TW202045531A

TW202045531A - Β-肌聚糖之腺相關病毒載體遞送及肌肉營養不良症之治療

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Publication number: TW202045531A
Application number: TW109106292A
Authority: TW
Inventors: 克拉帕克路易斯羅帝諾; 傑瑞 R 麥德爾
Original assignee: 美國全美兒童醫院之研究學會
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2020-12-16
Also published as: AU2020229340A1; CO2021012074A2; BR112021016570A2; MX2021010356A; IL285849A; CN113766935A; SG11202109113TA; JP2022521776A; EP3930765A1; WO2020176614A1; US20230241252A1; CA3131390A1; KR20210133242A; CL2021002236A1

Abstract

本文描述了包括投與重組AAV（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB載體的治療肌肉營養不良症之方法、在患者中表現β-肌聚糖基因之方法、包含該rAAV的藥物組成物以及產生該rAAV之方法。

Description

Β-肌聚糖之腺相關病毒載體遞送及肌肉營養不良症之治療

本文描述了治療載體，諸如表現β-肌聚糖的AAV載體；以及使用該等載體減少和預防患有肌肉營養不良症之受試者中的纖維化之方法。

肢帶型肌肉營養不良症（LGMD）2E型（LGMD2E）係一常染色體隱性病症，由編碼β-肌聚糖（SGCB）的基因中的突變（導致功能蛋白損失）引起。LGMD2E在美國代表LGMD的一種相對常見且嚴重的形式，全球報導的發病率為1/200,000-1/350,000。(2) β-肌聚糖的缺乏會導致進行性營養不良，並伴有慢性肌纖維損失、炎症、脂肪替代和纖維化，所有該等都會引起肌肉力量及功能退化。(3,4) 作為複合物，大小範圍在35至50 kD之間的肌聚糖（α-、β、γ-、δ-）(5)全部係為肌纖維膜提供穩定性的跨膜蛋白，從而在肌肉活動期間提供保護使其免受機械應力損傷。(3) LGMD2E中3-肌聚糖的損失通常會引起其他肌聚糖蛋白不同程度的伴隨損失，造成肌膜脆性，從而導致肌纖維損失。1儘管LGMD2E的臨床表型範圍不同，但是診斷通常發生在10歲之前，並且在十幾歲中期到後期發生行走能力喪失。患者呈現出血清肌酸激酶（CK）升高、近端肌肉無力、地板站立困難和進行性行走能力喪失。多達50%的病例發生心臟損害。

腺相關病毒（AAV）係一種複製缺陷型細小病毒，該病毒的單股DNA基因組之長度為約4.7 kb，包括兩個145個核苷酸之反向末端重複序列（ITR）。AAV有多種血清型。AAV血清型的基因組核苷酸序列係為已知。例如，在GenBank登錄號NC_002077中提供了AAV-1之完整基因組；在GenBank登錄號NC_001401和Srivastava等人, J. Virol. [病毒學雜誌], 45: 555-564 {1983)中提供了AAV-2之完整基因組；在GenBank登錄號NC_1829中提供了AAV-3之完整基因組；在GenBank登錄號NC_001829中提供了AAV-4之完整基因組；在GenBank登錄號AF085716中提供了AAV-5基因組；在GenBank登錄號NC_00 1862中提供了AAV-6之完整基因組；在GenBank登錄號AX753246和AX753249中分別提供了AAV-7和AAV-8基因組的至少一部分；在Gao等人, J. Virol. [病毒學雜誌], 78: 6381-6388 (2004)中提供了AAV-9基因組；在Mol. Ther. [分子療法], 13(1): 67-76 (2006)中提供了AAV-10基因組；並且在Virology [病毒學], 330(2): 375-383 (2004)中提供了AAV-11基因組。在藉由援引併入本文的美國專利9,434,928中提供了AAV rh.74基因組的序列。指導病毒DNA複製（rep）、衣殼化/包裝和宿主細胞染色體整合的順式作用序列包含在AAV ITR內。三個AAV啟動子（因其相對圖譜位置而命名為p5、p19和p40）驅動編碼rep和cap基因的兩個AAV內部開放閱讀框之表現。兩個rep啟動子（p5和p19）加上單個AAV內含子的差異剪接（在核苷酸2107和2227處）導致由rep基因產生四種rep蛋白（rep 78、rep 68、rep 52和rep 40）。rep蛋白具有最終負責複製病毒基因組的多種酶促特性。cap基因係從p40啟動子表現的，並且編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2和VP3。替代的剪接和非共有翻譯起始位點負責產生三種相關之衣殼蛋白。單個共有多聚腺苷酸化位點位於AAV基因組之圖譜位置95。在Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology [微生物學和免疫學的當前主題], 158: 97-129 (1992)中綜述了AAV之生命週期及遺傳學。

AAV具有獨特的特徵，該等特徵使其例如在基因治療中作為將外源DNA遞送至細胞的載體而引人注目。對培養中的細胞的AAV感染不會導致細胞病變，並且人和其他動物的自然感染係沈默且無症狀的。此外，AAV會感染許多哺乳動物細胞，使得有可能靶向體內許多不同的組織。此外，AAV會轉導緩慢分裂的細胞和非分裂細胞，並且可以在那些細胞的生命週期中作為轉錄活性核附加體（染色體外元件）基本上持續存在。將AAV前病毒基因組作為殖株的DNA插入質體中，這使得重組基因組的構建可行。此外，因為指導AAV複製和基因組衣殼化的訊號包含在AAV基因組的ITR內，所以可以用外源DNA置換內部大約4.3 kb的基因組（編碼複製和結構性衣殼蛋白，rep-cap）的一些或全部。為了產生AAV載體，可以反式提供rep和cap蛋白。AAV的另一個顯著特徵在於它係一種非常穩定且強烈的病毒。它很容易承受用於滅活腺病毒的條件（56°至65°C持續數小時），從而使得低溫保存AAV變得不那麼關鍵。AAV甚至可以凍乾。最終，經AAV感染的細胞對重疊感染無抗性。

多項研究已證明了肌肉中存在長期（＞ 1.5年）的重組AAV介導的蛋白質表現。參見Clark等人, Hum Gene Ther [人類基因治療], 8: 659-669 (1997)；Kessler等人, Proc Nat. Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 93: 14082-14087 (1996)；以及Xiao等人, J Virol [病毒性雜誌], 70: 8098-8108 (1996)。另見Chao等人, Mol Ther [分子療法], 2:619-623 (2000)和Chao等人, Mol Ther [分子療法], 4:217-222 (2001)。此外，因為肌肉高度血管化，所以重組AAV轉導導致在肌肉內注射後在全身循環中出現轉基因產物，如Herzog等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 94: 5804-5809 (1997)和Murphy等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 94: 13921-13926 (1997)所述。此外，Lewis等人, J Virol [病毒學雜誌], 76: 8769-8775 (2002)證明骨骼肌纖維具有抗體正確糖基化、折疊和分泌所必需的細胞因子，表明肌肉能夠穩定表現分泌型蛋白質治療劑。

LGMD2E的一種新興治療方式係病毒介導的基因遞送，以恢復受影響肌肉的野生型蛋白，從而導致肌肉功能的恢復。鑒於一部分患者可能發展心肌病(8, 9, 10, 13)，在該等患者的長期護理中必須考慮這一點。在先前的報告中，對Sgcb-null小鼠進行了充分的表徵。Araishi等人3開發了β-肌聚糖缺陷型小鼠，其伴隨有所有肌聚糖以及肌長蛋白（sarcospan）之損失，至少少量保留了分區蛋白（merosin）、營養不良聚糖（dystroglycan）和營養不良蛋白（dystrophin），從而再現了在LGMD2E中所見到的臨床表現。這種動物模型的組織學變化也是臨床對應物之原型，包括骨骼肌纖維化之突出。(14) Dressman等人(25)使用rAAV2.CMV.SGCB注射橫腹肌。表現持續21個月，並且避免了肌纖維發生復發性壞死。還描述了使用自我互補的AAV增強轉基因表現16，使用肌肉特異性啟動子更好地靶向骨骼肌(20, 26)以及優化人β-肌聚糖基因（hSGCB）。

患有LGMD和其他肌肉營養不良症的患者的功能改善既需要基因恢復也需要減少纖維化。需要減少纖維化之方法，該方法可以與基因恢復方法配對以更有效地治療LGMD和其他肌肉營養不良症。

本文描述了表現β-肌聚糖基因之基因治療載體（例如AAV），以及將β-肌聚糖遞送至肌肉以減少和/或預防纖維化、和/或增加肌力、和/或治療患有肌肉營養不良症的哺乳動物受試者之方法。

一方面，本文描述了一種治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法，該方法包括向有需要之受試者投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中使用全身投與途徑並且基於超螺旋質體作為定量標準以約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量，或基於線性化質體為定量標準以約1.0 × 10¹³ vg/kg至約1.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量投與rAAV；其中在投與該rAAV之後，該受試者的血清肌酸激酶（CK）水平與在投與該rAAV之前的血清CK水平相比降低。

另一方面，提供了一種治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法，該方法包括投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中在投與該rAAV之後，該受試者細胞中的β-肌聚糖基因表現水平與投與該rAAV之前的β-肌聚糖基因表現水平相比增加；其中在投與該rAAV之後，該受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維數量與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖陽性纖維數量相比增加；或其中與投與該rAAV之前所述受試者之運動功能相比，所述受試者的該運動功能得到改善，並且其中該運動功能係藉由100米計時步行測試測定的。

另一方面，本揭露提供了一種治療有需要之受試者中的肢帶型肌肉營養不良症之方法，該方法包括基於超螺旋質體作為定量標準以約5.0 × 10¹³ vg/kg或約2.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量，或基於線性化質體作為定量標準以約1.85 × 10¹³ vg/kg或7.41 × 10¹³ vg/kg之劑量，向該受試者投與大約1至2小時的rAAV靜脈輸注，並且其中該rAAV包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。另一方面，本揭露描述了一種在受試者的細胞中表現β-肌聚糖基因之方法，該方法包括向該受試者投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體，該構建體包含與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。一方面，本揭露提供了一種增加受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維和/或降低受試者的肌肉組織中的CK水平之方法，該方法包括向該受試者投與與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列。

一方面，本文描述了一種增加有需要之受試者中的α-肌聚糖表現之方法，該方法包括向該受試者投與包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體的rAAV，該構建體具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。另一方面，本文提供了一種增加有需要之受試者中的α-肌聚糖向細胞膜的定位之方法，該方法包括向該受試者投與與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列。另一方面，提供了一種增加受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現或改善受試者的肌肉功能之方法，該方法包括向該受試者投與包含與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列的rAAV。另一方面，本揭露提供了一種增加受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現之方法，該方法包括向該受試者投與包含編碼第一肌聚糖之核苷酸序列之構建體，並檢測表現所述第一肌聚糖的細胞的細胞膜中至少第二肌聚糖之表現增加。

另一方面，描述了一種組成物，該組成物包含rAAV scAAVrh74.MHCK7.hSGCB載體、緩衝劑、離子強度劑、和表面活性劑。另一方面，本文描述了一種包含重組AAV（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB的藥物組成物，其中該scAAVrh74.MHCK7.hSGCB包含與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。

另一方面，提供了一種產生重組AAV scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之方法，該方法包括將質體轉移至細胞，其中該質體包含與SEQ ID NO: 24至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。具體而言，質體包含SEQ ID NO: 24之核苷酸序列。在另一個實施方式中，質體包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

另一方面，本文描述了包含編碼β-肌聚糖之多核苷酸序列的重組AAV載體。在一些實施方式中，編碼β-肌聚糖之多核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，更典型地90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高程度相同的序列並且編碼保留β-肌聚糖活性的蛋白質。在一些實施方式中，編碼β-肌聚糖之多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列。在一些實施方式中，編碼β-肌聚糖之多核苷酸序列由SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列組成。

另一方面，本文所述之重組AAV載體包含編碼β-肌聚糖之多核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 2的胺基酸序列具有至少65%，至少70%，至少75%，至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%，更典型地至少90%、91%、92%、93%或94%，且甚至更典型地至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且該蛋白保留了β-肌聚糖活性。

另一方面，本文描述了一種包含編碼功能性β-肌聚糖之多核苷酸序列的重組AAV載體，該多核苷酸序列包含在嚴格條件下與SEQ ID NO: 1之核酸序列或其互補序列雜交之核苷酸序列。

術語「嚴格」用於指本領域通常理解為嚴格的條件。雜交嚴格性主要由溫度、離子強度和變性劑（諸如甲醯胺）之濃度決定。用於雜交和洗滌的嚴格條件之實例係65°C-68°C下0.015 M的氯化鈉、0.0015 M的檸檬酸鈉或42°C下0.015 M的氯化鈉、0.0015 M的檸檬酸鈉和50%的甲醯胺。參見Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory [冷泉港實驗室]，（紐約冷泉港（Cold Spring Harbor, N.Y.）, 1989）。也可以使用更嚴格的條件（諸如更高的溫度、更低的離子強度、更高濃度的甲醯胺或其他變性劑），但是，雜交速率將受到影響。在涉及去氧寡核苷酸雜交的情況下，另外的示例性嚴格雜交條件包括在37°C（對於14個鹼基的寡核苷酸）、48°C（對於17個鹼基的寡核苷酸）、55°C（對於20個鹼基的寡核苷酸）和60°C（對於23鹼基的寡核苷酸）下，在6x SSC 0.05%焦磷酸鈉中洗滌。

當本文將範圍用於物理性質，諸如分子量、濃度或劑量時，旨在包括範圍的所有組合和子組合及其中之特定實施方式。當提及數字或數值範圍時，術語「約」意指所提及的數字或數值範圍係在實驗變異性內（或在統計實驗誤差內）之近似值，並且由此該數字或數值範圍可以在所陳述的數字或數值範圍的例如1%與15%之間變化。

為了減少非特異性和/或背景雜交，在雜交和洗滌緩衝液中可以包括其他試劑。實例為0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙烯吡咯啶酮、0.1%焦磷酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉、NaDodSO₄ 、(SDS)、ficoll、Denhardt溶液、經超音波處理的鮭魚精DNA（或其他非互補性DNA）和葡聚糖硫酸鹽，但是也可以使用其他合適的試劑。可以在基本上不影響雜交條件的嚴格性的情況下改變該等添加劑之濃度和類型。雜交實驗通常在pH 6.8-7.4下進行，但是，在典型的離子強度條件下，雜交速率幾乎與pH無關。參見Anderson等人, Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach [核酸雜交：實踐方法], 第4章，IRL出版社有限公司（IRL Press Limited）（英格蘭牛津（Oxford, England））。雜交條件可以由熟悉該項技術者進行調節，以便適應該等變數並且使不同序列相關性的DNA形成雜交體。

另一方面，本文所述之重組AAV載體可以可操作地連接至肌肉特異性控制元件。例如，肌肉特異性控制元件係人骨骼肌動蛋白基因元件、心肌肌動蛋白基因元件、心肌細胞特異性增強子結合因子MEF、肌肉肌酸激酶（MCK）、tMCK（截短的MCK）、肌球蛋白重鏈（MHC）、MHCK7（MHC與MCK的雜交型式）、C5-12（合成啟動子）、鼠肌酸激酶增強子元件、骨骼快肌肌鈣蛋白C基因元件、慢肌心肌肌鈣蛋白C基因元件、慢肌肌鈣蛋白I基因元件、缺氧誘導型核因子、類固醇誘導元件或糖皮質激素反應元件（GRE）。

在一些實施方式中，肌肉特異性啟動子係MHCK7（SEQ ID NO: 4）。本文所述之示例性rAAV係包含SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的pAAV.MHCK7.hSCGB。在SEQ ID NO: 3之核苷酸序列內，MCHK7啟動子跨越核苷酸130-921，SV40嵌合內含子（SEQ ID NO: 20）跨越核苷酸931-1078，β-肌聚糖序列（SEQ ID NO: 1）跨越核苷酸1091-2047並且聚A（SEQ ID NO: 21）跨越核苷酸2054-2106。在一些實施方式中，rAAV pAAV.MHCK7.hSCGB包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。在SEQ ID NO: 19之核苷酸序列內，MCHK7啟動子跨越核苷酸128-919，SV40嵌合內含子跨越核苷酸929-1076，β-肌聚糖序列跨越核苷酸1086-2042並且聚A跨越核苷酸2049-2101。

在一些實施方式中，rAAV pAAV.MHCK7.hSCGB包含與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19所示之核苷酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、或約89%，更典型地約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%相同之核苷酸序列，或編碼與SEQ ID NO: 2至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、或約89%，更典型地約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%相同的多肽之核苷酸序列。

在一個實施方式中，多核苷酸序列編碼保留肌聚糖活性（包括β-肌聚糖和/或α-肌聚糖活性）的蛋白質。在另一個實施方式中，多核苷酸序列編碼保留β-肌聚糖活性的蛋白質。

在一些實施方式中，肌肉特異性啟動子係tMCK（SEQ ID NO: 6）。本文所述之示例性rAAV係包含SEQ ID NO: 5之核苷酸序列的pAAV.tMCK.hSCGB。在SEQ ID NO: 5之核苷酸序列內，tMCK啟動子跨越核苷酸141-854，SV40嵌合內含子跨越核苷酸886-1018，β-肌聚糖序列跨越核苷酸1058-2014並且聚A跨越核苷酸2021-2073。在一些實施方式中，編碼pAAV.tMCK.hSCGB之多核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 5所示之核苷酸序列例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、或約89%，更典型地約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%或更高程度相同的序列，其中該多核苷酸序列編碼保留肌聚糖活性（包括但不限於β-肌聚糖和/或α-肌聚糖活性）的蛋白質。

AAV可為任何血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAVrh.74。假型rAAV的產生在例如WO 01/83692中揭露。也可以設想其他類型的rAAV變體，例如具有衣殼突變的rAAV。參見例如Marsic等人, Molecular Therapy [分子療法], 22(11): 1900-1909 (2014)。

還設想了包含本文所述之任何rAAV載體之組成物。

在一些實施方式中，本揭露提供了一種包含scAAVrh74.MHCK7.hSCGB rAAV載體之組成物或藥物組成物，該載體包含與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19所示之核苷酸序列至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、或約89%，更典型地約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%相同之核苷酸序列，或包含編碼與SEQ ID NO: 2至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、或約89%，更典型地約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%相同的多肽之核苷酸序列。另外，本揭露提供了一種包含scAAVrh74.MHCK7.hSCGB rAAV載體之組成物或藥物組成物，該載體包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列，或包含編碼包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的多肽之核苷酸序列。

提供了治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法，該方法包括投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中使用全身投與途徑並以約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量投與rAAV。

還提供了用於治療肌肉營養不良症之組成物，其中該組成物包含劑量為約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg的重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGC，並且該組成物配製用於全身投與。

另外，提供了重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGC用於製備用於治療肌肉營養不良症的藥物之用途，其中該藥物包含劑量為約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg的scAAVrh74.MHCK7.hSGC並且該藥物配製用於全身投與。

在所提供之方法、組成物和用途中的任一項中，在投與該rAAV之後，該受試者的細胞中的β-肌聚糖基因表現水平與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖基因表現水平相比增加；其中在投與該rAAV之後，該受試者的血清肌酸激酶（CK）水平與在投與該rAAV之前的血清CK水平相比降低；和/或其中在投與該rAAV之後，該受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維數量與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖陽性纖維數量相比增加。

在另一個實施方式中，在所提供之方法、組成物和用途中的任一項中，與投與該rAAV之前所述受試者之運動功能相比，所述受試者的該運動功能得到改善，並且其中該運動功能係藉由100米計時步行測試測定的。例如，運動功能在基因轉移後1個月或30天內改善至少5%，在基因轉移後2個月或60天內改善至少10%，或在基因轉移後3個月或90天內改善至少15%。在一些實施方式中，該運動功能改善至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%或50%。

例如，在所提供之方法、組成物和用途中的任一項中，全身投與途徑係靜脈內途徑。例如，使用靜脈內途徑投與rAAV，並且投與的rAAV之劑量，基於線性化質體作為定量標準，為約1.85 × 10¹³ vg/kg或約7.41 × 10¹³ vg/kg，或者投與的rAAV之劑量，基於超螺旋質體作為定量標準，為約5 × 10¹³ vg/kg或約2 × 10¹⁴ vg/kg。

在一些實施方式中，該劑量的rAAV使用靜脈內途徑投與並且該劑量基於超螺旋質體作為定量標準，為約1.0 × 10¹³ vg/kg至約5 × 10¹⁴ ，或基於線性化質體作為定量標準，為約1.0 × 10¹³ vg/kg至約1.0 × 10¹⁴ vg/kg。

另外，投與的rAAV之劑量為約1.5 × 10¹³ vg至約2 × 10¹⁶ vg、或1.5 × 10¹³ vg至1 × 10¹⁶ vg、或約1.5 × 10¹³ vg至約2 × 10¹⁵ vg、或約1.5 × 10¹³ vg至約1 × 10¹⁵ vg。另外，在該等方法、組成物和用途中的任一項中，該劑量的rAAV以約10 mL/kg之濃度投與。在所提供之方法、組成物和用途中的任一項中，肌肉營養不良症係肢帶型肌肉營養不良症。

另外，提供了治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法，該方法包括投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中使用全身投與途徑並以約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量投與rAAV；其中在投與該rAAV之後，該受試者的細胞中的β-肌聚糖基因表現水平與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖基因表現水平相比增加；其中在投與該rAAV之後，該受試者的血清CK水平與在投與該rAAV之前的血清CK水平相比降低；或其中在投與該rAAV之後，該受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維數量與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖陽性纖維數量相比增加。例如，在所提供之方法中的任一種中，全身投與途徑係靜脈內途徑並且投與的rAAV之劑量基於超螺旋質體作為定量標準，為約5.0 × 10¹³ vg/kg。在另一個實施方式中，投與的rAAV之劑量基於超螺旋質體作為定量標準，為約2.0 × 10¹⁴ vg/kg。在另一個實施方式中，投與的rAAV之劑量基於線性化質體作為定量標準，為約7.41 × 10¹³ vg/kg。在另一個實施方式中，投與的rAAV之劑量基於線性化質體作為定量標準，為約1.85 × 10¹³ vg/kg。另外，投與的rAAV之劑量為約1.5 × 10¹³ vg至約2 × 10¹⁶ vg、或1.5 × 10¹³ vg至1 × 10¹⁶ vg、或約1.5 × 10¹³ vg至約2 × 10¹⁵ vg、或約1.5 × 10¹³ vg至約1 × 10¹⁵ vg。另外，在該等方法中的任一種中，該劑量的rAAV以約10 mL/kg之濃度投與。在所提供之方法中的任一種中，肌肉營養不良症係肢帶型肌肉營養不良症。

在一些實施方式中，本揭露包括一種治療有需要之受試者中之肌肉營養不良症之方法，該方法包括投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中所述受試者之運動功能與所述受試者在投與rAAV之前之運動功能相比明顯改善了，並且其中運動功能係藉由100m計時步行測試測定的。在一些方面，運動功能在基因轉移後1個月或30天內改善至少5%，在基因轉移後2個月或60天內改善至少10%，或在基因轉移後3個月或90天內改善至少15%。在一些方面，運動功能改善至少約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約40%、約45%或約50%。

提供了增加有需要之受試者中的α-肌聚糖水平之方法，該方法包括向受試者投與包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體。另外，提供了用於增加有需要之受試者中的α-肌聚糖水平之組成物，其中該組成物包含含有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體。還提供了包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體用於製備用於增加有需要之受試者中的α-肌聚糖水平的藥物之用途。在一些方面，α-肌聚糖共定位於表現由scAAVrh74.MHCK7.hSGCB編碼的β-肌聚糖的細胞之膜。

在一些實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含內含子序列。在一個實施方式中，內含子序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列。在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含聚A序列。在一個實施方式中，聚A序列包含SEQ ID NO: 21之核苷酸序列。在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含5’反向末端重複（ITR）序列。在一個實施方式中，5’ITR序列包含SEQ ID NO: 22之核苷酸序列。在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含3’反向末端重複（ITR）序列。在一個實施方式中，3’ITR序列包含SEQ ID NO: 23之核苷酸序列。

還提供了一種增加受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現之方法，該方法包括向該受試者投與包含編碼第一肌聚糖之核苷酸序列之構建體，並檢測表現所述第一肌聚糖的細胞的細胞膜中至少第二肌聚糖之表現增加。在一些方面，第一肌聚糖係β-肌聚糖（SGCB），並且所述第二肌聚糖係α-肌聚糖（SGCA）、γ-肌聚糖（SGCG）或δ-肌聚糖（SGCD）。

在提供的治療肌肉營養不良症之方法、用途和組成物中的任一項中，受試者為4-15歲，在兩個等位基因中具有確認的β-肌聚糖（SGCB）突變，AAVrh74抗體呈陰性和/或具有＞ 40%或正常的100米步行測試。在提供的治療肌肉營養不良症之方法、用途和組成物中的任一項中，受試者係兒科受試者。在一些實施方式中，受試者係兒科受試者，諸如年齡範圍在1至10歲之受試者。在一些實施方式中，受試者為4至15歲。在一個實施方式中，受試者係青少年受試者，諸如年齡範圍在10至19歲之受試者。另外，在一個實施方式中，受試者係年輕的成年受試者，諸如年齡範圍從十幾歲後期到二十歲初期之受試者，諸如受試者的年齡範圍可為15至29歲。在一些實施方式中，受試者係中年成人或老年受試者，使得中年成人的年齡範圍可以在25-55歲之間，並且老年受試者的年齡範圍可以在50歲以上。

在一些實施方式中，藉由注射、輸注或植入來投與該rAAV。例如，藉由大約1至2小時的輸注來投與該rAAV。另外，通過經由外周肢體靜脈的靜脈內途徑投與該rAAV。

治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法中，該方法包括投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中使用全身投與途徑並且基於超螺旋質體為定量標準以約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量投與該rAAV，並且該rAAV包含SEQ ID NO: 1的人β-肌聚糖核苷酸序列。另外，rAAV包含SEQ ID NO: 4的MHCK7啟動子序列。在一些實施方式中，rAAV係血清型AAVrh.74。另外，rAAV包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列。

在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含內含子序列。在一個實施方式中，內含子序列包含SEQ ID NO: 20之核苷酸序列。在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含聚A序列。在一個實施方式中，聚A序列包含SEQ ID NO: 21之核苷酸序列。在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含5’反向末端重複（ITR）序列。在一個實施方式中，5’ITR序列包含SEQ ID NO: 22之核苷酸序列。在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體包含3’反向末端重複（ITR）序列。在一個實施方式中，3’ITR序列包含SEQ ID NO: 23之核苷酸序列。

在一個示例性實施方式中，治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法包括投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中使用全身性投與途徑並以約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量投與該rAAV，其中該受試者患有肢帶型肌肉營養不良症，並且藉由大約1至2小時的靜脈輸注，基於超螺旋質體作定量標準以約5.0 × 10¹³ vg/kg或約2.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量，或基於線性化質體作為定量標準以約1.85 × 10¹³ vg/kg或7.41 × 10¹³ vg/kg之劑量投與該rAAV，並且其中該rAAV包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列。

另外，本揭露提供了用於治療肢帶型肌肉營養不良症之組成物，該組成物包含一定劑量的重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，並將該組成物配製為藉由大約1至2小時的靜脈輸注，遞送基於超螺旋質體作為定量標準，約5.0 × 10¹³ vg/kg或約2.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量，或基於線性化質體為定量標準，約1.85 × 10¹³ vg/kg或約7.41 × 10¹³ vg/kg之劑量。

本揭露還提供了一定劑量的重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB用於製備用於治療肢帶型肌肉營養不良症的藥物之用途，其中rAAV之劑量基於超螺旋質體作為定量標準，為約5.0 × 10¹³ vg/kg或約2.0 × 10¹⁴ vg/kg，或基於線性化質體作為定量標準，為約1.85 × 10¹³ vg/kg或約7.41 × 10¹³ vg/kg，並將藥物配製為藉由大約1至2小時的靜脈輸注遞送該劑量。

本揭露還提供了一種改善受試者肌肉功能之方法，該方法包括向該受試者投與包含與SEQ ID NO: 1、3、5或19具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性、或100%同一性之核苷酸序列之構建體。另外，提供了用於改善受試者肌肉功能之組成物，其中該組成物包含含有與SEQ ID NO: 1、3、5或19具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或100%同一性之核苷酸序列之構建體。還提供了包含與SEQ ID NO: 1、3、5或19具有至少90%同一性、至少95%同一性、至少99%同一性或100%同一性之核苷酸序列之構建體用於製備用於改善受試者肌肉功能的藥物之用途。

在所提供之方法、用途或組成物中的任一項中，受試者遭受編碼肌聚糖的基因中的基因突變或肌肉營養不良症。在一些方面，該肌聚糖係β-肌聚糖（SGCB）、α-肌聚糖（SGCA）、γ-肌聚糖（SGCG）或δ-肌聚糖（SGCD）。在一些方面，該肌聚糖係β-肌聚糖或α-肌聚糖。

在所提供之方法、用途或組成物中的任一項中，在投與該rAAV之後，該受試者的細胞中的β-肌聚糖基因表現水平與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖基因表現水平相比增加。

另外，在所提供之方法、用途或組成物中的任一項中，藉由在投與rAAV之前和之後生檢的肌肉中，用西方墨點法或免疫組織化學法測量β-肌聚糖蛋白水平來檢測細胞中β-肌聚糖基因之表現。

在所提供之方法、用途或組成物中的任一項中，β-肌聚糖蛋白之水平在投與rAAV之後增加至少25%、或至少26%、或至少27%、或至少28%、或至少29%、或至少30%、或至少31%、或至少32%、或至少33%、或至少34%、或至少或35%或至少36%、或至少37%、或至少38%、或至少39%、或至少40%、或至少41%、或至少42%、或至少43%、或至少44%、或至少45%、或至少46%、或至少47%、或至少48%、或至少49%、或至少50%、或至少51%、或至少52%、或至少53%、或至少54%、或至少55%、或至少56%、或至少57%、或至少58%、或至少59%、或至少60%、或至少63%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%或至少95%、或至少98%。例如，正如藉由在投與rAAV之前和之後生檢的肌肉中，用西方墨點法測量β-肌聚糖蛋白水平那樣，β-肌聚糖蛋白之水平增加至少33%，或者正如藉由在投與rAAV之前和之後生檢的肌肉中，用免疫組織化學法測量β-肌聚糖蛋白水平那樣，β-肌聚糖蛋白之水平增加至少38%或至少39%。

在本文提供之方法、用途或組成物中的任一項中，在投與該rAAV之後，受試者的血清CK水平與在投與該rAAV之前的血清CK水平相比降低。例如，到投與rAAV之後60至90天或60天或90天，受試者的血清CK水平與投與rAAV之前的血清CK水平相比降低至少50%、或至少51%、或至少52%、或至少53%、或至少54%、或至少55%或至少56%、或至少57%、或至少58%、或至少59%、或至少60%、或至少63%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少81%、或至少82%、或至少83%、或至少84%、或至少85%、或至少86%或至少87%、或至少88%、或至少89%、或至少90%或至少95%、或至少98%。

在本文提供之方法、用途或組成物中的任一項中，在投與rAAV之後，受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維數量與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖陽性纖維數量相比增加。例如，藉由對投與rAAV之前和之後的肌肉生檢樣本進行蛋白質印跡或免疫組織化學分析而測量β-肌聚糖蛋白水平來檢測β-肌聚糖陽性纖維的數量。例如，受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維數量在投與rAAV之後增加至少25%、或至少26%、或至少27%、或至少28%、或至少29%、或至少30%、或至少31%、或至少32%、或至少33%、或至少34%、或至少35%或至少36%、或至少37%、或至少38%、或至少39%、或至少40%、或至少41%、或至少42%、或至少43%、或至少44%、或至少45%、或至少46%、或至少47%、或至少48%、或至少49%、或至少50%、或至少51%、或至少52%、或至少53%、或至少54%、或至少55%、或至少56%、或至少57%、或至少58%、或至少59%、或至少60%、或至少63%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%或至少95%、或至少98%。

在本文提供之方法、組成物和用途中的任一項中，在投與rAAV之後，受試者的α-肌聚糖水平與投與rAAV之前的α-肌聚糖水平相比增加。藉由對投與rAAV之前和之後的肌肉生檢樣本進行免疫組織化學或蛋白質印跡分析而測量α-肌聚糖蛋白水平來檢測α-肌聚糖之水平。

另一個實施方式提供了在細胞中表現β-肌聚糖基因之方法，該方法包括向受試者投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

還提供了用於在細胞中表現β-肌聚糖基因之組成物，其中該組成物包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

本揭露還提供了scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列用於製備用於在細胞中表現β-肌聚糖基因的藥物之用途，其中scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

在提供的用於在細胞中表現β-肌聚糖基因之方法、用途或組成物中的任一項中，藉由在投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體之前和之後的肌肉生檢樣本中，用西方墨點法或免疫組織化學法測量β-肌聚糖蛋白水平來檢測細胞中β-肌聚糖基因之表現。例如，該細胞具有一個以上的AAV病毒拷貝數。另外，藉由檢測每個細胞核大於1個rAAV載體基因組拷貝，測量受試者中的β-肌聚糖基因。

還提供了用於降低有需要之受試者的血清CK水平之組成物，其中該組成物包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

本揭露還提供了scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列用於製備用於降低有需要之受試者的血清CK水平的藥物之用途，其中scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

在該等方法、用途和組成物中的任一項中，到投與rAAV之後60天，受試者的血清CK水平與在投與該rAAV之前的血清CK水平相比降低至少82%。

提供了增加受試者肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維之方法，該方法包括向受試者投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

還提供了用於增加受試者肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維之組成物，其中該組成物包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

本揭露還提供了scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列用於製備用於增加受試者肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維的藥物之用途，其中scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

在該等方法、用途和組成物中的任一項中，藉由對投與rAAV之前和之後的肌肉生檢樣本，用西方墨點法或免疫組織化學法測量β-肌聚糖蛋白水平來檢測β-肌聚糖陽性纖維的數量。另外，在該等方法、用途和組成物中的任一項中，藉由檢測每個細胞核大於1個rAAV載體基因組拷貝來測量β-肌聚糖陽性纖維的數量。

另一個實施方式提供了增加有需要之受試者中的α-肌聚糖表現之方法，該方法包括向該受試者投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體，該構建體包含與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列之核苷酸序列。

還提供了用於增加有需要之受試者中的α-肌聚糖表現之組成物，其中該組成物包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

本揭露還提供了scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列用於製備用於增加有需要之受試者中的α-肌聚糖表現的藥物之用途，其中scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

還提供了增加有需要之受試者中的α-肌聚糖向細胞膜的定位之方法，該方法包括向該受試者投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

還提供了用於增加有需要之受試者中的α-肌聚糖向細胞膜的定位之組成物，其中該組成物包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

本揭露還提供了scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列用於製備用於增加有需要之受試者中的α-肌聚糖向細胞膜的定位的藥物之用途，其中scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

在該等方法、用途和組成物中的任一項中，藉由對投與rAAV之前和之後的肌肉生檢樣本，用西方墨點法或免疫組織化學法測量α-肌聚糖蛋白水平來檢測α-肌聚糖之水平。另外，在所提供之方法、用途和組成物中的任一項中，α-肌聚糖共定位於表現由scAAVrh74.MHCK7.hSGCB編碼的β-肌聚糖的細胞之膜。

另一個實施方式提供了增加有需要之受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現之方法，該方法包括向該受試者投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體，該構建體包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列之核苷酸序列。

還提供了用於增加有需要之受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現之組成物，其中該組成物包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列，該序列與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

本揭露還提供了scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列用於製備用於增加有需要之受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現的藥物之用途，其中scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同或包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

在用於增加肌肉組織中的肌聚糖表現的該等方法、用途及組成物中的任一項中，受試者遭受編碼肌聚糖的基因中的基因突變或肌肉營養不良症。例如，在該等方法、用途或組成物中的任一項中，肌聚糖係β-肌聚糖（SGCB）、α-肌聚糖（SGCA）、γ-肌聚糖（SGCG）或δ-肌聚糖（SGCD）。

還提供了產生重組AAV載體顆粒之方法，該方法包括培養經本文所述之質體轉移的細胞並從轉染細胞的上清液中回收重組AAV顆粒。還設想了包含本文所述之任何重組AAV載體的病毒顆粒。在一個實施方式中，產生rAAV之方法包括將AAV載體質體轉移至宿主細胞。在另一個實施方式中，質體包含與SEQ ID NO: 24至少90%、95%、或99%相同之核苷酸序列。另一方面，本揭露提供了一種包含AAV載體質體之細胞，該載體質體包含SEQ ID NO: 24之核苷酸序列。本文所述之細胞包括昆蟲細胞，例如果蠅（Drosophila ）細胞（例如，S2細胞或Kc細胞）、蠶細胞（例如，Bme21細胞）、或蚊細胞（例如，C6/36細胞）；或哺乳動物細胞（較佳的是人細胞，例如人原代細胞或已建立的細胞系）。在一個實施方式中，哺乳動物細胞包括293細胞、COS細胞、HeLa細胞、或KB細胞。

在另一個實施方式中，質體包含與SEQ ID NO: 1、3、5、或19至少90%、95%、或99%相同之核苷酸序列。在一些實施方式中，載體質體包含SEQ ID NO: 1、3、5、或19中任一個之核苷酸序列。在一些實施方式中，AAV載體質體在宿主細胞中穩定表現。穩定地攜帶AAV載體質體的宿主細胞可用於產生rAAV。在一個實施方式中，AAV載體質體係pAAV.MHCK7.hSGCB.KAN質體。

本文提供的產生重組AAV載體顆粒之方法還可包括將包裝質體和/或輔助病毒轉移至宿主細胞之步驟。例如，該方法還包括以下步驟：其中包裝細胞包含穩定整合的AAV cap基因和/或其中包裝細胞包含穩定整合的AAV rep基因。本發明還提供了一種細胞，該細胞包含含有與SEQ ID NO: 24至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列的質體或含有SEQ ID NO: 24之核苷酸序列之質體。還提供了包含SEQ ID NO: 1、3、5或19之核苷酸序列之細胞。

還提供了減少有需要的哺乳動物受試者中的纖維化之方法。在這方面，該方法包括向哺乳動物受試者投與治療有效量的本文所述之AAV載體（或包含本文所述之AAV載體之組成物）。在一些實施方式中，哺乳動物受試者患有肌肉營養不良症。在一些實施方式中，投與本文所述之AAV載體（或包含本文所述之AAV載體之組成物）會減少受試者骨骼肌或心肌中的纖維化。

如本文所用，術語「肌肉營養不良症」係指一種力量和肌肉體積逐漸下降的病症。肌營養不良疾病的非限制性實例可包括貝克型肌肉營養不良症、脛骨肌肉營養不良症、杜氏肌肉營養不良症、Emery-Dreifuss肌肉營養不良症、臉肩胛肱肌肉營養不良症、肌聚糖病、先天性肌肉營養不良症（諸如部分LAMA2缺乏引起的先天性肌肉營養不良症、肌球蛋白缺陷型先天性肌肉營養不良症、1D型先天性肌肉營養不良症、福山型先天性肌肉營養不良症）、肢帶1A型肌肉營養不良症、肢帶2A型肌肉營養不良症、肢帶2B型肌肉營養不良症、肢帶2C型肌肉營養不良症、肢帶2D型肌肉營養不良症、肢帶2E型肌肉營養不良症、肢帶2F型肌肉營養不良症、肢帶2G型肌肉營養不良症、肢帶2H型肌肉營養不良症、肢帶2I型肌肉營養不良症、肢帶2I型肌肉營養不良症、肢帶2J型肌肉營養不良症、肢帶2K型肌肉營養不良症、肢體IC型肌肉營養不良症、硬脊骨肌營養不良合併大皰性表皮鬆解症、眼咽型肌肉營養不良症、Ullrich型先天性肌肉營養不良症和Ullrich硬化性肌肉營養不良症。在一些實施方式中，受試者患有肢帶型肌肉營養不良症。在一些實施方式中，受試者患有肢帶型肌肉營養不良症2E型（LGMD2E）。

如本文所用，術語「纖維化」係指細胞外基質（ECM）組分過多或不受調節的沈積，以及受損傷後組織（包括骨骼肌、心肌、肝、肺、腎和胰腺）的異常修復過程。沈積的ECM組分包括膠原蛋白（例如膠原蛋白1、膠原蛋白2或膠原蛋白3）和纖網蛋白。

另一方面，本文描述了增加哺乳動物受試者中的肌力和/或肌肉質量之方法，該方法包括向哺乳動物受試者投與治療有效量的本文所述之AAV載體（或包含本文所述之AAV載體之組成物）。在一個實施方式中，受試者係人。

在本發明之任何方法中，受試者可能患有肌肉營養不良症，諸如肢帶型肌肉營養不良症或任何其他與肌營養不良蛋白相關的肌肉營養不良症。

還提供了一種治療哺乳動物受試者中的肌肉營養不良症之方法，該方法包括向哺乳動物受試者投與治療有效量的本文所述之AAV載體（或包含本文所述之AAV載體之組成物）。在一些實施方式中，肌肉營養不良症係肢帶型肌肉營養不良症。

在本發明之任何方法中，藉由肌內注射或靜脈注射投與rAAV。另外，在本發明之任何方法中，rAAV係全身投與的，諸如藉由注射、輸注或植入進行腸胃外投與。

本發明之組成物配製用於肌內注射或靜脈注射。另外，本發明之組成物配製用於全身投與，諸如藉由注射、輸注或植入進行腸胃外投與。

另外，將任何組成物均配製用於向患有肌肉營養不良症（諸如肢帶型肌肉營養不良症或任何其他與肌營養不良蛋白相關的肌肉營養不良症）之受試者投與。在一些實施方式中，該組成物還可包含第二重組AAV載體，該載體包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 8所示之多核苷酸序列。

在本發明之任何用途中，將藥物配製用於肌內注射或靜脈注射。另外，在本發明之任何用途中，將藥物配製用於全身投與，諸如藉由注射、輸注或植入進行腸胃外投與。另外，可以製備任何組成物用於向患有肌肉營養不良症（諸如肢帶型肌肉營養不良症或任何其他與肌營養不良蛋白相關的肌肉營養不良症）之受試者投與。在一些實施方式中，藥物還可包含第二重組AAV載體，該載體包含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 8所示之多核苷酸序列。

本發明還提供了一種製劑或組成物，該製劑或組成物包含：含有AAVrh74來源的衣殼的rAAV病毒體、緩衝劑、離子強度劑和表面活性劑。在所提供的製劑或組成物中，rAAV之濃度為約1.0 × 10¹² vg/ml至約5.0 × 10¹⁴ vg/ml或濃度為約5.0 × 10¹² vg/ml至約1.0 × 10¹⁴ vg/ ml。另外，rAAV之濃度為約2.0 × 10¹³ vg/ml、4 × 10¹³ vg/ml、或5 × 10¹³ vg/ml。在所提供的製劑或組成物中，rAAV可為scAAVrh74.MHCK7.hSGCB病毒顆粒或scAAVrh74.MHCK7.hSGCB載體。例如，在所提供的製劑或組成物中的任一種中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。

在所提供的製劑或組成物中的任一種中，緩衝劑包括tris、tricine（三(羥甲基)甲基甘胺酸）、Bis-tricine、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES和CAPS中的一種或多種。例如，緩衝劑包含濃度為約5 mM至約40 mM的pH 8.0的tris，或緩衝劑包含約20 mM的pH 8.0的tris。

在所提供的製劑或組成物中的任一種中，離子強度劑包含以下一種或多種：氯化鉀（KCl）、乙酸鉀、硫酸鉀、硫酸銨、氯化銨（NH₄ Cl）、乙酸銨、氯化鎂（MgCl₂ ）、乙酸鎂、硫酸鎂、氯化錳（MnCl₂ ）、乙酸錳、硫酸錳、氯化鈉（NaCl）、乙酸鈉、氯化鋰（LiCl）和乙酸鋰。例如，離子強度劑包含濃度為約0.2 mM至約4 mM的MgCl₂ ，或離子強度劑包含濃度為約50 mM至約500 mM的NaCl，或離子強度劑包含濃度為約0.2 mM至約4 mM的MgCl₂ 和濃度為約50 mM至約500 mM的NaCl，或離子強度劑包含濃度為約1 mM的MgCl₂ 和濃度為約200 mM的NaCl。

在所提供的製劑或組成物中的任一種中，表面活性劑包含磺酸鹽、硫酸鹽、膦酸鹽、磷酸鹽、泊洛沙姆和陽離子表面活性劑中的一種或多種。例如，泊洛沙姆（Poloxamer）包含泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆331、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407中的一種或多種。泊洛沙姆之濃度可以為約0.00001%至約1%。示例性的表面活性劑係濃度為約0.001%的泊洛沙姆188。

前述段落並非旨在定義本發明之每個方面，其他方面在諸如「具體實施方式」的其他章節中進行了描述。旨在將整個文件作為統一揭露內容進行關聯，並且應該理解，即使在本文件的同一句子、段落或章節中未找到特徵的組合，也可以設想本文所述特徵的所有組合。作為附加方面，本發明包括以任何方式在範圍上比由以上具體段落所定義的變型更窄的本發明之所有實施方式。例如，將本發明之某些方面描述為屬的情況下，應當理解，屬的每個成員分別是本發明之一個方面。

本申請要求2019年2月26日提交的美國臨時申請案號62/810,917、2019年4月15日提交的美國臨時申請案號62/834,012、2019年6月7日提交的美國臨時申請案號62/858,644、2019年8月1日提交的美國臨時申請案號62/881,901、2019年10月2日提交的美國臨時申請案號62/909,564和2019年10月4日提交的美國臨時申請案號62/910,779的優先權，該等申請全部藉由援引以其全文併入本文。以電子方式提交之材料藉由援引併入

本申請含有作為本揭露的單獨部分的、電腦可讀形式的序列表，該序列表藉由援引以其全文併入本文並且標識如下：檔案名：54016_Seqlisting.txt；大小：33,466位元組；創建時間：2020年2月12日。

本揭露基於以下發現：投與包含表現β-肌聚糖的多核苷酸的AAV載體在肢帶型肌肉營養不良症動物模型中引起肌纖維化減少或完全逆轉。如實例中所展示的，本文所述之AAV載體的投與引起營養不良特徵的逆轉，包括變性纖維減少、炎症減輕以及藉由防止離心收縮並增加力的產生而改善功能恢復。

如本文所用，術語「AAV」係腺相關病毒的標準縮寫。腺相關病毒係單股DNA細小病毒，僅在藉由共感染輔助病毒提供某些功能的細胞中生長。目前已表徵了13種AAV血清型。有關AAV的一般資訊和綜述可以在例如Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses [細小病毒手冊]，第1卷，第169-228頁，以及Berns, 1990, Virology [病毒學]，第1743-1764頁，拉文出版社（Raven Press），紐約（New York））中找到。然而，完全可以預計到，該等相同的原理將適用於另外的AAV血清型，因為眾所周知，即使在遺傳水平上，各種血清型在結構和功能上也相當密切地相關。（參見例如Blacklowe, 1988，Parvoviruses and Human Disease [細小病毒和人類疾病]第165-174頁，J. R. Pattison編輯；以及Rose, Comprehensive Virology [綜合病毒學] 3: 1-61 (1974)）。例如，所有AAV血清型顯然展現出由同源rep基因介導的非常相似之複製特性；並且全部帶有三種相關的衣殼蛋白，諸如在AAV2中表現的那些。異源雙鏈體分析進一步表明了關聯度，該分析揭示了血清型之間沿基因組長度的廣泛交叉雜交；並且在末端存在與「反向末端重複序列」（ITR）相對應的類似自退火區段。相似的感染性模式也表明，每種血清型中的複製功能均處於相似的調控之下。

如本文所用，「AAV載體」係指包含側接AAV末端重複序列（ITR）的一個或多個感興趣的多核苷酸（或轉基因）之載體。此類AAV載體當存在於已經用編碼和表現rep和cap基因產物的載體轉染之宿主細胞中時，可以複製並包裝成感染性病毒顆粒。

「AAV病毒體」或「AAV病毒顆粒」或「AAV載體顆粒」係指由至少一種AAV衣殼蛋白和衣殼化多核苷酸AAV載體組成的病毒顆粒。如果顆粒包含異源多核苷酸（即除野生型AAV基因組以外的多核苷酸，諸如待遞送至哺乳動物細胞的轉基因），則典型地將其稱為「AAV載體顆粒」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體顆粒的產生必然包括AAV載體之產生，因為這種載體包含在AAV載體顆粒中。AAV

本發明之重組AAV基因組包含本發明之核酸分子和在核酸分子兩側的一個或多個AAV ITR。rAAV基因組中的AAV DNA可以來自任何AAV血清型（從該AAV血清型中可以衍生重組病毒），包括但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh.74。假型rAAV的產生在例如WO 01/83692中揭露。也可以設想其他類型的rAAV變體，例如具有衣殼突變的rAAV。參見例如Marsic等人, Molecular Therapy [分子療法], 22(11): 1900-1909 (2014)。如以上「背景技術」章節所述，各種AAV血清型的基因組之核苷酸序列係本領域已知的。為了促進骨骼肌特異性表現，可以使用AAV1、AAV5、AAV6、AAV8或AAV9。

本發明之DNA質體包含rAAV基因組。將DNA質體轉移至容許AAV的輔助病毒（例如，腺病毒、E1缺失型腺病毒或皰疹病毒）感染的細胞，以將rAAV基因組組裝成感染性病毒顆粒。用於產生rAAV顆粒的技術（其中向細胞提供待包裝的AAV基因組、rep和cap基因、以及輔助病毒功能）在本領域係標準的。產生rAAV需要單個細胞（本文稱為包裝細胞）記憶體在以下組分：rAAV基因組，與rAAV基因組分開（即不在其中）的AAV rep和cap基因，以及輔助病毒功能。AAV rep和cap基因可以來自任何AAV血清型（從該AAV血清型中可以衍生重組病毒），並且可以來自不同的AAV血清型而不是rAAV基因組ITR，包括但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh.74。在例如藉由援引以其全文併入本文的WO 01/83692中揭露了假型rAAV的產生。

生成包裝細胞之方法係產生對於AAV顆粒產生而言，穩定表現所有必需組分的細胞系。例如，將包含以下項的一個質體（或多個質體）整合到細胞的基因組中：缺少AAV rep和cap基因的rAAV基因組、與rAAV基因組分開的AAV rep和cap基因、以及選擇性標記（諸如新黴素抗性基因）。已經藉由以下程序將AAV基因組引入細菌質體中：諸如GC加尾（Samulski等人, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA [美國國家科學院院刊], 79:2077-2081）、含有限制性內切核酸酶切割位點的合成連接子（linker）之添加（Laughlin等人, 1983, Gene [基因], 23:65-73）或藉由直接的平端連接（Senapathy和Carter, 1984, J. Biol. Chem.[生物化學雜誌], 259: 4661-4666）。然後用輔助病毒（諸如腺病毒）感染包裝細胞系。此方法的優點係，細胞係可選擇的，並且適合rAAV的大規模生產。合適方法之其他實例採用了腺病毒或桿狀病毒而不是質體來將rAAV基因組和/或rep和cap基因引入包裝細胞中。

產生rAAV的一般原理在例如Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology [生物技術新見], 1533-539；和Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol. [微生物學與免疫學的當前課題], 158:97-129)中有綜述。以下文獻中描述了不同方法：Ratschin等人, Mol. Cell. Biol. [分子和細胞生物學] 4:2072 (1984)；Hermonat等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 81:6466 (1984)；Tratschin等人, Mo1. Cell. Biol. [分子和細胞生物學] 5:3251 (1985)；McLaughlin等人, J. Virol. [病毒學雜誌], 62:1963 (1988)；以及Lebkowski等人, 1988 Mol. Cell. Biol. [分子和細胞生物學] 7:349 (1988)。Samulski等人（1989, J. Virol. [病毒學雜誌], 63: 3822-3828）；美國專利案號5,173,414；WO 95/13365和相應的美國專利案號5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441（PCT/US96/14423）；WO 97/08298（PCT/US96/13872）；WO 97/21825（PCT/US96/20777）；WO 97/06243 （PCT/FR96/01064）；WO 99/11764；Perrin等人(1995) Vaccine [疫苗] 13: 1244-1250；Paul等人(1993) Human Gene Therapy [人類基因療法] 4: 609-615；Clark等人, (1996) Gene Therapy [基因療法] 3: 1124-1132；美國專利案號5,786,211；美國專利案號5,871,982；和美國專利案號6,258,595。前述文獻特此藉由援引以其全文併入本文，特別強調該等文獻中與rAAV產生有關的那些章節。

因此，本發明提供了產生感染性rAAV的包裝細胞。在一個實施方式中，包裝細胞可為穩定轉化的癌細胞，諸如HeLa細胞、293細胞和PerC.6細胞（同源293細胞系）。在另一個實施方式中，包裝細胞係未轉化的癌細胞之細胞，諸如低傳代293細胞（用腺病毒E1轉化的人胎腎細胞）、MRC-5細胞（人胎成纖維細胞）、WI-38細胞（人胎成纖維細胞）、Vero細胞（猴腎細胞）和FRhL-2細胞（恒河猴胎肺細胞）。

本發明之重組AAV（即，感染性衣殼化rAAV顆粒）包含rAAV基因組。實施方式包括但不限於命名為pAAV.MHCK7.hSCGB的rAAV，其包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19所示之多核苷酸序列；以及pAAV.tMCK.hSCGB，其包含SEQ ID NO: 5所示之多核苷酸序列。

可以藉由本領域標準之方法，諸如藉由柱層析法或氯化銫梯度來純化rAAV。從輔助病毒中純化rAAV載體之方法係本領域已知的，並包括在例如Clark等人, Hum. Gene Ther. [人類基因療法],10 (6): 1031-1039 (1999)；Schenpp和Clark,Methods Mol. Med. [分子醫學方法],69 427-443 (2002)；美國專利案號6,566,118和WO 98/09657中揭露之方法。

在另一個實施方式中，本發明設想了包含本發明之rAAV之組成物。本文所述之組成物包含在藥學上可接受的載劑中的rAAV。該等組成物還可以包含其他成分，諸如稀釋劑和佐劑。可接受的載劑、稀釋劑和佐劑在所採用之劑量和濃度下對接受者無毒並且較佳的是惰性的，並且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧化劑，諸如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如吐溫（Tween）、普朗尼克（pluronic）或聚乙二醇（PEG）。

在本發明之方法中要投與的rAAV的滴定度將根據例如特定的rAAV、投與模式、治療目標、個體和靶向的細胞類型而改變，並且可以藉由本領域的標準方式測定。rAAV的滴定度範圍可為每ml約1 × 10⁶ 、約1 × 10⁷ 、約1 × 10⁸ 、約1 × 10⁹ 、約1 × 10¹⁰ 、約1 × 10¹¹ 、約1 × 10¹² 、約1 × 10¹³ 至約1 × 10¹⁴ 或更多個DNA酶抗性顆粒（DRP）。劑量也可以用病毒基因組（vg）單位數表示。rAAV的滴定度可以用超螺旋質體定量標準或線性化質體定量標準來測定。

本發明設想了在體內或體外用rAAV轉導靶細胞之方法。體內方法包括向有需要的動物（包括人）投與一個有效劑量或多個有效劑量的包含本發明之rAAV之組成物之步驟。如果在病症/疾病發展之前投與該劑量，則該投與係預防性的。如果在病症/疾病發展之後投與該劑量，則該投與係治療性的。在本發明之實施方式中，有效劑量係緩解（消除或減輕）與所治病症/疾病狀態相關的至少一種症狀，減緩或預防進展為病症/疾病狀態，減緩或預防病症/疾病狀態的進展，縮減疾病的程度，引起疾病減退（部分或全部）和/或延長生存期之劑量。設想用本發明之方法預防或治療的疾病的實例係肌肉營養不良症，諸如肢帶型肌肉營養不良症。因此，提供了一種用包含SEQ ID NO: 3或19之核苷酸序列的rAAV scAAVrh74.MHCK7.hSGCB轉導靶細胞之方法。

本發明還設想了組合療法。如本文所用的組合包括同時治療或依序治療。具體設想了本發明之方法與標準藥物治療（例如，類固醇、皮質類固醇和/或糖皮質激素，包括但不限於強體松、普賴蘇穠中的一種或多種；和地夫可特（deflazacort））的組合，也設想了與新型療法之組合。在這方面，該等組合包括在向受試者投與本發明方法的rAAV之前，在向受試者投與本發明方法的rAAV的同時，或在向受試者投與本發明方法的rAAV之後，向受試者投與一種或多種類固醇、皮質類固醇和/或糖皮質激素，包括但不限於強體松、普賴蘇穠中的一種或多種；和地夫可特。

在本發明設想的組合療法的有關實施方式中，糖皮質激素包括但不限於倍氯米松（beclomethasone）、倍他米松（betamethasone）、布地奈德（budesonide）、可的松（cortisone）、地塞米松（dexamethasone）、氫化可的松（hydrocortisone）、甲基強的松龍（methylprednisolone）或去炎松（triamcinolone）。

已經認識到，在投與rAAV載體之受試者中可能發生抗原特異性T細胞反應。這係基因轉移後2-4週之間之預期反應。此類抗原特異性T細胞反應的一種可能結果係轉導細胞的清除和轉基因表現之喪失。為了減弱宿主對基於rAAV的治療的免疫反應，在治療之前，例如，在治療程序前二十四小時，受試者可以開始採用大約1 mg/kg/天的預防性強體松或同等的糖皮質激素，最大劑量為60 mg/天。如果需要，也可以允許以1 mg/kg/天的近似劑量靜脈投與同等的糖皮質激素。治療將持續大約一個月。可以根據藉由ELISpot測定法，還有用GGT進行的肝功監測來評估的個體受試者對基因轉移之免疫反應，實施強體松或同等的糖皮質激素之遞減方案。

rAAV載體的治療有效量係範圍為約1e13 vg/kg至約5e14 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約2e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約3e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約4e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約5e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約6e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約7e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約8e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約9e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約1e14 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約2e14 vg/kg、或1e13 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約1e13至約4e14 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約4e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約5e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約6e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約7e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約8e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約9e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約1e14 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約2e14 vg/kg、或3e13 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約3e13至約4e14 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約5e14 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約6e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約7e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約8e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約9e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約1e14 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約2e14 vg/kg、或5e13 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約5e13至約4e14 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約5e14 vg/kg、或約1e14 vg/kg至約2e14 vg/kg、或1e14 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約1e14至約4e14 vg/kg、或約1e14 vg/kg至約5e14 vg/kg、6e14 vg/kg、7e14 vg/kg、8e14 vg/kg或9e14 vg/kg的rAAV劑量。本發明還包括包含該等範圍的rAAV載體之組成物。

例如，rAAV載體的治療有效量係1e13 vg/kg、約2e13 vg/kg、約3e13 vg/kg、約4e13 vg/kg、約5e13 vg/kg、約6e13 vg/kg、約7e13 vg/kg、約7.4e13 vg/kg、約8e13 vg/kg、約9e13 vg/kg、約1e14 vg/kg、約2e14 vg/kg、約3e14 vg/kg、約4e14 vg/kg和5e14 vg/kg之劑量。AAV載體的滴定度或劑量可以根據作為定量標準的質體DNA之物理形式而改變。例如，滴定度或劑量的值可以基於超螺旋標準qPCR滴定法或線性標準qPCR滴定法而改變。在一個實施方式中，rAAV的治療有效量係基於超螺旋質體作為定量標準為5e13 vg/kg之劑量，或基於線性化質體作為定量標準為1.85e13 vg/kg之劑量。在另一個實施方式中，rAAV的治療有效量係基於超螺旋質體作為定量標準為2e14 vg/kg之劑量，或基於線性化質體作為定量標準為7.41e13 vg/kg之劑量。在另一個實施方式中，scAAVrh74.MHCK7.hSGCB的治療有效量係基於超螺旋質體作為定量標準，範圍為約1e13 vg/kg至約5e14 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約2e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約3e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約4e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約5e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約6e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約7e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約8e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約9e13 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約1e14 vg/kg、或約1e13 vg/kg至約2e14 vg/kg、或1e13 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約1e13至約4e14 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約4e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約5e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約6e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約7e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約8e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約9e13 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約1e14 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約2e14 vg/kg、或3e13 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約3e13至約4e14 vg/kg、或約3e13 vg/kg至約5e14 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約6e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約7e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約8e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約9e13 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約1e14 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約2e14 vg/kg、或5e13 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約5e13至約4e14 vg/kg、或約5e13 vg/kg至約5e14 vg/kg、或約1e14 vg/kg至約2e14 vg/kg、或1e14 vg/kg至約3e14 vg/kg、或約1e14至約4e14 vg/kg、或約1e14 vg/kg至約5e14 vg/kg、6e14 vg/kg、7e14 vg/kg、8e14 vg/kg或9e14 vg/kg之劑量。本發明還包括包含該等劑量的rAAV載體之組成物。

有效劑量之組成物的投與可以藉由本領域的標準途徑進行，包括但不限於肌內、腸胃外、靜脈內、口服、經頰、鼻、肺、顱內、骨內、眼內、直腸或陰道途徑。熟悉該項技術者可以對感染和/或所治疾病狀態以及要表現β-肌聚糖的靶細胞/組織加以考慮來選擇和/或匹配本發明之rAAV的AAV組分（尤其是AAV ITR和衣殼蛋白）之投與途徑和血清型。

本發明提供了有效劑量的rAAV和本發明之組成物之局部投與和全身投與。例如，全身投與係向循環系統投與，使得整個身體受到影響。全身投與包括經腸投與（諸如藉由胃腸道吸收）和藉由注射、輸注或植入進行的腸胃外投與。

具體而言，本發明之rAAV的實際投與可以藉由使用將rAAV重組載體轉運到動物靶組織內的任何物理方法來實現。根據本發明之投與包括但不限於注射至肌肉、血流和/或直接注射至肝臟。已經證明簡單地將rAAV重懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水中足以提供可用於肌肉組織表現之媒介物，並且對可以與rAAV共同投與的載劑或其他組分沒有已知的限制（但是會降解DNA之組成物應避免以常規方式與rAAV一起使用）。可以修飾rAAV的衣殼蛋白，使得將rAAV靶向感興趣的特定靶組織，諸如肌肉。參見例如WO 02/053703，其揭露內容藉由援引併入本文。

藥物組成物可以製備成可注射製劑或局部製劑，以藉由透皮轉運遞送至肌肉。先前已經開發了許多用於肌內注射和透皮轉運的製劑，並且可以用於實踐本發明。rAAV可以與任何藥學上可接受的載劑一起使用，以易於投與和處理。因此，在另一方面，本申請關於一種製劑，該製劑包含：含有AAVrh74來源的衣殼的rAAV、緩衝劑、離子強度劑和表面活性劑。在一個實施方式中，rAAV之濃度為約1.0 × 10¹² vg/ml至約5.0 × 10¹⁴ vg/ml。在另一個實施方式中，基於超螺旋質體作為定量標準，rAAV之濃度為約5.0 × 10¹² vg/ml至約1.0 × 10¹⁴ vg/ml。在另一個實施方式中，基於超螺旋質體作為定量標準，rAAV之濃度為約2.0 × 10¹³ vg/ml。在一個實施方式中，rAAV係scAAVrh74.MHCK7.hSGCB載體。在一個實施方式中，基於超螺旋質體作為定量標準，組成物或製劑中rAAV之濃度為1 × 10¹³ vg/ml至2 × 10¹⁴ vg/ml。在另一個實施方式中，基於超螺旋質體作為定量標準，濃度為2 × 10¹³ vg/ml、4 × 10¹³ vg/ml或5 × 10¹³ vg/ml。在一個實施方式中，緩衝劑包括tris、tricine、Bis-tricine、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES和CAPS中的一種或多種。在另一個實施方式中，緩衝劑包含濃度為約5 mM至約40 mM的pH 8.0的tris。在一個實施方式中，緩衝劑包含約20 mM的pH 8.0的tris。在一個實施方式中，離子強度劑包含以下一種或多種：氯化鉀（KCl）、乙酸鉀、硫酸鉀、硫酸銨、氯化銨（NH₄ Cl）、乙酸銨、氯化鎂（MgCl₂ ）、乙酸鎂、硫酸鎂、氯化錳（MnCl₂ ）、乙酸錳、硫酸錳、氯化鈉（NaCl）、乙酸鈉、氯化鋰（LiCl）和乙酸鋰。在一個實施方式中，離子強度劑包含濃度為約0.2 mM至約4 mM的MgCl₂ 。在另一個實施方式中，離子強度劑包含濃度為約50 mM至約500 mM的NaCl。在另一個實施方式中，離子強度劑包含濃度為約0.2 mM至約4 mM的MgCl₂ 和濃度為約50 mM至約500 mM的NaCl。在另一個實施方式中，離子強度劑包含濃度為約1 mM的MgCl₂ 和濃度為約200 mM的NaCl。在一個實施方式中，表面活性劑包含磺酸鹽、硫酸鹽、膦酸鹽、磷酸鹽、泊洛沙姆和陽離子表面活性劑中的一種或多種。在一個實施方式中，泊洛沙姆包含泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆331、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407中的一種或多種。在一個實施方式中，表面活性劑包含濃度為約0.00001%至約1%的泊洛沙姆。在另一個實施方式中，表面活性劑包含濃度為約0.001%的泊洛沙姆188。為了肌內注射的目的，可以採用在佐劑諸如芝麻油或花生油中或在丙二醇水溶液中的溶液，以及無菌水溶液。如果需要，可以緩衝此類水溶液並且首先用鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑變得等滲。可以在適當地混有表面活性劑諸如羥丙基纖維素的水中製備呈游離鹼（DNA含有酸性磷酸基團）或藥理學上可接受的鹽的rAAV的溶液。rAAV分散體也可以在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中以及在油中製備。在普通儲存和使用條件下，該等製備物含有防腐劑以防止微生物生長。就此而言，所採用的無菌水性介質全部可以藉由熟悉該項技術者眾所周知的標準技術容易地獲得。

適合於可注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。在所有情況下，該形式必須無菌並且就易於注射而言必須為流體。它在製造和儲存條件下必須穩定，並且必須防止諸如細菌和真菌等微生物的污染作用。載劑可為含有以下各項的一種溶劑或分散介質：例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等）、其合適的混合物以及植物油。可例如藉由使用諸如卵磷脂等包衣，藉由在分散液的情況下維持所需粒度以及藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。預防微生物作用可藉由各種抗細菌劑和抗真菌劑（例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞等）來實現。在許多情況下，較佳的是包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可藉由使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現可注射組成物之延長吸收。

藉由以下方式製備無菌可注射溶液：將rAAV以所需的量根據需要與以上枚舉的各種其他成分摻入適當的溶劑中，然後過濾滅菌。通常，藉由將滅菌的活性成分摻入無菌媒介物中來製備分散體，該無菌媒介物含有基礎分散介質以及來自以上枚舉的那些的所需其他成分。就用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末而言，較佳的製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥技術，該等方法產生活性成分的粉末以及來自其先前的無菌過濾溶液的任何另外的所需成分。

rAAV的轉導也可以在體外進行。在一個實施方式中，從受試者中取出所需的靶肌肉細胞，用rAAV轉導並重新引入受試者體內。替代性地，可以使用同基因或異基因肌細胞，其中那些細胞不會在受試者中產生不適當的免疫反應。

用於轉導並將轉導的細胞重新引入受試者體內的合適方法係本領域已知的。在一個實施方式中，可以藉由以下方式對細胞進行體外轉導：將rAAV與肌細胞組合（例如在適當的培養基中），並使用常規技術諸如南方墨點法和/或PCR或藉由使用可選標記來篩選那些攜帶感興趣的DNA之細胞。然後可以將轉導的細胞配製成藥物組成物，並藉由各種技術將該組成物引入受試者體內，諸如藉由肌內、靜脈、皮下和腹膜內注射，或藉由使用例如導管注射入平滑肌和心肌。

用本發明之rAAV轉導細胞引起β-肌聚糖的持續表現。因此本發明提供了將表現β-肌聚糖的rAAV投與/遞送給哺乳動物受試者（較佳的是人類）之方法。該等方法包括用本發明之一種或多種rAAV轉導組織（包括但不限於組織（諸如肌肉）、器官（諸如肝臟和腦部）、以及腺體（諸如唾液腺））。可以用包含組織特異性控制元件的基因盒進行轉導。例如，本發明之一個實施方式提供了轉導由肌肉特異性控制元件指導的肌細胞和肌肉組織之方法，該等肌肉特異性控制元件包括但不限於：源自肌動蛋白和肌球蛋白基因家族的那些，諸如源自myoD基因家族的那些 [參見Weintraub等人,Science [科學],251 : 761-766 (1991)]，肌細胞特異性增強子結合因子MEF-2 [Cserjesi和Olson,Mol Cell Biol [分子細胞生物學] 11: 4854-4862 (1991)]，源自人骨骼肌動蛋白基因的控制元件 [Muscat等人 , Mol Cell Biol [分子細胞生物學],7 : 4089-4099 (1987)]，心肌肌動蛋白基因，肌肉肌酸激酶序列元件[參見Johnson等人, Mol Cell Biol [分子細胞生物學],9 :3393-3399 (1989)]和鼠肌酸激酶增強子（mCK）元件，源自骨骼快肌肌鈣蛋白C基因、慢肌肌鈣蛋白C基因和慢肌肌鈣蛋白I基因的控制元件：缺氧誘導型核因子（Semenza等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊],88 : 5680-5684 (1991)），類固醇誘導元件和啟動子（包括糖皮質激素反應元件（GRE））（參見Mader and White,Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 90: 5603-5607 (1993)），以及其他控制元件。

肌肉組織係有吸引力的體內DNA遞送靶標，因為它不是重要器官，並且易於進入。本發明設想了來自轉導的肌纖維的miRNA之持續表現。

「肌肉細胞」或「肌肉組織」意指源自任何種類的肌肉（例如，骨骼肌和平滑肌，例如來自消化道、膀胱、血管或心臟組織）之一種細胞或一組細胞。此類肌肉細胞可為分化或未分化的，諸如成肌細胞、肌細胞、肌管、心肌細胞和心肌成肌細胞。

術語「轉導」用於指經由描述的複製缺陷型rAAV將感興趣的多核苷酸（例如，編碼β-肌聚糖之多核苷酸序列）投與/遞送至體內或體外的接受者細胞，引起β-肌聚糖在接受者細胞中表現。

因此，本文還描述了向有需要的哺乳動物受試者投與有效劑量（或基本上同時投與之劑量或間隔給予之劑量）的編碼β-肌聚糖的rAAV。

在本文中提及的所有出版物和專利均特此藉由援引以其全文併入，如同明確並且單獨地指明各個單獨的出版物或專利藉由援引併入一樣。如果出現衝突，則以本申請（包含本文的任何定義）為準。

本發明在以下實例中進一步說明，該等實例不得限制申請專利範圍中所描述的本發明之範圍。

在另一個實施方式中，本揭露提供了一種產生rAAV pAAV.MHCK7.hSCGB之方法，該方法包括將AAV載體質體轉移至宿主細胞。將DNA轉移至宿主細胞之方法係本領域已知的，包括但不限於轉染、感染、轉化、電穿孔和轉導。在一個實施方式中，載體質體包含與SEQ ID NO: 24至少90%、95%、或99%相同之核苷酸序列。在另一個實施方式中，載體質體包含SEQ ID NO: 24之核苷酸序列。另一方面，本揭露提供了一種包含AAV載體質體的宿主細胞，該載體質體包含SEQ ID NO: 24之核苷酸序列。在一些實施方式中，AAV載體質體在宿主細胞中穩定表現。穩定地攜帶AAV載體質體的宿主細胞可用於產生rAAV。在一個實施方式中，AAV載體質體係pAAV.MHCK7.hSGCB. KAN質體。pAAV.MHCK7.hSGCB. KAN質體如圖11所示。

在一個實施方式中，載體質體包含與SEQ ID NO: 1、3、5、或19至少90%、95%、或99%相同之核苷酸序列。在一個實施方式中，載體質體包含SEQ ID NO: 1、3、5或19之核苷酸序列。在一個實施方式中，產生rAAV之方法還包括將包裝質體和/或輔助病毒轉移至宿主細胞。在一些實施方式中，包裝質體包含與啟動子可操作連接的AAV rep和/或cap基因。在一個實施方式中，啟動子係AAV轉錄啟動子。在一個實施方式中，宿主細胞係包裝細胞。在一個實施方式中，包裝細胞包含穩定整合的AAV cap基因。在另一個實施方式中，包裝細胞包含穩定整合的AAV rep基因。

如本文所用，術語「宿主細胞」係指可用於表現外源DNA序列之細胞。宿主細胞的非限制性實例包括微生物、酵母細胞、昆蟲細胞和/或哺乳動物細胞。宿主細胞可用作AAV輔助構建體、包裝質體、AAV載體質體、協助工具載體或其他DNA的接受者。這裡所用的術語涵蓋在原始宿主細胞中表現外源DNA序列後原始細胞的後代。用於產生AAV的宿主細胞的非限制性實例包括Sf9昆蟲細胞和HEK 293T細胞。在一個實施方式中，本文所述之細胞包括昆蟲細胞，例如果蠅細胞（例如，S2細胞或Kc細胞）、蠶細胞（例如，Bme21細胞）、或蚊細胞（例如，C6/36細胞）；或哺乳動物細胞（較佳的是人細胞，例如人原代細胞或已建立的細胞系）。在一個實施方式中，哺乳動物細胞包括293細胞、COS細胞、HeLa細胞、或KB細胞。可以藉由感染（病毒或桿狀病毒）、使用試劑（例如脂質體、磷酸鈣）進行的暫態轉染或物理手段（例如電穿孔）、或本領域已知的其他手段將AAV載體質體引入宿主細胞例如Sf9或293T中。在另一個實施方式中，宿主細胞系有rAAV質體穩定整合到其基因組中。可以藉由將選擇標記摻入載體質體中來建立此類穩定的細胞系。

在一個實施方式中，宿主細胞係用於產生AAV病毒顆粒的包裝細胞。因此，另一方面，本揭露提供了包含AAV載體質體的宿主細胞，該載體質體包含與SEQ ID NO: 24至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。在一個實施方式中，AAV載體質體包含SEQ ID NO: 24之核苷酸序列。在另一個實施方式中，宿主細胞包含SEQ ID NO: 1、3、5或19之核苷酸序列。實例

使用scAAVrh74.MHCK7.hSGCB的臨床前研究在國際專利公開案號WO 2017/180976中有描述，該專利公開藉由援引以其全文併入本文。實例 1 材料與方法

動物模型 -所有程序均已獲得全國兒童醫院研究所的機構動物護理使用委員會（The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital Institutional Animal Care and Use Committee）批准（方案AR12-00040）。B6.129-Sgcb^tm1Kcam/1J 雜合小鼠購自傑克遜實驗室（Jackson Laboratory）（美國緬因州巴爾港（Bar Harbor, ME, USA）；品系# 006832）。藉由使雜合小鼠繁殖產生Sgcb⁻ ^/ ⁻ 小鼠。在全國兒童醫院研究所的動物資源中心（Animal Resources Core），使KO小鼠在標準條件下進行繁殖並維持為純合動物。使小鼠維持泰柯拉全面性齧齒動物飲食（Teklad Global Rodent Diet）（3.8z5纖維、18.8%蛋白質、5%脂肪食物）以及12:12小時的黑暗:光照循環。藉由使用PCR進行基因分型來進行SGCB⁻ ^/ ⁻ 小鼠的鑒定。將所有動物圈養在標準的小鼠籠中，隨意進食和飲水。

β- 肌聚糖基因構建 。全長人β-肌聚糖cDNA（GenBank登錄號NM_0034994.3）由美國新澤西州皮斯卡塔韋（Piscataway, NJ, USA）的金斯瑞公司（GenScript Inc.）進行密碼子優化和合成。藉由金斯瑞進行的密碼子優化使用了一種演算法，該演算法考慮了包括轉錄、mRNA加工和穩定性、翻譯和蛋白質折疊在內的參數，以設計出引起在肌肉組織中最大限度表現的cDNA序列（www.genscript.com）。

對於pAAV.tMCK.hSGCB構建體，然後將cDNA選殖到含有AAV2 ITR的質體中，並且該盒包含共有Kozak序列（CCACC）、SV40嵌合內含子和合成的聚腺苷酸化位點（53 bp）。重組tMCK啟動子由肖小（Xiao Xiao）博士（北卡羅來納大學（University of North Carolina））饋贈。它係對先前描述的CK6啟動子27的修飾，並且包括在含有轉錄因子結合位點的啟動子區上游的增強子中之修飾。增強子由兩個E-box（右和左）組成。tMCK啟動子修飾包括將左側E-box轉換為右側E-box的突變（2R修飾）和6-bp插入（S5修飾）。藉由將來自pUC57-BSG（金斯瑞公司）的1040 bp KpnI/XbaI片段連接到pAAV. tMCK.hSGCA.26的KpnI/XbaI位點構建了pAAV.tMCK.hSGCB載體。

藉由去除tMCK啟動子和具有NotI/KpnI位點的SV40嵌合內含子，並將含有MHCK7啟動子和具有NotI/KpnI位點的相同SV40嵌合內含子的PCR擴增片段插入，構建了pAAV.MHCK7.hSGCB載體。MHCK7係一種基於MCK之啟動子，它利用從內源性肌肉肌酸激酶基因內轉錄起始位點5’的~1.2 kb處獲得的206-bp增強子與近端啟動子（enh358MCK, 584-bp）^3,12 。MHCK7啟動子本身含有這種來自MCK基因家族的經修飾之CK7盒，該盒連接至CK部分5’的188-bp α-MyHC（α-肌球蛋白重鏈）增強子，以增強心臟表現¹² 。在tMCK和MHCK7之間，啟動子（CK）的肌酸激酶部分96%相同。最後，藉由將來自pAAV.MHCK7.DYSF5’DV44的960 bp NotI/KpnI MHCK7 + 內含子片段連接到pAAV.tMCK.hSGCB的NotI/KpnI位點，構建了pAAV.MHCK7.hSGCB載體（Pozgai等人,Gene Ther. [基因療法] 23: 57-66, 2016）。

rAAV 的產生 。使用Rodino-Klapac等人（J. Trans. Med . [轉化醫學雜誌] 5:45, 2007）先前報導的一種改進的交叉包裝方法產生rAAV載體。這裡，在HEK293細胞中用CaPO₄ 沈澱進行的三重轉染方法允許將AAV2 ITR包裝到不同的AAV衣殼血清型中。(28,29) 生產質體係 (i) pAAV.tMCK.hSGCB或pAAV.MHCK7.hSGCB，(ii) 編碼cap血清型8類分離株rh.74的經rep2-caprh.74修飾的AAV輔助質體和 (iii) 表現腺病毒E2A、E4 ORF6和VA I/II RNA基因的腺病毒5型輔助質體（pAdhelper）。如先前所述，純化載體並測定衣殼化vg滴定度（利用Prism 7500 Taqman檢測器系統；美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的PE應用生物系統公司（PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA）。30引物和螢光探針靶向tMCK啟動子並且如下：tMCK正向引物，5′-ACC CGA GAT GCC TGG TTA TAA TT-3′（SEQ ID NO: 10）；tMCK反向引物，5′-TCC ATG GTG TAC AGA GCC TAA GAC-3′（SEQ ID NO: 11）；和tMCK探針，5′-FAM-CTG CTG CCT GAG CCT GAG CGG TTA C-TAMRA-3′（SEQ ID NO: 12）。引物和螢光探針靶向MHCK7啟動子並且如下：MHCK7正向引物，5’-CCA ACA CCT GCT GCC TCT AAA-3’（SEQ ID NO: 16）；MHCK7反向引物，5’-GTC CCC CAC AGC CTT GTT C-3’（SEQ ID NO: 17）；和MHCK7探針，5’-FAM-TGG ATC CCC-Zen-TGC ATG CGA AGA TC-3IABKFQ-3’（SEQ ID NO: 18）。

全身基因遞送： 藉由將載體注射到sgcb ^-/- 小鼠的尾靜脈中來實現全身遞送。使用30規格的超細胰島素注射器為小鼠注射3 × 10¹² vg稀釋於鹽水中的scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB（2.0 × 10¹⁴ vg/kg）。將小鼠約束在保持管中，將尾部通過尾槽放回原處以使其升溫，以便擴張血管以易於注射。定位尾部中心線下方的動脈之後，在與尾動脈並排延伸的紫色/藍色側靜脈之一中進行注射。所有經過治療的小鼠均在4-5週齡時進行注射，並在注射後6個月施安樂死。

免疫螢光 。在室溫下於潮濕腔室內將冷凍切片（12 μm）與單株人β-肌聚糖一抗（英國紐卡斯爾的徠卡生物系統公司（Leica Biosystems, New Castle, UK）；目錄號NCL-L-b-SARC）一起以1:50的稀釋度在封閉緩衝液（1 × TBS、10%山羊血清、0.1%吐溫）中孵育1小時。然後用TBS洗滌切片三次，每次20分鐘，然後再次封閉30分鐘。將AlexaFluor 594偶聯的山羊抗小鼠IgG1二抗（美國紐約格蘭德艾蘭的生命科技公司（Life Technologies, Grand Island, NY, USA）；目錄號A21125）以1:250的稀釋度施加45分鐘。在TBS中洗滌切片三次，每次20分鐘，並用Vectashield封固劑（美國加利福尼亞州伯林蓋姆的載體實驗室（Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA））封固。使用Zeiss AxioCam MRC5相機拍攝覆蓋肌肉部分的四個不同象限的四張隨機 × 20圖像。測定每個圖像中β-肌聚糖染色呈陽性的纖維百分比（肌肉膜染色強度為450%），並為每種肌肉取平均值。

蛋白質印跡分析 。將組織切片或肌肉生檢樣本收集到微量離心機中，並在存在1片蛋白酶抑制劑混合片劑（美國印第安那州印弟安納波里斯的羅氏公司（Roche, Indianapolis, IN, USA））的情況下，用100 μl勻化緩衝液（125 mM Tris-HCl、4% SDS、4 M尿素）進行勻化。勻化後，將樣本在4°C下以10,000 rpm離心10分鐘。在NanoDrop（美國麻塞諸塞州沃爾瑟姆的賽默科技公司（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA））上對蛋白質進行定量。將蛋白質樣本（20 μg）在3%-8%聚丙烯醯胺Tris-乙酸鹽凝膠（NuPage，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德的英傑公司（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA））上以150 V電泳1小時5分鐘，然後轉移到PVDF膜（美國新澤西州皮斯卡塔韋的安瑪西亞生物科學公司（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）上，在35 V下保持1小時15分鐘。將膜在5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1小時，然後與兔多株人β-肌聚糖抗體（美國科羅拉多州利特爾頓的羅福斯生物製劑公司（Novus Biologicals, Littleton, CO, USA）；目錄號NBP-1-90300 1:100或1:250稀釋度）和1:5000的單株小鼠γ-微管蛋白抗體（美國密蘇里州聖路易斯的西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）；目錄號T6557）或1:5000稀釋度的小鼠單株小鼠α-肌動蛋白抗體（美國密蘇里州聖路易斯的西格瑪奧德里奇公司；目錄號A7811）一起孵育。使用1:500稀釋度的兔多株小鼠心肌肌鈣蛋白I抗體（麻塞諸塞州劍橋的艾博抗（Abcam, Cambridge, MA）；目錄號ab47003）和1:1000稀釋度的兔單株小鼠黏著斑蛋白抗體（馬里蘭州弗雷德里克的英傑公司（Invitrogen, Frederick, MD）；目錄號70062）。使用抗小鼠（美國麻塞諸塞州比勒利卡的密理博（Millipore, Billerica, MA, USA）；目錄號AP308P）和抗兔（生命科技公司（Life Technologies）；目錄號656120）二次HRP抗體進行ECL免疫檢測。

生物分佈 qPCR 分析。如先前所述，進行Taqman定量PCR來定量靶向和非靶向對側肌肉中存在的載體基因組拷貝的數量。(18,30)使用載體特異性引物探針組來擴增直接位於tMCK啟動子下游的內含子區的序列，tMCK啟動子係獨特的並且位於scAAVrh.74.tMCK.hSGCB轉基因盒內。本研究中使用以下引物和探針：tMCK和MHCK7內含子正向引物5′-GTG AGG CAC TGG GCA GGT AA -3′（SEQ ID NO: 13）；tMCK和MHCK7內含子反向引物5′-ACC TGT GGA GAG AAA GGC AAA G -3′（SEQ ID NO: 14）；以及tMCK和MHCK7內含子探針5′-6FAM-ATC AAG GTT ACA AGA CAG-GTT TAA GGA GAC CAA TAG AAA -tamra-3′（IDT）（SEQ ID NO: 15）。拷貝數報告為每微克基因組DNA的載體基因組數。用於免疫細胞染色的免疫組織化學法 。使用免疫組織化學法鑒定免疫細胞。使用抗大鼠Ig HRP檢測套組（kit）（美國加利福尼亞州聖約瑟的BD製藥公司（BD Pharmagen, San Jose, CA, USA）；目錄號：551013）：CD3（目錄號：555273）、CD4（目錄號：550280）、CD8（目錄號：550281）和用於巨噬細胞的Mac-3（目錄號：550292），將Fisherbrand Superfrost帶電顯微鏡載玻片上的冷凍組織切片與大鼠抗小鼠單株抗體一起孵育。所有一抗都用磷酸鹽緩衝鹽水按1:20稀釋。使用稀釋於含鏈黴親和素-HRP過氧化物酶依克他汀（ectastain）ABC過氧化物酶的DAB緩衝液中的DAB色原，使陽性免疫染色可見。每種肌肉和每種相應的染劑拍攝十張隨機的 × 40圖像。對單核細胞的數量進行計數，並以每mm² 的總數表示。

免疫螢光 ：藉由我們先前使用的方案，如Pozgai等人, Gene Therap. [基因療法] 23: 57-66, 2016，對來自脛骨前肌（TA）、腓腸肌（GAS）、四頭肌（QUAD）、腰大肌（PSOAS）、臀肌（GLUT）、三頭肌（TRI）和膈肌以及心臟的冷凍切片（12 µm）進行針對hSGCB轉基因的免疫螢光染色。將切片與小鼠單株人β-肌聚糖一抗（英國紐卡斯爾的徠卡生物系統公司（Leica Biosystems, New Castle, UK）；目錄號NCL-L-b-SARC）以1:100的稀釋度進行孵育。使用Zeiss AxioCam MRC5相機拍攝覆蓋肌肉部分的四個不同象限的四張隨機20X圖像。測定每個圖像中β-肌聚糖染色呈陽性的纖維百分比（＞ 50%肌肉膜染色），並為每種肌肉取平均值。

形態計量分析 ：對來自7月齡C57BL6 WT小鼠（n = 5）、sgcb^-/- 小鼠（n = 5）和經rAAV.MHCK7.hSGCB治療6個月的sgcb^-/- 小鼠（n = 5）的12 µm厚的冷凍切片進行蘇木精和伊紅（H&E）染色以便分析。測定TA、GAS、QUAD、PSOAS、GLUT、TRI和膈肌中具有中央核的肌纖維百分比。另外，測量GAS、PSOAS和TRI肌肉中的肌纖維直徑。用Zeiss AxioCam MRC5相機為每隻動物的每種肌肉拍攝四張隨機的20X圖像。使用NIH ImageJ軟體對核中心移位纖維進行定量，並使用Zeiss Axiovision LE4軟體測量纖維直徑。

開籠活動之 X 雷射監測 ：使用曠野活動室確定實驗小鼠的整體活動。按照先前描述的方案（Kobayashi等人,Nature [自然] 456: 511-5, 2008, Beastrom等人,Am. J. Pahol . [病理學雜誌] 179: 2464-74, 2011），做幾項修改對來自C57BL6 WT（n = 6）和未經治療的sgcb^-/- （n = 6）對照組的7月齡小鼠以及經rAAV.MHCK7.hSGCB治療6個月的sgcb^-/- 小鼠（n = 6）進行分析。當小鼠最活躍時，在清晨到接近夜晚週期結束時的一天的同一時間對所有小鼠進行測試。所有小鼠均在隔離房間中，在弱光下進行測試，每次使用相同的處理方式。為了減少焦慮並儘量減少行為變數（焦慮和行為變數可能會影響小鼠的正常活動並因此影響測定結果），沒有單獨圈養所測試的小鼠（Voikar等人,Genes Brain Behav. [基因、大腦與行為] 4: 240-52, 2005）。使用光電束活動系統（Photobeam Activity System）（加利福利亞州聖地牙哥的聖地牙哥儀器公司（San Diego Instruments, San Diego, CA））監測小鼠的活動。該系統使用不可見的紅外光束網格，紅外光束穿過動物腔室前後左右移動，以監測小鼠在X-Y-Z平面內的位置和運動。以5分鐘的間隔記錄1小時週期之活動。在開始採集數據前幾天，使小鼠適應活動測試室，持續最初的1小時時期。在獨立腔室中，4隻一組對小鼠進行測試。每次使用之間都要清潔測試設備，以減少可能改變我們的結果的小鼠反應行為變數。將收集的數據轉換為Microsoft Excel工作表，並且在Excel程式中完成所有計算。對於每隻小鼠，將X和Y平面中運動的單個光束中斷相加，以表示總體移動，並且將Z平面中的光束中斷相加以獲得在1小時的時間間隔內的垂直活動。實例 2 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 構建

構建如圖1所示的含有密碼子優化的全長人SCGB cDNA之轉基因盒。該盒包括共有Kozak序列（CCACC）、SV40嵌合內含子、合成的聚腺苷酸化位點和用於驅動該盒表現的肌肉特異性MHCK7。這係一種基於MCK的啟動子，它利用從內源性肌肉肌酸激酶基因內轉錄起始位點5’的~1.2 kb處獲得的206-bp增強子與近端啟動子（enh358MCK, 584-bp）^3,12 。將該盒包裝到與AAV8有93%同源的自我互補（sc）的AAVrh.74載體中。已經證實AAVrh.74在小鼠和非人靈長類動物中是安全有效的，特別是在通過循環遞送至肌肉時穿過血管屏障時更係如此。(17, 18, 21)實例 3 高劑量 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 全身遞送的長期功效

按照以1.0 × 10¹² vg總劑量（5.0 × 10¹³ vg/kg）scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB之劑量進行的先前研究的強烈結果，以3.0 × 10¹² vg總劑量（2.0 × 10¹⁴ vg/kg）的高劑量，藉由尾靜脈注射將載體遞送給6隻SGCB^-/- 小鼠，以評估在24週的長期時間點全身遞送時載體的轉基因表現和功效。在4-5週齡時為小鼠進行注射，並在注射後24週對所有6隻小鼠進行完整屍檢。提取以下肌肉進行分析：TA、腓腸肌、四頭肌、臀大肌、腰大肌、三頭肌、膈肌和心肌。還取出器官進行毒理學和生物分佈研究。簡言之，以這種高劑量治療24週後hSGCB轉基因表現與我們先前研究之劑量（所有肌肉98.10%）相比較高（所有肌肉98.77%），並且來自經過治療的小鼠的所有肌肉再次幾乎完全轉導。這伴隨著改善的肌肉組織病理學和改善的功能。 β- 肌聚糖表現

使用針對人β-肌聚糖的免疫螢光（IF）染色來測定除了給予hSGCB載體全身注射的所有KO小鼠的膈肌和心臟外以外的六種骨骼肌中的hSGCB轉基因表現。該等肌肉包括TA、腓腸肌（GAS）、四頭肌（QUAD）、臀肌（GLUT）、腰大肌（PSOAS）和三頭肌（TRI）。為了表現分析和轉導效率的目的，利用來自六隻經治療的小鼠的肌肉之圖像進行定量。對每種肌肉拍攝四張20X圖像，並對每張圖像測定hSGCB陽性纖維的百分比，從而得出每隻小鼠的每種肌肉的平均轉導百分比，並將該等數據呈現在附錄C中。在圖2A下方的圖中所示的結果係來自經過治療的小鼠的代表性圖像，並再次展示在所分析的所有肌肉（包括膈肌和心肌）中的轉導率 ≥ 98%。最後，圖2B中也描繪了的蛋白質印跡顯示hSGCB在TA和TRI肌肉中之表現與遞送初始臨床劑量之後達到之表現相似。 經治療的肌肉的組織病理學

如先前所討論的，SGCB^-/- 小鼠的骨骼肌和心肌均表現出廣泛的肌病，包括明顯的肌纖維萎縮和肥大，並伴有多個壞死灶區。還存在越來越多數量的單核細胞炎症（淋巴細胞和巨噬細胞，伴有中性粒細胞分散）和增加的營養不良性鈣化、脂肪浸潤、中心成核和纖維化。下圖3中的蘇木精和伊紅染色展示了與正常野生型小鼠相比時SGCB^-/- 小鼠中的這種營養不良表型，以及治療後肌肉病理的改善。組織學參數的定量顯示，由於β-肌聚糖基因轉移，許多不同的骨骼肌中的中心成核（CN）減少。對肌肉組織病理學更深入的分析揭示，在用載體治療的患病小鼠中，在所有檢查的三種肌肉（腓腸肌、腰大肌和三頭肌）中的纖維大小分佈歸一化，伴有平均纖維直徑增加（圖3）。 全身遞送的功能評估

為了確定高劑量hSGCB基因轉移是否為患病肌肉提供了更大的功能益處，測定用高劑量scAAVrh.74.MHCK7.hSCGB治療的SGCB^-/- 小鼠的膈肌的功能特性。展示了組織病理學，並確定了SGCB^-/- 小鼠膈和心臟中的功能缺陷。與BL6 WT小鼠相比，β-肌聚糖KO膈展示出比力輸出降低50.9%（116.24 mN/mm² 與236.67 mN/mm² ）。尾靜脈遞送高劑量scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB引起膈中近100%的hSGCB表現，從而導致膈比力輸出恢復，比力輸出提高到259.97 mN/mm² （n = 6）（圖4）。該等數據表明，高劑量hSGCB基因轉移確實為缺乏β-肌聚糖的患病肌肉提供了更大的功能益處。

為了確定高劑量AAV.hSGCB治療是否為患病的SGCB^-/- 小鼠提供總體功能益處（正如遞送我們的臨床劑量時所發生的那樣）並最終改善SGCB^-/- 小鼠的表型，對所有組的小鼠均進行了開籠活動的雷射監測。下圖5中的圖表描繪了與WT相比，KO小鼠在x和y平面中的總體移動顯著減少58.6%，而後肢垂直站立則減少了48.9%。藉由定性觀察，經高劑量scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB治療的小鼠與KO相比總體上更活躍，並且這在活動定量中得到了證明，其中經MCHK7治療的小鼠的總體移動增加36.2%且後肢垂直站立增加39.0%（每組n = 6）（圖5）。

以3.0 × 10¹² vg總劑量（2.0 × 10¹⁴ vg/kg）的較高劑量靜脈注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB，導致肢體骨骼肌、膈及重要的是心肌中的hSGCB表現幾乎完全轉導並恢復（≥ 98%）（圖2）。由於自我互補的AAV載體和rh.74血清型，使用相對較低之劑量（5.0 × 10¹³ vg/kg和2.0 × 10¹⁴ vg/kg）在全身所有肌肉中達到高水平的轉導，這一事實使這種療法非常有希望轉變為用於LGMD2E患者。治療後，所有肌肉在不存在β-肌聚糖的情況下出現的嚴重營養不良病理得到顯著改善（圖3）。該等結果導致觀察到膈中的比力輸出增加並且開籠活動增加（圖4、圖5）。實例 4 毒理學與載體生物分佈

這項研究的目的是評估供試品scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB遞送後24週時，SGCB基因治療在雄性和雌性SGCB^-/- 小鼠中的任何潛在毒性或安全性問題。將供試品以3.0 × 1012 vg總劑量（2.0 × 10¹⁴ vg/kg），藉由靜脈內（IV）途徑給予4-5週齡的SGCB^-/- 小鼠，總體積為520 μL，分為兩次注射，每次260 μL，間隔5小時達到所需劑量。為了評估我們的載體的安全性，對於從用載體治療的一組六隻SGCB^-/- 小鼠連同注射LRS的兩隻WT和兩隻KO對照收穫的肌肉組織和所有異位器官的冷凍切片進行蘇木精和伊紅染色（表1）。 [表 1 ]： scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 安全性研究設計

分組	基因型	載體滴定度（ vg 總劑量）	小鼠編號	性別	注射時的年齡	屍檢時的年齡
1	SGCB-/-	3.0 × 10¹²	785	雄性	4週	28週
786	雌性	4週	28週
787	雌性	4週	28週
788	雄性	4週	28週
789	雄性	4週	28週
790	雄性	4週	28週
2	SGCB-/-	無	1	雄性	N/A	28週
2	雄性	N/A	28週
3	野生型	無	1	雄性	N/A	28週
2	雄性	N/A	28週

然後，由獸醫病理學家對該等切片進行正式的毒性審查，除兩隻經治療的小鼠（#789和790）的肝臟中有幾個肝臟病變灶區外，在來自任何小鼠的大多數樣本中均未檢測到不良反應。還使用qPCR和西方墨點法評估蛋白質表現和載體生物分佈，該等數據表明除#785和#787小鼠的肝臟外，在任何非肌肉組織中均沒有hSGCB轉基因表現。 經載體轉導的組織的組織病理學審查

為了確定使用全身遞送的2.0 × 10¹⁴ vg/kg scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB的安全性和毒理學特徵，從一組載體給藥的SGCB^-/- 小鼠和對照中收穫各種骨骼肌（包括膈）連同心臟和五個其他器官，並由獨立的獸醫病理學家對每種組織的H&E切片進行正式審查。組的詳細資訊和研究設計如表1所示。

scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB組織病理學研究的給藥群組。向兩隻BL6 WT小鼠和兩隻SGCB^-/- 小鼠注射LRS，作為適當的年齡匹配的對照。藉由靜脈給予六隻SGCB^-/- 總劑量為3.0 × 1012 vg。注射後24週對小鼠施安樂死，終點年齡為28週。

總的來說，靜脈注射高劑量scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB不會在所檢查的任何骨骼肌肌纖維中引發任何微觀變化。在肌肉中注意到的任何變化在經過治療的小鼠和對照小鼠中均可見，被認為係偶然發現。另外，在進行組織學上評價的大多數非肌肉組織中均未見與治療相關的病變，只有小鼠#789和#790的肝臟顯示出局灶性肝臟病變。

為了進一步評價臨床肝功能，評估了該等小鼠血清中肝酶之水平。兩隻未經治療的BL6 WT小鼠和兩隻未經治療的SGCB^-/- 小鼠連同六隻經scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB治療的小鼠的丙胺酸轉胺酶（ALT）和天冬胺酸轉胺酶（AST）水平的分析，以確定它們與正常水平相比是否升高。下表2表明未經治療的SGCB-/-呈現出升高的ALT和AST水平，分別平均為288 U/L和784.5 U/L，超出健康小鼠之正常範圍。然而，AAV給藥的SGCB-/-小鼠呈現出ALT和AST平均水平並未升高，ALT和AST分別在89.5 U/L和330.75 U/L之正常範圍內。

綜上所述，該等數據表明試驗受試者對這種供試品耐受良好。此外，相對於來自兩隻年齡匹配、未經治療的SGCB^-/- 小鼠的參考標本，獨立的組織病理學審查表明，在經過治療的SGCB^-/- 小鼠中，投與scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB大幅減少了肌纖維萎縮和破壞，因此顯示該供試品可以改善與SGCB嚴重缺陷相關的肌病的程度。 [表 2 ]. 經 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 全身性治療的 SGCB^-/- 小鼠血清中的 肝酶水平分析

正常的ALT範圍：27-195 U/L 正常的AST範圍：43-397 U/L

表2提供了未經治療的BL6 WT小鼠（n = 2）和SGCB^-/- 小鼠（n = 2）連同經scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB治療的SGCB^-/- 小鼠（n = 6）血清中的丙胺酸轉胺酶和天冬胺酸轉胺酶水平的分析。在最右側的兩列中報告的平均值係針對三個群組中的每一個。以單位數/L報告。N/A表明樣本已溶血，無法進行分析。 載體基因組生物分佈

使用即時定量PCR測定法（qPCR）檢查供試品特異性DNA序列的存在。對從四隻載體給藥的SGCB^-/- 動物收集的組織樣本進行生物分佈分析。陽性信號係檢測到的等於或大於100個單股DNA拷貝/μg基因組DNA的任何信號。屍檢時收穫組織，並利用對MHCK7啟動子序列有特異性的載體特異性引物探針組。表3描繪了在來自於注射了高劑量（3.0 × 10¹² vg總劑量）scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB的小鼠（#785、786、789、790）的每個組織樣本中檢測到的載體基因組拷貝，連同我們先前研究過的臨床劑量（1.0 × 10¹² vg總劑量）治療的小鼠（#712、713）中來自相同組織樣本之vg拷貝數。

在收集的所有組織中檢測到不同水平的scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB轉錄物。正如預期的那樣，在骨骼肌和心臟中見到最高水平。在性腺、肺、腎臟和脾臟中檢測到最低水平。值得注意的是，將原始臨床劑量（5.0 × 10¹³ vg/kg）與該高劑量（2.0 × 10¹⁴ vg/kg）群組進行比較時，每個組織中的載體基因組拷貝數相似。該等數據表明供試品有效地遞送到載體給藥的小鼠的所有研究組織中。 [表 3 ]. 在 SGCB-/- 小鼠中全身遞送高劑量 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 後的定量 PCR 結果

組織	載體基因組拷貝數/ug
1.0 × 10¹² vg劑量	3.0 × 10¹² vg劑量
#712	#713	#785	#786	#789	#790
性腺	1.54e + 004	2.31e + 004	7.27E + 04	2.43E + 06	2.32E + 05	2.02E + 05
心臟	9.81e + 005	1.23e + 006	2.07E + 06	3.59E + 06	2.04E + 06	4.60E + 06
肺	2.34e + 005	3.21e + 005	4.54E + 05	9.19E + 05	2.55E + 06	1.08E + 06
腎臟	1.30e + 005	9.16e + 004	5.46E + 05	1.48E + 06	2.63E + 06	5.91E + 05
肝臟	3.51e + 007	4.07e + 007	7.31E + 07	3.46E + 07	4.75E + 05	1.84E + 06
脾臟	3.30e + 005	1.84e + 005	5.39E + 05	9.72E + 05	9.87E + 05	1.02E + 06
膈	9.82e + 005	1.29e + 006	3.85E + 06	4.11E + 05	5.50E + 06	2.57E + 06
TRI	1.82e + 006	1.29e + 006	1.77E + 06	2.21E + 06	5.41E + 06	2.52E + 06
QD	9.20e + 005	1.14e + 006	1.47E + 06	3.45E + 06	3.79E + 06	3.65E + 06
GAS	1.37e + 006	8.04e + 005	2.06E + 06	1.35E + 06	7.09E + 06	2.35E + 06
TA	1.80e + 006	1.11e + 006	2.02E + 06	1.15E + 06	2.23E + 06	2.51E + 06

表3提供了來自四隻經高劑量治療的SGCB^-/- 小鼠的器官和肌肉的載體基因組拷貝數。值以vg/µg基因組DNA示出。

如以上qPCR結果所表明的，靜脈遞送高劑量scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB在大多數組織中引起不同水平的載體轉錄物分佈，但在肌肉中出現最高水平。因此，這部分研究的目的是確定該等組織中人β-肌聚糖轉基因的蛋白質表現，以確保肌肉特異性MHCK7啟動子的功能性。使用西方墨點法檢測來自四隻經治療的小鼠（#785、787、789和790）的組織樣本中的β-肌聚糖表現。

在所有骨骼肌樣本以及心臟樣本中均觀察到不同量的β-肌聚糖蛋白表現，並且在小鼠#785和787的肝臟中檢測到β-肌聚糖蛋白表現。（表4、圖6）。為了進一步研究在肝臟中之表現，對來自所有六隻經治療的小鼠（#785、786、787、788、789和790）的肝臟組織進行針對β-肌聚糖蛋白表現的蛋白質印跡分析。圖6中所示的蛋白質印跡結果表明，我們確實在來自載體給藥的小鼠的六個肝臟中的四個（#785、786、787和788）中看到了β-糖多糖蛋白表現。下表5中列出了來自其中進行了完全的生物分佈蛋白質印跡分析的所有六隻小鼠（#785、796、787、788、789和790）的β-肌聚糖蛋白表現詳細結果。 [表 4 ]. 在 SGCB-/- 小鼠中全身遞送高劑量 scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB 後的 β- 肌聚糖蛋白的生物分佈

表4提供了來自於經2.0 × 10¹⁴ vg/kg scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB全身治療的六隻SGCB-/-小鼠的單個組織中的β-肌聚糖蛋白表現。X表示相應組織中之蛋白質表現。NA = 未進行測定

使用MHCK7啟動子的這種心臟表現在臨床上可應用之劑量水平下非常令人鼓舞，並且鑒於LGMD2E患者中β-肌聚糖缺乏時心臟受累的發生率很高，因此全身遞送在臨床上對該等患者將是最有益的。對以提出的這種3.0 × 10¹² vg總劑量的高劑量（2.0 × 10¹⁴ vg/kg）給予尾靜脈注射scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB的SGCB^-/- 小鼠進行了全面屍檢，並將提取的所有肌肉和器官用H＆E染色並送往獨立的獸醫病理學家進行審查。來自四隻載體給藥的小鼠（#785、786、787和788）的肝臟確實顯示出β-肌聚糖轉基因蛋白之表現，該蛋白之表現先前已藉由全身給藥得到證明（Salva等人, Mol Ther [分子治療], 2007.15 (2):第320-329頁）。據報導，六隻經過治療的動物中有兩隻（#789和790）有輕微至中度的局灶性肝臟病變，但是審查的來自六隻經過治療的小鼠的所有其他器官和肌肉均未顯示不良反應。為了評價#789和#790小鼠肝臟中輕度肝臟病變的任何臨床表現，我們測量了所有六隻經過治療的小鼠血清中的肝酶水平，即丙胺酸轉胺酶和天冬胺酸轉胺酶。表4中所示的該實驗的結果描繪來自六隻經過治療的小鼠的平均AST和ALT水平在正常範圍內，表明沒有臨床肝酶異常。除缺乏β-肌聚糖轉基因蛋白表現外，動物#789和#790的肝臟還呈現出較低的vg拷貝數（表3）。綜上所述，該數據表明在這兩隻動物中，轉基因β-肌聚糖蛋白可能已經從肝臟清除；但是對骨骼肌之表現或肝功能沒有影響。

在高劑量（2.0 × 10¹⁴ vg/kg）下，肝臟中確實出現持續的β-肌聚糖表現，而在低劑量治療的動物（5.0 × 10¹³ vg/kg）中並未觀察到。在提供的任何劑量下都未觀察到明顯毒性。該試驗將以NOAEL劑量（5.0 × 10¹³ vg/kg）開始。嚴密監測患者的肝毒性，並在另一項使用AAV針對脊髓肌肉萎縮進行的全身性遞送試驗中，使用皮質類固醇有效地管理肝酶升高（Mendell等人, N Engl J Med [新英格蘭醫學雜誌] 2017; 377:1713-1722）。實例 5 LGMD2E 開放標籤試驗

經由通過外周靜脈的全身輸注，一次性遞送攜帶受肌肉特異性MHCK7啟動子（scAAVrh74.MHCK7.hSGCB）控制的人SGCB基因的重組AAVrh74。如果需要，可將載體在大約10 ml/kg乳酸林格氏液中遞送，以在大約1-2小時內輸注。在30天後患者糖皮質激素的腎上腺抑制作用至多係極小的，但為了謹慎起見，在停止前，每個參與者的最大劑量將減少50%持續1週，再減少50%持續1週。

群組1包括3名4-15歲經治療之受試者，該等受試者均在兩個等位基因中具有確認的SGCB突變，AAVrh74抗體呈陰性，並且是正常的100米步行測試的＞ 40%。每個受試者都接受5 × 10¹³ vg/kg之劑量。給藥後六十天，在麻醉學家（或麻醉師）的建議下，在適當麻醉下，對脛骨前肌和二頭肌進行肌肉穿刺生檢。生檢可以在超音波引導下進行。每個受試者在基因轉移前1天接受1 mg/kg強體松治療，重複該劑量30天。

對生檢進行讀數並且如果所有群組1之受試者的TA和二頭肌中 ≥ 50%的肌纖維表現SGCB，則群組2不進行劑量遞增。如果不滿足該等條件，則群組2之受試者將接受2 × 10¹⁴ vg/kg。群組2中的三名患者將接受安慰劑乳酸林格氏液。大約一年後，該等安慰劑受試者將用與他們群組中接受治療之受試者相同之劑量進行治療。 注射前的基線測量（第 -60 天至第 -2 天）

獲得知情同意並完成登記程序後，收集了基線患者病史，包括患者正在採用的所有藥物和補充劑的記錄。將用於建立穩定基線的基線功能測試與先前自然病史研究中收集的功能測試結果進行比較，以確保基線測試的一致性。篩查訪視時，100 m計時測試必須 ≥ 針對年齡、身高和體重匹配的健康對照的預測值的40%才可以納入。如果受試者未篩入，則他或她可以繼續參加LGMD自然病史研究。將進行以下評估以確認受試者參加本研究的資格。在治療投與前必須完成的基線測試包括以下內容：基線基因轉移前的第-60天至第-2天 • 知情同意 • 病史 • 身體檢查/生命體徵 • EKG • 心臟MRI（無需麻醉即可進行，但如果手術耐受性差並且考慮到心臟評估在該疾病中的重要性，我們將討論在全國兒童方案中使用可接受的方案進行麻醉的選擇） • 無需麻醉的骨骼肌MRI • 針對乙型和丙型肝炎和HIV的抗體（IgG和IgM）測試 • 安全性實驗室分析： o 全血計數（CBC），包括分類和血小板計數 o 血清總蛋白 o 血清γ-穀胺醯轉移酶（GGT） ▪ GGT將用於監測肝酶，而不是ALT或AST，因為該等酶的來源來自受損的肌肉，其水平可以達到9-10X ULN。ALT和AST每天可改變30%-40%，使得解釋困難。GGT不受肌肉疾病的影響^22,23 o 血清總膽紅素 o 葡萄糖 o 肌酸激酶（CK）（較佳的是僅在2天訪視時得出CK水平，但是可以根據PI的判斷，在1天訪視時進行測試） o 肌酸酐/BUN o 胱抑素C o 鹼性磷酸酶 o 澱粉酶 o AST o ALT o 凝血酶原時間（PT）、部分凝血活酶時間（PTT） o 電解質（鈉、鉀、氯化物、C02 o 尿液分析 • 抗rAAVrh74的血清結合抗體 • 抗β-肌聚糖的血清結合抗體 • 對AAVrh74衣殼蛋白和β-肌聚糖的ELISpot測定 • 妊娠測試（如果研究者判斷有生育能力） • 膝蓋及肘屈肌和肘伸肌、髖內收肌和肩外展肌的力量測試（手持測力計） • PROMIS問卷 • 設置活動監測設備 • 肺功能測試（PFT），包括肺活量測定 • 計時功能測試[100米計時測試、上4個台階、起立-行走計時測試] • 工作空間體積 • 肢帶型肌肉營養不良症北極星評估（NSAD） • 上肢和下肢肌肉的基線肌肉生檢，可以使用超音波引導；根據針對肌肉的臨床發現進行的選擇將足以進行分析，對患者的風險最小。安慰劑延遲受試者將不會進行第二次基線肌肉生檢。 • 胸部X光第-1天 • 身體檢查和生命體徵 • 開始採用潑尼松或類似的糖皮質激素 • 潛在注射部位的照片 • 安全性實驗室分析： o 全血計數（CBC），包括分類和血小板計數 o 血清總蛋白 o 血清γ-穀胺醯轉移酶（GGT） ▪ GGT將用於監測肝酶，而不是ALT或AST，因為該等酶的來源來自受損的肌肉，其水平可以達到9-10X ULN。ALT和AST每天可改變30%-40%，使得解釋困難。GGT不受肌肉疾病的影響^22,23 o 血清總膽紅素 o 葡萄糖 o 肌酸激酶（CK）（較佳的是僅在2天訪視時得出CK水平，但是可以根據PI的判斷，在1天訪視時進行測試） o 肌酸酐/BUN o 胱抑素C o 鹼性磷酸酶 o 澱粉酶 o AST o ALT o 凝血酶原時間（PT）、部分凝血活酶時間（PTT） o 電解質（鈉、鉀、氯化物、C02） o 尿液分析 強體松的預防性投與

預期在基因轉移後2-4週之間，對AAV載體存在預期的抗原特異性T細胞反應。此類抗原特異性T細胞反應的一種可能結果係轉導細胞的清除和轉基因表現的喪失。為了減弱宿主對基於rAAV的治療的免疫反應，在基於AAV的治療之前，在手術前二十四小時，受試者開始口服大約1 mg/kg/天的預防性強體松或同等的糖皮質激素，最大劑量為60 mg/天。如果需要，也可以允許以1 mg/kg/天的近似劑量靜脈投與同等的糖皮質激素。治療持續大約一個月。根據藉由ELISpot測定，還有用GGT進行的肝功監測來評估的個體受試者對基因轉移之免疫反應，實施強體松或同等的糖皮質激素的遞減方案。 基因轉移方案

scAAVrh74.MHCK7.hSGCB基因載體係由研究藥劑師根據Manual of Operating Procedures [操作程序手冊]（MOOP）製備的。在即將運輸到臨床場所之前，由藥房完成對供試品之適當稀釋。使用乳酸林格氏液稀釋載體，並用60 ml無菌聚丙烯注射器吸取。對稀釋進行的文件記錄由藥房按照標準藥房規程完成。

含載體的注射器在室溫下遞送，並在製備後24小時以內投與於受試者。scAAVrh74.MHCK7.hSGCB的處理遵循生物安全性1級載體的符合性標準。（NIH Guidelines for Research Involving recombinant or Synthetic Acid Molecules [涉及重組或合成酸分子的NIH研究指南] [NIH指南]，2016年4月，衛生與公眾服務部（Department of Health and Human Services），國立衛生研究院科學政策辦公室（National Institutes of Health Office of Science Policy），生物技術活動辦公室（Office of Biotechnology Activities）。

在基因轉移的前一晚，接納受試者進行PICU或肺PICU的基因轉移，並藉由PI或Co-Is（第-1天）進行檢查。在基因轉移手術前一晚的午夜之後，受試者保持NPO。手術在病房中的無菌條件下進行。

將具有肝素封管（heparin lock）的靜脈導管放置在外周靜脈中以便遞送載體。放置第二根靜脈導管以在第一部位有併發症的情況下使用。在基因轉移當天拍攝該等部位的照片。在患者甦醒時，經靜脈內遞送載體。如果研究醫生認為有必要，則患者按照方案接受清醒性鎮靜。向患者給藥，使用注射泵通過60 mL聚丙烯注射器在大約1-2小時內投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB。輸注期間以及輸注後的4小時內每15分鐘和輸注後其餘24小時內每小時監測患者的生命體徵。 基因轉移後的監測

輸注後的4小時內每15分鐘和輸注後其餘24小時內每小時監測患者的生命體徵。術後第二天檢查安全性實驗室分析和尿液分析。還在注射後監測並記錄伴隨藥物和所有不良事件/嚴重不良事件。受試者在基因轉移後一天出院（如果未觀察到安全性方面的副作用）。在第7、14、30、60、90和180天以及第9、12、18、24、30和36個月，受試者返回進行隨訪。在以下每個日期的毒性監測包括： • 身體檢查和生命體徵 • 安全性實驗室分析： o 全血計數（CBC），包括分類和血小板計數 o 血清總蛋白 o 血清γ-穀胺醯轉移酶（GGT）*^▪ GGT將用於監測肝酶，而不是ALT或AST，因為該等酶的來源來自受損的肌肉，其水平可以達到9-10X ULN。ALT和AST每天可改變30%-40%，使得解釋困難。GGT不受肌肉疾病的影響^22,23 o 血清總膽紅素 o 葡萄糖 o 肌酸激酶（CK）（較佳的是僅在2天訪視時得出CK水平，但是可以根據PI的判斷，在1天訪視時進行測試） o 肌酸酐/BUN o 胱抑素C o 鹼性磷酸酶 o 澱粉酶 o AST o ALT o 凝血酶原時間（PT）、部分凝血活酶時間（PTT） o 電解質（鈉、鉀、氯化物、C02） o 尿液分析 • 免疫學研究 • 從第30天開始進行物理治療評估（100米計時測試、力量測試、PROMIS問卷、肢帶型肌肉營養不良症北極星評估（NSAD）、上4個台階、起立-行走計時測試及工作空間體積） • 尿液分析 • 注射部位的照片（第-1、0、1、7、14、30天） • 不良事件（在所有研究訪視時收集的） • EKG（第180天，第12、24、36個月） • 心臟和骨骼肌MRI（第12、24、36個月）， • 肺功能測試（第60、180天，第12、24、36個月） • 群組1和2在60天以及所有受試者在治療後2年進行基因轉移後肌肉生檢；肌肉的選擇將與治療前的生檢部位相同。除非風險指示應對對側肢體進行生檢，否則治療後的生檢較佳的是在同一側。 長期監測

關於基因轉移後的長期受試者隨訪，遵循最新的FDA指南。如所討論的並基於rAAV或轉基因的先前經驗，與基因轉移有關的延遲不良事件的可能性非常低。對三年期的短期安全性進行評價，其中併入了方案的有效階段。如果新確定的風險與該產品相關，或者如果在此期間受試者遭受任何不良事件，則根據FDA指南開始長期隨訪。

如果存在任何需要延長隨訪期的指徵，則通知CBER。為所有受試者提供書面說明，該書面說明係關於如果經歷他們認為可能與研究治療或參與研究有關的任何嚴重不良事件時，如何聯繫主要研究者或研究協調人員。該資訊包含在「知情同意書」文件中。指示所有受試者將位址或聯繫資訊的更改通知主要研究者。 研究後的隨訪

關於基因轉移後的長期受試者隨訪，遵循最新的FDA指導。如指南所示，載體具有與基因轉移有關的延遲不良事件的可能性非常低。在給藥後的三年期內對安全性進行評價，其中併入了方案的有效階段。如果新確定的風險與我們的產品相關，或者如果在此期間受試者遭受任何不良事件，則根據FDA指南開始長期隨訪。 臨床試驗的主要結果

這係I期臨床試驗並且安全性係主要結果。藉由在8週時對肌肉生檢樣本進行定量免疫螢光或免疫印跡分析（比基線高 ≥ 20%）來判斷β-SG蛋白質之表現。探索性結果 • 基因轉移後3年，對於每位參與者而言，與基線相比100米時間改善 ≥ 10% • 基因治療後CK的降低將作為探索性結果。較佳的是僅在2天訪視時得出CK水平，但是可以根據PI的判斷，在1天訪視時進行測試 • 工作空間體積 • 膝蓋及肘伸肌和肘屈肌、髖內收肌和肩外展肌的手持測力法 • 藉由cMRI測量的射血分數的改善 • 骨骼MRI • 肺功能測試（PFT），包括肺活量測定 • 計時功能測試[上4個台階、起立-行走計時測試] • 肢帶型肌肉營養不良症北極星評估（NSAD） o 由Fitbit或類似活動監測設備測定的活動級別 o 使用PROMIS上肢和活動能力問卷獲得的患者身體功能報告群組 1 的結果

群組1中的所有受試者在測試時都表現良好（受試者1和2：在注射後90天進行測試；受試者3在注射後60天進行測試）。所有受試者持續表現良好直到注射後9個月。在這項研究中存在一個嚴重不良事件，其中一個受試者在停用類固醇後展示出肝酶和膽紅素升高。該事件經增加類固醇而得以解決。兩個受試者的肝酶升高，藉由增加類固醇而得以解決，並且該等水平恢復到基線。

在群組1中使用脛骨前肌和二頭肌的肌肉穿刺生檢樣本來定量轉基因表現，將基線與第60天進行比較。主要終點係SGCB蛋白質表現 ≥ 20%。如果在所有接受治療之受試者中SGCB之表現均比基線高 ≥ 50%，則不會增加給藥。如果在所有接受治療之受試者中SGCB之表現均＜ 50%，則對於群組2和安慰劑受試者而言，劑量將增加至2 × 10¹⁴ vg/kg。在可能的情況下，治療後2年的生檢將在與基線生檢相同的肌肉上進行。對所有生檢樣本設盲，並由實驗室負責人用電腦生成的代碼進行編碼。表現的定量使用對肌肉生檢樣本的直接免疫螢光和蛋白質印跡研究進行。將使用Bioquant®自動化軟體對表現SGCB的肌纖維之數量進行定量。表5中列出了基線人口統計。 [表 5 ]：基線人口統計

受試者	年齡（歲）	基線的 CK 水平（ U/L ）
1	13	10,727
2	4	12,826
3	13	10,985

圖7提供了代表性圖像，該等圖像展示了在投與載體後8週在所有三個受試者的肌肉中的穩健SGCB 表現。表6提供了每個受試者中SGCB陽性纖維的平均強度和百分比。整個群組的平均免疫組織化學染色強度為47%，且SGCB陽性纖維的平均百分比為51%。圖8提供了蛋白質印跡，展示了在投與載體90天後在三個受試者中檢測到β-肌聚糖表現。蛋白質印跡數據證明基因轉移遞送了全長β-肌聚糖。表7提供了藉由蛋白質印跡進行的定量，證明與正常水平相比，平均β-肌聚糖蛋白表現增加約36.1%。 [表 6 ]- 免疫組織化學

受試者	平均強度	SCGB 陽性纖維的百分比
1	47%	63%
2	57%	49%
3	38%	42%
平均值	47%	51%

[表 7 ]- 蛋白質印跡

受試者	相比於正常值的 β- 肌聚糖平均表現（ N = 3 ）
1	34.7%
2	39.2%
3	34.5%
平均值	36.1%

對收集的肌肉生檢樣本，使用即時定量PCR測定法（qPCR）檢查供試品特異性DNA序列的存在。陽性信號係檢測到的等於或大於100個單股DNA拷貝/μg基因組DNA的任何信號。在肌肉生檢樣本中檢測到平均8.4E + 04個載體拷貝/μg DNA，每個細胞核0.6個拷貝。

還研究了每個受試者中肌聚糖複合物的存在。正如藉由西方墨點法測定的，平均微營養不良蛋白表現為正常值的36%（n = 3）。另外，藉由免疫組織化學法定量α-肌聚糖表現。圖9證明受試者中的β-肌聚糖表現使肌聚糖複合物上調，如α-肌聚糖表現所示。

測試受試者血液中之肌酸激酶（CK）水平。如表9所示，受試者之CK水平平均降低約82%。 [表 9 ]

受試者	年齡	基線的 CK
		水平（ U/L ）	第 30 天	第 60 天	第 90 天	第 180 天	第 270 天
1	13	10,727	619	2257	1135	1553	2300
2	4	12,826	4795	910	2159	5070	2665
3	13	10,985	687	2061	2392	10,055	1295

實例 6 β- 肌聚糖基因轉移使膜的肌聚糖複合物恢復

用scAAVrh74.MHCK7.hSGCB治療使膜的肌聚糖複合物恢復（圖10）。圖10示出了試驗中患者的β-肌聚糖、α-肌聚糖表現恢復以及β-肌聚糖和α-肌聚糖兩者在膜處的共定位。β-肌聚糖和α-肌聚糖的共定位表明scAAVrh74.MHCK7.hSGCB使肌聚糖複合物恢復。實例 7 經 β- 肌聚糖基因轉移治療的 LGMD2E 患者在施用後三個月的 100 米計時測試得到改善

用scAAVrh74.MHCK7.hSGCB治療在基因轉移後僅3個月的時期內便為患者提供了100米計時測試的明顯改善（圖11）。計時步行測試（如100米計時測試）用於測量患有肌肉營養不良症之受試者之功能。本研究中的測試測量了與治療後之表現相比的患者之基線表現。圖11示出了在基因轉移後的前三個月中，三個受試者相對於基線之平均百分比變化。數據顯示，在3個月後，與基線相比，平均增加超過15%，這證明在β-肌聚糖基因轉移後運動功能改善。實例 8 經 β- 肌聚糖基因轉移治療的 LGMD2E 患者在投與後九個月時顯示出改善的功能測量值

在全身投與scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB後九個月，用scAAVrh74.MHCK7.hSGCB治療為患者提供了明顯改善。三名患者參加了功能研究。例如，在100 m計時測試中，在基線時（投與前），一名患者在100 m跑時髖關節伸展和屈曲受限。但是，在投與後9個月時，同一名患者在跑步時顯示出髖關節伸展和屈曲改善且速度更快。另外，對於軀幹控制測試，另一名患者在投與後9個月的起身測試時間上顯示出改善。在基線時或投與前，受試者顯示出較差的軀幹控制，但是這在投與後9個月也有所改善。另外，在坐立測試中，要求患者從坐姿坐起。例如，其餘患者在投與後9個月與投與前相比，顯示出縮短的起立時間。該等數據匯總在表10中。 [表 10 ]

受試者	評估	NSAD （ Δ ）	起身時間（秒）	上 4 級台階（秒）	100 m （秒）	10 m （秒）
1	基線	40	5.0	2.4	49.3	5
第 270 天	41	4.1	2.3	43.2	4.5
2	基線	41	3.5	2.8	49.9	5.2
第 270 天	47	3.0	1.9	48.6	4.3
3	基線	48	1.5	1.6	59.3	3.4
第 270 天	54	1.2	1.3	48.4	3.2

一項年齡匹配的自然病史研究比較了未治療受試者（表示為自然病史受試者；參見表11）和投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之受試者NSAD（本文稱為「肢帶型肌肉營養不良症北極星評估」）相對於基線的變化。如圖12A-C所示，自然病史受試者在200天內的NSAD變化穩定下降，而經過治療之受試者在270天內顯示出NSAD變化的穩定改善（圖12A和12C），同時經過治療之受試者在270天內顯示出NSAD變化的穩定改善（圖12B）。 [表 11 ]

受試者	年齡（歲）
1	5
2	12
3	10
4	9
5	9

實例 9 製劑

將scAAVrh74.MHCK7.hSGCB配製在含有20 mM Tris（pH 8.0）、1 mM氯化鎂（MgCl₂ ）、200 mM氯化鈉（NaCl）和0.001%泊洛沙姆188的緩衝液中。在一個實施方式中，製劑資訊匯總於表12中。 [表 12 ]

製劑（呈冷凍液形式）
組分	濃度
scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB	2 × 10¹³ vg/ml、5 × 10¹³ vg/ml或4 × 10¹³ vg/ml^a
Tris（pH 8.0）	20 mM
氯化鎂（MgCl2）	1 mM
氯化鈉（NaCl）	200 mM
泊洛沙姆188	0.001%

藥品以冷凍液的形式儲存在低於-60°C的溫度下。冷凍藥品必須在臨床投與前解凍。

將scAAVrh74.MHCK7.hSGCB儲存在低於-60°C的溫度下，在該溫度下材料在長期儲存條件下穩定。將scAAVrh74.MHCK7.hSGCB小瓶在室溫（20°C至25°C）下解凍。用酒精擦拭解凍的載體小瓶並置於生物安全櫃中。scAAVrh74.MHCK7.hSGCB製劑係在II級生物安全櫃中在無菌條件下無菌製備的。

用於靜脈（IV）輸注的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB在小瓶中提供（每小瓶2 mL）。總vg劑量係基於患者的體重計算的。基於體重以5 × 10¹³ vg/kg或2 × 10¹⁴ vg/kg的當量，以及針對2 × 10¹³ vg/mL、5 × 10¹³ vg/mL或4 × 10¹³ vg/ml的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB批次產品滴定度確定適合每名患者的小瓶數量。

scAAVrh74.MHCK7.hSGCB作為一次性靜脈輸注投與，藉由注射泵在大約1-2小時內遞送到外周肢體靜脈中。實例 10 老年患者和耐久性

scAAVrh74.MHCK7.hSGCB介導的基因置換已在治療LGMD-2E和其他相關疾病中顯示出積極的成果。該研究係為了測試scAAVrh74.MHCK7.hSGCB治療受更嚴重影響的老年人肌肉的能力，以及AAV病毒載體的長期耐久性。首先，為了進行長期耐久性研究，用scAAVrh74.MHCK7.hSGCB對4週齡的sgcb^-/- 小鼠進行全身性治療。治療後超過24個月，藉由PCR在所有轉導肌肉上均檢測到高水平的載體基因組拷貝數。而且，與較早的時間點相比，經過治療的肌肉的免疫螢光染色顯示所有肌肉中的蛋白質表現水平均未降低（＞ 95%），hSGCB蛋白質仍正確定位在膜上。

其次，藉由全身遞送scAAVrh74.MHCK7.hSGCB載體來治療年齡較大（例如12個月）的LGMD2E（β-肌聚糖）小鼠模型。在治療後6個月的終點，評價該等小鼠的肌肉的蛋白表現、組織學挽救和功能改善。具體而言，觀察到整個下肢、上肢的肌肉和近端軀幹肌肉（包括膈和心臟）中的基因表現。而且，將纖維化水平與未治療的對照組進行比較。此外，功能研究涉及評價脛骨前肌（TA）和膈肌（DIA）的力輸出以及TA肌肉對收縮引起的損傷的抵抗力。

雖然已經根據特定實施方式描述了本揭露，但是應當理解，熟悉該項技術者將想到變型和修改。因此，僅應將申請專利範圍中出現的此類限制置於本揭露上。

本申請中提及的所有文檔均特此藉由援引以其全文併入。參考文獻： 1 Bonnemann CG, Modi R, Noguchi S, Mizuno Y, Yoshida M, Gussoni E et al. Beta-sarcoglycan (A3b) mutations cause autosomal recessive muscular dystrophy with loss of the sarcoglycan complex. Nat Genet 1995; 11: 266-273. 2 Moore SA, Shilling CJ, Westra S, Wall C, Wicklund MP, Stolle C et al. Limb-girdle muscular dystrophy in the United States. J Neuropathol Exp Neurol 2006; 65: 995-1003. 3 Araishi K, Sasaoka T, Imamura M, Noguchi S, Hama H, Wakabayashi E et al. Loss of the sarcoglycan complex and sarcospan leads to muscular dystrophy in beta-sarcoglycan-deficient mice. Hum Mol Genet 1999; 8: 1589-1598. 4 Durbeej M, Cohn RD, Hrstka RF, Moore SA, Allamand V, Davidson BL et al. Disruption of the beta-sarcoglycan gene reveals pathogenetic complexity of limb-girdle muscular dystrophy type 2E. Mol Cell 2000; 5: 141-151. 5 Bonnemann CG, Passos-Bueno MR, McNally EM, Vainzof M, de Sa Moreira E, Marie SK et al. 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[圖 1 ]提供了治療性β-肌聚糖轉基因盒之示意圖。含有密碼子優化的人β-肌聚糖基因（hSGCB）的自我互補的AAV載體。肌肉特異性MHCK7啟動子驅動表現。該盒還含有嵌合內含子，以增強加工和聚腺苷酸化信號從而實現穩定性。

[圖 2A-2B ]展示了骨骼肌中人β-肌聚糖之表現，A) 靜脈注射3e12 vg總劑量的scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB的SGCB^-/- 小鼠的骨骼肌、膈和心臟的免疫螢光成像。所有肌肉均顯示出 ≥ 98%轉導的代表性圖像。示出了20X圖像。B) 顯示出hSGCB轉基因（43 kDA）在經過臨床劑量（#716）和高劑量（#785、786）治療的肌肉中之表現的蛋白質印跡。對於治療組，N = 6，100 kDa對應於α-輔肌動蛋白上樣對照。

[圖 3 ]展示了用高劑量scAAVrh74.MHCK7.hSGCB進行全身治療對肌肉病理之影響。(A) C57BL/6 WT小鼠、SGCB-/-小鼠和經過scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB治療的小鼠的四頭肌和膈肌的H＆E染色，(B) 對核中心移位纖維（centrally nucleated fiber）的減少之定量，(C) 纖維分佈的歸一化以及 (D) 平均纖維尺寸的增加。每組N = 6。* = p ＜ 0.05；** = p ＜ 0.01；*** = p ＜ 0.001；**** = p ＜ 0.0001。

[圖 4 ]展示了SGCB^-/- 小鼠膈中力量不足的矯正。治療24週後，從小鼠中收穫膈肌肌條以測量刺激後之力量產生。與先前研究之劑量（1e12 vg總劑量）相比，治療使力量恢復至WT水平，並提供了更強的恢復（WT：n = 5；KO：n = 4；低劑量：n = 6；高劑量：n = 6）。** = p ＜ 0.01。

[圖 5 ]展示在x和y平面中的整體移動在KO小鼠中顯著減少而在MHCK7治療之小鼠中略有改善。在MCHK7治療的小鼠中，後肢站立的垂直活動略有改善（n = 6）。

[圖 6 ]提供了全身注射兩個高劑量（2.0 × 10¹⁴ vg/kg）scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB的SGCB^-/- 小鼠的肌肉和器官上之生物分佈蛋白質印跡圖。43 kDa對應於β-肌聚糖蛋白。125 kDa對應於粘著斑蛋白上樣對照。

[圖 7 ]提供了在全身投與5.0 × 10¹³ vg/kg scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB之後，藉由免疫組織化學法檢測和定量的人類受試者肌肉生檢樣本中的β-肌聚糖蛋白表現。

[圖 8 ]提供了在全身投與5.0 × 10¹³ vg/kg scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB之後90天，藉由西方墨點法檢測和定量的人類受試者肌肉生檢樣本中之β-肌聚糖蛋白表現。

[圖 9 ]展示正如藉由免疫組織化學法檢測和定量α-肌聚糖所表明的，β-肌聚糖蛋白表現上調了肌聚糖複合物之表現。

[圖 10 ]示出了試驗中#3患者的β-肌聚糖、α-肌聚糖表現恢復以及β-肌聚糖和α-肌聚糖兩者在膜處之共定位。

[圖 11 ]示出了在用scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB進行基因轉移後的前三個月中，三個受試者在100米計時測試中相對於基線之平均百分比變化或改善。

[圖 12A-C ]提供了自然病史對照組（圖12A）和投與5.0 × 10¹³ vg/kg scAAVrh.74.MHCK7.hSGCB後的測試受試者（圖12B）的肢帶型肌肉營養不良症北極星評估（NSAD）相對於基線的變化。圖12C中示出了六名單獨的自然病史對照患者之NSAD數據。

[圖 13 ]提供了pAAV.MHCK7.hSGCB. KAN AAV載體質體之示意性圖譜。

Claims

一種治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法，該方法包括向該受試者投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中使用全身投與途徑，並基於超螺旋質體作為定量標準以約1.0 × 10¹² vg/kg至約5.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量投與該rAAV；其中在投與該rAAV之後，該受試者的血清肌酸激酶（CK）水平與在投與該rAAV之前的血清CK水平相比降低。
一種治療有需要之受試者中的肌肉營養不良症之方法，該方法包括投與重組腺相關病毒（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之步驟，其中在投與該rAAV之後，該受試者的細胞中的β-肌聚糖基因表現水平與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖基因表現水平相比增加；其中在投與該rAAV之後，該受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維數量與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖陽性纖維數量相比增加；或者其中與投與該rAAV之前所述受試者之運動功能相比，所述受試者之運動功能得到改善，並且其中該運動功能係藉由100米計時步行測試測定的。
如請求項2之方法，其中該運動功能在基因轉移後1個月或30天內改善至少5%，在基因轉移後2個月或60天內改善至少10%，或在基因轉移後3個月或90天內改善至少15%。
如請求項2或3之方法，其中該運動功能改善至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%或50%。
如請求項1至4中任一項之方法，其中使用靜脈內途徑投與該rAAV。
如請求項1至5中任一項之方法，其中基於超螺旋質體作為定量標準以約5.0 × 10¹³ vg/kg或約2.0 × 10¹⁴ vg/kg，或基於線性化質體作為定量標準以約1.85 × 10¹³ vg/kg或7.41 × 10¹³ vg/kg投與該rAAV。
如請求項1至6中任一項之方法，其中以約10 mL/kg之濃度投與rAAV。
如請求項1至7中任一項之方法，其中藉由注射、輸注或植入來投與該rAAV。
如請求項1至8中任一項之方法，其中藉由大約1至2小時的輸注來投與該rAAV。
如請求項1至8中任一項之方法，其中藉由經由外周肢體靜脈的靜脈內途徑投與該rAAV。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 1的人β-肌聚糖核苷酸序列。
如請求項1至11中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 4的MHCK7啟動子序列。
如請求項1至12中任一項之方法，其中該rAAV係血清型AAVrh.74。
如請求項1至13中任一項之方法，其中該rAAV包含與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。
如請求項1至14中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 20的內含子序列。
如請求項1至15中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 21的聚A序列。
如請求項1至16中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 22的5’反向末端重複（ITR）序列。
如請求項1至17中任一項之方法，其中該rAAV包含SEQ ID NO: 23的3’反向末端重複（ITR）序列。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該肌肉營養不良症係肢帶型肌肉營養不良症。
如請求項1至18中任一項之方法，其中該肌肉營養不良症係肢帶型肌肉營養不良症2E型。
一種治療有需要之受試者中的肢帶型肌肉營養不良症之方法，該方法包括基於超螺旋質體作為定量標準以約5.0 × 10¹³ vg/kg或約2.0 × 10¹⁴ vg/kg之劑量，或基於線性化質體作為定量標準以約1.85 × 10¹³ vg/kg或7.41 × 10¹³ vg/kg之劑量，向該受試者投與大約1至2小時的rAAV靜脈輸注，並且其中該rAAV包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
一種在受試者的細胞中表現β-肌聚糖基因之方法，該方法包括向該受試者投與scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體，該構建體包含與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。
一種增加受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維和/或降低受試者的肌肉組織中的CK水平之方法，該方法包括向該受試者投與與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列。
如請求項22或23之方法，其中藉由在投與該rAAV之前和之後的肌肉生檢中，用西方墨點法測量該β-肌聚糖蛋白水平，來檢測該β-肌聚糖基因之表現或陽性β-肌聚糖陽性纖維的數量。
如請求項22之方法，其中在投與rAAV之後，β-肌聚糖蛋白之表現增加至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%或40%。
如請求項22至25中任一項之方法，其中藉由在投與該rAAV之前和之後的肌肉生檢中，用免疫組織化學法測量該β-肌聚糖蛋白水平，來檢測β-肌聚糖基因之表現或β-肌聚糖陽性肌纖維的數量。
如請求項22之方法，其中在投與rAAV之後，β-肌聚糖蛋白之表現增加至少39%。
如請求項23之方法，其中在投與該rAAV之後，該受試者的肌肉組織中的β-肌聚糖陽性纖維數量與在投與該rAAV之前的β-肌聚糖陽性纖維數量相比增加至少40%、41%或42%。
如請求項22之方法，其中該細胞具有一個以上的AAV病毒拷貝數。
如請求項22至29中任一項之方法，其中在投與該rAAV之後，該受試者的血清CK水平與在投與該rAAV之前的血清CK水平相比降低。
如請求項30之方法，其中到投與該rAAV之後60天至90天、60天或90天，該受試者的血清CK水平與投與該rAAV之前的血清CK水平相比，降低至少82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%。
如請求項1至31中任一項之方法，其中在投與該rAAV之後，該受試者的α-肌聚糖水平與投與該rAAV之前的α-肌聚糖水平相比增加。
一種增加有需要之受試者中的α-肌聚糖表現之方法，該方法包括向該受試者投與包含scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體的rAAV，該構建體具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。
一種增加有需要之受試者中的α-肌聚糖向細胞膜的定位之方法，該方法包括向該受試者投與與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同的scAAVrh74.MHCK7.hSGCB構建體核苷酸序列。
如請求項33或34之方法，其中藉由在投與該rAAV之前和之後的肌肉生檢中，用免疫組織化學法測量該α-肌聚糖蛋白水平來檢測該α-肌聚糖。
如請求項33或34之方法，其中藉由在投與該rAAV之前和之後的肌肉生檢中，用西方墨點法測量該α-肌聚糖蛋白水平來檢測該α-肌聚糖。
如請求項34至36中任一項之方法，其中所述α-肌聚糖共定位於表現由scAAVrh74.MHCK7.hSGCB編碼的β-肌聚糖的細胞的膜。
一種增加受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現或改善受試者的肌肉功能之方法，該方法包括向該受試者投與包含與SEQ ID NO: 19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列的rAAV。
如請求項38之方法，其中該受試者在編碼肌聚糖的基因中攜帶基因突變或患有肌肉營養不良症。
如請求項38之方法，其中該肌聚糖係β-肌聚糖（SGCB）、α-肌聚糖（SGCA）、γ-肌聚糖（SGCG）或δ-肌聚糖（SGCD）。
如請求項38之方法，其中該核苷酸序列包含SEQ ID NO: 19之多核苷酸序列。
一種增加受試者的肌肉組織中的肌聚糖表現之方法，該方法包括向該受試者投與包含編碼第一肌聚糖之核苷酸序列之構建體，並檢測表現所述第一肌聚糖的細胞的細胞膜中至少第二肌聚糖之表現增加。
如請求項42之方法，其中所述第一肌聚糖係β-肌聚糖（SGCB），並且所述第二肌聚糖係α-肌聚糖（SGCA）、γ-肌聚糖（SGCG）和/或δ-肌聚糖（SGCD）。
如請求項1至43中任一項之方法，其中該受試者係4至15歲的人類受試者。
如請求項1至43中任一項之方法，其中該受試者係兒科受試者、青少年受試者或年輕的成年受試者。
如請求項1至43中任一項之方法，其中該受試者係4-15歲的人類受試者，在兩個等位基因中都具有確認的β-肌聚糖（SGCB）突變，AAVrh74抗體呈陰性和/或具有＞ 40%或正常的100米步行測試。
如請求項1至43中任一項之方法，其中該受試者係中年成人或老年受試者。
如請求項1至43中任一項之方法，其中該受試者係25至55歲的人類受試者。
如請求項1至43中任一項之方法，其中該受試者係50歲以上的人類受試者。
一種組成物，其包含： rAAV scAAVrh74.MHCK7.hSGCB載體，緩衝劑，離子強度劑，和表面活性劑。
如請求項50之組成物，其中該rAAV之濃度為約1.0 × 10¹² vg/ml至約5.0 × 10¹⁴ vg/ml，或約5.0 × 10¹² vg/ml至約1.0 × 10¹⁴ vg/ml。
如請求項50之組成物，其中該rAAV之濃度為約2.0 × 10¹³ vg/ml、4 × 10¹³ vg/ml、5 × 10¹³ vg/ml。
如請求項50之組成物，其中該緩衝劑包含tris、tricine、Bis-tricine、HEPES、MOPS、TES、TAPS、PIPES和CAPS中的一種或多種。
如請求項53之組成物，其中該緩衝劑包含濃度為約5 mM至約40 mM的pH 8.0的tris。
如請求項53之組成物，其中該緩衝劑包含約20 mM的pH 8.0的tris。
如請求項50之組成物，其中該離子強度劑包含以下一種或多種：氯化鉀（KCl）、乙酸鉀、硫酸鉀、硫酸銨、氯化銨（NH₄ Cl）、乙酸銨、氯化鎂（MgCl₂ ）、乙酸鎂、硫酸鎂、氯化錳（MnCl₂ ）、乙酸錳、硫酸錳、氯化鈉（NaCl）、乙酸鈉、氯化鋰（LiCl）和乙酸鋰。
如請求項50之組成物，其中該離子強度劑包含濃度為約0.2 mM至約4 mM的MgCl₂ 。
如請求項50之組成物，其中該離子強度劑包含濃度為約50 mM至約500 mM的NaCl。
如請求項50之組成物，其中該離子強度劑包含濃度為約0.2 mM至約4 mM的MgCl₂ 和濃度為約50 mM至約500 mM的NaCl。
如請求項50之組成物，其中該離子強度劑包含濃度為約1 mM的MgCl₂ 和濃度為約200 mM的NaCl。
如請求項50之組成物，其中該表面活性劑包含磺酸鹽、硫酸鹽、膦酸鹽、磷酸鹽、泊洛沙姆和陽離子表面活性劑中的一種或多種。
如請求項61之組成物，其中該泊洛沙姆包含泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆331、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407中的一種或多種。
如請求項61之組成物，其中該表面活性劑包含濃度為約0.00001%至約1%的泊洛沙姆。
如請求項61之組成物，其中該表面活性劑包含濃度為約0.001%的泊洛沙姆188。
一種包含重組AAV（rAAV）scAAVrh74.MHCK7.hSGCB的藥物組成物，其中該scAAVrh74.MHCK7.hSGCB包含與SEQ ID NO: 19至少95%或99%相同之核苷酸序列。
如請求項65之藥物組成物，其中該scAAVrh74.MHCK7.hSGCB包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
一種產生重組AAV scAAVrh74.MHCK7.hSGCB之方法，該方法包括將質體轉移至細胞，其中該質體包含與SEQ ID NO: 24至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。
如請求項67之方法，其中該質體包含SEQ ID NO: 24之核苷酸序列。
如請求項67之方法，其中該質體包含與SEQ ID NO: 1、3或19至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。
如請求項67至69中任一項之方法，其中該質體包含SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
如請求項67至70中任一項之方法，其進一步包括將包裝質體和/或輔助病毒轉移至細胞。
如請求項67至70中任一項之方法，其中該細胞包含穩定整合的AAV cap基因。
如請求項67至70中任一項之方法，其中該細胞包含穩定整合的AAV rep基因。
一種細胞，其包含質體，該質體包含與SEQ ID NO: 24至少90%、95%或99%相同之核苷酸序列。
如請求項74之細胞，其中該質體包含SEQ ID NO: 24之核苷酸序列。
如請求項74或75之細胞，其包含：SEQ ID NO: 19之核苷酸序列。
如請求項74至76中任一項之細胞，其中該細胞係昆蟲細胞、蚊細胞或哺乳動物細胞。