CZ76297A3

CZ76297A3 - Způsob výroby modifikovaného pallidipinu - inhibitoru agregace krevních destiček vyvolané kolagenem

Info

Publication number: CZ76297A3
Application number: CZ97762A
Authority: CZ
Inventors: Christiane Noeske-Jungblut; Andreas Becker; Bernard Haendler
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1995-09-11
Publication date: 1998-01-14
Also published as: BG63276B1; FI971013A; PL184617B1; NO971110D0; RO117971B1; IL115272A0; NO971110L; ZA957649B; FI971013A0; PL319078A1; RU2186110C2; CA2199719A1; CN1075836C; US5882887A; MX9701720A; WO1996008563A1; EP0781334A1; AU3565795A; HUT76972A; BG101226A

Description

Vynález se týká způsobu výroby modifikovaného inhibitoru agregace krevních destiček vyvolané kolagenem, který se nazývá pallidipin. Dále se vynález týká modifikovaného pallidipinu.

Dosavadní stav techniky

Kolagen je nejúčinnější známá látka vyvolávající agregaci lidských krevních destiček. Krevní destičky se rychle slepují a aktivují například při poranění cévní stěny a vystavení působení kolagenu (H.R. Baumgartner (1977) Thromb. Haemostas. 37: 1-16; J. Hawiger (1987) Human Pathol. 18: 111-122).

Kolagenem vyvolaná agregace krevních destiček tak představuje rizikový faktor například pro pacienty podstupující procedury narušující cévy, například angioplastiku nebo sepsi, pro pacienty trpící infarkty myokardu a pro pacienty po léčení infarktu myokardu.

V některých případech je nezbytné inhibovat agregaci krevních destiček vyvolanou kolagenem. Jsou známé některé sloučeniny, které takovou agregaci inhibují. Například syntetické oligopeptidy inhibují agregaci krevních destiček vyvolanou kolagenem tím, že se váží na krevní destičky. Viz například Bevers a kol. (1985) Collagen Derived Octapeptide Inhibits Platelet Procoagulant Activity Induced by the Combined Action of Collagen and Thrombin, Thrombosis

Research, 37: 365-370; Karniguian a kol: (1983) Effect of a Collagen Derived Octapeptide on Different Steps of the Platelet/Collagen Interaction, Thrombosis Research 32: 593 až 604; Caen a kol. (1981) Oligopeptides with specific inhibiting properties of collagen-induced aggregation, process for preparing the same and pharmaceutical compositions containing them; a EPA 0 040 149.

Jiným příkladem inhibitoru agregace krevních destiček vyvolané kolagenem je.inhibitor neznámé struktury identifikovaný v hadím jedu. Viz Smith a kol.,

Identification o 50 kDalton snake venom proteins which specifically inhibit platelet adhesion to collagen. (1991) FEBS 283: 307-310.

Třetí takový inhibitor, ze slin medicinálních pijavic, je popsán v Munro a kol. (1991) Calin - a platelet adhesion inhibitor from the saliva of the medicinal leech, Blood Coagulation and Fibrinolysis 2: 179-184. Zveřejněná evropská patentová přihláška EP 0 480 651 (Merck & Co. Inc. zveřejněná 15. dubna 1992) popisuje protein mající molekulovou hmotnost kolem 16 kDalton (kD) a schopnost inhibovat agregaci lidských krevních destiček vyvolanou kolagenem, který je získán ze slinných žláz pijavic'Haemaenteria officinalis. LAPP je protein o molekulové hmotnosti 16 kDa z pijavic Haemaenteria officinalis, popsaný v Connolly a kol. (1992) J. Biol. Chem. 267: 6893-6898. Viz také Moubatin, popsaný v Waxman a Connolly (1993) J. Biol. Chem. 268: 5445-5449.

Další typ inhibitoru agregace krevních destiček vyvolané kolagenem je izolovatelný z hmyzu, jak je popsáno v Evropském patentovém spisu EP 0 530 937. Tyto proteiny jsou nazývány pallidipiny.

Alkalická fosfatáza (APáza) je protein Escherichia coli, který je vylučován do periplazmatického prostoru. APáza je syntetizována jako prekurzorový protein, má vedoucí sekvenci tvořenou jednadvaceti aminokyselinami, která je odštěpována vedoucí peptidázou během translokace přes vnitřní bakteriální membránu do periplazmatického prostoru (Y. Kikuchi a kol. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 5671-5678). Její biosyntéza je regulována koncentrací fosfátu v kultivačním mediu a exportu produktů heterologických genů umístěných po APázovém promotoru se dosahuje užitím nízkých koncentrací fosfátu (C. Monteilhet a kol. (1993) Gene 125: 223-228).

Přírodní zdroje proteinu pallidipin jsou omezeny. Logickým řešením výroby pallidipinu je užití biotechologických metod. Exprese pallidipinu v ledvinových buňkách mláďat křečků (EP 0 530 937) se děje rychlostí, která by se měla pro výrobu pallidipinu v průmyslovém množství zvýšit. Proto bylo třeba najít zlepšený systém získávání.

Vznikla tedy potřeba nalezení lepšího způsobu výroby rekombinantního pallidipinu, inhibujícího agregaci krevních destiček vyvolanou kolagenem, který by měl vysoký výtěžek a dovoloval reprodukovatelnou izolaci proteinu o vysokém stupni čistoty. Nový způsob nesmí negativně ovlivňovat biologickou aktivitu výsledného palidipinového proteinu.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že problém může být vyřešen způsobem výroby rekombinantního pallidipinového proteinu (Asp-pallidipin), kde Asp-pallidipin inhibuje agregaci krevních destiček savců vyvolanou kolagenem a kde Asp-pallidipin obsahuje:

i) protein (pallidipin) vybraný ze skupiny pallidipinových proteinů a ii) aminokyselinu kyselinu asparagovou, kde kyselina asparagová je spojena s N-terminálnim koncem pallidipinu peptidovou vazbou;

přičemž Asp-pallidipin má následující sekvence aminokyselin:

a) sekvence uvedené v

aa)	SEQ	ID	NO:	1;
bb)	SEQ	ID	NO:	2; nebo
cc)	SEQ	ID	NO:	3;

nebo

b) alelické varianty nebo modifikace nebo muteiny jakékoli ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3, kteréžto alelické variace, modifikace nebo muteiny nemají zásadní vliv na aktivitu proteinu, nebo

c) protein podle jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3 nebo jejich varianty nebo muteiny uvedené pod písmenem b), které mají posttranslační modifikace, které nemají zásadní vliv na aktivitu zralého proteinu;

který zahrnuje kroky:

aa) transfekci alespoň jedné bakterie vhodným vektorem, přičemž tento vektor obsahuje:

i) DNA nebo cDNA, kódující rekombinantní Asp-pallidipin, ii) vhodnou signální peptidovou sekvenci, kterážto signální sekvence je štěpena ták, že aminokyselina kyselina asparagová je v pozici +1 sekvence aminokyselin pallidipinu, a iii) vhodný promotor;

bb) expresi preproteinu obsahujícího Asp-pallidipin a signální peptidovou sekvenci;

cc) transport Asp-pallidipinu z cytoplazmy bakterie do periplazmy, za štěpení preproteinu alespoň jednou proteázou během transportu za vzniku Asp-pallidipinu, dd) izolaci Asp-pallidipinu extrakci periplazmy a ee) purifikaci Asp-pallidipinu.

Escherichia coli je rychlý expresní systém pro výrobu heterologických, například eukaryotických, proteinů.

Nesprávné složení proteinů během exprese eukaryotických genových produktů pomocí Escherichia coli je často problémem, který může vyústit ve snížení aktivity exprimovaných produktů. Pravděpodobnost správného složení proteinu je mnohem vyšší, když je protein transportován do periplazmy buňky Escherichia coli, než když je ponechán v cytoplazmě. Transport proteinů do periplazmy je vyvolán signální peptidovou sekvencí nápojenou na zralý protein. Tyto signální peptidové sekvence spolu se zralým proteinem jsou nazývány preproteiny. Správné štěpení preproteinu mezi signální peptidovou sekvencí a zralým proteinem je nezbytné pro expresi zralých eukaryotických proteinů v Escherichia coli. Sekvence signální sekvence a sekvence zralého proteinu má vliv na správné štěpení. Z tohoto důvodu ne všechny signální peptidové sekvence jsou kompatibilní se všemi kódovacími sekvencemi.

Je známo, že signální sekvence alkalické fosfatázy Escherichia coli je účinná pro export preproteinů. Ale je také známo, že kombinace dané signální peptidové sekvence a sekvence zralého proteinu nemusí nezbytně vyústit v dobrý postup přípravy preproteinu.

Překvapivě bylo zjištěno že výtěžek způsobu výroby podle vynálezu je patnáctinásobně vyšší, než výtěžek expresního systému využívajícího ledvinové buňky mláďat křečků. Tyto výsledky jsou uvedeny v příkladech provedení. Funkce a aktivita Asp-pallidipinu není ve srovnání s eukaryotickým expresním systémem křeččích ledvin, negativně ovlivněna způsobem podle vynálezu. Další výhodnou je, že proteáza (například vedoucí peptidáza) nezbytná pro štěpení preproteinu je produkována samotnou buňkou Escherichia coli.

Purifikace zralého Asp-pallidipinu za užití způsobu podle vynálezu je daleko snadnější, než purifikace exprimovaných proteinů produkovaných a uložených v cytoplazmě bakterie. K uvolnění Asp-pallidipinu nahromaděného v periplazmě je dostatečný osmotický šok.

Ve výhodném provedení DNA kódující signální peptidovou sekvenci kóduje signální sekvenci alkalické fosfatázy (APázy), výhodně APázy Escherichia coli.

Do rozsahu vynálezu patří způsob, kde vektor pro Asp-pallidipin podle vynálezu je odvozen od vektoru pSB94 (U. Boidol a kol. (1982) Mol. Gen. Genet. 185: 510-512) .

Dalším předmětem vynálezu je výše uvedený vektor a navíc vhodný signální peptid, vhodný promotor a, v případě potřeby, vhodný zesilovač transkripce. Vektory jsou popsány detailně v příkladech, a také v evropských patentových přihláškách EP 0 480 651, EP 0 462 632 a EP 0 173 177.

Výhodným hostitelem je bakterie Escherichia coli. Vhodné jsou také další mikroorganismy, například Bacillus subtilis.

Do rozsahu vynálezu navíc patří rekombinantní protein Asp-pallidipin, kde Asp-pallidipin inhibuje agregaci krevních destiček indukovanou kolagenem u savčích krevních destiček a kde Asp-pallidipin obsahuje:

i) protein (pallidipin) vybraný ze skupiny pallidípinových proteinů a ii) aminokyselinu kyselinu asparagovou;

kde kyselina asparagová je spojena s N-terminálním koncem pallidipinu peptidovou vazbou;

přičemž Asp-pallidipin má následující sekvence aminokyselin:

a) sekvence vybrané z

aa)	SEQ	ID	NO:	1;
bb)	SEQ	ID	NO:	2; nebo
cc)	SEQ	ID	NO:	3;

nebo

b) alelické varianty nebo modifikace nebo muteiny sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3, kterážto alelická varianta nebo modifikace nebo mutein mají v zásadě stejnou aktivitu, jako sekvence SEQ ID NO: 1 až 3 Asp-pallidipinu;

nebo

c) protein podle jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3 nebo jejich varianty nebo muteiny uvedené pod písmenem b), které mají posttranslační modifikace, které v zásadě neovlivňují aktivitu zralého proteinu.

Do rozsahu vynálezu také patří rekombinantní protein Asp-pallidipin, přičemž Asp-pallidipin inhibuje agregaci krevních destiček indukovanou kolagenem u savčích krevních destiček a Asp-pallidipin obsahuje:

i) protein (pallidipin) vybraný ze skupiny pallidípinových proteinů a ii) aminokyselinu kyselinu asparagovou, kde kyselina asparagová je spojena s N-terminálním koncem pallidipinu peptidovou vazbou;

přičemž Asp-pallidipin má následující sekvence aminokyselin:

a) sekvence uvedené v

aa)	SEQ	ID	NO:	i;
bb)	SEQ	ID	NO:	2; nebo
cc)	SEQ	ID	NO:	3;

nebo

b) alelické varianty nebo muteiny jakékoliv ze sekvenci SEQ ID NO: 1 až 3, kteréžto alelické varianty nebo muteiny neovlivňuji zásadně aktivitu proteinu, nebo

c) protein podle jakékoliv ze sekvenci SEQ ID NO: 1 až 3 nebo jejich varianty nebo muteiny uvedené pod písmenem b), které mají posttranslační modifikace, které v zásadě neovlivňují aktivitu zralého proteinu;

kde Asp-pallidipin je vyroben způsobem zahrnujícím kroky: aa) transfekci alespoň jedné bakterie vhodným vektorem, přičemž vektor obsahuje operabilní spojení:

i) první molekuly DNA nebo cDNA, kódující rekombinantní Asp-pallidipin, ii) druhé molekuly DNA kódující vhodnou signální peptidovou sekvenci a iii) vhodného promotoru;

přičemž při expresi je preprotein obsahující signální peptid a Asp-pallidipin štěpen tak, že aminokyselina kyselina asparagová je v pozici +1 sekvence aminokyselin zralého Asp-pallidipinu, bb) expresi preproteinu obsahujícího Asp-pallidipin a signální peptidovou sekvenci;

cc) transport Asp-pallidipinu z cytoplazmy bakterie do periplazmy za štěpení preproteinu alespoň jednou proteázou během transportu za vzniku zralého Asp-pallidipinu;

dd) izolaci Asp-pallidipinu extrakcí periplazmy a ee) purifikací Asp-pallidipinu.

V dalším výhodném provedení je Asp pallidipin vyroben způsobem zahrnujícím kroky:

kultivaci bakterie, která je transfektována vhodným vektorem, přičemž tento vektor obsahuje operabilní spojení:

přičemž při expresi je preprotein obsahující signální peptid a Asp-pallidipin štěpen tak, že aminokyselina kyselina asparagová je v pozici +1 sekvence aminokyselin zralého Asp-pallidipinu, za podmínek, kdy je exprimován preprotein obsahující Asp-pallidipin a signální peptidovou sekvenci a

Asp-pallidipin je transportován z cytoplazmy bakterie do periplazmy za štěpení preproteinu alespoň jednou proteázou během transportu za vzniku zralého Asp-pallidipinu a Asp-pallidipin je z periplazmy purifikován.

Výhodným proteinem je protein, ve kterém je signální peptidová sekvence signální sekvencí alkalické fosfatázy (APázy), výhodně APázy Escherichia coli.

Průmyslové užití proteinů podle vynálezu představuje užití proteinů jako farmaceutické kompozice obsahující protein podle vynálezu ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

Alelické variace nebo modifikace ve výše uvedeném významu zahrnují změny sekvence nukleotidů nebo aminokyselin, změny genotypu nebo fenotypu. Alespoň jeden nukleotid nebo jedna aminokyselina může být nahrazena, vypuštěna nebo vložena.

Většina vypuštěni (deleci), vloženi (inzerci) a náhrad (substituci) neni určena pro dosaženi radikálních změn ve vlastnostech proteinu podle vynálezu. Modifikované nebo mutované proteiny podle vynálezu mohou být rutině vyrobeny a prověřeny za účelem zjištění konkrétního důsledku substituce, delece nebo inzerce srovnáním funkcí modifikovaného nebo mutovaného proteinu s charakteristickými funkcemi proteinu podle vynálezu, například proteinů určených sekvencemi SEQ ID NO: 1 až 3, nebo s nativním pallidipinem, přičemž se zjišťuje, zda změněný protein má srovnatelnou aktivitu, například biologickou aktivitu.

Genetický kód je degenerativní; to znamená, že většina aminokyselin je kódována více než jedním kodonem tří nukleotidů. Proto alelické variace nebo modifikace v nukleotidové sekvenci mohou nebo nemusí měnit sekvenci aminokyselin. Proto jsou alelické variace primárně na úrovni DNA a mohou také existovat sekundárně na úrovni sekvencí aminokyselin.

Sekvence DNA kódující protein podle vynálezu může být modifikována konvenčními technikami za účelem produkce variací finálního proteinu podle vynálezu, které ještě mají v podstatě stejnou aktivitu jako protein podle vynálezu, například Asp-pallidipin sekvence SEQ ID NO: 1 až 3, nebo ve srovnání s původním palidipinovým proteinem. Aktivita se zjišťuje postupy uvedenými v příkladech provedení. Tak může být jedna nebo více aminokyselin, například 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 až 15 aminokyselin, přidáno, substituováno nebo

I odstraněno bez podstatného ovlivnění aktivity proteinu podle vynálezu. Pokud je žádoucí jemně modulovat aminokyselinové sekvence proteinu podle vynálezu, mohou být obecně užity substituce podle následující tabulky 1.

Podstatných změn ve funkci nebo imunologických vlastnostech se dociluje výběrem substitucí, které jsou méně konzervativní než ty, které jsou uvedeny v tabulce 1, to je výběrem zbytků, které se odlišují zásadněji co do zachování a) struktury polypeptidové kostry v oblasti substituce, jako je například listové nebo šroubovicové uspořádání, b) hydrofobicity molekuly nebo c) rozsahu bočních řetězců.

Tabulka 1

Normální substituce aminokyselin v proteinu

Původní zbytek	Příklad substituce
Ala	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile

Phe	Met,	Leu,
Ser	, Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp,	Phe
Val	Ile,	Leu

Muteiny jsou určeny homologií mezi dvěma srovnávanými proteiny. Výraz homologie zahrnuje podobnosti aminokyselin a mezer v sekvencích u obou srovnávaných sekvencí. Podobnost aminokyselin je uvedena například v tabulce 1. Výhodně zahrnují muteiny podle tohoto vynálezu sekvence aminokyselin majících alespoň 60% homologií, výhodněji alespoň 80% homologií, ještě výhodněji alespoň 90% a nejvýhodněji alespoň 95% homologií se sekvencí jednoho z proteinů o sekvenci SEQ ID NO: 1 až 3.

Výše uvedeným výrazem posttranslační variace jsou míněny změny během a po translaci, jako je tvorba disulfidových můstků a chemické modifikace aminokyselin.

Proteiny často tvoří kovalentní vnitrořetězcové vazby. Tyto disuífidové vazby se tvoří mezi aminokyselinovými zbytky cysteinu obsahujícími skupiny -SH ve složeném proteinu nebo v proteinu, který se skládá během translace. Tyto vazby stabilizují trojrozměrnou strukturu proteinu. Takovéto disuífidové vazby se zřídka tvoří v molekulách proteinů, které jsou ještě v buněčném cytosolu, protože vysoká intracelulární koncentrace glutathionu redukujícího vazby -SS- (disulfidické) má za následek štěpení většiny těchto vazeb. Jakmile jsou však proteiny mimo cytoplazmu, jsou vylučovány nebo jsou na povrchu buňky, často tvoří další kovalentní vnitrořetězcové vazby.

Navíc mohou být aminokyseliny změněny, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 91/10684. Jiné změny bočních řetězců aminokyselin jsou také možné.

Protein podle vynálezu má čistotu alespoň 40 %, výhodně alespoň 60 %, výhodněji alespoň 80 % a nejvýhodněji alespoň 90 %. Čistota je definována poměrem množství proteinu podle vynálezu a celkovým množstvím proteinu. Za užití purifikačních metod popsaných v příkladech provedení je čistota taková, že jiné proteiny než proteiny podle vynálezu nejsou detekovatelné.

Užitím purifikovaného proteinu podle vynálezu mohou být produkovány monoklonální protilátky za užití dobře známé metody podle Koehlera a Mílsteina, která zahrnuje užití purifikovaného proteinu jako imunogenu, kterým se obvykle imunizují myši nebo králíci, načež následuje produkce hybridomů myších nebo králičích buněk, které produkují protilátky.

Výhodné provedení vynálezu představuje protein uvedený v sekvenci SEQ ID NO: 1, který je exprimován v baktérii Escherichia coli kmen E 15.

Asp-pallidipin vykazuje farmakologickou aktivitu, a může tak být použitelný ve farmacii. Asp-pallidipin může být užit ve farmaceutické kompozici obsahující Asp-pallidipin ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem. Vynález se tak navíc týká farmaceutické kompozice obsahující farmaceuticky aktivní Asp-pallidipin podle vynálezu a farmaceuticky přijatelnou sůl nebo farmaceuticky přijatelný nosič.

Asp-pallidipin zvláště inhibuje agregaci krevních destiček způsobenou kolagenem a inhibuje adhezi nádorových buněk, přednostně metastatických nádorových buněk, na kolagen.

Asp-pallidipin inhibuje agregaci krevních destiček.

Testovací systém je popsán v příkladech provedení.

Asp-pallidipin významně inhibuje agregaci destiček při koncentracích od 0,5 do 50 pg proteinu. Nejvýhodnější Asp-pallidipin, protein sekvence SEQ ID NO: 1, vykazuje hodnotu IC₅₀ 50 nmol/1 vysoce čistého proteinu podle příkladů provedení. Asp-pallidipin inhibuje agregaci destiček při koncentracích od 5 nmol/1 do asi 1000 nmol/1.

Výsledky testů prováděných v systémech in vitro ukazují, že proteiny podle vynálezu mohou být užity jako léčiva nebo mohou být užity pro medicinální ošetření. Výsledky testů v systému in vitro mohou být korelovány se systémem in vivo, neboť tento systém je již v této oblastí vypracován. R.J. Shebuski a kol. (1990) Thrombosis and Haemostasis, 64: 576 až 581.

Asp-pallidipin může být podáván formou intraperitoneálních injekcí, které mohou být aplikovány denně nebo 2 až 3 krát za týden. Pokud zvířata dostávají injekce denně za účelem dosažení koncentrace 100 nmol/1, redukuje se agregace jejich krevních destiček. Za těchto podmínek nejsou pozorovány žádné vedlejší účinky. Asp-pallidipin způsobuje inhibici krevních destiček u myši při denní dávce, kterou se dosahuje koncentrace v krvi od asi 10 nmol/1 do 1000 nmol/1.

Asp-pallidipin je tak vhodný pro léčení atherosklerotických nebo thrombotických stavů nebo pro prevenci reokluze po léčení infarktu myokardu. Asp-pallidipin může být užit jako antiatherosklerotické a antithrombotické činidlo u savců včetně lidí, například pro léčeni atherosklerotických/thrombotických lézí, způsobených například protržením atherosklerotických povlaků nebo porušením nebo odstraněním endothelia, například při sepsi nebo transplantaci, nebo při léčení nestabilní anginy. Může být také použit k prevenci reokluze po léčení infarktu myokardu fibrinolýzou·nebo angioplastikou (PTCA). Jestliže je fibrinolytická terapie (pomocí streptokinázy, t-PA nebo jinými aktivátory plasminogenu) aplikována pro léčení infarktu myokardu, Asp-pallidipin může být užit jako přídavné činidlo pro prevenci reokluze cévy. Ošetření infarktu myokardu balónovým katetrem (PTCA) také poškozuje stěny cév, což může vést k tvorbě nových thrombů. Tomu se může zabránit podáváním Asp-pallidipinu během procedury nebo po ní. Asp-pallidipin může být užit při koronární angioplastice stejně jako při jiných angioplatických aplikacích.

Do rozsahu vynálezu patří

a) použití proteinu podle vynálezu pro výrobu léčiva pro ošetření atherosklerotických nebo thrombotických chorob nebo pro prevenci reokluze po ošetření infarktu myokardu (proteiny jsou vhodné jako profylakticky účinné prostředky pro ošetření pacientů, o nichž je známo, že je u nich riziko vzniku choroby nebo chorobného stavu);

b) způsob ošetření atherosklerotických nebo thrombotických chorob nebo prevence reokluze po ošetření infarktu myokardu, který zahrnuje podávání účinného množství proteinu podle vynálezu k omezení choroby u pacienta vyžadujícího toto ošetření;

c) farmaceutickou kompozici pro ošetření atherosklerotických nebo thrombotických chorob nebo pro prevenci reokluze po ošetření infarktu myokardu, která obsahuje protein podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

Pro tato užití se bude samozřejmě lišit vhodné dávkování v závislosti například na druhu použité sloučeniny podle vynálezu, na pacientovi, na způsobu podávání a na povaze a závažnosti léčeného stavu. Obecně však lze uspokojivých výsledků na zvířatech dosáhnout při denní dávce dostatečné k dosažení koncentrace v krvi od 10 do 1000 nmol/1, výhodně při denní dávce od 30 do 300 nmol/1.

Proteiny podle vynálezu mohou být podávány jakýmkoli obvyklým způsobem, zvláště enterálně nebo parenterálně, například formou injekčních roztoků nebo suspenzí. Výhodná je intraperitoneální injekce.

Výhodnou sloučeninou je protein o sekvenci SEQ ID NO: 1.

Do rozsahu vynálezu spadá farmaceutická kompozice obsahující sloučeniny podle vynálezu ve spojení s alespoň jedním farmaceutickým nosičem nebo ředidlem. Tyto kompozice mohou být vyráběny obvyklým způsobem. Viz Remington's Pharmaceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980).

Proteiny podle vynálezu také inhibují adhezi metastatíckých nádorových buněk na kolagen. Testovací systém je popsán v příkladech provedení. Proteiny podle vynálezu vykazují významnou inhibici adheze metastatíckých nádorových buněk na kolagen v koncentraci od 1 do 100 pg proteinu.

Zkoušky nejvýhodnějšího proteinu, proteinu o sekvenci SEQ ID NO: 1, ukazují, že hodnota IC₅o je 100 nmol/1 vysoce čistého proteinu podle příkladů 2 až 15. Proteiny podle vynálezu vykazují inhibici adheze metastatických nádorových buněk na kolagen v koncentraci od 10 do 2000 nmol/1.

Výsledky testů v systémech in vitro ukazují, že proteiny podle vynálezu mohou být užity jako léčiva nebo mohou být užity pro medicinální ošetření. Tyto výsledky mohou být převedeny ze systému in vitro do systému in vivo, neboť tento systém je již v této oblasti vypracován. Chán a kol. (1990), Science, 2: 1600 - 1602.

Proteiny podle vynálezu mohou být podávány během nebo po chirurgické operaci primárního tumoru za účelem prevence tvorby metastáz oddělenými nádorovými buňkami, které mohou během operace vstupovat do krevního řečiště. Tento antimetastatický účinek může být demonstrován na experimentálním a spontánním zvířecím modelu, jak je popsáno v Chán a kol. (1990), Science, 2: 1600 - 1602.

Proteiny podle vynálezu mohou být podávány intraperitoneálními injekcemi, které se aplikují denně nebo 2 až 3 krát za týden. Pokud zvířata dostávají injekce denně za účelem dosažení koncentrace 200 nmol/1, redukuje se adheze metastatických nádorových buněk zjištěná spočítáním center usazených metastatických buněk. Za těchto podmínek nejsou pozorovány žádné vedlejší účinky.

Proteiny podle vynálezu vykazují inhibici adheze metastatických nádorových buněk na kolagen u myší při denní dávce, kterou se dosahuje koncentrace v krvi od 20 nmol/1 do 2000 nmol/1, výhodně koncentrace od 60 nmol/1 do 600 nmol/1.

Proteiny podle vynálezu tak jsou vhodné pro léčení rakoviny, zvláště rakoviny s metastatickými nádorovými buňkami, nejvýhodněji s vysoce matastatickými nádorovými buňkami.

Vynález se tak týká

a) použití proteinu podle vynálezu pro výrobu léčiva pro ošetření rakoviny s metastatickými nádorovými buňkami (proteiny jsou tak vhodné pro profylakticky účinná léčiva podávaná před, například, chirurgickým odstraněním tumorů);

b) způsobu ošetření rakoviny s metastatickými nádorovými buňkami, který zahrnuje podávání proteinu podle vynálezu v množství účinně omezujícím chorobu pacientovi, který takovéto ošetření potřebuje;

c) farmaceutické kompozice pro ošetření rakoviny s metastatickými nádorovými buňkami, která obsahuje protein podle vynálezu a farmaceuticky vhodný nosič nebo ředidlo.

Pro tato užití se bude samozřejmě lišit vhodné dávkování v závislosti například na druhu použité sloučeniny podle vynálezu, na pacientovi, na způsobu podávání a na povaze a závažnosti léčeného stavu. Obecně však lze uspokojivých výsledků na zvířatech dosáhnout při denních dávkách dostatečných k dosažení koncentrace v krvi od 20 do 2000 nmol/1, výhodně při denních dávkách od 60 do 600 nmol/1.

Proteiny podle vynálezu mohou být podávány jakýmkoli obvyklým způsobem, zvláště enterálně nebo parenterálně, například formou injekčních roztoků nebo suspenzí.

Výhodnou sloučeninou je protein o sekvenci SEQ ID NO: 1.

Vynález zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující sloučeniny podle vynálezu ve spojení s alespoň jedním farmaceutickým nosičem nebo ředidlem. Tyto kompozice mohou být vyráběny obvyklým způsobem. Viz Remington's Pharmaceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980).

Do rozsahu vynálezu spadají také sekvence DNA, vektory obsahující tyto sekvence, buňky obsahující tyto vektory, metody rekombinantní produkce proteinů a protilátek proti proteinům podle vynálezu. Vynález zahrnuje také izolované a/nebo rekombinantní sekvence DNA (například genomovou nebo cDNA) kódující protein, který inhibuje agregací lidských krevních destiček vyvolanou kolagenem. V dalším provedení vynález poskytuje rekombinantně produkované proteiny podle tohoto vynálezu, například mající zde uvedené sekvence.

Výrazem izolovaný je míněno, že inhibitor podle tohoto vynálezu nebo jiná entita jsou přítomny ve formě oddělené (přečištěné) od složek, se kterými jsou produkovány rekombinantně nebo synteticky. Všechny stupně takové izolace nebo purifikace jsou míněny genericky. Výhodné jsou takové stupně izolace a purifikace (čištění), kterými se připraví inhibitor vhodný pro farmaceutické účely. Takovéto stupně izolování (například aktivity nebo čistoty) mohou být běžně dosaženy chromatografickými technikami, jako jsou techniky užité v příkladech provedení vynálezu. Další purifikace, například k dosažení homogenity, může být běžně dosažena užitím konvenčních me^od, jako jsou metody popsané v následujících publikacích:

Methods of Enzymology, Svazek 182, Guide to Protein

Purification, ed. Murray P. Deutscher, Academie Press 1990;

Protein Purification Applications - A Practical Approach, ed. E.L.V. Harris and S. Angel, IRL-Press 1990;

Protein Purification, Principles and Practice, Robert Scopes, Springer-Verlag 1982;'a

Protein Purificaton, Principles, High Resolutin Methods and Applications, ed. J.-C. Janson and L. Ryden, VCH publishers 1989.

Čistota může být určena jakoukoli běžnou metodou, například elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu, analytickou HPLC a tak dále. Purifikovaný inhibitor může být užit k určení sekvence aminokyselin proteinu podle metod běžně známých odborníkovi v oboru. Hewíck, R.M. a kol.

(1981), J. Biol. Chem. 256, 7990 - 7997.

Sekvence aminokyselin inhibitoru podle vynálezu může být užito k určení sekvence vhodných vzorků DNA, kterých může být užito pro nalezení nových inhibitorů, například u jiných druhů. Tyto vzorky mohou být rutině syntetizovány, například užitím automatických syntetizátorů DNA, a screening knihoven genomových nebo cDNA je obdobně rutinní záležitostí pro odborníka v oboru (Viz mezinárodní přihlášku WO 90/07861 z 26. července 1990) .

Do rozsahu vynálezu také patří sekvence DNA odpovídající (kódující) jak sekvenci DNA (genu) pro Asp-pallidipin, když je izolován z přirozeného prostředí, například v roztoku nebo na vektoru, tak jejím muteinům. Metody produkce muteinů jsou také běžně známé a běžné pro odborníka v oboru, stejně jako screening metod testování účinnosti takovýchto nových proteinů, například těch, které jsou zde popsány.

Vhodné muteiny jsou ty, které mají alespoň část, například alespoň 5 %, výhodně alespoň 50 %, nejvýhodněji alespoň 90 % biologické aktivity, například inhíbice agregace krevních destiček vyvolané kolagenem, jako má zde popsaný inhibitor.

Dále do rozsahu vynálezu patří způsob purifikace, přičemž purifikace zahrnuje následující postupné kroky:

i) purifikací iontově výměnnou chromatografií na katexu, ii) purifikací iontově výměnnou chromatografií na anexu a iii) purifikací na základě rozdílu velikostí.

Má se za to, že odborník v oboru je schopen bez dalšího upřesnění za užití předchozího popisu využít v plné míře tento vynález. Následující výhodná provedení vynálezu jsou proto uvedena pouze pro ilustraci bez toho, že by se na ně vynález jakýmkoli způsobem omezoval.

V následujících příkladech provedení vynálezu jsou všechny teploty uvedeny ve stupních Celsia; a, pokud není uvedeno jinak, všechny díly a procenta jsou hmotnostní.

Kompletní závěry všech přihlášek, patentů a publikací, které jsou výše a níže citovány, včetně EP 94250224.6, podané 2. září 1994, jsou zde začleněny formou odkazu.

Příklady provedení

Příklad 1

Konstrukce expresívního vektoru

Pro konstrukci vektoru kódujícího Asp-pallidipin podle vynálezu se využívá následujícího mediátorového a antimediátorového primeru:

p3:

5'-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3' (Nrul) (SEQ ID NO:4) a p4:

5'-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC-3' (BamHI) (SEQ ID NO:5).

PCR je pro 8 cyklů 2 minuty při 94 °C, 1 minuta a 30 sekund při 42 °C a 2 minuty a 30 sekund při 72 °C při užití p3 a p4 jako příměrových párů a 1 pg matricové DNA. Po gelové purifikaci a digesci s Nrul a BamHI je fragment subklonován do pSB/pho. Plazmid je připraven digesci Xmal následovanou zpracováním mungovými boby pro obnažení 5' konce a digesci BamHI.

Konstrukt je prověřen sekvenční analýzou kompletních řetězců DNA vložených fragmentů za užití metody ukončení dideoxy řetězce (F. Sanger a kol. (1977) Proč. Nať 1 Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) a sekvenčním kitem s [³⁵S]dATP. Transformace příslušné E. coli E15 s pallidipinovým expresívním konstruktem nebo prázdným plazmidem (simulovaná transformace) se provádí za užití standardních metod (J. Sambrook a kol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Příklad 2

Exprese a extrakce Asp-pallidipinu

Pro plazmid pSB/pho (odvozený od pSB94, viz J. Daum a kol.(1989) Eur. J. Biochem. 185: 347-354) jsou jednonoční kultury E15 (S.J. Hayashi a kol. (1964) J. Biol. Chem. 239: 3091-3106) zředěny na 8 % (objem/objem) v mediu o nízkém obsahu fosfátů a kultivovány při 37 °C po dobu 6 hodin (A. Becker a kol. (1994) Protein Expression and Purification 5: 50-56). Bakterie jsou po indukci zpracovány odstředěním a resuspendováním v objemovém poměru 1:10 v roztoku 50 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,0) / 100 mmol/1 NaCl. Tento preparát je zmražen, rozpuštěn a odstředěn, přičemž je takto získána první frakce supernatantu (SNI). Bakteriální pelety jsou resuspendovány a před odstředěním ekvilibrovány 10 minut při pokojové teplotě v 0,5 mol/1 roztoku sacharózy. Supernatant (SN2) je uchován pro analýzu, zatímco pelety se znovu resuspendují v ledové vodě doplněné 1 mmol/1 PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid) a inkubovány pro dobu 10 minut na ledu. Po tomto osmotickém šoku jsou buňky odstředěny a je odebrán supernatant (SN3). Pelety obsahující cytoplazmatickou frakci (CF) jsou resuspendovány v roztoku 50 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,0) / 100 mmol/1 NaCl.

Příklad 3

Purifikace rekombinantního Asp-pallidipinu

Supernatantová frakce obsahující převážnou část

Asp-pallidipinu (SNI) je upravena na pH 4,0 pomocí kyseliny octové a aplikována na katexovou kolonu (Mono S, Pharmacia) za užití systému FPLC. Po promývání za užití gradientu od 0 do 500 mmol/1 NaCl v acetátu sodném o pH 4,0 se dosáhne eluce Asp-pallidipinu užitím roztoku 20 mmol/1 NaPi, pH 7,0. Eluované frakce obsahující Asp-pallidipin, jak vyplývá z elektroforézy na SDS-polyakrylamidovém gelu (PAGE) a z imunologických stanovení, se spojí, upraví na pH 8,0 a aplikují na anexovou kolonu (Fractogel-EMD-TMAE 650, Merck). Eluce Asp-pallidipinu je dosažena gradientem 0 až 1 mol/1

NaCl ve 20 mmol/1 acetátu sodného o pH 8,4. Pro konečnou purifikaci jsou eluční frakce obsahující Asp-pallidipin spojeny, zkoncentrovány v Seed-Vac (Bachofer) a podrobeny vylučovací chromatografii za užití Superose 12 (Pharmacia).

Příklad 4

Zkouška agregace krevních destiček

Zkouška se provádí v zásadě podle postupu popsaného v publikaci C. Noeske-Jungblut (C. Noeske-Jungblut (1994) J. Biol. Chem. 269: 5050-5053). Ve stručnosti: lidská krev je shromážděna v objemovém poměru 1 : 6 v roztoku 71 mmol/1 kyselina citrónová / 85 mmol/1 citrát trisodný / 111 mmol/1 glukóza. Plazma bohatá na krevní destičky se získá odstředěním při 135 G po dobu 20 minut. Asp-pallidipin se inkubuje s 500 μΐ plazmy bohaté na krevní destičky po dobu 1 minuty při 37 °C před přidáním kolagenu (2 pg/ml). Agregace je monitorována za užití agregometru Micron a vyhodnotí se maximální hodnota. IC₅₀ má hodnotu kolem 50 nM. Nelze pozorovat podstatný rozdíl mezi sloučeninami, které mají či nemají Asp na první pozici.

Vyhodnocuje je biologická aktivita a výtěžek Asp-pallidipinu purifikovaného z periplazmatického prostoru Escherichia coli. Plazma bohatá na krevní destičky je inkubována s Asp-palidipinem a kontrolními vzorky. Agregace se dosahuje přidáním kolagenu. Divoký typ pallidipinu purifikovaného ze slin je užit jako pozitivní kontrolní vzorek. Dále jsou jako kontrolní vzorky užity další konstrukty, přičemž se prokazují výhody Asp-pallidipinu podle vynálezu. Proteiny podle vynálezu a kontrolní vzorky vykazují odlišné výtěžky (tabulka 2).

Tabulka 2

Druh	Výtěžek
rekombinantní pallidipin	4 61 pg
rekombinantní arginyl-pallidipin	298 pg
rekombinantní aspartyl-pallidipin	864 pg
Příklad 5

Adheze nádorových buněk na kolagen klesá v přítomnosti proteinu podle vynálezu

Protein podle vynálezu inhibuje adhezi nádorových buněk na kolagenovou matrici. Pokud je protein podle vynálezu v plazmě nebo krvi pacienta, může být částečně nebo zcela zabráněno migraci nádorových buněk a jejich usídlování v orgánech nebo v krevním řečišti.

Buňky MTLn3 (prsní nádorové buňky krys) byly označeny ⁵¹Cr. Testovací destička s prohlubněmi byla pokryta kolagenem (typ III) přes noc při 4 °C. 2 x 10⁴ označených buněk v 500 pl media DMEM F12, 20 mmol/1 Hepes, 1 mmol/1 bikarbonátu, 1 %

BSA bylo inkubováno nejprve s 0, 2, 5 nebo 10 pl proteinu podle vynálezu (Superose Pool, 0,5 mg proteinu na ml) po dobu 10 minut při 37 °C. Potom byla suspenze přemístěna do prohlubní pokrytých kolagenem a inkubována po dobu 2 hodin při 37 °C. Poté byly prohlubně opláchnuty a ulpělé buňky byly odstraněny pomocí NaOH o koncentraci 1 mol/1. Byla zjišťována radioaktivita ulpělých buněk.

Tabulka 3

Množství přidaného inhibitoru (pl) 0 ulpělé buňky (cpm) 2215

2071

1608

1081

Příklad 6: Produkce protilátky

Asi 100 pg inhibitoru purifikovaného podle příkladů provedení bylo přidáno do 0,5 ml kompletního Freundova činidla a emulze byla injektována s. c. do králíka. Po 2 týdnech se provedlo druhé přeočkování, které sestávalo z asi 80 pg purifikovaného inhibitoru a 0,5 ml nekompletního Freundova činidla. Po injekci bylo odebráno několik vzorků séra pro kontrolu produkce specifických protilátek. Byly stanovovány ve „Western blot. 20 ng purifikovaného inhibitoru se aplikovalo na 12,5% SDS-polyakrylamidový gel a elektroforéza, vybarvení skvrn a detekce byly provedeny standardními metodami popsanými v E. Harlowe, D. Lané (1988) Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory (ředění testovacího séra 1 : 500, kozí antikráličí peroxidázou konjugovaný IgG jako druhá protilátka, detekce kitem ECL od Amersham International, Amersham, UK). Skvrny ukazují, že antiserum specificky reaguje s purifikovaným inhibitorem.

Výše uvedené příklady provedení mohou být zopakovány se stejným úspěchem, užijí-li se obecně či specificky popsané reaktanty a/nebo pracovní podmínky podle vynálezu náhradou za ty, které jsou popsány v předchozích příkladech.

Z výše uvedeného popisu může odborník v oboru snadno zjistit základní znaky vynálezu a, aniž by opustil duch a rozsah vynálezu, může udělat různé změny a modifikace vynálezu, aby ho přizpůsobil různým použitím a podmínkám.

Seznam sekvencí

1) Obecné informace:

i) A) Přihlašovatel: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT

B) Ulice : Muellerstrasse 172 - 178

C) Město : Berlín

E) Země : Německo

F) Poštovní kód (ZIP) : 13353

G) Telefon : (030) - 468-2085

H) Fax : (030) - 468-2058 ii) Název vynálezu: Způsob výroby modifikovaného pallidipinu - inhibitoru agregace krevních destiček vyvolané kolagenem iii) Počet sekvencí: 5 iv) Počítačová forma :

A) Medium : disketa

B) Počítač : IBM PC kompatibilní

C) Operační systém : PC-DOC/MS-DOS

D) Software : Patentln Release #1.0, verze #1.30 (EPO)

v) Aktuální data přihlášky

Číslo přihlášky : EP 94250224.6

2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 1

i) Vlastnosti sekvence:

A) Délka: 172 aminokyselin

B) Typ: aminokyselinový

C) Charakter řetězce : jednoduchý

D) Topologie: linerární ii) Typ molekuly: protein iii) Hypotetický: ne

v) Typ fragmentu: N-terminální xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1

Asp 1

Glu

Cys

Glu 5

Leu

Met Pro

Pro

Gly 10

Asp

Asn Phe

Asp

Leu Glu 15

Lys

Tyr

Phe

Ser

Ile

Pro

His

Val

Tyr

Val

Thr

His

Ser

Arg

Asn

Gly

20

25

30

Pro

Lys

Glu

Gin

Val

Cys

Arg

Glu

Tyr

Lys

Thr

Lys

Asn

Ser

Asp

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Ser

Asp

Tyr

Lys

Thr

Gly

50

55

60

Lys

Pro

Tyr

His

Ser

Glu

Leu

Lys

Cys

Thr

Asn

Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

65

70

75

80

Gly

Lys

Gly

Gin

Phe

Ser

Val

Glu

Cys

Glu

Val

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

85

90

95

Gly

Lys

Ile

His

Val

Glu

Thr

Ser

Val

Ile

Ala

Thr

Asp

Tyr

100

105

110

Lys

Asn

Tyr

Ala

Leu

Gin

Ser

Cys

Thr

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

Ile

115

120

125

Ala

Asp

Val

Leu

Gin

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

Asp

Pro

130

135

140

Gly

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Lys

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Leu

Asp

Trp

145

150

155

160

Phe Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys 165 170

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 2

i) Vlastnosti sekvence:

A) Délka: 171 aminokyselin

B) Typ: aminokyselinový

C) Charakter řetězce : jednoduchý

D) Topologie: linerární ii) Typ molekuly: protein iii) Hypotetický: ne xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2

Asp 1

Glu

Cys

Glu 5

Leu Met

Pro

Pro Gly 10

Asp

Asn

Phe

Asp

Leu 15

Glu

Lys

Tyr

Phe

Ser

Ile

Pro

His

Val

Tyr

Val

Thr

His

Ser

Arg

Asn

Gly

20

25

30

Pro

Lys

Glu

Gin

Val

Cys

Arg

Glu

Tyr

Lys

Thr

Lys

Asn

Ser

Asp

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Ser

Asp

Tyr

Lys

Thr

Gly

Lys

50

55

60

Pro

Tyr

His

Ser

Glu

Leu

Lys

Cys

Thr

Asn

Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

Val

65

70

75

80

Lys

Gly

Gin

Phe

Ser

Val

Glu

Cys

Glu

Val

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

85

90

95

Lys

Ile

His

Val

Glu

Thr

Ser

Val

Ile

Ala

Thr

Asp

Tyr

Lys

100

105

110

Asn

Tyr

Ala

Leu

Gin

Ser

Cys

Thr

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

Ile

Ala

115

120

125

Asp

Val

Leu

Gin

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

Asp

Pro

Gly

130

135

140

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Lys

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Leu

Asp

Trp

Phe

145

150

155

160

Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys 165 * 170

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 3

i) Vlastnosti sekvence:

A) Délka: 172 aminokyselin

B) Typ: aminokyselinový

C) Charakter řetězce : jednoduchý

D) Topologie: linerárni ii) Typ molekuly: protein iii) Hypotetický: ne xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3

Asp 1

Glu

Cys

Glu 5

Leu

Met

Pro

Gly 10

Asp

Asn

Phe

Asp

Leu 15

Glu

Lys

Tyr

Phe

Ser 20

Ile

Pro

His

Val

Tyr 25

Val

Thr

His

Ser

Arg 30

Asn

Gly

Pro

Lys

Glu 35

Gin

Val

Cys

Arg

Glu 40

Tyr

Lys

Thr

Lys 45

Asn

Ser

Asp

Gly

Thr 50

Thr

Leu 55

Val

Thr

Ser

Asp

Tyr 60

Lys

Thr

Gly

Lys 65

Pro

Tyr

His

Ser

Glu 70

Leu

Lys

Cys

Thr

Asn 75

Thr

Gin

Lys

Ser

Gly 80

Gly

Lys

Gly

Gin

Phe 85

Ser

Val

Glu

Cys

Glu 90

Val

Pro

Asn

Gly

Asn 95

Gly

Lys

Lys 1Ó0

Ile

His

Val

Glu

Thr 105

Ser

Val

Ile

Ala

Thr 110

Asp

Tyr

Lys

Asn

Tyr 115

Ala

Leu

Gin

Ser 120

Cys

Thr

Lys

Thr

Glu 125

Ser

Gly

Ile

Ala

Asp 130

Asp

Val

Leu

Leu 135

Gin

Thr

Lys

Glu 140

Gly

Val

Asp

Pro

Gly 145

Val

Thr

Ser

Val

Leu 150

Lys

Ser

Val

Asn

Trp 155

Ser

Leu

Asp

Trp 160

Phe Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asd Asn Met Lys 165 * 170

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 4

i) Vlastnosti sekvence:

A) Délka: 31 párů bází

B) Typ: nukleové kyseliny

C) Charakter řetězce : jednoduchý

D) Topologie: linerární ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina

A) Popis: /desc = „mediátorový primer iii) Hypotetický: ne iv) Antimediátorový: ne xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4

GCGATATCGC GACGAAGAAT GCGAACTCAT G

Informace o sekvenci SEQ ID NO: 5

i) Vlastnosti sekvence:

A) Délka: 34 párů bází

B) Typ: nukleové kyseliny

C) Charakter řetězce : jednoduchý

D) Topologie: linerární ii) Typ molekuly: nukleová kyselina

A) Popis: /desc = „mediátorový primer iii) Hypotetický: ne iv) Antimediátorový: ano xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5 GCGATAGGAT CCAAGCTTAT TACTTCATGT TATC

7-C 2yOt, «Stel

Claims

1. Způsob výroby rekombinantního pallidipinového proteinu (Asp-pallidipin), kde Asp-pallidipin inhibuje agregaci krevních destiček vyvolanou kolagenem u savců a kde Asppallidipin obsahuje:

i) protein (pallidipin) vybraný ze skupiny pallidipinových proteinů a ii) aminokyselinu kyselinu asparagovou, kde kyselina asparagová je spojena s N-terminálním koncem pallidipinu peptidovou vazbou;

přičemž Asp-pallidipin má následující sekvence aminokyselin:

a) sekvence uvedené v

aa) SEQ ID NO: 1; bb) SEQ ID NO: 2; nebo cc) SEQ ID NO: 3;

nebo

b) alelickou variantu·nebo mutein jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3, kterážto alelická variace nebo mutein mají aktivitu zralého proteinu, s výjimkou těch sekvencí, které nemají kyselinu asparagovou navázanou na N-terminální konec pallidipinu peptidovou vazbou, nebo

c) protein podle jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3 nebo variantu nebo mutein uvedený pod písmenem b), který má posttranslační modifikaci, která nemá aktivitu zralého proteinu;

který zahrnuje kroky:

aa) transfekci alespoň jedné bakterie vhodným vektorem, přičemž vektor obsahuje operabilní spojení:

i) první molekuly DNA nebo cDNA, kódující rekombinantní Asppallidipin, ii) druhé molekuly DNA kódující vhodnou signální peptidovou sekvenci a iii) vhodného promotoru;

přičemž při expresi a transportu do periplazmy je preprotein obsahující signální peptid a Asp-pallidipin štěpen tak, že aminokyselina kyselina asparagová je v pozici +1 sekvence aminokyselin zralého Asp-pallidipinu, bb) expresi preproteinu obsahujícího Asp-pallidipin a signální peptidovou sekvenci;

cc) transport Asp-pallidipinu z cytoplazmy bakterie do periplazmy za štěpení preproteinu alespoň jednou proteázou během transportu za vzniku zralého Asp-pallidipinu, dd) izolaci Asp-pallidipinu extrakcí periplazmy a ee) purifikaci Asp-pallidipinu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že je kultivována bakterie, která je transfektována vhodným vektorem, přičemž tento vektor obsahuje operabilní spojení:

přičemž při expresi a transportu do periplazmy je preprotein obsahující signální peptid a Asp-pallidipin štěpen tak, že aminokyselina kyselina asparagová je v pozici +1 sekvence aminokyselin zralého Asp-pallidipinu, za podmínek, kdy

A) je exprimován preprotein obsahující Asp-pallidipin a signální peptidovou sekvenci a

B) Asp-pallidipin je transportován z cytoplazmy bakterie do periplazmy, za štěpení preproteinu alespoň jednou proteázou během transportu za vzniku zralého Asp-pallidipinu a takto získaný Asp-pallidipinu je z periplazmy purifikován.

«

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že DNA kódující signální sekvenci kóduje signální sekvenci alkalické fosfatázy (APázy).

4. Způsob podle nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že bakterie je Escherichia coli.

5. Rekombinantní protein Asp-pallidipin, kde Asp-pallidipin inhibuje agregaci krevních destiček vyvolanou kolagenem u savců a kde Asp-pallidipin obsahuje:

přičemž Asp-pallidipin má následující sekvence aminokyselin:

a) sekvence uvedené v

aa) SEQ ID NO: 1; bb) SEQ ID NO: 2; nebo cc) SEQ ID NO: 3;

nebo

b) alelickou variantu nebo mutein jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3, kterážto alelická variace nebo mutein mají aktivitu zralého proteinu, s výjimkou těch sekvencí, které nemají kyselinu asparagovou navázanou na N-terminální konec pallidipinu peptidovou vazbou, nebo

c) protein podle jakékoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 1 až 3 nebo variantu nebo mutein uvedené pod písmenem b), který má posttranslační modifikaci, která v zásadě neovlivňuje aktivitu zralého proteinu.

6. Rekombinantní protein podle nároku 5, kde Asp-pallidipin je vyroben způsobem zahrnujícím kroky:

c) transport Asp-pallidipinu z cytoplazmy bakterie do periplazmy za štěpení preproteinu alespoň jednou proteázou během transportu za vzniku zralého Asp-pallidipinu, dd) izolaci Asp-pallidipinu extrakcí periplazmy a ee) purifikaci Asp-pallidipinu.

7. Rekombinantní protein podle nároku 5, kde Asp-Pallidipin je vyroben postupem zahrnujícím:

kultivaci bakterie transfektované vhodným vektorem, přičemž vektor obsahuje operabilní spojení:

A) je exprimován preprotein obsahující Asp-pallidipin a sekvenci signálního peptidu a

B) Asp-pallidipin je transportován z cytoplazmy bakterie do periplazmy za štěpení preproteinu alespoň jednou proteázou během transportu za vzniku zralého Asp-pallidipinu a takto získaný Asp-pallidipin je z periplazmy purifikován.

8. Asp-pallidipin podle nároků 6 nebo 7, kde DNA kódující signální peptidovou sekvenci kóduje signální sekvenci alkalické fosfatázy (APázy).

9. Asp-pallidipin podle některého z nároků 5 až 8 jako léčivo.

10. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje Asp-pallidipin podle některého z nároků 5 až 8 ve spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo nosičem.

11. Použití Asp-pallidipinu podle některého z nároků 5 až 8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení artherosklerotických nebo thrombotických chorob nebo pro předcházení reokluze po léčení infarktu myokardu.

12. Použití Asp-pallidipinu podle některého z nároků 5 až 8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení nádoru s i metastatickými nádorovými buňkami.

13. Způsob purifikace Asp-pallidipinu, vyznačující se tím, že purifikace zahrnuje následující postupné kroky:

i) purifikaci výměnnou chromatografií na katexu;

ii) purifikaci výměnnou chromatografií na anexu;

iii) purifikaci na základě rozdílu velikostí.

14. Rekombinantní vektor obsahující operabilní spojení:

i) první molekuly DNA nebo cDNA, kódující rekombinantní Asppallidipin, která má sekvenci aminokyselin vybranou ze: a) sekvence uvedené v

aa) SEQ ID NO: l; bb) SEQ ID NO: 2; nebo cc) SEQ ID NO: 3;

nebo

b) alelickou variantu nebo mutein kterékoliv sekvence SEQ ID NO: 1 až 3, kterážto alelická variace nebo mutein mají aktivitu zralého proteinu, s výjimkou těch sekvencí, které nemají kyselinu asparagovou navázanou na N-terminální konec pallidipinu peptidovou vazbou, ii) druhé molekuly DNA kódující vhodnou signální peptidovou sekvenci a iii) vhodného promotoru;

přičemž při expresi ve vhodném bakteriálním hostiteli je preprotein obsahující signální peptid a Asp-pallidipin štěpen tak, že je aminokyselina kyselina asparagová v pozici +1 sekvence aminokyselin zralého Asp-pallidipinu.

15. Bakteriální hostitel transformovaný vektorem podle nároku 14 .

16. Bakteriální hostitel podle nároku 15, kterým je

Escherichia coli.