲労困憊は、動物が走るのをやめて、トレッドミルに再び入ろうとせず、ショッカー（最小設定）と接触した状態のまま通常1～3秒経過した時点で判定される。走行しなかった動物は解析から除外した。

血清CK活性測定
尾静脈採血により新鮮な血清を得た。CK活性は、Stanbio Laboratory社（米国テキサス州ベルネ）のCK liqui-UVテストキットを用い、メーカーの指示書に従って測定した。

前肢握力測定
前肢握力は、既報の方法と同様にして、コンピュータ制御式握力計（Columbus Instruments、米国オハイオ州コロンバス）を用いて測定した^43,53。この握力計は、力変換器に取り付けられた引っ張り棒とデジタルディスプレーとを備えている。まず、マウスを約5分間装置に慣らした。次いで、マウスの尾の先を持って、マウスに引っ張り棒を掴ませた。グリップバーから離れる方向にマウスを優しく引っ張った。マウスがバーをつかめなくなった時点で、測定値を記録した。このプロトコールを、少なくとも30秒の休息を挟んで5回繰り返した。測定値の高い方から上位3つの値を平均し、絶対握力とした。標準化握力は、絶対握力を体重で除して求めた。

ECGおよび血行動態測定
心機能は、公開されているプロトコールを用いて評価した^54,55。具体的には、AD Instruments社（米国コロラド州コロラドスプリングス）の市販のシステムを用いて、12誘導ECG測定を行った^51,56。Q波の振幅は、リードIのトレースを用いて決定した。その他のECGパラメータは、リードIIのトレースを用いて解析した。QTc間隔は、QT間隔を心拍数で補正して求めた⁵⁷。心筋症指数は、QT間隔をPQ部分で除して算出した⁵⁸。左室血行動態は、既報の方法と同様にして、閉胸式アプローチにより評価した^51,54。得られた圧容積（PV）ループは、PVANソフトウェア（Millar Instruments、米国テキサス州ヒューストン）を用いて解析した。また、心臓弛緩時定数（Tau）を算出した⁵⁹。また、体表面積も算出した⁶⁰。

免疫染色による筋線維型の評価
各筋線維型の一次抗体は、アイオワ大学のDevelopmental Studies Hybridoma Bank（DSHB）から入手した。具体的には、I型筋線維は、一次抗体としてBA-D5（1：5）と二次抗体としてAlexa Flour 350ヤギ抗マウスIgG2b（1：50、Invitrogen、Cat. No. A21140）を用いて検出し、IIa型筋線維は、一次抗体としてSC-71（1：10）と二次抗体としてAlexa Flour 594ヤギ抗マウスIgG1（1：100、Invitrogen、Cat. No. A21125）を用いて検出した。IIb型筋線維は、一次抗体としてBF-F3（1：10）と二次抗体としてFITCヤギ抗マウスIgM（1：100、Jackson ImmunoResearch、Cat. No. 115-095-075）を用いて検出した。ラミニンは、ポリクローナル一次抗体（1：200、Sigma-Aldrich、Cat. No. L9393）と二次抗体としてヤギ抗ウサギIgG Alexa Flour Plus 647（1：100、Invitrogen、Cat. No. A32733）を用いて検出した。定量化するために、各組織から蛍光チャネルごとに無作為に5枚の画像を収集し、ImageJを用いて重ね合わせた。計数は、ImageJのマルチポイントツールを用いて行った。結果をExcelにエクスポートし、パーセント計算を行った。

統計分析
データは、平均値±平均値の標準誤差で示した。生理学的アッセイについては、個々の被験体のデータを散布図で示した。一元配置分散分析とTukeyの多重比較分析は、GraphPad Prismソフトウェアバージョン7.0 for Mac OSX（GraphPad、米国カリフォルニア州ラホヤ）を用いて行った。p<0.05の場合に、統計的に有意であるとみなした。

実施例2：In vitroヒト心室筋組織モデル
DMD由来iPS細胞の心筋細胞への分化
DMD患者由来のヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）をヒト心室筋細胞（hvCM）に直接分化誘導し、心室サブタイプのhiPSC由来CMを90%を超える収率で得る（Weng, Z., et al. (2014). Stem Cells Dev 23: 1704-1716）。以下方法を簡単に説明する。hiPSCを単一細胞に分散し、1ng/ml骨形成タンパク質4（BMP4）含有mTeSR1を加えた超低接着プレートで、低酸素条件下、一晩培養して細胞クラスターを形成させる。1日目から4日目まで、細胞クラスターを、5%O₂の低酸素条件下、GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）を加えたStemPro-34培地中、50μg/mlアスコルビン酸（Sigma-Aldrich）、10ng/mlアクチビンA、10ng/ml BMP4および10μM ROCK阻害剤Y-27632で処理する。分化後4～8日目に、低酸素条件下の細胞クラスターを、StemPro-34培地中、50μg/mlアスコルビン酸と5mM IWR-1で処理する。8日目以降は、50μg/mlアスコルビン酸を含む1×B27サプリメント（Thermo Fisher Scientific）含有RPMI1640培地を使用して、細胞クラスターを正常酸素条件下で維持する。

ヒト心室筋組織片（hvCTS）の収縮性評価
3次元多細胞心筋組織hvCTSを作製し、既報の方法と同様にして収縮活性を測定することにより、hvCMの収縮性とその動態を評価する（Turnbull, I. C., et al. (2014). FASEB J 28: 644-654; および Cashman, T. J., et al., (2016). J Vis Exp 109: e53447）。以下方法を簡単に説明する。hiPSCの心筋への分化誘導開始から15～16日目に得られた心筋球（cardiosphere）を単一細胞に分散し、1×B27、50μg/mlアスコルビン酸および10μM ROCK阻害剤Y-27632を含有するRPMI1640に加えてインキュベーター内で3日間回復させた後、hvCTSを作製する。hvCTSを作製するために、hiPSCから分化誘導した心筋細胞1.0×10⁶個とヒト包皮線維芽細胞1.0×10⁵個を、2mg/ml I型コラーゲン（Thermo Fisher Scientific）、0.80～0.95mg/mlマトリゲル、15mM NaOH、0.9×最小必須培地（Sigma-Aldrich）、25mM 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸（HEPES）および0.1×hvCTS維持培地からなる氷冷溶液100μlに加える。この細胞・コラーゲン混合物100μlを、長方形のウェルの両端に力感知カンチレバーポストを配置したPDMS（ポリジメチルシロキサン）バイオリアクターに加え、インキュベーターに戻して、両端のポスト間に付着したhvCTSを形成させる。得られたhvCTSを10%新生仔ウシ血清（Gibco）を加えたDMEM培地で維持する。組織作製後7～8日目に試験に使用できるようになるまで、2～3日ごとに培地を半分ずつ交換しながら維持する。

測定当日、hvCTSの収縮振幅を、HEPESバッファーを含むhvCTS維持培地中、37℃で、温度制御された加熱プレート上に配置された、カンチレバーポストの変位を記録する特注のポスト追跡方式収縮力測定システムを用いて測定する。試験中、hvCTSに異なる周波数の電場刺激を与えて、ペーシングを行う。力の発生および収縮動態を、特注のデータ処理・解析ソフトウェアで解析する。

AAV1.SERCA2aを用いた感染
AAV1.CMV.SERCA2aは、筋小胞体カルシウムATPaseポンプ（SERCA2a）の心臓型アイソフォームを駆動するCMVプロモーターを含む組換えアデノ随伴ベクター血清型1型である。1.0×10¹²ウイルスゲノム（vg）/mlの濃度のAAV1.SERCA2aの溶液を使用する。DMD由来ヒト心室筋組織片（hvCTS）へのAAV1.CMV.SERCA2aの形質導入は、0.1μl、1μl、10μlまたは100μlのベクター溶液を添加することにより行う。ヒトDMD由来hvCTSにウイルス液を0日間、2日間、4日間、7日間または14日間接触させ、各時点でヒトDMD由来hvCTSを用いて、後述する全パラメータを測定し、0日目の形質導入前の測定値と比較する。さらに、DMD-hvCTSに導入されたAAV1.GFP（緑色蛍光タンパク質）ウイルスを、各時点でのコントロールとして用いる。測定したパラメータは、発生力、標準化した発生力、速度変動、力変動、力-頻度関係およびβアドレナリン作動性反応である。AAV1.GFPを導入したDMD-hvCTSでは、これらすべてのパラメータに異常が見られ、AAV1.SERCA2aを導入したDMD-hvCTSでは、これらの異常が改善されると予想される。

hvCTS収縮性解析
測定日に各hvCTSを側面から撮影する。ImageJ（NIH）の画像解析により、PDMSポストの高さと組織の平均高さを求める。特注のMATLABデータ処理実行ファイルを用いて、測定したhvCTSの収縮振幅を力の発生に変換する。この力に関するデータを別のMATLABデータ解析ソフトウェアでまとめて解析を行い、可視化する。

実施例3：DMD治療の臨床試験
目的
DMDによる二次性心筋症を有する被験者における、SRD-001（AAV1/SERCA2a）の安全性と有効性を評価するため、第2相無作為化二重盲検プラセボ対照試験を行う。主要目的：DMDによる二次性心筋症を有する被験者に、SRD-001を単回冠動脈内投与し、安全性と有効性を評価する。副次目的：SRD-001が骨格筋機能とQOLに及ぼす影響を評価する。

試験デザイン
この第2相多施設共同無作為化二重盲検プラセボ対照試験は、DMDによる二次性心筋症を有する、抗AAV1中和抗体（NAb）陰性の被験者に対して、SRD-001の順行性心外膜冠動脈注入による単回投与を行い、その安全性と有効性を評価するものである。SRD-001は、筋小胞体／小胞体Ca²⁺ ATPアーゼ2aアイソフォーム（SERCA2a）の導入遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス血清型1型（AAV1）ベクターである。

方法
遺伝子検査によりDMDと臨床診断され、心筋症の所見が認められた被験者は、インフォームド・コンセントの後、無作為化を行うまでの30日間のスクリーニング期間中に、一連の検査と処置を受ける。これにより、被験者の適格性を判定し、特定のパラメータに関するベースライン測定を行う。そして、合計50名の適格被験者をSRD-001またはプラセボのいずれかに1：1の割合で無作為に割り付ける。

1日目、被験者に左心カテーテル検査を併用しない診断用血管造影を行い、その後、禁忌でない限り、左心室の3つの主要な心領域（前方、側方、下方／後方）に送達されるように治験薬の順行性心外膜冠動脈注入による単回投与を行う。処置の前後は、少なくとも4時間被験者を継続的にモニターし、処置前後の合併症で一晩入院が必要な場合を除き、その日のうちに被験者を帰宅させる。

24ヶ月間の試験期間中、あらかじめ指定した診察日に被験者に対して追跡調査を行う。1週目に電話による評価を行い、臨床的な指示があれば、可能な限り早い時期に対面による確認や評価を行う。2週目、1ヶ月目、3ヶ月目、6ヶ月目、12ヶ月目、18ヶ月目および24ヶ月目に、被験者に対して、身体検査、臨床検査、12誘導心電図（ECG）測定、有害事象（AE）の収集、また、12ヶ月目と24ヶ月目のみガドリニウム遅延造影（LGE）心臓MRIを実施し、一連の安全性評価および有効性評価を行う。さらに、6ヶ月目、12ヶ月目、18ヶ月目および24ヶ月目に、被験者に対して、上肢機能評価尺度バージョン2.0（Performance of Upper Limb version 2.0：PUL2.0）、握力、鍵つまみ力と指尖つまみ力、肘屈曲力、および歩行可能な場合は10m歩行／走行時間とノーススター歩行能力評価により評価される骨格筋機能；肺機能；ならびにDMDの上肢に関する患者報告アウトカム尺度（DMD Upper Limb Patient-Reported Outcome Measures：DMD UL-PROM）と小児のアウトカムデータ収集質問紙（Pediatric Outcomes Data Collection Instrument：PODCI）により評価されるQOLの判定を行う。24ヶ月目の診察時で、各被験者に対する本試験は終了する。図9に第2相試験計画の概略を示す。

評価項目
有効性の主要評価項目：
ガドリニウム遅延造影（LGE）心臓MRIにより評価した左室構造および左室機能のベースラインから12ヶ月目および24ヶ月目までの以下の変化：左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、1回拍出量、円周方向ストレイン、局所壁厚、左室LGEを左室心筋重量に対するパーセント値とグラム単位で表したもの、左室生存心筋重量をグラム単位で表したもの、およびLGEが認められる左室セグメント数。
有効性の代替主要評価項目：
左室機能（LVESV）、PUL2.0、肺機能（パラメータを1つ選択）、QOLおよび最終事象のベースラインから12ヶ月目および24ヶ月目までの変化における複合アウトカム
有効性の副次評価項目：
ベースラインから6ヶ月目、12ヶ月目、18ヶ月目および24ヶ月目までの以下の変化：
（a）PUL2.0、握力、鍵つまみ力と指尖つまみ力、肘屈曲力、歩行可能な場合は10m歩行／走行時間（10MWRT）、10MWRT>30秒と定義される歩行不能の発生率、およびノーススター歩行能力評価（NSAA）により評価される骨格筋機能；
（b）安静時肺活量（SVC）、1秒間の努力呼気量（FEV1）、努力肺活量（FVC）、最大呼気流量（PEF）、最大吸気圧（MIP）、最大呼気圧（MEP）、咳嗽時最大呼気流量（PCF）および予備吸気量（IFR）により評価される肺機能；ならびに
（c）DMD UL-PROMとPODCIにより評価されるQOL。

安全性の主要評価項目：
1日目から24ヶ月目までの以下の発生率：全死因死亡、重篤な有害事象、治験薬または投与処置に関連して治療中に発生した有害事象、および細胞性免疫反応。
安全性の副次評価項目：
1日目から24ヶ月目までの全有害事象の発生率および重症度。

診断および主な選択基準
試験の主要目的および副次目的には、50名のサンプルサイズが適切であると考えられる。被験者数（予定）：最大N=50。

DMDを有し、心筋症の所見が認められた被験者の試験参加資格は以下のように評価する。
1. 無作為化後60日以内の抗AAV1中和抗体力価が<1：2または不明。
2. 同意時に10歳以上の男性被験者。
3. 18歳以上の場合、試験参加のインフォームド・コンセントを提供する意思と能力があること。18歳未満の場合、親または保護者のインフォームド・コンセントによる承認が得られること。
4. DMDに一致する臨床症状および表現型（例えば、DMDの家族歴、クレアチニンキナーゼの上昇、ジストロフィン筋生検、腓腹筋仮性肥大、ガワーズ徴候および／または7歳未満の体重増加障害）と、認定検査機関で実施された確定遺伝子検査とに基づいてDMDの診断を受けた被験者。該当する場合は、18歳の誕生日を迎えるまでに自立歩行が不能になった被験者。ただし、介助なしでの立ち上がりや、数歩程度の自立歩行は歩行とはみなされない。
5. 心臓MRIによる評価で、少なくとも4つのセグメントにガドリニウム遅延造影による左室瘢痕を有し、スクリーニング時の左室駆出率が40%未満である心筋症。
6. PUL2.0で特定のスコアを有する。
7. 歩行可能な場合、10m歩行／走行速度が1m／sec未満。
8. 実績豊富な多職種連携型のDMDセンターにおいて、定期的な心臓と肺のモニタリング、グルココルチコイドの全身性投与、自宅での可動域訓練などの標準治療を受けている。
9. 無作為化前の少なくとも12ヶ月間、全身性グルココルチコイド療法を受けており、無作為化前の少なくとも6ヶ月間、体重に応じた用量調整または毒性によるステロイド用量の10%以下の減少を除いて用量が安定している。
10. 禁忌でない限り、年1回のインフルエンザ；髄膜炎菌と髄膜炎菌B；破傷風・ジフテリア・百日咳（Tdap）；および肺炎球菌多糖体などの現行かつ最新の予防接種を受けている。
11. 治験薬投与後6ヶ月間は、ウイルス排出からパートナーを守るため、性交渉の際のコンドームと殺精子剤の使用に同意すること。
12. 妊娠可能なパートナーが、治験薬投与後6ヶ月間、妊娠を避けるために適切な避妊（経口避妊薬、注射避妊薬、子宮内避妊具もしくは外科的不妊手術、および／またはコンドームと殺精子剤の併用）を行うことに同意すること。
13. 治験責任医師が、試験計画の要件を遵守する意思と能力があると判断した被験者。

主な除外基準
以下の基準のいずれかに該当する被験者は、試験から除外する：
肘屈曲拘縮が両肢で30°を超える、肥満度が45を超える、ジストロフィン遺伝子のエクソン44スキップが適応となる変異を有する、またはエクソン307など（これに限定されない）のジストロフィン欠失変異を有するなどのDMDを有する被験者。
その他の除外基準は以下の通りである。
1. スクリーニング前または登録前30日以内に循環作動薬、血管拡張薬または利尿薬の静脈内投与を受けた。
2. 拘束型心筋症、肥大型心筋症、急性心筋炎、心膜疾患、アミロイドーシス、浸潤性心筋症、未治療の甲状腺疾患、または限局性左室（LV）瘤を有する。
3. スクリーニング前30日以内に心臓手術、経皮的冠動脈インターベンション（PCI）、弁形成術または弁置換術を受けた。
4. スクリーニング前90日以内に心筋梗塞（例えば、ST上昇型心筋梗塞［STEMI］または広範囲非ST上昇型心筋梗塞）を発症した。広範囲非ST上昇型心筋梗塞とは、クレアチンキナーゼ検査（CK-MB）で正常値上限（ULN）の3倍を超える値、またはトロポニンでULNの5倍を超える値と定義する。
5. 心臓移植、左室縮小形成術（LVRS）、心筋形成術、受動拘束型装置（例えば、心臓補助装置CorCap（登録商標））、機械的循環補助装置（MCSD）、または心臓シャント術の既往がある。
6. 治療後6ヶ月以内に心臓再同期療法、心筋形成術、LVRS、通常の血行再建術または弁修復術を受ける可能性が高い。
7. 血行動態が不安定なため、早急に心臓移植またはMCSD植込みが必要になる可能性が高い。
8. 血管造影に使用されるX線不透過性薬剤に対する既知の過敏症がある。血管造影を行う前に、高用量のコルチコステロイド前処置の既往があるか、または当該処置が必要になる可能性が高い。
9. 治験責任医師の所見から、左冠動脈主幹部または右冠動脈入口部に顕著な内腔狭窄が認められる。
10. 肝機能検査（アラニンアミノトランスフェラーゼ［ALT］、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ［AST］、アルカリホスファターゼ）で>3×ULNであるか、総ビリルビンが>2×ULNであるか、または既知の内在性肝疾患（例えば、肝硬変、慢性B型肝炎ウイルス感染もしくはC型肝炎ウイルス感染）を有する。
11. 現在血液透析を受けているか、12ヶ月以内に血液透析が必要となる可能性が高いか、または、MDRD（Modification of Diet in Renal Disease）の計算式で求められる推定糸球体濾過量（GFR）が20mL/min/1.73m²以下である。
12. 出血性素因があるか、または、血小板数＜75,000/μLと定義される血小板減少症を有する。
13. ヘモグロビン<9g/dLと定義される貧血を有する。
14. 以下に該当する肺機能不全を有する：
a. FVCの予測値が<35%である。
b. スクリーニング時の組合せ検査で、FVCとPEFの測定値がそれぞれ±15%の範囲内に収まらない。
c. 治験責任医師が、近い将来に呼吸不全を起こす危険性があると判断した場合、またはスクリーニング時の血清中の重炭酸塩が29mmol/L以上と定義される非侵襲的人工呼吸器による補助を開始する必要がある基準を満たすと判断した場合。
d. 継続的または間欠的な治療を必要とする、DMDとは無関係の慢性呼吸器疾患（例えば、以下に限定されないが、喘息、気管支炎および結核など）の既往歴がある。
e. スクリーニング前30日以内に急性呼吸器疾患に罹患した場合。
f. スクリーニング前30日以内に非侵襲的人工呼吸療法を開始した場合、またはスクリーニング後12ヶ月以内に非侵襲的人工呼吸療法を開始する必要があると予想される場合。
15. 無作為化後12ヶ月以内に胸部もしくは脊椎の手術、または歩行可能な場合は下肢の手術を受ける予定があるか、当該手術を受けることが予想される場合。
16. 無作為化前3ヶ月以内にメトホルミンまたはインスリンによる治療を開始した場合。
17. 無作為化前3ヶ月以内にヒト成長ホルモン（HGH）の投与を受けた場合（ただし、無作為化前少なくとも24ヶ月間投与量が安定している場合を除く）。
18. 過去5年以内に、外科的切除が治癒的処置とみなされるがん（ただし、基底細胞がんおよびin situがんを除く）と診断を受けたか、その治療を受けた場合（ただし、過去にがんの既往歴があっても、診断・治療後少なくとも5年無病であれば除外されない）。
19. 過去に遺伝子導入試験に参加したことがある。ただし、その試験が盲検化されていない場合、または被験者がプラセボ対照群に無作為に割り付けられ、活性を有する遺伝子導入剤の投与を受けなかったことを示す文書が存在する場合は、試験への参加は可能である。
20. スクリーニング前30日以内または薬物の半減期5日以内に別の治験薬による介入を受けたか、または別の臨床試験に参加した場合。ただし、被験者が、治療目的でない観察研究（レジストリ）、またはスポンサー機関が登録を承認する治療目的研究の観察研究部分に登録されている場合は例外とする。
21. 治験責任医師の所見から、最近被験者に、治験実施計画書に定められた手順を遵守する能力を損なう可能性が高い精神疾患（薬物中毒またはアルコール中毒を含む）の既往が認められる。
22. 治験実施計画書では明確に除外されていないが、被験者の安全または試験の目的を危うくする可能性のあるその他の医学的状態を併発している。

治験薬、投与量および投与方法
市販のガイドカテーテルまたは診断用心臓カテーテルとB. Braun Perfusor（登録商標） Spaceシリンジポンプを用い、300mL/hrの流速で10分間にわたり、3×10¹³vgのSRD-001を順行性心外膜冠動脈注入により左冠動脈および／または右冠動脈に投与する。ニトログリセリンの静脈内注入を、SRD-001の注入前および注入と同時に、最大耐量で最低10分間行う。

治療期間
単回冠動脈内注入。

参照とする治療法、投与量、投与方法
SRD-001と同じ添加剤を配合した、AAV1/SERCA2a活性成分を含まないプラセボ薬を、市販のガイドカテーテルまたは診断用心臓カテーテルとB. Braun Perfusor（登録商標） Spaceシリンジポンプを用い、300mL/hrの流速で10分間にわたり、順行性心外膜冠動脈注入により左冠動脈および／または右冠動脈に投与する。ニトログリセリンの静脈内注入を、プラセボの注入前および注入と同時に、最大耐量で最低10分間行う。

評価基準
有効性：
LGE心臓MRI、PUL2.0、鍵つまみ力と指尖つまみ力、肘屈曲力、10MWRTとNSAA（歩行可能な場合）、肺機能、[NT-proBNP]、およびDMD UL-PROMとPODCIにより評価されるQOL。

安全性：
被験者の処遇（入院の要否）、有害事象（AE）、併用薬、臨床検査（全血球数［CBC］、白血球［WBC］分画、血小板数、血清生化学検査による基礎代謝パネルと総合肝パネル、乳酸脱水素酵素［LDH］および尿酸）、トロポニンT、酵素結合免疫スポット（ELISpot）、尿検査、身体検査（体重測定を含む）とバイタルサイン、ならびに12誘導心電図（ECG）測定。

統計的手法
解析集団：
治療企図集団（ITT）とは、試験で無作為化された全被験者であり、無作為化された治療割り付けに従って集計・解析される。修正ITT（mITT）集団は、試験で実際に治療を受けたすべての被験者であり、無作為化された治療割り付けに従って集計・解析される。パープロトコール（PP）集団は、治験データの完全性、正確性および／または信頼性に重大な影響を及ぼすようなプロトコール違反をすることなく、試験で治療を受けた被験者である。安全性集団は、試験で治療を受けた被験者であり、実際に受けた治療に従って集計・解析される。

分析データのカットオフは2回行う。
12ヶ月目：無作為化された全被験者が12ヶ月目の診察を終えた後（それ以前に中止された場合を除く）。
24ヶ月目：無作為化された全被験者が24ヶ月目の診察を終えた後（それ以前に中止された場合を除く）。

安全性と有効性のデータは、ITT集団を対象として記載する。安全性データは、12ヶ月目と24ヶ月目に安全性集団を対象として集計する。有効性解析は、12ヶ月目と24ヶ月目の解析データカットオフ時にmITT集団を対象として行う。また、ITT集団とPP集団を用いた有効性解析も行う。

方法：
集計は、治療群ごと、試験期間中の診察回ごとに行う。カテゴリー変数は、各カテゴリーにおける頻度とパーセント値で集計する。連続変数は、被験者数、平均値、標準偏差、中央値および範囲として集計する。臨床的事象発生率は、患者ごとに1年間の追跡期間中の事象発生数として集計する。臨床的事象発生率に対する治療効果は、最終事象による競合リスクを考慮したセミパラメトリックjoint frailtyモデルによって推定されたハザード比として集計する。

複合アウトカムを用いて、群レベルと被験者レベルの総合的な治療効果を検討する。群レベルの分析では、アウトカムは以下の領域のいずれかに分類される：
1. 心臓の構造的パラメータ：LGE心臓MRI
2. 機能的パラメータ：PUL2.0、握力、鍵つまみ力と指尖つまみ力、肘屈曲力および10MWRT（歩行可能な被験者のみ）
3. 肺パラメータ：肺機能パラメータ
4. バイオマーカー：NT-proBNP（%および絶対変化量）
5. QOLパラメータ：DMD UL-PROMおよびPODCI
6. 臨床アウトカム：最終事象

ベースラインからの変化に対する治療効果は、ベースライン値をコントロールとする共分散分析を用いるか、または関連性の有無を検定するカイ二乗検定（治療群で変化カテゴリーに含まれる被験者が5人未満の場合はフィッシャーの正確検定）を用いて変化スコアの分布を比較することにより解析する。臨床アウトカムに対する治療効果は、joint frailtyモデルを用いて解析する。仮説検定は両側検定とする。

治療群における「成功」領域は以下の基準を満たす領域である。その領域内の少なくとも1つのアウトカムについて、SRD-001の優越性が0.20の有意水準で示され、その領域内の他のアウトカムについて、SRD-001の優越性が記述的に示されること。

SRD-001群で少なくとも2つの「成功」領域が存在し、いずれの領域においても臨床的に有意な悪化（事前に定義されているもの）が認められない場合、群レベルで治験薬による改善が認められたと判断する。

被験者レベルの解析では、各被験者を臨床的に有意に改善（+1）、臨床的に有意に悪化（-1）、または変化なし（0）として各アウトカムをスコア化し、被験者レベルの活性スコアをすべてのアウトカムの合計スコアとして算出する。臨床的に有意な変化は、事前に定義されている。平均スコアに基づく治療効果の検定には、両側t検定を用いる。SRD-001の優越性が0.20の有意水準で認められた場合、被験者レベルで治験薬による改善が認められたと判断する。

SRD-001の活性が「有意」とみなされるのは、SRD-001群における改善（上記で定義した通り）が、群または被験者のいずれかのレベルで検出され、SRD-001群における記述的改善が、群および被験者の両方のレベルで明らかである場合である。この有効性解析は探索的なものであるため、多重性に関する有意水準の調整は行わない。

評価スケジュール
評価のスケジュールを表3に示す。

予想される結果
プラセボ群と比較して、治療群における上記の主要評価項目および／または副次評価項目のうち1つ以上の改善が、6ヶ月目、12ヶ月目、18ヶ月目および24ヶ月目の時点のうち1つ以上で認められる。

表3の略語：
AAV1：アデノ随伴ウイルス血清型1型
ALT：アラニンアミノトランスフェラーゼ
AST：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
BUN：血中尿素窒素
CBC：全血球数
CK-MB：クレアチンキナーゼ検査
DMD UL-PROM：DMDの上肢に関する患者報告アウトカム尺度
d：日数
ECG：心電図
ELISpot：酵素結合免疫スポット
LGE：ガドリニウム遅延造影
LDH：乳酸脱水素酵素
MRI：磁気共鳴画像法
NAb：中和抗体
NSAA：ノーススター歩行能力評価
NT proBNP：脳性ナトリウム利尿ペプチドのN末端プロホルモン
PODCI：小児のアウトカムデータ収集質問紙
PUL2.0：上肢機能評価尺度バージョン2.0
WBC：白血球数
a、スクリーニング前
b、無作為化前
c、治験薬投与前
d、治験薬投与後2～4時間
e、心臓カテーテル検査および治験薬投与から18～30時間以内
f、本試験に関するインフォームド・コンセントは、通常、スクリーニング実施の30日前までに取得する。
g、身長（スクリーニングのみ）、体重、収縮期・拡張期血圧、脈拍および体温
h、AE/SAE報告は、被験者が試験の最初のインフォームド・コンセントに署名した時点から開始する。臨床的事象報告は、被験者が本試験のインフォームド・コンセントに署名した時点から開始する。
i、中央検査室で実施。1日目には、標準治療に従って、心臓カテーテル検査および血管造影のための健康診断として必要な臨床現場即時検査を実施。
j、ELISpotは、所定の時点に加え、臨床的な指示があればいつでも実施可能である。
k、CBC（WBC分画）、ヘモグロビン、ヘマトクリットおよび血小板数
l、基礎代謝パネル（グルコース、ナトリウム、カリウム、塩化物、重炭酸塩、BUN、クレアチニン、カルシウム）、総合肝パネル（アルブミン、アルカリホスファターゼ、総タンパク質、ALT、AST、直接ビリルビン、総ビリルビン）、LDHおよび尿酸
m、機能検査の前に心臓MRIを実施。
n、治験薬の推奨出荷リードタイムに合わせて、1日目より前に無作為化を行う。
o、過去2ヶ月以内に血管造影を実施していない場合は、注入直前に実施し、忍容性がある場合はニトログリセリンの静脈内投与を併用する。
p、2日目に被験者に電話で連絡し、心臓カテーテル検査に関連して起こりうる遅発性の合併症（例えば、穿刺部位からの出血）を評価し、必要に応じて適切な処置を行う。1週目に、被験者に電話で連絡し、一般安全性評価を行う。ただし、臨床的な指示がある場合は、できるだけ早く対面での評価を行うこと。

以下の文献は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される。
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本明細書において、「含む」という語は、「包含する」、「含有する」または「特徴とする」と同義で、包含的またはオープンエンドな語であり、記載されていない他の要素や方法のステップを排除するものではない。

前述の説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示するものである。本発明の方法および材料は、変更することができ、製造方法および器具も変更することができる。このような変更は、本明細書に開示された本発明の実施または本開示を考慮に入れて、当業者であれば容易に理解することができる。したがって、本発明は、本明細書に開示された具体的な実施形態に限定されるものではなく、本発明の真の範囲および精神の内にある変更および代替もすべて本発明に包含される。

本明細書において引用された公開特許出願、非公開特許出願、特許および学術文献を含む（ただしこれらに限定されない）すべての参考文献は、引用によりその全体が本明細書に援用され、本明細書の一部を構成する。参照により援用された刊行物、特許または特許出願が本明細書の開示内容と矛盾する場合、このような矛盾するいかなる事項に対しても本明細書の記載が採用および／または優先される。

Claims (111)

1. 対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する方法であって、
   筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドを対象に投与する工程
   を含む方法。
2. 前記筋ジストロフィーが、前記対象における全身性のジストロフィン欠損を含む、請求項1に記載の方法。
3. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）およびベッカー型筋ジストロフィー（BMD）から選択される、請求項1または2に記載の方法。
4. 前記筋ジストロフィーが、DMDを含む、請求項3に記載の方法。
5. 前記骨格筋ジストロフィーが、心筋リモデリングおよび／または線維化を含む、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
6. 前記治療、前記抑制または前記改善により、前記対象における心筋リモデリングおよび／または線維化が、前記ポリヌクレオチドを投与していない対象より抑えられる、請求項1～5のいずれか1項に記載の方法。
7. 前記SERCAポリペプチドが、SERCA2aポリペプチドを含む、請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
8. 前記ポリヌクレオチドが、ベクターを含む、請求項1～7のいずれか1項に記載の方法。
9. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される、請求項8に記載の方法。
10. 前記ベクターが、AAVベクターを含む、請求項9に記載の方法。
11. 前記AAVベクターが、AAV血清型1～12型のいずれかから選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする、請求項10に記載の方法。
12. 前記AAVベクターが、AAV血清型1型（AAV1）およびAAV血清型9型（AAV9）から選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする、請求項9または10に記載の方法。
13. 前記ポリヌクレオチドが、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項1～12のいずれか1項に記載の方法。
14. 前記プロモーターが、構成的プロモーターを含む、請求項13に記載の方法。
15. 前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含む、請求項13または14に記載の方法。
16. 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスカプシドに包含されている、請求項1～15のいずれか1項に記載の方法。
17. 前記ポリヌクレオチドが、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む、請求項16に記載の方法。
18. 前記対象におけるAAV血清型に対する抗体の有無を判定する工程をさらに含む、請求項1～17のいずれか1項に記載の方法。
19. 前記ポリヌクレオチドの投与が、全身投与を含む、請求項1～18のいずれか1項に記載の方法。
20. 前記ポリヌクレオチドの投与が、静脈内投与を含む、請求項1～19のいずれか1項に記載の方法。
21. 前記ポリヌクレオチドの投与が、冠動脈内注入を含む、請求項1～20のいずれか1項に記載の方法。
22. 前記ポリヌクレオチドの投与が、子宮内投与を含む、請求項1～21のいずれか1項に記載の方法。
23. 前記ポリヌクレオチドの投与が、前記ポリヌクレオチドの単回投与からなる、請求項1～22のいずれか1項に記載の方法。
24. 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスベクターを含み、前記投与が、約1×10⁸ウイルスゲノム数～約1×10¹⁵ウイルスゲノム数の前記ポリヌクレオチドの投与を含む、請求項1～23のいずれか1項に記載の方法。
25. 前記ポリヌクレオチドの投与量が、約1×10¹³ウイルスゲノム数～約9×10¹³ウイルスゲノム数である、請求項24に記載の方法。
26. 血管拡張剤を投与する工程をさらに含む、請求項1～25のいずれか1項に記載の方法。
27. 前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与前に投与する、請求項26に記載の方法。
28. 前記血管拡張剤を前記ポリヌクレオチドの投与と同時に投与する、請求項26または27に記載の方法。
29. 前記血管拡張剤が、ニトログリセリンを含む、請求項26～28のいずれか1項に記載の方法。
30. 前記ポリヌクレオチドを筋組織損傷の発症前に投与する、請求項1～29のいずれか1項に記載の方法。
31. 前記骨格筋ジストロフィーによる筋組織損傷の発症が予測される、請求項30に記載の方法。
32. 前記筋組織損傷が、筋組織学的検査により測定可能である、請求項30または31に記載の方法。
33. 前記対象が、子宮内に存在する、請求項1～32のいずれか1項に記載の方法。
34. 前記対象が、新生児である、請求項1～32のいずれか1項に記載の方法。
35. 前記対象が、少なくとも3歳である、請求項1～32のいずれか1項に記載の方法。
36. 前記対象が、少なくとも5歳である、請求項1～32のいずれか1項に記載の方法。
37. 前記対象が、少なくとも10歳である、請求項1～32のいずれか1項に記載の方法。
38. 前記対象が、20歳以下または15歳以下である、請求項1～32のいずれか1項に記載の方法。
39. 前記対象が、10歳以上20歳以下である、請求項1～32のいずれか1項に記載の方法。
40. 前記対象が、歩行不能である、請求項1～39のいずれか1項に記載の方法。
41. 前記対象の心機能が、筋ジストロフィーでない対象の心機能と比べて低下している、請求項1～40のいずれか1項に記載の方法。
42. 前記対象が、哺乳動物である、請求項1～41のいずれか1項に記載の方法。
43. 前記対象が、ヒトである、請求項1～42のいずれか1項に記載の方法。
44. 前記対象が、雄性である、請求項1～43のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記治療により、未治療の対象の骨格筋ジストロフィーの症状または指標と比べて、前記ポリヌクレオチドの投与後、少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月または12ヶ月の期間にわたって、前記対象の骨格筋ジストロフィーの症状または指標に改善が見られる、請求項1～44のいずれか一項に記載の方法。
46. 前記期間が、少なくとも1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年または10年である、請求項45に記載の方法。
47. 前記治療により、未治療の対象の心組織または心機能と比べて、前記対象の心組織または心機能に改善が見られる、請求項1～46のいずれか1項に記載の方法。
48. 前記治療により、未治療の対象の骨格筋組織または骨格筋機能と比べて、前記対象の骨格筋組織または骨格筋機能に改善が見られる、請求項1～47のいずれか1項に記載の方法。
49. 前記治療により、未治療の対象の心室機能と比べて、前記対象の心室機能に改善が見られる、請求項1～48のいずれか1項に記載の方法。
50. 前記心室機能の改善が、
    ガドリニウム遅延造影（LGE）心臓MRIによって評価される左室構造ならびに左室機能として、左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、1回拍出量および／または円周方向ストレイン、局所壁厚、左室心筋重量に対する左室LGEのパーセント値、左室生存心筋重量、LGEが認められる左室セグメント数などのベースラインからの変化；ならびに
    左室機能（LVESV）のベースラインからの変化における複合アウトカム
    からなる群から選択されるパラメータの改善を含む、請求項49に記載の方法。
51. 前記改善が、
    ガドリニウム遅延造影（LGE）心臓MRIによって評価される左室構造ならびに左室機能として、左室駆出率、拡張末期容積、収縮末期容積、1回拍出量および／または円周方向ストレイン、局所壁厚、左室心筋重量に対する左室LGEのパーセント値、左室生存心筋重量、LGEが認められる左室セグメント数などのベースラインからの変化；
    左室機能（LVESV）、上肢機能評価尺度バージョン2.0（PUL2.0）、選択した肺機能、QOLおよび最終事象のベースラインからの変化における複合アウトカム；ならびに
    以下の項目：
    （a）PUL2.0、握力、鍵つまみ力と指尖つまみ力、肘屈曲力、歩行可能な場合は10m歩行／走行時間（10MWRT）、10MWRT>30秒と定義される歩行不能の発生率、およびノーススター歩行能力評価（NSAA）により評価される骨格筋機能；
    （b）安静時肺活量（SVC）、1秒間の努力呼気量（FEV1）、努力肺活量（FVC）、最大呼気流量（PEF）、最大吸気圧（MIP）、最大呼気圧（MEP）、咳嗽時最大呼気流量（PCF）および予備吸気量（IFR）により評価される肺機能；または
    （c）DMDの上肢に関する患者報告アウトカム尺度（DMD UL-PROM）と小児のアウトカムデータ収集質問紙（PODCI）により評価されるQOL
    のベースラインからの変化
    からなる群から選択されるパラメータの改善を含む、請求項45～50のいずれか1項に記載の方法。
52. 前記期間後に、前記対象の改善の程度を測定することをさらに含む、請求項45～51のいずれか1項に記載の方法。
53. 対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善するための、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドの使用。
54. 対象における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善するための医薬の製造における、筋小胞体／小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドの使用。
55. 前記筋ジストロフィーが、前記対象における全身性のジストロフィン欠損を含む、請求項53または54に記載の使用。
56. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）およびベッカー型筋ジストロフィー（BMD）から選択される、請求項53～55のいずれか1項に記載の使用。
57. 前記筋ジストロフィーが、DMDを含む、請求項56に記載の使用。
58. 前記骨格筋ジストロフィーが、心筋リモデリングおよび／または線維化を含む、請求項53～57のいずれか1項に記載の使用。
59. 前記SERCAポリペプチドが、SERCA2aポリペプチドを含む、請求項53～58のいずれか1項に記載の使用。
60. 前記ポリヌクレオチドが、ベクターを含む、請求項53～59のいずれか1項に記載の使用。
61. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される、請求項60に記載の使用。
62. 前記ベクターが、AAVベクターを含む、請求項61に記載の使用。
63. 前記AAVベクターが、AAV血清型1～12型のいずれかから選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする、請求項62に記載の使用。
64. 前記AAVベクターが、AAV血清型1型（AAV1）およびAAV血清型9型（AAV9）から選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする、請求項62または63に記載の使用。
65. 前記ポリヌクレオチドが、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項53～64のいずれか1項に記載の使用。
66. 前記プロモーターが、構成的プロモーターを含む、請求項65に記載の使用。
67. 前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含む、請求項65または66に記載の使用。
68. 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスカプシドに包含されている、請求項53～67のいずれか1項に記載の使用。
69. 前記ポリヌクレオチドが、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む、請求項68に記載の使用。
70. 前記ポリヌクレオチドが、全身投与用に調整されたものである、請求項53～69のいずれか1項に記載の使用。
71. 前記ポリヌクレオチドが、静脈内投与用に調整されたものである、請求項53～70のいずれか1項に記載の使用。
72. 前記ポリヌクレオチドが、冠動脈内注入による投与用に調整されたものである、請求項53～71のいずれか1項に記載の使用。
73. 前記ポリヌクレオチドが、子宮内投与用に調整されたものである、請求項53～72のいずれか1項に記載の使用。
74. 血管拡張剤と組み合わせた、請求項53～73のいずれか1項に記載の使用。
75. 前記血管拡張剤が、ニトログリセリンを含む、請求項74に記載の使用。
76. 前記対象が、哺乳動物である、請求項53～75のいずれか1項に記載の使用。
77. 前記対象が、ヒトである、請求項53～76のいずれか1項に記載の使用。
78. 前記対象が、子宮内に存在する、請求項53～77のいずれか1項に記載の使用。
79. 前記対象が、乳児である、請求項53～77のいずれか1項に記載の使用。
80. 前記対象が、新生児である、請求項53～77のいずれか1項に記載の使用。
81. 前記対象が、少なくとも3歳である、請求項53～77のいずれか1項に記載の使用。
82. 前記対象が、少なくとも5歳である、請求項53～77のいずれか1項に記載の使用。
83. 前記対象が、少なくとも10歳である、請求項53～77のいずれか1項に記載の使用。
84. 前記対象が、20歳以下または15歳以下である、請求項53～77のいずれか1項に記載の使用。
85. 前記対象が、雄性である、請求項53～84のいずれか1項に記載の使用。
86. 患者における骨格筋ジストロフィーを治療、抑制または改善する治療剤をスクリーニングする方法であって、
    （a）試験薬剤を心室筋組織片に接触させる工程；
    （b）前記試験薬剤と接触させた心室筋組織片の収縮振幅を測定する工程；
    （c）前記試験薬剤と接触させた心室筋組織片の収縮振幅を、前記試験薬剤と接触させていない心室筋組織片の収縮振幅と比較する工程；および
    （d）前記比較に基づいて、前記試験薬剤が前記治療剤を含むと判定する工程
    を含む、方法。
87. 前記心室筋組織片を得るために、
    （i）人工多能性幹細胞の集団を分化誘導して、複数個の心室筋細胞を含む複数個の心筋球を得る工程；
    （ii）前記複数個の心筋球を単一細胞に分散させて、複数個の心筋細胞を得る工程；および
    （iii）心室筋組織片が得られる条件下で、前記複数個の心筋細胞をコラーゲンの存在下、線維芽細胞の集団と接触させる工程
    を行う、請求項86に記載の方法。
88. 前記心室筋組織片を得る工程をさらに含み、該心室筋組織片を得る工程が、
    （i）人工多能性幹細胞の集団を分化誘導して、複数個の心室筋細胞を含む複数個の心筋球を得る工程；
    （ii）前記複数個の心筋球を単一細胞に分散させて、複数個の心筋細胞を得る工程；および
    （iii）心室筋組織片が得られる条件下で、前記複数個の心筋細胞をコラーゲンの存在下、線維芽細胞の集団と接触させる工程
    を含む、請求項86または87に記載の方法。
89. 前記人工多能性幹細胞の集団が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）の対象から得られたものである、請求項86～88のいずれか1項に記載の方法。
90. 工程（a）が、少なくとも1時間かけて行われる、請求項86～89のいずれか1項に記載の方法。
91. 工程（a）が、少なくとも1日間かけて行われる、請求項86～90のいずれか1項に記載の方法。
92. 前記心室筋組織片に一定の周波数の電場刺激を与える、請求項86～91のいずれか1項に記載の方法。
93. 工程（b）が、複数の周波数を用いて行われる、請求項92に記載の方法。
94. 工程（b）が、発生力、標準化した発生力、速度変動、力変動、力-頻度関係およびβアドレナリン作動性応答から選択されるパラメータの測定を含む、請求項86～93のいずれか1項に記載の方法。
95. 前記筋ジストロフィーが、前記患者における全身性のジストロフィン欠損を含む、請求項86～94のいずれか1項に記載の方法。
96. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）およびベッカー型筋ジストロフィー（BMD）から選択される、請求項86～95のいずれか1項に記載の方法。
97. 前記筋ジストロフィーが、DMDを含む、請求項96に記載の方法。
98. 前記試験薬剤が、ポリヌクレオチドを含む、請求項86～97のいずれか1項に記載の方法。
99. 前記ポリヌクレオチドが、SERCAポリペプチドをコードする、請求項98に記載の方法。
100. 前記SERCAポリペプチドが、SERCA2aポリペプチドを含む、請求項99に記載の方法。
101. 前記ポリヌクレオチドが、ベクターを含む、請求項98～100のいずれか1項に記載の方法。
102. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レンチウイルスベクターおよびレトロウイルスベクターから選択される、請求項101に記載の方法。
103. 前記ベクターが、AAVベクターを含む、請求項102に記載の方法。
104. 前記AAVベクターが、AAV血清型1～11型のいずれかから選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする、請求項103に記載の方法。
105. 前記AAVベクターが、AAV血清型1型（AAV1）およびAAV血清型9型（AAV9）から選択される血清型を有するAAVまたはその断片をコードする、請求項103または104に記載の方法。
106. 前記ポリヌクレオチドが、前記SERCAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項98～105のいずれか1項に記載の方法。
107. 前記プロモーターが、構成的プロモーターを含む、請求項106に記載の方法。
108. 前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターを含む、請求項106または107に記載の方法。
109. 前記プロモーターが、誘導性プロモーターを含む、請求項106または107に記載の方法。
110. 前記ポリヌクレオチドが、ウイルスカプシドにパッケージされている、請求項98～109のいずれか1項に記載の方法。
111. 前記ポリヌクレオチドが、前記ウイルスカプシドをコードする核酸を含む、請求項110に記載の方法。