JP7213238B2 - 筋ジストロフィーを治療するための筋特異的マイクロジストロフィンのアデノ随伴ウイルスベクター送達 - Google Patents

Description

本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）／国立神経疾患・脳卒中研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ）によって交付された助成金第ＮＳ０５５９５８号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。

本願は、２０１７年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５７３，９５５号明細書に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により援用される。

電子的に提出された資料の参照による援用
本願は、本開示の別個の部分としてコンピュータ可読形式の配列表を含み、この配列表は、その全体が参照により援用され、以下のとおり特定される：ファイル名：５２８２２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：３９，８５１バイト、作成日；２０１８年３月１３日。

本発明は、ミニチュア化したヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのベクターと、ｍｉＲ２９を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのベクターとを含む併用遺伝子療法を提供する。本発明はまた、この併用療法を用いて横隔膜及び心筋を含めた骨格筋にマイクロジストロフィン及びｍｉＲ２９を発現させ、筋ジストロフィー罹患対象の筋線維を傷害から保護し、筋肉強度を増加させ、及び線維化を低減及び／又は予防する方法も提供する。

歩行運動及び呼吸などの日常の活動、並びに全身代謝に筋量及び筋肉強度が重要であることは明白である。筋機能の不全は、筋脱力及び筋消耗によって特徴付けられる筋ジストロフィー（ＭＤ）を引き起こし、クオリティ・オブ・ライフに深刻な影響を及ぼす。最も十分に特徴付けられたＭＤは、ジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）のメンバーをコードする遺伝子の突然変異によって生じる。これらのＭＤは、ＤＡＰＣによる筋鞘－細胞骨格のつなぎ止めが失われることに伴う膜脆弱性によって生じる。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、５０００人に１人の新生男児に発症する最も破壊的な筋疾患の一つである。

ＤＭＤは、ｍＲＮＡの減少及びジストロフィン結合タンパク質複合体（ＤＡＰＣ）に関連する４２７ｋＤ筋鞘タンパク質であるジストロフィンの欠如を招くＤＭＤ遺伝子の突然変異によって引き起こされる（Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８，１９８７）。ＤＡＰＣは、アクチン結合タンパク質であるジストロフィン、及びラミニン結合タンパク質であるα－ジストログリカンを介して細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と細胞骨格との間の構造的結び付きを形成する筋鞘にある複数のタンパク質で構成される。これらの構造的結び付きが、収縮時の筋細胞膜を安定化させて収縮誘発性損傷を防ぐ働きをする。ジストロフィンが失われると、膜脆弱性によって筋鞘が破れてカルシウムが流入し、カルシウム活性化プロテアーゼが惹起され、分節状筋線維壊死が起こる（Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８－７５，１９９７）。この無制御の筋変性・筋再生サイクルによって最終的に筋幹細胞集団が消耗し（Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９－７１；Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７－５７）、進行性の筋脱力、筋内膜炎症、及び線維性瘢痕が生じる。

ジストロフィン又はマイクロジストロフィンによる膜安定化がないため、ＤＭＤでは無制御の組織傷害・修復サイクルが現れることになり、最終的に失われた筋線維が結合組織増殖を通じて線維性瘢痕組織に取って代わる。線維化は、コラーゲン及びエラスチンを含めたＥＣＭマトリックスタンパク質の過剰な沈着によって特徴付けられる。ＥＣＭタンパク質は主に、ストレス及び炎症に応答して活性化線維芽細胞が放出するＴＧＦβなどのサイトカインによって産生される。ＤＭＤの主な病理学的特徴は筋線維変性及び壊死であるが、病理学的帰結としての線維化も同等の影響を有する。線維化組織の過剰産生は筋再生を制限し、ＤＭＤ患者の進行性筋脱力の一因である。ある研究では、初回ＤＭＤ筋生検における線維化の存在が１０年フォローアップ時の運動転帰の不良と高度に相関した（Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２－７）。これらの結果は、線維化がＤＭＤ筋機能不全の主要な寄与因子であることを指し示しており、線維化が顕性化する前の早期介入の必要性が強調される。

ｍｄｘマウスで試験されたほとんどの抗線維化療法は、ＴＧＦβ経路の阻害によって線維化サイトカインシグナル伝達を遮断する働きをする。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内の塩基との対合、翻訳の阻害、又はｍＲＮＡ分解の促進によって転写後レベルで遺伝子サイレンシングを媒介する約２２ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡの５’末端にある７ｂｐのシード配列によってｍｉＲＮＡが標的化される；標的とされる配列の残りの部分、並びにその二次構造により、更なる認識が提供される。ｍｉＲＮＡは筋疾患病理において重要な役割を果たし、問題の筋ジストロフィーの型に唯一依存する発現プロファイルを呈する（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１）。増えつつある一連のエビデンスによれば、心臓、肝臓、腎臓、及び肺を含めた多くの臓器の線維化過程にｍｉＲＮＡが関与することが示唆される（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２１）。最近になって、ｍｉＲ－２９の下方制御が心筋繊維化の一因であることが示され（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ，２０１０．１２（４）：ｐ．３４１－５１）、及びｍｉＲ－２９の発現低下がヒトＤＭＤ患者の筋肉と遺伝的に関連付けられた（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，２００７．１０４（４３）：ｐ．１７０１６－２）。ｍｉＲ－２９ファミリーは、２つのバイシストロニックｍｉＲＮＡクラスターから発現する３つのファミリーメンバーからなる。ｍｉＲ－２９ａはｍｉＲ－２９ｂ（ｍｉＲ－２９ｂ－１）と共発現し；ｍｉＲ－２９ｃはｍｉＲ－２９ｂの第２のコピー（ｍｉＲ－２９ｂ－２）と共発現する。ｍｉＲ－２９ファミリーは保存されたシード配列を共有し、ｍｉＲ－２９ａ及びｍｉＲ－２９ｂは各々、ｍｉＲ－２９ｃと僅か１塩基だけ異なる。更に、ｍｉＲ－２９プラスミド（ｍｉＲ－２９ａ及びｍｉＲ－２９ｂ－１のクラスター）をｍｄｘマウス筋肉に電気穿孔すると、ＥＣＭ成分であるコラーゲン及びエラスチンの発現レベルが低下し、治療後２５日以内に筋切片のコラーゲン沈着が著しく減少した（Ｃａｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ，２０１０．１２（４）：ｐ．３４１－５１）。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂ長である。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ血清型２型（ＡＡＶ２）ゲノムのヌクレオチド配列は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提示され、Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７５：３３８５－３３９２（１９９４）によって訂正されたとおりである。他の例として、ＡＡＶ－１の完全ゲノムがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ－３の完全ゲノムがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ－４の完全ゲノムがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ－５ゲノムがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ－６の完全ゲノムがＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２に提供され；ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部がＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９にそれぞれ提供され（ＡＡＶ－８に関しては米国特許第７，２８２，１９９号明細書及び同第７，７９０，４４９号明細書も参照のこと）；ＡＡＶ－９ゲノムがＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムがＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供され；及びＡＡＶ－１１ゲノムがＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングについては、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ＩＴＲ内には、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド化／パッケージング及び宿主細胞染色体組み込みを指図するシス作用配列が含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（その相対マッピング位置からｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と呼ばれる）が、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現をドライブする。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）が、単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（例えば、ＡＡＶ２ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と一緒になって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は複数の酵素的特性を備え、最終的にはそれらがウイルスゲノムの複製に関与する。ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現し、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング部位及び非コンセンサス翻訳開始部位が、これらの３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位が、ＡＡＶゲノムのマッピング位置９５に位置する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学については、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）にレビューされている。
ＡＡＶは、それを例えば遺伝子療法における細胞への外来ＤＮＡの送達用ベクターとして魅力的なものにするユニークな特徴を備えている。培養下の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は不顕性且つ無症候性である。更に、ＡＡＶは多くの哺乳類細胞を感染させるため、インビボで多くの異なる組織を標的化できる可能性がもたらされる。更に、ＡＡＶは分裂及び非分裂細胞にゆっくりと形質導入し、本質的にそうした細胞の全寿命にわたって、転写活性のある核エピソーム（染色体外エレメント）として存続し得る。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中のクローニングされたＤＮＡとして感染力があり、そのため組換えゲノムの構築が実現可能となる。更に、ＡＡＶ複製、ゲノムカプシド化及び組み込みを指図するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、このゲノムの内部約４．３ｋｂ（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の一部又は全てを、プロモーター、目的のＤＮＡ及びポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセットなど、外来ＤＮＡに置き換えることができる。ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質はイントランスで提供されてもよい。ＡＡＶの別の顕著な特徴は、それが極めて安定した頑強なウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するために用いられる条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐え、そのためＡＡＶの低温保存は特に必須とはならない。ＡＡＶは凍結乾燥すらできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は重感染に抵抗性でない。
複数の研究が、長期（１．５年超）にわたる筋肉での組換えＡＡＶ媒介性タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９－６６９（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２－１４０８７（１９９６）；及びＸｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８－８１０８（１９９６）を参照のこと。また、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９－６２３（２０００）及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７－２２２（２００１）も参照のこと。更に、筋肉は高度に血管化しているため、Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４－５８０９（１９９７）及びＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１－１３９２６（１９９７）に記載されるとおり、組換えＡＡＶの形質導入によって筋肉内注射後の体循環中にトランス遺伝子産物が出現している。更に、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９－８７７５（２００２）は、骨格筋筋線維が、正しい抗体グリコシル化、折り畳み、及び分泌に必要な細胞性因子を備えることを実証しており、筋肉が分泌タンパク質療法薬の安定発現能を有することが指摘される。

米国特許第７，２８２，１９９号明細書 米国特許第７，７９０，４４９号明細書

Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１（６）：９１９－２８，１９８７ Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０（２）：１６８－７５，１９９７ Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１０．１４３（７）：ｐ．１０５９－７１ Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９．７１：ｐ．３７－５７ Ｄｅｓｇｕｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，２００９．６８（７）：ｐ．７６２－７

ＤＭＤ及び他の筋ジストロフィーに罹患している患者の機能改善には、疾患初期に遺伝子を復元する必要がある。ＤＭＤ罹患患者の筋肉強度を増加させ、且つ筋傷害を防ぐ治療が必要とされている。

本発明は、筋線維を傷害から保護し、筋肉強度を増加させ、及び線維化を低減及び／又は予防するための、横隔膜及び心筋を含めた骨格筋に対するマイクロジストロフィン遺伝子を発現する遺伝子療法ベクター、例えばＡＡＶに関する。

本発明は、遺伝子療法ベクターを使用してマイクロジストロフィンを送達することによりＤＭＤに見られる遺伝子欠損に対処する筋力増強及び／又は筋量増強療法及び手法を提供する。実施例２に示されるとおり、マイクロジストロフィン遺伝子療法による治療は、インビボでより高い筋力を生じさせた。更に、マイクロジストロフィン遺伝子療法の筋肉内及び全身送達により、マウスモデルにおいてインビボで筋肉にジストロフィンが送達されることが示された。

一実施形態において、本発明は、筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列と、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含むｒＡＡＶベクターを提供する。例えば、このヌクレオチド配列は機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードし、ここでヌクレオチドは、例えば、配列番号１と少なくとも、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％及び更により典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であり、ここでタンパク質はマイクロジストロフィン活性を保持している。マイクロジストロフィンタンパク質は、筋収縮時に筋膜に安定性を付与し、例えばマイクロジストロフィンは筋収縮時に衝撃吸収材として働く。

本発明はまた、ストリンジェントな条件下で配列番号１の核酸配列、又はその相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）とハイブリダイズする、且つ機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列が機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするｒＡＡＶベクターも提供する。

用語「ストリンジェント」は、当該技術分野において一般にストリンジェントと理解される条件を指して使用される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、主として温度、イオン強度、及びホルムアミドなどの変性剤の濃度によって決まる。ハイブリダイゼーション及び洗浄についてのストリンジェントな条件の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムで６５～６８℃又は０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び５０％ホルムアミドで４２℃である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。よりストリンジェントな条件（より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、又は他の変性剤など）を用いることもできるが、ハイブリダイゼーション速度が影響を受けることになる。デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが関係する例では、更なる例示的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として、６×ＳＳＣ ０．０５％ピロリン酸ナトリウム中３７℃（１４塩基オリゴについて）、４８℃（１７塩基オリゴについて）、５５℃（２０塩基オリゴについて）、及び６０℃（２３塩基オリゴについて）での洗浄が挙げられる。

ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中には、非特異的な及び／又はバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減らすことを目的として他の薬剤が含まれてもよい。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ（又は他の非相補ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランであり、しかし他の好適な薬剤もまた使用することができる。これらの添加剤の濃度及び種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を及ぼすことなく変更することができる。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８～７．４で行われるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーション速度はｐＨにほとんど依存しない。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｈ．４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変数を適合させて、異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成可能となるように当業者が調整し得る。

用語「筋特異的調節エレメント」は、筋組織における発現に特異的なコード配列の発現を制御するヌクレオチド配列を指す。こうした調節エレメントにはエンハンサー及びプロモーターが含まれる。本発明は、筋特異的調節エレメントＭＣＫＨ７プロモーター、ＭＣＫプロモーター及びＭＣＫエンハンサーを含むコンストラクトを提供する。

一態様において、本発明は、筋特異的調節エレメントが、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、トランケート型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント又はグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）であるｒＡＡＶベクターを提供する。

例えば、筋特異的調節エレメントはＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列、配列番号２であるか、又は筋特異的調節エレメントはＭＣＫヌクレオチド配列、配列番号４である。加えて、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれにおいても、筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列、例えばＭＨＣＫ７又はＭＣＫヌクレオチド配列は、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。例えば、ＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列（配列番号２）は、図１又は図１０に提供されるコンストラクト（配列番号３）に示されるとおり、ヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に作動可能に連結されている。ＭＣＫプロモーター（配列番号４）は、図７又は図１１に提供されるコンストラクト（配列番号５）に示されるとおり、ヒトマイクロジストロフィンコード配列（配列番号１）に作動可能に連結されている。別の態様において、本発明は、配列番号１及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。本発明はまた、配列番号１及び配列番号４のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターも提供する。

更なる態様において、本発明は、配列番号３又は配列番号５のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。例えば、ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンベクターは、配列番号３の、図１０に示されるヌクレオチド配列を含む。このｒＡＡＶベクターは、ＭＨＣＫ７プロモーター、キメライントロン配列、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列、ポリＡ、アンピシリン耐性及びｐＢＲ３２２複製起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を有するｐＧＥＸプラスミド骨格を含む。

本発明は、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列と配列番号３のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列とを含む組換えＡＡＶベクターを提供する。このｒＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。

本発明はまた、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターも提供する。このｒＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４である。

本発明のｒＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３など、任意のＡＡＶ血清型であってよい。

本発明はまた、本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む医薬組成物（又は時に本明細書では単に「組成物」と称される）も提供する。

別の実施形態において、本発明は、ｒＡＡＶベクター粒子の作製方法を提供し、この方法は、本発明の任意のｒＡＡＶベクターがトランスフェクトされた細胞を培養すること、及びトランスフェクト細胞の上清からｒＡＡＶ粒子を回収することを含む。本発明はまた、本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含むウイルス粒子も提供する。

本発明は、ヒトマイクロジストロフィンを発現する本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかの治療有効量を投与することを含む筋ジストロフィーの治療方法を提供する。

本発明は、配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列と配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列とを含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む筋ジストロフィーの治療方法を提供する。

本発明はまた、配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む筋ジストロフィーの治療方法も提供する。

「線維化」は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の過度の又は無秩序な沈着、並びに骨格筋、心筋、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓を含めた傷害時の組織における異常な修復過程を指す。沈着するＥＣＭ成分には、フィブロネクチン及びコラーゲン、例えば１型コラーゲン、２型コラーゲン又は３型コラーゲンが含まれる。

別の実施形態において、本発明は、必要としている対象の線維化を予防又は低減する方法を提供し、この方法は、本発明の任意の組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含み、筋肉を標的とするヒトマイクロジストロフィンタンパク質並びに向上した心臓遺伝子デリバリー及び心臓における発現。例えば、本発明のｒＡＡＶのいずれかが、線維化を予防又は低減するため筋ジストロフィー罹患対象に投与され、例えばヒトマイクロジストロフィンタンパク質を発現する本発明のｒＡＡＶが、対象に線維化が認められる前に投与される。加えて、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現する本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えばＤＭＤに罹患している又はそれと診断された対象など、線維化を発症するリスクがある対象に投与される。本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィー罹患対象に対し、そうした対象における新規の線維化を予防するため、又はそうした対象における線維化を低減するために投与される。

本発明は、対象に線維化が認められる前に本発明のＡＡＶベクターのいずれかを投与することを企図する。加えて、本発明のｒＡＡＶは、筋ジストロフィー、例えばＤＭＤに罹患している又はそれと診断された対象など、線維化を発症するリスクがある対象に投与される。本発明のｒＡＡＶは、既に線維化を発症している筋ジストロフィー罹患対象に対し、そうした対象における新規の線維化を予防するために投与される。

本発明はまた、ヒトマイクロジストロフィン遺伝子を発現する本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の筋力及び／又は筋量を増加させる方法も提供する。本方法は、マイクロジストロフィンを発現するｒＡＡＶを投与するステップを更に含み得る。

本発明は、ＤＭＤと診断された患者に対し、対象に線維化が認められる前又は筋力が低下する前又は筋量が低下する前に本発明のＡＡＶベクターのいずれかを投与することを企図する。
本発明はまた、既に線維化を発症している筋ジストロフィー罹患対象に対し、そうした対象における新規の線維化を予防するため本発明のｒＡＡＶのいずれかを投与することも企図する。本発明はまた、既に筋力が低下した又は筋量が低下した筋ジストロフィー罹患患者に対し、筋肉を更なる傷害から保護するため本発明のｒＡＡＶのいずれかを投与することも提供する。

本発明の方法のいずれにおいても、対象は、ＤＭＤ又は任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなど、筋ジストロフィーの罹患者であり得る。

別の態様において、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶベクターは、ＭＨＣＫ７又はＭＣＫ以外の筋特異的調節エレメントに作動可能に連結されたマイクロジストロフィン遺伝子のコード配列を含む。例えば、筋特異的調節エレメントは、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ、ｔＭＣＫ（トランケート型ＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、Ｃ５－１２（合成プロモーター）、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンＩ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント又はグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）である。

本発明の方法のいずれにおいても、ｒＡＡＶベクター又は組成物は筋肉内注射又は静脈内注射によって投与される。

加えて、本発明の方法のいずれにおいても、ｒＡＡＶベクター又は組成物は全身投与される。例えば、ｒＡＡＶベクター又は組成物は、注射、注入又は移植による非経口投与（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）である。

別の実施形態において、本発明は、必要としている対象の線維化を低減するための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。

加えて、本発明は、筋ジストロフィー罹患患者の線維化を予防するための本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。

本発明は、筋ジストロフィーの治療用の本発明の組換えＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。

本発明は、筋ジストロフィーの治療用の配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列と配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーター配列とを含む組換えＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。

本発明は、筋ジストロフィーの治療用の配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターを含む組成物を提供する。

本発明はまた、筋ジストロフィー罹患対象の筋力及び／又は筋量を増加させるための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物も提供する。更なる実施形態において、本発明は、筋ジストロフィーの治療用の本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかを含む組成物を提供する。

本発明の組成物は筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化される。本発明の組成物はまた、注射、注入又は移植による非経口投与（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）など、全身投与用にも製剤化される。

加えて、本組成物のいずれも、ＤＭＤ又は任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなど、筋ジストロフィーに罹患している対象への投与用に製剤化される。

更なる実施形態において、本発明は、必要としている対象における線維化の低減用医薬を調製するための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかの使用を提供する。例えば、対象は、ＤＭＤ又は任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなど、筋ジストロフィーに罹患していて必要としている。

別の実施形態において、本発明は、筋ジストロフィー罹患対象における線維化の予防用医薬を調製するための本発明のｒＡＡＶベクターのいずれかの使用を提供する。

加えて、本発明は、筋ジストロフィー罹患対象における筋肉強度及び／又は筋量の増強用医薬を調製するための本発明の組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。

本発明はまた、筋ジストロフィーの治療用医薬を調製するための本発明のｒＡＡＶベクターの使用も提供する。

本発明は、筋ジストロフィーの治療用医薬を調製するための配列番号１のヒトマイクロジストロフィンヌクレオチド配列と配列番号２のＭＨＣＫ７プロモーターヌクレオチド配列とを含む組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。

本発明は、筋ジストロフィーの治療のための配列番号３のｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトヌクレオチド配列を含む組換えＡＡＶベクターの使用を提供する。

本発明の使用のいずれにおいても、医薬は筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化される。加えて、本発明の使用のいずれにおいても、医薬は、注射、注入又は移植による非経口投与（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）など、全身投与用に製剤化される。

医薬のいずれも、ＤＭＤ又は任意の他のジストロフィン関連筋ジストロフィーなど、筋ジストロフィーに罹患している対象への投与用に調製され得る。

本発明はまた、マイクロジストロフィンを発現する組換えＡＡＶベクターを投与すること、並びにｍｉＲ－２９を発現する、及びｍｉＲ－２９の発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターを投与することを含む併用療法又は同時療法も提供する。

一実施形態において、本発明は、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィーの治療方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の筋力又は筋量を増加させる方法を提供する。

更なる実施形態において、本発明は、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の線維化を低減又は予防する方法を提供する。

本発明はまた、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を含む筋ジストロフィーの治療用組成物も提供する。

別の実施形態において、本発明は、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の筋力又は筋量を増加させるための組成物を提供する。

更なる実施形態において、本発明は、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節されるｉ）組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の線維化を低減又は予防するための組成物を提供する。

本発明はまた、筋ジストロフィーの治療用医薬を調製するための、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する組換えＡＡＶベクターであって、マイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクターであって、ｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用も提供する。

別の実施形態において、本発明は、筋ジストロフィー罹患対象における筋力又は筋量の増強用医薬を調製するための、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する組換えＡＡＶベクターであって、マイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクターであって、ｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用を提供する。

更なる実施形態において、本発明は、筋ジストロフィー罹患対象における線維化の低減又は予防用医薬を調製するための、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する組換えＡＡＶベクターであって、マイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクターであって、ｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用を提供する。

本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。

本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ａ）ヌクレオチド配列の配列番号１と少なくとも８５％同一であり、且つ機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又はｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を含む。

加えて、本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクターは、ａ）配列番号８及び配列番号９のヌクレオチド配列、ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列、又はｃ）配列番号６のヌクレオチド配列を含む。

本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、筋特異的調節エレメントのうちの少なくとも１つは、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、トランケート型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント又はグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である。例えば、マイクロジストロフィンの発現を調節する筋特異的調節エレメントは配列番号２（ＭＨＣＫ７）を含み、及び／又はｍｉＲ－２９ｃの発現を調節する筋特異的調節エレメントは配列番号１０（ＣＭＶ）を含む。

例示的な併用又は同時療法の方法、組成物又は使用において、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターはｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含み、又はマイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターは配列番号３のヌクレオチド配列を含む。

例示的な併用又は同時療法の方法、組成物又は使用において、ｍｉＲ－２９ｃを発現するＡＡＶベクターはｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含み、又はｍｉＲ－２９ｃを発現するＡＡＶベクターは配列番号６のヌクレオチド配列を含む。

別の例示的な併用又は同時療法の方法、組成物又は使用において、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターはｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含み、ここでｍｉＲ－２９ｃを発現するＡＡＶベクターはｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含む。

更なる併用又は同時療法の方法、組成物又は使用において、マイクロジストロフィンを発現するＡＡＶベクターは配列番号３のヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲ－２９ｃを発現するＡＡＶベクターは配列番号６のヌクレオチド配列を含む。

本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つは、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３である。

本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つ（ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）、組成物又は医薬は、筋肉内注射又は静脈内注射によって投与される。

本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つ又は組成物又は医薬は全身投与される。

本発明の併用又は同時療法の方法、組成物又は使用のいずれにおいても、組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つ、組成物又は医薬は、注射、注入又は移植によって非経口投与される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィーの治療方法。
（項目２）
ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の筋力又は筋量を増加させる方法。
（項目３）
ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節されるｉ）組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の線維化を低減又は予防する方法。
（項目４）
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、
ａ）ヌクレオチド配列の配列番号１と少なくとも８５％同一であり、且つ機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列
を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが、
ａ）配列番号８及び配列番号９のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列、又は
ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列
を含む、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記筋特異的調節エレメントのうちの少なくとも１つが、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、トランケート型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント又はグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
マイクロジストロフィンの発現を調節する前記筋特異的調節エレメントが配列番号２（ＭＨＣＫ７）を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ｍｉＲ－２９ｃの発現を調節する前記筋特異的調節エレメントが配列番号１０（ＣＭＶ）を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号３のヌクレオチド配列を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号６のヌクレオチド配列を含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含み、ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号３のヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号６のヌクレオチド配列を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３である、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが筋肉内注射又は静脈内注射によって投与される、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが全身投与される、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが、注射、注入又は移植によって非経口投与される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を含む筋ジストロフィーの治療用組成物。
（項目２１）
ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の筋力又は筋量を増加させるための組成物。
（項目２２）
ｉ）マイクロジストロフィンを発現する、及びマイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節されるｉ）組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する、及びｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の線維化を低減又は予防するための組成物。
（項目２３）
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、項目２０～２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、
ａ）ヌクレオチド配列の配列番号１と少なくとも８５％同一であり、且つ機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列
を含む、項目２０～２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが、
ａ）配列番号８及び配列番号９のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列、又は
ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列
を含む、項目２０～２４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６）
前記筋特異的調節エレメントのうちの少なくとも１つが、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、トランケート型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント又はグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である、項目２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７）
マイクロジストロフィンの発現を調節する前記筋特異的調節エレメントが配列番号２（ＭＨＣＫ７）を含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２８）
ｍｉＲ－２９ｃの発現を調節する前記筋特異的調節エレメントが配列番号１０（ＣＭＶ）を含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２９）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号３のヌクレオチド配列を含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号６のヌクレオチド配列を含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含み、ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記ＡＡＶベクターがｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含む、項目２０～２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号３のヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号６のヌクレオチド配列を含む、項目２０～２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３である、項目２０～３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化された、項目２０～３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３７）
全身送達用に製剤化された、項目２０～３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
注射、注入又は移植による非経口投与用に製剤化される、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
筋ジストロフィーの治療用医薬を調製するための、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する組換えＡＡＶベクターであって、マイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクターであって、ｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用。
（項目４０）
筋ジストロフィー罹患対象における筋力又は筋量の増強用医薬を調製するための、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する組換えＡＶベクターであって、マイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクターであって、ｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用。
（項目４１）
筋ジストロフィー罹患対象における線維化の低減又は予防用医薬を調製するための、ｉ）マイクロジストロフィンを発現する組換えＡＡＶベクターであって、マイクロジストロフィンの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）ｍｉＲ－２９ｃを発現する組換えＡＡＶベクターであって、ｍｉＲ－２９ｃの発現が筋特異的調節エレメントヌクレオチド配列によって調節される組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用。
（項目４２）
前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、項目３９～４１のいずれか一項に記載の使用。
（項目４３）
マイクロジストロフィンタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、
ａ）ヌクレオチド配列の配列番号１と少なくとも８５％同一であり、且つ機能性マイクロジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列
を含む、項目３９～４２のいずれか一項に記載の使用。
（項目４４）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが、
ａ）配列番号８及び配列番号９のヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列、又は
ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列
を含む、項目３９～４３のいずれか一項に記載の使用。
（項目４５）
前記筋特異的調節エレメントのうちの少なくとも１つが、ヒト骨格筋アクチン遺伝子エレメント、心筋アクチン遺伝子エレメント、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ｍｅｆ、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、トランケート型ＭＣＫ（ｔＭＣＫ）、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ハイブリッドα－ミオシン重鎖エンハンサー／ＭＣＫエンハンサープロモーター（ＭＨＣＫ７）、Ｃ５－１２、マウスクレアチンキナーゼエンハンサーエレメント、骨格筋速筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋心筋トロポニンｃ遺伝子エレメント、遅筋トロポニンｉ遺伝子エレメント、低酸素誘導性核因子、ステロイド誘導性エレメント又はグルココルチコイド応答エレメント（ｇｒｅ）である、項目３９～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目４６）
マイクロジストロフィンの発現を調節する前記筋特異的調節エレメントが配列番号２（ＭＨＣＫ７）を含む、項目３９～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目４７）
ｍｉＲ－２９ｃの発現を調節する前記筋特異的調節エレメントが配列番号１０（ＣＭＶ）を含む、項目３９～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目４８）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含む、項目３９～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目４９）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号３のヌクレオチド配列を含む、項目３９～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目５０）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含む、項目３９～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目５１）
ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号６のヌクレオチド配列を含む、項目３９～４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目５２）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターがｉ）配列番号１のヌクレオチド配列（マイクロジス）及びｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列（ＭＨＣＫ７）を含み、ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記ＡＡＶベクターがｉ）配列番号８又は配列番号９のヌクレオチド配列及びｉｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列（ＣＭＶ）を含む、項目３９～４２のいずれか一項に記載の使用。
（項目５３）
マイクロジストロフィンを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号３のヌクレオチド配列を含み、ｍｉＲ－２９ｃを発現する前記組換えＡＡＶベクターが配列番号６のヌクレオチド配列を含む、項目３９～４２のいずれか一項に記載の使用。
（項目５４）
前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３である、項目３９～５３のいずれか一項に記載の使用。
（項目５５）
前記医薬が筋肉内又は静脈内投与用に製剤化される、項目３９～５４のいずれか一項に記載の使用。
（項目５６）
前記医薬が全身送達用に製剤化される、項目３９～５４のいずれか一項に記載の使用。
（項目５７）
前記医薬が、注射、注入又は移植による非経口投与用に製剤化される、項目５６に記載の使用。

ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトを示す。このコンストラクトでは、ｃＤＮＡ発現カセットにＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。このコンストラクトはインフレームロッド欠失（Ｒ４～Ｒ２３）によって特徴付けられ、一方で、ヒンジ１、２及び４（Ｈ_１、Ｈ_２及びＨ_３）及びシステインリッチドメインは残り、１３８ｋＤａタンパク質を産生する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現はＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）によってガイドされる。イントロン及び５’ＵＴＲはプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットはＡＴＧ開始のすぐ前にコンセンサスコザックを有し、ｍＲＮＡ終結用の小さい５３ｂｐ合成ポリＡシグナルを有した。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，２５３－２６１（２００２））によって以前記載されたとおりの（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含んだ。 ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７コンストラクトの筋肉内送達後のジストロフィンタンパク質発現を実証する。ｍｄｘマウスの前脛骨筋に１×１０^１１ｖｇを注射した（ｎ＝５匹／群）。６週間後、筋肉を採取し、ジストロフィン発現に関してジストロフィン用のＮ末端抗体で染色し、及びヘマトキシリン・エオシン染色した。 図３Ａ～図３Ｃは、ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７コンストラクトの筋肉内注射後の骨格筋筋力測定及びマイクロジストロフィン発現の定量化を提供する。（Ａ）ｍｄｘマウスの前脛骨筋にＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７コンストラクトによって１×１０^１１ｖｇ（ｎ＝５）を注射した。６週間後、前脛骨筋を採取し、インビボ筋力測定に供した。投薬コホートは未治療ｍｄｘ対照と比べて筋力産生が有意に高かった。 図４Ａ～図４Ｃは、全身投与後の骨格筋横隔膜及び心筋線維の広範な形質導入を実証する。（Ａ）ｍｄｘマウスを６週齢で尾静脈から６×１０^１２ｖｇ（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジスによって１２週間の治療に従い全身治療した。（Ｂ）マイクロジストロフィン染色が、各組織中のマイクロジストロフィンを発現する筋線維の割合の定量化を示すことを実証する。（Ｃ）低用量及び高用量（予定臨床用量）における横隔膜で測定された比筋力を示す。低用量では有意差は認められなかった；しかしながら、高用量では有意な改善があった。 ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジスコンストラクトの全身送達後のジストロフィンタンパク質発現を実証する。ｍｄｘマウス（ｎ＝５）を６週齢で尾静脈から６×１０^１２ｖｇのＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジスによって全身治療し、１２週間の治療後に全ての筋肉を採取し、ジストロフィン及びＤＡＰＣ成分（β－サルコグリカンが示される）の復元に関して染色した。 図６Ａ～図６Ｄは、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７の毒性／安全性を実証する。以下の筋組織：前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、四頭筋（ＱＤ）、腰筋（ＰＳＯ）、三頭筋（ＴＲＩ）、及び横隔膜（ＤＩＡ）に関してヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を実施し、毒性を分析した（図６Ａ）。毒性は認められなかった。有効性の指標として、中心に位置する核（ＣＮ）を有する筋線維の数を定量化した（図６Ｂ）。ＣＮは筋変性・再生サイクルの指標となり、従ってＣＮの減少は治療効果を実証する。（図６Ｃ）は、治療によって総線維数が変化しないことを実証する。（Ｄ）にはクレアチンキナーゼの量が提供され、高用量における改善が示される。対応のないｔ検定を用いて差を検出した（ｐ＜０．０５）；データは平均値±ＳＥＭとして報告する。 ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドコンストラクトを示す。 ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン（ヒト）効力アッセイの結果を提供する。ｍｄｘマウスの前脛骨筋に３×１０^９、３×１０^１０、又は１×１０^１１ｖｇを注射した（ｎ＝３匹／群）。４週間後、筋肉を採取し、Ｎ末端Ｄｙｓ３抗体でジストロフィン発現に関して染色した。発現と用量との間には線形相関があり、３×１０^９ｖｇでは発現は極めて低く（無効レベル）、１×１０^１１ｖｇでは８９％の発現であった。 図９Ａ～図９Ｃは、ヒトマイクロジストロフィンが筋力産生及び伸張性収縮誘発性傷害からの保護を改善することを実証する。（Ａ）長趾伸筋（ＥＤＬ）及びＴＡのジストロフィンタンパク質免疫染色は、ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫ－マイクロジス（ヒト）を大腿動脈から注射した後のｍｄｘ筋線維における発現を示す。モック感染筋も同じ方法で染色しており、曝露時間は対応させる。（Ｂ）ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫマイクロジスでは、モック治療ｍｄｘ筋と比べて正規化比筋力が有意に増加した（Ｐ＜０．０５ 対ｍｄｘ）。（Ｃ）ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫ－マイクロジス（ヒト）を感染させたｍｄｘ筋を遺伝子導入後１２週間の時点で反復伸張性収縮時の筋力降下に関してモック感染対側ｍｄｘ ＥＤＬ筋及びＷＴ（ＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／１０）ＥＤＬ筋と比較した。ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫ－マイクロジストロフィン（マイクロジス）治療はモック治療ｍｄｘ筋と比較して筋力喪失を有意に防いだ（Ｐ＜０．００１ 対ｍｄｘ）。誤差はＳＥＭである。 核酸配列（配列番号３ ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン）を提供する。 同上。 同上。 同上。 核酸配列（配列番号５）ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを提供する。 同上。 同上。 同上。 ｒＡＡＶベクターｓｃＡＡＶｒｈ．７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９ｃ及び天然ｍｉＲ－３０骨格中のｍｉＲ－２９ｃのヌクレオチド配列及び予測されるヘアピン構造のヌクレオチド配列の概略図を提供する。 同上。 図１３Ａ～図１３Ｃは、早期併用療法が筋力を復元し、収縮誘発性損傷を防ぐことを実証する。強縮後の絶対（Ａ）及び正規化比筋力（Ｂ）の測定から、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋及びマイクロジストロフィン療法単独と比較した併用療法による筋力増強が実証された（^＊ｐ＜０．０５）。一元配置ＡＮＯＶＡ （Ｃ）次に反復伸張性収縮後の筋力喪失に関して筋肉を評価した。マウスをｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで同時に、及びマイクロジストロフィン単独で治療すると、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋＼－筋（赤色）と比較して筋力喪失からの保護が示された。二元配置ＡＮＯＶＡ（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。データは全て、平均値±ＳＥＭを表す （Ｄ）筋線維（緑色）及びコラーゲン含有量（赤色）を実証する代表的シリウスレッド染色像。 図１４Ａ～図１４Ｆは、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン併用療法の治療が線維化及びＥＣＭ発現の低減に有効であることを実証する。（Ａ）シリウスレッド染色は、両方の治療コホートにおけるコラーゲン染色の減少を示す。（Ｂ）ｑＲＴ－ＰＣＲにより、治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加が確認される（全ての群についてｎ＝２～３匹）一元配置ＡＮＯＶＡ。半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲは、対側肢及びＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンの単独療法と比較したＡＡＶ．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン治療筋肉におけるＣｏｌ１Ａ１及びＣｏｌ３Ａ１（Ｃ、Ｄ）、Ｆｂｎ（Ｅ）及びＴｇｆβ１（Ｆ）レベルの減少を示し、Ｃｏｌ１Ａ１及びＣｏｌ３Ａ１は有意である。Ｃ～Ｆ（ｎ＝２～３匹／群）一元配置ＡＮＯＶＡ。データは全て、平均値±ＳＥＭを表す（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。 図１５Ａ～図１５Ｄは、ＡＡＶ．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン併用療法の治療により線維直径が増加したことを実証する。（Ａ）治療後ｇａｓ（腓腹筋）重量は、ＷＴ又は未治療筋肉と比較して有意差を示さなかった。（Ｂ）ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療は平均線維サイズの増加を実証した。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－と比較すると、平均直径が２９．０２から３３．６１μｍに増加した（ｎ＝５～６匹／群）、一元配置ＡＮＯＶＡ。（Ｃ）同時送達により、野生型線維サイズ分布の方へのシフトが生じた。（Ｄ）ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ^２当たりの筋線維数については、未治療マウス又はＷＴマウスと差はなかった。Ｃ～Ｆ（ｎ＝５～５匹／群）、一元配置ＡＮＯＶＡ。データは全て、平均値±ＳＥＭを表す（^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

本発明は、ヒトマイクロジストロフィンを過剰発現する遺伝子療法ベクター、例えばｒＡＡＶベクター並びに筋ジストロフィー患者の線維化を低減及び予防する方法を提供する。本発明はまた、ｍｉＲ－２９を発現する遺伝子療法ベクターを、ＤＭＤ患者において欠失しているマイクロジストロフィンを発現する遺伝子療法ベクターと併用して投与することを含む、同時療法（併用）遺伝子療法の方法も提供する。

最も若いＤＭＤ診断年齢で採取された筋生検では、顕著な結合組織増殖が明らかになる。筋線維化は幾つもの形で有害である。それは結合組織関門を通じた筋内膜栄養素の正常な移行を減少させ、血流を減少させ、及び筋肉から血管由来栄養成分を欠乏させ、及び四肢拘縮によって機能的に早期歩行能喪失の一因となる。時間が経つにつれ、筋肉の顕著な線維化の結果として治療上の難題が増大する。これは、筋生検において連続的な時点で結合組織増殖を比較すると認めることができる。この過程は増悪し続け、歩行能喪失を招き、特に車椅子利用患者において制御不能に加速する。

早期治療、線維化を低減するための並行する手法がなければ、エクソンスキッピング、終止コドンリードスルー、又は遺伝子置換療法の利益をそもそも完全に実現できるとは考えにくい。小分子又はタンパク質補充戦略でさえも、筋線維化の低減手法がなければ失敗するものと思われる。線維化が既に存在する高齢ｍｄｘマウスをＡＡＶ．マイクロジストロフィンで治療した先行研究では、本発明者らが完全な機能的復元を実現できなかったことが実証された（Ｌｉｕ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１，２４５－２５６（２００５））。また、ＤＭＤ心筋症の進行に伴い心室壁の瘢痕化及び線維化が起こることも公知である。マイクロＲＮＡ送達は、免疫障壁がなく、送達が比較的容易であるため、特に画期的である。マイクロＲＮＡは小さく（約２００ｂｐ）、従って遺伝的欠陥を修正し又はそれを回避するための治療用カセットと共にＡＡＶにパッケージングすることができる。

本明細書で使用されるとき、用語「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの一般的な略語である。アデノ随伴ウイルスは一本鎖ＤＮＡパルボウイルスであり、同時感染するヘルパーウイルスによって特定の機能が提供される細胞内においてのみ成長する。現在、特徴付けられているＡＡＶの血清型は１３種ある。ＡＡＶの一般的な情報及びレビューについては、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１６９－２２８、及びＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１７４３－１７６４，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照することができる。しかしながら、様々な血清型が構造的にも機能的にも、更には遺伝子レベルでさえも非常に近似した関係にあることは周知であり、そのためこれらの同じ原理を別のＡＡＶ血清型に適用可能であろうことは十分に予想される（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，ｐｐ．１６５－１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．；及びＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１－６１（１９７４）を参照のこと）。例えば、全てのＡＡＶ血清型が、相同ｒｅｐ遺伝子によって媒介される極めて類似した複製特性を呈するように見え；及び全てが、ＡＡＶ２で発現するもののような３つの関連するカプシドタンパク質を担持している。関連性の程度は、ヘテロ二重鎖分析解析によってゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション；及び「逆方向末端反復配列」（ＩＴＲ）に対応する末端の類似した自己アニールセグメントの存在が明らかになることにより更に示唆される。同様の感染力パターンもまた、各血清型の複製機能が同様の調節管理下にあることを示唆している。

「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用されるとき、ＡＡＶ末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する１つ以上の目的のポリヌクレオチド（又はトランス遺伝子）を含むベクターを指す。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子産物をコードし且つそれを発現するベクターをトランスフェクトした宿主細胞に存在するとき、複製し、及び感染性ウイルス粒子にパッケージングされ得る。

「ＡＡＶビリオン」又は「ＡＡＶウイルス粒子」又は「ＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質とカプシド化したポリヌクレオチドＡＡＶベクターとで構成されるウイルス粒子を指す。この粒子が異種ポリヌクレオチド（即ち、哺乳類細胞に送達しようとするトランス遺伝子など、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、これは典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」又は単に「ＡＡＶベクター」と称される。従って、ＡＡＶベクター粒子内にはＡＡＶベクターが含まれるため、ＡＡＶベクター粒子の作製は必然的にかかるベクターの作製を含む。

ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子と、核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲとを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２及びＡＡＶ－１３を含め、組換えウイルスを送達し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってよい。シュードタイプｒＡＡＶの作製が、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。他の種類のｒＡＡＶ変異体、例えばカプシド突然変異を有するｒＡＡＶもまた企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照のこと。上記の背景の節で指摘したとおり、様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が当該技術分野において公知である。骨格筋特異的発現を促進するためには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８又はＡＡＶｒｈ．７４を使用し得る。

本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。このＤＮＡプラスミドが、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子となるようアセンブルするため、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）の感染許容性細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子の作製技法は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの作製には、単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞と称される）の中に以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個の（即ち、そこにない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能が存在する必要がある。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２及びＡＡＶ－１３を含め、組換えウイルスを誘導し得る任意のＡＡＶ血清型由来であってよく、且つｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型由来であってよい。シュードタイプｒＡＡＶの作製については、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレット（参照により全体として本明細書に援用される）に開示されている。

パッケージング細胞の作成方法は、ＡＡＶ粒子作製に必要な成分全てを安定に発現する細胞株を作り出すことである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いているｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個のＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを含むプラスミド（又は複数のプラスミド）が細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテール法（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）又は直接的に、平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次にパッケージング細胞株にアデノウイルスなどのヘルパーウイルスを感染させる。この方法の利点は、細胞を選択可能であり、大規模なｒＡＡＶ作製に好適なことである。好適な方法の他の例では、プラスミドよりむしろアデノウイルス又はバキュロウイルスを利用してｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がパッケージング細胞に導入される。

ｒＡＡＶ作製の一般的原理については、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）にレビューされている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８（１９８９）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０（１９９５）；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５（１９９３）；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２（１９９６）；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。前述の文献は、特にｒＡＡＶ作製に関連するこれらの文献の節を強調しつつ、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。

従って、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（コグネイト２９３株）などの安定形質転換癌細胞であってもよい。別の実施形態において、パッケージング細胞は、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル胎仔肺細胞）など、形質転換癌細胞でない細胞である。

本発明の組換えＡＡＶ（即ち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）はｒＡＡＶゲノムを含む。例示的実施形態において、両方のｒＡＡＶのゲノムがＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、即ち、ゲノムのＩＴＲ間にＡＡＶ ｒｅｐ又はｃａｐ ＤＮＡはない。本発明の核酸分子を含むように構築し得るｒＡＡＶの例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号明細書（国際公開第２０１３／０１６３５２号パンフレット）（全体として参照により本明細書に援用される）に示される。

ｒＡＡＶは、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によるなど、当該技術分野において標準的な方法によって精製し得る。ヘルパーウイルスからのｒＡＡＶベクターの精製方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９）；Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）；米国特許第６，５６６，１１８号明細書及び国際公開第９８／０９６５７号パンフレットに開示される方法が含まれる。

別の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、ｒＡＡＶと薬学的に許容可能な担体とを含む。本組成物はまた、希釈剤及び補助剤などの他の成分も含み得る。許容可能な担体、希釈剤及び補助剤は、被投与者にとって非毒性であり、好ましくは用いられる投薬量及び濃度で不活性で、緩衝液及びプルロニック（登録商標）などの界面活性剤が含まれる。

本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、詳細なｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的となる１つ又は複数の細胞型に応じて異なることになり、当該技術分野において標準的な方法によって決定し得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４ＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）又はそれ以上の範囲であり得る。投薬量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）単位で表されてもよい。

標的細胞にｒＡＡＶを形質導入するインビボ又はインビトロでの方法が、本発明により企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む有効用量、又は有効な複数用量の組成物をそれを必要としている動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。障害／疾患の発症前にこの用量が投与される場合、投与は予防的である。障害／疾患の発症後にこの用量が投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態において、有効用量は、治療下の障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和する（消失させる又は低減する）用量、障害／疾患状態への進行を減速させる又は防止する用量、障害／疾患状態の進行を減速させる又は防止する用量、疾患の程度を減じる用量、疾患の（部分的な又は全面的な）寛解をもたらす用量、及び／又は生存を延長させる用量である。本発明の方法による予防又は治療に企図される疾患の例は、ＦＳＨＤである。

併用療法又は同時療法もまた本発明により企図される。併用は、本明細書で使用されるとき、同時に行われる治療及び逐次的に行われる治療の両方を含む。本発明の方法と標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイド）との併用が、新規療法との併用と同じく特に企図される。

組成物の有効用量の投与は、限定はされないが、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、鼻腔、肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、又は腟を含め、当該技術分野において標準的な経路によることができる。１つ又は複数の投与経路及び本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（詳細には、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の１つ又は複数の血清型は、当業者により、治療下の感染及び／又は疾患状態並びにマイクロジストロフィンタンパク質を発現させようとする標的細胞／１つ又は複数の組織を考慮して選択され、及び／又は適合されてもよい。

本発明は、本発明のｒＡＡＶ及び組成物の有効用量の局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与は循環系への投与であり、体全体が影響を受けることになる。全身投与には、胃腸管を通じた吸収などの経腸投与、及び注射、注入又は移植を通じた非経口投与（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が含まれる。

詳細には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織内に輸送するであろう任意の物理的方法を用いることにより達成されてもよい。本発明に係る投与には、限定はされないが、筋肉内、血流中への、及び／又は肝臓内への直接の注射が含まれる。単にｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁すれば、筋組織発現に有用な媒体を提供するには十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと共投与し得る担体又は他の成分に関して制限は知られていない（しかしｒＡＡＶがある場合には普通に、ＤＮＡを分解する組成物は避けなければならない）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの詳細な目的の標的組織を標的とするように修飾されてもよい。例えば、国際公開第０２／０５３７０３号パンフレット（この開示は参照により本明細書に援用される）を参照のこと。医薬組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射用及び経皮輸送用の両方の数多くの製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするための任意の薬学的に許容可能な担体と共に使用することができる。

本明細書に開示される方法において投与されるｒＡＡＶの用量は、例えば、詳細なｒＡＡＶ、投与方法、治療目標、個体、及び標的となる１つ又は複数の細胞型に応じて異なることになり、当該技術分野において標準的な方法によって決定し得る。投与される各ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４から、又は約１×１０^１５ＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）又はそれ以上に及ぶ範囲であり得る。投薬量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）単位で表されてもよい（即ち、それぞれ、１×１０^７ｖｇ、１×１０^８ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、１×１０^１１ｖｇ、１×１０^１２ｖｇ、１×１０^１３ｖｇ、１×１０^１４ｖｇ、１×１０^１５）。投薬量はまた、体重１キログラム（ｋｇ）当たりのウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい（即ち、それぞれ、１×１０^１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ）。ＡＡＶ力価の決定方法は、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９（１９９９）に記載されている。

詳細には、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織内に輸送するであろう任意の物理的方法を用いることにより達成されてもよい。本発明に係る投与には、限定はされないが、筋肉内、血流中への、及び／又は肝臓内への直接の注射が含まれる。単にｒＡＡＶをリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁すれば、筋組織発現に有用な媒体を提供するには十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと共投与し得る担体又は他の成分に関して制限は知られていない（しかしｒＡＡＶがある場合には普通に、ＤＮＡを分解する組成物は避けなければならない）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが筋肉などの詳細な目的の標的組織を標的とするように修飾されてもよい。例えば、国際公開第０２／０５３７０３号パンフレット（この開示は参照により本明細書に援用される）を参照のこと。医薬組成物は、注射用製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射用及び経皮輸送用の両方の数多くの製剤がこれまでに開発されており、本発明の実施において使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするための任意の薬学的に許容可能な担体と共に使用することができる。

筋肉内注射の目的上、ゴマ油若しくはピーナッツ油などの補助剤中又はプロピレングリコール水溶液中の溶液を、並びに滅菌水溶液も、利用することができる。かかる水溶液は必要に応じて緩衝されてもよく、液体希釈剤は初めに生理食塩水又はグルコースで等張性にされてもよい。遊離酸（ＤＮＡが酸性リン酸基を含む）又は薬理学的に許容可能な塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｐｒｏｐｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などの界面活性剤と好適に混合した水中に調製することができる。ｒＡＡＶの分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中並びに油中に調製することができる。通常の貯蔵及び使用条件下では、こうした調製物は、微生物の増殖を防ぐため保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は、全て当業者に周知の標準技法により容易に入手可能である。

注射液としての使用に好適な医薬担体、希釈剤又は賦形剤には、滅菌水性溶液又は分散液及び滅菌注射用溶液若しくは分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。いずれの場合にも、その形態は無菌でなければならず、且つ易通針性が存在する程度に流動性でなければならない。それは製造及び貯蔵条件下で安定していなければならず、且つ細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合に必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらすことができる。

滅菌注射用溶液は、適切な溶媒中に必要な量のｒＡＡＶを適宜上記に列挙される種々の他の成分と共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製される。概して、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙されるものからの他の必要な成分を含有する滅菌媒体中に滅菌活性成分を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加的な所望の成分の粉末を予め滅菌ろ過されたその溶液から生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥法である。

ｒＡＡＶによる形質導入はまた、インビトロで行われてもよい。一実施形態において、対象から所望の標的筋細胞が取り出され、ｒＡＡＶで形質導入されて、対象に再導入される。或いは、同系又は異種筋細胞を使用することもでき、ここで細胞は、対象に不適切な免疫応答を生じさせることのないものである。

好適な形質導入方法、及び形質導入細胞を対象に再導入する方法は、当該技術分野において公知である。一実施形態において、細胞は、ｒＡＡＶを例えば適切な培地中で筋細胞と合わせて、目的のＤＮＡを有する細胞をサザンブロット及び／又はＰＣＲなどの従来技法を用いてスクリーニングすることによるか、又は選択可能なマーカーを用いることにより、インビトロで形質導入することができる。次に形質導入された細胞は、医薬組成物として製剤化し、その組成物を、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内注射によるか、又は平滑筋及び心筋への例えばカテーテルを使用した注射によるなど、様々な技法によって対象に導入することができる。

細胞を本発明のｒＡＡＶによって形質導入すると、マイクロジストロフィンタンパク質の持続的発現が起こる。従って本発明は、マイクロジストロフィンタンパク質を発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。こうした方法は、組織（限定はされないが、筋肉などの組織、肝臓及び脳などの器官、及び唾液腺などの腺を含む）を１つ以上の本発明のｒＡＡＶによって形質導入することを含む。形質導入は、組織特異的調節エレメントを含む遺伝子カセットで行われてもよい。例えば、本発明の一実施形態は、限定はされないが、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーなど、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２（Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１））、ヒト骨格筋アクチン遺伝子（Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７：４０８９－４０９９（１９８７））、心筋アクチン遺伝子に由来する調節エレメント、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照）及びマウスクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメント、骨格筋速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子及び遅筋トロポニンＩ遺伝子に由来する調節エレメント：低酸素誘導性核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８８：５６８０－５６８４（１９９１））、ステロイド誘導性エレメント及びグルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照）、及び他の調節エレメントを含めた筋特異的調節エレメントが指向する筋細胞及び筋組織を形質導入する方法を提供する。

筋組織は、生命維持に必要な重要器官でなく、且つ到達し易いため、インビボＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのマイクロジストロフィンの持続的発現を企図する。

「筋細胞」又は「筋組織」とは、あらゆる種類の筋肉（例えば消化管、膀胱、血管又は心臓組織の例えば骨格筋及び平滑筋）に由来する細胞又は細胞群が意味される。かかる筋細胞は、筋芽細胞、ミオサイト、筋管、心筋細胞及び心筋芽細胞など、分化細胞であっても、又は未分化細胞であってもよい。

用語「形質導入」は、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介した、レシピエント細胞によるマイクロジストロフィンの発現をもたらすインビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞へのマイクロジストロフィンのコード領域の投与／送達を指して使用される。

従って、本発明は、マイクロジストロフィンをコードするｒＡＡＶの有効用量（又は複数用量、本質的に同時に投与されるもの、又は間隔を置いて与えられる複数用量）をそれを必要としている患者に投与する方法を提供する。

実施例１
ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの作成
ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含む（図１を参照）。このマイクロジスコンストラクトはインフレームロッド欠失（Ｒ４～Ｒ２３）によって特徴付けられたが、一方、ヒンジ１、２及び４及びシステインリッチドメインは残り、１３８ｋＤａタンパク質を産生する。マイクロジストロフィンタンパク質（３５７９ｂｐ）の発現はＭＨＣＫ７プロモーター（７９５ｂｐ）によってガイドされた。イントロン及び５’ＵＴＲはプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する。マイクロジストロフィンカセットはＡＴＧ開始のすぐ前にコンセンサスコザックを有し、ｍＲＮＡ終結用の小さい５３ｂｐ合成ポリＡシグナルを有した。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８，２５３－２６１（２００２））によって以前記載されたとおりの（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含んだ。相補ＤＮＡはヒト使用にコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８，１０９－１１７（２０１０））。このベクターに含まれる唯一のウイルス配列は、ウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングの両方に必要なＡＡＶ２の逆方向末端反復配列であった。マイクロジストロフィンカセットは、ｍＲＮＡ終結用の小さい５３ｂｐ合成ポリＡシグナルを有する。

先行研究により、ＭＨＣＫ７プロモーターを使用した心臓での発現（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３２０－３２９（２００７）並びにＡＡＶｒｈ７４が骨格筋、横隔膜、及び心筋での発現を実現すること（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，２５６－２７０（２０１５））が確認されており、図１のコンストラクトの配列をＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化した。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンはアカゲザルリンパ節からクローニングされたもので、これについては、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。

実施例２
ｒＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンを使用した筋肉内発現研究
筋肉内注射によるヒトマイクロジストロフィンコンストラクト（ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン；実施例１に記載される）で発現研究を行った。ｍｄｘマウス（ジストロフィンを発現しない自然発生Ｄｍｄ^ｍｄｘ変異マウス）の前脛骨筋に１×１０^１１ｖｇのカセットを注射した（ｎ＝５匹／群）。６週間後、筋肉を採取し、ジストロフィン（Ｄｙｓ３）発現に関してジストロフィン用のＮ末端抗体で染色し、及びヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色した。図２は、未治療筋肉と比較して１×１０^１１ｖｇ用量での広範な遺伝子発現及び中心に位置する核の減少を示す。更に、マイクロジストロフィンコンストラクトによる治療後に平均線維／フレームの増加を伴う中心核形成の低下が認められた。ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの発現レベルを定量化すると、約７３％であった。

マイクロジストロフィンの局在及び発現レベルを測定することに加えて、カセットの筋肉内注射後に骨格筋筋力を測定した、ｎの測定及び定量化。ｐＡＡＶ．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンコンストラクトの筋肉内発現は、未治療の対照と比較して有意に高い絶対筋力及び比筋力の産生をもたらした（それぞれ、図３Ａ及び図３Ｂ）。

実施例３
ｍｄｘマウスへのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジスの全身送達
ｍｄｘマウスのコホートに２×１０^１２ｖｇ（８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ）又は高用量（予定臨床用量）６×１０^１２ｖｇ（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）のいずれかのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジスを６週齢で尾静脈から注射した。１２週間の治療後、全ての筋肉を採取し、ジストロフィン及びＤＡＰＣ成分の復元に関して染色した。全身注射（尾静脈）したマウスはあらゆる筋肉の全体にわたって高いジストロフィン染色レベルを示した。図４Ａは、６×１０^１２ｖｇ（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）全身投与後の骨格筋、横隔膜及び心筋線維の広範な形質導入を表す。図４Ｂは、各組織におけるマイクロジストロフィンを発現する筋線維の割合の定量化を示す。最後に横隔膜を機能改善に関して試験した（図４Ｃ）。低用量では有意差は認められなかった；しかしながら、高用量では有意な改善があった。重要なことに、図５は、マイクロジストロフィン送達後にＤＡＰＣの他の成分が完全に復元されたことを実証している。β－サルコグリカン（Ｂ－ＳＧ）を示す。

ベクターを表１に従い静脈内（ｉ．ｖ．）注射によってｍｄｘマウスの尾静脈に投与することにより、ＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジスの毒性／安全性を判定する。前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋（ＧＡＳ）、四頭筋（ＱＤ）、腰筋（ＰＳＯ）、三頭筋（ＴＲＩ）、及び横隔膜（ＤＩＡ）を含む分析した筋組織のいずれにも、毒性のエビデンスはなかった（図６Ａ及び図６Ｂ）。高用量６×１０^１２ｖｇ（２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ）では、中心に位置する核の数が減少した。歴史的に、未治療年齢対応ｍｄｘマウスにおける骨格筋の中心核形成は、平均して約８０％である。最後に、小標本サイズ（ｎ＝３匹）からの予備的データは、高用量治療マウスの血清中のＣＫ放出レベル（Ｕ／Ｌ）の低下を実証している（Ｄ）。対応のないｔ検定を用いて差を検出した（ｐ＜０．０５）；データは平均値±ＳＥＭとして報告する。

実施例４
ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンコンストラクトの作成
コドン最適化ヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ配列をドライブするＭＣＫ発現カセットをＡＡＶクローニングベクターｐｓｕｂ２０１に挿入することにより、ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドを構築した（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１０）：３０９６－３１０１）。このコンストラクトには、筋特異的遺伝子発現をドライブするため筋特異的調節エレメントが含まれた。この調節エレメントは、３５１ｂｐ ＭＣＫコアプロモーター（近位）に融合したマウスＭＣＫコアエンハンサー（２０６ｂｐ）を含んだ。コンストラクトは、コアプロモーターの後に、効率的な転写開始のための５３ｂｐ内因性マウスＭＣＫエクソン１（非翻訳）、続いてＳＶ４０後期１６Ｓ／１９Ｓスプライスシグナル（９７ｂｐ）及び小さい５’ＵＴＲ（６１ｂｐ）を含む。イントロン及び５’ＵＴＲはプラスミドｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来した。マイクロジストロフィンカセットはＡＴＧ開始のすぐ前にコンセンサスコザックを有し、ｍＲＮＡ終結用の小さい５３ｂｐ合成ポリＡシグナルを有する。ヒトマイクロジストロフィンカセットは、Ｈａｒｐｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８（３）：２５３－６１，２００２によって以前記載されたとおりの（Ｒ４～Ｒ２３／Δ７１～７８）ドメインを含む。

ｐＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンプラスミドは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接するヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含んだ（図７を参照）。この配列をＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化した。ＡＡＶｒｈ．７４血清型の分子クローンはアカゲザルリンパ節からクローニングされたもので、これについては、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎ．Ｍｅｄ．４５（２００７）に記載されている。

実施例５
ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを使用した効力及び用量分析
筋肉内注射によるヒトマイクロジストロフィンコンストラクト（ｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィン；実施例１に記載される）で発現研究を行った。ｍｄｘマウス（ジストロフィンを発現しない自然発生Ｄｍｄ^ｍｄｘ変異マウス）の前脛骨（ＴＡ）筋に３×１０^９、３×１０^１０、又は１×１０^１１ｖｇを注射した（ｎ＝３匹／群）。４週間後、筋肉を採取し、Ｎ末端Ｄｙｓ３に特異的な抗体を用いてジストロフィン発現に関して染色し、及びヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色した。図８は発現と用量との間の線形相関を示し、３×１０^９ｖｇでは発現は極めて低く（無効レベル）、１×１０^１１ｖｇでは８９％の発現であった。

実施例６
ｍｄｘマウスへのｒＡＡＶ．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンの血管送達
分離式肢灌流モデルのモデルを使用して（Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．５（４５）：１－１１，２００７）、ｍｄｘマウス（ｎ＝１０匹）に大腿動脈から１×１０^１１ｖｇのｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＣＫ．マイクロジストロフィンを注射し、実施されたアウトカム分析を行った。遺伝子導入の３ヵ月後、下肢筋を採取し、有効性研究により、筋力及び伸張性収縮誘発性傷害に対する抵抗性の両方の有意な改善が実証された（図９）。

長趾伸（ＥＤＬ）筋及びＴＡ筋におけるジストロフィンタンパク質免疫染色は、ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫ－マイクロジス治療後のｍｄｘ筋線維における発現を示す（図９Ａ）。モック感染筋も同じ方法で染色しており、曝露時間は対応させる。図９Ｂは、ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫ－マイクロジスにより、モック治療ｍｄｘ筋と比べて正規化比筋力が有意に増加したことを実証している（Ｐ＜０．０５ 対ｍｄｘ）。加えて、ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫ－マイクロジス（ヒト）を感染させたｍｄｘ筋を遺伝子導入後１２週間の時点で反復伸張性収縮時の筋力降下に関してモック感染対側ｍｄｘ ＥＤＬ筋（青色）及び野生型（ＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／１０）ＥＤＬ筋と比較した（図９Ｃ）。ｒＡＡＶｒｈ．７４－ＭＣＫ－マイクロジストロフィン（マイクロジス）治療はモック治療ｍｄｘ筋と比較して筋力喪失を有意に防いだ（Ｐ＜０．００１ 対ｍｄｘ）。

実施例７
同時送達ＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン＋ＡＡＶｒｈ７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃ
ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用遺伝子療法手法が線維化の低減に一層有益となり得るかどうかを決定するため、４週齢ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋＼－マウスが、各５×１０^１１ｖｇのＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン及びｒＡＡＶｒｈ７４．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃの筋肉内注射を左腓腹筋に受けた。ｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン、及びｒＡＡＶｒｈ．７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン単独。マウスは注射後１２週間の時点で分析した（これは初期治療と見なされる）。

ｐＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィンプラスミドは、図１０に示されるとおり、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接したヒトマイクロジストロフィンｃＤＮＡ発現カセットを含み、実施例１に詳細に記載される。ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化したのは、この配列である。

ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ｍｉＲ２９Ｃプラスミドは、ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接したｍｉＲ－３０ステムループ骨格におけるｍｉｒ２９ｃ ｃＤＮＡを含む。ＡＡＶｒｈ．７４ビリオンにカプシド化したのは、この配列である。加えて、ｍｉＲ－２９ｃ標的配列中にある数個のヌクレオチドを変更して、ｓｈＲＮＡ－ｍｉＲ（ｌｕｃ）にあるようなこの部位におけるワトソン・クリック対合を模倣した。ｓｈＲＮＡ－ｌｕｃ設計によれば、ヘアピンは、その長さ全体にわたって完全に相補的でなければならない。更に、パッセンジャー鎖を多く変更するほど、ステムによってｍｉＲＮＡを認識する可能性のあるｍｉＲ－２９プロセシングを制御する任意の内因性機構が消失する可能性が高くなる。図１２に示されるとおり、ガイド鎖の１９番目の塩基をシトシンに改変することにより、天然ｍｉ－２９ｃ配列において切断部位の前にあるヌクレオチドを模倣し、対合が保たれるように他方の鎖上の対応する塩基を変更した。

強縮後の絶対（図１３Ａ）及び正規化比（図１３Ｂ）の測定では、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－筋及びマイクロジストロフィン療法単独と比較して併用療法での筋力の増加が実証された（^＊ｐ＜０．０５）。次に筋肉を反復伸張性収縮後の筋力喪失に関して評価した。マウスをｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィンで同時に、及びマイクロジストロフィン単独で治療すると、未治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋＼－筋と比較して筋力喪失からの保護が示された（図１３Ｃ）。筋線維（緑色）及びコラーゲン含有量（赤色）を実証する代表的シリウスレッド染色像を図１３Ｄに示す。

注射１２ヵ月後にＧＡＳ筋を分析して、シリウスレッド染色及び続くＩｍａｇｅＪによる定量化によりコラーゲン蓄積を評価した。シリウスレッド染色は、両方の治療コホートにおけるコラーゲン染色の減少を示す（図１４Ａ）。更なるアウトカムには、ｍｉＲ－２９ｃ及びコラーゲン転写物レベルが含まれた。ｑＲＴ－ＰＣＲにより、治療コホートにおけるｍｉＲ－２９ｃ転写物レベルの増加が確認される（全群についてｎ＝２～３匹）一元配置ＡＮＯＶＡ（図１４Ｂ）。

ピクロシリウスレッド染色によって観察されたコラーゲンの減少を更に検証するため、筋肉に関して半定量的ｑＲＴ－ＰＣＲを実施して、Ｃｏｌ１Ａ、Ｃｏｌ３Ａ及びまた別のＥＣＭ成分であるフィブロネクチン（Ｆｂｎ）の転写物レベルを定量化した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析から、同時治療後のＣｏｌ１Ａ及びＣｏｌ３Ａの低下が見出された（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。この分析により、Ｆｂｎは同時治療コホートにおいてのみ有意に減少したことが明らかになった（図１４Ｅ）。

ＴＧＦ－β１は、以前、ジストロフィー筋において上方制御されることが示されており、線維化カスケードの惹起において役割を果たしている可能性がある。ＴＧＦ－β１は、ｍｉＲ－２９ｃを下方制御する既知の線維化促進サイトカインであり、コラーゲンの増加及び筋線維形成を伴う筋芽細胞から筋線維芽細胞への変換に関与する。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、未注射の筋肉及びいずれか一方の治療単独と比較して同時治療した筋肉でＴＧＦ－β１レベルが低かったことを示している（図１４Ｆ）。

ＡＡＶ．ＣＭＶ．ｍｉＲ－２９ｃ／ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン併用療法が筋線維直径に及ぼす効果もまた調べた。図１５に示されるとおり、併用療法では線維直径が増加した。図１５Ａ及び図１５Ｂは、ＭＨＣＫ７．マイクロジストロフィン治療後筋肉ｇａｓ（腓腹筋）重量がＷＴ又は未治療筋肉と比較して有意差を示さないが、一方、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療は平均線維サイズの増加を実証したことを実証している。ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－対照をｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン治療ｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／－と比較すると、平均直径が２９．０２から３３．６１μｍに増加した（ｎ＝５～６匹／群）。図１５Ｃは、併用療法がｍｄｘ／ｕｔｒｎ^＋／マウスにおいて野生型線維サイズ分布の方へのシフトを生じさせたことを実証している。図１５Ｄは、ｍｉＲ－２９ｃ／マイクロジストロフィン併用治療における１ｍｍ^２当たりの筋線維の数について、未治療マウス又はＷＴマウスと差がなかったことを示している。

抗線維化療法としてｒＡＡＶ．ｍｉＲ－２９ｃを使用した初期の結果からは、線維化の重要な寄与因子であるコラーゲンレベルの減少に伴い有益な効果があることが示唆される。更に、マイクロジストロフィンと併用して膜安定性を改善すると、ｍｉＲ２９上方制御が筋力を正常化した。

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３５． Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｐ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．ＡＡＶ．Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｙｓｆｅｒｌｉｎｏｐａｔｈｙ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ．Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２，２５６－２７０（２０１５）．
３６． Ｄｅ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｒｈ．１０ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｄｅｓｐｉｔｅ ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｃｏｍｍｏｎ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １３，６７－７６（２００６）．
３７． Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｌｉｍｂ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｇｈ ｖｏｌｕｍｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）．
３８． Ｂｕｌｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ｍｄｘ）ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８４；８１（４）：１１８９－１１９２．
３９． Ｓｉｃｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｄｘ ｍｏｕｓｅ：ａ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９８９ ３０；２４４（４９１２）：１５７８－８０

Claims (16)

1. ｉ）配列番号３のヌクレオチド２３６からヌクレオチド４８４２を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１２０から２０９１を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を含む筋ジストロフィーの治療用組成物。
2. ｉ）配列番号３のヌクレオチド２３６からヌクレオチド４８４２を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１２０から２０９１を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の筋力又は筋量を増加させるための組成物。
3. ｉ）配列番号３のヌクレオチド２３６からヌクレオチド４８４２を含むｉ）組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１２０から２０９１を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量を投与することを含む、筋ジストロフィー罹患対象の線維化を低減又は予防するための組成物。
4. 前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 筋肉内注射又は静脈内注射用に製剤化された、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 全身送達用に製剤化された、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
8. 注射、注入又は移植による非経口投与用に製剤化される、請求項７に記載の組成物。
9. 筋ジストロフィーの治療用医薬を調製するための、ｉ）配列番号３のヌクレオチド２３６からヌクレオチド４８４２を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１２０から２０９１を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用。
10. 筋ジストロフィー罹患対象における筋力又は筋量の増強用医薬を調製するための、ｉ）配列番号３のヌクレオチド２３６からヌクレオチド４８４２を含む組換えＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１２０から２０９１を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用。
11. 筋ジストロフィー罹患対象における線維化の低減又は予防用医薬を調製するための、ｉ）配列番号３のヌクレオチド２３６からヌクレオチド４８４２を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量、及びｉｉ）配列番号６のヌクレオチド１２０から２０９１を含む組換えＡＡＶベクターの治療有効量の使用。
12. 前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項９～１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 前記組換えＡＡＶベクターのうちの少なくとも１つが、血清型ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又はＡＡＶ１３である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の使用。
14. 前記医薬が筋肉内又は静脈内投与用に製剤化される、請求項９～１３のいずれか一項に記載の使用。
15. 前記医薬が全身送達用に製剤化される、請求項９～１３のいずれか一項に記載の使用。
16. 前記医薬が、注射、注入又は移植による非経口投与用に製剤化される、請求項１５に記載の使用。

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