SI9520093A

SI9520093A - Process for manufacture of a modified collagen-induced platelet aggregation inhibitor pallidipin.

Info

Publication number: SI9520093A
Application number: SI9520093A
Authority: SI
Inventors: Christiane Noeske-Jungblut; Andreas Becker
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1995-09-11
Publication date: 1997-08-31
Also published as: BG101226A; ZA957649B; WO1996008563A1; NO971110L; HUT76972A; AU701643B2; FI971013A0; NO971110D0; IL115272A0; JPH10505502A; BR9508910A; CA2199719A1; CN1159828A; MX9701720A; EP0781334A1; BG63276B1; AU3565795A; PL319078A1; US5882887A; CZ76297A3

Description

POSTOPEK ZA IZDELAVO MODIFICIRANEGA, S KOLAGENOM

INDUCIRANEGA, TROMBOCITNEGA AG REG ACI J SKEGA INHIBITORJA

PALLIDIPINA

Izum se nanaša na postopek izdelave modificiranega, s kolagenom inuciranega, trombocitnega agregacijskega inhibitorja, imenovanega Pallidipin. Nadalje izum vključuje snov Pallidipin, ki je modificirana.

Kolagen je najmočnejši znani povzročitelj trombocitne agregacije pri ljudeh. Na primer, po poškodbi stene krvne žile in izpostavitvi kolagenu, se krvni trombociti hitro vežejo in postanejo aktivirani. (H.R. Baumgartner (1977) Thromb. Haemostas. 37:1-16; J. Hawiger (1987) Human Pathol. 18:111122.)

S kolagenom inducirana, trombocitna agregacija človeških trombocitov, tako predstavlja rizičen faktor za bolnike, ki prestajajo postopke, ki se nanašajo na krvne žile, med drugim npr. angioplastijo ali sepse, za tiste, ki trpijo miokardijski infarkt in za tiste, ki okrevajo po zdravljenju miokardijskega infarkta.

V nekaterih primerih je nujno inhibirati, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo. Znano je, da nekatere spojine inhibirajo tako agregacijo. Na primer, sintetični oligopeptidi inhibirajo, s kolagenom inducirano trombocitno agregacijo, z vezanjem na trombocite. Glej npr. Bevers s sod. (1985) Collagen Derived Octapeptide Inhibits Platelet Procoagulant Activity Induced by the Combined Action of Collagen and Thrombin, Thrombosis Research, 37:365-370; Karniguian s sod. (1983) Effect of a Collagen Derived Octapeptide on Different Steps of the

-2Platelet/Collagen Interaction, Thrombosis Research 32:593-604; Caen s sod. (1981) Oligopeptides with specific inhibiting properties of collageninduced aggregation, process for preparing the same and pharmaceutical compositions containing them; in EPA 0 040 149.

Drug vir, s kolagenom induciranega, trombocitnega agregacijskega inhibitorja je inhibitor, identificiran v kačjem strupu, ki ima nepoznano sestavo. Glej Smith s sod., Identification of 50 kDalton snake venom proteins which specifically inhibit platelet adhesion to collagen. (1991) FEBS 283:307-310.

Tretjega takega inhibitorja iz sline zdravilnih pijavk je opisal Munro s sod. (1991) Calin - a platelet adhesion inhibitor from the šaliva of the medicinal leech, Blood Coagulation and Fibrinolysis 2:179-184. Objava evropske patentne prijave EP 0 480 651 (Merck & Co. inc., objavljena 15. aprila 1992) opisuje protein, ki ima molekularno težo približno 16 kDaltonov (kD) in sposobnost inhibirati, s kolagenom inducirano agregacijo človeških trombocitov, protein je dobljen iz žleze slinavke, pijavke Haemaenteria officinalis. LAPP je 16 kDa-ski protein iz pijavke Haemaenteria officinalis, opisan v Connolly s sod. (1992) J. Biol. Chem. 267:6893-6898. Glej tudi Moubatin, opisan v Waxman and Connolly (1993) J. Biol. Chem. 268:54455449.

Še druga vrsta s kolagenom inducirane, trombocitne agregacije je lahko izolirana iz insektov, kot je opisano v evropski objavi EP 0 530 937. Ti proteini so imenovani Pallidipini.

Alkalna fosfataza (APaza) je protein E. coli, ki je izločen v periplazmatski prostor. APaza je sintetizirana kot prokurzorski protein, ima 21-aminokislin

-3dolgo vodečo sekvenco, ki je odstrižena z vodečo peptidazo med potekom premestitve preko bakterijske notranje membrane v periplazmatski prostor (Y. Kikuchi s sod. (1981) Nucl. Acids Res. 9:5671-5678). Njegova biosinteza je regulirana s koncentracijo fosfata v hranilnem mediju in iznos produktov heterolognih genov, nameščenih vzdolž AP-aznega promotorja je dosežen z uporabljanjem nizkih koncentracij fosfata (C. Monteilhet s sod. (1993) Gene 125:223-228).

Naravni vir proteina Pallidipina je omejen. Postopki, ki uporabljajo biotehnološke metode, so logična rešitev za izdelovanje Pallidipina. Ekspresija Pallidipina v celicah ledvic mladičev hrčkov (EP 0 530 937), se dogaja pri hitrosti produkcije, ki bi morala biti povečana, da bi prišlo do ekspresije Pallidipina v industrijskih količinah. Zaradi tega je bil nujen izboljšan sistem ekspresije.

Tako je bila tu potreba za izboljšan postopek izdelave rekombinantnega Pallidipina, ki inhibira s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo in postopka, ki ima visok donos in omogoča reproducibilno izolacijo proteina, z visoko stopnjo čistosti. Nov postopek nebi smel negativno prizadeti biološke aktivnosti nastalega proteina Pallidipina.

Sedaj je bilo odkrito, da je problem lahko rešen, s postopkom izdelave rekombinantnega proteina Pallidipina (Asp-Pallidipina), v katerem AspPallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:

(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino,

-4v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;

s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:

a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID ΝΟ.Ί; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

b) alelne variante ali modifikacije, ali muteine sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelne variacije ali modifikacije ali muteini, bistveno ne prizadanejo aktivnosti proteina, ali

c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3 ali njihovih variantah ali muteinih omenjenih pod b), ki ima posttranslacijske modifikacije, ki bistveno ne prizadanejo aktivnosti izgrajenega proteina;

vključuje stopnje:

aa) transfektiranje vsaj ene bakterije s primernim vektorjem, pri čemer vektor vsebuje:

(i) DNA ali cDNA, ki kodira za rekombinantni Asp-Pallidipin (ii) ustrezno signalno peptidno sekvenco, katerega signalna sekvenca je tako razcepljena, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence, gledano iz pozicije Pallidipina in (iii) ustrezen promotor;

bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno sekvenco;

-5cc) transportiranje Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, med transportom cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, proizvajanje Asp-Pallidipina, dd) izoliranje Asp-Pallidipina z ekstrahiranjem periplazme, in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.

E. coli je hiter ekspresijski sistem za produkcijo heterolognih, npr. eukariotskih proteinov. Nepravilno zvijanje proteinov je med ekspresijo eukariotskih genskih produktov z E. coli pogosto problem, ki ima lahko za posledico zmanjšano aktivnost produktov ekspresije. Verjetnost pravilnega zvijanja proteinov je mnogo večja, kadar je protein transportiran v periplazmo celic E. coli, kot kadar je protein zadržan v citoplazmi. Transport proteinov v periplazmo je induciran s signalnimi peptidnimi sekvencami, nalepljenimi na izgrajene proteine; te signalne peptidne sekvence, skupaj z izgrajenimi proteinskimi sekvencami, so imenovane predproteini. Pravilna cepitev proteina med signalno peptidno sekvenco in izgrajenim proteinom je za ekspresijo izgrajenih, eukariotskih proteinov v E. coli nujna; sekvenca signalne sekvence in sekvenca izgrajenega proteina, imata vpliv na pravilno cepitev. Zaradi tega, niso vse signalne peptidne sekvence kompatibilne z vsemi kodirajočimi sekvencami.

Za alkalno fosfatazno signalno sekvenco E. coli je poznano, da je učinkovita za iznos proteinov. Toda poznano je, da kombinacija dane signalne peptidne sekvence in sekvence izgrajenega proteina, ne bo nujno imela za posledico dobrega proizvajanja predproteina.

-6Presenetljivo je bilo odkrito, da je dobitek inventivnega postopka izdelave 15-krat višji, kot dobitek ekspresijskega sistema, z uporabljanem ledvičnih celic mladičev hrčkov. Ti rezultati so prikazani v primerih. Funkcija in aktivnost Asp-Pallidipina, v primerjavi z eukariotskim ekspresijskim sistemom ledvice hrčka, z inventivnim postopkom nista negativno prizadeti. Nadaljna prednost je, da je proteaza (npr. vodeča peptidaza), nujna za cepitev predproteina, izdelana z E. coli samo.

Čiščenje izgrajenega Asp-Pallidipina je z uporabljanjem inventivnega postopka mnogo lažje, kot je čiščenje izraženih proteinov, izdelanih in shranjenih znotraj bakterijske citoplazme. Da se sprosti Asp-Pallidipin, akomuliran v periplazmi je zadosten že osmotski šok.

V prednostni izvedbeni obliki ima DNA nakodirane signalne peptidne sekvenčne kode za signalno sekvenco alkalne fosfataze (APaze), prednostno E. coli APaze.

Izum vsebuje postopek v katerem je vektor, za Asp-Pallidipin izuma, dobljen iz vektorja pSB94 (U. Boidol s sod. (1982) Mol. Gen. Genet. 185:510-512).

Nadaljni vidik izuma je vektor, kot je predhodno omenjeno in dodatno, ustrezen signalni peptid, ustrezen promotor in, če mora biti, ustrezen pospeševalec. Vektorji so podrobno opisani v literaturi primerov in tudi v evropskih objavah EP 0 480 651; 0 462 632 in 0 173 177.

Bakterija E. coli je prednosten gostitelj. Ustrezni so tudi drugi mikroorganizmi, npr. Bacillus subtilis.

-7V dodatku, izum vsebuje rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem

Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje (i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina:

s čimer ima Asp-Pallidipin aminokislinske sekvence izbrane iz:

a) sekvenco izbrano iz aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

b) alelne variante ali modifikacije, ali muteina sekvence, SEQ ID NOS:1 do 3, katere alelna varianta ali modifikacija ali mutein ima bistveno isto aktivnost, kot Asp-Pallidipin SEQ ID NO:1 do 3;

ali

c) proteina, po SEQ ID NOS: 1 do 3 ali njihovih variantah ali muteinih, omenjenih pod b), ki ima posttranslacijske modifikacije, ki bistveno ne prizadanejo aktivnosti izgrajenega proteina.

Izum vsebuje tudi rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem AspPallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:

-8v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;

s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:

a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

b) alelne variante ali muteine sekvenc v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelne variante ali muteini, bistveno ne prizadanejo aktivnosti proteina, ali

v katerem je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje stopnje:

aa) transfektiranje vsaj ene bakterije z ustreznim vektorjem, pri čemer vektor vsebuje izvedljivo povezavo:

(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni AspPailidipin, (ii) druga DNA molekula ima nekodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;

s čimer je, po ekspresiji, predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina,

-9bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco;

cc) transportirale Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, dd) izoliranje Asp-Pallidipina z ekstrahiranjem periplazme, in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.

V nadaljni prednostni izvedbeni obliki je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje stopnje:

gojenje bakterije, transfektirane z ustreznim vektorjem, pri čemer vektor vsebuje izvedljivo povezavo:

(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni Asp-Pallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;

s čimer je po ekspresiji protein, ki vsebuje signalni peptid in Asp-Pallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina, pod pogoji s katerimi je izražen predprotein, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco, in je Asp-Pallidipin transportiran iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, in čiščenje Asp-Palidipina iz periplazme.

-10Prednosten je protein, v katerem je signalna peptična sekvenca, signalna sekvenca alkalne fosfataze (APaze), prednostno APaze E. coli.

Industrijska uporaba proteinov izuma je uporaba proteinov, kot farmacevtskega pripravka, ki vsebuje protein po izumu v povezavi s farmacevtsko sprejemljivim razredčilom ali nosilcem.

Alelne variacije ali modifikacije, kot je bilo prej omenjeno, vključujejo spremembo v sekvenci nukleotidov ali aminokislin, spremembo genotipa ali fenotipa. Vsaj en nukleotid ali ena aminokislina je lahko zamenjana (substituted), odstranjena (deleted) ali dodana (inserted).

Ni za pričakovati, da bo večina delecij, insercij in posebno substitucij, ustvarjala radikalne spremembe v značilnostih proteina izuma. Modificirani ali mutirani proteini, so po izumu lahko rutinsko narejeni in preiskani, zato da bi določili natančen učinek substitucije, delecije ali insercije, s primerjavo funkcij modificiranega ali mutiranega proteina z značilnimi funkcijami proteina izuma, npr. proteinov SEQ ID NOS:1 do 3, ali z naravnim Pallidipinom in s tem ugotavili, če ima spremenjen protein primerljivo aktivnost, npr. biološko aktivnost.

Genetska koda je degenerativna; to je, večina aminokislin je nakodiranih z več kot enim kodonom treh nukleotidov. Skladno, alelna variacija ali modifikacija v nukleotidni sekvenci sme ali pa ne sme spremeniti aminokislinske sekvence. Zato so alelne variacije primarno na DNA nivoju in lahko obstajajo tudi sekundarno, na nivoju aminokislinske sekvence.

DNA sekvenca, ki kodira za protein izuma je lahko modificirana z običajnimi tehnikami, da proizvaja variacije v končnem proteinu izuma, ki

-11ima še vedno v bistvu isto aktivnost, kot protein izuma, npr. Asp-Pallidipin SEQ ID NOS.1 do 3, ali kot primerjano z naravnim pallidipinskim proteinom. Aktivnost je merjena glede na primere. Tako je ena ali več aminokislin, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10... do 15 aminokislin lahko dodana, substituirana ali odstranjena, brez da bi bila bistveno prizadeta aktivnost proteina izuma. Substitucije so splošno lahko narejene skladno s sledečo tabelo 1, kadar je zaželjeno končno spremeniti aminokislinsko sekvenco proteina izuma.

Bistvene spremembe v delovanju ali imunološki identiteti, so narejene z izbiranjem substitucij, ki so manj konzervativne, kot te v tabeli 1, npr. izbiranjem ostankov, ki se bolj značilno razlikujejo v svojem učinku na vzdrževanje (a) strukture polipeptidne hrbtenice v področju substitucije, npr., kot plasti ali helične konformacije, (b) naboja ali hidrofobnosti molekule, ali (c) obsega končnih verig.

-12TABELA 1

NAVADNE SUBSTITUCIJE AMINOKISLIN V PROTEINU

ORIGINALNI OSTANKI	PONAZORITVENE SUBSTITUCIJE
Ala	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Giy	Ala, Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Tyr, lie
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Muteini so definirani s homologijo med dvema primerjanima proteinoma. Izraz homologija, obsega podobnosti aminokislin in vrzeli v obeh primerjanih sekvencah. Podobnost aminokislin je npr. definirana v tabeli 1. Prednostno muteini tega izuma, vsebujejo aminokislinsko sekvenco, ki ima vsaj 60% homologijo, bolj prednostno vsaj 80%, veliko bolj prednostno vsaj 90% in najbolj prednostno vsaj 95% homologijo s sekvenco enega od proteinov SEQ ID NOS:1 do 3.

S posttranslacijskimi variacijami, kot je omenjeno zgoraj, je mišljeno variacije med ali po translaciji, kot je tvorjenje disulfidnih mostičkov in kemične modifikacije aminokislin.

-13Proteini pogosto tvorijo kovalentne medverižne vezi. Te disulfidne vezi se tvorijo med cisteinskimi-SH aminokislinami in zvitim proteinom ali proteinom, ki se zvija med translacijo. Vezi stabilizirajo tridimenzionalno zgradbo proteina. Take disulfidne vezi so redko tvorjene v proteinskih molekulah, ki so še vedno v celičnem citosolu, zato ker visoka intracelularna koncentracija -SS-(disulfidnega) reducirajočega sredstva glutationa, cepi večino takih vezi. Ko so proteini enkrat zunaj citoplazme, so izločeni ali pa so na površini celice, pogosto tudi tvorijo dodatne, kovalentne, medverižne vezi.

Nadalje so lahko aminokisline spremenjene, kot je opisano v PCT prijavi WO 91/10684. Možne so tudi druge spremembe stranskih verig aminokislin.

Protein izuma ima čistost vsaj 40%, prednostno vsaj 60%, bolj prednostno vsaj 80% in najbolj prednostno vsaj 90%. Čistost je definirana s količino proteina izuma, glede na celotno količino proteina. Z uporabljanjem metod čiščenja, opisanih v primerih, niso mogli odkriti nobenih drugih proteinov, kot le proteine izuma.

Z uporabljanjem očiščenega proteina izuma, so lahko monoklonska protitelesa proizvedena po dobro znani Koehler in Milstein metodi, ki vključuje zlasti običajno imunizirane miši ali kunce, z očiščenim proteinom izuma, kot imunogenom, čemur sledi produkcija hibridomov iz celic miši ali kunca, ki proizvajajo protitelesa.

Prednostna izvedbena oblika izuma je protein, omenjen v SEQ ID NO:1, izražen v E. coli, sev E 15.

-14I Asp-Pallidipin kaže farmakološko aktivnost in se zato lahko uporablja, kot farmacevtski. Asp-Pallidipin je lahko uporabljen v farmacevtskem pripravku, ki vsebuje Asp-Pallidipin v povezavi s farmacevtsko sprejemljivim razredčilom ali nosilcem. Dodatno izum vključuje farmacevtski pripravek, ki vsebuje farmacevtsko aktiven Asp-Pallidipin po izumu in farmacevtsko sprejemljivo sol ali farmacevtsko sprejemljiv nosilec.

Asp-Pallidipin zlasti inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo in inhibira adhezijo tumorskih celic, prednostno metastaznih, tumorskih celic, na kolagen.

Asp-Pallidipin inhibira trombocitno agregacijo. Testni sistem je opisan v primerih. Asp-Pallidipin značilno inhibira trombocitno agregacijo pri koncentraciji 0.5 do 50 gg proteina. Po primerih najbolj prednosten AspPallidipin, protein SEQ ID ΝΟ.Ί, ima IC₅₀, 50 nmol/L visoko očiščenega proteina. Asp-Pallidipin inhibira trombocitno agregacijo pri koncentracijah od 5 nmol/L do okoli 1,000 nmol/L.

/ Rezultati iz in vitro testnih sistemov kažejo, da so lahko proteini izuma

I uporabljeni, kot zdravilo ali pa so lahko uporabljeni za zdravniško zdravljenje. Testni rezultati za in vitro sistem so lahko korelirani z in vivo sistemom, zato ker je ta sistem na tem področju že uveljavljen. R.J. Shebuski s sod. (1990) Thrombosis and Haemostasis, 64:576-581.

Asp-Pallidipin se lahko da z intraperitonealnimi injekcijami, ki so lahko dane dnevno ali 2 do 3-krat na teden. Kadar živali prejmejo dnevne injekcije, da bi v krvi dosegli koncentracijo 100 nmol/L, je njihova trombocitna agregacija zmanjšana. Pod temi pogoji niso zabeležili nobenih resnih stranskih učinkov. Asp-Pallidipin povzroča to inhibicijo trombocitne

-15agregacije v miših pri dnevnih dozah, ki v krvi dosegajo koncentracijo od okoli 10 nmol/L do 1,000 nmol/L.

Asp-Pallidipin je zato uporaben za zdravljenje ateroskleroznih ali tromboznih bolezenskih poškodb ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta. Asp-Pallidipin je lahko uporabljen kot, antiaterosklerozno in antitrombozno sredstvo pri sesalcih, vključno ljudeh, npr., da zdravi aterosklerozne/trombozne poškodbe, nastale npr. zaradi pretrganja področij, kjer so stene arterij obložene ali tistih nastalih, zaradi perturbacije ali odstranitve endotela, npr. pri sepsah ali transplantih, ali da zdravi nestabilno angino (pektoris). Lahko se uporablja tudi za preprečevanje ponovnih zamašitev žil po zdravljenju miokardijskega infarkta s fibrinolizo ali z angioplastijo (PTCA). Če je fibrinolizna terapija (s streptokinazo, t-PA ali drugimi plazminogenimi aktivatorji), dana za zdravljenje miokardijskega infarkta je Asp-Pallidipin lahko uporabljen, kot koristno sredstvo za preprečevanje ponovne zamašitve krvne žile. Zdravljenje miokardijskega infarkta z balonskim katetrom (PTCA), tudi poškoduje steno žile in to lahko vodi do nastanka novega strdka. To je lahko preprečeno z dajanjem Asp-Pallidipina med in po postopku. AspPallidipin je lahko uporabljen v koronarni angioplastiji, kakor tudi pri drugih uporabah angioplastije.

Izum zagotavlja

a) uporabo proteina izuma za izdelavo ') zdravila, za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta (tako so proteini uporabni kot profilaktično učinkovita zdravila pri zdravljenje bolnikov, za

-16katere je znano, da so v nevarnosti, da se pri njih razvije bolezen ali pogoj zanjo);

b) metodo zdravljenja aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta, ki vključuje dajanje učinkovite količine proteina izuma, da se zatre bolezen pri bolniku, ki potrebuje tako zdravljenje.

c) farmacevtski pripravek za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta, ki vsebuje protein izuma in farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali razredčilo.

Za te potrebe se bo primerna doza seveda spreminjala, odvisno od, npr. uporabljene spojine izuma, gostitelja, načina dajanja in narave ter resnosti stanja, ki se ga zdravi. Vendar se je v splošnem pokazalo, da so zadovoljivi rezultati pri živalih, za dosego koncentracije v krvi od 10 do 1,000 nmol/L, bili dobljeni pri dnevnih dozah, prednostno pri dnevnih dozah od 30 do 300 nmol/L.

Proteini izuma so lahko dani po vsaki običajni poti, posebno enteralno ali parenteralno, npr. v obliki raztopin aii suspenzij, ki se jih lahko injicira. Prednostno je intraperitonealno injiciranje.

Protein SEQ ID NO:1 je prednostna spojina.

Pričujoči izum zagotavlja farmacevtske pripravke, ki vsebujejo spojine izuma, v povezavi z vsaj enim farmacevtskim nosilcem ali razredčilom. Taki pripravki so lahko izdelani na običajen način. Glej Remington’s

ΑΊPharmaceutical Science, 15^th ed. Mačk Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).

Proteini izuma tudi inhibirajo adhezijo metastaznih tumorskih celic na kolagen. Testni sistem je opisan v primerih. Proteini izuma kažejo značilno adhezijsko inhibicijo metastaznih tumorskih celic na kolagen, pri koncentraciji 1 do 100 pg proteina.

Test najbolj prednostnega proteina, proteina SEQ ID NOJ, po primerih 2 in 15 kaže vrednost IC₅o, 100 nmol/L visoko očiščenega proteina. Proteini izuma kažejo adhezijsko inhibicijo metastaznih tumorskih celic na kolagen, pri koncentraciji od 10 do 2,000 nmol/L

Rezultati iz in vitro testnih sistemov kažejo, da so proteini izuma lahko uporabljeni kot zdravilo ali pa so lahko uporabljeni za medicinsko zdravljenje. Testni rezultati se lahko prenesejo iz in vitro sistema v in vivo sistem, ker je to uveljavljen sistem na tem področju. Chan s sod. (1990), Science, 2J 600-1602.

Proteini izuma so lahko dani med ali po kirurških operacijah primarnega tumorja, da se prepreči tvorjenje metastaz z izločitvijo tumorskih celic, ki lahko vstopijo v krvni tok med operacijo. Ti proti-metastazni učinki so lahko demonstrirani v “eksperimentalnem” in “spontanem” živalskem modelu, kot je opisal Chan s sod. (1990), Science, 2J600-1602.

Proteini izuma so lahko dani z intraperitonealnimi injekcijami, ki so dane dnevno ali 2 do 3-krat na teden. Kadar živali prejmejo dnevne injekcije, da se v krvi doseže koncentracija 200 nmol/L, imajo zmanjšano adhezijo metastaznih tumorskih celic, merjenih s štetjem vrednosti centrov usedenih

-18metastaznih celic. Pod temi pogoji, niso bili zabeleženi nobeni resni stranski učinki.

Proteini izuma pri miših kažejo to adhezijsko inhibicijo metastaznih tumorskih celic na kolagen pri dnevnih dozah, da se v krvi doseže koncentracija od 20 do 2,000 nmol/L, prednostno koncentracije od 60 do 600 nmol/L.

Proteini izuma so zato uporabni za zdravljenje raka, posebno raka z metastaznimi tumorskimi celicami, najbolj prednostno, raka z visoko metastaznimi tumorskimi celicami.

Izum tako zagotavlja

a) uporabo proteina izuma, za izdelavo zdravila, za zdravljenje raka z metastaznimi tumorskimi celicami (proteini so tako uporabni za profilaktično učinkovita zdravila dana pred, npr. kirurško odstranitvijo tumorjev);

b) metodo zdravljenja raka z metastaznimi tumorskimi celicami, ki vključuje dajanje učinkovite količine proteina izuma, da se zatre bolezen pri bolniku, ki potrebuje tako zdravljenje;

c) farmacevtski pripravek za zdravljenje raka z metastaznimi tumorskimi celicami, ki vsebuje protein izuma in farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali razredčilo.

Za te potrebe se bo primerna doza seveda spreminjala, odvisno od, npr.

uporabljene spojine izuma, gostitelja, načina dajanja in narave ter resnosti stanja, ki se ga zdravi. Vendar se je v glavnem pokazalo, da so

-19zadovoljivi rezultati pri živalih, da bi v krvi dosegli koncentracijo od 20 do 2,000 nmol/L, dobljeni pri dnevnih dozah, prednostno pri dnevnih dozah 60 do 600 nmol/L.

Proteini izuma so lahko dani po vsaki običajni poti, posebno enteralno ali parenteralno, npr. v obliki raztopin ali suspenzij, ki se jih lahko injicira.

Protein SEQ ID NO:1 je prednostna spojina.

Pričujoči izum zagotavlja farmacevtske pripravke, ki vsebujejo spojine izuma v povezavi z vsaj enim farmacevtskim nosilcem ali razredčilom. Taki pripravki so lahko izdelani na običajen način. Glej Remington’s Pharmaceutical Science, 15^th ed. Mačk Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980).

V še enem vidiku tega izuma, so zagotovljene DNA sekvence, vektorji, ki vsebujejo te sekvence, celice, ki vsebujejo navedene vektorje, metode rekombinantno proizvajanih proteinov in protitelesa za proteine tega izuma. Zagotovljene so tudi izolirane in/ali rekombinantne DNA sekvence (npr., genomska ali cDNA), ki kodirajo za protein, ki inhibira s kolagenom inducirano, agregacijo človeških trombocitov. V še nadaljnem vidiku izum zagotavlja rekombinantno proizvedene proteine tega izuma, npr. proteine, ki imajo sekvence, ki so navedene tu notri.

Z izrazom izoliran je mišljeno, da je inhibitor tega izuma ali druga esenca, navzoč v obliki, ločeni od (očiščeni od) spojin, s katerimi je rekombinantno ali sintetično proizveden. Vse stopnje take izolacije ali čiščenja so vključene splošno. Prednostne so stopnje izolacije ali čiščenja, s pomočjo katerih je inhibitor uporaben za farmacevtske namene. Na

-20primer, take stopnje izolacije (npr., aktivnosti ali čistosti) so lahko dosežene rutinsko, s kromatografskimi tehnikami, takimi kot so tiste uporabljene v primerih. Nadaljna čiščenja, npr., do homogenosti, so lahko dosežena rutinsko, z uporabljanjem običajnih metod, kot so metode opisane v tekstu, ki sledi:

Methods of Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, ed. Murray P. Deutscher, Academic Press 1990;

Protein Purification Applications - A Practical Approach. ed. E.L.V. Harris in S. Angel, IRL-Press 1990;

Protein Purification, Principles and Practice, Robert Scopes, Springer-Verlag

1982;

in

Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. J.-C. Janson in L. Ryden, VCH Publishers 1989.

Čistost je lahko določena s katero koli od številnih rutinskih metod, npr., SDS poliakrilamidno gelsko elektroforezo, analitsko HPLC, itd. Očiščeni inhibitor je lahko uporabljen za določitev aminokislinske sekvence proteina po metodah, ki so popolnoma rutinske za nekoga, ki je običajno izkušen v tem delu. Hewick, R.M. s sod. (1981) J. Biol. Chem. 256,7990-7997.

Aminokislinska sekvenca inhibitorja pričujočega izuma je lahko uporabljena za določitev sekvence ustreznih DNA prob, ki so lahko uporabljene za iskanje novih inhibitorjev, npr., pri drugih vrstah. Take probe so lahko sintetizirane rutinsko, npr. z uporabljanjem avtomatiziranega DNA sintetizatorja in preiskovanje genomskih ali cDNA knjižnic je podobno rutina za nekoga, ki je običajno izkušen v tem delu. (Glej International Publication WO 90/07861, z dne 26 julija, 1990).

-21Zato, pričujoči izum vključuje tudi DNA sekvenco, ki se ujema z (kodira za) obema, DNA sekvenco (genom) za Asp-Pallidipin, ko je izoliran iz naravnega okolja, npr. v raztopini ali na vektorju, kakor tudi njegovimi muteini. Metode za proizvajanje muteinov so tudi rutinske in običajne za nekoga, ki je izkušen v tem delu, kot so takšne tudi metode preiskovanja za testiranje učinkovitosti takih novih proteinov, npr. tako, kot je tu notri opisano.

Ustrezni muteini so tisti, ki imajo vsaj frakcijo, npr., vsaj 5%, prednostno vsaj 50%, najbolj prednostno vsaj 90% biološke aktivnosti, npr., s kolagenom inducirane, trombocitne agregacijske inhibicije, ihibitorja, kot je opisan tu notri.

Nadalje izum vsebuje metodo čiščenja, v kateri čiščenje vključuje sledeče zaporedne stopnje:

(i) čiščenje s kationsko izmenjevalno kromatografijo;

(ii) čiščenje z anionsko izmenjavo in (iii) čiščenje z izločanjem po velikosti.

Verjeti je, da nekdo, ki je izkušen v tem delu, z uporabljanjem predhodnega opisa, brez nadaljnega izpopolnjevanja, lahko pričujoči izum do največjega obsega koristno uporabi. Sledeče prednostne, specifične izvedbene oblike morajo zato biti tolmačene, kot samo edino ponazorilne in vsekakor ne omejitvene za preostali del odkritja.

V prej omenjenih in primerih, ki sledijo, so vse temperature pokazane v stopinjah Celzija; in, razen, če je drugače naznačeno, so vsi deleži in procenti utežni.

-22Celotna razkritja vseh prijav, patentov in objav, citiranih zgoraj in spodaj, če so kakršnakoli, vključno EP 94250224.6, dovršena 2. septembra, 1994, so tu nekje vključena z navedbo.

-23PRIMER1

Primer 1: Konstrukcija ekspresijskega vektorja

Za konstrukcijo inventivnega vektorja, ki kodira za Asp-Pallidipin, sta uporabljena sledeči smiselni (sense) in nesmiselni (antisense) primer: p3:

5’-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3’ (Nrul) (SEQ ID NO:4); in p4:

5-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC-3’ (SamHI) (SEQ ID N0:5).

PCR (polimerazna verižna reakcija) poteka v 8 ciklih po 2 minuti pri 94°C, 1 munuto in 30 sekund pri 42°C in 2 minuti in 30 sekund pri 72°C, z uporabljanjem p3 in p4, kot primerskega para in 1 gg matrične DNA. Po gelskem čiščenju in digestiji z Nrul in BamHI je fragment subkloniran v pSB/pho. Plazmid je pripravljen z Xmal digestijo, ki ji sledita, Mung-ova “bean” obdelava za nastanek 5’ topega konca in SamHI digestija.

Konstrukt je preverjen s celotnim DNA sekvenciranjem dodanih fragmentov, z uporabljanjem dideoksi verižne-terminacijske metode (F. Sanger s sod. (1977) Proč. Nat’l. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) in priborom za sekvenciranje z [³⁵S]dATP. Transformacija kompetentne E. coli, E15 s Pallidipinskim ekspresijskim konstruktom ali praznim plazmidom (slepa transformacija) je izvršena z uporabljanjem standardnih metod (J. Sambrook s sod. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Karbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

-24Primer 2: Ekspresija in ekstrakcija Asp-Palidipina

Za pSB/pho plazmid (dobljen iz pSB94; glej J. Daum s sod. (1989) Eur. J. Biochem. 185:347-354), so kulture E15 preko noči (S.J. Hayashi s sod. (1964) J. Biol. Chem. 239:3091-3106) v nizko fosfatnem mediju razredčene na 8% (vol/vol) in nato so 6 ur rastle pri 37°C. (A. Becker s sod. (1994) Protein Expression and Purification 5:50-56). Bakterije so po indukciji pobrane s centrifugacijo in ponovno suspendirane v 1/10 volumna 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)/100 mmol/L NaCI. Ta pripravek je zamrznjen, odmrznjen in centrifugiran, ter tako daje frakcijo supernatanta (SN1). Bakterijski pelet je ponovno suspendiran in pred centrifugiranjem, 10 minut pri sobni temperaturi uravnotežen v 0.5 mol/L saharoze. Supernatant (SN2) je shranjen za analizo, medtem ko je pelet ponovno suspendiran v ledeno hladni vodi, dopolnjen z 1 mmol/L PMSF (fenilmetilsulfonilfluorida) in za 10 min inkubiran na ledu. Celice sledijo temu osmotskemu šoku in se odcentrifugirajo, zbran pa je supernatant (SN3). Pelet, ki vsebuje citoplazemsko frakcijo (CF) je ponovno suspendiran v 50 mmol/L Tris-HCL (pH 8.0)/1 OOmmol/L NaCI.

Primer 3: Čiščenje rekombinantnega Asp-Pallidiplna

Supernatantna frakcija, ki vsebuje večino rekombinantnega Asp-Pallidipina (SN1) je z ocetno kislina naravnana na pH 4.0 in nanešena na kationsko izmenjevalno kolono (Mono S, Pharmacia), z uporabljanjem FPLC sistema. Po izpiranju z gradientom 0 do 500 mmol/L NaCI v natrijevem acetatu, pH 4.0 je elucija Asp-Pallidipina dosežena z 20 mmol/L NaPi, pH 7.0. Eluirane frakcije, ki vsebujejo Asp-Pallidipin, kot je bilo določeno z SDSpoliakrilamidno gelsko elektroforezo (PAGE) in imunoblotingom, so združene, naravnane na pH 8.0 in nanesene na anionsko izmenjevalno

-25kolono (Fractogel-EMD-TMAE 650, Merck). Elucija Asp-Pallidipina je dosežena z gradientom 0 do 1 mol/L NaCl v 20 mmol/L natrijevega acetata, pH 8.4. Za končno čiščenje so frakcije eluenta, ki vsebujejo AspPallidipin združene, koncentrirane v Seed-Vac (Bachofer) in podvržene izločitveni kromatografiji na osnovi velikosti molekul z uporabljanjem Superoze 12 (Pharmacia).

Primer 4: Test trombocitne agregacije

Test je bistveno tako izvršen, kot je opisano v objavi C. Noeske-Jungblut (C. Noeske-Jungblut (1994) J. Biol. Chem. 269:5050-5053). Na kratko, človeška kri je zbrana v 1/6 volumna 71 mmol/l citronske kisline/85 mmol/L trinatrijevega citrata/111 mmol/L glukoze. S trombociti bogata plazma je dobljena z 20 minutno centrifugacijo pri 135 g. Asp-Pallidipin je za 1 min pri 37°C, pred dodatkom kolagena (2 gg/ml), inkubiran z 500 μΙ s trombociti bogato plazmo. Agregacija je beležena z Micron agregometrom in določena je maksimalna vrednost. IC₅₀ ima vrednost okoli 50 nM. Med spojinama z ali brez Asp v prvi poziciji ni bilo videti znatne razlike.

Določena sta biološka aktivnost in dobitek Asp-Pallidipina, očiščenega iz periplazemskega prostora E. coli. S trombociti bogata plazma je inkubirana z Asp-Pallidipinom in kontrolami. Agregacija je inducirana z dodajanjem kolagena. Divja vrsta Pallidipina, očiščenega iz sline je uporabljena kot pozitivna kontrola. Nadalje so nekateri drugi konstrukti uporabljeni kot kontrole, da kažejo prednost inventivnega Asp-Pallidipina. Protein izuma in kontrole kažejo različne dobitke (tabela 2).

-26TABELA 2

Sev	Dobitek
rekombinantni Pallidipin	461 μg
rekombinantni arginil-Pallidipin	298 pg
rekombinantni aspartil-Pallidipin	864 μg

Primer 5: Adhezija tumorskih celic na kolagen je v prisotnosti proteina izuma zmanjšana

Protein izuma inhibira adhezijo tumorskih celic na kolagensko matrico. Zato, kadar je protein izuma znotraj pacientove krvi ali plazme, lahko delno ali popolnoma prepreči, da bi se tumorske celice, ki se selijo po telesu, ustalile v organih ali krvnih žilah.

MTLn3 celice (prsne tumorske celice podgane) so označene z ⁵¹ Cr. Plošča z vdolbino je prevlečena s kolagenom (vrste lil) in čez noč puščena na 4°C. 2 X 10⁴ radioaktivno označenih celic v 500 μΙ DMEM F12 medija, 20 mmol/L Hepesa, 1 mmol/l bikarbonata, 1% BSA-ja je najprej inkubiranih z 0, 2, 5 ali 10 μΙ proteina izuma (“Superose Pool”, 0.5 mg proteina/ml), oziroma za 10 min pri 37°C. Potem je ta suspenzija prenesena v s kolagenom prevlečeno vdolbino in za 2 h inkubirana pri 37°C. Nato so vdolbine sprane in sprijete celice so odstranjene z 1 mol/L NaOH. Šteje se radioaktivnost sprijetih celic.

-27TABELA 3

količina dodanega inhibitorja	pričvrstitev celic
ul	(cpm).
0	2215
2	2071
5	1608
10	1081

Primer 6: Proizvajanje protiteles

Okoli 100 gg inhibitorja, očiščenega glede na primere je dodanega k 0.5 ml popolnega Freundovega adjuvansa in sama emulzija je injicirana v kunca. Po 2 tednih je dana druga injekcija, ki je sestavljena iz okoli 80 gg očiščenega inhibitorja in 0.5 ml nepopolnega Freundovega adjuvansa. Po injiciranju je za preverjanje produkcije, vzetih več vzorcev seruma specifičnih protiteles. Analizirani so v VVestern blottingu. 20 ng očiščenega inhibitorja je danega na 12.5% SDS-poliakrilamidni gel in elektroforeza, “blotting” in detekcija so narejeni po standardnih metodah, ki sta jih opisala E. Harlowe in D. Lane, (1988) Antibodies: a laboratory manual,

Cold Spring Harbour Laboratory (redčenje testnega seruma 1:500, s kozjo anti-kunčjo peroksidazo združen IgG kot drugo protitelo, detekcija z ECLpriborom iz Amersham International, Amersham, UK). Lisa kaže, da protiserum specifično reagira z očiščenim inhibitorjem.

Predhodni primeri so lahko, s podobnim uspehom, ponovljeni z zamenjavo splošno ali specifično opisanih reaktantov in/ali pogojev delovanja tega izuma, za tiste uporabljene v predhodnih primerih.

-28Iz zgornjega opisa, lahko nekdo, ki je izkušen v tem delu, brez težav dojame bistvene značilnosti tega izuma in brez spreminjanja njegovega smisla in cilja lahko naredi različne spremembe in modifikacije izuma, da ga tako prilagodi različnim uporabam in pogojem.

-29PREDSTAVITEV SEKVENC (1) SPLOŠNA INFORMACIJA:

(i) PRIJAVITELJ:

(A) IME: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT (B) ULICA: MUELLERSTRASSE 172 - 178 (C) MESTO: BERLIN (E) DRŽAVA: NEMČIJA (F) POŠTNA KODA (ZIP); 13353 (G) TELEFON: (030) - 468-2085 (H) TELEFAX: (030) - 468-2058 (ii) NASLOV IZUMA: POSTOPEK ZA IZDELAVO MODIFICIRANEGA, S KOLAGENOM INDUCIRANEGA, TROMBOCITNEGA AGREGACIJSKEGA INHIBITORJA PALLIDIPINA (iii) ŠTEVILO SEKVENC: 5 (iv) RAČUNALNIŠKO ČITLJIVA OBLIKA:

(A) MEDIJSKI TIP: Gibljivi disk (B) RAČUNALNIK: IBM, PC kompatibilen (C) OPERACIJSKI SISTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROCESNA OPREMA: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) TEKOČI PODATKI O PRIJAVI:

ŠTEVILKA PRIJAVE: EP 94250224.6

-30(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 1:

(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 172 aminokislin (B) VRSTA: aminokislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: protein (iii) HIPOTETIČEN: ne (v) VRSTA FRAGMENTA: N-terminalen (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Asp Glu 1

Glu Cys Glu 5

Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu

Glu

10

15

Lys

Tyr

Phe

Ser

Ile

Pro

His

Val

Tyr

Val

Thr

His

Ser

Arg

Asn

Gly

20

-

25

30

Pro

Lys

Glu

Gin

Val

Cys

Arg

Glu

Tyr

Lys

Thr

Lys

Asn

Ser

Asp

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Ser

Asp

Tyr

Lys

Thr

Gly

50

55

60

Lys

Pro

Tyr

His

Ser

Glu

Leu

Lys

Cys

Thr

Asn

Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

65

70

75

80

Gly

Lys

Gly

Gin

Phe

Ser

Val

Glu

Cys

Glu

Val

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

85

90

95

Gly

Lys

lle

His

Val

Glu

Thr

Ser

Val

lle

Ala

Thr

Asp

Tyr

100

105

110

Lys

Asn

Tyr

Ala

Leu

Gin

Ser

Cys

Thr

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

lle

115

120

125

Ala

Asp

Val

Leu

Gin

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

Asp

Pro

130

135

140

Gly

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Lys

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Leu

Asp

Trp

145

150

155

160

Phe

Ser

Arg

Ser

Lys

Val

Asn

Cys

Asp

Asn

Met

Lys

165

170

(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 2:

(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 171 aminokislin (B) VRSTA: aminokislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: protein (iii) HIPOTETIČEN: NE (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Asp 1

Glu Glu

Cys

Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp

Leu 15

Glu

5

10

Lys

Tyr

Phe

Ser

lle

Pro

His

Val

Tyr

Val

Thr

His

Ser

Arg

Asn

Gly

20

25

30

P to

Lys

Glu

Gin

Val

Cys

Arg

Glu

Tyr

Lys

Thr

Lys

Asn

Ser

Asp

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Ser

Asp

Tyr

Lys

Thr

Gly

Lys

50

55

60

Pro

Tyr

His

Ser

Glu

Leu

Lys

Cys

Thr

Asn

Thr

Pro

Lys

Ser

Gly

Val

65

70

75

80

Lys

Gly

Gin

Phe

Ser

Val

Glu

Cys

Glu

Val

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

85

90

95

Lys

lle

His

Val

Glu

Thr

Ser

Val

lle

Ala

Thr

Asp

Tyr·

Lys

100

105

110

Asn

Tyr

Ala

Leu

Gin

Ser

Cys

Thr

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

lle

Ala

115

120

125

Asp

Val

Leu

Gin

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

Asp

Pro

Gly

130

135

140

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Lys

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Leu

Asp

Trp

Phe

145

150

155

160

Ser

Arg

Ser

Lys

Val

Asn

Cys

Asp

Asn

Met

Lys

165 170 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 3:

(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 172 aminokislin (B) VRSTA: aminokislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: protein (iii) HIPOTETIČEN: NE

-33(xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

Asp

Glu

Cys

Glu

Leu

Met

Pro

Gly

Asp

Asn

Phe

Asp

Leu

Glu

1

5

10

15

Lys

Tyr

Phe

Ser

Ile

Pro

His

Val

Tyr

Val

Thr

His

Ser

Arg

Asn

Gly

20

25

30

Pro

Lys

Glu

Gin

Val

Cys

Arg

Glu

Tyr

Lys

Thr

Lys

Asn

Ser

Asp

35

40

45

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Ser

Asp

Tyr

Lys

Thr

Gly

50

55

60

Lys

Pro

Tyr

His

Ser

Glu

Leu

Lys

Cys

Thr

Asn

Thr

Gin

Lys

Ser

Gly

65

70

75

80

Gly

Lys

Gly

Gin

Phe

Ser

Val

Glu

Cys

Glu

Val

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

85

90

95

Gly

Lys

Ile

His

Val

Glu

Thr

Ser

Val

Ile

Ala

Thr

Asp

Tyr

100

105

110

Lys

Asn

Tyr

Ala

Leu

Gin

Ser

Cys

Thr

Lys

Thr

Glu

Ser

Gly

Ile

115

120

125

Ala

Asp

Val

Leu

Gin

Thr

Lys

Glu

Gly

Val

Asp

Pro

130

135

140

Gly

Val

Thr

Ser

Val

Leu

Lys

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Leu

Asp

Trp

145

150

155

160

Phe

Ser

Arg

Ser

Lys

Val

Asn

Cys

Asp

Asn

Met

Lys

165 170 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 4:

(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 31 baznih parov (B) VRSTA: nukleinska kislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna

-34(ii) VRSTA MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: /desc= “sense primer” (iii) HIPOTETIČEN: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

GCGATATCGC GACGAAGAAT GCGAACTCAT G (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 5:

(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:

(A) DOLŽINA: 34 baznih parov (B) VRSTA: nukleinska kislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: /desc = “antisense primer” (iii) HIPOTETIČEN: NE (iv) ANTI-SENSE: DA (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

GCGATAGGAT CCAAGCTTAT TACTTCATGT TATC

Claims

ZAHTEVKI

1. Postopek izdelave rekombinantnega proteina Pallidipina (Asp-Pallidipina), v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:

(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;

s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:

a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

b) alelno varianto ali mutein sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein, bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina, ali

c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS: 1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttranslacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;

vključuje stopnje:

aa) transfektiranje vsaj ene bakterije z ustreznim vektorjem, pri katerem vektor vsebuje izvedljivo povezavo:

-36(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano, ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;

s čemer je po ekspresiji predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina, bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco;

cc) transportiranje Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, dd) izoliranje Asp-Pallidipina z ekstrahiranjem periplazme in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.
2. Postopek izdelave rekombinantnega proteina Pallidipina (Asp-Pallidipina), v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:

(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;

s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence

-37a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NOJ;

bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

b) alelno varianto ali mutein sekvenc v vsaki od SEQ ID NOS J do 3, katerih alelna variacija ali mutein, bistveno ne prizadeneta aktivnosti proteina, ali

c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS J do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttranslacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;

vključuje:

gojenje bakterije, transfektirane s primernim vektorjem, v kateri vektor vsebuje izvedljivo povezavo:

(i) prva DNA ali cDNA molekula, ima nakodiran rekombinantni AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula, ima nakodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;

s čimer je po ekspresiji predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina, aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina, pod pogoji, s katerimi

-38(A) je izražen predprotein, ki vsebuje Asp-Pailidipin in signalno peptidno sekvenco, in (B) Asp-Pallidipin je transportiran iz citoplazme bakterije v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, in čiščenje tako proizvedenega Asp-Pallidipina iz periplazme.
3. Postopek po zahtevku 1 ali 2 v katerem ima DNA nakodirane signalne sekvenčne kode za signalno sekvenco alkalne fosfataze (APaze).
4. Postopek po zahtevkih 1 do 3 v katerem je bakterija E. coli.
5. Rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:

(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;

s čemer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:

a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

-39b) alelno varianto ali mutein sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina, ali

c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS.1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttransiacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina.
6. Rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje (i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;

s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence

a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

b) alelno varianto aii mutein sekvenc, v vsaki SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna varianta ali mutein bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina, ali

c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttransiacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;

-40v katerem je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje stopnje:

aa) transfektiranje vsaj ene bakterije z ustreznim vektorjem, pri katerem vektor vsebuje izvedljivo povezavo:

(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;

s čimer je po izražanju predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartnska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence, izgrajenega Asp-Pallidipina, bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco;

cc) transportiranje Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, dd) izoliranje Asp-Pailidipina z ekstrahiranjem periplazme, in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.
7. Rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:

(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinaskih proteinov, in

-41(ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;

s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:

a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;

ali

b) alelno varianto ali mutein sekvenc, v vsaki SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein bistveno ne prizadaneta učinkovitosti proteina, ali

c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttranslacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;

v katerem je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje:

gojenje bakterije transfektirane z ustreznim vektorjem, pri katerem vektor vsebuje izvedljivo povezavo:

(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinanten AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustreženo signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;

s čimer je po ekspresiji predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina,

-42pod pogoji s katerimi (A) je izražen predprotein, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco, in (B) Asp-Pallidipin je transportiran iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, in čiščenje Asp-Pallidipina iz periplazme.
8. Asp-Pallidipin po zahtevku 6 ali 7 v katerem ima DNA, ki ima nakodirano signalno peptidno sekvenco, nakodirano signalno sekvenco alkalne fosfataze (APaze).
9. Asp-Pallidipin po vsakem od zahtevkov 5 do 8, za uporabo kot zdravilo.
10. Farmacevtski pripravek po vsakem od zahtevkov 5 do 8, ki vsebuje AspPallidipin, v povezavi s farmacevtsko sprejemljivim razredčilom ali nosilcem.
11. Uporaba Asp-Pallidipina po vsakem od zahtevkov 5 do 8 za izdelovanje zdravila za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta.
12. Uporaba Asp-Pallidipina po vsakem od zahtevkov 1 do 4 za izdelavanje zdravila za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta.

-4313. Uporaba Asp-Pallidipina po vsakem od zahtevkov 1 do 4 za izdelovanje zdravila za zdravljenje raka z metastaznimi tumorskimi celicami.
14. Postopek čiščenja po vsakem od zahtevkov 1 do 4 in 6 do 8 v katerem čiščenje vključuje sledeče zaporedne stopnje:

(i) čiščenje s kationsko izmenjevalno kromatografijo;

(ii) čiščenje z anionsko izmenjavo; in (iii) čiščenje z izločanjem po velikosti.
15. Rekombinantni vektor vsebuje izvedljivo povezavo:

(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni Asp-Pallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustreženo signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;

s čimer je po ekspresiji v ustreznem bakterijskem gostitelju, predprotein, ki vsebuje signalni peptid in Asp-Pallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega AspPallidipina.
16. Rekombinantni vektor zahtevka 15 v katerem imata DNA ali cDNA molekuli nakodiran Asp-Pallidipin, ki ima aminokislinsko sekvenco izbrano iz:

a) sekvenc pokazanih v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO;3;

-44ali

b) alelne variante ali muteina sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina.
17. Bakterijski gostitelj transformiran z vektorjem zahtevka 15 ali 16.
18. Bakterijski gostitelj zahtevka 17, ki je E. coli.