TW202000915A

TW202000915A - 腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症

Info

Publication number: TW202000915A
Application number: TW108121156A
Authority: TW
Inventors: 克拉帕克路易斯羅帝諾; 傑瑞 R 麥德爾
Original assignee: 美國全美兒童醫院之研究學會
Priority date: 2018-06-18
Filing date: 2019-06-18
Publication date: 2020-01-01
Also published as: BR112020025995A2; WO2019245973A1; SG11202012450QA; CO2021000227A2; MX2020013888A; EP3807413A1; AU2019290544A1; IL279521A; KR20210022038A; US20210260218A1; CA3103485A1; JP2021527657A; CN112823210A; CL2020003289A1

Abstract

本發明提供表現小型化人微小肌縮蛋白基因之基因療法載體，諸如腺相關病毒（AAV）載體，以及在患有肌肉萎縮症之個體中使用此等載體在包含隔膜及心臟肌肉之骨胳肌肉中表現微小肌縮蛋白，並防止肌纖維損傷，增加肌肉力量以及減少及/或預防纖維化的方法。

Description

腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症

本申請案主張2018年6月18日提交的美國臨時專利申請案第62/686,668號；2018年10月2日提交的美國臨時專利申請案第62/740,402號；2018年10月30日提交的美國臨時專利申請案第62/752,841號；2019年3月25日提交的美國臨時專利申請案第62/823,649號；及2019年6月11日提交的美國臨時專利申請案第62/860,220號的優先權；及2019年6月17日提交的國際申請案第PCT/US2019/037489號，其各自以全文引用的方式併入本文中。以引用的方式併入以電子方式提交的材料

本申請案含有呈電腦可讀形式之序列表作為本揭示案之獨立部分，該序列表以全文引用的方式併入本文中且標識如下：檔案名：53169ARTW_Seqlisting.txt；創建大小：60,103位元組；2019年6月17日。

本發明提供表現小型化人微小肌縮蛋白（micro-dystrophin）基因之基因療法載體，諸如腺相關病毒（AAV）載體，以及在患有肌肉萎縮症之個體中使用此等載體在包含隔膜及心臟肌肉之骨胳肌肉中表現微小肌縮蛋白，並防止肌纖維損傷，增加肌肉力量以及減少及/或預防纖維化的方法。

肌肉質量及力量對於每日活動，諸如行動及呼吸，及對於整個身體代謝的重要性不言而喻。肌肉功能缺陷引起肌肉萎縮（MD），其特徵在於肌肉無力及消瘦且對生活品質具有嚴重影響。表徵最充分之MD係由編碼肌縮蛋白相關蛋白質複合物（DAPC）成員之基因突變引起。此等MD係與缺失由DAPC引起的肌纖維膜-細胞骨架繫栓相關之膜脆弱性引起。杜興氏肌肉萎縮症（Duchenne Muscular Dystrophy；DMD）係最具破壞性的肌肉疾病之一，每5000個新生男性中即有1個受影響。

DMD係由DMD基因突變導致mRNA減少以及不存在肌縮蛋白引起，肌縮蛋白係一種與肌縮蛋白相關蛋白質複合物（DAPC）有關的427 kD肌纖維膜蛋白質（Hoffman等人, 《細胞（Cell ）》51(6):919-28, 1987）。DAPC係由肌肉肌纖維膜處之多種蛋白質構成，這些蛋白質經由肌縮蛋白（一種肌動蛋白結合蛋白）及α-肌縮蛋白聚糖（dystroglycan）（一種層黏連蛋白結合蛋白）在細胞外基質（ECM）與細胞骨架之間形成結構連接。此等結構連接用於使肌肉細胞膜在收縮期間穩定並且防止收縮誘發的損傷。當肌縮蛋白缺失時，膜脆弱性引起肌纖維膜撕裂及鈣內流，由此觸發鈣活化之蛋白酶及區段性纖維壞死（Straub等人, 《神經學新見（Curr Opin. Neurol. ）》10(2): 168-75, 1997）。這種不受控制的肌肉退化與再生循環最終會耗盡肌肉幹細胞群（Sacco等人, 《細胞》, 2010. 143(7): 第1059-71頁； Wallace等人, 《生理學年評（Annu Rev Physiol ）》, 2009. 71: 第37-57頁），導致進行性肌無力、肌內膜炎症及纖維化疤痕形成。

若沒有肌縮蛋白或微小肌縮蛋白使膜穩定，則DMD將顯現不受控制的組織損傷與修復循環，最終經由結締組織增殖用纖維化瘢痕組織替代損失之肌纖維。纖維化係以包含膠原蛋白及彈性蛋白在內之ECM基質蛋白過量沈積為特徵。ECM蛋白質主要由諸如TGFβ之細胞介素產生，所述TGFβ係由活化之纖維母細胞對應激及炎症起反應而釋放。儘管DMD之主要病理特徵係肌纖維變性及壞死，但纖維化作為病理性後果具有相同影響。在DMD患者中，纖維化組織之過量產生將限制肌肉再生且造成進行性肌肉無力。在一項研究中，在10年隨訪時，在初始DMD肌肉活體組織切片上纖維化之存在與不良運動後果高度相關（Desguerre等人, 《神經病理學與實驗神經病學雜誌（J Neuropathol Exp Neurol ）》, 2009. 68(7): 第762-7頁）。此等結果指出，纖維化係DMD肌肉功能障礙之主要促成因素且突出顯示在明顯纖維化之前對早期干預之需求。

需要增加患有DMD之患者的肌肉力量且防止肌肉損傷之治療。

本發明係關於在包含隔膜及心臟肌肉之骨骼肌中表現微小肌縮蛋白基因以防止肌纖維損傷、增加肌肉力量以及減少及/或預防纖維化的基因療法載體，例如AAV。

本發明提供使用基因療法載體遞送微小肌縮蛋白以解決在DMD中所觀察到的基因缺陷，由此增加肌肉力量及/或增加肌肉質量的療法及方法。實例2描述關於杜興氏肌肉萎縮症的全身基因遞送臨床試驗，在本研究中，個體接受2×1014 vg/kg AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。實例3中描述的臨床研究提供一種新穎的關鍵臨床方案，該方案包含隨機化雙盲安慰劑對照之設計。在研究開始時，對個體隨機分組並使其接受2×10¹⁴ vg/kg AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白或乳酸林格氏溶液（lactated ringers）。

本發明提供了包括SEQ ID NO:3、8或9之核苷酸序列的核酸分子。本發明亦提供包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021之核酸序列的rAAV，及包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021之核酸序列的rAAV粒子。

本發明之另一態樣提供組合物，其包括含SEQ ID NO:3、8或9之核苷酸序列的核酸分子；含SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021之核酸序列的rAAV；以及含具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021之核酸序列的rAAV粒子。本文所揭示方法中之任一種均可用此等組合物進行。

本發明提供治療有需要人類個體之肌肉萎縮症的方法，所述方法包括投與重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白之步驟，其中所述rAAV係藉由全身投與途徑以約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg之劑量投與。所述肌肉萎縮症可為杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症。

舉例而言，投與的rAAV之劑量係約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約5.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約2.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹³ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹³ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約4.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至1.0×10¹⁵ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.5 ×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.5 ×10¹⁴ vg/kg、或1.5×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或1.75×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至1.0×10¹⁵ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約4.0×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg。

在一個實施例中，本發明之方法包括全身投與rAAV，其中所述全身投與途徑係靜脈內途徑且投與的rAAV之劑量係約2.0×10¹⁴ vg/kg。在另一個實施例中，本發明之方法包括全身投與rAAV，其中所述全身投與途徑係靜脈內途徑且投與的rAAV之劑量係約5.0×10¹² vg/kg、或約6.0×10¹² vg/kg、或約7.0×10¹² vg/kg、或約8.0×10¹² vg/kg、或約9.0×10¹² vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg、或約1.25×10¹³ vg/kg、或約1.5×10¹³ vg/kg、或約1.75×10¹³ vg/kg、或約2.25×10¹³ vg/kg、或約2.5×10¹³ vg/kg、或約2.75×10¹³ vg/kg、或約3.0×10¹³ vg/kg、或約3.25×10¹³ vg/kg、或約3.5×10¹³ vg/kg、或約3.75×10¹³ vg/kg、或約4.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg、或約6.0×10¹³ vg/kg、或約7.0×10¹³ vg/kg、或約8.0×10¹³ vg/kg、或約9.0×10¹³ vg/kg、或約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg、或約2.25×10¹⁴ vg/kg、或約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約4.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約6.0×10¹⁴ vg/kg、或約1×10¹⁵ vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白或AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在本發明方法中之任一種中，投與的rAAV之劑量可以為約5 mL/kg至約15 mL/kg、或約8 mL/kg至約12 mL/kg、或8 mL/kg至約10 mL/kg、或5 mL/kg至約10 mL/kg、或約10 mL/kg至12 mL/k、或約10 mL/kg至15 mL/kg、或10 mL/kg至約20 mL/kg。在一個特定實施例中，投與的劑量或rAAV係約10 mL/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白或AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在本發明方法中之任一種中，rAAV之劑量可藉由注射、輸注或植入投與。舉例而言，rAAV之劑量係藉由經約一小時輸注投與。此外，rAAV之劑量係藉由靜脈內途徑，經由周邊肢體靜脈，諸如周邊臂靜脈或周邊腿靜脈投與。或者，輸注可以在約30分鐘、或約1.5小時、或約2小時、或約2.5小時或約3小時內投與。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

藉由本發明方法中之任一種投與的rAAV可包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。此外，藉由本發明方法中之任一種投與的rAAV包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。舉例而言，rAAV可包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。

在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在本發明方法中之任一種中，所投與的rAAV具有血清型AAVrh7.4。

在一些實施例中，本發明之方法治療杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症。例示性實施例係一種治療有需要人類個體之杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症的方法，所述方法包括投與一定劑量的重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白之步驟，其中投與途徑係靜脈內輸注且在約一小時內投與約2×10¹⁴ vg/kg劑量之rAAV，且其中rAAV載體包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977、或ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在一個實施例中，本發明提供rAAV，其包括肌肉特異性控制元件核苷酸序列，及編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核苷酸序列。舉例而言，核苷酸序列編碼功能性微小肌縮蛋白蛋白質，其中所述核苷酸與SEQ ID NO: 1具有例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%或89%、更通常至少90%、91%、92%、93%或94%且甚至更通常至少95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，其中所述蛋白質保持微小肌縮蛋白活性。微小肌縮蛋白蛋白質使肌肉膜在肌肉收縮期間具有穩定性，例如微小肌縮蛋白在肌肉收縮期間充當減震器。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

本發明亦提供rAAV，其中核苷酸序列包括在嚴格條件下與SEQ ID NO:1之核酸序列或其補體雜交的核苷酸序列，且編碼功能性微小肌縮蛋白蛋白質。

在一個實施例中，rAAV係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的非複製性重組腺相關病毒（AAV），稱為AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。此載體基因組含有基因表現所需的最小元件，包含AAV2反向末端重複序列（ITR）、微小肌縮蛋白、SV40內含子（SD/SA）及合成聚腺苷酸化（Poly A）信號，所有這些皆在MHCK7啟動子/強化子控制下。載體基因組及表現卡匣之示意圖示於圖1中。AAVrh74血清型可用以在IV投與後實現骨骼及心臟肌肉中之高效基因轉移。

術語「嚴格」用於指本領域中通常理解為嚴格的條件。雜交嚴格度主要由溫度、離子強度及諸如甲醯胺之變性劑的濃度決定。用於雜交及洗滌之嚴格條件的實例係65-68℃下0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉，或在42℃下0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉及50%甲醯胺。參見Sambrook等人, 《分子選殖實驗指南（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）》, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, (紐約冷泉港（Cold Spring Harbor, N.Y.） 1989)。亦可使用更嚴格的條件（諸如更高的溫度、更低的離子強度、更高濃度的甲醯胺或其他變性劑），不過，雜交速率將受到影響。在涉及脫氧寡核苷酸雜交的情況下，其他例示性嚴格雜交條件包含在37℃（針對14個鹼基之寡核苷酸）、48℃（針對17個鹼基之寡核苷酸）、55℃（針對20個鹼基之寡核苷酸）及60℃（針對23個鹼基之寡核苷酸）下在6× SSC 0.05%焦磷酸鈉中洗滌。

出於減少非特異性及/或背景雜交之目的，可以在雜交及洗滌緩衝液中包含其他試劑。實例係0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙烯基-吡咯啶酮、0.1%焦磷酸鈉、0.1%十二烷基硫酸鈉、NaDodSO4（SDS）、菲科爾（ficoll）、鄧哈特氏溶液（Denhardt's solution）、音波處理之鮭魚精DNA（或其他非互補DNA）及硫酸葡聚糖，但亦可使用其他適合之試劑。可以在基本上不影響雜交條件嚴格度的情況下改變這些添加劑的濃度及類型。雜交實驗通常在pH 6.8-7.4下進行，然而，在典型離子強度條件下，雜交速率基本上與pH無關。參見Anderson等人, 《核酸雜交實踐方法（Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach）》, 第4章, IRL Press Limited (英格蘭牛津（Oxford, England）)。雜交條件可以由本領域中熟習此項技術者調整，以便適應這些變數且允許具有不同序列相關性的DNA形成雜交體。

術語「肌肉特異性控制元件」係指調控在肌肉組織中特異性表現的編碼序列之表現的核苷酸序列。此等控制元件包含強化子及啟動子。本發明提供包括肌肉特異性控制元件MCKH7啟動子、MCK啟動子及MCK強化子之構築體。

術語「可操作地連接」係指定位調控元件核苷酸序列，例如啟動子核苷酸序列，以使所述調控元件能夠表現所述核苷酸序列。

在一個態樣中，本發明提供一種rAAV，其中肌肉特異性控制元件係人骨骼肌動蛋白基因元件、心臟肌動蛋白基因元件、肌細胞特異性強化子結合因子（MEF）、肌肉肌酸激酶（MCK）、截短之MCK（tMCK）、肌凝蛋白重鏈（MHC）、雜交α-肌凝蛋白重鏈強化子-啟動子/MCK強化子-啟動子（MHCK7）、C5-12、鼠類肌酸激酶強化子元件、骨骼快速抽動肌鈣蛋白c基因元件、緩慢抽動心臟肌鈣蛋白c基因元件、緩慢抽動肌鈣蛋白i基因元件、低氧誘導性核因子、類固醇誘導性元件或糖皮質激素反應元件（GRE）。

舉例而言，肌肉特異性控制元件係MHCK7啟動子核苷酸序列SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7，或肌肉特異性控制元件係MCK核苷酸序列SEQ ID NO: 4。此外，在本發明之rAAV載體中之任一種中，肌肉特異性控制元件核苷酸序列，例如MHCK7或MCK核苷酸序列，可操作地連接至編碼微小肌縮蛋白蛋白質之核苷酸序列。舉例而言，如圖1或圖2（SEQ ID NO: 3）或圖13（SEQ ID NO: 9）中所提供之構築體中所陳述，MHCK7啟動子核苷酸序列（SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7）可操作地連接至人微小肌縮蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 1）。在另一個實例中，如圖5或圖6（SEQ ID NO: 5）中所提供之構築體中所陳述，MCK啟動子（SEQ ID NO: 4）可操作地連接至人微小肌縮蛋白編碼序列（SEQ ID NO: 1）。在另一態樣中，本發明提供一種rAAV載體，其包括SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2，或SEQ ID NO:1及SEQ ID NO: 7之核苷酸序列。本發明亦提供一種rAAV載體，其包括SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。

在另一態樣中，本發明提供一種包含在質體中之rAAV構築體，其包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8之核苷酸序列。舉例而言，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體包括在SEQ ID NO:3內且包含該序列之ITR在內之核苷酸序列且示於圖2中。rAAV載體包括5’ ITR、MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人微小肌縮蛋白基因之編碼序列、多聚腺苷酸及3' ITR。在一個實施例中，所述載體包括SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021。SEQ ID NO:3中陳述之質體進一步包括安比西林（ampicillin）抗性及具有pBR322複製起點之pGEX質體主鏈。

在另一態樣中，本發明提供包括SEQ ID NO: 9之核苷酸序列的rAAV。舉例而言，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體構築體包括SEQ ID NO: 9之核苷酸序列且顯示於圖13中。此rAAV載體構築體包括MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人微小肌縮蛋白基因之編碼序列及多聚腺苷酸。在一個實施例中，rAAV載體構築體進一步包括在所述啟動子5'端之ITR及在所述多聚腺苷酸3'端之ITR。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74。

在另一態樣中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體包括在SEQ ID NO: 8內且包含該序列之ITR在內之核苷酸序列且示於圖15中。rAAV載體包括5'ITR、MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人微小肌縮蛋白基因之編碼序列、多聚腺苷酸及3' ITR。在一個實施例中，所述載體包括SEQ ID NO:9之核苷酸1-4977。SEQ ID NO:3中陳述之質體進一步包括卡那黴素（kanamycin）抗性及具有pBR322複製起點之pGEX質體主鏈。

在另一態樣中，本發明提供包括AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體構築體之質體。在一個實施例中，所述質體包括5' ITR、MHCK7啟動子、嵌合內含子序列、人微小肌縮蛋白基因之編碼序列、多聚腺苷酸及3'ITR。在一個實施例中，所述質體包括卡那黴素抗性且視情況包括具有pBR322複製起點之pGEX質體主鏈。在一個特定實施例中，所述質體陳述於SEQ ID NO: 8中且示於圖14及15中。

本發明提供一種重組AAV載體，其包括SEQ ID NO: 1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子核苷酸序列。此rAAV載體係AAV血清型AAVrh.74。

本發明亦提供一種rAAV，其包括在SEQ ID NO:3內且包含該序列中之ITR在內的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列、在SEQ ID NO: 8內且包含該序列中之ITR在內的核苷酸序列或如SEQ ID NO: 9中所述之核苷酸序列。此rAAV載體係AAV血清型AAVrh.74。

本發明之rAAV載體可為任何AAV血清型，諸如血清型AAVrh.74、AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13。

本發明亦提供包括本發明之rAAV載體中之任一種的醫藥組合物（或有時在本文中簡稱為「組合物」）。

在另一個實施例中，本發明提供製造rAAV載體粒子之方法，其包括培養已用任何本發明之rAAV載體轉染之細胞及自經轉染細胞之上清液回收rAAV粒子。本發明亦提供包括本發明之重組AAV載體中之任一種的病毒粒子。

在治療肌肉萎縮症之方法中之任一種中，在投與rAAV之後，個體之細胞中微小肌縮蛋白基因之表現量增加。所述細胞中微小肌縮蛋白基因之表現係藉由用西方墨點法（Western blot）量測在投與所述rAAV前後切片檢查之肌肉中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。確切地說，在投與rAAV之後微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與rAAV之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%到至少約80%、或至少約70%到至少約90%、或至少約80%到至少約90%。舉例而言，在投與rAAV之後微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與rAAV之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%、或至少約71%、或至少約72%、或至少約73%、或至少約74%、或至少約75%、或至少約76%、或至少約77%、或至少約78%、或至少約79%、或至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%。

此外，所述細胞中微小肌縮蛋白基因之表現係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。在投與rAAV之後微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與rAAV之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%到至少約80%、或至少約70%到至少約90%、或至少約80%到至少約90%。舉例而言，在投與rAAV之後微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與rAAV之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%、或至少約71%、或至少約72%、或至少約73%、或至少約74%、或至少約75%、或至少約76%、或至少約77%、或至少約78%、或至少約79%、或至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%。

在治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準有所降低。舉例而言，在投與rAAV之後60天該個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約65%至約90%、或約65%至約95%、或約75%至約90%、或約80%至約90%、或約85%至約95%、或約87%至約95%、或約87%至約90%。確切地說，在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約87%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約72%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約73%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約78%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約95%。在治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與所述rAAV之後所述個體之肌肉組織中微小肌縮蛋白陽性纖維之數量相較於在投與所述rAAV之前微小肌縮蛋白陽性纖維之數量有所增加。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與rAAV前後肌肉活體組織切片上微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測微小肌縮蛋白陽性纖維之數量。

在治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，投與rAAV使諸如α-肌聚糖或β-肌聚糖之類DAPC蛋白質的表現上調。舉例而言，在投與rAAV之後所述個體中之α-肌聚糖水準相較於在投與rAAV之前的α-肌聚糖水準有所增加。此外，在投與rAAV之後所述個體中之β-肌聚糖水準相較於在投與rAAV之前的β-肌聚糖水準有所增加。α-肌聚糖或β-肌聚糖之水準係藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測投與rAAV前後肌肉活體組織切片上α-肌聚糖或β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。

在治療肌肉萎縮症之方法的任一種中，如藉由以下任一種所量測，所述個體之疾病進展在投與所述rAAV之後延遲：六分鐘步行測試、起身時間（time to rise）、登高4級台階（ascend 4 steps）、登高及下降4級台階（ascend and descend 4 steps）、北極星移動評估（North Star Ambulatory Assessment，NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手持肌力測定法（HHD）、計時起立行走（Timed Up and Go）及/或大肌肉動作分測試量表（Gross Motor Subtest Scaled）（Bayley-III）分數。

舉例而言，在任何一種方法中，所述個體在投與rAAV之後至少270天的NSAA分數相較於在投與rAAV之前的NSAA分數有至少6分的改善。另外，在任何一種方法中，所述個體在投與rAAV之後至少270天的起身時間相較於在投與rAAV之前的起身時間有至少約0.8秒的改善。此外，在任何一種方法中，所述個體在投與rAAV之後至少270天的登高4級台階測試的時間相較於在投與rAAV之前登高4級台階測試的時間有至少約1.2秒的改善。另外，在任何一種方法中，所述個體在投與rAAV之後至少270天的100 m計時測試相較於在投與rAAV之前的100 m計時測試有至少約7秒的改善。

在另一個實施例中，本發明提供在患者細胞中表現微小肌縮蛋白基因之方法，其包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體前後肌肉活體組織切片中微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測患者細胞中微小肌縮蛋白基因之表現。此外，亦藉由偵測每個核中載體基因組之數量增加來量測患者中微小肌縮蛋白基因之表現，其中每個核中1個載體基因組有約50%微小肌縮蛋白表現且每個核中超過1個複本符合微小肌縮蛋白表現量。舉例而言，所述細胞每個核有1.2個載體複本、或每個核有1.3個載體複本、或每個核有1.4個載體複本、或每個核有1.5個載體複本、或每個核有1.6個載體複本、或每個核有1.7個載體複本、或每個核有1.8個載體複本、或每個核有1.9個載體複本。

在另一個實施例中，本發明提供降低有需要患者中之血清CK水準之方法，所述方法包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，在投與rAAV之後60天患者中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低至少約65%至約90%、或約65%至約95%、或約75%至約90%、或約80%至約90%、或約85%至約95%、或約87%至約95%、或約87%至約90%。確切地說，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約87%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約72%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約73%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約78%，或在本發明的治療肌肉萎縮症之方法中的任一種中，在投與rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低約95%。

本發明亦提供增加患者肌肉組織中之微小肌縮蛋白陽性纖維之方法，其包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與rAAV前後肌肉活體組織切片上肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測微小肌縮蛋白陽性纖維之數量。此外，亦藉由偵測每個核中載體基因組之數量增加來量測患者中微小肌縮蛋白基因之表現，其中每個核中1個載體基因組有約50%微小肌縮蛋白表現且每個核中超過1個複本符合微小肌縮蛋白表現量。舉例而言，所述細胞每個核有1.2個載體複本、或每個核有1.3個載體複本、或每個核有1.4個載體複本、或每個核有1.5個載體複本、或每個核有1.6個載體複本、或每個核有1.7個載體複本、或每個核有1.8個載體複本、或每個核有1.9個載體複本。

在另一個實施例中，本發明提供增加有需要患者中α-肌聚糖之表現的方法，其包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與rAAV前後肌肉活體組織切片上α-肌聚糖之蛋白質水準來偵測α-肌聚糖之水準。

此外，本發明提供增加有需要患者中β-肌聚糖之表現的方法，其包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與rAAV前後肌肉活體組織切片上β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測β-肌聚糖之水準。

本發明亦提供治療患有杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症之患者的方法，其包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列，使得如藉由以下任一種所量測，患者之疾病進展延遲：六分鐘步行測試、起身時間、登高4級台階、登高及下降4級台階、北極星移動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手持肌力測定法（HHD）、計時起立行走及/或大肌肉動作分測試量表（Bayley-III）分數。

「纖維化」係指組織在損傷後細胞外基質（ECM）組分過量的或不受調控的沈積以及異常修復過程，所述組織包含骨胳肌肉、心臟肌肉、肝、肺、腎臟及胰臟。沈積之ECM組分包含纖維結合蛋白及膠原蛋白，例如膠原蛋白1、膠原蛋白2或膠原蛋白3。

本發明亦提供減少或預防患有肌肉萎縮症之個體中之纖維化的方法，其包括投與治療有效量的包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子核苷酸序列的rAAV；或包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的rAAV載體。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在另一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在另一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5066的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在另一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在另一個實施例中，本發明提供預防有需要個體之纖維化的方法，其包括投與治療有效量的SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子核苷酸序列；或包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAV74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的rAAV載體。舉例而言，可以將本發明之rAAV中的任一種投與患有肌肉萎縮症之個體以預防纖維化，例如在所述個體中觀察在纖維化之前投與的表現人微小肌縮蛋白蛋白質的本發明之rAAV。此外，亦可將表現人微小肌縮蛋白基因的本發明之rAAV投與有發展纖維化之風險的個體，諸如患有或經診斷患有肌肉萎縮症，例如DMD的個體。本發明之rAAV可投與患有肌肉萎縮症之個體以便預防此等個體中出現新的纖維化。

本發明涵蓋在個體中觀察到纖維化之前投與rAAV。另外，亦可將rAAV投與有發展纖維化風險之個體，諸如患有或經診斷患有肌肉萎縮症，例如DMD的個體。rAAV可投與已發展纖維化的患有肌肉萎縮症之個體以便預防此等個體中出現新的纖維化。

本發明亦提供增加患有肌肉萎縮症之個體之肌肉力量及/或肌肉質量的方法，其包括投與治療有效量的SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子核苷酸序列；或包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的rAAV。

本發明涵蓋在所述個體中觀察到纖維化之前或在肌肉力量減小之前或在肌肉質量降低之前向診斷患有DMD之個體投與rAAV載體。

本發明亦涵蓋向已發展纖維化的患有肌肉萎縮症之個體投與SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子核苷酸序列；或包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的rAAV，以便預防在這些個體中出現新的纖維化或減少這些個體中之纖維化。本發明亦提供向肌肉力量已減小或肌肉質量已降低的患有肌肉萎縮症之個體投與SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子核苷酸序列；或包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的rAAV載體，以便防止肌肉進一步損傷。

在本發明方法中之任一種中，個體可患有肌肉萎縮症，諸如DMD，或任何其他肌縮蛋白相關肌肉萎縮症。

在本文所描述的本發明方法中之任一種的其他實施例中，在投與rAAV之後所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的所述血清CK水準降低選自由以下組成之群組的百分比水準： a)在所述投與之後90、180或270天降低至少78%； b)在所述投與之後270天降低至少46、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或85%； c)在所述投與之後180天降低至少72、73、74或95%； d)在所述投與之後90天降低至少87、88、93或95%； e)在所述投與之後270天降低至少70%； f)在所述投與之後90、180或270天降低70至95%； g)在投與之後90、180或270天降低至少56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%；以及 h)在投與之後90、180或270天降低至少56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%。

在另一個實施例中，本發明提供用於治療有需要人類個體之肌肉萎縮症的組合物，其中所述組合物包括一定劑量的重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白，其中組合物係調配用於全身投與途徑且rAAV之劑量係約1×10¹⁴ vg/kg至約4×10¹⁴ vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

舉例而言，本發明之組合物包括的rAAV之劑量係約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約5.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約2.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹³ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹³ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約4.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至1.0×10¹⁵ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.5 ×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.5 ×10¹⁴ vg/kg、或1.5×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或1.75×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至1.0×10¹⁵ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約4.0×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在一個實施例中，本發明之組合物係調配用於靜脈內投與且包括約2.0×10¹⁴ vg/kg劑量之rAAV。在另一個實施例中，本發明之組合物係調配用於靜脈內投與且包括的rAAV之劑量係約5.0×10¹² vg/kg、或約6.0×10¹² vg/kg、或約7.0×10¹² vg/kg、或約8.0×10¹² vg/kg、或約9.0×10¹² vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg、或約1.25×10¹³ vg/kg、或約1.5×10¹³ vg/kg、或約1.75×10¹³ vg/kg、或約2.25×10¹³ vg/kg、或約2.5×10¹³ vg/kg、或約2.75×10¹³ vg/kg、或約3.0×10¹³ vg/kg、或約3.25×10¹³ vg/kg、或約3.5×10¹³ vg/kg、或約3.75×10¹³ vg/kg、或約4.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg、或約6.0×10¹³ vg/kg、或約7.0×10¹³ vg/kg、或約8.0×10¹³ vg/kg、或約9.0×10¹³ vg/kg、或約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg、或約2.25×10¹⁴ vg/kg、或約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約4.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約6.0×10¹⁴ vg/kg、或約1×10¹⁵ 。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在另一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在本發明組合物中之任一種中，遞送的rAAV之劑量係約5 mL/kg至約15 mL/kg、或約8 mL/kg至約12 mL/kg、或8 mL/kg至約10 mL/kg、或5 mL/kg至約10 mL/kg、或約10 mL/kg至12 mL/kg、或約10 mL/kg至15 mL/kg、或10 mL/kg至約20 mL/kg。在一個特定實施例中，所述組合物包括遞送約10 mL/kg劑量之rAAV。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在另一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

本發明之組合物係調配用於藉由注射、輸注或植入投與。舉例而言，所述組合物係調配用於藉由經約一小時輸注來投與。此外，本發明之組合物係調配用於經由周邊肢體靜脈，諸如周邊臂靜脈或周邊腿靜脈經靜脈內投與。或者，輸注可以在約30分鐘、或約1.5小時、或約2小時、或約2.5小時或約3小時內投與。

本發明組合物中之任一種包括含SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列的rAAV，或含具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的rAAV載體。

確切地說，本發明之組合物係用於治療杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症。舉例而言，本發明提供用於治療有需要人類個體之杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症的組合物，其中所述組合物包括一定劑量的重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白，其中所述組合物係調配用於藉由經約一小時靜脈內輸注來投與且投與的rAAV之劑量係約2×10¹⁴ vg/kg，且其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。

在另一個實施例中，本發明亦提供一種包括rAAV之組合物，其用於減少有需要個體中之纖維化。此外，本發明亦提供一種包括rAAV載體之組合物，其用於預防患有肌肉萎縮症之個體之纖維化。

本發明亦提供包括rAAV之組合物，其用於增加患有肌肉萎縮症之個體之肌肉力量及/或肌肉質量。在另一個實施例中，本發明提供包括本發明之rAAV中之任一種的組合物，其用於治療肌肉萎縮症。

在本發明組合物中之任一種的其他實施例中，在將所述組合物投與需要治療肌肉萎縮症之人類個體之後，所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物之前的血清CK水準降低選自由以下組成之群組的百分比水準： a)在所述投與之後90、180或270天降低至少78%； b)在所述投與之後270天降低至少46、55、70或85%； c)在所述投與之後180天降低至少72、73、74或95%； d)在所述投與之後90天降低至少87、99、93或95%； e)在所述投與之後270天降低至少70%； f)在所述投與之後90、180或270天降低70至95%； g)在所述投與之後90、180或270天降低至少69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%；以及 h)在所述投與之後90、180或270天降低69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%。

在另一個實施例中，本發明提供一定劑量的重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白的用途，其用於製備供治療有需要人類個體之肌肉萎縮症用的藥劑，其中所述藥劑係調配用於全身投與途徑且rAAV之劑量係約1×10¹⁴ vg/kg至約4×101⁴ vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

舉例而言，所述藥劑包括的rAAV之劑量係約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約5.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約2.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹³ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹³ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或5.0×10¹³ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約6.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約5.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約4.0×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.0×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或1.0×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至1.0×10¹⁵ 、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.5 ×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg至約3.5 ×10¹⁴ vg/kg、或1.5×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或1.75×10¹⁴ vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至4.0×10¹⁴ 、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg至約2.0×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至1.0×10¹⁵ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至6.0×10¹⁴ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至5.0×10¹⁴ 、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約4.0×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約2.0×10¹⁴ vg/kg至約3.25×10¹⁴ vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在一個實施例中，本發明之方法係調配用於全身投與一定劑量的rAAV，其中所述全身投與途徑係靜脈內途徑且投與的rAAV之劑量係約2.0×10¹⁴ vg/kg。在另一個實施例中，本發明之藥劑係調配用於全身投與一定劑量的rAAV，其中所述全身投與途徑係靜脈內途徑且rAAV之劑量係約5.0×10¹² vg/kg、或約6.0×10¹² vg/kg、或約7.0×10¹² vg/kg、或約8.0×10¹² vg/kg、或約9.0×10¹² vg/kg、或約1.0×10¹³ vg/kg、或約1.25×10¹³ vg/kg、或約1.5×10¹³ vg/kg、或約1.75×10¹³ vg/kg、或約2.25×10¹³ vg/kg、或約2.5×10¹³ vg/kg、或約2.75×10¹³ vg/kg、或約3.0×10¹³ vg/kg、或約3.25×10¹³ vg/kg、或約3.5×10¹³ vg/kg、或約3.75×10¹³ vg/kg、或約4.0×10¹³ vg/kg、或約5.0×10¹³ vg/kg、或約6.0×10¹³ vg/kg、或約7.0×10¹³ vg/kg、或約8.0×10¹³ vg/kg、或約9.0×10¹³ vg/kg、或約1.0×10¹⁴ vg/kg、或約1.25×10¹⁴ vg/kg、或約1.5×10¹⁴ vg/kg、或約1.75×10¹⁴ vg/kg、或約2.25×10¹⁴ vg/kg、或約2.5×10¹⁴ vg/kg、或約2.75×10¹⁴ vg/kg、或約3.0×10¹⁴ vg/kg、或約3.25×10¹⁴ vg/kg、或約3.5×10¹⁴ vg/kg、或約3.75×10¹⁴ vg/kg、或約4.0×10¹⁴ vg/kg、或約5.0×10¹⁴ vg/kg、或約6.0×10¹⁴ vg/kg、或約1×10¹⁵ vg/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在本發明之用途中的任一個中，所述藥劑包括的rAAV之劑量係約5 mL/kg至約15 mL/kg、或約8 mL/kg至約12 mL/kg、或8 mL/kg至約10 mL/kg、或5 mL/kg至約10 mL/kg、或約10 mL/kg至12 mL/k、或約10 mL/kg至15 mL/kg、或10 mL/kg至約20 mL/kg。在一個特定實施例中，所述劑量或rAAV係約10 mL/kg。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，rAAV係AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。在一個實施例中，AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白係具有SEQ ID NO:5之核苷酸56-4820的AAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白。

在本發明之用途中的任一個中，所述藥劑係調配用於藉由注射、輸注或植入投與。舉例而言，所述藥劑係調配用於藉由經約一小時輸注來投與。此外，所述藥劑係調配用於經由周邊肢體靜脈，諸如周邊臂靜脈或周邊腿靜脈經靜脈內投與。或者，輸注可以在約30分鐘、或約1.5小時、或約2小時、或約2.5小時或約3小時內投與。

在本發明之用途中之任一個中，所述藥劑包括rAAV，其包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列，或具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。

本發明之特定用途係用於製備供治療杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症用之藥劑。舉例而言，本發明提供一定劑量重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白之用途，其係用於製備供治療有需要人類個體之杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症用之藥劑，其中所述藥劑係調配用於藉由經約一小時靜脈內輸注來投與且投與的rAAV之劑量係約2×10¹⁴ vg/kg，且其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。

在另一個實施例中，本發明提供rAAV之用途，其用於製備供減少有需要個體中之纖維化用的藥劑。舉例而言，所述有需要個體可能患有肌肉萎縮症，諸如DMD或任何其他肌縮蛋白相關肌肉萎縮症。

在另一個實施例中，本發明提供rAAV之用途，其用於製備供預防患有肌肉萎縮症之個體之纖維化的藥劑。

此外，本發明提供rAAV之用途，其用於製備供增加患有肌肉萎縮症之個體之肌肉力量及/或肌肉質量的藥劑。

本發明亦提供rAAV之用途，其用於製備供治療肌肉萎縮症用的藥劑。

本發明提供包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列及SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子核苷酸序列之rAAV載體的用途，其用於製備供治療肌肉萎縮症用之藥劑；或包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022之AAVrf74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列之rAAV載體的用途，其用於治療肌肉萎縮症。

在本發明之用途中之任一個的其他實施例中，在向個體投與rAAV之後所述個體中之血清CK水準相較於在投與rAAV之前的血清CK水準降低選自由以下組成之群組的百分比水準： a)在所述投與之後90、180或270天降低至少78%； b)在所述投與之後270天降低至少46、55、70或95%； c)在所述投與之後180天降低至少72、73、74或95%； d)在所述投與之後90天降低至少87、88、93或95%； e)在所述投與之後270天降低至少70%； f)在所述投與之後90、180或270天降低70至95%； g)在所述投與之後90、180或270天降低至少69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%；以及 h)在所述投與之後90、180或270天降低69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%。

在用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種中，在投與所述組合物或藥劑之後，個體之細胞中微小肌縮蛋白基因表現之水準增加。所述細胞中微小肌縮蛋白基因之表現係藉由用西方墨點法量測在投與所述組合物或藥劑前後切片檢查之肌肉中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。確切地說，在投與所述組合物或藥劑之後微小肌縮蛋白蛋白質之水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%到至少約80%、或至少約70%到至少約90%、或至少約80%到至少約90%。舉例而言，在投與所述組合物之後微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%、或至少約71%、或至少約72%、或至少約73%、或至少約74%、或至少約75%、或至少約76%、或至少約77%、或至少約78%、或至少約79%、或至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%。

此外，亦藉由用免疫組織化學法量測在投與所述組合物或藥劑前後肌肉活體組織切片中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測所述細胞中微小肌縮蛋白基因之表現。在投與rAAV之後微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%到至少約80%、或至少約70%到至少約90%、或至少約80%到至少約90%。舉例而言，在投與所述組合物或藥劑之後微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前微小肌縮蛋白之水準增加至少約70%、或至少約71%、或至少約72%、或至少約73%、或至少約74%、或至少約75%、或至少約76%、或至少約77%、或至少約78%、或至少約79%、或至少約80%、或至少約81%、或至少約82%、或至少約83%、或至少約84%、或至少約85%。

在用於治療肌肉萎縮症之組合物中的任一種中，在投與rAAV之後所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清CK水準有所降低。舉例而言，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清CK水準降低約65%至約90%、或約65%至約95%、或約75%至約90%、或約80%至約90%、或約85%至約95%、或約87%至約95%、或約87%至約90%。確切地說，在本發明的用於治療肌肉萎縮症之組合物中的任一種中，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清水準降低約87%，或在本發明的用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種中，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清CK水準降低約72%，或在本發明的用於治療肌肉萎縮症之組合物中的任一種中，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清CK水準降低約73%，或在本發明的用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種中，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物之前的血清CK水準降低約78%，或在本發明的用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種中，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清CK水準降低約95%。在用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種中，在投與所述組合物或藥劑之後所述個體之肌肉組織中微小肌縮蛋白陽性纖維之數量相較於在投與所述組合物或藥劑之前的微小肌縮蛋白陽性纖維之數量有所增加。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與所述組合物或藥劑前後肌肉活體組織切片上微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測微小肌縮蛋白陽性纖維之數量。

在用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種中，投與所述組合物或藥劑使諸如α-肌聚糖或β-肌聚糖之類蛋白質之表現上調。舉例而言，在投與所述組合物或藥劑之後所述個體中之α-肌聚糖水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的α-肌聚糖水準有所增加。此外，在投與所述組合物或藥劑之後所述個體中之β-肌聚糖水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的β-肌聚糖水準有所增加。α-肌聚糖或β-肌聚糖之水準係藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測投與所述組合物或藥劑前後肌肉活體組織切片上α-肌聚糖或β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。

在用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種中，如藉由以下任一種所量測，所述個體之疾病進展在投與所述組合物或藥劑之後延遲：六分鐘步行測試、起身時間、登高4級台階、登高及下降4級台階、北極星移動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手持肌力測定法（HHD）、計時起立行走及/或大肌肉動作分測試量表（Bayley-III）分數。

舉例而言，在投與用於治療肌肉萎縮症之組合物或藥劑用於治療肌肉萎縮症之用途中的任一種之後，所述個體在投與所述組合物或藥劑之後至少270天的NSAA分數相較於在投與rAAV之前的NSAA分數有至少6分的改善。另外，在任何一種方法中，所述個體在投與所述組合物或藥劑之後至少270天的起身時間相較於在投與所述組合物或藥劑之前的起身時間有至少約0.8秒的改善。此外，在本發明之方法或用途中的任一種中，所述個體在投與所述組合物或藥劑之後至少270天的登高4級台階測試的時間相較於在投與所述組合物或藥劑之前的登高4級台階測試的時間有至少約1.2秒的改善。此外，在本發明之方法或用途中的任一種中，所述個體在投與所述組合物或藥劑之後至少270天的100 m計時測試相較於在投與所述組合物或藥劑之前的100 m計時測試有至少約7秒的改善。

在另一個實施例中，本發明提供用於在患者細胞中表現微小肌縮蛋白基因之組合物，其包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。在另一個實施例中，本發明提供一定劑量具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的用途，其用於製備供在患者細胞中表現微小肌縮蛋白基因用之藥劑。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體前後肌肉活體組織切片中微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測患者細胞中微小肌縮蛋白基因之表現。此外，亦藉由偵測每個核中載體基因組之數量增加來量測患者中微小肌縮蛋白基因之表現，其中每個核中1個載體基因組有約50%微小肌縮蛋白表現且每個核中超過1個複本符合微小肌縮蛋白表現量。舉例而言，所述細胞每個核有1.2個載體複本、或每個核有1.3個載體複本、或每個核有1.4個載體複本、或每個核有1.5個載體複本、或每個核有1.6個載體複本、或每個核有1.7個載體複本、或每個核有1.8個載體複本、或每個核有1.9個載體複本。

在另一個實施例中，本發明提供用於降低有需要患者中之血清CK水準的組合物，所述組合物包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。此外，本發明亦提供一定劑量具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022之AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的用途，其用於製備供降低有需要患者中之血清CK水準用的藥劑。舉例而言，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述患者中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清CK水準降低至少約65%至約90%、或約65%至約95%、或約75%至約90%、或約80%至約90%、或約85%至約95%、或約87%至約95%、或約87%至約90%。確切地說，在投與所述組合物或藥劑之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清CK水準降低約87%，或在投與所述組合物或藥劑之後60天相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清水準降低約72%，或在投與所述組合物或藥劑之後60天相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清水準降低約73%，或在投與所述組合物或藥劑之後60天相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清水準降低約78%，或在投與所述組合物或藥劑之後60天相較於在投與所述組合物或藥劑之前的血清水準降低約95%。

本發明亦提供用於增加患者肌肉組織中之微小肌縮蛋白陽性纖維的組合物，其包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。此外，本發明亦提供一定劑量具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的用途，其用於製備供增加患者肌肉組織中之微小肌縮蛋白陽性纖維用的藥劑。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與所述組合物或藥劑前後肌肉活體組織切片上肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測微小肌縮蛋白陽性纖維之數量。此外，亦藉由偵測每個核中載體基因組之數量增加來量測患者中微小肌縮蛋白基因之表現，其中每個核中1個載體基因組有約50%微小肌縮蛋白表現且每個核中超過1個複本符合微小肌縮蛋白表現量。舉例而言，所述細胞每個核有1.2個載體複本、或每個核有1.3個載體複本、或每個核有1.4個載體複本、或每個核有1.5個載體複本、或每個核有1.6個載體複本、或每個核有1.7個載體複本、或每個核有1.8個載體複本、或每個核有1.9個載體複本。

在另一個實施例中，本發明提供用於增加有需要患者中之α-肌聚糖表現的組合物，其包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。本發明亦提供一定劑量具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的用途，其用於製備供增加有需要患者中之α-肌聚糖表現用的藥劑。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與所述組合物或藥劑前後肌肉活體組織切片上α-肌聚糖之蛋白質水準來偵測α-肌聚糖之水準。

此外，本發明亦提供用於增加有需要患者中之β-肌聚糖表現的組合物，其包括具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。本發明亦提供一定劑量具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的用途，其用於製備供增加有需要患者中之β-肌聚糖表現用的藥劑。舉例而言，藉由用西方墨點法或免疫組織化學法量測在投與所述組合物或藥劑前後肌肉活體組織切片上β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測β-肌聚糖之水準。

本發明亦提供一定劑量具有SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021、SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977或SEQ ID NO:6之核苷酸56-5022的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列的用途，其用於製備供治療患有杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症之患者用的藥劑，使得如藉由以下任一種所量測，投與所述藥劑使患者之疾病進展延遲：六分鐘步行測試、起身時間、登高4級台階、登高及下降4級台階、北極星移動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手持肌力測定法（HHD）、計時起立行走及/或大肌肉動作分測試量表（Bayley-III）分數。

舉例而言，所述個體在投與所述所述組合物或藥劑之後至少270天的NSAA分數相較於在投與所述組合物或藥劑之前的NSAA分數有至少6分的改善。另外，所述個體在投與所述組合物或藥劑之後至少270天的起身時間相較於在投與所述組合物或藥劑之前的起身時間有至少約0.8秒的改善。此外，所述個體在投與所述組合物或藥劑之後至少270天的登高4級台階測試的時間相較於在投與所述組合物或藥劑之前的登高4級台階測試的時間有至少約1.2秒的改善。此外，所述個體在投與所述組合物或藥劑之後至少270天的100 m計時測試相較於在投與所述組合物或藥劑之前的100 m計時測試有至少約7秒的改善。

本發明提供過度表現人微小肌縮蛋白之基因療法載體，例如rAAV載體，及減少及預防肌肉萎縮症患者中之纖維化之方法。在診斷患有DMD之最早時期採集之肌肉活體組織切片展現顯著的結締組織增殖。肌肉纖維化以多種方式引起有害作用。其減少肌內膜養分穿過結締組織屏障之正常運輸，減小血流量且剝奪肌肉中來源於血管之營養成分，並經由肢體攣縮而在功能上造成早期無法步行。隨時間推移，治療難度因肌肉中之明顯纖維化而成倍增加。這可在肌肉活體組織切片中藉由比較連續時間點時結締組織之增殖觀察到。所述過程不斷加劇，導致無法步行且加速失控，尤其是在依賴輪椅之患者中。

若不進行早期治療，包含減少纖維化之並行方法，則不太可能完全實現外顯子跳躍、終止密碼子通讀或基因替代療法之益處。若沒有減少肌肉纖維化之方法，即使是小分子或蛋白質替代策略亦可能會失敗。先前用AAV.微小肌縮蛋白治療發生纖維化之老年mdx 小鼠的研究展示，吾人無法實現完全功能復原（Liu, M.等人, 《分子治療（Mol Ther ）》 11, 245-256 (2005)）。亦已知DMD心肌病之進展伴隨著心室壁中疤痕形成及纖維化。

如本文所使用，術語「AAV」係腺相關病毒之標準縮寫。腺相關病毒係僅在由共感染輔助病毒提供某些功能之細胞中生長之單股DNA小病毒。當前有十三種得到表徵之AAV血清型。關於AAV之總體資訊及綜述可見於例如Carter, 1989, 《細小病毒手冊（Handbook of Parvoviruses）》, 第1卷, 第169-228頁，及Berns, 1990, 《病毒學（Virology）》, 第1743-1764頁, Raven Press, (紐約)中。然而，完全可以預料到此等相同原理將適用於其他AAV血清型，因為眾所周知，各種血清型在結構上及功能上關聯極其緊密，甚至是在基因層面上亦如此。（參見例如Blacklowe, 1988, 《細小病毒及人類疾病（Parvoviruses and Human Disease）》, 第165-174頁, J. R. Pattison編；及Rose, 《綜合病毒學（Comprehensive Virology）》 3:1-61 (1974)）。舉例而言，所有AAV血清型表觀上展現極其類似的由同源rep基因介導之複製特性；且全部皆帶有三種相關衣殼蛋白，諸如在AAV2中表現之該等蛋白質。相關性程度藉由沿基因組長度在各血清型之間展現廣泛交叉雜交的異雙螺旋分析；及在對應於「反向末端重複序列」（ITR）之末端處類似自黏接區段之存在進一步表明。類似感染性模式亦表明各血清型中之複製功能受到類似調節控制。

如本文所使用，「AAV載體」係指包括一或多個所關注聚核苷酸（或轉殖基因）側接AAV末端重複序列（ITR）之載體。當感染性病毒粒子存在於用編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的宿主細胞中時，此類AAV載體可複製及包裝至感染性病毒粒子中。

「AAV病毒體」或「AAV病毒粒子」或「AAV載體粒子」係指由至少一個AAV衣殼蛋白及衣殼包裹之聚核苷酸AAV載體構成的病毒粒子。若所述粒子包括異源聚核苷酸（亦即，除野生型AAV基因組，諸如待遞送至哺乳動物細胞之轉殖基因以外的聚核苷酸），則其通常稱為「AAV載體粒子」或簡稱為「AAV載體」。因此，AAV載體粒子之製造必定包含AAV載體之製造，由此載體被包含在AAV載體粒子內。AAV

腺相關病毒（AAV）係複製缺陷型細小病毒，其單股DNA基因組係約4.7 kb長度，包含145個核苷酸之反向末端重複序列（ITR）。有多種AAV血清型。已知AAV血清型之基因組的核苷酸序列。舉例而言，AAV血清型2（AAV2）基因組之核苷酸序列呈現於如由Ruffing等人, 《普通病毒學雜誌（J Gen Virol ）》, 75: 3385-3392 (1994)修正之Srivastava等人, 《病毒學雜誌（J Virol ）》, 45: 555-564 (1983)中。作為其他實例，AAV-1之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_002077中；AAV-3之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_1829中；AAV-4之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_001829中；AAV-5基因組提供於GenBank寄存編號AF085716中；AAV-6之完整基因組提供於GenBank寄存編號NC_00 1862中；AAV-7及AAV-8基因組之至少部分分別提供於GenBank寄存編號AX753246及AX753249中（關於AAV-8亦參見美國專利第7,282,199號及第7,790,449號）；AAV-9基因組提供於Gao等人, 《病毒學雜誌》, 78: 6381-6388 (2004)中；AAV-10基因組提供於《分子治療》, 13(1): 67-76 (2006)中；且AAV-11基因組提供於《病毒學》, 330(2): 375-383 (2004)中。AAVrh.74血清型之選殖描述於Rodino-Klapac.等人, 《轉化醫學雜誌（Journal of translational medicine ）》5 , 45 (2007)中。引導病毒DNA複製（rep）、衣殼包裹/包裝及宿主細胞染色體整合之順式作用序列係包含在ITR內。三個AAV啟動子（針對其相關圖譜位置命名為p5、p19及p40）驅動編碼兩個AAV內部開放閱讀框架之rep及cap基因的表現。兩個rep啟動子（p5及p19）與單個AAV內含子之差異性剪接偶合（例如在AAV2核苷酸2107及2227處）使得由rep基因產生四種rep蛋白質（rep 78、rep 68、rep 52及rep 40）。Rep蛋白質具有最終負責複製病毒基因組的多種酶特性。cap基因由p40啟動子表現，且其編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共同轉譯起始位點負責產生三種相關衣殼蛋白。單個共同聚腺苷酸化位點係位於AAV基因組之圖譜位置95處。在Muzyczka，《微生物學及免疫學之當前課題（Current Topics in Microbiology and Immunology ）》，158 : 97-129 (1992)中評述AAV之生命週期及遺傳。

AAV具有獨特特徵，使得其成為例如基因療法中用於將外來DNA遞送至細胞的引人注目之載體。AAV在培養物中感染細胞係不致細胞病變的，且對人類及其他動物之天然感染為沉默且無症狀的。此外，AAV感染多種哺乳動物細胞，使得有可能在活體內靶向多種不同組織。另外，AAV緩慢地轉導分裂細胞及非分裂細胞，且在該等細胞之生命期內可基本上保持轉錄活性細胞核游離基因體（染色體外元件）形式。AAV前病毒基因組作為質體中選殖之DNA具有感染性，使得構築重組基因組變得可行。此外，由於引導AAV複製、基因組衣殼包裹及整合之信號係包含在AAV基因組之ITR內，故固有的大約4.3 kb之基因組（編碼複製及結構性衣殼蛋白，rep-cap）中的一些或全部可經外來DNA，諸如含有啟動子、所關注DNA及聚腺苷酸化信號之基因卡匣替代。rep及cap蛋白質可以反式提供。AAV之另一個顯著特徵在於其係極其穩定且充滿活力之病毒。其容易地承受用於滅活腺病毒（在56℃至65℃下保持數小時）的條件，使得AAV之低溫保藏不那麼重要。甚至能將AAV凍乾。最後，經AAV感染之細胞對重複感染不具抗性。

多項研究展示出肌肉中長期（＞ 1.5年）重組AAV介導之蛋白質表現。參見Clark等人, 《人類基因療法（Hum Gene Ther ）》, 8 : 659-669(1997)；Kessler等人, 《美國國家科學院院刊（Proc Nat.Acad Sc.USA ）》, 93 : 14082-14087 (1996)；及Xiao等人, 《病毒學雜誌》, 70 : 8098-8108 (1996)。亦參見Chao等人, 《分子治療》,2 :619-623 (2000)及Chao等人, 《分子治療》, 4:217-222 (2001)。此外，如Herzog等人, 《美國國家科學院院刊》,94 : 5804-5809 (1997)及Murphy等人, 《美國國家科學院院刊》,94 : 13921-13926 (1997)中所描述，由於肌肉高度血管化，故在肌肉內注射後，重組AAV轉導使得在全身循環中出現轉殖基因產物。另外，Lewis等人, 《病毒學雜誌》,76 : 8769-8775 (2002)展示，骨骼肌纖維具有正確抗體糖基化、摺疊及分泌所必需的細胞因子，表明肌肉能夠穩定表現分泌的蛋白質治療劑。

本發明之重組AAV基因組包括本發明之核酸分子及一或多個側接核酸分子之AAV ITR。rAAV基因組中之AAV DNA可來自能衍生出重組病毒之任何AAV血清型，包含但不限於AAV血清型AAVrh.74、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12及AAV-13。假模式化rAAV之製造揭示於例如WO 01/83692中。亦涵蓋其他類型之rAAV變異體，例如具有衣殼突變之rAAV。參見例如Marsic等人，《分子治療（Molecular Therapy ）》，22(11): 1900-1909 (2014)。如以上先前技術部分中所述，各種AAV血清型之基因組之核苷酸序列係此項技術中已知的。為促進骨胳肌肉特異性表現，可使用AAV1、AAV6、AAV8或AAVrh.74。

本發明之DNA質體包括本發明之rAAV基因組。將DNA質體轉移至容許用AAV之輔助病毒（例如腺病毒、E1缺失之腺病毒或疱疹病毒）感染之細胞中，用於將rAAV基因組組裝至感染性病毒粒子中。製造rAAV粒子之技術係此項技術中之標準技術，在所述技術中，將待包裝之AAV基因組、rep及cap基因以及輔助病毒功能提供至細胞。rAAV之製造需要在單個細胞（本文中稱為包裝細胞）內存在以下組分：rAAV基因組、與rAAV基因組分開（亦即，不在該基因組中）之AAV rep及cap基因以及輔助病毒功能。AAV rep及cap基因可來自能衍生出重組病毒之任何AAV血清型，且可來自與rAAV基因組ITR不同的AAV血清型，包含但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAVrh.74、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12及AAV-13。假模式化rAAV之製造揭示於例如WO 01/83692中，其以全文引用的方式併入本文中。

一種產生包裝細胞之方法係產生穩定表現AAV粒子製造所必需之所有組分的細胞株。舉例而言，將包括不含AAV rep及cap基因之rAAV基因組、與rAAV基因組分開之AAV rep及cap基因以及可選擇標記物（諸如新黴素（neomycin）抗性基因）之一個質體（或多個質體）整合至細胞基因組中。已藉由諸如以下程序將AAV基因組引入細菌質體中：GC加尾（Samulski等人，1982，《美國國家科學院院刊》, 79:2077-2081）、添加含有限制性內切核酸酶裂解位點之合成連接子（Laughlin等人，1983，《基因（Gene）》，23:65-73）或藉由直接平末端連接（Senapathy及Carter，1984，《生物化學雜誌（J. Biol. Chem.）》, 259:4661-4666）。接著，包裝細胞株經諸如腺病毒之輔助病毒感染。此方法之優勢在於，此等細胞係可選擇的且適合於大規模製造rAAV。適合方法之其他實例採用腺病毒或桿狀病毒而非質體將rAAV基因組及/或rep及cap基因引入至包裝細胞中。

rAAV製造之一般原理評述於例如Carter，1992，《生物技術之當前觀點（Current Opinions in Biotechnology）》，1533-539；及Muzyczka，1992，《微生物學及免疫學當前課題》, 158:97-129）中。各種方法在Ratschin等人, 《分子與細胞生物學（Mol.Cell.Biol .）》 4:2072 (1984)；Hermonat等人, 《美國國家科學院院刊》, 81:6466 (1984)；Tratschin等人, 《分子與細胞生物學》, 5:3251 (1985)；McLaughlin等人, 《病毒學雜誌》, 62:1963 (1988)；及Lebkowski等人, 《分子與細胞生物學》, 7:349 (1988)；Samulski等人 , 《病毒學雜誌》, 63:3822-3828 (1989)；美國專利第5,173,414號；WO 95/13365及相應美國專利第5,658.776號、第WO 95/13392號、第WO 96/17947號、第PCT/US98/18600號、第WO 97/09441號（PCT/US96/14423）、第WO 97/08298號（PCT/US96/13872）、第WO 97/21825號（PCT/US96/20777）、第WO 97/06243號（PCT/FR96/01064）、第WO 99/11764號；Perrin等人, 《疫苗》13:1244-1250 (1995)；Paul等人, 《人類基因療法》, 4:609-615 (1993)；Clark等人, 《基因療法（Gene Therapy ）》3:1124-1132 (1996)；美國專利第5,786,211號；美國專利第5,871,982號；及美國專利第6,258,595號中有描述。前述文獻以全文引用之方式併入本文中，其中特別強調文獻中與rAAV製造相關之該等部分。

因此，本發明提供產生感染性rAAV之包裝細胞。在一個實施例中，包裝細胞可為穩定轉型之癌細胞，諸如HeLa細胞、293細胞及PerC.6細胞（同源293株）。在另一個實施例中，包裝細胞係不為經轉型癌細胞之細胞，諸如低傳代次數293細胞（經腺病毒之E1轉型之人胚腎細胞）、MRC-5細胞（人胚纖維母細胞）、WI-38細胞（人胚纖維母細胞）、Vero細胞（猴腎細胞）及FRhL-2細胞（恆河猴胚肺細胞）。

本發明之重組AAV（亦即，感染性衣殼化rAAV粒子）包括rAAV基因組。在例示性實施例中，兩個rAAV之基因組均缺乏AAV rep及cap DNA，亦即，在基因組之ITR之間不存在AAV rep或cap DNA。可構築成包括本發明之核酸分子的rAAV之實例陳述於國際專利申請案第PCT/US2012/047999號（WO 2013/016352）中，其以全文引用的方式併入本文中。

在一個例示性實施例中，本發明之重組AAV載體係藉由三重轉染方法（Xiao等人, 《病毒學雜誌》72 , 2224-2232(1998)，使用AAV載體質體rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白、pNLRep2-Caprh74及pHelp製造，rAAV含有側接AAV2反向末端重複序列（ITR）之微小肌縮蛋白基因表現卡匣。正是此序列經衣殼包裹至AAVrh74病毒體中。所述質體含有微小肌縮蛋白序列以及具有肌肉特異性啟動子之MHCK7強化子及核心啟動子元件，用以驅動基因表現。表現卡匣亦含有SV40內含子（SD/SA）以促進高水準基因表現，及牛生長激素聚腺苷酸化信號用於高效的轉譯終止。

pNLREP2-Caprh74係編碼來自血清型rh74之4種野生型AAV2 rep蛋白質及3種野生型AAV VP衣殼蛋白的AAV輔助質體。pNLREP2-Caprh74質體之示意性圖譜示於圖3中。

pHELP腺病毒輔助質體係11,635 bp且獲自Applied Viromics。所述質體含有腺病毒基因組中對AAV複製至關重要的區域，即E2A、E4ORF6及VA RNA（腺病毒E1功能係由293細胞提供）。此質體中存在之腺病毒序列僅佔腺病毒基因組之約40%，且不含複製必不可少的順式元件，諸如腺病毒末端重複序列。因此，預期此類製造系統不能產生感染性腺病毒。pHELP質體之示意性圖譜示於圖4中。

rAAV可藉由此項領域中之標準方法，諸如藉由管柱層析法或氯化銫梯度純化。自輔助病毒純化出rAAV載體之方法係此項領域中已知的，且包含例如Clark等人, 《人類基因療法》,10 (6): 1031-1039 (1999)；Schenpp及Clark, 《分子生物學方法（Methods Mol. Med. ）》,69 427-443 (2002)；美國專利第6,566,118號及WO 98/09657中揭示之方法。

在另一個實施例中，本發明涵蓋包括本發明之rAAV之組合物。本發明之組合物包括rAAV及醫藥學上可接受之載劑。所述組合物亦可包括其他成分，諸如稀釋劑及佐劑。可接受之載劑、稀釋劑及佐劑對接受者無毒且在所採用劑量及濃度下較佳呈惰性，且包含緩衝劑及諸如普朗尼克（pluronics）之界面活性劑。

在本發明之方法中投與的rAAV之效價將取決於例如特定rAAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向之細胞類型而變化，且可藉由此項技術中之標準方法測定。rAAV之效價可在每毫升約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 至約1×10¹⁴ 或更高DNA酶抗性粒子（DRP）之範圍內。劑量亦可以病毒基因組之單位數表示（vg）。測定衣殼包裹之載體基因組效價之一種例示性方法使用了定量PCR，諸如（Pozsgai等人, 《分子治療》25(4):855-869, 2017）中所描述之方法。

本發明涵蓋在活體內或活體外用rAAV轉導目標細胞之方法。活體內方法包括向有需要之動物（包含人類）投與一次有效劑量或多次有效劑量的包括本發明之rAAV之組合物的步驟。若在發展病症/疾病之前投與所述劑量，則投與係預防性的。若在發展病症/疾病之後投與所述劑量，則投與係治療性的。在本發明之實施例中，有效劑量係緩解（消除或減少）與所治療病症/疾病狀態有關之至少一種症狀、減緩或預防病症/疾病狀態之進展、減緩或預防病症/疾病狀態之進展、減輕疾病之程度、使疾病緩解（局部或總體）及/或延長存活期的劑量。預期用本發明之方法預防或治療之疾病的實例係DMD。

本發明亦涵蓋組合療法。如本文所使用，組合包含同時治療及依序治療兩種。特定地涵蓋本發明方法與標準醫學治療（例如皮質類固醇）之組合，以及其與新穎療法之組合。

有效劑量之組合物可藉由此項技術中之標準途徑投與，包含但不限於肌肉內、非經腸、靜脈內、經口、經頰、經鼻、經肺、顱內、骨內、眼內、經直腸或經陰道投與。本領域中熟習此項技術者考慮所治療之感染及/或疾病狀態以及用於表現微小肌縮蛋白之目標細胞/組織可選擇及/或匹配本發明之rAAV（尤其是AAV ITR及衣殼蛋白）的投與途徑及AAV組分之血清型。

本發明提供局部投與及全身投與有效劑量的本發明之rAAV及組合物。舉例而言，全身投與係投與至循環系統中，以使整個身體均受影響。全身投與包含經腸投與，諸如經由胃腸道吸收，及經由注射、輸注或植入非經腸投與。

特定言之，實際投與本發明之rAAV可藉由使用將rAAV重組載體輸送至動物之目標組織中的任何物理方法實現。根據本發明之投與包含但不限於注射至肌肉中及注射至血流中。經展示，簡單地將rAAV再懸浮於磷酸鹽緩衝生理食鹽水中足以提供可用於肌肉組織表現之媒劑，且對於可與rAAV共投與之載劑或其他組分並無已知限制（不過，在利用rAAV之正常方式中應避免降解DNA之組合物）。rAAV之衣殼蛋白可經修飾，以使得rAAV靶向所關注之特定目標組織，諸如肌肉。參見例如WO 02/053703，其揭示內容以引用之方式併入本文中。醫藥組合物可製備成可注射調配物或製備成擬藉由經皮輸送遞送至肌肉中的局部調配物。先前已開發出眾多用於肌肉內注射及經皮輸送之調配物，且可用於本發明之實踐中。為投與及處置簡易性起見，rAAV可與任何醫藥學上可接受之載劑一起使用。

在本發明之一個實施例中，本文所描述的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白係在含有20 mM Tris（pH 8.0）、1 mM氯化鎂（MgCl₂ ）、200 mM氯化鈉（NaCl）及0.001%泊洛沙姆（poloxamer）188之緩衝液中調配。

在本文所揭示之方法中投與的rAAV之劑量將取決於例如特定rAAV、投與模式、治療目標、個體及所靶向之細胞類型而變化，且可藉由此項技術中之標準方法測定。所投與各rAAV之效價可在每毫升約1×10⁶ 、約1×10⁷ 、約1×10⁸ 、約1×10⁹ 、約1×10¹⁰ 、約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、1×10¹⁴ 或2×10¹⁴ 至約1×10¹⁵ 或更多個DNA酶抗性粒子（DRP）的範圍內。劑量亦可以病毒基因組之單位數（vg）表示（亦即，分別為1×10⁷ vg、1×10⁸ vg、1×10⁹ vg、1×10¹⁰ vg、1×10¹¹ vg、1×10¹² vg、1×10¹³ vg、1×10¹⁴ vg、2×10¹⁴ vg、1×10¹⁵ vg）。劑量亦可以每公斤（kg）體重病毒基因組之單位數（vg）表示（亦即，分別為1×10¹⁰ vg/kg、1×10¹¹ vg/kg、1×10¹² vg/kg、1×10¹³ vg/kg、1×10¹⁴ vg/kg、1.25×10¹⁴ vg/kg、1.5×10¹⁴ vg/kg、1.75×10¹⁴ vg/kg、2.0×10¹⁴ vg/kg、2.25×10¹⁴ vg/kg、2.5×10¹⁴ vg/kg、2.75×10¹⁴ vg/kg、3.0×10¹⁴ vg/kg、3.25×10¹⁴ vg/kg、3.5×10¹⁴ vg/kg、3.75×10¹⁴ vg/kg、4.0×10¹⁴ vg/kg、1×10¹⁵ vg/kg）。用於滴定AAV之方法描述於Clark等人, 《人類基因療法》,10 : 1031-1039 (1999)中。

出於肌肉內注射之目的，可採用在諸如芝麻油或花生油之佐劑中或在水性丙二醇中之溶液，以及無菌水溶液。必要時，此類水溶液可經緩衝，且先用生理食鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等張。可在適當地混有諸如羥丙基纖維素之界面活性劑的水中製備呈游離酸（DNA含有酸性磷酸根基）或藥理學上可接受之鹽形式之rAAV的溶液。亦可在甘油、液態聚乙二醇及其混合物中以及在油中製備rAAV之分散液。在普通的儲存及使用條件下，此等製劑含有防腐劑，用以防止微生物生長。就這一點而言，所採用的無菌水性介質皆可容易地藉由本領域中熟習此項技術者熟知之標準技術獲得。

適合於注射使用之醫藥載劑、稀釋劑或賦形劑包含無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。在所有情況下，所述形式必須為無菌的且就存在易於注射性而言，必須為流體。其在製造及儲存條件下必須為穩定的，且必須防止諸如細菌及真菌之類微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及其類似物）、其適合混合物及植物油之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之類包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。微生物作用之預防可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物來實現。在多數情況下，其較佳地包含等張劑，例如糖或氯化鈉。可注射醫藥組合物之吸收延長可藉由使用延遲吸收之試劑，例如單硬脂酸鋁及明膠實現。

無菌可注射溶液係藉由以下製備：將所需量之rAAV與上文列舉之各種其他成分一起併入適當溶劑中，視需要，隨後過濾滅菌。一般而言，藉由將滅菌之活性成分併入含有基礎分散介質及來自上文所列成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，較佳之製備方法係真空乾燥及冷凍乾燥技術，由此自其預先無菌過濾之溶液產生活性成分加任何額外所需成分之粉末。

用rAAV轉導亦可在活體外進行。在一個實施例中，自個體移出所需目標肌肉細胞，經rAAV轉導且再引入個體中。替代地，可使用同基因型或異種肌肉細胞，在此情況下，該等細胞在個體中將不會產生不當的免疫反應。

用於轉導並將經轉導細胞再引入個體中之適合方法係此項技術中已知的。在一個實施例中，可在活體外，藉由在例如適當介質中將rAAV與肌肉細胞組合，並使用習知技術，諸如南方墨點法（Southern blots）及/或PCR，或藉由使用可選擇標記物篩選帶有所關注DNA之細胞，來轉導細胞。接著，經轉導細胞可調配成醫藥組合物，且將所述組合物藉由各種技術，諸如藉由肌肉內、靜脈內、皮下及腹膜內注射，或藉由使用例如導管注射至平滑及心臟肌肉中來引入個體中。

用本發明之rAAV轉導細胞引起微小肌縮蛋白之持續表現。因此，本發明提供將表現微小肌縮蛋白之rAAV投與/遞送至動物，較佳人類的方法。此等方法包含用本發明之一或多種rAAV轉導組織（包含但不限於組織，諸如肌肉；器官，諸如肝及腦；及腺體，諸如唾液腺）。轉導可以用包括組織特異性控制元件之基因卡匣進行。舉例而言，本發明之一個實施例提供轉導由肌肉特異性控制元件引導之肌肉細胞及肌肉組織之方法，所述肌肉特異性控制元件包含但不限於源自肌動蛋白及肌凝蛋白基因家族，諸如源自myoD基因家族（參見Weintraub等人, 《科學（Science ）》,251 : 761-766 (1991)）之控制元件、肌細胞特異性強化子結合因子MEF-2（Cserjesi及Olson, 《分子與細胞生物學》, 11: 4854-4862 (1991)）、源自人骨骼肌動蛋白基因之控制元件（Muscat等人, 《分子與細胞生物學》,7 : 4089-4099 (1987)）、心臟肌動蛋白基因、肌肉肌酸激酶序列元件（參見Johnson 等人, 《分子與細胞生物學》,9 :3393-3399 (1989)）及鼠類肌酸激酶強化子（mCK）元件、源自骨骼快速抽動肌鈣蛋白C基因、緩慢抽動心臟肌鈣蛋白C基因及緩慢抽動肌鈣蛋白I基因之控制元件：低氧誘導性核因子（Semenza等人, 《美國國家科學院院刊》,88 : 5680-5684 (1991)）、類固醇誘導性元件及包含糖皮質激素反應元件（GRE）之啟動子（參見Mader及White, 《美國國家科學院院刊》, 90: 5603-5607 (1993)），及其他控制元件。

肌肉組織係活體內DNA遞送的引人注目之目標，因為其並非生命器官且容易獲取。本發明涵蓋由經轉導之肌纖維持續表現微小肌縮蛋白。

「肌肉細胞」或「肌肉組織」意謂源自任何種類肌肉（例如骨胳肌及平滑肌，例如來自消化道、膀胱、血管或心臟組織之骨胳肌及平滑肌）之細胞或細胞群。此類肌肉細胞可為分化或未分化的，諸如肌母細胞、肌細胞、肌管、心肌細胞及心肌母細胞。

術語「轉導」用以指在活體內或活體外經由本發明之複製缺陷型rAAV將微小肌縮蛋白之編碼區投與/遞送至受體細胞，使得受體細胞表現微小肌縮蛋白。

因此，本發明提供將有效劑量（或基本上同時投與之多次劑量或以一定時間間隔給與之多次劑量）的編碼微小肌縮蛋白之rAAV投與有需要之個體的方法。

以下實例係以說明而非限制之方式提供。所描述的數字範圍包含各範圍內之每一整數值且包含最小及最大的所陳述整數在內。實例實例 1 A) 產生 AAVrh74.MHCK7. 微小肌縮蛋白構築體

AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白質體含有側接AAV2反向末端重複序列（ITR）之人微小肌縮蛋白cDNA表現卡匣（參見圖1）。微小肌縮蛋白構築體之特徵在於框內桿缺失（R4-R23），同時鉸鏈1、2及4以及富含半胱胺酸之結構域仍產生138 kDa蛋白質。微小肌縮蛋白蛋白質（3579 bp）之表現係由MHCK7啟動子（792 bp）引導。由rAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體，藉由移除MCK啟動子並插入MHCK7啟動子來構築所述質體。在核心啟動子之後，存在53 bp之內源性小鼠MCK外顯子1（非轉譯）用於高效轉譯起始，隨後為SV40晚期16S/19S剪接信號（150 bp）及小5'UTR（61 bp）。內含子及5' UTR源自質體pCMVβ（Clontech）。微小肌縮蛋白卡匣具有共同Kozak剛好在ATG起點前，及用於mRNA終止的小的53 bp合成多聚腺苷酸信號。如Harper等人（《自然-醫學》8 , 253-261(2002)）先前所描述，人微小肌縮蛋白卡匣含有（R4-R23/Δ71-78）結構域。互補DNA針對人類使用進行密碼子優化且由GenScript（新澤西州皮斯卡塔威（Piscataway, NJ））（《分子治療》18 , 109-117 (2010)）合成。此載體中所包含的唯一病毒序列係AAV2反向末端重複序列，其為病毒DNA複製及包裝所需的。微小肌縮蛋白卡匣具有用於mRNA終止的小的53 bp合成多聚腺苷酸信號。

先前的研究已驗證使用MHCK7啟動子（Salva等人, 《分子治療》15 , 320-329 (2007)）及AAVrh74進行心臟表現，實現骨骼、隔膜及心臟肌肉表現（Sondergaard等人, 《臨床與轉化神經病學年鑒（Annals of clinical and Transl Neurology ）》 2 , 256-270 (2015)），圖1中構築體之序列經衣殼包裹於AAVrh.74病毒體中。自恆河猴淋巴結選殖AAVrh.74血清型之分子純系且其論述於Rodino-Klapac等人, 《轉化醫學雜誌》5 , 45 (2007)中。表 1 顯示質體AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白（SEQ ID NO: 3）之分子特徵

B) 由及編碼卡那黴素（ Kan ）抗性之質體產生 AAVrh74.MHCK7. 微小肌縮蛋白構築體

藉由自MHCK7.µDys.AMP質體分離出MHCK7.µDys片段及卡那黴素主鏈，並使用NEBuilder選殖工作流程將其黏接在一起來達成MHCK7.µDys.KAN之選殖。MHCK7.µDys片段係經由用SnaBI消化限制酶來分離。在37℃下，在1×CutSmart緩衝液（NEB）及1 µL SnaBI中以50 µL總反應物進行消化，持續1小時。使用1%瓊脂糖凝膠，經由電泳在105伏特下跑膠1.5小時，分離所得片段。切下對應於MHCK7.µDys插入物的條帶並使用凝膠純化套組（Macherey-Nagel）進行純化。所得片段的DNA濃度為10 ng/µL。在37℃下，在50 µL反應物中，在1×CutSmart緩衝液（NEB）及1 µL XbaI存在下經由XbaI限制酶消化1小時，分離出Kan主鏈片段。使用1%瓊脂糖凝膠，經由電泳在105伏特下跑膠1.5小時，分離所得片段。切下對應於Kan主鏈之條帶並經由凝膠純化套組（Macherey-Nagel）進行純化。所得片段的DNA濃度為8.1 ng/µL。使用NEB選殖工作流程黏接所述兩個片段，該選殖工作流程能夠利用重疊序列接合兩個片段。根據製造商的方案，在1×NEBuilder HiFi DNA組裝主混合物中使用1:1比率之MHCK7.µDys比卡那黴素主鏈，在50℃下執行NEBuilder選殖反應15分鐘，總反應體積為20 µL。藉由將2.5 µL選殖產物添加至細胞中，隨後在冰上保持30分鐘，接著在42℃下保持30秒且在冰上再保持5分鐘，將所得純系轉型至NEB®穩定感受態大腸桿菌（C3040）中。轉型之後，將950 µL生長培養基添加至細胞中並在225rpm振盪下，使其在30℃下生長1.5小時。在生長之後，將450 µL該等細胞塗鋪於50 µg/mL卡那黴素LB瓊脂盤上並在乾燥恆溫箱中在30℃下培育過夜。自此盤中揀取集落並使其在含有50 µg/mL卡那黴素之LB中生長過夜。使用QIAprep® Spin Miniprep套組（Qiagen）自3 mL此培養物中分離出DNA。使用此DNA確定選殖產物。經由用PmeI、MscI及SmaI進行限制酶消化，隨後凝膠電泳來確定選殖產物。另外，經由測序確定選殖產物。所得質體陳述於SEQ ID NO: 8中且示於圖14及15中。如上文所描述，將對應於SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977之序列的圖13之構築體序列用衣殼包裹於AAVrh.74病毒體中。實例 2 關於杜興氏肌肉萎縮症之全身基因遞送臨床試驗

此係使用具有SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白針對DMD受試者進行的單劑量對照試驗。第A組將包含年齡自3個月至3歲的六位受試者，且第B組將包含年齡自4歲至7歲的六位受試者。所有受試者將經靜脈內接受微小肌縮蛋白載體（2×10¹⁴ vg/kg，10 mL/kg）。在含有20 mM Tris（pH 8.0）、1 mM氯化鎂（MgCl₂ ）、200 mM氯化鈉（NaCl)及0.001%泊洛沙姆188之緩衝液中調配rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白。

在本研究中，經由周邊臂靜脈輸注rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白，以使其可以到達體內所有肌肉。招收第A組中年齡自3個月至3歲的六位DMD受試者，及第B組中年齡自4歲至7歲的六位DMD受試者。所有受試者經靜脈內接受微小肌縮蛋白載體（2×10¹⁴ vg/kg，10 mL/kg）。使用定量PCR，使用Prism 7500 Taqman偵測器系統（PE Applied Biosystems），用針對MHCK7啟動子之引子，相較於超螺旋DNA質體標準品測定所投與之劑量中衣殼包裹之載體基因組效價（Pozsgai等人, 《分子治療》 25(4):855-869, 2017）。

受試者在全國兒童醫院（Nationwide Children's Hospital）之兒科加護病室（PICU）接受1小時之輸液。在基因療法之前，在篩查訪視時執行肌肉切片檢查。在遞送後90天，受試者將經歷第二次肌肉切片檢查以確定所述基因是否能替代缺失之肌縮蛋白蛋白質。在基因轉移之後，小心地監測患者的任何治療副作用。此監測包含在篩查訪視期間以及在第0天、第1天、第7天、第14天、第30天、第60天、第90天及第180天、及在9個月、12個月、18個月、24個月、30個月及36個月進行血液及尿液測試，以及體檢，以確保無基因注射引起之副作用。

第A組受試者（n=6位）在3個月至3歲之間，並經靜脈內接受rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體（2×10¹⁴ vg/kg，10 mL/kg）。在基因轉移前一天，第A組中的受試者以1 mg/kg潑尼松（prednisone）或地夫可特（deflazacort）起始並維持30天，同時監測免疫反應。若在第30天呈陰性，則在1週內中斷類固醇。若對AAV或微小肌縮蛋白起反應之T細胞＞125 SFC/106個PBMC，則維持類固醇，直至水準降低至此臨限值以下。

第B組受試者（n=6位）之年齡在4歲至7歲之間，並經靜脈內接受rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體（2×10¹⁴ vg/kg，10 mL/kg）。這些受試者在整個試驗中維持穩定的皮質類固醇劑量，但在對AAV或微小肌縮蛋白起反應之T細胞＞125 SFC/106 PBMC時，可以短時間增加劑量。資格標準

本研究之納入標準如下： ● 入選年齡：第A組：3個月至7歲且第B組：在4-7歲之間，包括端點。 ● 具有含讀框轉移（缺失或複製）或在外顯子18至58之間含過早終止密碼子突變之DMD基因的分子表徵。 ● CK升高＞1000 U/L ● 第A組受試者：在Bayley-III動作評估時大肌肉動作低於平均值，定義為量表分數≤9分 ● 第B組：在100公尺計時測試時低於平均值，定義為＜80%預測值 ● 任何種族之男性。 ● 能夠配合動作評估測試。 ● 第A組受試者：先前未用皮質類固醇治療。 ● 第B組受試者：在篩查之前，口服穩定劑量的皮質類固醇等效物至少12週，並預期所述劑量在整個研究中保持恆定（為適應體重變化進行之修改除外）

本研究之排除標準如下： ● 基於臨床觀察結果有活動性病毒感染。 ● 心肌病之病徵，包含射血分數低於40%之心動回聲圖。 ● 有HIV感染、或B型或C型肝炎感染之血清學證據。 ● 自身免疫性疾病之診斷（或正經歷相應治療）。 ● 被認為有臨床意義之異常實驗室值 ● PI認為對基因轉移產生不必要風險之伴隨疾病或對慢性藥物治療之要求。 ● 如藉由ELISA免疫分析所測定，AAVrh74或AAV8抗體效價＞1:400之受試者。 ● 研究者認為可能損害受試者遵守測試或程序所需之方案的能力或損害受試者之健康、安全性或臨床可解譯性的醫學病況或情有可原的情況。 ● 在基因轉移訪視之前4週內有重度感染（例如肺炎、腎盂腎炎或腦膜炎）（入選可推遲） ● 在本研究篩查之前最後6個月內，接受過任何研究藥物（皮質類固醇除外）或外顯子跳躍藥物（包含ExonDys 51®）、實驗或其他藥物。 ● 有過任何類型之基因療法、基於細胞之療法（例如幹細胞移植）或CRISPR/Cas9療法。 ● 家人不希望主治醫師及其他醫療提供者披露患者參與研究的情況。結果指標

主要結果指標係基於出現不良事件之參與者之數量的安全性（時間範圍：3年）。監測不良作用並針對嚴重程度及與研究物之相關性進行評分。

次要結果指標如下：

大肌肉動作分測試量表（Bayley-III）分數（時間範圍：篩查、第30天-3年）：以動作發展量測的大肌肉動作量表分數。在第30天開始至3年的每次隨訪時，利用Bayley-III大肌肉動作分測試對第A組評分。在篩查時，年齡為43-47個月（包括端點）之任何受試者皆具有與42個月大兒童之標準化資料相比較計算的量表分數。Bayley-III提供1-42個月年齡之兒童的標準化資料。

物理療法評估100公尺計時測試（100 m）（時間範圍：篩查、第30天-3年）：100 m係第B組之主要動作結果。100公尺計時測試係在第A組中兒童達到3歲就開始的探索性結果。

物理療法評估北極星移動評估（NSAA）（時間範圍：篩查、第30天-3年）：北極星移動評估（NSAA）係第A組中兒童達到四歲時以及針對第B組開始的探索性結果。NSAA度量患有杜興氏肌肉萎縮症之小男孩之移動品質。

針對兒童修改的的物理療法評估計時起立行走（TUG）（時間範圍：篩查、第30天-3年）：第B組之探索性結果包含針對兒童修改的計時起立行走（TUG）。

物理療法評估登高及下降4級台階（時間範圍：篩查、第30天-3年）：第B組之探索性結果將包含登高及下降4級台階。

物理療法評估手持肌力測定法（HHD）（時間範圍：篩查、第30天-3年）：第B組之探索性結果包含針對膝伸肌及膝屈肌，以及肘屈肌及肘伸肌之手持肌力測定（HHD）。

藉由免疫螢光法定量微小肌縮蛋白基因表現（時間範圍：篩查、第90天）：藉由免疫螢光法定量前後肌肉活體組織切片中之微小肌縮蛋白基因表現量並進行比較。

藉由西方墨點法定量微小肌縮蛋白基因表現（時間範圍：篩查、第90天）：藉由西方墨點分析定量前後肌肉活體組織切片中之微小肌縮蛋白基因表現量並進行比較。

在基因療法後CK減少（時間範圍：3年）：循環血液中之CK水準降低。

心臟磁共振成像（1年時）。微小肌縮蛋白基因表現

分析並定量經由免疫螢光（IF）纖維強度得到的微小肌縮蛋白表現自基線之變化。如圖7中所示，受試者1（5歲）展示在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後腓腸肌活體組織切片之肌纖維中有78%之微小肌縮蛋白蛋白質表現，受試者2（4歲）展示在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後腓腸肌活體組織切片之肌纖維中有73.5%之微小肌縮蛋白蛋白質表現，且受試者3（6歲）展示在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後腓腸肌活體組織切片之肌纖維中有77.0%之微小肌縮蛋白蛋白質表現。受試者4（4歲）展示在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後腓腸肌活體組織切片之肌纖維中有96.2%之微小肌縮蛋白表現。如藉由免疫組織化學法所量測，所有患者均顯示經轉導微小肌縮蛋白之穩健表現，該表現完全地侷限於肌肉肌纖維膜。相較於正常對照，藉由微小肌縮蛋白陽性纖維之百分比量測的平均基因表現為76.2%且所述纖維之平均強度為74.5%。

另外，藉由用西方墨點法量測切片檢查之肌肉組織定量微小肌縮蛋白之蛋白質表現來評估自基線至第60天微小肌縮蛋白基因表現之變化。如圖8A及8B中所示，用西方墨點分析偵測受試者1（5歲）、受試者2（4歲）及受試者3（6歲）中之微小肌縮蛋白蛋白質表現。圖8C提供西方墨點分析偵測受試者4（4歲）中微小肌縮蛋白之蛋白質表現。如藉由西方墨點法所量測，所有治療後活體組織切片顯示穩固的微小肌縮蛋白水準，其中利用方法1，相較於正常值，受試者1-4之平均值為74.3，且依照調整用於脂肪及纖維化組織之方法2，相較於正常值為95.8%。

對於每一受試者，量測每個肌纖維核中的載體基因組複本數。如表2中所示，在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後，對於每個受試者，每個核酸酶之載體基因組複本數大於1個。載體之一個複本指示有約50%之微小肌縮蛋白基因表現。在受試者1-3中量測到每個細胞核平均有1.6個載體複本，符合所觀察到的較高微小肌縮蛋白表現量。當受試者4之值包含在內時，每微克DNA之平均載體複本數＞10⁵ 個，其中每個細胞核平均有3.3個載體複本。表 2

藉由免疫組織化學法量測投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白前後肌肉切片檢查組織中α-肌聚糖及β-肌聚糖之蛋白質水準。投與rAAVrh74.MHCK7亦使受試者中之DAPC蛋白質上調。如圖9中所示，受試者1（圖9A）、受試者2（圖9B）及受試者3（圖9C）中肌肉切片檢查組織中α-肌聚糖及β-肌聚糖之表現相較於在投與rAAVrh74.MHCK7之前肌肉活體組織切片中該等蛋白質之表現水準有所增加。循環血清 CK 水準

在藉由靜脈內輸注投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體（2×10¹⁴ vg/kg，10 mL/kg）之後每30天獲得血液樣品。在每次訪視時量測CK水準並與在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白（訪視第0天）之前獲得的基線水準相比較。基線血清CK水準（單位/公升）提供於下表3中。如圖10中所示，在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後2個月，循環血清CK之水準降低約87%。在治療後2個月，所有受試者均顯示血清肌酸激酶（CK）水準顯著降低，且平均CK降低超過87%（n=3）。CK係與肌肉損傷有關之酶且DMD患者一致地展現較高的CK水準。實際上，CK之明顯升高通常用作DMD之初步診斷工具，隨後進行確證基因測試。

表4及圖10提供每一受試者之CK水準。圖11提供平均CK水準隨時間之變化，且展示平均CK水準在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後隨時間明顯降低。平均基線CK水準27,064 U/L（表3之平均值）降低約63%達到平均值9,982 U/L（平均值，第270天，表4）。表 3

表 4 ：自基線至第 270 天之 CK 水準變化

功效評估

除微小肌縮蛋白及CK水準外，藉由以下功能測試量測功效：自地板起身之時間、登高4級台階、北極星移動評估（NSAA）、起身測試時間、爬4層樓梯測試、10公尺計時測試（10 m）及100公尺計時測試（100 m）。資料提供於下表5及6中，且此資料展示在投與rAAVrh74。MHCK7.微小肌縮蛋白之後9個月一致且持久的改善。圖12亦提供NSAA隨時間改善。表 5 ：自基線至第 270 天之 NSAA 變化

表 6 ：自基線至第 270 天之變化

安全性評估

在本研究中未觀察到嚴重不良事件（SAE）。三位受試者具有升高的γ-麩胺醯基轉移酶（GGT），GGT升高在一週內藉由增加類固醇解決且恢復至基線水準。不存在其他有臨床意義之實驗室研究結果。患者一般在第一週療法期間出現短暫的噁心，同時增加類固醇劑量。此與肝酶升高或任何其他異常不相關。實例 3 隨機化雙盲安慰劑對照的全身基因遞送第 I/IIa 期臨床試驗

此係在DMD受試者中使用rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白進行的隨機化雙盲單次劑量試驗。本研究包含年齡為4至7歲之二十四位受試者。受試者在入選時隨機分入治療組或安慰劑組。十二位受試者經靜脈內接受rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白載體（2×10¹⁴ vg/kg，約10 mL/kg），且十二位受試者將接受10 mL/kg安慰劑（乳酸林格氏溶液）。安慰劑受試者將繼續進行治療，該治療將在最後一次治療之受試者給藥之後一年以與12位先前治療之受試者相同之方式給與。受試者經約1小時輸注帶有微小肌縮蛋白之rAAV或乳酸林格氏溶液。在治療前後（90天）對腓腸肌進行穿刺肌肉切片檢查。

本研究之主要目的係評估經由周邊肢體靜脈，對DMD受試者靜脈內投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之安全性。藉由血液學、血清化學、尿分析之變化、針對rAAVrh74及微小肌縮蛋白之免疫反應、以及報告的病史及症狀觀察結果評估安全性終點。肌縮蛋白基因表現用作主要結果指標以及安全性。使用驗證之免疫螢光法及免疫墨點分析進行定量。基因療法後CK之降低用作次要結果。藉由以下功能性測試量測功效：起身時間、登高4級台階、北極星移動評估（NSAA）、10公尺計時測試（10 m）、100公尺計時測試（100 m）。探索性指標包含針對膝伸肌和膝屈肌、以及肘屈肌及肘伸肌之手持肌力測定（HHD）。

本研究之納入標準如下： ● 入選年齡：在4-7歲之間，包括端點。 ● 具有含讀框轉移（缺失或複製）或在外顯子18至58之間含過早終止密碼子突變之DMD基因的分子表徵。 ● 有症狀的肌肉萎縮症之指徵：CK升高＞1000 U/L且低於100公尺步行測試之平均預測時間百分比 ● 任何種族之男性均符合條件。 ● 能夠配合動作評估測試。 ● 在篩查之前，口服穩定劑量之皮質類固醇等效物至少12週，且預期該劑量在整個研究中保持恆定（為適應體重變化作出的可能修改除外）。

本研究之排除標準如下： ● 基於臨床觀察結果有活動性病毒感染。 ● 心肌病之病徵，包含射血分數低於40%之心動回聲圖。 ● 有HIV感染、或B型或C型肝炎感染之血清學證據。 ● 自身免疫性疾病之診斷（或正經歷相應治療）。 ● 被認為有臨床意義之異常實驗室值（GGT＞3XULN，膽紅素≥3.0 mg/dL，肌酸酐≥1.8 mg/dL，Hgb＜8或＞18 g/Dl；WBC＞18,500個/cmm），血小板≤50,000。 ● PI認為對基因轉移產生不必要風險之伴隨疾病或對慢性藥物治療之要求。 ● 如藉由ELISA免疫分析所測定，AAVrh74或AAV8抗體效價＞1:400之受試者。若在篩查時，終點效價呈陽性，則在排除之前可以重複測試。 ● 研究者認為可能損害受試者遵守測試或程序所需之方案的能力或損害受試者之健康、安全性或臨床可解譯性的醫學病況或情有可原的情況。 ● 在基因轉移訪視之前4週內有重度感染（例如肺炎、腎盂腎炎或腦膜炎）（入選可推遲） ● 在本研究篩查之前最後6個月內，接受過任何研究藥物（皮質類固醇除外）或外顯子跳躍藥物（包含ExonDys 51®）、實驗或其他藥物。 ● 有過任何類型之基因療法、基於細胞之療法（例如幹細胞移植）或CRISPR/Cas9療法。 ● 家人不希望主治醫師及其他醫療提供者披露患者參與研究的情況。功效評估

肌縮蛋白基因表現用作主要結果指標以及安全性。使用驗證之免疫螢光法及免疫墨點分析進行定量。基因療法後CK之降低用作次要結果。此外，亦藉由以下功能性測試量測功效：自地板起身之時間、登高4級台階、北極星移動評估（NSAA）、10公尺計時測試（10 m）、100公尺計時測試（100 m）]。探索性指標包含針對膝伸肌和膝屈肌、以及肘屈肌及肘伸肌之手持肌力測定（HHD）。

使用超音波指導之肌肉切片檢查定量轉殖基因表現，比較基線與第90天之表現。切片檢查係對與初始活體組織切片相同的肌肉但在相對腿上進行。在對所有受試者給藥後一年，安慰劑交叉受試者將在第1次訪視時重新開始研究時間表。安慰劑受試者在第二次基線篩查時不會執行以下操作：心臟MRI及肌肉切片檢查。安慰劑受試者在第90天經歷肌肉切片檢查（總計3次肌肉切片檢查）。使用間接免疫螢光法（IF）對冷凍切片中之肌縮蛋白進行染色。進行全載片掃描並使用驗證之圖像掃描及MuscleMapTM分析演算法定量微小肌縮蛋白強度及陽性纖維百分比。肌肉形態測定係不知情之情況下執行，包含纖維尺寸直方圖。使用在不知情之情況下得到的冷凍肌肉活體組織切片刮屑（shavings），使用驗證之西方墨點方法執行微小肌縮蛋白之定量蛋白質分析。

使用腓腸肌之肌肉穿刺活體組織切片（除非PI認為特定受試者禁忌此操作，在此情況下PI將選擇替代肌肉進行切片檢查）定量微小肌縮蛋白表現。功效分析

主要功效終點係如藉由西方墨點法量測的切片檢查之肌肉組織中微小肌縮蛋白之蛋白質表現之數量自基線至第90天的變化。利用共變異數（ANCOVA）模型分析，以治療作為固定因子及基線值作為共變數，評估主要功效終點之治療組差異。執行威爾卡森秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test）作為支持性分析。經由免疫螢光（IF）纖維強度，以類似方式分析微小肌縮蛋白表現自基線之變化。

支持性功效終點包含自基線至關於自地板起身之時間、登高4級台階、NSAA、10公尺計時測試（10 m）、100公尺計時測試（100 m）及CK變化之每一預定評估的變化。探索性指標包含針對膝伸肌和膝屈肌、以及肘屈肌及肘伸肌之HHD。利用ANCOVA模型，以治療作為固定因子及基線值作為共變數，評估治療組差異。執行威爾卡森秩和檢驗作為支持性分析。實例 4

利用如SEQ ID NO: 9中所述；如SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977中所述；或如SEQ ID NO: 6之核苷酸56-5022中所述的rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體替代地進行以上實例2及3中所描述的試驗及研究。實例 5 pAAV.MCK. 微小肌縮蛋白構築體之產生

藉由將驅動密碼子優化之人微小肌縮蛋白cDNA序列的MCK表現卡匣插入AAV選殖載體psub201中來構築pAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體（Samulski等人, 《病毒學雜誌》, 61(10):3096-3101）。在所述構築體中包含肌肉特異性調控元件以驅動肌肉特異性基因表現。此調控元件包括小鼠MCK核心強化子（206 bp）與351 bp MCK核心啟動子（近端）之融合物。所述構築體在核心啟動子之後包括53 bp之內源性小鼠MCK外顯子1（非轉譯）用於高效轉譯起始，隨後為SV40晚期16S/19S剪接信號（97 bp）及小5'UTR（61 bp）。內含子及5' UTR源自質體pCMVβ（Clontech）。微小肌縮蛋白卡匣具有共同Kozak剛好在ATG起點前，及用於mRNA終止的小的53 bp合成多聚腺苷酸信號。如Harper等人《自然-醫學》, 8(3):253-61, 2002先前所描述，人微小肌縮蛋白卡匣含有（R4-R23/Δ71-78）結構域。

pAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體含有側接AAV2反向末端重複序列（ITR）之人微小肌縮蛋白cDNA表現卡匣（參見圖5）。此序列經衣殼包裹於AAVrh.74病毒體中。自恆河猴淋巴結選殖AAVrh.74血清型之分子純系且描述於Rodino-Klapac等人, 《轉化醫學雜誌》, 45 (2007)中。參考文獻 1. Hoffman, E.P., Brown, R.H., Jr.及Kunkel, L.M., 肌縮蛋白：杜興氏肌肉萎縮症基因座之蛋白質產物（Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.）, 《細胞（Cell ）》51 , 919-928 (1987)。 2. Straub, V.& Campbell, K.P., 肌肉萎縮症及肌縮蛋白-醣蛋白複合物（Muscular dystrophies and the dystrophin-glycoprotein complex.）, 《神經學新見（Curr Opin Neurol ）》10 , 168-175 (1997)。 3. Sacco, A.等人, mdx/mTR小鼠杜興氏肌肉萎縮症之短端粒及幹細胞耗竭模型（Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice.）, 《細胞（Cell ）》143 , 1059-1071 (2010)。 4. Wallace, G.Q.及McNally, E.M., 肌肉萎縮症中之肌肉退化、再生及修復機制（Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.）, 《生理學年鑒（Annu Rev Physiol ）》71 , 37-57 (2009)。 5. 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圖 1 示出rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體。在此構築體中，cDNA表現卡匣側接AAV2反向末端重複序列（ITR）。構築體之特徵在於框內桿缺失（R4-R23），同時鉸鏈1、2及4（H₁ 、H₂ 及H₄ ）以及富含半胱胺酸之結構域仍產生138 kDa蛋白質。微小肌縮蛋白（3579 bp）之表現係由MHCK7啟動子（795 bp）引導。內含子及5' UTR源自質體pCMVβ（Clontech）。微小肌縮蛋白卡匣具有共同Kozak剛好在ATG起點前，及用於mRNA終止的小的53 bp合成多聚腺苷酸信號。如Harper等人（《自然-醫學（Nature Medicine ）》 8, 253-261 (2002)）先前所描述，人微小肌縮蛋白卡匣含有（R4-R23/Δ71-78）結構域。

圖 2 提供AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之核酸序列（SEQ ID NO: 3）。

圖 3 提供pNLREP2-Caprh74 AAV輔助質體圖譜。

圖 4 提供Ad輔助質體pHELP。

圖 5 示出rAAV.MCK.微小肌縮蛋白質體構築體。

圖 6 提供rAAVrh74.MCK.微小肌縮蛋白之核酸序列（SEQ ID NO: 5）。

圖 7 展示如藉由免疫細胞化學法量測的腓腸肌活體組織切片之肌纖維中的微小肌縮蛋白基因表現。

圖 8A-8C 提供展示在校正分子量下微小肌縮蛋白蛋白質表現之西方墨點。在圖8C中，當在初始分析中超過ULDQ（＞80%）時，將受試者4樣品（*）以1:4稀釋（至線性範圍），並用平均值乘以稀釋度校正因子，得到相較於正常值的最終值。相對於正常值的平均微小肌縮蛋白表現在方法1中為182.7%且在方法2中為222.0%。

圖 9A-9C 展示投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白使DAPC蛋白質、α-肌聚糖及β-肌聚糖之表現上調。

圖 10 展示藉由投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白引起的肌酸激酶（CK）之持續顯著減少。

圖 11 提供自基線至第270天的平均CK變化。此資料展示，在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後，CK隨時間明顯減少。

圖 12 提供自基線至第270天的平均NSAA變化及平均CK變化。此資料展示，在投與rAAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之後，NSAA隨時間明顯增加。

圖 13 提供AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白之核酸序列（SEQ ID NO: 9）。

圖 14 示出AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白質體構築體。

圖 15 提供AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白質體構築體之核酸序列（SEQ ID NO: 8），其包括卡那黴素抗性基因。

Claims

一種治療有需要之人類個體之肌肉萎縮症的方法，所述方法包括投與重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白的步驟，其中所述rAAV係使用全身投與途徑以約5.0×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg劑量投與。
如請求項1的方法，其中所述全身投與途徑係靜脈內途徑且所投與的所述rAAV之劑量係約2×10¹⁴ vg/kg。
如請求項1或2的方法，其中所述rAAV之劑量係以約10 mL/kg之濃度投與。
如請求項1至3中任一項的方法，其中所述rAAV係藉由注射、輸注或植入投與。
如請求項1至4中任一項的方法，其中所述rAAV係藉由經約一小時輸注來投與。
如請求項1至5中任一項的方法，其中所述rAAV係藉由靜脈內途徑，經由周邊肢體靜脈投與。
如請求項1至6中任一項的方法，其中所述rAAV包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列。
如請求項1至7中任一項的方法，其中所述rAAV包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。
如請求項1至8中任一項的方法，其中所述rAAV具有血清型AAVrh.74。
如請求項1至9中任一項的方法，其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項1至10中任一項的方法，其中所述肌肉萎縮症係杜興氏肌肉萎縮症（Duchenne muscular dystrophy）或貝克氏肌肉萎縮症（Becker's muscular dystrophy）。
如請求項1至11中任一項的方法，其中所述人類個體患有杜興氏肌肉萎縮症，且所述rAAV係藉由經約一小時靜脈內輸注約2×10¹⁴ vg/kg劑量投與，且其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項1至12中任一項的方法，其中在投與所述rAAV之後所述個體之細胞中微小肌縮蛋白的基因表現水準相較於在投與所述rAAV之前微小肌縮蛋白基因表現水準有所增加。
如請求項13的方法，其中所述細胞中所述微小肌縮蛋白基因之表現係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV前後切片檢查之肌肉中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項14的方法，其中在投與rAAV之後所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與rAAV之前微小肌縮蛋白的水準增加至少72%。
如請求項13的方法，其中所述細胞中所述微小肌縮蛋白基因之表現係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項16的方法，其中在投與rAAV之後所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準相較於在投與rAAV之前微小肌縮蛋白的水準增加至少72%。
如請求項1至12中任一項的方法，其中在投與所述rAAV之後所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述rAAV之前的血清CK水準有所降低。
如請求項18的方法，其中在投與所述rAAV之後60天所述個體中之血清CK水準相較於在投與所述rAAV之前的所述血清CK水準降低87%。
如請求項1至12中任一項的方法，其中在投與所述rAAV之後所述個體之肌肉組織中微小肌縮蛋白陽性纖維之數量相較於在投與所述rAAV之前微小肌縮蛋白陽性纖維之數量有所增加。
如請求項20的方法，其中所述微小肌縮蛋白陽性纖維之數量係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項20的方法，其中所述微小肌縮蛋白陽性纖維之數量係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項1至12中任一項的方法，其中在投與所述rAAV之後所述個體中之α-肌聚糖水準相較於在投與所述rAAV之前的α-肌聚糖水準有所增加。
如請求項23的方法，其中所述α-肌聚糖之水準係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述α-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。
如請求項23的方法，其中所述α-肌聚糖之數量係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述α-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。
如請求項1至12中任一項的方法，其中在投與所述rAAV之後所述個體中之β-肌聚糖水準相較於在投與所述rAAV之前所述β-肌聚糖水準有所增加。
如請求項26的方法，其中所述β-肌聚糖之水準係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。
如請求項26的方法，其中所述β-肌聚糖之數量係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。 [第25項] 如請求項1至12中任一項的方法，其中如藉由以下任一種所量測，所述個體之疾病進展在投與所述rAAV之後延遲：六分鐘步行測試、起身時間、登高4級台階、登高及下降4級台階、北極星移動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手持肌力測定法（HHD）、計時起立行走及/或大肌肉動作分測試量表（Bayley-III）分數。 [第26項] 如請求項25的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少270天的NSAA分數相較於在投與所述rAAV之前的NSAA分數有至少6分的改善。 [第27項] 如請求項25的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少270天的起身時間相較於在投與所述rAAV之前的起身時間有至少0.8秒的改善。 [第28項] 如請求項25的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少270天的登高4級台階之時間相較於在投與所述rAAV之前登高4級台階之時間有至少1.2秒的改善。
如請求項25的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少270天的100 m計時測試相較於在投與所述rAAV之前所述100 m計時測試有至少7秒的改善。
一種在患者細胞中表現微小肌縮蛋白基因之方法，所述方法包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項30的方法，其中所述患者細胞中所述微小肌縮蛋白基因之表現係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體前後肌肉活體組織切片中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項30的方法，其中所述患者細胞中所述微小肌縮蛋白基因之表現係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV.MHCK7微小肌縮蛋白構築體前後肌肉活體組織切片中所述微小肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項30的方法，其中所述患者中所述微小肌縮蛋白基因之表現係藉由偵測每個核中超過1個rAAV載體基因組複本來量測。
一種降低有需要患者中之血清CK水準的方法，所述方法包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項34的方法，其中在投與所述rAAV之後60天所述患者中之所述血清CK水準相較於在投與所述rAAV之前的所述血清CK水準降低至少87%。
一種增加患者肌肉組織中之微小肌縮蛋白陽性纖維的方法，所述方法包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項36的方法，其中所述微小肌縮蛋白陽性纖維之數量係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項36的方法，其中所述微小肌縮蛋白陽性纖維之數量係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述肌縮蛋白之蛋白質水準來偵測。
如請求項36的方法，其中所述微小肌縮蛋白陽性纖維之數量係藉由偵測每個核中超過1個rAAV載體基因組複本來量測。
一種增加有需要患者中之α-肌聚糖表現的方法，所述方法包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項40的方法，其中所述α-肌聚糖之水準係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片上所述α-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。
如請求項40的方法，其中所述α-肌聚糖之數量係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述α-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。
一種增加有需要患者中之β-肌聚糖表現的方法，所述方法包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項43的方法，其中所述β-肌聚糖之水準係藉由用西方墨點法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片中所述β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。
如請求項43的方法，其中所述β-肌聚糖之數量係藉由用免疫組織化學法量測在投與所述rAAV前後肌肉活體組織切片上所述β-肌聚糖之蛋白質水準來偵測。
一種治療患有杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症之患者的方法，所述方法包括向所述患者投與具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列，使得如藉由以下任一種所量測，所述患者之疾病進展延遲：六分鐘步行測試、起身時間、登高4級台階、登高及下降4級台階、北極星移動評估（NSAA）、10公尺計時測試、100公尺計時測試、手持肌力測定法（HHD）、計時起立行走及/或大肌肉動作分測試量表（Bayley-III）分數。
如請求項46的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少90天的NSAA分數相較於在投與所述rAAV之前的NSAA分數有至少6分的改善。
如請求項46的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少90天的起身時間相較於在投與所述rAAV之前的起身時間有至少0.8秒的改善。
如請求項46的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少90天的登高4級台階之時間相較於在投與所述rAAV之前登高4級台階之時間有至少1.2秒的改善。
如請求項46的方法，其中所述個體在投與所述rAAV之後至少90天的100 m計時測試相較於在投與所述rAAV之前的100 m計時測試有至少7秒的改善。
一種用於治療有需要人類個體之肌肉萎縮症的組合物，其中所述組合物包括重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白，其中所述組合物係調配用於全身投與途徑且所述rAAV之劑量係約5×10¹² vg/kg至約1.0×10¹⁵ vg/kg。
如請求項51的組合物，其中所述全身投與途徑係靜脈內途徑且所述rAAV之劑量係約2×10¹⁴ vg/kg。
如請求項51或52的組合物，其中所述rAAV之劑量係約10 mL/kg。
如請求項51至53中任一項的組合物，其中所述組合物係調配用於藉由注射、輸注或植入投與。
如請求項51至53中任一項的組合物，其中所述組合物係調配用於藉由經約一小時輸注投與。
如請求項51至53中任一項的組合物，其中所述組合物之劑量係調配用於經由周邊肢體靜脈經靜脈內投與。
如請求項51至56中任一項的組合物，其中所述rAAV包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列。
如請求項51至57中任一項的組合物，其中所述rAAV包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。
如請求項51至58中任一項的組合物，其中所述rAAV具有血清型AAVrh.74。
如請求項51至59中任一項的組合物，其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項51至60中任一項的組合物，其中所述肌肉萎縮症係杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症。
一種用於治療有需要人類個體之杜興氏肌肉萎縮症的組合物，其中所述組合物包括投與重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白，其中所述組合物係調配用於藉由經約一小時靜脈內輸注以約2×10¹⁴ vg/kg劑量投與，且其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
一種重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白的用途，其用於製備供治療有需要人類個體之肌肉萎縮症用的藥劑，其中所述藥劑係調配用於全身投與途徑且包括約1×10¹⁴ vg/kg至約4×10¹⁴ vg/kg劑量之rAAV。
如請求項55的用途，其中所述藥劑係調配用於靜脈內投與且所述rAAV之劑量係約2×10¹⁴ vg/kg。
如請求項63或64的用途，其中所述rAAV之劑量係約10 mL/kg。
如請求項63至65中任一項的用途，其中所述藥劑係調配用於藉由注射、輸注或植入投與。
如請求項63至65中任一項的用途，其中所述藥劑係調配用於藉由經約一小時輸注來投與。
如請求項63至65中任一項的用途，其中所述藥劑係調配用於經由周邊肢體靜脈經靜脈內投與。
如請求項63至68中任一項的用途，其中所述rAAV包括SEQ ID NO:1之人微小肌縮蛋白核苷酸序列。
如請求項63至69中任一項的用途，其中所述rAAV包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 7之MHCK7啟動子序列。
如請求項63至70中任一項的用途，其中所述rAAV具有血清型AAVrh.74。
如請求項63至70中任一項的用途，其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項63至71中任一項的用途，其中所述肌肉萎縮症係杜興氏肌肉萎縮症或貝克氏肌肉萎縮症。
一種重組腺病毒相關（rAAV）rAAV.MHCK7.微小肌縮蛋白之用途，其用於製備供治療有需要人類個體之杜興氏肌肉萎縮症用的藥劑，其中所述藥劑係調配用於藉由經約一小時靜脈內輸注來投與且包括約2×10¹⁴ vg/kg劑量之所述rAAV，且其中所述rAAV包括具有SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO:3之核苷酸55-5021的AAVrh74.MHCK7.微小肌縮蛋白構築體核苷酸序列。
如請求項1至50中任一項的方法，其中在投與所述rAAV之後所述個體中之所述血清CK水準相較於在投與所述rAAV之前的所述血清CK水準降低選自由以下組成之群組的百分比水準： a)在所述投與之後90、180或270天降低至少78%； b)在所述投與之後270天降低至少46、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或85%； c)在所述投與之後180天降低至少72、73、74或95%； d)在所述投與之後90天降低至少87、88、93或95%； e)在所述投與之後270天降低至少70%； f)在所述投與之後90、180或270天降低70至95%； g)在投與之後90、180或270天降低至少55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%；以及 h)在投與之後90、180或270天降低至少55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%。
如請求項51至62中任一項的組合物，其中在將所述組合物投與需要肌肉萎縮症治療之人類個體之後，所述個體中之所述血清CK水準相較於在投與所述組合物之前的所述血清CK水準降低選自由以下組成之群組的百分比水準： a)在所述投與之後90、180或270天降低至少78%； b)在所述投與之後270天降低至少46、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或85%； c)在所述投與之後180天降低至少72、73、74或95%； d)在所述投與之後90天降低至少87、88、93或95%； e)在所述投與之後270天降低至少70%； f)在所述投與之後90、180或270天降低70至95%； g)在投與之後90、180或270天降低至少55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%；以及 h)在投與之後90、180或270天降低至少55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%。
如請求項63至74中任一項的用途，其中在向所述個體投與所述rAAV之後所述個體中之所述血清CK水準相較於在投與所述rAAV之前的所述血清CK水準降低選自由以下組成之群組的百分比水準： a)在所述投與之後90、180或270天降低至少78%； b)在所述投與之後270天降低至少46、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或85%； c)在所述投與之後180天降低至少72、73、74或95%； d)在所述投與之後90天降低至少87、88、93或95%； e)在所述投與之後270天降低至少70%； f)在所述投與之後90、180或270天降低70至95%； g)在投與之後90、180或270天降低至少55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%；以及 h)在投與之後90、180或270天降低至少55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95%。
一種組合物，其包括 a) SEQ ID NO: 3之核苷酸序列， b) SEQ ID NO: 8之核苷酸序列， c) SEQ ID NO: 9之核苷酸序列， d)包括SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021的rAAV， e)包括SEQ ID NO: 9之核酸序列的rAAV， f)包括SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977的rAAV， g)包括SEQ ID NO: 3之核苷酸55-5021的rAAV粒子， h)包括SEQ ID NO: 9之核酸序列的rAAV粒子，或 i)包括SEQ ID NO: 8之核苷酸1-4977的rAAV粒子。