JP2022185591A - 肢帯型筋ジストロフィー２ａを治療する組換えアデノ随伴ウイルス産物および方法 - Google Patents

肢帯型筋ジストロフィー２ａを治療する組換えアデノ随伴ウイルス産物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための組成物を提供する。【解決手段】筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物を提供する。好ましくは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させる前記タンパク質が、マイクロジストロフィン、ジストロフィン、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）、ＳＧＣＧＡ（α－サルコグリカン）、ＳＧＣＢ（β－サルコグリカン）、γ－サルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニンアンコタミン５（ＡＮＯ５）、ＧＡＬＧＴ２、ミオチリン、ラミンＡ／Ｃ、カベオリン、デスミン、テレトニン、ＦＫＲＰ、タイチン、ＰＯＭＴ１、ＧＡＬＧＴ２およびフクチンである、組成物とする。【選択図】なし

Description

この出願は、２０２１年６月２日に出願された米国仮特許出願第６３／１９６，１０８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で提供されるのは、肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための産物および方法である。この方法では、組換えアデノ随伴ウイルスは、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを送達する。
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：２０２２年５月３１日に作成された５６５２４＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、４３，８２８バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性を特徴とする。ＭＤのいくつかの形態は乳児期または小児期に発症するが、他の形態は中年以降まで現れない場合がある。障害は、筋力低下の分布および程度（ＭＤのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす）、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝形式の点で異なる。
ＭＤのうちの１つのグループは、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）である。ＬＧＭＤは、まれな状態であり、発症年齢、筋力低下の領域、心臓および呼吸器の関与、進行速度、ならびに重症度に関して、人によって症状が異なる。ＬＧＭＤは、小児期、青年期、若年成人期、またはそれ以降に始まる可能性がある。両方の性別が等しく影響を受ける。ＬＧＭＤは、肩および骨盤帯に衰弱を引き起こし、上肢および腕の近くの筋肉も時間とともに衰弱することがある。脚の脱力感は、腕の脱力感よりも前に現れることがよくある。顔の筋肉は、通常影響を受けない。状態が進行するにつれて、人々は、歩行に問題を抱えることがあり、時間の経過とともに車椅子を使用する必要があるかもしれない。肩および腕の筋肉が関与すると、腕を頭上に上げたり、物を持ち上げたりするのが困難になることがある。ＬＧＭＤの種類によっては、心臓および呼吸筋が関与し得る。
ＬＧＭＤには少なくとも１９個の形態があり、それらの形態は、関連する遺伝的欠陥によって分類される。
Figure 2022185591000001
ＬＧＭＤのための専門の検査は、診断のための全国的な計画であるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＮＣＧ）を通じて現在利用可能である。
ｃａｌｐａｉｎ３遺伝子（ＣＡＰＮ３）の変異は、世界中で最も一般的な肢帯型筋ジストロフィーの１つであるＬＧＭＤ２Ａを引き起こす。現在、この遺伝性疾患の治療法はない。以前の研究では、ＣＡＰＮ３遺伝子導入がＣＡＰＮ３欠損マウスの病理学的兆候を修正する可能性があることが示されている。しかしながら、デスミンプロモーターによって駆動されるＣＡＰＮ３の発現は心毒性をもたらした（Ｂａｒｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：２５０－２５９（２００６））。フォローアップ研究では、遺伝子の骨格筋発現が研究された（Ｒｏｕｄａｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２８：１０９４－１１０４（２０１３））。
したがって、ＬＧＭＤ２Ａの処置に対する当該技術分野における必要性が残っている。
Ｒｏｕｄａｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２８：１０９４－１１０４（２０１３）
カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを送達するための方法および製品が、本明細書に提供される。そのような方法および製品は、様々な疾患、例えば、ＬＧＭＤ２Ａを治療するために使用され得る。
さらに、対象において筋ジストロフィーを治療する方法が提供され、この方法は、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含み、治療は、対照のＰＧＣ１αレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの増加をもたらす。この方法は、ＰＧＣ１α核酸またはＰＧＣ１αタンパク質のレベルを測定するステップをさらに含む。他の実施形態において、ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。
提供されるのは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）対象に投与することを含む、対象におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させる方法であり、ｒＡＡＶは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、対照のＰＧＣ１αレベルと比較してのレベルの増加をもたらす。この方法により、被験者の速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替わりがもたらされる。この方法は、対象においてＰＧＣ１αのレベルを測定するステップをさらに含み得る。ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。
提供されるのはまた、力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを対象に投与することと、ｒＡＡＶの投与後に対象から得られたサンプル中のペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ｐＧＣ１α）のレベルを測定することとを含む、対象の筋ジストロフィーを治療する方法であり、ＰＧＣ１αレベルの変化が、対照のｐＧＣ１αレベルと比較して、いくつかの実施形態におけるｒＡＡＶの治療効果および／または対象の筋機能を示し、ＰＧＣ１αレベルの変化が、対照のｐＧＣ１αレベルと比較して、ＰＧＣ１αの増加であり、これは、ｒＡＡＶを投与することの治療効果を示している。例えば、ＰＧＣ１αレベルの増加は、筋機能の改善を示している。
さらに、方法は、任意選択で、ｒＡＡＶの投与前および／または後に対象からサンプルを得るステップを含む。対照のｐＧＣ１αレベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベル、または既知の標準のＰＧＣ１のレベルである。ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。
提供される方法のいずれにおいても、対照のｐＧＣ１αレベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベルを指し、例えば、対照のレベルは、「基礎レベル」と呼ばれることもある。さらに、対照のｐＧＣ１αレベルは、健康なまたは正常な年齢が一致する対象の既知の標準のＰＧＣ１αのレベルである。
さらに、本開示は、対象において筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、ｒＡＡＶは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、ｒＡＡＶの投与は、対照のｐＧＣ１αレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの増加をもたらす。ＰＧＣ１α核酸またはＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与後に測定され得る。例えば、ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。
対象におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるためのｒＡＡＶも提供され、ｒＡＡＶは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、対照と比較して、ＰＧＣ１αのレベルの増加をもたらす。ｒＡＡＶの投与は、対象において、速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替えをもたらす。
本開示はまた、対象において筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、ｒＡＡＶは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、ｒＡＡＶの投与は、対照のｐＧＣ１αレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの増加をもたらし、ＰＧＣ１αレベルの変化は、対象のｒＡＡＶおよび／または筋機能の治療効果を示す。開示されたｒＡＡＶのいずれかの投与は、ＰＧＣ１αレベルの増加をもたらし得、これは、改善された筋機能を示す。さらに、開示されたｒＡＡＶのいずれかの投与は、対象にｒＡＡＶを投与する前および／または投与した後に得られるサンプルにおいて決定されるＰＧＣ１αの変化をもたらし得る。提供される方法のいずれにおいても、対照のｐＧＣ１αレベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベルを指し、例えば、対照のレベルは、「基礎レベル」と呼ばれることもある。さらに、ＰＧＣ１αの対照レベルは、健康なまたは正常な年齢が一致する対象の既知の標準のＰＧＣ１αのレベルである。
筋ジストロフィーを治療するために提供されるｒＡＡＶのいずれにおいても、ＰＧＣ１αの対照レベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベルを指し、例えば、対照レベルは、「基礎レベル」と呼ばれることもある。さらに、ＰＧＣ１αの対照レベルは、健康なまたは正常な年齢が一致する対象の既知の標準のＰＧＣ１αのレベルである。
さらに、本開示は、対象において筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供し、ｒＡＡＶは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、ｒＡＡＶの投与は、ＰＧＣ１αの対照レベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの増加をもたらす。ＰＧＣ１α核酸またはＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、ｒＡＡＶの投与後に測定され得る。例えば、ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。
対象におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用も提供され、ｒＡＡＶは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、対照と比較して、ＰＧＣ１αのレベルの増加をもたらす。ｒＡＡＶの投与は、対象において、速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替えをもたらす。
さらに、本開示は、対象において筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供し、ｒＡＡＶは、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、ｒＡＡＶの投与は、ＰＧＣ１αの対照レベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの変化をもたらし、ＰＧＣ１αレベルの変化は、記対象のｒＡＡＶおよび／または筋機能の治療効果を示す。開示された使用のいずれにおいても、ＰＧＣ１αレベルの増加は、改善された筋機能を示す。さらに、開示された使用のいずれにおいても、ＰＧＣ１αの変化は、対象にｒＡＡＶを投与する前および／または後に得られたサンプルにおいて決定される。
筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のために提供される使用のいずれにおいても、ＰＧＣ１αの対照レベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベルを指し、例えば、対照レベルは、「基礎レベル」とも呼ばれることがある。さらに、ＰＧＣ１αの対照レベルは、健康なまたは正常な年齢が一致する対象の既知の標準のＰＧＣ１αのレベルである。
提供されるいずれの方法、ｒＡＡＶおよび使用のいずれにおいても、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質は、マイクロジストロフィン、ジストロフィン、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）、ＳＧＣＧＡ（α－サルコグリカン）、ＳＧＣＢ（β－サルコグリカン）、γ－サルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニンアンコタミン５（ＡＮＯ５）、ｇａｌｇｔ２、ミオチリン、ラミンＡ／Ｃ、カベオリン、デスミン、テレトニン、ＦＫＲＰ、タイチン、ＰＯＭＴ１またはフクチンである。
提供されている方法、ｒＡＡＶ、および使用のいずれにおいても、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）；ベッカー筋ジストロフィー；先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ；肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ ２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏおよび２Ｑ；ウルリッヒ先天性筋ジストロフィー；福山型先天性筋ジストロフィー；筋強直性ジストロフィー；エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー；遠位型筋ジストロフィー；中心核；および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーである。
さらに、いずれの方法においても、ｒＡＡＶは、筋肉内注射または静脈内注射によって投与されるか、またはｒＡＡＶのいずれかは、筋肉内注射または静脈内注射による投与のために処方される。さらに、ｒＡＡＶおよび医薬品のいずれも、筋肉内注射または静脈内注射による投与用に処方される。
本開示はまた、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含む、肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させる方法を提供し、ｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、ＰＧＣ１αの対照レベルと比較して、ＰＧＣ１αの増加をもたらす。ＰＧＣ１αの対照レベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベル、または既知の標準のＰＧＣ１のレベルである。任意選択で、方法は、ｒＡＡＶの投与前および／または後に、対象におけるＰＧＣ１αのレベルを測定するステップをさらに含む。ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。例えば、方法は、治療有効量のｒＡＡＶを投与することを含む。さらに、方法は、対象において、速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替えをもたらす。
本開示はまた、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含む、対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法を提供し、ｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶの投与前の性能または表現型と比較して、対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、性能の改善は、ｉ）筋収攣縮の増加、またはｉｉ）ランニングから疲労までの性能の改善のうちの１つ以上であり、表現型の改善は、ｉ）筋線維直径の増加、ｉｉ）酸化的筋線維の数の増加、ｉｉｉ）速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、またはｉｖ）酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である。
本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含む、対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法を提供し、ｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶの投与の投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加は、対象の性能または表現型の増加を示す。ｒＡＡＶの投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現の増加は、対象における性能または表現型の改善を示す閾値である。閾値は、少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％、または少なくとも約１３％、または少なくとも約１４％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約１６％、または少なくとも約１７％、または少なくとも約１８％、または少なくとも約１９％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％であり得る。
例えば、方法のいずれにおいても、性能の改善は、対照と比較して、筋肉攣縮の増加であり、例えば、最大攣縮反応における少なくとも約２０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２１％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２２％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２３％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２４％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２５％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２６％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２７％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２８％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２９％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約３０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約４０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約５０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約６０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約７０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約８０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約９０％の増加である。
例えば、方法のいずれにおいても、性能の改善は、対照と比較して、筋肉攣縮の増加であり、例えば、最大攣縮反応における少なくとも約１０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１１％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１２％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１３％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１４％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１５％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１６％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１７％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１８％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１９％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約３０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約４０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約５０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約６０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約７０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約８０％の増加、または最大単収縮反応における少なくとも約９０％の増加である。
例えば、方法のいずれにおいても、性能の改善は、ランニングから疲労までの試験における改善であり、例えば、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７１％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７２％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７３％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７４％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７５％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７６％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７７％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７８％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７９％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約８０％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約８５％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約９０％の改善、またはトレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約９５％の改善である。
例えば、方法のいずれにおいても、性能の改善は、ランニングから疲労までの距離の改善であり、例えば、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１００％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１１０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１２０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１３０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１４０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１５０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１６０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１７０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１８０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１９０％の改善、またはランニングから疲労までの距離の少なくとも約２００％の改善である。
方法のいずれにおいても、筋線維は、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む。
さらに、本発明の方法のいずれかにおいて、ｒＡＡＶは、筋肉内注射または静脈内注射によって投与される。
本開示はまた、肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含むｒＡＡＶまたは組成物を提供し、ｒＡＡＶは、ポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。例えば、ｒＡＡＶの投与は、ＰＧＣ１αの対照レベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）レベルの増加をもたらす。ＰＧＣ１αの対照レベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベル、または既知の標準のＰＧＣ１のレベルである。ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。
別の実施形態において、本開示は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、または対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するためのｒＡＡＶを含む組成物を提供し、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含む、対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法を提供し、ｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶの投与前の性能または表現型と比較して、対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、性能の改善は、ｉ）筋攣縮の増加、またはｉｉ）ランニングから疲労までの性能の改善のうちの１つ以上であり、表現型の改善は、ｉ）筋線維直径の増加、ｉｉ）酸化的筋線維の数の増加、ｉｉｉ）速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、またはｉｖ）酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である。
本開示は、対象において肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）またはｒＡＡＶを含む組成物を提供し、ｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶの投与の投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加は、対象の性能または表現型の増加を示す。ｒＡＡＶの投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現の増加は、対象における性能または表現型の改善を示す閾値である。閾値は、少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％、または少なくとも約１３％、または少なくとも約１４％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約１６％、または少なくとも約１７％、または少なくとも約１８％、または少なくとも約１９％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％であり得る。
例えば、ｒＡＡＶまたは組成物のいずれにおいても、性能の改善は、対照と比較して、筋肉攣縮の増加であり、例えば、最大攣縮反応における少なくとも約２０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２１％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２２％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２３％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２４％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２５％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２６％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２７％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２８％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２９％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約３０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約４０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約５０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約６０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約７０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約８０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約９０％の増加である。
例えば、ｒＡＡＶまたは組成物のいずれにおいても、性能の改善は、対照と比較して、筋肉攣縮の増加であり、例えば、最大攣縮反応における少なくとも約１０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１１％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１２％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１３％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１４％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１５％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１６％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１７％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１８％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１９％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約３０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約４０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約５０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約６０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約７０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約８０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約９０％の増加である。
例えば、ｒＡＡＶまたは組成物のいずれにおいても、性能の改善は、ランニングから疲労までの試験における改善であり、例えば、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７１％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７２％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７３％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７４％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７５％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７６％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７７％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７８％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７９％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約８０％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約８５％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約９０％の改善、またはトレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約９５％の改善である。
例えば、ｒＡＡＶまたは組成物のいずれにおいても、性能の改善は、ランニングから疲労までの試験まで距離の改善であり、例えば、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１００％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１１０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１２０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１３０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１４０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１５０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１６０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１７０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１８０％の改善、ランニングから疲労までので距離の少なくとも約１９０％の改善、またはランニングから疲労までの距離の少なくとも約２００％の改善である。
ｒＡＡＶまたは組成物のいずれにおいても、筋線維は、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む。
さらに、ｒＡＡＶまたは組成物のいずれも、筋肉内注射または静脈内注射による投与のために処方される。
本開示はまた、肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるための薬剤の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用を提供し、ｒＡＡＶは、ポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。例えば、ｒＡＡＶの投与は、対照のＰＧＣ１αレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）レベルの増加をもたらす。対照のＰＧＣ１αレベルは、ｒＡＡＶの投与前の対象におけるＰＧＣ１αのレベル、または既知の標準のＰＧＣ１αのレベルである。ＰＧＣ１αのレベルは、ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはサザンブロット、またはＰＧＣ１α核酸を検出するための他の任意の方法によってＰＧＣ１α核酸の発現を測定することによって検出され得る。他の実施形態において、ＰＧＣ１αタンパク質のレベルは、免疫組織化学、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、またはＰＧＣ１αタンパク質を検出する任意の方法によって測定され得る。
別の実施形態において、本開示は、対象において肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための薬剤の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用を提供し、ｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶの投与前の性能または表現型と比較して、対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、性能の改善は、ｉ）筋攣縮の増加、またはｉｉ）ランニングから疲労までの性能における改善のうちの１つ以上であり、表現型の改善は、ｉ）筋線維直径の増加、ｉｉ）酸化的筋線維の数の増加、ｉｉｉ）速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、またはｉｖ）酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である。
本開示は、対象において肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するためのｒＡＡＶを含む薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用を提供し、ｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、ｒＡＡＶの投与は、ｒＡＡＶの投与の投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加は、対象の性能または表現型の増加を示す。ｒＡＡＶの投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現の増加は、対象における性能または表現型の改善を示す閾値である。閾値は、少なくとも約１０％、または少なくとも約１１％、または少なくとも約１２％、または少なくとも約１３％、または少なくとも約１４％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約１６％、または少なくとも約１７％、または少なくとも約１８％、または少なくとも約１９％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約３５％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％であり得る。
例えば、薬剤の調製のためのｒＡＡＶのいずれの開示された使用においても、性能の改善は、対照と比較して筋肉攣縮の増加であり、例えば、最大攣縮反応における少なくとも約２０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２１％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２２％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２３％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２４％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２５％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２６％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２７％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２８％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２９％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約３０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約４０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約５０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約６０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約７０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約８０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約９０％の増加である。
例えば、薬剤の調製のためのｒＡＡＶのいずれの開示された使用においても、性能の改善は、対照と比較して筋肉攣縮の増加であり、例えば、最大攣縮反応における少なくとも約１０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１１％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１２％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１３％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１４％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１５％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１６％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１７％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１８％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約１９％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約２０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約３０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約４０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約５０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約６０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約７０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約８０％の増加、または最大攣縮反応における少なくとも約９０％の増加である。
例えば、薬剤の調製のためのｒＡＡＶのいずれの開示された使用においても、性能の改善は、ランニングから疲労までの試験における改善であり、例えば、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７１％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７２％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７３％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７４％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７５％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７６％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７７％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７８％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７９％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約８０％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約８５％の改善、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約９０％の改善、またはトレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約９５％の改善である。
例えば、例えば、薬剤の調製のためのｒＡＡＶのいずれかの開示された使用において、性能の改善は、ランニングから疲労までの距離の改善であり、例えば、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１００％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１１０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１２０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１３０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１４０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１５０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１６０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１７０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１８０％の改善、ランニングから疲労までの距離の少なくとも約１９０％の改善、またはランニングから疲労までの距離の少なくとも約２００％の改善である。
開示された用途のいずれかにおいて、筋線維は、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む。
さらに、ｒＡＡＶを含むｒＡＡＶまたは薬剤の開示された使用のいずれも、筋肉内注射または静脈内注射による投与のために処方される。
本明細書に開示される方法、組成物または薬剤のいずれも、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を投与し得るかつ／または含み得る。さらに、開示されたｒＡＡＶ、ｒＡＡＶまたは薬剤を含む組成物のいずれも、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む。例えば、組換えアデノ随伴ウイルスは、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。例えば、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか、または配列番号２の配列を含む。
例えば、提供されるｒＡＡＶは、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。例えば、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも９０％同一であるか、または配列番号２と少なくとも９１％同一、配列番号２と少なくとも９２％同一、配列番号２と少なくとも９３％同一、配列番号２と少なくとも９４％同一、配列番号２と少なくとも９５％同一、配列番号２と少なくとも９６％同一、配列番号２と少なくとも９７％同一、配列番号２と少なくとも９８％同一、または配列番号２と少なくとも９９％同一である。ｒＡＡＶは、配列番号２の配列を含む、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
さらに、提供されるｒＡＡＶは、配列番号５と少なくとも９０％同一、配列番号５と少なくとも９１％同一、配列番号５と少なくとも９２％同一、配列番号５と少なくとも９３％同一、配列番号５と少なくとも９４％同一、配列番号５と少なくとも９５％同一、配列番号５と少なくとも９６％同一、配列番号５と少なくとも９７％同一、配列番号５と少なくとも９８％同一、または配列番号５と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶは、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
提供されるｒＡＡＶは、配列番号１と少なくとも９０％同一、配列番号１と少なくとも９１％同一、配列番号１と少なくとも９２％同一、配列番号１と少なくとも９３％同一、配列番号１と少なくとも９４％同一、配列番号１と少なくとも９５％同一、配列番号１と少なくとも９６％同一、配列番号１と少なくとも９７％同一、配列番号１と少なくとも９８％同一、または配列番号１と少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。前記ｒＡＡＶは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。
提供されるｒＡＡＶは、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９０％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９１％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９２％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９３％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９４％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９５％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９６％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９７％同一、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９８％同一、または配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶは、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７のポリヌクレオチド配列を含む。
提供されるｒＡＡＶは、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９０％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９１％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９２％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９３％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９４％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９５％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９６％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９７％同一、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９８％同一、または配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７と少なくとも９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。ｒＡＡＶは、配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７のポリヌクレオチド配列を含む。
ヌクレオチド配列は、一実施形態では、筋肉特異的プロモーターの転写制御下にある。例えば、筋特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファア－クチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、およびグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）のうちの１つ以上を含む。一実施形態では、筋特異的プロモーターは、配列番号３の配列を含むｔＭＣＫプロモーターである。別の実施形態において、筋特異的プロモーターは、配列番号４の配列を含むＭＨＣＫ７プロモーターである。
例えば、ｒＡＡＶは、一実施形態では、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ｔＭＣＫプロモーター、カルパイン３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を含むポリヌクレオチドを含む。ＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、第１および／または第２のＡＡＶ ＩＴＲ）は、例えば、ＡＡＶ２逆位末端反復である。ｒＡＡＶのキャプシドタンパク質は、例えば、ＡＡＶ ｒｈ．７４キャプシドタンパク質またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。
提供されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４およびＡＡＶ ｒｈ．１０キャプシドタンパク質の１つ以上を含む。
別の実施形態において、開示されたｒＡＡＶのいずれかを含む組成物が提供される。例えば、組成物は、筋肉内注射または静脈内注射用に処方される。
開示されたｒＡＡＶまたは提供される組成物のいずれかの治療有効量の方法、組成物または使用のいずれかにおいて、ｒＡＡＶ、薬剤または組成物での治療後に、対象の心筋は、開示されたｒＡＡＶ、薬剤または組成物から発現された最小または低いカルパイン３タンパク質を示さない。
本開示の方法、ｒＡＡＶ、組成物または使用のいずれにおいても、対象は、より高齢の成人対象である。いくつかの実施形態において、対象は、成人（１８歳以上）である。特に、対象は、若年成人（１８～３９歳）、中年成人（４０～６４歳）、または高年成人もしくは高齢成人対象（６５歳以上）、または老齢対象（７０歳以上）である。
本開示はまた、配列番号１３または配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、配列番号１３または配列番号２０のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７または配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７を含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、本開示は、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７または配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７を含むポリヌクレオチド配列を提供する。
本開示はまた、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７または配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７を含むヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を提供する。例えば、ｒＡＡＶは、配列番号１３のヌクレオチド１～３９７７または配列番号２０のヌクレオチド１～３９７７を含むポリヌクレオチド配列を含む。開示されたｒＡＡＶのいずれかは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ．７４、およびＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む。例えば、ｒＡＡＶは、ｒｈ．７４キャプシドタンパク質またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。
本開示は、組換えＡＡＶ ｒＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を生成する方法であって、プラスミドを細胞に移入することを含み、プラスミドが、配列番号１３または配列番号２０と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列、例えば、配列番号１３または配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、方法を提供する。方法のいずれも、パッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを細胞に移動させるステップをさらに含み得る。方法のいずれにおいても、細胞は、安定して組み込まれたＡＡＶ ｃａｐ遺伝子および／または安定して組み込まれたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。
本開示は、プラスミドが、配列番号１３と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列、例えば、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む細胞を提供する。例えば、細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、蚊細胞、または哺乳動物細胞である。例示的な細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞である。
本開示は、プラスミドが、配列番号２０と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列、例えば、配列番号２０のヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む細胞を提供する。例えば、細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、蚊細胞、または哺乳動物細胞である。例示的な細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
対象におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させる方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較して、ＰＧＣ１αのレベルの増加をもたらす、方法。
(項目２)
前記対象における前記ＰＧＣ１αのレベルを測定するステップをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目３)
前記方法が、前記対象において、速収縮性解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替えをもたらす、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目４)
対象における筋ジストロフィーを治療する方法であって、
筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶを前記対象に投与することと、
ｒＡＡＶの投与後に前記対象から得られた試料におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現レベルを測定することであって、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較したＰＧＣ１αレベルの変化が、前記対照の前記ｒＡＡＶおよび／または筋機能の治療効果を示す、方法。
(項目５)
ＰＧＣ１αレベルの増加が、筋機能の改善を示す、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記対象に前記ｒＡＡＶを投与する前および／または後に前記試料を得ることをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
対象における筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記ｒＡＡＶの投与が、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの変化をもたらし、前記ＰＧＣ１αレベルの変化が、前記対象の前記ｒＡＡＶおよび／または筋機能の治療効果を示す、ｒＡＡＶ。
(項目８)
対象における筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用であって、前記ｒＡＡＶが、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記ｒＡＡＶの投与が、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの変化をもたらし、前記ＰＧＣ１αレベルの変化が、前記対象の前記ｒＡＡＶおよび／または筋機能の治療効果を示す、使用。
(項目９)
ＰＧＣ１αレベルの増加が、筋機能の改善を示す、前記項目のいずれか一項に記載の組成物または使用。
(項目１０)
前記ＰＧＣ１αにおける変化が、前記対象に前記ｒＡＡＶを投与する前および／または後に得られた試料において決定される、前記項目のいずれか一項に記載の組成物または使用。
(項目１１)
前記対照のＰＧＣ１αのレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前または投与なしの前記対象における前記ＰＧＣ１αのレベル、または既知の標準のＰＧＣ１αのレベルである、前記項目のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目１２)
筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させる前記タンパク質が、マイクロジストロフィン、ジストロフィン、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）、ＳＧＣＧＡ（α－サルコグリカン）、ＳＧＣＢ（β－サルコグリカン）、γ－サルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニンアンコタミン５（ＡＮＯ５）、ＧＡＬＧＴ２、ミオチリン、ラミンＡ／Ｃ、カベオリン、デスミン、テレトニン、ＦＫＲＰ、タイチン、ＰＯＭＴ１、ＧＡＬＧＴ２およびフクチンである、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目１３)
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）；ベッカー筋ジストロフィー；先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ；肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ ２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏおよび２Ｑ；ウルリッヒ先天性筋ジストロフィー；福山型先天性筋ジストロフィー；筋強直性ジストロフィー；エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー；遠位型筋ジストロフィー；中心核；および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーである、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目１４)
肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させる方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、ＰＧＣ１αの対照レベルと比較して、ＰＧＣ１αのレベルの増加をもたらす、方法。
(項目１５)
前記対象における前記ＰＧＣ１αのレベルを測定するステップをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記方法が、前記対象において、速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替えをもたらす、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目１７)
対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの前記投与が、前記ｒＡＡＶの投与前の性能または表現型と比較して、前記対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、
前記性能の改善が、
筋肉収縮性の増加、または
ランニングから疲労までの試験における性能の改善のうちの１つ以上であり、
前記表現型の改善が、
筋線維直径の増加、
酸化性筋線維の数の増加、
速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、または
酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である、方法。
(項目１８)
対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、前記ｒＡＡＶの投与前のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加が、前記対象の性能または表現型の増加を示す、方法。
(項目１９)
前記性能が、
筋肉収縮性の増加、または
ランニングから疲労までの試験における性能の改善である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記表現型が、
酸化的筋線維の数の増加、
速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、
酸化的筋線維の割合の増加、または
筋線維直径の増加のうちの１つ以上である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記性能の改善が、最大攣縮反応の少なくとも約２０％の増加であるか、または最大強縮反応の少なくとも約１０％の増加である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
前記性能の改善が、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、またはランニングから疲労までの試験に対する距離の少なくとも約１００％の増加である、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記筋線維が、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２４)
前記ｒＡＡＶが、筋肉内注射または静脈内注射によって投与される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む、ｒＡＡＶ。
(項目２６)
対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、前記ｒＡＡＶの投与前の性能または表現型と比較して、前記対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、
前記性能の改善が、
筋肉収縮性の増加、または
ランニングから疲労までの試験における性能の改善のうちの１つ以上であり、
前記表現型の改善が、
筋線維直径の増加、
酸化的筋線維の数の増加、
速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、または
酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である、ｒＡＡＶ。
(項目２７)
対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、前記ｒＡＡＶの投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加が、前記対象の性能または表現型の増加を示す、ｒＡＡＶ。
(項目２８)
前記性能が、
筋肉収縮性の増加、または
ランニングから疲労までの試験における性能の改善である、前記項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
(項目２９)
前記表現型が、
酸化的筋線維の数の増加、
酸化的筋線維の割合の増加、または
筋線維直径の増加のうちの１つ以上である、前記項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３０)
前記性能の改善が、最大攣縮反応の少なくとも約２０％の増加であるか、または最大強縮反応の少なくとも約１０％の増加である、前記項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３１)
前記性能の改善が、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、またはランニングから疲労までの試験に対する距離の少なくとも約１００％の増加である、前記項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３２)
前記筋線維が、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む、前記項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３３)
前記ｒＡＡＶが、筋肉内注射または静脈内注射による投与のために処方される、前記項目のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
(項目３４)
肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）レベルの増加をもたらす、使用。
(項目３５)
肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてＰＧＣ１αレベルを増加させるための薬剤の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、前記ｒＡＡＶの投与前の性能または表現型と比較して、前記対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、
前記性能の改善が、
筋収縮性の増加、または
ランニングから疲労までの試験における性能の改善のうちの１つ以上であり、
前記表現型の改善が、
筋線維直径の増加、
酸化的筋線維の数の増加、
速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、または
酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である、使用。
(項目３６)
肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための薬剤の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、前記ｒＡＡＶの投与の投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加が、前記対象における性能または表現型の増加を示す、使用。
(項目３７)
前記性能が
筋肉収縮性の増加、または
ランニングから疲労までの試験における性能の改善である、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目３８)
前記表現型が、
酸化的筋線維の数の増加、
酸化的筋線維の割合の増加、または
筋線維直径の増加のうちの１つ以上である、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目３９)
前記性能の改善が、最大攣縮反応の少なくとも約２０％の増加であるか、または最大強縮反応の少なくとも約１０％の増加である、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目４０)
前記性能の改善が、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、またはランニングから疲労までの試験に対する距離の少なくとも約１００％の増加である、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目４１)
前記筋線維が、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目４２)
前記ｒＡＡＶが、筋肉内注射または静脈内注射によるために処方される、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目４３)
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目４４)
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９５％同一である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目４５)
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２の配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目４６)
ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質が、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目４７)
ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目４８)
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目４９)
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５０)
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５１)
前記プロモーターが、筋特異的プロモーターである、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
前記筋特異的プロモーターが、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速攣縮トロポニンｃ遺伝子要素、遅攣縮心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅攣縮トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、およびグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）のうちの１つ以上を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５３)
前記筋特異的プロモーターが、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、またはＭＨＣＫ７プロモーターである、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５４)
前記筋特異的プロモーターが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む短縮型ＭＣＫプロモーターである、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５５)
前記第１および第２のＡＡＶ逆位末端反復が、ＡＡＶ２逆位末端反復である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５６)
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４およびＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５７)
前記ｒＡＡＶが、ｒｈ．７４キャプシドタンパク質またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５８)
前記対象が、小児対象、青年対象、または若年成人対象である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目５９)
前記対象が、中年成人または高齢対象である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目６０)
前記対象が、４～１５歳である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目６１)
前記対象が、１５～５５歳である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目６２)
前記対象が、５５歳超である、前記項目のいずれか一項に記載の方法、ｒＡＡＶまたは使用。
(項目６３)
ポリヌクレオチドであって、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
(項目６４)
前記ポリヌクレオチドが、前記配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
(項目６５)
組換えＡＡＶ ｒＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を生成する方法であって、プラスミドを細胞に移入することを含み、前記プラスミドが、配列番号１３と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
(項目６６)
前記プラスミドが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６７)
前記細胞にパッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを移入することをさらに含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６８)
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目６９)
前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
(項目７０)
細胞であって、配列番号１３と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む、細胞。
(項目７１)
前記プラスミドが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の細胞。
(項目７２)
配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、前記項目のいずれか一項に記載の細胞。
(項目７３)
前記細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、蚊細胞、または哺乳動物細胞である、前記項目のいずれか一項に記載の細胞。
(項目７４)
前記細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、前記項目のいずれか一項に記載の細胞。
(項目７５)
前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞またはヨトウガ（Ｓｆ９）昆虫細胞である、前記項目のいずれか一項に記載の細胞。
ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３ベクターの生物効力および遺伝子送達後４週間での短期間の有効性を示している。（Ａ）５’および３’ＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、ｔＭＣＫプロモーター、キメライントロン（Ｉｎ）、導入遺伝子としてのヒトカルパイン３、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）を示すＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３ベクターの概略図。（Ｂ）正常なヒト筋肉溶解物を含むＣＡＰＮ３ＫＯマウスにおける筋肉内（ＩＭ）および全身遺伝子送達後の筋肉試料中のカルパイン３タンパク質（前脛骨筋／ＴＡ、大腿四頭筋および腓腹筋からのマウス溶解物と比較して６０％総タンパク質のゲル負荷）、および比較のための未処理のＣＡＰＮ３ＫＯの代表的なウエスタンブロット画像。９４ｋＤａの全長ヒトカルパイン３が、４週間後の１ｘ１０１１ｖｇでのベクターのＩＭ注射でＴＡにおいて検出された。全身送達後の、３ｘ１０１２ｖｇ（ＬＤ、低用量）コホートと比較して、６ｘ１０１２ｖｇ治療（ＨＤ、高用量）による完全長カルパイン３タンパク質の顕著な増加に注意されたい。（Ｃ）ＡＡＶ．ｈＣＡＰＮ３またはリンガー乳酸（ＵＴ、未処理）のＩＭ送達後の野生型（ＷＴ）およびＣＡＰＮ３ＫＯマウスのＴＡ筋肉からのコハク酸デヒドロゲナーゼ、ＳＤＨ染色組織切片の代表的な画像。正常化に向けた繊維サイズの増加は、ＣＡＰＮ３遺伝子治療で明らかであった。（Ｄ）全身ＡＡＶ．ｈＣＡＰＮ３遺伝子治療後、ＬＤおよびＨＤの両方で治療したＣＡＰＮ３ ＫＯマウスは、ＵＴの対応するマウスと比較して、トレッドミル試験をより良好に施された。（Ｅ）ＴＡ筋肉の平均繊維径は、ＬＤおよびＨＤコホートでの全身送達後に示されている。ＵＴ ＣＡＰＮ３ＫＯおよびＷＴマウスからのデータは、ＤおよびＥに含まれている。各バーは、３～４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。ＷＴ図１におけるスケールバー＝３０μｍは、すべてに適用される。 ＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身注射後の心臓毒性の証拠を示さない組織学的およびウエスタンブロット分析データを提供する。（Ａ）低用量（ＬＤ、３ｘ１０１２ｖｇ）および高用量（ＨＤ、６ｘ１０１２ｖｇ）でのＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身注射４回後におけるＣＡＰＮ３ＫＯマウスの代表的な心臓試料からの左心室のＨ＆Ｅ染色新鮮凍結切片、未処理の対照と比較している。筋線維の壊死、再生または炎症は見られなかった。（Ｂ）ＨＤコホートからの心臓組織のウエスタンブロット分析は、検出可能なカルパイン３タンパク質を示さなかった。全長９４ｋＤａｈＣＡＰＮ３バンドは、陽性対照としてのヒト骨格筋に存在しますが、対照ＣＡＰＮ３ＫＯ筋には存在しない。（Ｃ）ＬＤおよびＨＤでのＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身注射の２０週間後のパラフィン包埋心臓組織からのＨ＆Ｅ染色切片においては、長期毒性がないことを示す組織病理学は明らかにならなかった。 トレッドミル性能による、ＡＡＶ．ＣＡＰＮ３遺伝子治療の機能的有効性が提供される。トレッドミル試験では、ＬＤ（３ｘ１０１２ｖｇ）およびＨＤ（６ｘ１０１２ｖｇ）の両方の治療コホートが、未治療（ＵＴ）のＣＡＰＮ３ＫＯマウスと比較して（Ａ）老齢群および（Ｂ）若年齢群で有意な改善を示した。（Ｃ）老齢群のＨＤコホートの女性は、同じ群の男性よりも有意により良好な性能を示した。（Ｄ）早期発症治療によりもたらされるトレッドミルの転帰に有意差はなかった。各バーは、１２～１４匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、（Ａ）と（Ｂ）についてのテューキーの多重比較検定、ならびに（Ｃ）および（Ｄ）についての二元配置分散分析、シダックの多重比較検定。 ＡＡＶ．ＣＡＰＮ３遺伝子治療による筋肉生理学の改善を示す。老齢群のＵＴ ＣＡＰＮ３ＫＯマウス動物と比較して、ＬＤおよびＨＤ治療コホートにおける（Ａ）最大攣縮および（Ｂ）強縮反応の両方でより高い力出力を示すインビボ筋収縮アッセイ。データは、組み合わされたすべての治療群を反映している（治療コホート、ｎ＝．２３；ＵＴコホート、ｎ＝２８）。同様に、治療されたマウスは、若齢群での（Ｃ）攣縮および（Ｄ）強縮反応の増加を示した（治療されたコホート、ｎ＝．２２～０．２３；ＵＴコホート、ｎ＝１３）。各バーは、平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対応のないｔ検定。 ＡＡＶ．ＣＡＰＮ３遺伝子治療を受けたＣＡＰＮ３ＫＯマウスの筋線維サイズの増加を示す。（Ａ）ミトコンドリア含有量に基づく筋線維タイプを示すコハク酸デヒドロゲナーゼ染色：疲労耐性遅攣縮酸化的（ＳＴＯ、ｄａｒｋ）または１型繊維、中間染色強度の速攣縮酸化的（ＦＴＯ、中間）繊維および最も軽い染色強度を有する速攣縮解糖（ＦＴＧ、軽い）繊維。（Ｂ）未処理（ＵＴ）、低用量（ＬＤ、３ｘ１０１２ｖｇ）、および高用量（ＨＤ、６ｘ１０１２ｖｇ）治療コホートからの３つの異なるゾーン（深部、中間、表面；ゾーン１、２、および３として指定）を示す前脛骨筋の代表的な画像。（Ｃ）筋肉の３つのゾーンから得られた画像上で行われた繊維サイズの測定では、ＵＴ ＣＡＰＮ３ＫＯ群と比較して、ＬＤおよびＨＤコホートの両方におけるすべての繊維タイプ（ＳＴＯ、ＦＴＯ、およびＦＴＧ）について有意な増加を示した。各バーは、各群における１２～１５匹のマウスの平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＵＴと比較）、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。未処理のゾーン１において、スケールバー＝３０μｍ。 ＡＡＶ．ＣＡＰＮ３遺伝子治療を受けたＣＡＰＮ３ＫＯマウスの筋線維型リモデリングを示す。未処理（ＵＴ）コホートと比較して、両方の年齢群の処理されたＣＡＰＮ３ＫＯマウスの前脛骨筋（ＴＡ）、上腕三頭筋（Ｔｒｉ）、腓腹筋（Ｇａｓ）、大腿四頭筋（Ｑｕａｄ）の各繊維タイプの平均繊維サイズおよびパーセント分布で観察された変化の方向が、矢印で描かれている。アスタリスクは、観察された変化が未処理のマウスとは大幅に異なることを示している。 注射後２０週間でのＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクター生体内分布を提供する。（Ａ～Ｃ）ウイルスゲノム／二倍体ゲノムに対応するベクターコピー数（ｖｇ／ｄｇまたはゲノムＤＮＡのμｇあたりのベクターコピー）は、老齢群のＬＤおよびＨＤコホートのＣＡＰＮ３ＫＯマウスの下肢および上肢からの４つの異なる筋肉群を含むさまざまな組織で定量化された。（Ａ）ベクターゲノム分布は、臓器および筋肉において用量依存的に変化しやすい。最高のベクターゲノムコピー数は、両方の治療コホートの肝臓に存在していた。（Ｂ）ＨＤ治療により、ＬＤと比較して、骨格筋のｖｇレベルが５９．６％増加し、ｐ＜０．０００１になった。（Ｃ）ＣＡＰＮ３ＫＯにおけるＡＡＶ生体内分布の性差が示されている。雌は、雄マウスの対応のないｔ検定と比較して、すべての治療にわたって組み合わされた骨格筋のｖｇレベルが４８．７％増加し、ｐ＝０．０００１になった。各バーは、９～１２個の試料の平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、二元配置分散分析、テューキーの多重比較検定。 遺伝子送達の２０週間後にＣＡＰＮ３ＫＯマウスのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでｈＣＡＰＮ３の筋肉組織発現を提供する。ＣＡＰＮ３ＫＯマウスの老齢群（Ａ）および若年齢群（Ｂ）からのいくつかの骨格筋および心筋組織試料におけるｈＣＡＰＮ３の相対的な発現レベルが示されている。両方の年齢群の低用量（ＬＤ、３ｘ１０１２ｇ；ｎ＝１２）と比較して、高用量（ＨＤ、６ｘ１０１２ｖｇ；ｎ＝１２）治療コホートで、ＣＡＰＮ３ ｍＲＮＡ転写物の用量依存的な増加が観察された。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、二元配置分散分析、シダックの多重比較検定。（Ｃ）４匹のマウスからの代表的なウエスタンブロット画像は、老齢群のＨＤコホートからの大腿四頭筋および腓腹筋における９４ｋＤａ ＣＡＰＮ３タンパク質の可変量を示す。対応する未治療のＷＴＣ５７ＢＬ／６参照筋肉からの１５μｇ～２．５μｇ（３０～５％）の範囲の検量線を、対応する治療済みＣＡＰＮ３－ＫＯマウスの筋肉におけるＡＡＶ媒介ＣＡＰＮ３レベルの半定量分析に使用した。ＣＡＰＮ３レベルは、ヒトおよびマウスの筋肉抽出物におけるエピトープを認識するＣＡＬＰ－１２Ａ２抗体を使用して検出された。アッセイ感度は、対照のＷＴレベルの２．５％という低い量のＣＡＰＮ３タンパク質を確実に検出するように最適化された。 ＣＡＰＮ３の発現レベルとトレッドミルの性能との相関関係を示す。（Ａ）低用量（ＬＤ、３ｘ１０１２ｖｇ、ｎ＝１２）コホート（Ｒ２＝０．５１９２、ｐ＝０．００８２、線形回帰分析）でのランニングから疲労までの試験と相関する４つの代表的な筋肉（前脛骨筋、腓腹筋、大腿四頭筋、および三頭筋）からの総ｍＲＮＡレベル間の相関を示す散布図（一方、高用量コホート（ＨＤ、６ｘ１０１２ｖｇ、ｎ＝１２）では、ｍＲＮＡレベルとランニングから疲労までの試験の性能との間に相関は見られなかった）。（Ｂ）最良のトレッドミル性能のためのｍＲＮＡレベルウィンドウは、ＨＤコホートとＬＤコホートの両方の女性に有利であった。 筋肉における相対的なＰＧＣ１α発現レベルおよび繊維タイプリモデリングとのその相関関係を提供する。ＣＡＰＮ３ＫＯの老齢群（ＵＴ、ｎ＝８；ＬＤ、ｎ＝１２；ＨＤ、ｎ＝１２）の腓腹筋（Ｇａｓ、ＡおよびＢ）ならびに前脛骨筋（ＴＡ、ＤおよびＥ）におけるＰＧＣ１αの相対的発現レベル）ならびにｈＣＡＰＮ３遺伝子送達の２０週間後の年齢を一致させた野生型（ＷＴ、ｎ＝８）マウスは、両方の性別を組み合わせたもの（ＡおよびＤ）および別々にしたもの（ＢおよびＥ）として示されている。ＬＤおよびＨＤ治療コホートからの同じ筋肉、腓腹筋（Ｃ）および前脛骨筋（Ｆ）における繊維タイプ（ＳＴＯ、ＦＴＯ、およびＦＴＧ）分布の変化率を示す線グラフ。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、、対応のないｔ検定。ＬＤ男性が女性（Ｂ、Ｅ）よりも高いＰＧＣ１α発現を示したにもかかわらず、ＨＤコホートおよびＬＤコホートの両方でのＳＴＯへの切り替え（％増加として）は女性（Ｃ、Ｆ）でのみ観察された。 ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの概略図を提供する。図１１Ａは、円形のマップを提供し、図１１Ｂは、線形のマップを提供する。 ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの概略図を提供する。図１１Ａは、円形のマップを提供し、図１１Ｂは、線形のマップを提供する。
本明細書で提供される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む。一実施形態において、ヌクレオチドは、ＣＡＰＮ３をコードする。実施形態には、ＣＡＰＮ３をコードするヌクレオチド配列またはＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質を含むｒＡＡＶが含まれるが、これらに限定されないが、ヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％同一である。追加の実施形態には、、配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶが含まれるが、これらに限定されず、ＣＡＰＮ３タンパク質分解活性を有するポリペプチドをコードする。ＣＡＰＮ３タンパク質分解活性は、当該技術分野において、フォドリンおよびＨＳＰ６０などの可能性のある基質をタンパク質分解する活性、および／または自己分解的に自己切断する活性として理解されている。したがって、本明細書で使用される場合、「カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質」という用語は、フォドリンおよびＨＳＰ６０などのタンパク質分解基質の活性を含むがこれらに限定されない、ＣＡＰＮ３タンパク質分解活性を有するタンパク質、および／または自己分解的に自己切断する活性を指す。ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、全長カルパイン３タンパク質の完全または部分的な活性を有し得る。一実施形態において、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、全長ＣＡＰＮ３タンパク質の活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を有する。別の実施形態において、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２の配列を含む。別の実施形態において、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、ｒＡＡＶのポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を含む。
別の態様において、ストリンジェントな条件下で配列番号２の核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはその補体を含む、組換えＡＡＶベクターが本明細書に記載されている。「ストリンジェントな」という用語は、ストリンジェントとして当該技術分野において一般に理解される条件を指すために使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のためのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、６５～６８℃の０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウムまたは０．０１５Ｍの塩化ナトリウム、０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム、および４２℃の５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。
本明細書に記載の組換えＡＡＶゲノムにおいて、ＣＡＰＮ３ポリヌクレオチドは、転写制御因子（プロモーター、エンハンサー、および／またはイントロンを含むが、これらに限定されない）、特に、目的の標的細胞において機能的な転写制御因子に作動可能に連結されている。例えば、さまざまな実施形態は、アクチンおよびミオシン遺伝子ファミリー、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリー［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照されたい］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子由来の対照因子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７）］、筋クレアチンキナーゼ配列因子［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照されたい］およびマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）因子、骨格速攣縮トロポニンＣ遺伝子、遅攣縮心筋トロポニンＣ遺伝子および遅攣縮トロポニンＩ遺伝子に由来する制御因子：低酸素症誘導性核内因子［Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１）］、グルココルチコイド応答因子（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導性因子およびプロモーター［Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５６０３－５６０７（１９９３）］、ｔＭＣＫプロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：１４８９－１４９９（２００８）を参照されたい］、ＣＫ６プロモーター［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、上記を参照されたい］、ならびに他の制御因子、由来のものを含むが、それらに依存しない筋肉特異的転写対照因子を使用して筋細胞を形質導入する方法を提供する。一実施形態において、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、筋特異的プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態において、筋特異的プロモーターは、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファア－クチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、グルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）のうちの１つ以上を含む。別の実施形態において、筋特異的プロモーターは、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、またはＭＨＣＫ７プロモーターである。一実施形態において、筋特異的プロモーターは、配列番号３のヌクレオチド配列を含むｔＭＣＫである。一実施形態において、筋特異的プロモーターは、配列番号４のヌクレオチド配列を含むＭＨＣＫ７である。
以前の研究は、デスミンプロモーターによって駆動されるＣＡＰＮ３の発現が心毒性をもたらすことを示した。フォローアップ研究では、遺伝子の選択的な骨格筋発現が心臓の欠陥を排除した。本明細書に開示されるＡＡＶゲノムは、ＣＡＰＮ３発現を骨格筋に制限するための筋肉特異的プロモーターｔＭＣＫを含み、遺伝子注射の４週間後の６Ｅ１２ｖｇ（提案された初期高用量の２倍）でのウイルスの全身送達後に心臓毒性を示さなかった。
したがって、本明細書で提供される組換えＡＡＶは、組換えゲノムを含む、複製欠損、感染性、カプシド形成ウイルス粒子である。例としては、ＣＡＰＮ３をコードする配列番号１に記載された配列を含むゲノムを含むｒＡＡＶと、ＣＡＰＮ３をコードする配列番号１に記載された配列から本質的になるゲノムを含むｒＡＡＶと、ＣＡＰＮ３をコードする配列番号１に記載された配列からなるゲノムを含むｒＡＡＶ（「ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３」と名付けられた）が含まれるが、これらに限定されない。ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡが存在しない。
ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３配列の配列は、配列番号１に記載されており、ＡＡＶ２ ＩＴＲはヌクレオチド１～１２８にまたがり、ｔＭＣＫプロモーターはヌクレオチド１６５～８８４にまたがり、キメライントロンはヌクレオチド９３７～１０６９にまたがり、コザック配列はヌクレオチド１１０１～１１０６にまたがり、ＣＡＰＮ３ポリヌクレオチドはヌクレオチド１１０７～３５７２にまたがり、ポリＡシグナルはヌクレオチド３５８１～３７８０にまたがり、第２のＡＡＶ２ ＩＴＲはヌクレオチド３８５０～３９７７にまたがっている。
ｒＡＡＶを有する筋細胞など標的細胞をインビボまたはインビトロで形質導入する方法が、本発明で企図される。インビボでの方法は、本明細書で提供されるｒＡＡＶを含む組成物の有効用量または有効複数用量をそれを必要とする対象（例えば、ヒト患者を含むが、これに限定されない動物）に投与するステップを含む。用量が、障害／疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が、障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。「有効用量」は、処置される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または低減）する用量、障害／疾患状態への進行を遅らせるかまたは防止する用量、障害／疾患状態の進行を遅らせるかまたは防止する用量、疾患の程度を減少させる用量、疾患の寛解（部分的または完全）をもたらす用量、および／または生存を延長させる用量である。治療前の対象と比較して、本明細書の方法は、筋線維直径の増加、小分葉状筋線維の数の減少、内部核を有する線維の数の減少、筋内膜結合組織含有量の減少、筋萎縮の矯正、および筋力生成の増加のうちの１つ以上をもたらす。一実施形態において、筋線維は、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む。一実施形態において、治療は、（ａ）投与後４週間までに１ｍｍ２あたりの総筋線維数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％、または４０％の減少；（ｂ）投与後４週間までに筋線維直径の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の増加；（ｃ）投与後４週間までに１ｍｍ２あたりのＳＴＯ筋線維数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、または４２％の減少；（ｄ）投与後４週間までにＳＴＯ筋線維直径の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の増加；（ｅ）投与後４週間までに１ｍｍ２あたりのＦＴＯ筋線維数の少なくとも５％、１０％、１５％、または２０％の減少；（ｆ）投与後４週間までにＦＴＯ筋線維直径の少なくとも５％、１０％、１５％、または２０％の増加；（ｇ）投与後４週間までに１ｍｍ２あたりのＦＴＧ筋線維数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％の減少；および（ｈ）投与後４週間までにＦＴＧ筋線維直径の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の増加のうちの１つ以上をもたらす。本開示の方法は、一実施形態では、ｒＡＡＶを投与された対象の心筋において、ｒＡＡＶから発現されるカルパイン３タンパク質がない、最小である、または低いことがもたらされる。
これらの結果を調べるためのアッセイは、当該技術分野で理解されており、かつ／または本明細書の実施例に記載されている。ＣＡＰＮ３活性における欠陥またはＣＡＰＮ３の発現における欠陥によって引き起こされる障害／疾患（例えば、筋ジストロフィー）を予防または治療するための本明細書に記載の方法の使用が企図される。ＬＧＭＤ２Ａは、この方法に従った予防または治療が企図される疾患の例である。
併用療法も企図される。本明細書で使用される併用療法は、同時治療または連続治療を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイド）との組み合わせが、新規治療との組み合わせと同様に、特に企図されている。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、髄腔内、経口、口腔、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むが、これらに限定されない、当該技術分野における標準的な経路により得る。ｒＡＡＶのＡＡＶ成分（具体的には、ＡＡＶ ＩＴＲおよびカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）および血清型（複数可）は、治療される感染症および／または疾患状態、ならびにＣＡＰＮ３を発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択かつ／または適合され得る。一実施形態において、ｒＡＡＶは、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮下投与、膣内注射、皮内投与、または経鼻投与によって投与される。別の実施形態において、ｒＡＡＶは、筋肉内注射または静脈内注射によって投与される。
本開示は、有効用量のｒＡＡＶおよび本開示の組成物の局所投与および全身投与を提供する。例えば、全身投与とは、全身が影響を受けるように循環系に投与することである。全身投与には、消化管を介した吸収などの経腸投与、および注射、注入、または移植による非経口投与が含まれる。
特に、本明細書に記載のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することにより達成され得る。投与としては、筋肉内への注入、血流への注入、および／または肝臓への直接注入が挙げられるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを再懸濁するのみで、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、担体、またはｒＡＡＶと共投与され得る他の成分に既知の制限はない。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように修飾されてもよい。例えば、本開示が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ第０２／０５３７０３号を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送により筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、方法の実施において使用され得るができる。ｒＡＡＶは、投与および取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射を目的として、ゴマ油や落花生油などのアジュバント溶液、または水性プロピレングリコール溶液、および滅菌水溶液を使用することができる。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースで等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。通常の保存状態および使用下においては、これらの製剤は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術により容易に入手可能である。
全身注射可能用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。製造および保管の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
滅菌されている注射可能な溶液は、必要な量のｒＡＡＶを適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した他の様々な成分とともに組み込み、その後濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散液は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒および上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルへと混合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法としては、いくつかの実施形態において、活性成分と、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライ技術が含まれる。
本開示の一実施形態において、ｒＡＡＶは、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、２００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．００１％のポロキサマー１８８を含有する緩衝液中で製剤化される。
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系または異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。
対象への形質導入および形質導入細胞の再導入のための好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態では、細胞は、例えば適切な培地でｒＡＡＶを筋肉細胞と組み合わせ、サザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の技術を使用して、または選択可能なマーカーを使用して目的のＤＮＡを持つ細胞をスクリーニングすることにより、インビトロで形質導入することができる。次に、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内注射による、または例えばカテーテルを使用して平滑筋および心筋への注射によるなど、様々な技術により対象に導入することができる。
本明細書に記載の方法によるｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＣＡＰＮ３またはＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質の持続的発現をもたらす。したがって、ＣＡＰＮ３またはＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質を発現するｒＡＡＶを対象、好ましくはヒトに投与するための方法が提供される。本開示の主題には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、齧歯動物（例えば、ラットおよびマウス）、および霊長類が含まれるが、これらに限定されない。これらの方法は、本明細書に記載の１つ以上のｒＡＡＶで組織を形質導入すること（筋肉などの組織、肝臓および脳等の臓器、ならびに唾液腺などの腺を含むが、これらに限定されない）を含む。
筋肉組織は生命維持に必須な臓器ではなく、アクセスしやすいため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本明細書の方法は、形質導入された筋細胞からのＣＡＰＮ３の持続的発現を提供する。
「筋肉細胞」または「筋肉組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、骨格筋および平滑筋（例えば、消化管、膀胱、血管または心臓組織））に由来する細胞または細胞群を意味する。そのような筋肉細胞は、筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、および心筋芽細胞など、分化または未分化であり得る。
例えば、「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるＣＡＰＮ３の発現をもたらす、記載のｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞へのＣＡＰＮ３の投与／送達を指すように使用される。
したがって、本発明は、ＣＡＰＮ３をコードするｒＡＡＶの有効用量（または、本質的に同時に投与される用量もしくは間隔を置いて投与される用量）を、それを必要とする対象に投与する方法を提供する。
上記のように、本明細書に記載の方法は、治療前の対象と比較して、対象に、筋線維直径の増加、小分葉状遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維の数の減少、内部核を有する線維の数の減少、筋内膜結合組織含有量の減少、筋萎縮の矯正、および筋力生成の増加のうちの１つ以上をもたらす。
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者の技術の範囲内で、ウイルス学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，ｅｄ．）、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上特に明記されていない限り、複数形の指示対象が含まれる。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「培養物」への言及は、１つ以上の培養物および当業者に周知されるその同等物への言及を含む、などである。「組換えＡＡＶ」への言及は、２つ以上のｒＡＡＶビリオンの混合物を含む、などである。別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替案のみを指すように明示的に示されない限り、または代替案が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替案および「および／または」のみを指す定義を支持する。
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されているデバイスまたは方法に対する統計的実験誤差（誤差の標準偏差）を含むことを示すために使用される。
「ベクター」という用語は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの、適切な制御要素と関連する場合に複製することができ、かつ細胞間で遺伝子配列を移入することができる、任意の遺伝子要素を意味する。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは、ある特定の機能が同時感染ヘルパーウイルスによって提供される細胞内でのみ成長する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである。現在、特性評価されているＡＡＶの血清型は１３個存在する。ＡＡＶの一般的な情報および概説は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）で見つけることができる。しかしながら、様々な血清型が遺伝子レベルでさえも構造的および機能的の両方で非常に密接に関連していることがよく知られているため、これらの同じ原理が追加のＡＡＶ血清型に適用可能であることが十分に予想される。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照されたい）。例えば、全てのＡＡＶ血清型は、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される非常に類似した複製特性を明らかに呈し、これらは全て、ＡＡＶ２で発現されたもの等の３つの関連カプシドタンパク質を有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション、および「末端逆位配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニーリングセグメントの存在を明らかにするヘテロ二本鎖分析によってさらに示唆される。類似の感染性パターンは、各血清型における複製機能が類似の調節制御下にあることも示唆する。
本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」とは、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している１つ以上の目的とするポリヌクレオチド（または導入遺伝子）を指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞中に存在する場合に、感染性ウイルス粒子に複製およびパッケージングされ得る。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、限定されないが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ ｒｈ１０、およびＡＡＶ ｒｈ７４を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターである。ＡＡＶベクターは、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子で、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上が全部または一部分において欠失しているが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持することができる。機能的なＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスで必要とされる少なくともそれらの配列を含むように本明細書で定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製、およびパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る。
「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、生産的なＡＡＶ複製のために次にトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現され得るＡＡＶ由来コード配列を指す。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ、およびｃａｐを含む。Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合、およびニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節を含む、多くの機能を所有することが示されている。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶベクターから失われたトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。
「組換えウイルス」とは、例えば、ウイルス粒子への異種核酸配列の付加または挿入によって遺伝的に変更されたウイルスを意味する。
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶベクター粒子」とは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシドに包まれたポリヌクレオチドＡＡＶベクターから成るウイルス粒子を指す。一実施形態では、ＡＡＶビリオンは、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む。一実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子の産生には、ＡＡＶベクターの産生が含まれ、例えば、ベクターは、ＡＡＶベクター粒子内に含有される。
哺乳類細胞に送達される導入遺伝子などのＡＡＶゲノム、それは、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または単に「ＡＡＶベクター」と称される。したがって、かかるベクターがＡＡＶベクター粒子内に含有されるため、ＡＡＶベクター粒子の産生には、必然的にＡＡＶベクターの産生が含まれる。
例えば、野生型（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質コートに関連する線形の一本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む。ＡＡＶビリオンは、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶまたは自己相補的（ＳＣ）ＡＡＶのいずれかであり得る。一実施形態では、相補的センス、例えば「センス」または「アンチセンス」鎖のいずれかの一本鎖ＡＡＶ核酸分子は、ＡＡＶビリオンにパッケージングされ得、両方の鎖は、等しく感染性である。
「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプセル化する、ＡＡＶタンパク質シェルから成る感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書で定義される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、好適な宿主細胞で産生され、これは、その中に導入されたＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能、およびアクセサリー機能を有する。このようにして、宿主細胞は、その後の遺伝子送達のために、ＡＡＶベクター（目的の組換えヌクレオチド配列を含有する）を感染性組換えビリオン粒子にパッケージングするために必要とされるＡＡＶポリペプチドをコードすることができる。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときに「トランスフェクト」される。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技術を用いて、ヌクレオチド組込みベクターおよび他の核酸分子などの、１つ以上の外来性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入することができる。
「形質導入」という用語は、複製欠損ウイルスベクターを介した、例えば、組換えＡＡＶビリオンを介したインビボまたはインビトロのいずれかでのレシピエント細胞へのＤＮＡ分子の送達を意味する。
「宿主細胞」という用語は、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶベクタープラスミド、アクセサリー機能ベクター、またはその他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用できるか、または使用されてきた、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を意味する。この用語には、トランスフェクトされた元の細胞の子孫が含まれる。したがって、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。単一の親細胞の子孫は、自然、偶発的、または意図的な変異のために、形態またはゲノムまたは全ＤＮＡ補体において必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。
「異種」という用語は、コード配列および制御配列などの核酸配列に関連するとき、通常は一緒に結合されていない、かつ／または通常は特定の細胞に関連していない配列を示す。したがって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見られない、別の核酸分子内または別の核酸分子に付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、自然界のコード配列に関連して見られない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が自然界で見られない（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）構築物である。同様に、細胞内に通常は存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的のために異種であると見なされるであろう。本明細書で使用される場合、対立遺伝子変異または自然に発生する変異事象は、異種ＤＮＡを生じさせない。
「コード配列」または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に配置されると、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置するであろう。
「核酸」配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。核酸には、４－アセチルシトシン、８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルアデニン、１－メチルシュードウラシル、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－メチルアデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボニルメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、および２，６－ジアミノプリンを含むが、これらに限定されないＤＮＡおよびＲＮＡの塩基類似体が含まれる。
ＤＮＡ「制御配列」という用語は、集合的に、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製の起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサーなどを指し、これらは、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適切な宿主細胞で複製、転写、および翻訳されることができる限り、これらの制御配列のすべてが常に存在する必要はない。
「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために、その通常の意味で本明細書において使用され、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’－方向）コーディング配列の転写を開始させることができる遺伝子に由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、および「構成的プロモーター」が含まれ得る。一実施形態では、プロモーターは、筋特異的プロモーターであり、これには、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファアクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格の速筋トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅筋トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、およびグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、プロモーターは、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、またはＭＨＣＫ７プロモーターである。
「動作可能にリンクされた」という用語は、そのように記述された構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される要素の配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現に影響を与えることができる。制御配列は、それらがその発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」と見なされ得る。
ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次にコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳されるとき、プロモーターは、細胞内のコード配列の「転写を指示」する。
「発現カセット」または「発現構築物」は、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）の発現を指示することができる集合体を指す。発現カセットは、上記のように、目的の配列（複数可）または遺伝子（複数可）に（転写を指示するように）作動可能に連結されるプロモーターなどの制御要素を含み、ポリアデニル化配列も含むことが多い。本発明のある特定の実施形態内で、本明細書に記載の発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル、少なくとも１つのマルチクローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
ヌクレオチド配列を指す場合の「単離された」とは、示された分子が、他のヌクレオチド配列、クロマチン材料などの他の生物学的高分子の実質的な不在下に存在することを意味する。したがって、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子」は、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが、しかしながら、分子は、組成物の基本的な特性に悪影響を及ぼさないいくつかの追加の塩基または部分を含み得る。
特定のヌクレオチド配列が別の配列に対して「上流」、「下流」、「３」、または「５」に位置すると記載されている場合など、本出願全体にわたって特定の核酸分子中のヌクレオチド配列の相対位置を記載する目的で、それは、当技術分野で慣習的であると称されるＤＮＡ分子の「センス」または「コーディング」鎖における配列の位置であることが理解されるべきである。
核酸配列またはアミノ酸配列の文脈における「配列同一性」、「配列同一性の割合」、または「同一の割合」という用語は、最大限対応するようにアラインメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長であり得るか、または少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片が望ましい。しかしながら、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドなど、より小さい断片間の同一性もまた所望され得る。配列の同一性の割合は、当技術分野で知られている技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させ、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、およびＢＬＡＳＴなどの容易に入手可能なコンピュータープログラムを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。一実施形態では、ＢＬＡＳＴがアラインメントツールとして使用される場合、次のデフォルトパラメータ、遺伝暗号＝標準；ｆｉｌｔｅｒ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリクッス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０個の配列；並べ替え＝高得点；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋スイスプロテイン＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。
「対象」という用語は、動物界の任意のメンバーを指し、これには、ヒトならびにチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類、牛、羊、豚、山羊、および馬などの家畜、犬および猫などの家畜哺乳類、マウス、ラット、およびモルモットなどの齧歯動物を含む実験動物などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象は、出生～２歳、１～１０歳の範囲、または４～１５歳の範囲、または１０～１９歳の範囲、または２０～４０歳、または１５～２９歳または２５～５５歳の範囲、または４０～６０歳の範囲、または５０歳以上または６０歳以上または６５歳以上または７０歳以上のヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、成人（１８歳以上）である。特に、対象は、若年成人（１８～３９歳）、中年成人（４０～６４歳）、または高年もしくは高齢成人対象（６５歳以上）、または老齢対象（７０歳以上）である。いくつかの実施形態において、対象は、１～１０歳、または２～１２歳、４～１５歳、または１０～１９歳である。一実施形態では、対象は、青年対象であり、例えば、１２～２１歳の範囲の対象である。加えて、対象は、一実施形態では、１５～２９歳または１８～３９歳の年齢の範囲の対象などの若年成人対象である。いくつかの実施形態では、対象は、中年成人または高齢対象であり、その結果、中年成人は、２５～５５歳の範囲であってもよく、それ以上の年齢の成人対象は、５０歳を超える範囲であってもよく、高齢対象は、６５歳を超える範囲であってもよい。
ＡＡＶ
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶの複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって修正されたＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示されている。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００２０７７に提示されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿１８２９に提示されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８２９に提示されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＦ０８５７１６に提示されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＮＣ＿００１８６２に提示されており、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提示されており（ＡＡＶ－８に関する米国特許第７，２８２，１９９および同第７，７９０，４４９もまた参照されたい）、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提示されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提示されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提示されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、および宿主細胞染色体組込みを指示するＣｉｓ作用配列は、ＩＴＲ内に含有される。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対マップ位置に対してｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と名付けられる）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２のヌクレオチド２１０７および２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）が生成される。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連キャプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において概説されている。
ＡＡＶは、例えば、遺伝子治療において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒトおよび他の動物の自然感染はサイレントおよび無症候性である。さらに、ＡＡＶは、多くの哺乳動物細胞を感染させ、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を許容にする。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞および非分裂細胞を形質導入し、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）としてそれらの細胞の寿命にわたって本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化ＤＮＡとして感染性である。さらに、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド形成および組込みを指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるので、ゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製および構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）のいくつかまたは全てを、プロモーター、目的のＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットのような外来ＤＮＡと置換し得る。ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供され得る。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑健なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の重要性を低くする。ＡＡＶは、凍結乾燥され得る。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性を示さない。
複数の研究により、筋肉における長期（１．５年を超える）の組換えＡＡＶ媒介タンパク質発現が実証されている。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）、Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）、およびＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）ａｎｄ Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）もまた参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管新生化されているため、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）、およびＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されているように、組換えＡＡＶ形質導入により、筋肉内注射後の体循環において導入遺伝子産物の出現がもたらされる。さらに、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋線維が抗体の正しいグリコシル化、フォールディング、および分泌に必要な細胞因子を持っていることを実証し、筋肉が分泌タンパク質治療薬を安定して発現できることを示している。
本開示の組換えＡＡＶゲノムは、本開示の核酸分子および核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノムのＡＡＶ ＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶｒｈ．７４を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導できる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。偽型ｒＡＡＶの生成は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示される。他のタイプのｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の部分に記載されたように、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。筋肉特異的な発現を促進するために、ＡＡＶｒｈ．７４を使用することができる。
本開示のＤＮＡプラスミドは、本開示のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムの感染性ウイルス粒子への組み立てのために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）の感染に許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離した（すなわち、その中に存在しない）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が、単一細胞（本明細書でパッケージング細胞と表される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、およびＡＡＶ－１３を含むがこれらに限定されない血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０１／８３６９２に開示される。
パッケージング細胞を生成する方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要なすべての成分を安定して発現する細胞株を作成することである。例えば、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離したＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子、およびネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ＆Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順により細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に好適であることである。適切な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノムおよび／またはｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するためのプラスミドではなく、アデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いる。
ｒＡＡＶ生産の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、およびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）に概説されている。様々なアプローチは、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）に記載されている。Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ９５／１３３６５、ならびに対応する米国特許第５，６５８．７７６号、ＷＯ９５／１３３９２、ＷＯ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０（１９９５）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）、米国特許第５，７８６，２１１号、米国特許第５，８７１，９８２号、および米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、ｒＡＡＶ産生に関する文書の部分を特に強調する。
したがって、本開示は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、およびＰｅｒＣ．６細胞（同種２９３株）などの安定して形質転換されたがん細胞であり得る。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換されたがん細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、およびＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎児肺細胞）である。
本開示の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。例示的な実施形態では、ｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶのｒｅｐとｃａｐの両方のＤＮＡを欠いており、すなわち、ｒＡＡＶのゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶのｒｅｐまたはｃａｐのＤＮＡが存在しない。本開示の核酸分子を含むように構築され得るｒＡＡＶの例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ２０１３／０１６３５２）に記載されている。
ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４は、血清型ｒｈ７４由来の４つの野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質と３つの野生型ＡＡＶ ＶＰカプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。ｐＮＬＲＥＰ２－Ｃａｐｒｈ７４プラスミドの概略図を、図３に示す。
ｐＨＥＬＰアデノウイルスヘルパープラスミドは１１，６３５ｂｐで、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｖｉｒｏｍｉｃｓから入手した。このプラスミドには、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、およびＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１機能は２９３細胞によって提供される）。このプラスミドに存在するアデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムの約４０％に過ぎず、アデノウイルスの末端反復配列などの複製に重要なシスエレメントを含んでいない。したがって、このような生産システムから感染性アデノウイルスが生成されることは予想されない。ｐＨＥＬＰプラスミドの概略図を図４に示す。
ｒＡＡＶは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製され得る。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）、Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、およびＷＯ９８／０９６５７に開示される方法を含む。
別の実施形態において、本開示は、本開示のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本開示の組成物は、ｒＡＡＶおよび薬学的に許容される担体を含む。本組成物は、希釈剤およびアジュバント等の他の成分も含み得る。許容される担体、希釈剤、およびアジュバントは、受容者に対して無毒であり、好ましくは、採用される用量および濃度で不活性であり、緩衝液およびプルロニック（登録商標）などの界面活性剤を含む。
本開示の方法で投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与モード、治療目標、標的化された個体、および細胞型に応じて異なり、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。例示的な開示された用量には、１Ｅ１１ｖｇ、３Ｅ１２ｖｇ、および６Ｅ１２ｖｇが含まれる。カプセル化されたベクターゲノム力価を決定する１つの例示的な方法は、（Ｐｏｚｓｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２５（４）：８５５－８６９，２０１７）に記載されている方法などの定量的ＰＣＲを使用する。
本明細書に開示される方法で投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、および標的とされる細胞型（複数可）に応じて変動し、当該技術分野における標準の方法によって決定され得る。投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０６６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３、約１×１０１４、または約１×１０１５以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であり得る。投薬量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ、１×１０７ｖｇ、１×１０８ｖｇ、１×１０９ｖｇ、１×１０１０ｖｇ、１×１０１１ｖｇ、１×１０１２ｖｇ、１×１０１３ｖｇ、１×１０１４ｖｇ、１×１０１５）。用量はまた、体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（すなわち、それぞれ、１ｘ１０１０ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１１ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１２ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１３ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、２．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．２５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、３．７５ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、４．０ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ、１ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶを滴定する方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載されている。
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋肉細胞を対象から取り出し、ｒＡＡＶで形質導入し、対象に再導入する。代替的に、同系または異種の筋肉細胞は、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生成しない場合に使用され得る。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（「ＤＭＤ」）またはベッカー型筋ジストロフィー（「ＢＭＤ」）を含む筋ジストロフィーの、マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶによる治療
本発明は、マイクロジストロフィンをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与するステップを含み、さらに免疫抑制レジメンを投与することを含む、それを必要とするヒト対象における筋ジストロフィーを治療する方法を包含する。本発明の様々な実施形態において、方法は、マイクロジストロフィンをコードする異種ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス関連（ｒＡＡＶ）を投与することを含み、さらに、例えばプレドニゾンを含む抗炎症ステロイドを投与することを含む。
マイクロジストロフィンを含むｒＡＡＶで筋ジストロフィーを治療することを対象とし、さらに免疫抑制レジメンまたは抗炎症ステロイドを投与することを含む本発明のすべての実施形態において、本発明の方法で利用できるヌクレオチド配列をコードするｒＡＡＶまたはマイクロジストロフィンには、各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ－２０２０／１２３６４５、ＷＯ－２０１９／２０９７７７、ＷＯ－２０１９／１９５３６２、ＷＯ－２０１６／１１５５４３、ＷＯ－２０１９１１８８０６、ＷＯ－２０１７／２２１１４５に記載されているものが含まれ、ＳＧＴ－００１、ｚｉｌｄｉｓｔｒｏｇｅｎｅ ｖａｒｏｐａｒｖｏｖｅｃ、およびＰＦ－０６９３９９２６が含まれる。
肢帯型筋ジストロフィーの治療
肢帯型筋ジストロフィー（「ＬＧＭＤ」）の治療は、本発明の態様である。本明細書に記載の本発明の方法は、そのようなジストロフィーを治療するのに有用なｒＡＡＶベクターを用いることによって、肢帯型筋ジストロフィーの治療に利用できることが認識されている。そのようなｒＡＡＶベクターには、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３９８９３（ＷＯ２０２０／０９８９３）にも記載されているＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３（配列番号１）が含まれ、その各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または下記に関わらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。記載された数値範囲には、各範囲内の各整数値が含まれ、記述される整数の最小および最大が含まれる。
本発明の態様および実施形態は、以下の実施例によって示される。実施例１では、ＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の産生について記載している。実施例２では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの効力を調査する研究について記載している。実施例３では、ランニングから疲労までの試験によって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果について記載している。実施例４では、インビボ筋収縮性アッセイによって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果について記載している。実施例５では、組織病理学的分析によって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果について記載している。実施例６ベクターコピー数分析によって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果。実施例７では、ベクターコピー数分析によって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果について記載している。実施例７では、ＣＡＰＮ３の発現および機能的相関の分析について記載している。実施例８では、ＧＣ１αの発現レベルおよび筋肉リモデリングについて記載している。実施例９では、ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の投与後の毒物学研究について記載している。
実施例１
ｒＡＡＶｒｈ．７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３の産生
切断筋特異的ＭＣＫプロモーター（ｔＭＣＫプロモーター）の下で、ｔＭＣＫプロモーターの制御下にある２４個のエクソンからなるヒトＣＡＰＮ３ ｃＤＮＡコード配列を担持するＡＡＶベクター（ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３という名前である）が産生された。図１Ａは、ｔＭＣＫプロモーター、遺伝子発現を増強するイントロン、完全なヒトＣＡＰＮ３ ｃＤＮＡ、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む遺伝子導入に使用されるカセットの概略図を示す。プラスミドｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの円形マップを図１１Ａに示し、プラスミドの線形マップを図１１Ｂに示す。
ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１３または配列番号２０として提供される。表Ａは、プラスミドｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の分子的特徴を示す。
Figure 2022185591000002
ｔＭＣＫ（三重筋クレアチンキナーゼエンハンサー）プロモーターおよびカナマイシン耐性配列を備えた一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶ発現カセットを設計した。遺伝子断片（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＵＳＡ）からｔＭＣＫプロモーターの下流へのヒトＣＡＰＮ３オープンリーディングフレームには、キメライントロンおよびＫＯＺＡＫ配列が続く。最終的なカセットは、ＡＡＶ産生に送られる前に、配列決定された。ｒｈ７４血清型のＡＡＶ－ｈＣＡＰＮ３ベクターが産生され、精製され、そして力価決定された。例えば、力価は、定量化対照としてスーパーコイルプラスミドを使用することによって決定することができ、等分されたベクターは、使用するまで－８０℃に保たれた。
産生は、ＨＥＫ２９３細胞を使用した標準的な３プラスミドＤＮＡ／ＣａＰＯ４沈殿法を使用して達成された。２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で維持された。分割したウイルスは、使用するまで－８０℃で保存された。
実施例２
ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクター効力
ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３のインビボ生体力試験は、遺伝子送達後４週間でＣＡＰＮ３ＫＯマウス（ｎ＝３）の前脛骨筋にＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３（１ｘ１０１１ｖｇ）を注射した後に、最初にＩＭルートを使用して実施した。ＲＴ－ｑＰＣＲおよびウエスタンブロット分析は、ヒトＣＡＰＮ３転写物および９４ｋＤａの完全長ＣＡＰＮ３タンパク質（図１Ｂ）を示し、ＣＡＰＮ３の産生が達成されたことを示している。さらに、組織学的分析は、ＣＡＰＮ３置換が、対照（リンガー乳酸塩注射）筋と比較して、前脛骨筋の筋線維径を増加させることを示した（図１Ｃ）。
次のステップとして、ＣＡＰＮ３ＫＯマウスの尾静脈を介した低用量および高用量（ＬＤ、３ｘ１０１２ｖｇ、ｎ＝４、およびＨＤ、６ｘ１０１２ｖｇ、ｎ＝３）および両方のコホートで注射後４週間で生体内分布および短期治療効果データを生成した。全身送達後のＣＡＰＮ３ＫＯ筋におけるｈＣＡＰＮ３発現は、異なる筋肉間で変動し、特にＬＤコホートでは、１ｘ１０１１ｖｇでのＩＭ送達と比較して、有意に低かった（前脛骨筋についてのＩＭ送達の＜１％）。したがって、全長９４ｋＤａのタンパク質は、ウエスタンブロットによる検出限界を下回った（図１Ｂ）。ただし、ＨＤコホートでの６ｘ１０１２ｖｇの全身投与後に、ロバストな遺伝子発現および顕著な量の完全長カルパイン３タンパク質が示され、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３送達後の用量依存的応答が示唆された（図１Ｂ）。生物学的力価実験で使用されたＣＡＰＮ３ＫＯマウスの数は少なかったが、これらのマウスから追加のデータを得られ、短期間の機能的または組織学的有効性を検出できるかどうかを評価した。これらのパラメーターの改善は、乳酸リンゲル液を注射された（ｎ＝３）対応物と比較して、遺伝子注射後４週間で３ｘ１０１２ｖｇか、または６ｘ１０１２ｖｇのベクターを全身的に受けたＣＡＰＮ３ＫＯマウスの両方のコホートで観察された（図１ＤおよびＥ）。ランニングから疲労までの試験においては、両方の治療コホートは、未治療コホートと比較して有意に改善され、用量に関連した性能の違いはなかった。これに伴い、筋線維直径は、両方のコホートでノーマライゼーションに向けて増加したが、この場合も用量に関連した違いはなかった（表Ｓ１）。
Figure 2022185591000003
さらに、いずれかのコホートで４週間でのＡＡＶｒｈ７．４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３ベクターの全身注射後に、心毒性の組織病理学的証拠は観察されなかった。心尖を通る２つのレベルの切片（心室からの表層切片および深層切片）の顕微鏡検査は、心筋に炎症、壊死、再生、または線維性変化がないことを明らかにし、これら２つの用量でのベクターの全身送達による短期間の心毒性効果がないことを示している（図２Ａ）。心組織で検出可能なＣＡＰＮ３タンパク質バンドは、どちらのコホートでもウエスタンブロットでは観察されなかった（図２Ｂ）。
実施例３
ランニングから疲労までの試験によって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果
機能的、インビボ筋肉生理学および組織学的転帰を使用して、ＣＡＰＮ３ＫＯマウスの若齢および老齢グループにおける同じ低用量および高用量での全身ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３遺伝子治療の長期有効性を調査するための研究が実施された。これらの研究では、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３が、６～１０週齢および２１～２４週齢のＣＡＰＮ３ＫＯマウスの２つの異なる年齢群に全身投与された。各群には、ベクターのＬＤ（３ｘ１０１２ｖｇ）およびＨＤ（６ｘ１０１２ｖｇ）を投与された２つの治療コホートと、年齢を一致させた未治療（ＵＴ）の対照ＣＡＰＮ３ＫＯマウスが含まれていた。治療効果は、機能的（トレッドミルのランニングから疲労までの試験）、生理学的（インビボ心収縮アッセイ）、および組織病理学的転帰を使用して、遺伝子送達２０週間後に試験された。表２Ｓは、各年齢群の実験コホートをまとめたものである。
Figure 2022185591000004
ランニングから疲労までのトレッドミル試験を使用して、ＣＡＰＮ３遺伝子治療の機能的有効性を評価した。若齢群および高齢群の両方の用量で、遺伝子治療は遺伝子送達後２０週間でトレッドミルのパフォーマンスを改善し、年齢を一致させたＵＴ－ＣＡＰＮ３ＫＯコホートと比較して、走行距離と倦怠感までの時間を大幅に増加させました。高齢群では、ＣＡＰＮ３遺伝子治療により、ＵＴコホート（ＵＴ対両方の治療コホートについて、７６．２±６．２ｍ、ｎ＝１４；ｐ≦０．０００１、図３Ａ）と比較して、ＬＤでのランニングから疲労までの距離が１１９％増加し（１６７．２±１４．１ｍ、ｎ＝１２）、ＨＤでのランニングから疲労までの距離が１４２％増加した（１８４．５±１９．２ｍ、ｎ＝１２）。同様に、若齢群では、トレッドミルのデータは、ＵＴコホート（ＵＴ対両方の治療コホートについて、９３．９±６．０ｍ、ｎ＝１２；ｐ≦０．００１、図３Ｂ）と比較して、ＬＤで７２％の性能の増加（１５６．７±１４．０ｍ、ｎ＝１２）、ＨＤでのランニングから疲労までの距離における８８％の増加（１７１．４±９．６ｍ、ｎ＝１２）を示した。若齢群のＵＴコホートは、統計的有意性に達することなく、老齢群のＵＴの対応物よりも良好な性能を示した。トレッドミルの性能は、治療されたコホート間で有意差はなく、ＬＤでのＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３ベクターが、ＨＤコホートに匹敵する機能改善をもたらすのに十分であることを示唆している。一方、ＨＤでの雄（ｎ＝７）の性能および雌（ｎ＝５）の性能を比較すると、雌の性能は大幅に良好になった（ｐ＝０．００６、図３Ｃ）が、若齢群では、性別の違いはトレッドミルの性能に影響しなかった。（図３Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ベクター投与時の年齢およびベクター用量がこのモデルにおけるトレッドミルの性能に影響を与えなかったことを示している。
実施例４
インビボ筋収縮アッセイによって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果
インビボ筋収縮アッセイを使用して、ＣＡＰＮ３遺伝子治療に応答した筋生理学を評価した。このアッセイによって、脛骨神経を刺激して足首関節周辺の腓腹筋トルクを達成することによって生成される総トルクが測定される。
ＣＡＰＮ３ＫＯマウスの老齢群では、未治療の雄で、高齢のＣＡＰＮ３ＫＯ表現型の一部としてさまざまな程度の踵索拘縮が観察され、ヒトの男性と女性との間の表現型の違いが再現された（Ｆａｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ３３：１７９－８０１，２０１４）。拘縮は、エンドポイントでのＬＤ治療コホートの雄（４／６マウス）でも観察されたが、ＨＤコホートの雄は遺伝子治療で救助された。この変動性を考慮して、ＨＤとＬＤを組み合わせた治療コホート（ｎ＝２３）をＵＴコホート（ｎ＝２８）と比較して、インビボ心収縮データを分析した。治療されたマウスは、最大の攣縮反応および強縮反応の両方に対してより高い力を示した。未治療群（攣縮、１．９２±０．１ｍＮ・ｍ；強縮、９．４４±０．４ｍＮ・ｍ、図４ＡおよびＢ）と比較して、治療群の最大攣縮反応（２．４３±０．１ｍＮ・ｍ）は２７％の増加（ｐ＝０．００１０１）を示し、最大強縮反応（１０．５８±０．３ｍＮ・ｍ）は１２％（ｐ＝０．０４７）改善した。
まず第一に穏やかな表現型を示したＣＡＰＮ３ＫＯマウスの若い群（図３ＡおよびＢの若齢群および老齢群のＵＴコホートのトレッドミル性能を参照されたい）では、心収縮の経時変化が、ベースライン測定値を治療後２０週間のエンドポイントと比較することによって評価された。攣縮反応および強縮反応の変化の割合を各マウスについて計算した。治療により、最大攣縮反応の平均割合増加は、併用治療群（ｎ＝２３）で５％であったが、未治療群では平均９％の減少が発生した（ｎ＝１３、ｐ＝０．２０、図４Ｃ）。治療されたマウス（ｎ＝２２）では最大強縮反応の平均割合が８％増加したことが観察され、一方、未治療群（ｎ＝１３）では９％減少した（ｐ＝０．００２、図４Ｄ）。
実施例５
組織病理学的分析によって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果
筋線維のサイズおよび線維タイプの組成に対するＣＡＰＮ３ＫＯマウスにおけるＣＡＰＮ３遺伝子療法の効果は、高ミトコンドリア含有量の繊維、すなわち疲労耐性性の遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）線維またはタイプ１線維、中程度の染色強度の速攣縮酸化的（ＦＴＯ）線維および最も軽い染色強度の速攣縮糖分解性（ＦＴＧ）繊維を描写するコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）染色を使用して、遠位四肢筋および近位四肢筋（腓腹筋、前脛骨筋、および大腿四頭筋）ならびに上肢からの三頭筋における遺伝子注射後２０週間で定量化された（図５Ａ）。繊維サイズの測定は、老年期の前脛骨筋に示されているように、筋肉の３つのゾーン（ゾーン１、２、および３として指定される深部、中間部、および表層部）からの代表的な画像上で行われた（図５Ｂおよび５Ｃ、表Ｓ３）。ＷＴと比較して、すべての繊維タイプの筋肉量および筋繊維サイズはＵＴ－Ｃａｐｎ３ヌル筋肉で小さく、以前の報告（Ｋｒａｍｅｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：１３７３－１３８８，２００４；Ｙａｌｖａｃ ｅｔ ａｌ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅｓ ７：２７，２０１７）を裏付けている（表Ｓ４－Ｓ１３を参照されたい）。ＫＯマウスでのＣＡＰＮ３遺伝子治療により、ＵＴコホートと比較して、ＬＤコホートおよびＨＤコホートの両方ですべての繊維タイプで有意な繊維サイズの増加がもたらされた（表Ｓ３）。全体として、ＣＡＰＮ３ＫＯマウスの両方の老齢群および若齢群の他の筋肉で、線維サイズの増加が観察された（表Ｓ４～１３）。
Figure 2022185591000005
Figure 2022185591000006
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雌と雄のデータのさらなる分析により、トレッドミル試験の改善が、筋肉のリモデリング、繊維サイズの増加に伴う雌の耐疲労性酸化繊維への切り替え、および雄におけるＳＴＯ繊維で最も顕著であった繊維直径の有意な増加と相関していたことが示差された。未処理のコホートと比較した、治療されたコホートで観察されたＳＴＯ、ＦＴＯ、およびＦＴＧの繊維サイズと繊維タイプの分布の変化（全体のパーセントとして）を図６に示した。表Ｓ３－１４に、年齢を一致させたＷＴのデータを用いた繊維タイプの直径（平均±Ｐμｍ；各マウスで個別に行われた測定値の平均から導出）および繊維タイプの分布（各マウスのパーセント分布から導出）を詳細を示す。まとめると、遺伝子送達後２０週間でのＣＡＰＮ３ＫＯマウスの骨格筋の組織学的分析は、筋肉のリモデリングによるＣＡＰＮ３置換の効果、繊維サイズの増加に伴う若齢群および老齢群の両方での酸化的繊維への全体的な切り替えを反映していした。
実施例６
ベクトルコピー数分析によって決定されたｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ｈＣＡＰＮ３の長期治療効果
ＣＡＰＮ３遺伝子導入の有効性分析の一環として、組織間のベクターの生体内分布を、筋肉（前脛骨筋、腓腹筋、四頭筋、三頭筋）のベクターゲノムコピーならびに治療後２０週間のＣＡＰＮ３ＫＯマウスの老齢グループのＬＤおよびＨＤコホートから収集された内臓を分析することによって評価した。
ＣＡＰＮ３ＫＯマウスにおけるＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３は、広い向性があり、骨格筋を効率的に標的にしていた。全身ベクター送達後に予想されるように、最高のベクターゲノムコピー数が肝臓に存在した（図７Ａ）。ベクターゲノムの分布は、臓器および筋肉で用量依存的に変動した。ＨＤ送達により、ＬＤと比較して、骨格筋ベクターゲノムレベルが５９．６％増加した（ｐ＜０．０００１）（図７Ｂ）。興味深いことに、さらなるデータの分析により、雌は、雄のマウスと比較して、すべての治療にわたって骨格筋ベクターゲノムレベルが４８．７％増加し（ｐ＝０．０００１）（図７Ｃ）、性別がＣａｐｎ３ヌルバックグラウンドでの形質導入効率に影響を与える可能性があることを示唆している。
実施例７
ＣＡＰＮ３の発現および機能的相関の分析
ｈＣＡＰＮ３の組織発現は、ＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３ベクター送達２０週間後にＵＴ、ＬＤ、またはＨＤで治療されたＣＡＰＮ３ＫＯコホートから収集された骨格筋および心筋サンプル、ならびに年齢を一致させたＷＴマウスからの筋肉において、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで実施された。ｑＰＣＲを使用すると、ＣＡＰＮ３ＫＯモデルの後肢および前肢（前脛骨筋、腓腹筋、四頭筋、三頭筋）の４つの代表的な筋肉および心臓でＣＡＰＮ３ｍＲＮＡの持続的な発現が観察された。ＣＡＰＮ３ｍＲＮＡレベルは、用量依存的に筋肉／動物間で変動した。ＨＤベクターを受け取った両方の若齢群および老齢群の骨格筋は、両方の年齢群のＬＤコホートと比較して、より高いＣＡＰＮ３ｍＲＮＡレベル（若齢群の違い：１４．４％、ｐ＝０．００１；老齢群の違い：１１．０％、ｐ＜０．００１）グループ（図８ＡおよびＢ）を示した。動物の治療年齢に関連する骨格筋ＣＡＰＮ３ｍＲＮＡ発現には有意差はなかった（平均差＜２％、ｐ＝０．７２、対応のないｔ検定）。
ウエスタンブロット分析は、より老齢の群から見た、ＨＤ治療マウスの四頭筋および腓腹筋における全長９４ｋＤａＣＡＰＮ３タンパク質の測定可能量を示した（図８Ｃ）。これらの２つの筋肉において、ＣＡＰＮ３の発現レベルが最も高かった。タンパク質レベルはまた、筋肉／動物間で変動し、ｍＲＮＡレベルと直接相関していなかった。ＬＤコホートにおいては、全長９４ｋＤａタンパク質は、ｍＲＮＡ発現が最も高い腓腹筋サンプルを除いてすべて検出限界を下回り、Ｃａｐｎ３ヌルバックグラウンドの筋肉で９４ｋＤａＣＡＰＮ３タンパク質バンドを検出するためのｍＲＮＡレベルのしきい値を示唆している。
次の分析では、ＣＡＰＮ３ｍＲＮＡレベルがトレッドミルパフォーマンスの機能改善と相関しているかどうかを判定した。この分析では、各動物についての総ｍＲＮＡパーセント値が、腓腹筋、前脛骨筋、四頭筋、および三頭筋の相対的なＣＡＰＮ３ｍＲＮＡレベルの合計から導出されて計算された。トレッドミルランニング中に４つの筋肉すべてが発揮されるため、ｍＲＮＡの合計パーセント値が機能的な性能指標として役立つ可能性があると考えられた。老齢群では、すべての４つの筋肉からの合計ｍＲＮＡレベルは、ＬＤコホート（Ｒ２＝０．５１９２、ｐ＝０．００８２）においては疲労感試験と相関していたが、ＨＤコホートにおいては、ｍＲＮＡレベルとランニングから疲労への試験性能との間に相関は見られなかった（図９Ａ）。ＬＤコホートにおいて高い性能を示したマウスは、ＨＤの最高のパフォーマーと重複しており、しきい値を超えるｍＲＮＡレベルでは性能がさらに改善されない可能性があることが示唆されている。これらの結果は、性能を改善するために必要なｍＲＮＡしきい値効果を支持している。最高のトレッドミル性能のためのｍＲＮＡレベルのウィンドウの発生は、雌に有利な性差の影響を示した（図９Ｂ）。トレッドミル性能と老齢群において観察されたｍＲＮＡレベルとの相関関係は、若齢では明らかではなく。これは、性別および年齢に関連する分子の変化が、疾病の症状の重症度および治療効果に影響を与える可能性があることを示唆している。
実施例８
ＰＧＣ１αの発現レベルおよび筋肉のリモデリング
これまでのところ、本明細書に提示されたデータにより、ＣＡＰＮ３遺伝子治療がＦＴＧからＳＴＯ疲労耐性繊維タイプへの繊維タイプの切り替えをもたらし、雌に有利なランニングから疲労への耐久性能における改善に関連していることが示された。これらの観察は、ミトコンドリア生合成と呼吸の重要な転写コアクチベーターである、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現レベルにおいて性依存性変化があるかどうかを調査する更なる研究を促している（Ｈａｎｄｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ２７：７２８－７３５，２００２）。以前の研究では、ＰＧＣ１αが耐疲労性のＳＴＯ筋線維の形成を促進することが示されている（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ４１８：７９７－８０１，２００２）。さらに、ＰＧＣ－１αは、オーファン核内受容体エストロゲン関連受容体アルファ（ＥＲＲα）の発現および活性を調節する（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：９０１３－９０１８，２００３）。現在、ＰＧＣ１αレベルが、ＷＴ筋肉と比較して、再生プロセス中にＣＡＰＮ３ＫＯマウスで減少したことが以前に示されている（Ｙａｌｖａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ７：２７，２０１７）。本研究において、ＣＡＰＮ３ＫＯの老齢群および若齢群ならびに年齢を一致させたＷＴマウスのＨＤおよびＬＤ治療コホートの筋肉におけるＣＡＰＮ３遺伝子治療に応答したＰＧＣ１αの発現レベルが分析された。
Figure 2022185591000016
ＷＴ対照の２つの異なる年齢の腓腹筋を比較すると、ＰＧＣ１αの相対的発現レベルの増加が１０か月齢で観察され、性差がないことを示す４～６ヶ月齢のＷＴマウスのサンプルと比較して、雄は雌よりも有意に高いＰＧＣ１α発現を示した（図１０ＡおよびＢ）。対照的に、ＰＧＣ１α発現は両方の性の１０ヶ月齢のＵＴ－ＣＡＰＮ３ＫＯマウスで有意に低く、Ｃａｐｎ３ヌル筋がこの増加を示さず、おそらくこの年齢でＷＴにおいて加齢に伴う代償性変化が起こったことを示唆している（図１０ＡおよびＢ）。両方のＬＤコホートおよびＨＤコホートにおける遺伝子治療は、ＵＴコホートと比較して、ＰＧＣ１α転写物を有意に増加させた（図１０Ａ）。ＰＧＣ１α転写産物の増加は、正常化に向けて両方の性で見られたが（図１０Ｂ）、ＳＴＯへの線維タイプの切り替えは、両方の治療コホートの雌でのみ発生した（図６、図１０Ｃ））。
次に、ＰＧＣ１α発現の変化がＡＡＶ．ＣＡＰＮ３遺伝子治療に応答して後部および前部のコンパートメント筋間で変化するかどうかを決定するための研究が実施された。前脛骨筋では、ＨＤを除き、ＷＴと比較して、ＰＧＣ１α転写物の増加があった以外は、両性合わせて、ＷＴ、ＬＤ、およびＵＴコホート間のＰＧＣ１α発現において統計的に有意な変化はなかった（図１０Ｄ）。ＷＴの腓腹筋とは対照的に、ＰＧＣ１α相対的発現１０ヶ月齢のＷＴからの前脛骨筋では、約５０％低く、性差は見られなかった（図１０ＤおよびＥ）。ＵＴ－ＣＡＰＮ３ＫＯの雌は、ＷＴの雄よりもより有意に高いＰＧＣ１α転写産物を示した（図１０Ｅ）。興味深いことに、ＵＴ－腓腹筋においてはＰＧＣ１αの発現に性差はなかったが、雌と比較して、雄のＵＴ－前脛骨筋で有意なレベルの増加が見られた。ＬＤ治療コホートの雄は、雌よりもより高いＰＧＣ１αの発現を有するＵＴコホートと同様のパターンを示した。未処理のＣＡＰＮ３ＫＯ雌と比較して、ＰＧＣ１α転写物が２．３６倍増加した雌を支持する、ＨＤコホートにおけるこのパターンの逆転が観察された。腓腹筋（伸筋）のように、前脛骨筋（屈筋）では、両方のＨＤコホートおよびＬＤコホートにおけるＳＴＯへの切り替え（％増加として）は、雌でのみ観察されており（図１０Ｆ）、これは、ＬＤの雄が雌よりもより高いＰＧＣ１α発現を示して（図１０Ｅ）いるにもかかわらずである。若齢のＣＡＰＮ３ＫＯマウスからのこれらの筋肉のＰＧＣ１α転写物は、ＬＤの雄が同じ群の雌およびＵＴコホートの雄よりも有意により高いＰＧＣ１α発現を示したことを除いて、互いに異ならなかった（データは示されていない）。全体として、これらの結果は、ＦＴＧをＳＴＯ線維タイプに変換することによってより効率的な、雌におけるＰＧＣ１ａの筋肉の増加に対して反応していることを示唆している。または、他の可能性は、ＰＧＣ１ａの筋肉の増加に対する雄の反応が雌と同じではないということである。
実施例９
毒物学研究
ＧＬＰのような実験は、ベクターの生体内分布、キャプシド免疫原性、血液学、血清化学、および複数の臓器組織の病理学的レビューを含む試験品の安全性を評価するために実施された。生体内分布分析では、ベクターがグローバルに配置されていることが示されたが、タンパク質の検出は標的の骨格筋に限定されており、具体的には、全長９４ｋＤａのＣＡＰＮ３タンパク質は、肝臓、腎臓、または心臓組織（すべてのＨＤおよびＬＤの老齢群からの）の試験されたウエスタンブロット分析で検出限界を下回り、これらの組織において高いベクターゲノム負荷およびｍＲＮＡレベルが観察された（図２Ｃ）。重要なことに、いずれの治療用量でも、２０週間の試験期間を通じて、毒性の有害な臨床的兆候は観察されなかった。未治療のＣＡＰＮ３ＫＯ対照と比較して、治療群では、肉眼的異常は認められず、動物または臓器の重量の差は観察されなかった。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、性腺、横隔膜、胃、膵臓、脳、鼠径リンパ節、および第三者（Ｖｅｔ Ｐａｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｉｎｃ．）による組織病理学的観察のために除去された骨格筋の顕微鏡評価では、２０週間の研究エンドポイントでの未治療群と治療群の間での治療に関連する顕微鏡的差異はないと報告された（図示せず）。さらに、血液学および血清化学は異常な変化を示されず、ｒＡＡＶｒｈ７４．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３遺伝子治療の可能性がＬＧＭＤ２Ａのための全体的に安全で効果的な治療であることが示唆されている。
配列
ホモサピエンスカルパイン３（ＣＡＰＮ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００００７０．２（配列番号２）
＞ＮＭ＿００００７０．２：３０７－２７７２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃａｌｐａｉｎ ３（ＣＡＰＮ３）、転写変異体１、ｍＲＮＡ
ＡＴＧＣＣＧＡＣＣＧＴＣＡＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＧＧＡＴＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＴＧＣＧＡＧＡＡＴＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＧＡＧＴＣＡＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＡＧＴＴＴＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＡＴＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＧＡＴＴＧＣＡＣＧＧＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＣＧＧＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＧＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＣＣＣＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＴＡＣＧＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＧＴＡＣＧＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＣＣＴＴＡＡＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＡＴＧＡＴＴＧＣＧＣＴＣＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＧＣＧＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＧＴＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＣＣＴＧＡ
５｀ＩＴＲ（配列番号６）
Figure 2022185591000017
（ｎｔ．１．．１２８または配列番号１３または配列番号２０）
ｔＭＣＫプロモーター（配列番号３）
ＣＣＡＣＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＣＧＣＴＣＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＣＣＣＡＧＧＧＧＣＡＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＧＧＴＣＡＣ（配列番号１３または配列番号２０のｎｔ１６５～８８４）
キメライントロン（配列番号７）
Ｃｔｇｔｇｇａｇａｇａａａｇｇｃａａａｇｔｇｇａｔｇｔｃａｇｔａａｇａｃｃａａｔａｇｇｔｇｃｃｔａｔｃａｇａａａｃｇｃａａｇａｇｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｃｃａｇｔｔｔｃｔａｔｔｇｇｔｃｔｃｃｔｔａａａｃｃｔｇｔｃｔｔｇｔａａｃｃｔｔｇａｔａｃｔｔａｃ（配列番号１３または配列番号２０のｎｔ９３７～１０６９）
コザック配列（配列番号８）
ＧＣＣＡＣＣ（配列番号１３または配列番号２０のｎｔ１１０１～１１０６）
ＷＴ ｈＣＡＰＮ３（配列番号２）
ＡＴＧＣＣＧＡＣＣＧＴＣＡＴＴＡＧＣＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＡＡＧＴＧＧＣＡＴＣＴＡＴＴＣＡＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＣＣＴＡＴＴＡＴＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＴＴＣＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＴＣＴＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＧＧＡＴＧＡＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＴＴＴＧＣＧＡＧＡＡＴＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＧＡＧＴＣＡＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＡＧＴＴＴＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＴＴＣＴＧＧＣＧＣＴＡＴＧＧＡＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＡＴＡＧＡＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＡＡＣＧＴＡＣＡＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＡＣＣＡＣＣＧＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＡＣＧＡＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＣＴＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＡＧＴＴＴＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＧＴＴＧＡＴＴＧＣＡＣＧＧＡＴＧＧＴＡＡＧＧＡＡＴＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＣＧＧＡＣＡＡＴＣＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＡＧＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＧＣＧＧＧＣＴＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣＡＣＧＣＣＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧＧＡＴＧＡＧＧＴＣＣＣＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＡＴＣＣＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＡＣＧＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＡＴＣＴＡＣＣＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＧＧＣＣＧＡＴＧＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＴＧＧＧＴＡＣＧＧＧＧＴＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＴＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＣＣＧＧＡＡＧＣＴＡＧＧＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＧＣＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＡＧＴＡＣＧＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＣＣＴＴＡＡＣＡＣＡＧＴＣＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＣＧＧＧＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＣＣＧＴＡＧＣＡＴＧＡＴＴＧＣＧＣＴＣＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＣＴＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＡＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＧＣＧＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＧＴＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣＡＧＡＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＣＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＴＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＣＣＴＧＡ
（配列番号１３または配列番号２０のｎｔ．１１０７～３５７２）
ポリＡ配列（配列番号９）
ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣ
３｀ＩＴＲ配列（配列番号１０）
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ＯＲＩ配列（配列番号１１）
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ＮｅｏＲ／ＫａｎＲ配列（配列番号１２）
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ｐＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３プラスミド全配列（配列番号１３）
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本開示は特定の実施形態を提供するが、当業者には、変形および修正が発生するであろうことが理解される。したがって、請求項に見られるそのような制限のみが、本発明に課せられるべきである。
本出願で参照されるすべての文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (70)

  1. 対象におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させる方法において使用するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、前記方法が前記組成物を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記組成物の投与が、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較して、ＰＧＣ１αのレベルの増加をもたらす、組成物。
  2. 前記方法が、前記対象における前記ＰＧＣ１αのレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記方法が、前記対象において、速収縮性解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替えをもたらす、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 対象における筋ジストロフィーを治療する方法において使用するための、ｒＡＡＶを含む組成物であって、前記方法が、
    前記組成物を前記対象に投与することであって、前記ｒＡＡＶが筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、ことと、
    前記組成物の投与後に前記対象から得られた試料におけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現レベルを測定することであって、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較したＰＧＣ１αレベルの変化が、前記対照の前記組成物および／または筋機能の治療効果を示す、方法。
  5. ＰＧＣ１αレベルの増加が、筋機能の改善を示す、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記方法が、前記対象に前記組成物を投与する前および／または後に前記試料を得ることをさらに含む、請求項４または５に記載の組成物。
  7. 対象における筋ジストロフィーを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、前記ｒＡＡＶが、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記組成物の投与が、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの変化をもたらし、前記ＰＧＣ１αレベルの変化が、前記対象の前記組成物および／または筋機能の治療効果を示す、組成物。
  8. 対象における筋ジストロフィーを治療するための薬剤の調製のためのｒＡＡＶの使用であって、前記ｒＡＡＶが、筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させるタンパク質をコードする遺伝子を含み、前記ｒＡＡＶの投与が、対照のＰＧＣ１αのレベルと比較して、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）のレベルの変化をもたらし、前記ＰＧＣ１αレベルの変化が、前記対象の前記ｒＡＡＶおよび／または筋機能の治療効果を示す、使用。
  9. ＰＧＣ１αレベルの増加が、筋機能の改善を示す、請求項７または８に記載の組成物または使用。
  10. 前記ＰＧＣ１αにおける変化が、前記対象に前記ｒＡＡＶを投与する前および／または後に得られた試料において決定される、請求項７～９のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  11. 前記対照のＰＧＣ１αのレベルが、前記ｒＡＡＶの投与前または投与なしの前記対象における前記ＰＧＣ１αのレベル、または既知の標準のＰＧＣ１αのレベルである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
  12. 筋力を増加させるかつ／または筋肉量を増加させる前記タンパク質が、マイクロジストロフィン、ジストロフィン、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）、ジスフェリン（ＤＹＳＦ）、ＳＧＣＧＡ（α－サルコグリカン）、ＳＧＣＢ（β－サルコグリカン）、γ－サルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニンアンコタミン５（ＡＮＯ５）、ＧＡＬＧＴ２、ミオチリン、ラミンＡ／Ｃ、カベオリン、デスミン、テレトニン、ＦＫＲＰ、タイチン、ＰＯＭＴ１、ＧＡＬＧＴ２およびフクチンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  13. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）；ベッカー筋ジストロフィー；先天性筋ジストロフィー（ＭＤＣ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ；肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇ、１Ｈ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ ２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ、２Ｎ、２Ｏおよび２Ｑ；ウルリッヒ先天性筋ジストロフィー；福山型先天性筋ジストロフィー；筋強直性ジストロフィー；エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー；遠位型筋ジストロフィー；中心核；および顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  14. 肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させる方法において使用するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、前記方法が前記組成物を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記組成物の投与が、ＰＧＣ１αの対照レベルと比較して、ＰＧＣ１αのレベルの増加をもたらす、組成物。
  15. 前記方法が、前記対象における前記ＰＧＣ１αのレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記方法が、前記対象において、速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替えをもたらす、請求項１４または１５に記載の組成物。
  17. 対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法において使用するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、前記方法が前記組成物を対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの前記投与が、前記組成物の投与前の性能または表現型と比較して、前記対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、
    前記性能の改善が、
    筋肉収縮性の増加、または
    ランニングから疲労までの試験における性能の改善のうちの１つ以上であり、
    前記表現型の改善が、
    筋線維直径の増加、
    酸化性筋線維の数の増加、
    速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、または
    酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である、組成物。
  18. 対象における肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療する方法において使用するための、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、前記方法が前記組成物を前記対象に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記組成物の投与が、前記ｒＡＡＶの投与前のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加が、前記対象の性能または表現型の増加を示す、組成物。
  19. 前記性能が、
    筋肉収縮性の増加、または
    ランニングから疲労までの試験における性能の改善である、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記表現型が、
    酸化的筋線維の数の増加、
    速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、
    酸化的筋線維の割合の増加、または
    筋線維直径の増加のうちの１つ以上である、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記性能の改善が、最大攣縮反応の少なくとも約２０％の増加であるか、または最大強縮反応の少なくとも約１０％の増加である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記性能の改善が、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、またはランニングから疲労までの試験に対する距離の少なくとも約１００％の増加である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記筋線維が、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む、請求項２０に記載の組成物。
  24. 前記組成物が、筋肉内注射または静脈内注射によって投与される、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含む、組成物。
  26. 前記表現型が、
    酸化的筋線維の数の増加、
    酸化的筋線維の割合の増加、または
    筋線維直径の増加のうちの１つ以上である、請求項１８に記載の組成物。
  27. 前記筋線維が、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む、請求項１７～１９および２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記組成物が、筋肉内注射または静脈内注射による投与のために処方される、請求項１７～１９、２１、２２および２５～２７いずれか一項に記載の組成物。
  29. 肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）の発現を増加させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ１α）レベルの増加をもたらす、使用。
  30. 肢帯型筋ジストロフィー２Ａに罹患している対象においてＰＧＣ１αレベルを増加させるための薬剤の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、前記ｒＡＡＶの投与前の性能または表現型と比較して、前記対象において性能の改善または表現型の改善をもたらし、
    前記性能の改善が、
    筋収縮性の増加、または
    ランニングから疲労までの試験における性能の改善のうちの１つ以上であり、
    前記表現型の改善が、
    筋線維直径の増加、
    酸化的筋線維の数の増加、
    速攣縮解糖（ＦＴＧ）繊維から遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）繊維への切り替え、または
    酸化的筋線維の割合の増加のうちの１つ以上である、使用。
  31. 肢帯型筋ジストロフィー２Ａを治療するための薬剤の調製のための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用であって、前記ｒＡＡＶが、第１のＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、プロモーター、カルパイン３（ＣＡＰＮ３）活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含むポリヌクレオチドを含み、前記ｒＡＡＶの投与が、前記ｒＡＡＶの投与の投与前のＣａｐｎ３ ｍＲＮＡ発現のレベルと比較して、少なくとも１０％のＣａｐｎ３ｍＲＮＡ発現の増加をもたらし、少なくとも１０％の増加が、前記対象における性能または表現型の増加を示す、使用。
  32. 前記性能が
    筋肉収縮性の増加、または
    ランニングから疲労までの試験における性能の改善である、請求項３１に記載の使用。
  33. 前記表現型が、
    酸化的筋線維の数の増加、
    酸化的筋線維の割合の増加、または
    筋線維直径の増加のうちの１つ以上である、請求項３１に記載の使用。
  34. 前記性能の改善が、最大攣縮反応の少なくとも約２０％の増加であるか、または最大強縮反応の少なくとも約１０％の増加である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の使用。
  35. 前記性能の改善が、トレッドミルのランニングから疲労までの試験における少なくとも約７０％の改善、またはランニングから疲労までの試験に対する距離の少なくとも約１００％の増加である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の使用。
  36. 前記筋線維が、遅攣縮酸化的（ＳＴＯ）筋線維、速攣縮酸化的（ＦＴＯ）筋線維、および速攣縮解糖（ＦＴＧ）線維のうちの１つ以上を含む、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の使用。
  37. 前記ｒＡＡＶが、筋肉内注射または静脈内注射によるために処方される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の使用。
  38. ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の方法、組成物または使用。
  39. ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２と少なくとも９５％同一である、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  40. ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号２の配列を含む、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  41. ＣＡＰＮ３活性を有する前記タンパク質が、配列番号５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  42. ＣＡＰＮ３活性を有するタンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  43. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  44. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  45. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列を含む、請求項１４～３７のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  46. 前記プロモーターが、筋特異的プロモーターである、請求項１４～４５のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  47. 前記筋特異的プロモーターが、ヒト骨格アクチン遺伝子要素、心臓アクチン遺伝子要素、デスミンプロモーター、骨格アルファ－アクチン（ＡＳＫＡ）プロモーター、トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモーター、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ結合要素、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター、短縮型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）プロモーター、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）プロモーター、ハイブリッドａ－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）プロモーター、Ｃ５～１２プロモーター、マウスクレアチンキナーゼエンハンサー要素、骨格速攣縮トロポニンｃ遺伝子要素、遅攣縮心臓トロポニンｃ遺伝子要素、遅攣縮トロポニンｉ遺伝子要素、低酸素誘導性核因子（ＨＩＦ）応答要素（ＨＲＥ）、ステロイド誘導性要素、およびグルココルチコイド応答要素（ｇｒｅ）のうちの１つ以上を含む、請求項４６に記載の組成物または使用。
  48. 前記筋特異的プロモーターが、ＭＣＫプロモーター、ｔＭＣＫプロモーター、またはＭＨＣＫ７プロモーターである、請求項４６に記載の組成物または使用。
  49. 前記筋特異的プロモーターが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む短縮型ＭＣＫプロモーターである、請求項４６に記載の組成物または使用。
  50. 前記第１および第２のＡＡＶ逆位末端反復が、ＡＡＶ２逆位末端反復である、請求項１４～４９のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  51. 前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶｒｈ．７４およびＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項１４～５０のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  52. 前記ｒＡＡＶが、ｒｈ．７４キャプシドタンパク質またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む、請求項１４～５０のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  53. 前記対象が、小児対象、青年対象、または若年成人対象である、請求項１４～５２のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  54. 前記対象が、中年成人または高齢対象である、請求項１４～５２のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  55. 前記対象が、４～１５歳である、請求項１４～５２のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  56. 前記対象が、１５～５５歳である、請求項１４～５２のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  57. 前記対象が、５５歳超である、請求項１４～５２のいずれか一項に記載の組成物または使用。
  58. ポリヌクレオチドであって、配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９５％または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
  59. 前記ポリヌクレオチドが、前記配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
  60. 組換えＡＡＶ ｒＡＡＶ．ｔＭＣＫ．ＣＡＰＮ３を生成する方法であって、プラスミドを細胞に移入することを含み、前記プラスミドが、配列番号１３と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、方法。
  61. 前記プラスミドが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記細胞にパッケージングプラスミドおよび／またはヘルパーウイルスを移入することをさらに含む、請求項６０または６１に記載の方法。
  63. 前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｃａｐ遺伝子を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記細胞が、安定に組み込まれたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含む、請求項６０５～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 細胞であって、配列番号１３と少なくとも９０％、９５％、または９９％同一であるヌクレオチド配列を含むプラスミドを含む、細胞。
  66. 前記プラスミドが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項６５に記載の細胞。
  67. 配列番号１３のヌクレオチド配列を含む、請求項６５または６６に記載の細胞。
  68. 前記細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、蚊細胞、または哺乳動物細胞である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の細胞。
  69. 前記細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の細胞。
  70. 前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞またはヨトウガ（Ｓｆ９）昆虫細胞である、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の細胞。
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