EA045762B1 - Продукты на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов и способы для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2а - Google Patents

Продукты на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов и способы для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2а Download PDF

Info

Publication number
EA045762B1
EA045762B1 EA202190155 EA045762B1 EA 045762 B1 EA045762 B1 EA 045762B1 EA 202190155 EA202190155 EA 202190155 EA 045762 B1 EA045762 B1 EA 045762B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
aav
muscle
capn3
raav
weeks
Prior art date
Application number
EA202190155
Other languages
English (en)
Inventor
Зариф Саенк
Original Assignee
Рисерч Инститьют Эт Нэшнуайд Чилдрен'С Хоспитал
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Рисерч Инститьют Эт Нэшнуайд Чилдрен'С Хоспитал filed Critical Рисерч Инститьют Эт Нэшнуайд Чилдрен'С Хоспитал
Publication of EA045762B1 publication Critical patent/EA045762B1/ru

Links

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №
62/691934, поданной 29 июня 2018 г., и предварительной заявке на патент США № 62/865081, поданной июня 2019 г., обе из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Область техники
В данном документе предусмотрены продукты и способы для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А. В данных способах рекомбинантные аденоассоциированные вирусы доставляют ДНК, кодирующую белок, обладающий активностью кальпаина-3 (CAPN3).
Включение перечня последовательностей посредством ссылки
Настоящая заявка содержит в качестве отдельной части настоящего раскрытия перечень последовательностей в машиночитаемой форме (название файла: 52684P2_SeqListing.txt; 23755 байтов - текстовый файл в формате ASCII, созданный 26 июня 2019 г.), который включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Предпосылки изобретения
Формы мышечной дистрофии (MD) представляют собой группу генетических заболеваний. Данная группа характеризуется прогрессирующей слабостью и дегенерацией скелетных мышц, контролирующих движения. Некоторые формы MD развиваются в младенчестве или детстве, тогда как другие могут не проявляться до достижения зрелого или более позднего возраста. Данные нарушения различаются по распределению и степени мышечной слабости (некоторые формы MD также поражают сердечную мышцу), возрасту начала проявления заболевания, скорости прогрессирования и типу наследования.
Одна группа MD представляет собой группу тазово-плечевых MD (LGMD). LGMD являются редкими состояниями и проявляются по-разному у разных людей в том, что касается возраста начала проявления заболевания, областей мышечной слабости, вовлечения сердца и дыхательной системы, скорости прогрессирования и степени тяжести. LGMD могут начинаться в детском возрасте, подростковом возрасте, в раннем зрелом возрасте или даже позже. Представители обоих полов поражаются в равной степени. LGMD обуславливают слабость мышц плечевого и тазового пояса, при этом близлежащие мышцы бедер и плеч также иногда со временем слабеют. Слабость мышц ног часто появляется раньше слабости мышц рук. Лицевые мышцы обычно не поражаются. С прогрессированием состояния у людей могут появляться проблемы с ходьбой, и со временем для них может стать необходимым использование инвалидной коляски. Вовлечение мышц плечевого пояса и рук может приводить к трудностям при поднимании рук над головой и поднятии предметов. При некоторых типах LGMD могут вовлекаться сердечная и дыхательные мышцы.
Существует по меньшей мере девятнадцать форм LGMD, и эти формы классифицируют по генетическим дефектам, ассоциированным с ними.
Тип Тип наследования Ген или хромосома
LGMD1A Аутосомно-доминантный Ген миотилина
LGMD1B Аутосомно-доминантный Ген ламина А/С
LGMDIC Аутосомно-доминантный Ген кавеолина
LGMD1D Аутосомно-доминантный Хромосома 7
LGMD1E Аутосомно-доминантный Ген десмина
LGMD1F Аутосомно-доминантный Хромосома 7
LGMD1G Аутосомно-доминантный Хромосома 4
LGMD2A Аутосомно-рецессивный Ген кальпаина-3
LGMD2B Аутосомно-рецессивный Ген дисферлина
LGMD2C Аутосомно-рецессивный Ген гамма-саркогликана
LGMD2D Аутосомно-рецессивный Ген альфа-саркогликана
LGMD2E Аутосомно-рецессивный Ген бета-саркогликана
LGMD2F Аутосомно-рецессивный Ген дельта-саркогликана
LGMD2G Аутосомно-рецессивный Ген телетонина
LGMD2H Аутосомно-рецессивный TRIM32
LGMD2I Аутосомно-рецессивный Ген FKRP
LGMD2J Аутосомно-рецессивный Ген титина
LGMD2K Аутосомно-рецессивный Ген РОМТ1
LGMD2L Аутосомно-рецессивный Ген фукутина
Специализированные тесты для выявления LGMD в настоящее время являются доступными в рамках национальной программы диагностики Национальной группы, отвечающей за внедрение медицинских услуг (NCG).
Мутации в гене кальпаина-3 (CAPN3) приводят к развитию LGMD2A - одной из наиболее распространенных форм тазово-плечевой мышечной дистрофии во всем мире. В настоящее время лечения этого наследственного заболевания не существует. Предыдущие исследования продемонстрировали возможную перспективу переноса гена CAPN3 для коррекции патологических признаков у мышей с дефицитом CAPN3. Однако экспрессия CAPN3, управляемая промотором гена десмина, приводила к кардиотоксич- 1 045762 ности [Bartoli et al., Mol. Ther., 13: 250-259 (2006)]. В ходе проспективных исследований изучали экспрессию данного гена в скелетных мышцах [Roudaut et al., Circulation, 128: 1094-1104 (2013)].
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой парвовирус, дефектный по репликации, однонитевой ДНК-геном которого имеет длину приблизительно 4,7 т. п. о., включая два инвертированных концевых повтора (ITR) длиной 145 нуклеотидов. Существует несколько серотипов AAV. Известны нуклеотидные последовательности геномов серотипов AAV. Например, полный геном AAV-1 представлен под номером доступа в GenBank NC_002077; полный геном AAV-2 представлен под номером доступа в GenBank NC_001401 и в Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983); полный геном AAV-3 представлен под номером доступа в GenBank NC_1829; полный геном AAV-4 представлен под номером доступа в GenBank NC_001829; геном AAV-5 представлен под номером доступа в GenBank AF085716; полный геном AAV-6 представлен под номером доступа в GenBank NC_001862; по меньшей мере части геномов AAV-7 и AAV-8 представлены под номерами доступа в GenBank AX753246 и АХ753249 соответственно; геном AAV-9 представлен в Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); геном AAV-10 представлен в Mol. Ther., 73(1): 67-76 (2006); и геном AAV-11 представлен в Virology, 330(2): 375-383 (2004). Последовательность генома AAV-rh.74 представлена в патенте США № 9434928, включенном в данный документ посредством ссылки. Цис-действующие последовательности, управляющие репликацией вирусной ДНК (rep), капсидированием/упаковкой и интеграцией в хромосому клетки-хозяина, содержатся в ITR AAV. Три промотора AAV (называемые р5, р19 и р40 по их относительным местоположениям на карте) управляют экспрессией двух внутренних открытых рамок считывания AAV, кодирующих гены rep и cap. Два промотора rep (p5 и р19) в сочетании с дифференциальным сплайсингом одного интрона AAV (в нуклеотидах 2107 и 2227) приводят к продуцированию четырех белков rep (rep 78, rep 68, rep 52 и rep 40) из гена rep. Белки rep обладают несколькими ферментативными свойствами, которые в конечном счете отвечают за репликацию вирусного генома. Ген cap экспрессируется под управлением промотора р40, и он кодирует три капсидных белка VP1, VP2 и VP3. Альтернативный сплайсинг и неконсенсусные сайты начала трансляции отвечают за продуцирование трех родственных капсидных белков. Один консенсусный сайт полиаденилирования расположен в положении 95 на карте генома AAV. Обзор жизненного цикла и генетических особенностей AAV представлен в Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
AAV обладает уникальными признаками, которые делают его привлекательным в качестве вектора для доставки чужеродной ДНК в клетки, например, при генной терапии. Инфицирование клеток в культуре с помощью AAV является нецитопатическим, а естественное инфицирование людей и других животных является скрытым и бессимптомным. Более того, AAV инфицирует многие клетки млекопитающих, что обеспечивает возможность нацеливания на многие различные ткани in vivo. Более того, AAV трансдуцирует медленно делящиеся и неделящиеся клетки и может персистировать по сути на протяжении всей жизни этих клеток в качестве транскрипционно активной ядерной эписомы (внехромосомного элемента). Провирусный геном AAV вставляют в виде клонированной ДНК в плазмиды, что делает осуществимым конструирование рекомбинантных геномов. Кроме того, поскольку сигналы, управляющие репликацией AAV и капсидированием генома, содержатся в ITR генома AAV, внутренняя часть генома, составляющая примерно 4,3 т. п. о. (кодирующая белки репликации и структурные капсидные белки repcap), может быть частично или полностью заменена чужеродной ДНК. Для получения векторов на основе AAV белки rep и cap могут предоставляться в трансположении. Еще одним важным признаком AAV является то, что он является чрезвычайно стабильным и стойким вирусом. Он легко выдерживает условия, используемые для инактивации аденовируса (от 56 до 65°С в течение нескольких часов), что делает холодильное хранение AAV менее критически важным. AAV можно даже лиофилизировать. Наконец, клетки, инфицированные AAV, не являются устойчивыми к суперинфекции.
В данной области техники остается необходимость в методах лечения LGMD2A.
Краткое описание изобретения
В данном документе предусмотрены способы и продукты для доставки ДНК, кодирующей белок, обладающий активностью кальпаина-3 (CAPN3). Такие способы и продукты можно применять для лечения различных заболеваний, например, LGMD2A.
Предусмотрены рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV), кодирующие белок, обладающий активностью кальпаина-3 (CAPN3). Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы содержат полинуклеотид, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью CAPN3. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, обладающий активностью CAPN3, например, является на по меньшей мере 90% идентичной SEQ ID NO: 2 или содержит последовательность под SEQ ID NO: 2.
Например, предусмотренный rAAV содержит полинуклеотид, который содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR) AAV, промотор, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью кальпаина-3 (CAPN3), и второй ITR AAV. Нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, обладающий активностью CAPN3, например, является на по меньшей мере 90% идентичной SEQ ID NO: 2 или на по меньшей мере 91% идентичной SEQ ID NO: 2, на по меньшей мере 92% идентичной SEQ ID NO: 2, на по меньшей мере 93% идентичной SEQ ID NO: 2, на по меньшей
- 2 045762 мере 94% идентичной SEQ ID NO: 2, на по меньшей мере 95% идентичной SEQ ID NO: 2, на по меньшей мере 96% идентичной SEQ ID NO: 2, на по меньшей мере 97% идентичной SEQ ID NO: 2, на по меньшей мере 98% идентичной SEQ ID NO: 2 или на по меньшей мере 99% идентичной SEQ ID NO: 2. rAAV со держит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью CAPN3, содержащую последовательность под SEQ ID NO: 2.
Кроме того, предусмотренный rAAV содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью CAPN3, который содержит аминокислотную последовательность, являющуюся на по меньшей мере 90% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 91% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 92% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 93% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 94% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 95% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 96% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 97% идентичной SEQ ID NO: 7, на по меньшей мере 98% идентичной SEQ ID NO: 7 или на по меньшей мере 99% идентичной SEQ ID NO: 7. rAAV содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью CAPN3, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7.
Предусмотренные rAAV содержат полинуклеотидную последовательность, являющуюся на по меньшей мере 90% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 91% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 92% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 93% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 94% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 95% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 96% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 97% идентичной SEQ ID NO: 1, на по меньшей мере 98% идентичной SEQ ID NO: 1 или на по меньшей мере 99% идентичной SEQ ID NO: 1. rAAV содержит полинуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность находится под транскрипционным контролем промотора, специфичного для мышц. Например, промотор, специфичный для мышц, содержит один или более из элемента гена скелетномышечного актина человека, элемента гена сердечного актина, промотора гена десмина, промотора гена скелетномышечного альфа-актина (ASKA), промотора гена тропонина I (TNNI2), связывающего элемента для миоцит-специфического энхансерного связывающего фактора mef, промотора гена мышечной креатинкиназы (MCK), усеченного промотора гена MCK (tMCK), промотора гена тяжелой цепи миозина (МНС), гибридного промотора, представляющего собой энхансер гена тяжелой цепи а-миозина/тандем энхансер-промотор гена MCK (MHCK7), промотора С5-12, энхансерного элемента гена креатинкиназы мыши, элемента гена тропонина С быстро сокращающихся волокон скелетных мышц, элемента гена тропонина С медленно сокращающихся волокон сердечной мышцы, элемента гена тропонина I медленно сокращающихся волокон, элемента, отвечающего на ядерный фактор, индуцируемый гипоксией (HIF) (HRE), стероид-индуцируемого элемента и глюкокортикоид-отвечающего элемента (gre). В одном варианте осуществления промотор, специфичный для мышц, представляет собой промотор tMCK, который содержит последовательность под SEQ ID NO: 3.
Например, rAAV содержит полинуклеотид, который в одном варианте осуществления содержит первый инвертированный концевой повтор AAV (ITR), промотор tMCK, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью кальпаина-3, и второй инвертированный концевой повтор AAV (ITR). ITR AAV (например, первый и/или второй ITR AAV) представляет собой, например, инвертированный концевой повтор AAV2. Капсидные белки rAAV включают в себя, например, капсидный белок AAV-rh.74 или капсидный белок AAV9.
Предусмотренный rAAV содержит один или более из капсидных белков AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-rh.74 и AAVrh.10.
В другом варианте осуществления предусмотрены композиции, содержащие любой из раскрытых rAAV. Например, композиции составлены для внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции.
Также предусмотрены способы лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества любого из раскрытых rAAV или любой композиции, содержащей раскрытый rAAV. В любом из предусмотренных способов rAAV вводят путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции.
Например, в этих способах лечение приводит к одному или более из (а) увеличения диаметра мышечных волокон, (b) уменьшения количества мелких дольчатых мышечных волокон, (с) уменьшения количества волокон с внутренними ядрами, (d) уменьшения содержания эндомизиальной соединительной ткани, (е) коррекции мышечной атрофии и (f) увеличения формирования мышечной силы. Мышечное волокно, на которое воздействует лечение, включает в себя одно или более из медленно сокращающегося окислительного (STO) мышечного волокна, быстро сокращающегося окислительного (FTO) мышечного волокна и быстро сокращающегося гликолитического (FTG) волокна.
Кроме того, в любом из предусмотренных способов лечение приводит к одному или более из (а) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, или 35%, или 40% уменьшения общего количества мышечных волокон на мм2 через 4 недели после введения; (b) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон через 4 недели после введения; (с) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 42% уменьшения количества мышечных волокон STO на мм2 через 4 не- 3 045762 дели после введения; (d) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон STO через 4 недели после введения; (е) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% уменьшения количества мышечных волокон FTO на мм2 через 4 недели после введения; (f) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% увеличения диаметра мышечных волокон FTO через 4 недели после введения; (g) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или 35% уменьшения количества мышечных волокон FTG на мм2 через 4 недели после введения и (h) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон FTG через 4 недели после введения.
В любом из предусмотренных способов сердечная мышца субъекта демонстрирует минимальный или низкий уровень белка кальпаина-3, экспрессирующегося из любого из предусмотренных rAAV или композиции, содержащей любой из предусмотренных rAAV. Мышечное волокно, на которое воздействует лечение с помощью композиции, включает в себя одно или более из медленно сокращающегося окислительного (STO) мышечного волокна, быстро сокращающегося окислительного (FTO) мышечного волокна и быстро сокращающегося гликолитического (FTG) волокна.
Предусмотрены композиции для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А, содержащие терапевтически эффективное количество любого из раскрытых rAAV или композиции, содержащей любой из раскрытых rAAV. Данные композиции для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А составлены для введения путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции. Кроме того, лечение с помощью любой из раскрытых композиций для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А приводит к одному или более из: (а) увеличения диаметра мышечных волокон, (b) уменьшения количества мелких дольчатых мышечных волокон, (с) уменьшения количества волокон с внутренними ядрами, (d) уменьшения содержания эндомизиальной соединительной ткани, (е) коррекции мышечной атрофии и (f) увеличения формирования мышечной силы. Мышечное волокно, на которое воздействует лечение с помощью композиции, включает в себя одно или более из медленно сокращающегося окислительного (STO) мышечного волокна, быстро сокращающегося окислительного (FTO) мышечного волокна и быстро сокращающегося гликолитического (FTG) волокна.
Кроме того, лечение с помощью любой из раскрытых композиций для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А приводит к одному или более из: (а) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, или 35%, или 40% уменьшения общего количества мышечных волокон на мм2 через 4 недели после введения; (b) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон через 4 недели после введения; (с) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 42% уменьшения количества мышечных волокон STO на мм2 через 4 недели после введения; (d) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон STO через 4 недели после введения; (е) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% уменьшения количества мышечных волокон FTO на мм2 через 4 недели после введения; (f) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% увеличения диаметра мышечных волокон FTO через 4 недели после введения; (g) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или 35% уменьшения количества мышечных волокон FTG на мм2 через 4 недели после введения и (h) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон FTG через 4 недели после введения.
Более того, лечение с помощью любой из предусмотренных композиций для лечения тазовоплечевой мышечной дистрофии типа 2А приводит к тому, что сердечная мышца субъекта демонстрирует минимальный или низкий уровень белка кальпаина-3, экспрессирующегося из любого из предусмотренных rAAV или композиции, содержащей любой из предусмотренных rAAV. После введения rAAV сердечная мышца демонстрирует отсутствие токсического эффекта, например, воспаления, некроза и/или регенерации, или небольшой таковой эффект.
В настоящем изобретении также предусмотрено применение терапевтически эффективного количества любого из раскрытых rAAV или композиции, содержащей любой из раскрытых rAAV, для получения лекарственного препарата для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А. Например, лекарственный препарат составляют для введения путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции.
В любом из путей применения лечение с помощью лекарственного препарата приводит к одному или более из: (а) увеличения диаметра мышечных волокон, (b) уменьшения количества мелких дольчатых мышечных волокон, (с) уменьшения количества волокон с внутренними ядрами, (d) уменьшения содержания эндомизиальной соединительной ткани, (е) коррекции мышечной атрофии и (f) увеличения формирования мышечной силы. Мышечное волокно, на которое воздействует лечение с помощью лекарственного препарата, представляет собой одно или более из медленно сокращающегося окислительного (STO) мышечного волокна, быстро сокращающегося окислительного (FTO) мышечного волокна и быстро сокращающегося гликолитического (FTG) волокна.
Кроме того, в любом из путей применения терапевтически эффективного количества любого из раскрытых rAAV или предусмотренной композиции лечение с помощью лекарственного препарата приводит к одному или более из: (а) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, или 35%, или 40% уменьшения общего количества мышечных волокон на мм2 через 4 недели после введения; (b) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон через 4 недели после
- 4 045762 введения; (с) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 42% уменьшения количества мышечных волокон STO на мм2 через 4 недели после введения; (d) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон STO через 4 недели после введения; (е) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% уменьшения количества мышечных волокон FTO на мм2 через 4 недели после введения; (f) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% увеличения диаметра мышечных волокон FTO через 4 недели после введения; (g) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или 35% уменьшения количества мышечных волокон FTG на мм2 через 4 недели после введения и (h) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон FTG через 4 недели после введения.
В любом из путей применения терапевтически эффективного количества любого из раскрытых rAAV или предусмотренной композиции после лечения с помощью лекарственного препарата сердечная мышца субъекта демонстрирует отсутствие или минимальный или низкий уровень белка кальпаина-3, экспрессирующегося из раскрытых продуктов или раскрытой композиции.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1A-1F показано, что генная терапия приводила к восстановлению нарушенной регенерации в мышце CAPN3-KO. На фиг. 1А показано схематическое изображение однонитевого rAAV AAV9.CAPN3. Между однонитевыми 5'- и 3'-ITR (инвертированными концевыми повторами) находится промотор гена мышечной креатинкиназы (MCK) (563 п. о.), который управляет экспрессией открытой рамки считывания CAPN3 (2466 п. о.). Также обозначен сайт полиаденилирования (поли(А), 53 п. о.). В передние большеберцовые (ТА) мышцы мышей CAPN3-KO вначале инъецировали СТХ, а через 2 недели 1x1011 в. г. AAV.CAPN3 в левую ТА (фиг. 1В) или PBS в правую ТА (фиг. 1C). Через четыре недели после инъекции rAAV диаметр мышцы увеличивался, и дольчатые волокна встречались менее часто по сравнению с мышцей CAPN3-KO, не подвергнутой обработке. На фиг. 1D, где представлены дольчатые волокна с паттерном субсарколеммальных органелл, распределение митохондрий (показано стрелками) позволяет предположить частичное слияние мышечных трубочек в не подвергнутой обработке мышце CAPN3-KO при более сильном увеличении. Масштабная метка=20 мкм для B-D. На фиг. 1E гистограммы распределения мышечных волокон по размеру (среднее значение ± SEM/мм2 площади; данные получены от 3 мышей в каждой группе) в подвергнутых обработке и не подвергнутых обработке мышцах ТА мышей CAPN3-KO демонстрируют сдвиг в сторону волокон большего диаметра при обработке и увеличение субпопуляции с малым диаметром, имеющейся в группе, не подвергнутой обработке. На фиг. 1F гистограммы распределения медленно сокращающихся окислительных (STO) волокон по размеру демонстрируют большее количество тонких волокон (например, волокон с диаметром, равным 30 мкм или меньше) в не подвергнутой обработке мышце CAPN3-KO по сравнению с подвергнутой обработке мышцей CAPN3-KO.
На фиг. 2 показано схематическое изображение rAAV по настоящему изобретению, называемого AAVrh.74.tMCK.CAPN3.
На фиг. 3А-3В представлены данные вестерн-блоттинга (панель А) и RT-PCR (панель В) после введения AAVrh.74.tMCK.CAPN3 посредством внутримышечной инъекции (1Е11 в. г.) и системной инъекции (3Е12 в. г. и 6Е12 в. г.). Эти данные сравнивали с лизатом нормальных мышц человека (загрузка в гель 60% общего белка по сравнению с лизатами от мышей) и не подвергнутых обработке мышей CAPN3-KO.
На фиг. 4 представлены иллюстративные изображения срезов ткани мышц CAPN3-KO (подвергнутых инъекции гена AAV.hCAPN3 и не подвергнутых обработке) и мышц ТА дикого типа (WT), окрашенных SDH. Средний размер волокна для медленно сокращающихся окислительных (STO, темные), быстро сокращающихся окислительных (FTO, промежуточные) и быстро сокращающихся гликолитических (FTG, светлые) волокон в мышце ТА мышей, подвергнутых обработке с помощью AAVrh.74.tMCK.CAPN3, выглядел нормализованным до значений для WT. Размеры волокон в зависимости от типа при наличии и в отсутствие обработки проиллюстрированы в табл. 4.
На фиг. 5 представлены относительные уровни экспрессии белка CAPN3, показанные в мышцах WT (Z18-14) и ТА для когорты, получавшей низкую дозу (3Е12 в. г., Z18-13, Z18-15, Z18-16, Z18-17, Z18-18), и икроножной мышце (икроножная), сердечной мышце, четырехглавой мышце, передней большеберцовой мышце (ТА) и трехглавой мышце для когорты, получавшей высокую дозу (6Е12 в. г., Z1820, Z18-21, Z18-23, Z18-24, Z18-22) (UT: не подвергнутые обработке).
На фиг. 6 представлено число копий вектора AAVrh74.tMCK.hCAPN3/мкг геномной ДНК в когорте, получавшей высокую дозу 6Е12 векторных геномов посредством системного введения, в следующих мышцах: четырехглавой (четырехглавая), сердечной, передней большеберцовой (ТА), икроножной (икроножная), трехглавой, а также в печени.
На фиг. 7 представлены средние значения диаметра волокна для медленно сокращающихся окислительных (STO, темные), быстро сокращающихся окислительных (FTO, промежуточные) и быстро сокращающихся гликолитических (FTG, светлые) волокон левой мышцы ТА после системного введения 3Е12 и 6Е12 в. г. AAVrh.74.tMCK.CAPN3. Были включены данные от не подвергнутых обработке мышей CAPN3-KO и WT.
На фиг. 8 представлены данные теста бега до изнеможения. На фиг. 8А представлены данные для
- 5 045762 когорты, получавшей низкую дозу, которая получала 3Е12 в. г. AAVrh.74.tMCK.CAPN3, и когорты, получавшей высокую дозу, которая получала 6Е12 в. г. AAVrh.74.tMCK.CAPN3, через 4 недели после системного введения. Мыши CAPN3-KO, подвергнутые обработке, показали лучшие результаты в тесте бега до изнеможения по сравнению с соответствующими животными, не подвергнутыми обработке. На фиг. 8В представлены данные для когорты, получавшей высокую дозу, в которой мышей тестировали через 20-24 недели после системного введения 6Е12 в. г. AAVrh.74.tMCK.CAPN3 (n=5), и соответствующих животных, не подвергнутых обработке (n=16).
На фиг. 9 представлены свежезамороженные срезы левых желудочков, окрашенные гематоксилином и эозином (Н&Е), из иллюстративных образцов сердца от мышей CAPN3-KO через 4 недели после системной инъекции вектора AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 в дозах 3Е12 в. г. и 6Е12 в. г. и соответствующих контрольных животных, не подвергнутых обработке.
На фиг. 10 представлены результаты вестерн-блот-анализа образцов ткани сердца из когорты, получавшей высокую дозу (которая получала 6Е12 в. г. AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3). Данный анализ показал отсутствие или минимальное выявляемое количество белка кальпаина-3 в сердце животного, подвергнутого обработке. Под идентификационными номерами животных Z18-19 и 22 представлены лизаты от мышей CAPN3-KO, не подвергнутых обработке.
Подробное описание
Рекомбинантные AAV (rAAV), предусмотренные в данном документе, содержат полинуклеотид, который содержит первый инвертированный концевой повтор (ITR) AAV, промотор, нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью кальпаина-3 (CAPN3), и второй ITR AAV. В одном варианте осуществления нуклеотид кодирует CAPN3. Варианты осуществления включают без ограничения rAAV, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую CAPN3 или белок, обладающий активностью CAPN3, где нуклеотидная последовательность является на по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89% идентичной нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 2. Дополнительные варианты осуществления включают, также без ограничения, rAAV, содержащий нуклеотидную последовательность, являющуюся на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичной нуклеотидной последовательности, представленной под SEQ ID NO: 2, и кодирующую полипептид, обладающий протеолитической активностью CAPN3. Протеолитическая активность CAPN3 понимается в данной области техники как активность протеолиза потенциальных субстратов, таких как фодрин и HSP60, и/или активность аутолитического саморасщепления. Таким образом, используемый в данном документе термин белок, обладающий активностью кальпаина-3 (CAPN3), относится к белку, обладающему протеолитической активностью CAPN3, которая включает без ограничения активность протеолиза потенциальных субстратов, таких как фодрин и HSP60, и/или активность аутолитического саморасщепления. Белок, обладающий активностью CAPN3, может обладать полной или частичной активностью полноразмерного белка кальпаина-3. В одном варианте осуществления белок, обладающий активностью CAPN3, обладает по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% активности полноразмерного белка CAPN3. В другом варианте осуществления белок, обладающий активностью CAPN3, содержит аминокислотную последовательность, являющуюся на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, обладающий активностью CAPN3, содержит последовательность под SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления белок, обладающий активностью CAPN3, содержит аминокислотную последовательность, являющуюся на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления белок, обладающий активностью CAPN3, содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7. В другом варианте осуществления полинуклеотид rAAV содержит последовательность, являющуюся на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность, являющуюся на по меньшей мере 95% идентичной SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность под SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте в данном документе описан рекомбинантный AAV, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, обладающий активностью CAPN3, и/или которая содержит нуклеотидную последовательность, гибридизирующуюся в жестких условиях с последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 2 или комплементарной ей последовательностью. Термин жесткие используется по отношению к условиям, которые часто понимаются в данной области техники как жесткие. Жесткость условий гибридизации определяется преимущественно температурой, ионной силой и концентрацией денатурирующих средств, таких как формамид. Примерами жестких условий гибридизации и отмывки являются 0,015 М хлорид натрия, 0,0015 М цитрат натрия при 65-68°С или 0,015 М хлорид натрия, 0,0015 М цитрат натрия и 50% формамид при 42°С. См. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).
В рекомбинантных геномах, описанных в данном документе, полинуклеотид CAPN3 функциональ
- 6 045762 но связан с элементами, контролирующими транскрипцию (включающими без ограничения промоторы, энхансеры и/или интроны), в частности, элементами, контролирующими транскрипцию, являющимися функциональными в клетках-мишенях, представляющих интерес. Например, в различных вариантах осуществления предусмотрены способы трансдукции мышечных клеток с использованием элементов, контролирующих транскрипцию, специфичных для мышц, включающих без ограничения элементы, полученные из семейств генов актина и миозина, как, например, из семейства генов myoD [см. Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], миоцит-специфический энхансерный связывающий фактор MEF-2 [Cserjesi и Olson, Mol Cell Biol, 11: 4854-4862 (1991)], контролирующие элементы, полученные из гена скелетномышечного актина человека [Muscat et al, Mol Cell Biol, 7: 4089-4099 (1987)], элементы последовательности гена мышечной креатинкиназы [см. Johnson et al, Mol Cell Biol, 9:3393-3399 (1989)] и энхансерный элемент гена креатинкиназы мыши (mCK), контролирующие элементы, полученные из гена тропонина С быстро сокращающихся волокон скелетных мышц, гена тропонина С медленно сокращающихся волокон сердечной мышцы и гена тропонина I медленно сокращающихся волокон; ядерные факторы, индуцируемые гипоксией [Semenza et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88: 5680-5684 (1991)], стероидиндуцируемые элементы, а также промоторы, содержащие глюкокортикоид-отвечающий элемент (GRE) [см. Mader and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5603-5607 (1993)], промотор tMCK [cm. Wang et al., Gene Therapy, 15: 1489-1499 (2008)], промотор CK6 [см. Wang et al., выше] и другие контролирующие элементы. В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, обладающий активностью кальпаина-3 (CAPN3), функционально связана с промотором, специфичным для мышц. В одном варианте осуществления промотор, специфичный для мышц, содержит один или более из элемента гена скелетномышечного актина человека, элемента гена сердечного актина, промотора гена десмина, промотора гена скелетномышечного альфа-актина (ASKA), промотора гена тропонина I (TNNI2), связывающего элемента для миоцит-специфического энхансерного связывающего фактора mef, промотора гена мышечной креатинкиназы (MCK), усеченного промотора гена MCK (tMCK), промотора гена тяжелой цепи миозина (МНС), гибридного промотора, представляющего собой энхансер гена тяжелой цепи а-миозина/тандем энхансер-промотор гена MCK (MHCK7), промотора С5-12, энхансерного элемента гена креатинкиназы мыши, элемента гена тропонина С быстро сокращающихся волокон скелетных мышц, элемента гена тропонина С медленно сокращающихся волокон сердечной мышцы, элемента гена тропонина I медленно сокращающихся волокон, элемента, отвечающего на ядерный фактор, индуцируемый гипоксией (HIF) (HRE), стероид-индуцируемого элемента, глюкокортикоид-отвечающего элемента (gre). В другом варианте осуществления промотор, специфичный для мышц, представляет собой промотор MCK, промотор tMCK или промотор MHCK7. В некоторых вариантах осуществления промотор, специфичный для мышц, представляет собой tMCK, который содержит нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 3.
Предыдущие исследования продемонстрировали, что экспрессия CAPN3, управляемая промотором гена десмина, приводила к кардиотоксичности. В ходе проспективных исследований было показано, что избирательная экспрессия гена в скелетных мышцах приводила к устранению пороков сердца. Геномы AAV, раскрытые в данном документе, содержат промотор tMCK, специфичный для мышц, для ограничения экспрессии CAPN3 скелетными мышцами и продемонстрировали отсутствие кардиотоксичности после системной доставки вируса в дозе 6Е12 в. г. (в два раза превышающей предлагаемую исходную высокую дозу) через 4 недели после инъекции гена.
В геномах rAAV, описанных в данном документе, отсутствует ДНК rep и cap AAV. Предусмотренные геномы rAAV содержат полинуклеотид CAPN3, описанный выше, и один или более ITR AAV, фланкирующих полинуклеотид. ДНК AAV в геномах rAAV может быть получена из любого серотипа AAV, для которого может быть получен рекомбинантный вирус, в том числе без ограничения из серотипов AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV12, AAV-13, AAV-rh.74 и AAV-rh.10. Также рассматриваются другие типы вариантов rAAV, например, rAAV с мутациями капсидных белков. См., например, Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Как отмечено в разделе Предпосылки изобретения выше, нуклеотидные последовательности геномов различных серотипов AAV известны из уровня техники. Для содействия экспрессии, специфичной для скелетных мышц, можно использовать AAV1, AAV5, AAV6, AAV8 или AAV9.
Предусмотренные ДНК-плазмиды содержат геномы rAAV. ДНК-плазмиды переносят в клетки, допускающие инфицирование вирусом-помощником AAV (в том числе без ограничения аденовирусом, аденовирусом с делецией Е1 или вирусом герпеса), для сборки генома rAAV в виде инфекционных вирусных частиц. Методики получения частиц rAAV, в рамках которых геном AAV, подлежащий упаковке, гены rep и cap и функциональные элементы вируса-помощника предоставляются клетке, являются стандартными в данной области техники. Для получения rAAV требуется, чтобы в одной клетке (называемой в данном документе пакующей клеткой) присутствовали следующие компоненты: геном rAAV, гены rep и cap AAV, отделенные от генома rAAV (т.е. не находящиеся в нем), и функциональные элементы вируса-помощника. ITR и гены rep и cap AAV могут быть получены из любого серотипа AAV, для которого может быть получен рекомбинантный вирус, и могут быть получены из серотипа AAV, отличного от серотипа для ITR генома rAAV, в том числе без ограничения из серотипов AAV AAV-1, AAV-2,
- 7 045762
AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-rh.10 и AAV-rh.74. Получение псевдотипированного rAAV раскрыто, например, в WO 01/83692, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Таким образом, в одном варианте осуществления rAAV содержит один или более из капсидных белков AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-rh.74 или AAV-rh. 10. В другом варианте осуществления rAAV содержит капсидный белок AAV-rh.74 или капсидный белок AAV9.
Способ получения пакующей клетки заключается в создании клеточной линии, которая стабильно экспрессирует все необходимые компоненты для продуцирования частиц AAV. Например, плазмиду (или несколько плазмид), содержащую геном rAAV, в котором отсутствуют гены rep и cap AAV, гены rep и cap AAV, отделенные от генома rAAV, и селектируемый маркер, такой как ген устойчивости к неомицину, интегрируют в геном клетки. Геномы AAV вводили в бактериальные плазмиды с помощью процедур, таких как образование GC-хвостов [Samulski et al., Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081 (1982)], добавление синтетических линкеров, содержащих сайты расщепления рестрикционной эндонуклеазой [Laughlin et al., Gene, 23:65-73 (1983)], или путем прямого лигирования тупых концов [Senapathy & Carter, J. Bioh Chem., 259:4661-4666 (1984)]. Затем пакующую клеточную линию инфицируют вирусом-помощником, таким как аденовирус. Преимущества этого способа заключаются в том, что клетки могут быть подвергнуты отбору и подходят для крупномасштабного получения rAAV. В других примерах подходящих способов используют аденовирус или бакуловирус, а не плазмиды, для введения геномов rAAV и/или генов rep и cap в пакующие клетки.
Обзор общих принципов получения rAAV представлен, например, в Carter, Current Opinions in Biotechnology, 1533-1539 (1992) и Muzyczka, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129 (1992). Различные подходы описаны в Ratschin et al., Mol. Cell. Biol., 4:2072 (1984); Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol., 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 7:349 (1988); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989); патенте США № 5173414; WO 95/13365 и соответствующем патенте США № 5658776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US 98/18600; WO 97/09441 (PCT/US 96/14423); WO 97/08298 (PCT/US 96/13872); WO 97/21825 (PCT/US 96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR 96/01064); WO 99/11764; Perrin et al., Vaccine, 13:1244-1250 (1995); Paul et al., Human Gene Therapy, 4:609-615 (1993); Clark et al., Gene Therapy 3:11241132 (1996); патенте США № 5786211; патенте США № 5871982; патенте США № 6258595 и McCarty, Mol. Ther., 76(10): 1648-1656 (2008). Вышеупомянутые документы настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте с особым акцентом на тех разделах документов, которые относятся к получению rAAV.
Таким образом, предусмотрены пакующие клетки, которые продуцируют инфекционный rAAV. В одном варианте осуществления пакующие клетки могут представлять собой стабильно трансформированные раковые клетки, такие как клетки HeLa и клетки PerC.6 (линия, когнатная 293). В другом варианте осуществления пакующие клетки представляют собой клетки, которые не являются трансформированными раковыми клетками, такие как клетки 293 низкого пассажа (клетки почки человеческого плода, трансформированные с помощью Е1 аденовируса), клетки MRC-5 (фибробласты человеческого плода), клетки WI-38 (фибробласты человеческого плода), клетки Vero (клетки почки обезьяны) и клетки FRhL-2 (клетки легкого плода макака-резуса).
Рекомбинантные AAV, предусмотренные в данном документе, являются, таким образом, дефектными по репликации, инфекционными, инкапсидированными вирусными частицами, которые содержат рекомбинантный геном. Примеры включают без ограничения rAAV, содержащий геном, содержащий последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, кодирующую CAPN3, rAAV, содержащий геном, по сути состоящий из последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1, кодирующей CAPN3, и rAAV (называемый AAVrh.74.tMCK.CAPN3), содержащий геном, состоящий из последовательности, представленной под SEQ ID NO: 1, кодирующей CAPN3. В геномах rAAV отсутствует ДНК rep и cap AAV, что означает, что в геноме rAAV между ITR отсутствует ДНК rep или cap AAV.
Последовательность AAVrh.74.tMCK.CAPN3 представлена под SEQ ID NO: 1, в которой ITR AAV2 охватывает нуклеотиды 1-128, промотор tMCK охватывает нуклеотиды 165-884, химерный интрон охватывает нуклеотиды 937-1069, последовательность Козак охватывает нуклеотиды 1101-1106, полинуклеотид CAPN3 охватывает нуклеотиды 1107-3572, сигнал поли(А) охватывает нуклеотиды 3581-3780, и второй ITR AAV2 охватывает нуклеотиды 3850-3977.
rAAV может быть очищен с помощью способов, известных из уровня техники, как, например, с помощью колоночной хроматографии или градиентов хлорида цезия. Способы очистки векторов rAAV от вируса-помощника известны из уровня техники и включают в себя способы, раскрытые, например, в Clark et al., Hum. Gene Ther., 10(6): 1031-1039 (1999); Schnepp and Clark, Methods Mol. Med., 69: 427-443 (2002); патенте США № 6566118 и WO 98/09657.
В другом варианте осуществления предусмотрены композиции, содержащие rAAV, описанный в данном документе. Предусмотренные композиции содержат rAAV в фармацевтически приемлемом носителе. Композиции могут также содержать другие ингредиенты, такие как разбавители и вспомогатель
- 8 045762 ные средства. Приемлемые носители, разбавители и вспомогательные средства являются нетоксичными для получающих их пациентов и предпочтительно являются инертными в используемых дозировках и концентрациях, и они включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат или другие органические кислоты; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота; низкомолекулярные полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, в том числе глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как Tween, плюроники или полиэтиленгликоль (PEG).
Титры rAAV, подлежащего введению в способах, описанных в данном документе, могут варьироваться в зависимости, например, от конкретного rAAV, способа введения, цели лечения, индивидуума и типа(типов) клеток, на которые производится нацеливание, и могут быть определены с помощью способов, стандартных в данной области техники. Титры rAAV могут находиться в диапазоне от приблизительно 1x101°, приблизительно 1x1011, приблизительно 1х1012, приблизительно 1х1013 до приблизительно 1х1014 или больше частиц, устойчивых к ДНКазам (DRP), на мл. Дозировки также могут быть выражены в единицах вирусных геномов (в. г.). Иллюстративные раскрытые дозы включают 1Е11 в. г., 3Е12 в. г. и 6Е12 в. г.
В данном документе рассматриваются способы трансдукции клетки-мишени, такой как мышечная клетка, с помощью rAAV in vivo или in vitro. Способы in vivo включают стадию введения эффективной дозы или нескольких эффективных доз композиции, содержащей rAAV, предусмотренный в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом (например, животному, в том числе без ограничения пациентучеловеку). Если дозу вводят до развития нарушения/заболевания, то введение является профилактическим. Если дозу вводят после развития нарушения/заболевания, то введение является терапевтическим. Эффективная доза представляет собой дозу, которая приводит к уменьшению интенсивности (устранению или ослаблению) по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с нарушением/болезненным состоянием, лечение которого осуществляется, которая приводит к замедлению или предупреждению прогрессирования до нарушения/болезненного состояния, которая приводит к замедлению или предупреждению прогрессирования нарушения/болезненного состояния, которая приводит к уменьшению степени заболевания, которая приводит к ремиссии (частичной или полной) заболевания и/или которая приводит к продлению выживаемости. По сравнению с субъектом до лечения способы, описанные в данном документе, приводят к одному или более из увеличения диаметра мышечных волокон, уменьшения количества мелких дольчатых мышечных волокон, уменьшения количества волокон с внутренними ядрами, уменьшения содержания эндомизиальной соединительной ткани, коррекции мышечной атрофии и увеличения формирования мышечной силы. В одном варианте осуществления мышечное волокно включает в себя одно или более из медленно сокращающегося окислительного (STO) мышечного волокна, быстро сокращающегося окислительного (FTO) мышечного волокна и быстро сокращающегося гликолитического (FTG) волокна. В одном варианте осуществления лечение приводит к одному или более из: (а) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, или 35%, или 40% уменьшения общего количества мышечных волокон на мм2 через 4 недели после введения; (b) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон через 4 недели после введения; (с) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% или 42% уменьшения количества мышечных волокон STO на мм2 через 4 недели после введения; (d) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон STO через 4 недели после введения; (е) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% уменьшения количества мышечных волокон FTO на мм2 через 4 недели после введения; (f) по меньшей мере 5%, 10%, 15% или 20% увеличения диаметра мышечных волокон FTO через 4 недели после введения; (g) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или 35% уменьшения количества мышечных волокон FTG на мм2 через 4 недели после введения и (h) по меньшей мере 5%, 10%, 15%, 20% или 25% увеличения диаметра мышечных волокон FTG через 4 недели после введения. В одном варианте осуществления способ по настоящему изобретению приводит к отсутствию или минимальному или низкому уровню белка кальпаина-3, экспрессирующегося из rAAV, в сердечной мышце субъекта, которому вводили rAAV.
Анализы для изучения этих результатов понятны в данной области техники и/или описаны в примерах в данном документе. В данном документе рассматривается применение способов, описанных в данном документе, для предупреждения или лечения нарушений/заболеваний (например, форм мышечной дистрофии), обусловленных дефектами активности CAPN3 или дефектами экспрессии CAPN3. LGMD2A является примером заболевания, для которого рассматривается предупреждение или лечение согласно способам.
Также рассматриваются виды комбинированной терапии. Комбинация, применяемая в данном документе, включает в себя как одновременное лечение, так и последовательное лечение. В частности, рассматриваются комбинации способов, описанных в данном документе, со стандартными видами медицинского лечения (например, применением кортикостероидов), равно как и комбинации с новыми видами
- 9 045762 терапии.
Введение эффективной дозы композиций можно осуществлять с помощью путей, стандартных в данной области техники, включающих без ограничения внутримышечный, парентеральный, внутривенный, интратекальный, пероральный, трансбуккальный, интраназальный, легочный, внутричерепной, внутрикостный, внутриглазной, ректальный или вагинальный пути. Путь(пути) введения и серотип(серотипы) компонентов AAV в rAAV (в частности, ITR и капсидного белка AAV) могут быть выбраны и/или подобраны специалистом в данной области с учетом инфекции и/или болезненного состояния, лечение которого осуществляется, и клеток/ткани(тканей)-мишеней, которые должны будут экспрессировать CAPN3. В одном варианте осуществления rAAV вводят путем внутримышечной инъекции, внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, подкожной инъекции, накожного введения, интравагинальной инъекции, внутрикожного введения или интраназального введения. В другом варианте осуществления rAAV вводят путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции.
В частности, фактическое введение rAAV, описанного в данном документе, можно осуществлять с помощью любого физического способа, который будет обеспечивать транспортировку рекомбинантного вектора rAAV в ткань-мишень животного. Введение включает без ограничения инъекцию мышцу, кровоток и/или непосредственно в печень. Было продемонстрировано, что простое ресуспендирование rAAV в фосфатно-солевом буферном растворе является достаточным для получения среды-носителя, применимой для экспрессии в мышечной ткани, и не существует каких-либо известных ограничений в отношении носителей или других компонентов, которые можно вводить совместно с rAAV. Капсидные белки rAAV могут быть модифицированы таким образом, чтобы rAAV был нацелен на конкретную ткань-мишень, представляющую интерес, такую как мышца. См., например, WO 02/053703, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки. Фармацевтические композиции могут быть получены в виде инъекционных составов или в виде составов для местного применения, которые подлежат доставке в мышцы путем чрескожного транспорта. Многочисленные составы как для внутримышечной инъекции, так и для чрескожного транспорта были разработаны ранее и могут применяться при практическом осуществлении способов. rAAV можно применять совместно с любым фармацевтически приемлемым носителем для простоты введения и обращения.
Для целей внутримышечной инъекции можно использовать растворы во вспомогательном средстве, таком как кунжутное или арахисовое масло, или в водном пропиленгликоле, а также стерильные водные растворы. Такие водные растворы могут быть при необходимости забуферены, а жидкий разбавитель сначала делают изотоническим с помощью физиологического раствора или глюкозы. Растворы rAAV в виде свободной кислоты (ДНК содержит кислые фосфатные группы) или фармакологически приемлемой соли можно получать в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсию rAAV также можно получать в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. В обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов. В связи с этим все используемые стерильные водные среды можно легко получить посредством стандартных методик, хорошо известных специалистам в данной области.
Фармацевтические формы, подходящие для системного (например, внутривенного) инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного применения. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть текучей до такой степени, чтобы ее можно было легко вводить через шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от загрязняющих воздействий микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов может обеспечиваться различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимеросалом и т.п. Во многих случаях будет предпочтительно включать изотонические средства, например, сахара или хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъекционных композиций может обеспечиваться благодаря использованию средств, замедляющих всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные инъекционные растворы получают путем включения rAAV в требуемом количестве в соответствующий растворитель, при необходимости с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизующей фильтрацией. Обычно дисперсии получают путем включения стерилизованного активного ингредиента в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов в некоторых вариантах осуществления способы получения включают методику вакуумной сушки и/или сублимационной сушки, каждая из которых может обеспечивать получение порошка на основе активного ингредиента и любого дополнитель- 10 045762 ного необходимого ингредиента из их раствора, предварительно подвергнутого стерилизующей фильтрации.
Трансдукцию посредством rAAV также можно выполнять in vitro. В одном варианте осуществления необходимые мышечные клетки-мишени извлекают из организма субъекта, трансдуцируют посредством rAAV и вводят обратно субъекту. В качестве альтернативы, можно использовать сингенные или ксеногенные мышечные клетки, если эти клетки не будут вызывать неприемлемый иммунный ответ у субъекта.
Подходящие способы выполнения трансдукции и введения трансдуцированных клеток обратно субъекту известны из уровня техники. В одном варианте осуществления клетки могут быть подвергнуты трансдукции in vitro посредством объединения rAAV с мышечными клетками, например, в подходящей среде, и скрининга в отношении тех клеток, которые содержат ДНК, представляющую интерес, с помощью традиционных методик, таких как Саузерн-блоттинг и/или ПЦР, или с помощью селектируемых маркеров. Трансдуцированные клетки можно затем составлять в виде фармацевтических композиций, и композицию можно вводить субъекту с помощью различных методик, как, например, путем внутримышечной, внутривенной, подкожной и внутрибрюшинной инъекции или путем инъекции в гладкую и сердечную мышцу с помощью, например, катетера.
Трансдукция клеток посредством rAAV с помощью способов, описанных в данном документе, приводит к устойчивой экспрессии CAPN3 или белка, обладающего активностью CAPN3. Таким образом, предусмотрены способы введения rAAV, который экспрессирует CAPN3 или белок, обладающий активностью CAPN3, субъекту, предпочтительно человеку. Субъект по настоящему изобретению включает без ограничения человека, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, курицу, грызуна (например, крыс и мышей) и примата. Эти способы включают трансдукцию тканей (в том числе без ограничения тканей, таких как мышечная ткань, органов, таких как печень и головной мозг, и желез, таких как слюнные железы) посредством одного или более rAAV, описанных в данном документе.
Мышечная ткань является привлекательной мишенью для доставки ДНК in vivo, поскольку она не является жизненно важным органом и легко доступна. Способы, описанные в данном документе, обеспечивают устойчивую экспрессию CAPN3 в трансдуцированных мышечных клетках.
Под мышечной клеткой, мышечным волокном или мышечной тканью подразумевается клетка или группа клеток, полученные из мышцы любого типа [например, скелетной мышцы и гладкой мышцы (например, из пищеварительного тракта, мочевого пузыря, кровеносных сосудов или ткани сердца)]. Такие мышечные клетки могут быть дифференцированными или недифференцированными, такими как миобласты, миоциты, мышечные трубочки, кардиомиоциты и кардиомиобласты.
Термин трансдукция используется по отношению к введению/доставке CAPN3 в клеткуреципиента in vivo либо in vitro посредством описанного rAAV, что приводит к экспрессии CAPN3 клеткой-реципиентом.
Таким образом, предусмотрены способы введения эффективной дозы (или доз, вводимых по сути одновременно, или доз, вводимых с интервалами) rAAV, который кодирует CAPN3, субъекту, нуждающемуся в этом.
Как отмечалось выше, способы, описанные в данном документе, приводят к развитию у субъекта по сравнению с субъектом до лечения одного или более из увеличения диаметра мышечных волокон, уменьшения количества мелких дольчатых медленно сокращающихся окислительных (STO) мышечных волокон, уменьшения количества волокон с внутренними ядрами, уменьшения содержания эндомизиальной соединительной ткани, коррекции мышечной атрофии и увеличения формирования мышечной силы.
Примеры
Аспекты и варианты осуществления проиллюстрированы с помощью следующих примеров. В примере 1 описано получение AAV9.MCK.CAPN3. В примере 2 описано внутримышечное введение AAV9.MCK.CAPN3. В примере 3 описано получение AAVrh.74.tMCK.CAPN3. В примере 4 описано внутримышечное введение AAVrh.74.tMCK.CAPN3. В примере 5 описано внутривенное введение AAVrh.74.tMCK.CAPN3. В примере 6 описаны исследования конечных точек. В примере 7 описаны токсикологические исследования и исследования биораспределения. В примере 8 описано тестирование биологической активности in vivo после внутримышечного введения. В примере 9 описано тестирование биологической активности in vivo после системной инъекции. В примере 10 описана оценка системной доставки гена AAVrh.74.tMCK.CAPN3. В примере 11 описана оценка кардиотоксичности после системной инъекции вектора AAVrh.74.tMCK.CAPN3. В примере 12 описан физиологический анализ in vivo.
Пример 1. Получение AAV9.MCK.CAPN3
Получали вектор AAV (называемый AAV.CAPN3), несущий ген CAPN3 под контролем промотора MCK, специфичного для мышц (фиг. 1А). ДНК, содержащую открытую рамку считывания CAPN3 мыши (NM_007601.3) между двумя сайтами рестрикции для Not1, синтезировали в Eurofins Genomics, США, и затем субклонировали в однонитевой вектор AAV.MCK (мышечная креатинкиназа), ранее описанный в Rodino-Klapac et al., Journal of Translational Medicine, 5:45-55 (2007). Векторы rAAV получали с применением модифицированного подхода перекрестной упаковки, посредством которого векторный геном AAV
- 11 045762 типа 2 может быть упакован в капсиды AAV нескольких серотипов. [Rabinowitz et al., J Virol. 76 (2):791801 (2002)]. Получение осуществлялось с помощью стандартного трехплазмидного способа с осаждением ДНК с помощью СаРО4 и использованием клеток HEK293. Клетки 293 выдерживали в DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), а также пенициллином и стрептомицином. Продуцирующими плазмидами являлись: (i) pAAV.MCK.microdys, (ii) rep2/capX-модифицированные плазмиды-помощники AAV, кодирующие cap серотипов 1, 6 или изолята, подобного серотипу 8, и (iii) плазмида-помощник на основе аденовируса типа 5 (pAdhelper), экспрессирующая гены аденовируса Е2А, ORF6 Е4 и РНК VA I/II. Для обеспечения возможности проведения сравнений между серотипами применяли способ титрования на основе количественной ПЦР для определения титра инкапсидированных векторных геномов (в. г.) с использованием системы выявления в режиме реального времени Prism 7500 TaqMan (РЕ Applied Biosystems). [Clark et al., Hum Gene Ther. 10 (6): 1031-1039 (1999)]. Праймер и флуоресцентный зонд для нацеливания на промотор MCK были следующими: прямой праймер для MCK - 5CCCGAGATGCCTGGTTATAATT-3 (SEQ ID NO: 4); обратный праймер для MCK - 5GCTCAGGCAGCAGGTGTTG-3 (SEQ ID NO: 5) и зонд для MCK - 5-FAMCCAGACATGTGGCTGCTCCCCC-TAMRA-3 (SEQ ID NO: 6). Конечный титр (в. г.-мл’1) определяли с помощью количественной ПЦР с обратной транскриптазой с применением праймеров и зондов, специфичных для промотора MCK, с использованием системы выявления в режиме реального времени Prism 7500 (РЕ Applied Biosystems, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Разделенные на аликвоты вирусы выдерживали при -80°С до применения.
Пример 2. Внутримышечное введение AAV9.MCK.CAPN3
Для демонстрации того, может ли CAPN3 WT восстанавливать нарушенный процесс регенерации у мышей с нокаутом CAPN3 (CAPN3-KO), в мышцы ТА мышей CAPN3-KO (n=4) [Kramerova et al., HumMolGenet 13(13): 1373-1388 (2004)]] под анестезией вначале инъецировали 30 мкл СТХ, а через 2 недели их трансдуцировали для экспрессии CAPN3 дикого типа с помощью AAV9.MCK.CAPN3 в количестве 1x1011 в. г. в объеме 20 мкл посредством внутримышечной инъекции. В мышцы ТА из другой когорты CAPN3-KO (n=4), служившие в качестве контроля, вводили такой же объем PBS через 2 недели после инъекции СТХ.
Мышей умерщвляли через 6 недель после инъекции СТХ, и мышцы ТА удаляли и подвергали обработке для изготовления срезов в криостате. Поперечные срезы толщиной двенадцать мкм вначале окрашивали с помощью Н&Е для проведения стандартной патогистологической оценки; измерения диаметра конкретных типов мышечных волокон получали с использованием поперечных срезов ТА, окрашенных SDH, от 3 мышей из каждой группы. Производили по три произвольных фотографических снимка ТА (на каждый срез от каждого животного) при увеличении 20Х и проводили измерения диаметра волокон и построение гистограмм для конкретных типов волокон.
Для оценки метаболической дифференцировки типов волокон [медленно сокращающиеся окислительные (STO), быстро сокращающиеся окислительные (FTO) и быстро сокращающиеся гликолитические (FTG)] применяли гистохимический анализ с использованием фермента сукцинатдегидрогеназы (SDH). Измерения диаметра конкретных типов мышечных волокон получали с использованием поперечных срезов толщиной 12 мкм, окрашенных с помощью SDH, через 4 и 12 недель после заключительной инъекции кардиотоксина. Производили по три фотографических снимка, на каждом из которых представлены три отдельные зоны икроножной мышцы (глубокую зону, состоящую преимущественно из STO, промежуточную зону, демонстрирующую STO и FTO или FTG, представленные в шахматном порядке, и поверхностную зону, преимущественно состоящую из волокон FTG) вдоль оси срединной линии (на каждый срез от каждого животного) при увеличении 20Х с использованием микроскопа Olympus BX41 и камеры SPOT (Olympus BX61, Япония). Этот подход был выбран, чтобы зафиксировать изменения в окислительном состоянии волокон в каждой зоне в ответ на метаболические изменения во время регенерации. Диаметры темных (STO), промежуточных (FTO) и светлых (FTG) волокон определяли путем измерения кратчайшего расстояния в пределах мышечного волокна с использованием программного обеспечения Zeiss AxioVision LE4 (версия 4.8). Гистограммы диаметра волокон строили отдельно для STO; а для FTG и FTO объединяли с целью представления общей популяции быстро сокращающихся волокон (FTG/O), полученных от 3 животных и выраженных в виде количества на мм2 площади эндомизия (среднее значение ± SEM). Средний диаметр волокна получали путем объединения показателей для всех 3 типов волокон. В среднем измеряли по 900-1700 волокон на группу. Мышцы ТА использовали для оценки фиброза (см. ниже).
Через четыре недели после инъекции AAV9.MCK.CAPN3 наблюдалось значительное увеличение диаметра мышцы, а также выраженное уменьшение количества внутренних ядер и намного меньшее количество тонких волокон с дольчатым паттерном (фиг. 1В). В не подвергнутой обработке мышце CAPN3-KO наблюдалось на 31,6% больше волокон на мм2 площади, и они в основном состояли из тонких и дольчатых волокон STO, что указывало на то, что обработка приводила к улучшению слияния мышечных трубочек и, следовательно, уменьшению количества отдельных тонких волокон на единицу площади (фиг. 1С и D; табл. 1).
- 12 045762
Таблица 1. Размер волокон передней большеберцовой мышцы
Не подвергнутые обработке, количество на мм2 Не подвергнутые обработке, диаметр Подвергнутые обработке с помощью AAV.CAPN3, количество на мм2 Подвергнутые обработке с помощью AAV.CAPN3, диаметр
STO 355 32,72 ± 0,4 233 39,81 ±0,6*
FTG/O 116 44,26 ± 0,9 99 50,40 ± 1,2*
Все типы волокон 471 35,55 ±0,4 322 43,08 ±0,6*
*р < 0,0001 по сравнению с аналогичным параметром для дикого типа
На гистограммах распределения волокон по размеру в мышце ТА, подвергнутой обработке, демонстрировался сдвиг в сторону волокон большего диаметра при обработке, и избыточное количество тонких волокон в контрольной мышце CAPN3-KO, не подвергнутой обработке, относились к гистохимическому типу волокон STO (фиг. 1E и 1F). В совокупности эти полученные данные демонстрируют, что замещение CAPN3 посредством генной терапии в мышце CAPN3-KO помогало при дефектной регенерации, о чем свидетельствовали тенденция к нормализации размера волокон и уменьшение количества волокон в популяции STO.
Пример 3. Получение AAVrh.74.tMCK.CAPN3
Получали вектор AAV (называемый AAVrh74.tMCK.CAPN3), несущий ген CAPN3 под контролем усеченного промотора MCK, специфичного для мышц (промотора tMCK). ДНК, содержащую открытую рамку считывания CAPN3 мыши (NM_007601.3) между двумя сайтами рестрикции для Not1, синтезировали в Eurofin Genomics, США, и затем вставляли в продуцирующую плазмиду на основе AAV. Карта плазмиды показана на фиг. 2.
Затем получали векторы rAAV с применением подхода, описанного в примере 1.
Пример 4. Внутривенное введение AAVrh.74.tMCK.CAPN3
Мыши CAPN3-KO в возрасте 6 месяцев получали AAVrh.74.tMCK.CAPN3 в низкой (3х1012 в. г.) и высокой дозах (6х1012 в. г.) посредством инъекции в хвостовую вену. Мышей умерщвляли через 20 недель после инъекции гена для проведения исследований конечных точек. Соответствующие по возрасту мыши CAPN3-KO, подвергнутые обработке с помощью среды-носителя, служили в качестве контролей.
Таблица 2. Когорты обработки
Когорты Обработка Общее количество мышей Возраст на момент начала обработки Доза, используемая при обработке (AAVrh.74. tMCK.CAPN3) Продолжи-тельность обработки Возраст в конечной точке
CAPN3- КО 40
- 13 045762
Низкая доза AAV. CAPN3 8 24 недели Зе12 в. г. в 300 мкл физиологического раствора, i.v. 20 недель 44 недели
Обработк а с помощью физиологического раствора 8 24 недели 20 недель 44 недели
Высокая доза AAV. CAPN3 8 24 недели 6е12 в. г. в 300 мкл физиологического раствора, i.v. 20 недель 44 недели
Обработк а с помощью физиолог и-ческого раствора 8 24 недели 20 недель 44 недели
Контрольные животны е дикого типа Обработк а с помощью физиолог и-ческого раствора 8 24 недели 20 недель 44 недели
Исследования конечных точек, проводившиеся, как описано в примере 7 ниже, включали анализ физиологических показателей мышц (анализ формирования силы в ТА или сократимости мышц in vivo, а также анализ защиты от эксцентрических сокращений), патогистологический анализ мышц, выявление hCAPN3 с помощью qPCR и вестерн-блот-анализ.
Пример 5. Внутримышечное введение AAVrh.74.tMCK.CAPN3
В старых и молодых мышцах CAPN3-KO измеряли регенеративные ответы на синхронный некроз, индуцированный кардиотоксином (СТХ), после введения CAPN3 в регенерирующую мышцу посредством обработки с помощью rAAV.
В когортах, состоящих из молодых (в возрасте 2 месяцев) и старых мышей (в возрасте 6 месяцев), СТХ инъецировали в обе мышцы ТА с целью индуцирования синхронного некроза за 2 недели до инъекции rAAV в левую мышцу ТА. AAVrh.74.tMCK.CAPN3 в количестве 1x1011 в. г. в объеме 20 мкл вводили посредством внутримышечной инъекции. Исследования конечных точек проводили через 8 недель после переноса гена (в дозе 1x1011 в. г. с эффективностью, установленной в предыдущих исследованиях авторов настоящего изобретения) для оценки коррекции дефекта регенерации путем сравнения количественных гистологических и физиологических исходов для левой ТА и не подвергнутой обработке правой ТА.
- 14 045762
Таблица 3. Когорты обработки
Когорты Обра-ботка Общее коли-чество мышей Билатераль-ная инъекция СТХ в мышцу ТА; возраст/путь доставки/ лоза Возраст на момент начала генной терапии Доза, используе-мая при обработке (AAVrh.74.tMCK. CAPN3), левая ТА Продолжи-тельность обработки Возраст в конечной точке
CAPN3- КО СТХ+ AAV. CAPN 3 16
Молодые 8 6 недель/i.m./ 30 мкл 8 недель lell в. г. в 30 мкл PBS, i.m. 8 недель 16 недель
Старые 8 22 недели/i.m./ 30 мкл 24 недели lell в. г. в 30 мкл PBS, i.m. 8 недель 32 недели
Животн ые дикого типа Тольк оСТХ 18
Молодые 8 6 8 30 мкл 8 недель 16
недель/i.m./ 30 мкл недель PBS недель
Старые 8 22 недели/i.m./ 30 мкл 24 недели 30 мкл PBS 8 недель 32 недели
Через восемь недель после инъекции rAAV выполняли исследования конечных точек, описанные в примере 6 ниже, включающие анализ физиологических показателей мышц (формирования силы в ТА и защиты от эксцентрических сокращений), количественный патогистологический анализ мышц, выявление hCAPN3 с помощью qPCR и вестерн-блот-анализ.
Пример 6. Исследования конечных точек
Формирование силы в ТА и защита от эксцентрических сокращений
Протокол оценки функциональных исходов для мышцы ТА осуществляли на мышцах, извлеченных из мышей [Wein et al., Nature Medicine, 20(9):992-1000 (2014)]. Мышей подвергали анестезии с помощью смеси кетамин/ксилазин. С использованием препаровального микроскопа удаляли кожу задней конечности для обнажения мышцы ТА и надколенника. Дистальное сухожилие ТА иссекали, и с помощью хирургического шва 4-0 завязывали двойной прямой узел вокруг сухожилия как можно ближе к мышце, и сухожилие разрезали. Обнаженную мышцу постоянно смачивали с помощью физиологического раствора. Мышей затем переносили на нагревательную платформу с контролем температуры и выдерживали при 37 градусах. Колено прикрепляли к платформе с помощью иглы, проведенной через сухожилие надколенника, шов дистального сухожилия ТА - к плечу рычага датчика силы (Aurora Scientific, Opopa, Онтарио, Канада), и стопу закрепляли с помощью клейкой ленты. Сокращения мышцы ТА вызывали посредством стимуляции седалищного нерва с помощью биполярных платиновых электродов. После стабилизации мышцы определяли оптимальную длину путем постепенного растяжения мышцы до достижения максимальной силы сокращения. После 3-минутного периода отдыха производили стимуляцию ТА при 50, 100, 150 и 200 Гц, предоставляя 1-минутный период отдыха между стимуляциями, для определения максимальной силы тетанического сокращения. Измеряли длину мышцы. После 5-минутного отдыха проводили оценку восприимчивости мышцы ТА к повреждению, индуцированному сокращением. После 500 мс стимуляции мышца удлинялась на 10% от оптимальной длины. Это включало стимуляцию мышцы при 150 Гц в течение 700 мс. После стимуляции мышца возвращалась к оптимальной длине. Цикл повторяли каждую минуту в общей сложности в течение 10 циклов. Удельную силу рассчитывали посредством деления максимальной силы тетанического сокращения на площадь поперечного сечения мышцы ТА. После эксцентрических сокращений мышей подвергали эвтаназии, и мышцу ТА иссекали, взвешивали и замораживали для проведения анализа. Анализ данных проводили слепым методом, но не произвольным образом.
- 15 045762
Анализ сократимости мышц in vivo
В ходе данного анализа измеряли совокупную величину крутящего момента, производимого подошвенными мышцами или тыльными мышцами-сгибателями стопы нижней конечности, и его выполняли с помощью прибора для изучения физиологических свойств мышц (Aurora Scientific, Онтарио, Канада). Животное подвергали анестезии с помощью изофлурана. После того, как животное было подвергнуто анестезии, шерсть в области спины и задней конечности удаляли в случае необходимости с помощью машинки для стрижки волос. Если удаление шерсти с помощью машинки для стрижки волос было недостаточным, наносили тонкий слой крема для удаления волос (Nair), и область нанесения тщательно очищали с помощью теплой воды с целью предотвращения неприятных ощущений. Заднюю конечность, предназначенную для проведения измерений, прикрепляли к педали с помощью клейкой ленты. Конечность удерживали в неподвижном состоянии с помощью закругленного зажима. Большеберцовый или малоберцовый компонент седалищного нерва стимулировали с помощью двух стерильных одноразовых монополярных электродов 28 калибра, введенных через кожу и установленных подкожно возле нерва. Температуру мыши поддерживали с помощью кондуктивной терморегулируемой нагревательной подушки (установленной на 37°С) или источника теплового излучения и отслеживали с помощью датчика температуры.
Патогистологическое исследование
Для гистологического анализа все мышцы и органы заливали в 7% трагакантовую камедь и подвергали быстрому замораживанию в изопентане, охлажденном с помощью жидкого азота. Замороженные срезы (12 мкм) собирали для проведения иммуногистохимического исследования и вестерн-блотанализа.
Вестерн-блот-анализ для выявления CAPN3 человека
Количественное оценивание белка CAPN3 в образцах мышечной ткани мыши проводили с помощью способа вестерн-блоттинга. Фермент CAPN3 отделялся в ходе электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и мигрировал в виде полосы размером 94 кДа вместе с продуктом аутолиза размером примерно 60 кДа, что выявляли с помощью антитела Novocastra NCL-CALP-12A2 для клинического применения, распознающего N-конец. Кроме того, антитело NCLCALP-2C4 распознает CAPN3 с этой же молекулярной массой (94 кДа), а также дополнительный фрагмент (30 кДа) в скелетной мышце; и оба эти антитела подходят для выявления белка. Проводили полуколичественное измерение уровней экспрессии белка CAPN3 в образцах от мышей с нокаутом кальпаина после доставки терапевтического вектора rAAV и сравнивали их с показателями контрольных животных, не подвергнутых обработке.
Количественный гистологический анализ мышц
Поперечные срезы мышцы ТА и четырехглавой мышцы от животных, обработанных с помощью AAVrh.74.tMCK.CAPN3, по сравнению с контрольными животными, не получавшими инъекции, окрашивали с помощью гематоксилина и эозина, и производили их фотографические снимки с помощью программного обеспечения Zeiss AxioVision L4 (по 4 произвольных снимка при увеличении 20Х на каждый срез от каждого животного). Диаметры, определяющие размер волокон, сравнивали для животных, подвергнутых обработке, и контрольных животных.
Статистический анализ
Проводили множественные сравнительные тесты с применением t-критерия Стьюдента или однофакторного ANOVA там, где это было применимо.
Пример 7. Токсикологические исследования/исследования биораспределения
Токсикологические исследования/исследования биораспределения выполняли с использованием установленной эффективной дозы и дозы на один log выше. Токсикологические исследования выполнялись посредством системной (в хвостовую вену) доставки rAAV мышам CAPN3-KO в возрасте 6-8 недель и включали сравнение с нормальными показателями у нормальных мышей C57BL6. В исследование включали когорты по 6-10 мышей и проводили процедуры полного вскрытия с применением способов, соответствующих GLP.
Сыворотку крови, собранную из образцов крови, использовали для проведения клиникобиохимического анализа с определением уровней аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы, билирубина (общего и прямого), азота мочевины крови, креатинина, креатинкиназы, глюкозы и общего белка.
Проводили полное вскрытие, включающее тщательный и систематический осмотр и препарирование внутренних органов и костно-мышечного каркаса животного. Ткани/органы, которые собирали, включали половые железы, головной мозг, селезенку, почки, тощую кишку, ободочную кишку, поджелудочную железу, сердце, легкое, желудок, печень, паховые лимфатические узлы, спинной мозг, икроножную мышцу и четырехглавую мышцу. Ткани/органы для патогистологических исследований собирали и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (10% NBF), за исключением всех образцов скелетных мышц, которые монтировали в блоках с ОСТ и подвергали быстрому замораживанию в метилбутане, охлажденном с помощью жидкого азота, для изготовления криосрезов.
- 16 045762
Пример 8. Тестирование биологической активности in vivo после внутримышечной инъекции
Тестирование биологической активности in vivo выполняли после внутримышечной (IM) инъекции
AAVrh.74.tMCK.CAPN3 (1E11 в. г.) в переднюю большеберцовую мышцу (ТА) мышей CAPN3-KO (n=3), как описано выше в примере 5.
Через 4 недели после введения доставку гена анализировали с помощью анализов методами количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) и вестерн-блоттинга. Для проведения вестернблот-анализа образцы, соответствующие 50 мкг цельномышечных экстрактов белков, разделяли в 3-8% акриламидном геле с трис-ацетатным буфером и SDS и переносили на мембрану из PVDF. Иммунологический анализ проводили с использованием моноклонального антитела, вырабатываемого против синтетического пептида, содержащего аминокислоты 1-19 последовательности кальпаина-3 человека (Leica), и антитела к мышечноспецифическому актину (Leica) в качестве контроля нагрузки. На фиг. 3А продемонстрировано наличие белка кальпаина-3 размером 94 кДа в мышце ТА после внутримышечной инъекции. Анализ методом RT-qPCR демонстрировал возвращение относительных уровней экспрессии гена кальпаина-3 человека к нормализованным уровням по сравнению с мышами WT через 4 недели после переноса гена (см. фиг. 3В). GAPDH мыши использовали в качестве эталонного гена, и C57BL/6 WT использовали для калибровки данных RT-qPCR.
Кроме того, выполняли количественный патогистологический анализ после внутримышечного введения. Как показано, диаметр мышечного волокна ТА у мышей CAPN3-KO, подвергнутых обработке, сравнивали с таковым для контрольной мышцы, не подвергнутой обработке (ТА, в которую инъецировали раствор Рингера с лактатом). Средний размер волокна для медленно сокращающихся окислительных (STO, темные), быстро сокращающихся окислительных (FTO, промежуточные) и быстро сокращающихся гликолитических (FTG, светлые) волокон в мышце ТА, в которую инъецировали AAV.hCAPN3, выглядел нормализованным до значений для WT. Количественное оценивание размера волокон в зависимости от типа представлено в табл. 4 и демонстрирует увеличение при обработке.
Таблица 4
WT (zl8-14) Подвергнутые обработке (zl8-ll) Не обработке (2 подвергнутые :18-22 L)
Количеств о Диаметр (мкм) Количеств о Диаметр (мкм) Количеств о Диаметр (мкм)
STO 246 28,06 0,27 ± 142 28,89 0,32 ± 240 25,57 ±0,27
FTO 63 36,65 0,53 ± 86 36,71 0,58 ± 110 32,19 ±0,48
FTG 82 42,55 0,53 ± 86 43,68 0,66 ± 128 35,49 ±0,50
Все типы волоко н 391 32,45 0,38 ± 314 35,08 0,45 ± 478 29,75 ± 0,30
Вкратце, тестирование биологической активности in vivo после IM-инъекции вектора (1Е11 в. г.) в переднюю большеберцовую мышцу (ТА) у мышей CAPN3-KO (n=2) демонстрировало, что через 4 недели после доставки гена 1) анализы методами RT-qPCR и вестерн-блоттинга демонстрировали экспрессию транскриптов CAPN3 и полноразмерного белка кальпаина-3 размером 94 кДа и 2) гистологический анализ демонстрировал увеличение диаметра мышечных волокон ТА по сравнению с контрольной мышцей (ТА, в которую инъецировали раствор Рингера с лактатом).
Пример 9. Тестирование биологической активности in vivo после системной инъекции
Тестирование биологической активности in vivo выполняли после системной инъекции AAVrh.74.tMCK.CAPN3 (3E12 в. г. или 6Е12 в. г.) в хвостовую вену мышей CAPN3-KO. Когорта CAPN3KO, получавшая низкую дозу (п=5; мышей обозначали как Z18-13, Z18-15, Z18-16, Z18-17, Z18-18), получала 3Е12 в. г. в 300 мкл раствора Рингера с лактатом. Через 4 недели после инъекции гена мышей оценивали в отношении усталости при беге с помощью теста бега до изнеможения на тредбане и затем подвергали эвтаназии для сбора тканей. Мышцы верхних и нижних конечностей (ТА, икроножную (GAS), четырехглавую, трехглавую), сердце, печень, селезенку, легкое, яичники и семенники удаляли, и образцы тканей замораживали в изопентане и охлаждали в жидком азоте.
Оценивали экспрессию CAPN3 в мышцах ТА с помощью RT-qPCR. При низкой дозе 3Е12 в. г. уровни экспрессии мРНК CAPN3 были низкими, как наблюдалось по высоким значениям СТ > 27. Вестерн-блот-анализ не демонстрировал выявляемые полосы соответствующего белка. Несмотря на то, что при низкой дозе в данной ткани были получены данные о низкой экспрессии, при системном введении 3Е12 в. г. демонстрировались как функциональные, так и гистологические благоприятные эффекты.
Следовательно, производили системное введение более высокой дозы (6Е12 в. г.) с целью исследования возможности выявления экспрессии белка при более высокой дозе доставляемого вектора. Когорта мышей CAPN3-KO, получавшая высокую дозу (мышей обозначали как Z18-20, Z18-21, Z18-23 и Z18-24), получала 6Е12 в. г. вектора AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 (что в два раза превышает дозу, используемую для когорты, получавшей низкую дозу, посредством системной инъекции в хвостовую вену) и подвергалась эвтаназии через 4 недели после инъекции. RT-qPCR демонстрировала вариабельные уровни экспрессии
- 17 045762
CAPN3 в четырехглавой мышце, трехглавой мышце, GAS, ТА и сердечной мышце.
Для определения относительной экспрессии мРНК CAPN3 собирали образцы мышечной ткани от мышей CAPN3-KO, подвергнутых обработке с помощью вектора tMCK.hCAPN3 в дозе 3Е12 в. г. (когорта 1, получавшая низкую дозу) и 6Е12 в. г. (когорта 2, получавшая высокую дозу). Общую РНК выделяли из обеих когорт, и с помощью qPCR анализировали CAPN3 в сравнении с GAPDH мыши наряду с полученными ранее образцами из когорты, получавшей вектор посредством IM-инъекции (1Е11 в. г.; см. выше в примере 8).
Относительную экспрессию CAPN3 определяли с помощью способа, приведенного ниже:
CT=CTCAPN3 - CTmGAPDH
ΔΔСТ=ΔСТ - ΔСТкαлибрαтор*
Относительная экспрессия CAPN3=2^CT
Относительная экспрессия CAPN3 в каждой ткани и исходное значение СТ показаны в табл. 5 ниже и на фиг. 5. В табл. 5 представлены данные для IM-доставки (мыши №№ Z18-11 и Z18-12) и системной доставки.
Таблица 5. RT-PCR для CAPTN3
№ мыши Ткань Геноти п Доза для обработк и (DRAP на мышь) Значение СТ ACT AACT 2(- ДАСТ)
CAPN3 mGAPDH
Z18-14* ТА WT 0 22,437 22,456 15,234 15,274 7,193 0,000 1,0003
Z18-19 ТА CAPN3- КО 0 35,259 32,705 15,159 15,176 18,814 11,621 0,0003
Z18-11 ТА 1Е11 24,338 24,217 15,800 15,835 8,460 1,267 0,4155
Z18-12 ТА 21,030 21,104 14,906 15,058 6,085 -1,108 2,1548
Z18-13 ТА ЗЕ12 32,376 32,430 15,236 15,203 17,183 9,990 0,0010
Z18-15 ТА 27,407 27,443 14,510 14,520 12,910 5,717 0,0190
Z18-16 ТА 28,609 28,333 15,229 15,259 13,227 6,034 0,0153
Z18-17 ТА 28,675 28,670 14,997 15,005 13,671 6,478 0,0112
Z18-18 ТА 27,869 28,128 14,522 14,544 13,466 6,273 0,0129
Z18-20 Икро- ножная 6Е12 22,271 22,439 15,939 15,974 6,398 -0,795 1,7347
Сердечная 21,996 22,051 15,267 15,315 6,732 -0,461 1,3762
Четырех- главая 21,008 21,202 15,203 15,407 5,800 -1,393 2,6262
ТА 23,806 24,173 16,169 16,385 7,713 0,520 0,6975
Трехглава я 24,083 24,361 15,978 16,097 8,185 0,992 0,5027
Z18-21 Икро- ножная 25,330 25,221 15,461 15,462 9,814 2,621 0,1625
Сердечна я 25,024 24,819 15,032 15,097 9,857 2,664 0,1577
Четырех- главая 26,278 26,108 15,285 15,370 10,866 3,673 0,0784
ТА 26,649 26,697 15,017 15,010 11,659 4,466 0,0452
Трехглава я 27,040 27,134 15,321 15,343 11,755 4,562 0,0423
- 18 045762
Z18-23 Икро- ножная 24,150 24,144 16,225 16,117 7,976 0,783 0,5812
Сердечна я 22,799 22,495 14,593 14,502 8,099 0,906 0,5335
Четырех- главая 24,248 24,076 16,511 16,504 7,655 0,462 0,7262
ТА 25,554 25,338 16,124 16,054 9,357 2,164 0,2231
Трехглава я 24,396 24,383 15,363 15,277 9,070 1,877 0,2723
Z18-24 Икро- ножная 24,444 24,165 18,083 18,036 6,245 -0,948 1,9297
Сердечна я 22,769 22,425 15,100 15,077 7,508 0,315 0,8037
Четырехглавая 22,754 22,521 15,637 15,672 6,983 -0,210 1,1568
ТА 23,491 23,555 15,979 15,974 7,547 0,354 0,7826
Трехглава я 24,554 24,403 16,370 16,329 8,128 0,935 0,5229
Z18-22 Икро- ножная 0 31,878 31,962 15,433 15,527 16,440 9,247 0,0016
Сердечна я 31,407 32,964 16,006 15,972 16,197 9,004 0,0019
Четырехглавая 32,332 33,464 16,528 16,468 16,400 9,207 0,0017
ТА 35,584 33,917 16,451 16,372 18,339 11,146 0,0004
Трехглава я 33,615 32,786 15,742 15,628 17,516 10,323 0,0008
Человеческая ткань Мышца 23,547 23,539 37,743 38,262
pAAV.tM CK.hCAP N3 1 пг/мкл 16,328 16,413 н. о. 38,302
* Калибратор
В целом, экспрессия мРНК CAPN3 в мышце CAPN3-KO после системной доставки характеризовалась вариабельностью, специфичной для животного и типа ткани, и более низкой относительной экспрессией по сравнению с IM-доставкой в дозе 1Е11 в. г. (< 1% от наблюдаемой при IM-доставке); что было в особенной степени справедливо для когорты, получавшей низкую дозу 3Е12. Соответственно, уровень полноразмерного белка размером 94 кДа находился ниже порога выявления для вестернблоттинга. Однако после системной инъекции системной дозы 6Е12 в. г. в когорте, получавшей высокую дозу, проявлялись устойчивая экспрессия гена и значительные количества полноразмерного белка кальпаина-3.
Пример 10. Оценка системной доставки гена AAVrh74.tMCK.hCAPN3
Эффективность переноса гена оценивали с помощью qPCR посредством подсчета числа копий векторных геномов в образцах тканей мышей CAPN3-KO после системной доставки AAVrh74.tMCK.hCAPN3 в дозе 6Е12 в. г. Определяли нагрузку векторными геномами в скелетных мышцах верхней и нижней конечностей (четырехглавой, ТА, икроножной, трехглавой), сердце и печени. Геномную ДНК выделяли из замороженных образцов тканей. Анализ методом qPCR проводили на ABI 7500 (Applied Biosystems) с использованием следующего набора праймеров: 5'CGGAGAGCAACTGCATAAG-3' (прямой; SEQ ID NO: 8); 5'-GGCTGATGATGGCTGAATAG-3' (обратный; SEQ ID NO: 9). Пара праймеров амплифицирует исключительно продукт из 5'-концевой области ORF hCAPN3 и нижерасположенной области, уникальной для вектора экспрессии, охватывающей части интронного элемента. Конечные результаты приведены в виде среднего числа копий вектора AAVrh74 на
- 19 045762 микрограмм геномной ДНК.
Как показано на фиг. 6, наиболее высокое число копий векторных геномов присутствовало в печени после системной доставки вектора. Распределение векторных геномов было вариабельным в зависимости от группы мышц. В целом более высокие значения наблюдались для четырехглавой мышцы и сердечной ткани по сравнению с другими мышцами. Отмечалась также вариабельность между экспериментами; как в случае с мышью № Z18-21, которая демонстрировала относительно более низкое число копий во всех группах мышц по сравнению с другими 3 мышами.
У мышей CAPN3-KO, подвергнутых обработке путем системного введения 3Е12 в. г., наблюдалось улучшение как функциональных, так и гистологических признаков, однако в изолятах общей РНК с помощью RT-qPCR выявлялись лишь низкие уровни экспрессии мышечного кальпаина-3, и полноразмерный белок размером 94 кДа для определенной мышечной ткани было невозможно выявить с помощью вестерн-блоттинга (см. фиг. 3А). Однако после введения системной дозы 6Е12 в. г. проявлялись устойчивая экспрессия гена и значительные количества полноразмерного белка кальпаина-3 (см. фиг. 3В). Данные демонстрируют, что экспрессия гена кальпаина-3 возвращалась к нормализованным уровням по сравнению с мышами WT через 4 недели после переноса гена в частицах AAVrh74.tMCK.hCAPN3. GAPDH мыши использовали в качестве эталонного гена, a C57BL/6 WT - для калибровки данных RTqPCR.
Патогистологическое исследование
Как обсуждалось выше, наблюдалась тенденция к повышению эффективности через 4 недели после инъекции. Значимое увеличение размера волокон наблюдалось в мышце ТА от мышей CAPN3-KO после системной доставки AAVrh.74.tMCK.hCAPN3 через 4 недели после инъекции в обеих когортах (3Е12 и 6Е12). Как показано на фиг. 7, общий диаметр волокна значимо увеличивался в обеих когортах, подвергнутых обработке, по сравнению с соответствующими KO-животными, не подвергнутыми обработке (р < 0,00001). Обработка приводила к нормализации размера волокон, и дозозависимые различия между когортами обработки не наблюдались (р=0,78058). В табл. 6 представлены размеры мышечных волокон для мышей дикого типа и мышей CAPN3-KO после системной генной терапии с помощью AAV.hCAPN3 в дозах 3Е12 и 6Е12 в. г.
Таблица 6
WT (п=3) 6Е12 CAPN3 (п=3) ЗЕ 12 CAPN3 (п=4) КО (п=4)
Коли- чество Диамет р (мкм) Коли- чество Диамет р (мкм) Коли- чество Диамет р (мкм) Коли- чество Диамет р (мкм)
532 30,0 ± 0,6 441 31,7 ± 0,8 464 30,7 ± 1,2 858 27,2 ± 0,8
278 40,7 ± 1,1 345 38,8 ± 1,1 447 40,8 ± 1,4 364 35,4 ± 1,1
275 46,1 ± 1,3 226 45,8 ± 1,4 403 44,1 ± 1,6 455 39,7 ± 1,2
1085 38,9 ± 1,8 1012 38,8 ± 2,0 1314 38,5 ± 2,4 1677 34,1 ± 1,8
Патогистологические свидетельства кардиотоксичности после системной инъекции вектора AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 через 4 недели не наблюдались ни в одной из когорт. В сердечной ткани обнаруживались вариабельные количества вируса, однако полосы белка в сердечной ткани не выявлялись с помощью вестерн-блоттинга ни в одной из когорт.
Исследование функциональных свойств: тест бега до изнеможения
Мышей приучали к тредбану (Columbus Instruments) посредством 15-минутного забега со скоростью 10 м/мин один раз в день на протяжении 3 дней до получения данных для теста бега до изнеможения. Согласно используемому протоколу требовалось нахождение мышей на тредбане, установленном под наклоном в 15°. Скорость движения тредбана при включении составляла 1 м/мин, и скорость увеличивали на 1 м каждую минуту до изнеможения мыши. Изнеможение определяли, если мышь сидела на площадке для отдыха в течение по меньшей мере 15 с. Регистрировали время, скорость и расстояние, преодолеваемое до наступления изнеможения.
На фиг. 8А представлены данные теста бега до изнеможения для когорты, получавшей низкую дозу, которая получала 3Е12 в. г. AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3, и когорты 2, получавшей высокую дозу, которая получала 6Е12 в. г. AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3, согласно оценке через 4 недели после системного введения. Мыши CAPN3-KO, подвергнутые обработке, в обеих когортах показали лучшие результаты в тесте
- 20 045762 бега до изнеможения по сравнению с соответствующими животными, не подвергнутыми обработке. Не наблюдались выраженные дозозависимые различия при выполнении теста бега до изнеможения или статистически значимые различия в диаметре мышечных волокон между когортами, получавшими низкую или высокую дозу.
Мышей из когорты 2, получавшей высокую дозу (n=16), подвергали дополнительному анализу через 20-24 недели после введения 6Е12 в. г. AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3. Как показано на фиг. 8В, мыши CAPN3-KO, подвергнутые обработке, продолжали показывать лучшие результаты в тесте бега до изнеможения по сравнению с соответствующими животными, не подвергнутыми обработке (р < 0,00001).
Пример 11. Оценка кардиотоксичности после системной инъекции вектора AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3
После того, как мышей из когорт подвергали эвтаназии через 4 недели после инъекции, собирали образцы сыворотки крови и органов. Когорта 1 CAPN3-KO, получавшая низкую дозу (n=5), получала вектор AAVrh.74.tMCK.hCAPN3 в дозе 3Е12 в. г. в 300 мкл раствора Рингера с лактатом посредством инъекции в хвостовую вену. Когорта 2 мышей CAPN3-KO, получавшая высокую дозу, получала вектор AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 в дозе 6Е12 в. г. через хвостовую вену, и обе когорты подвергали эвтаназии через 4 недели после инъекции. Исследовали два среза через верхушку сердца, поверхностные и глубокие области желудочков. В срезах тканей не обнаруживали признаков воспаления, некроза или регенерации, что указывало на отсутствие наблюдаемых токсических эффектов в отношении сердечной мышцы после системного введения вектора AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3 в двух различных дозах через 4 недели после инъекции. Мыши №№ Z18-19 и Z18-22 (получавшие инъекцию раствора Рингера с лактатом/не подвергнутые обработке) служили в качестве контрольных KO-животных. На фиг. 9 представлены свежезамороженные срезы сердца, окрашенные с помощью Н&Е. Признаки некроза, регенерации или воспаления мышечных волокон не наблюдались. Несмотря на то, что в сердечной ткани присутствовали вариабельные количества вируса, полосы белка не выявлялись с помощью вестерн-блоттинга ни в одной из когорт. На фиг. 10 представлены результаты вестерн-блот-анализа, которые демонстрируют, что уровень полноразмерного белка кальпаина-3 находится ниже порога выявления в тканях сердца после трансдукции.
Пример 12. Анализ физиологических показателей in vivo
Оценку физиологических показателей выполняли после IM или системного введения вектора AAVrh7.4.tMCK.hCAPN3. Во время проведения оценки физиологических показателей in vivo мышей подвергали анестезии путем ингаляции изофлурана. После того, как животное было подвергнуто анестезии, шерсть в области спины и задней конечности удаляли в случае необходимости с помощью машинки для стрижки волос. Если удаление шерсти с помощью машинки для стрижки волос было недостаточным, наносили тонкий слой крема для удаления волос. Во время проведения физиологических измерений силы in vivo крутящий момент для задней конечности измеряли с помощью педали для неинвазивного измерения силы, соединенной с двигателем детектора силы (Aurora Scientific, Канада), после сверхмаксимальных стимуляций седалищного нерва. Заднюю конечность, предназначенную для проведения измерений, прикрепляли к педали с помощью клейкой ленты. Конечность удерживали в неподвижном состоянии с помощью закругленного зажима. Большеберцовый или малоберцовый компонент седалищного нерва стимулировали с помощью двух стерильных одноразовых монополярных электродов 28 калибра, установленных подкожно возле нерва. Температуру мыши поддерживали с помощью кондуктивной терморегулируемой нагревательной пластины (установленной на 37°С) или источника теплового излучения и отслеживали с помощью инфракрасного датчика температуры.
Хотя в настоящем изобретении предусмотрены конкретные варианты осуществления, следует понимать, что специалистам в данной области придут на ум их видоизменения и модификации. Соответственно, на изобретение должны быть наложены только те ограничения, которые указаны в формуле изобретения.
Все документы, ссылки на которые присутствуют в настоящей заявке, включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Claims (7)

1. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), содержащий последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 1.
2. rAAV по п.1, где rAAV содержит один или более из капсидных белков AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-rh.74 и AAVrh.10.
3. rAAV по любому из пп.1 или 2, где rAAV содержит капсидный белок AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV rh.74, AAV rh.10, или его вариант.
4. rAAV по любому из пп.2 или 3, где rAAV содержит капсидный белок rh.74 или капсидный белок AAV9.
- 21 045762
5. Композиция для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А у субъекта, содержащая rAAV по любому из пп.1-4.
6. Способ лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2А у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества rAAV по любому из пп.1-4 или композиции по
п.5.
7. Способ по п.6, где введение осуществляют путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции.
EA202190155 2018-06-29 2019-06-28 Продукты на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов и способы для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2а EA045762B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/691,934 2018-06-29
US62/865,081 2019-06-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA045762B1 true EA045762B1 (ru) 2023-12-25

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110997923B (zh) 腺相关病毒载体递送肌肉特异性微肌营养不良蛋白以治疗肌营养不良症
JP7390426B2 (ja) β－サルコグリカン及びマイクロＲＮＡ－２９のアデノ随伴ウイルスベクター送達ならびに筋ジストロフィーの治療
JP7507697B2 (ja) 肢帯型筋ジストロフィー２ａを治療するための組換えアデノ随伴ウイルス産物及び方法
JP7361701B2 (ja) 肢帯型筋ジストロフィー２ｃ型のための遺伝子治療
JP2021527657A (ja) 筋ジストロフィーを治療するための筋肉特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクターデリバリー
US9133482B2 (en) Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of myotilin
CN110325219B (zh) 编码甲基-CpG结合蛋白2的重组腺相关病毒的鞘内递送
JP2019511916A (ja) 組換えウイルス産物及びｄｕｘ４エクソンスキッピングを誘導するための方法
JP2022543236A (ja) エクソン４４標的化核酸およびジストロフィンベースのミオパチーの治療のための当該核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス
JP2022185591A (ja) 肢帯型筋ジストロフィー２ａを治療する組換えアデノ随伴ウイルス産物および方法
TWI854984B (zh) 用於治療肢帶型肌營養不良症2a之重組腺相關病毒產品與方法
EA045762B1 (ru) Продукты на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов и способы для лечения тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2а
AU2020385387A1 (en) Materials and methods for treatment of disorders associated with the IGHMBP2 gene
TWI856016B (zh) 腺相關病毒載體遞送肌肉特異性微小肌縮蛋白以治療肌肉萎縮症
US20230390417A1 (en) Recombinant Adeno-Associated Virus Products and Methods for Treating Limb Girdle Muscular Dystrophy 2A
EA045951B1 (ru) Генная терапия против тазово-плечевой мышечной дистрофии типа 2c
WO2024081706A1 (en) Adeno-associated virus delivery to treat spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (smard1) and charcot-marie-tooth type 2s (cmt2s)
JP2023540095A (ja) Ｇ－サルコグリカンを発現するアデノ随伴ウイルスベクターの全身送達および筋ジストロフィーの治療
JP2024515623A (ja) 髄腔内送達によってピット・ホプキンス症候群を治療するためのメチル－ｃｐｇ結合タンパク質２をコードする組換えアデノ随伴ウイルス
EA044609B1 (ru) Доставка бета-саркогликана и микрорнк-29 вектором на основе аденоассоциированного вируса и лечение мышечной дистрофии