RO117971B1 - Procedeu de obtinere a unei proteine asp pallidipin recombinanta, proteina obtinuta si compozitie farmaceutica cu aceasta - Google Patents
Procedeu de obtinere a unei proteine asp pallidipin recombinanta, proteina obtinuta si compozitie farmaceutica cu aceasta Download PDFInfo
- Publication number
- RO117971B1 RO117971B1 RO97-00444A RO9700444A RO117971B1 RO 117971 B1 RO117971 B1 RO 117971B1 RO 9700444 A RO9700444 A RO 9700444A RO 117971 B1 RO117971 B1 RO 117971B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- pallidipin
- asp
- protein
- sequence
- purification
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 108010077752 pallidipin Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 109
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 106
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 3
- -1 aspartic acid amino acid Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 101
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 30
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 30
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 30
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 14
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 claims description 12
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 10
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 10
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 9
- 206010038563 Reocclusion Diseases 0.000 claims description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 16
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N Thr-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IEZVHOULSUULHD-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N Asp-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N Glu-Cys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- AQNYKMCFCCZEEL-JYJNAYRXSA-N Glu-Lys-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AQNYKMCFCCZEEL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N Gly-Asn-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O GGEJHJIXRBTJPD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 3
- XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N Met-Pro-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- MVIJMIZJPHQGEN-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 MVIJMIZJPHQGEN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N Pro-His-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C([O-])=O)NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 3
- FRUYSSRPJXNRRB-GUBZILKMSA-N Val-Cys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FRUYSSRPJXNRRB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- LGXUZJIQCGXKGZ-QXEWZRGKSA-N Val-Pro-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N LGXUZJIQCGXKGZ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 3
- 108010068265 aspartyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 108010033670 threonyl-aspartyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 7-N,N-Dimethylamino-1,2,3,4,5-pentathiocyclooctane Chemical compound CN(C)C1CSSSSSC1 KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- GJFYPBDMUGGLFR-NKWVEPMBSA-N Asn-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O GJFYPBDMUGGLFR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- JIVJQYNNAYFXDG-LKXGYXEUSA-N Cys-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JIVJQYNNAYFXDG-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- IRKLTAKLAFUTLA-KATARQTJSA-N Cys-Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O IRKLTAKLAFUTLA-KATARQTJSA-N 0.000 description 2
- 101000783577 Dendroaspis angusticeps Thrombostatin Proteins 0.000 description 2
- 101000783578 Dendroaspis jamesoni kaimosae Dendroaspin Proteins 0.000 description 2
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N Gly-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(=O)O WDEHMRNSGHVNOH-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- FHKZHRMERJUXRJ-DCAQKATOSA-N His-Ser-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 FHKZHRMERJUXRJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N His-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VCHVSKNMTXWIIP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- JHNOXVASMSXSNB-WEDXCCLWSA-N Lys-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O JHNOXVASMSXSNB-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N Pro-Gly-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HAEGAELAYWSUNC-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N Ser-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O BNFVPSRLHHPQKS-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N Thr-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ONNSECRQFSTMCC-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 2
- KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O KZSYAEWQMJEGRZ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IVDFVBVIVLJJHR-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- TVOGEPLDNYTAHD-CQDKDKBSSA-N Tyr-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 TVOGEPLDNYTAHD-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 2
- JHORGUYURUBVOM-KKUMJFAQSA-N Tyr-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JHORGUYURUBVOM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GITNQBVCEQBDQC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N Tyr-Lys-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SINRIKQYQJRGDQ-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N Tyr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 2
- NMPXRFYMZDIBRF-ZOBUZTSGSA-N Val-Asn-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N NMPXRFYMZDIBRF-ZOBUZTSGSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- ZABMJSAHPWHMNM-QCOJBMJGSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[2-[[(2s)-1-[(2s)-4-carboxy-2-[[2-[[(2s)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]butanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CCC1 ZABMJSAHPWHMNM-QCOJBMJGSA-N 0.000 description 1
- 101710154545 16 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- VWJFQGXPYOPXJH-ZLUOBGJFSA-N Asn-Cys-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)C(=O)N VWJFQGXPYOPXJH-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- QGABLMITFKUQDF-DCAQKATOSA-N Asn-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QGABLMITFKUQDF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MLJZMGIXXMTEPO-UBHSHLNASA-N Asn-Trp-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MLJZMGIXXMTEPO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- WKGJGVGTEZGFSW-FXQIFTODSA-N Asp-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O WKGJGVGTEZGFSW-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PXLNPFOJZQMXAT-BYULHYEWSA-N Asp-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PXLNPFOJZQMXAT-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- UWXFFVQPAMBETM-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UWXFFVQPAMBETM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SXGAGTVDWKQYCX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- MXJYXYDREQWUMS-XKBZYTNZSA-N Glu-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MXJYXYDREQWUMS-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- SWQALSGKVLYKDT-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SWQALSGKVLYKDT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N Gly-Ile-Ala Natural products NCC(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(C)C(O)=O SWQALSGKVLYKDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GAAHQHNCMIAYEX-UWVGGRQHSA-N Gly-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GAAHQHNCMIAYEX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N Gly-Val-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- JMSONHOUHFDOJH-GUBZILKMSA-N His-Ser-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 JMSONHOUHFDOJH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- APDIECQNNDGFPD-PYJNHQTQSA-N Ile-His-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N APDIECQNNDGFPD-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DCGXHWINSHEPIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DCGXHWINSHEPIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PXHCFKXNSBJSTQ-KKUMJFAQSA-N Lys-Asn-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O PXHCFKXNSBJSTQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N Lys-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SBQDRNOLGSYHQA-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MEQLGHAMAUPOSJ-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MEQLGHAMAUPOSJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N Lys-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N Phe-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 PYOHODCEOHCZBM-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- 206010050661 Platelet aggregation inhibition Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- FDINZVJXLPILKV-DCAQKATOSA-N Pro-His-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FDINZVJXLPILKV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N QFBNNYNWKYKVJO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- PMCMLDNPAZUYGI-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PMCMLDNPAZUYGI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YEDSOSIKVUMIJE-DCAQKATOSA-N Ser-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YEDSOSIKVUMIJE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N Thr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PQLXHSACXPGWPD-GSSVUCPTSA-N 0.000 description 1
- DCLBXIWHLVEPMQ-JRQIVUDYSA-N Thr-Asp-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DCLBXIWHLVEPMQ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- JWQNAFHCXKVZKZ-UVOCVTCTSA-N Thr-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O JWQNAFHCXKVZKZ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- GDPDVIBHJDFRFD-RNXOBYDBSA-N Trp-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O GDPDVIBHJDFRFD-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- DCOOGDCRFXXQNW-ZKWXMUAHSA-N Val-Asn-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N DCOOGDCRFXXQNW-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- DDNIHOWRDOXXPF-NGZCFLSTSA-N Val-Asp-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N DDNIHOWRDOXXPF-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- CPGJELLYDQEDRK-NAKRPEOUSA-N Val-Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CPGJELLYDQEDRK-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- TVGWMCTYUFBXAP-QTKMDUPCSA-N Val-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O TVGWMCTYUFBXAP-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 1
- OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 108010055353 lysyl-prolyl-glycyl-glutamyl-prolyl-glycyl-prolyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108010000867 moubatin Proteins 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Inventia se refera la un procedeu de obtinere a unei proteine Asp Pallidipin recombinanta, la o proteina recombinanta, la o compozitie farmaceutica cu aceasta, si prezinta aplicabilitate in domeniul medical. Procedeul conform inventiei consta in aceea ca cuprinde urmatoarele etape: a) transfectarea a cel putin unei bacterii cu un vector adecvat, in care vectorul cuprinde o inlantuire operabila intre: (i) o prima molecula de ADN sau ADNc care codifica pentru Asp-Pallidipin recombinant, (ii) o a doua molecula de ADN care codifica o secventa peptidica semnal adecvata, si (iii) un promotor adecvat, prin care, in ceea ce priveste expresia si transportul in periplasma, preproteina cuprinzand peptida semnal si Asp-Pallidipin este clivata astfel incat aminoacidul acid aspartic sa fie in pozitia +1 a secventei de aminoacizi Asp-Pallidipin matur; b) exprimarea preproteinei cuprinzand Asp-Pallidipin si secventa peptidica semnal; c) transportul Asp-Pallidipin din citoplasma bacteriei in periplasma, urmata de clivare la acest nivel a preproteinei de cel putin o proteaza, in cursul transportului producand Asp-Pallidipin matur; d) izolarea Asp-Pallidipin prin extractia periplasmei; e) purificarea Asp-Pallidipin.
Description
Invenția se referă la procedeu de obținere a unei proteine Asp-Pallidipin recombinantă, la o proteină Asp-Pollidipin, precum și la o compoziție farmaceutică cu aceasta.
Invenția prezintă aplicabilitate în domeniul medical, pentru tratamentul bolilor arterosclerotice sau trombotice, pentru prevenirea reoclusiei după tratamentul infarctului miocardic etc.
Colagenul este cel mai puternic inductor cunoscut al agregării plachetelor umane. De exemplu, în caz de rănire a pereților vaselor de sânge și de expunere la colagen, plachetele sanguine aderă rapid și se activează (H. R. Baumgartner (1977) Thromb Haemostas 37-1-16; J.Hawiger(1987), Human Pathol 18:111-122).
Agregarea plachetelor, indusă de colagen, a plachetelor umane, reprezintă din acest motiv un factor de risc pentru pacienții care urmează proceduri ce afectează vasele sanguine, de exemplu angioplastie sau septicemie, pentru cei care suferă infarct miocardic, pentru cei convalescenți după un tratament pentru infarct miocardic, printre altele.
în unele cazuri, este necesar să inhibăm agregarea plachetelor, indusă de colagen. Există numeroși compuși cunoscuți ca inhibitori ai agregării. De exemplu, oligopeptidele sintetice inhibă agregarea plachetelor, indusă de colagen, prin legare la plachete. Vezi, de exemplu, Bevers și colab. (1985), “Octapeptida derivată de la colagen inhibă activitatea procoagulantă a plachetelor prin acțiunea combinată a colagenului și trombinei”, Thrombosis Research, 37: 365-370; Karniguian și colab. (1983), “Efectul octapeptidei derivate de la colagen în diferite etape ale interacțiunii plachete/colagen”, Thrombosis Research 32:593604; Caen și colab. (1981), “Oligopeptide cu proprietăți inhibitorii specifice ale agregării induse de colagen, procedeu de preparare a acelora și compoziții farmaceutice care le conțin” și EP-A-0040149.
O altă sursă de inhibitor al agregării plachetelor induse de colagen este un inhibitor identificat în veninul unui șarpe, având o structură necunoscută. Vezi Smith și colab., “Identificarea unor proteine din veninul de șarpe de 50 k Daltoni care inhibă în mod specific adeziunea plachetelor la colagen”, (1991) FEBS 283:307-310.
Un al treilea astfel de inhibitor din saliva lipitorii medicinale este descris de către Munro și colab. (1991) “Calin-un inhibitor al adeziunii plachetelor din saliva lipitorii medicinale”, Blood Xoagulation and Fibrinolysis 2:179-184. Publicația Cererii de Brevet Europene EP 048051 (Merck & Co.lnc., publicată în 15 aprilie 1992) descrie o proteină având o masă moleculară de aproximativ 16 kDaltoni și o capacitate de a inhiba agregarea indusă de colagen, a plachetelor umane, proteină care este derivată din glandele salivare ale unei lipitori Haemaenteria officinalis.LAPP este o proteină cu 16 kDa de la lipitoarea Haemaenteria officinalis, descrisă de Cannolly și colab. (1992, J.Biol.Chem.267: 6893-6898. Vezi de asemenea Moubatin, descrisă de Waxman și Connolly (1993), în J.Biol.Chem. 268:5445-5449.
Totuși, mai există un alt tip de inhibitor al agregării plachetelor, indusă de colagen, izolabil de la insecte, așa cum s-a descris EP 0530937. Aceste proteine sunt denumite “Pallidipine”.
Fosfataza alcalină (APază) este o proteină de la E.coli, care este secretată în spațiul periplasmic. APaza este sintetizată ca o proteină precursoare, are o secvență - lider lungă de 21 aminoacizi care este tăiată de peptidaza-lider în cursul translocării prin membrana internă bacteriană, în spațiul periplasmic (Y.Kikuchi și colab. (1981), Nucl.Acids F?es.9:56715678). Biosinteză sa este reglată de concentrația fosfatului în mediul de cultură, iar exportul produselor genelor heteroloage, plasate după promotorul pentru APază, este realizat prin utilizarea concentrațiilor scăzute de fosfat (C.Monteilhet și colab. (1983), Gene 125:223228).
RO 117971 Β1
Sursa naturală de proteină Pallidipin este limitată. Procedeele care utilizează metode biotehnologice reprezintă soluția cea mai bună pentru fabricarea Pallidipin. Expresia 50
Pallidipin în celulele renale ale unui pui de hamster (EP 0530937) are loc la o rată a producției care ar trebui crescută pentru a exprima Pallidipin în cantități industriale. De aceea, a fost necesar un sistem îmbunătățit de expresie.
Problema pe care o rezolvă procedeul prezentei invenții este aceea că se obține o proteină Pallidipin recombinantă (Asp-Pallidipin), în care Asp-Pallidipin inhibă agregarea 55 plachetelor, indusă de colagen, a plachetelor mamiferelor.
Procedeul conform invenției constă în aceea că acesta cuprinde următoarele etape:
a) transfectarea a cel puțin unei bacterii cu un vector adecvat, în care vectorul cuprinde o înlănțuire operabilă între:
(i) o primă moleculă de ADN sau ADNccare codifică pentru Asp-Pallidipin 60 recombinant, (ii) o a doua moleculă de ADN care codifică o secvență peptidică semnal adecvată, și (iii) un promotor adecvat, prin care, în ceea ce privește expresia și transportul în periplasmă, preproteina 65 cuprinzând peptidă semnal și Asp-Pallidipin este clivată astfel, încât aminoacidul acid aspartic să fie în poziția + 1 a secvenței de aminoacizi Asp-Pallidipin matur;
b) exprimarea preproteinei cuprinzând Asp-Pallidipin și secvența peptidică semnal;
c) transportul Asp-Pallidipin din citoplasmă bacteriei în periplasmă, urmată de clivare, la acest nivel, a preproteinei, de cel puțin o protează în cursul transportului, pro- 70 ducând Asp-Pallidipin matur;
d) izolarea Asp-Pallidipin prin extracția periplasmei;
e) purificarea Asp-Pallidipin.
Proteina Asp-Pallidipin recombinantă, conform invenției, este selectată din grupul proteinelor Pallidipin și aminoacidului acid aspartic, acidul aspartic fiind legat printr-o legătură 75 peptidică la capătul N-terminal al Pallidipin și în care Asp Pallidipin este selectată din următoarele secvențe de aminoacizi:
a) secvența indicată în:
aa) SEQ IN NO: 1, bb) SEQ IN NO: 2, 80 cc) SEQ IN NO: 3, sau
b) o variantă alelică sau mutații ale secvențelor în oricare dintre SEQ IN NO: 1 la 3, această variație alelică sau mutație având activitatea proteinei mature, cu excepția acelor secvențe care nu au acid aspartic legat printr-o legătură peptidică cu capătul 85 N-terminal al Pallidipin, sau
c) o proteină conform cu oricare dintre SEQ IN NO: 1 la 3 și o variantă alelică sau o mutație menționată la b), având o modificare posttranslațională care nu afectează în mod substanțial activitatea proteinei mature. 90
Compoziția conform invenției cuprinde proteina Asp-Pallidipin, împreună cu un diluant sau purtător acceptabil farmaceutic, și care este administrată ca medicament pentru tratamentul bolilor arterosclerotice sau trombotice, pentru prevenirea reocluziei după tratamentul infarctului miocardic sau pentru tratamentul cancerului cu celule tumorale metastazice.
Avantajele prezentei invenții constau în îmbunătățirea producerii de Pallidipin la un 95 randament ridicat, inhibarea agregării plachetelor, indusă de colagen, izolarea reproductibilă a proteinei cu un grad mare de purificare, ce afectează negativ activitatea biologică a proteinei rezultante Pallidipin.
RO 117971 Β1
Avantajul procedeului este acela că este de 15 ori mai mare decât randamentul sistemului de expresie, utilizând celule renale de la pui de hamster. Funcția și activitatea
Asp-Pallidipin, comparate cu sistemul de expresie eucariotic din rinichiul de hamster, nu sunt afectate negativ de procedeul invenției. Un alt avantaj este acela că proteaza (de exemplu, peptidaza-lider), necesară pentru clivarea preproteinei, este produsă chiar de către E.coii.
E.coiieste un sistem rapid de expresie pentru producerea proteinelor heteroloage, de exemplu proteine eucariote. Plierea incorectă a proteinelor este adesea o problemă în timpul exprimării produselor genelor eucariote de către E.coii, care poate avea drept rezultat descreșterea activității produselor de expresie. Probabilitatea plierii corecte a proteinei este mult mai mare când proteina este transportată în periplasma de la E.coii decât atunci când proteina este menținută în citoplasmă. Transportul proteinelor în periplasma este indus de secvențele peptidice semnal, atașate de proteinele mature; aceste secvențe peptidice semnal, împreună cu secvențele proteinei mature, sunt denumite “preproteine”. Clivarea corectă a preproteinei în secvența peptidică semnal și în proteina matură este necesară pentru exprimarea proteinelor mature eucariote în E.coii, succesiunea din secvența semnal și secvența proteinei mature având o influență asupra clivării corecte. De aceea, nu toate secvențele peptidice semnal sunt compatibile cu toate secvențele codificatoare.
Secvența semnal a fosfatazei alcaline de la E.coii este cunoscută a fi eficace pentru exportul preproteinelor. Dar se cunoaște că, respectiv, combinația unei secvențe peptidice semnal cu o proteină matură nu va avea obligatoriu, ca rezultat, o procesare bună a preproteinei.
Purificarea Asp-Pallidipin mature este mult mai ușoară utilizând procedeul conform invenției decât este purificarea proteinelor exprimate produse și stocate în citoplasmă bacteriană. Șocul osmic este suficient pentru a elibera Asp-Pallidipin acumulat în periplasmă.
Molecula de ADN care codifică secvența peptidică semnal, codifică pentru secvența fosfatazei alcaline (APaza) este preferabil APaza din E.coii.
Variațiile sau modificările alelice, așa cum s-au menționat mai sus, includ alterarea acestora în secvența nucleotidelor sau aminoacizilor, alterare a genotipului sau fenotipului. Cel puțin o nucleotidă sau un aminoacid poate fi substituit, eliminat prin deleție, sau inserat.
Nu se așteaptă ca majoritatea delețiilor, inserțiilor și substituțiilor în particular să producă schimbări radicale în caracteristicile proteinei conform invenției. Proteinele modificate sau mutante, conform invenției, pot fi în mod uzual produse și ecranate în scopul determinării efectului precis al substituției, deleției sau inserției, prin comparația funcțiilor proteinei modificate sau mutante, cu funcțiile caracteristice ale proteinei conform invenției, de exemplu, proteinele SEQ ID NO: 1 la 3, sau Pallidipin nativ, prin aceasta determinându-se dacă proteina alterată are sau nu activitate comparabilă, de exemplu activitate biologică.
Codul genetic este degenerat, adică majoritatea aminoacizilor sunt codificați de mai mult de un singur codon cu trei nucleotide. în mod corespunzător, variația sau modificarea alelică în secvența nucleotidelor poate sau nu poate altera secvența aminoacizilor. De aceea, variațiile alelice sunt mai ales la nivelul ADN și pot exista, de asemenea, în mod secundar la nivelul secvenței de aminoacizi.
Secvența de ADN care codifică proteina poate fi modificată prin tehnici convenționale, pentru a produce variații în proteina finală, conform invenției, care încă posedă în mod substanțial aceeași activitate ca și proteina conform invenției, de exemplu, AspPallidipin din SEQ ID NO:1 la 3, sau ca și proteina nativă Pallidipin. Activitatea se măsoară conform cu exemplele. Astfel, unul sau mai mulți aminoacizi, de exemplu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,... până la 15 aminoacizi pot fi adăugați, substituiți sau îndepărtați, fără a afecta în mod substanțial activitatea proteinei conform invenției. Substituțiile pot fi făcute, în general, în concordanță cu tabelul 1, când este de dorit să modulăm cu finețe secvența de aminoacizi a proteinei conform invenției.
RO 117971 Β1
Schimbări substanțiale în funcția sau identitatea imunologică se realizează prin selecția substituțiilor care sunt mai puțin conservative decât cele din tabelul 1, adică selec- 150 tând reziduurile care diferă semnificativ în efectul lor asupra menținerii (a) structurii scheletului polipeptidei în zona substituției, de exemplu, în conformație de helix sau de foaie, (b) încărcării sau hidrofobicității moleculei sau (c) compactizării catenelor laterale.
155
Tabelul 1
Substituții normale ale aminoacizilor în proteine
| Reziduuri originale | Exemple de substituții |
| — | Gly, Ser |
| Arg | Lys |
| Asn | Gin, HiGlus |
| Asp | Ser |
| Cys | Ser |
| Gin | Asn |
| Glu | Asp |
| Gly | Ala, Pro |
| His | Asn, Gin |
| lle | Leu, Val |
| Leu | lle, Val |
| Lys | Arg, Gin, Glu |
| Met | Leu, Tyr, lle |
| Phe | Met, Leu, Tyr |
| Ser | Thr |
| Thr | Ser |
| Trp | Tyr |
| Tyr | Trp, Phe |
| Val | lle Leu |
160
165
170
175
Mutantele se definesc prin omologie cu două proteine comparate. Expresia “omologie” cuprinde similarități ale aminoacizilor și spații în secvențele ambelor secvențe comparate. Similaritatea aminoacizilor este definită, de exemplu, în tabelul 1. Preferabil, mutan- 180 tele acestei invenții cuprind o secvență de aminoacizi având o omologie de cel puțin 60%, mai preferabil de cel puțin 80%, mult mai preferabil, de cel puțin 90%, și cel mai preferabil, de cel puțin 95%, cu secvența uneia dintre proteinele SEQ ID NO:1 la 3.
Prin variații post-translaționale, așa cum s-a menționat mai sus, se înțeleg variațiile din timpul translației sau după translație, așa cum sunt formarea punților disulfurice și 185 modificările chimice ale aminoacizilor.
Proteinele formează adesea legături intracatenare. Aceste legături disulfură se formează între grupările SH ale resturilor de cisteină din proteina pliată sau din proteina care
RO 117971 Β1 se pliază în timpul translației. Legăturile stabilizează structura tridimensională a proteinei. Astfel de legături disulfurice se formează rar în moleculele proteice care sunt încă în citosol, deoarece concentrația intracelulară a agentului de reducere a — SS — (disulfură) care este glutationul desface majoritatea acestor legături. O dată ce se găsesc în afara citoplasmei, sunt secretate sau se găsesc pe suprafața celulei, proteinele formează adesea legături covalente intracatenare suplimentare.
în plus, aminoacizii pot fi alterați așa cum s-a descris în WO 91/10684. Alte alterări ale catenelor laterale ale aminoacizilor sunt posibile.
Proteina conform invenției are o puritate de cel puțin 40%, preferabil, de cel puțin 60%, mai preferabil, de cel puțin 80% și cel mai preferabil, de cel puțin 90%. Puritatea este definită de cantitatea de proteină conform invenției, în raport cu cantitatea totală de proteină. Utilizând metodele de purificare descrise în exemple, nici o altă proteină, diferită de proteinele conform invenției, nu este detectabilă.
Utilizând proteina purificată, se pot produce anticorpi monoclonali în concordanță cu binecunoscuta metodă Koehler și Milstein care, în particular, cuprinde șoareci sau iepuri imunizați convențional cu proteina purificată, conform cu invenția ca imunogen, urmată de producerea hibridomilor de la celulele producătoare de anticorpi ale șoarecelui sau iepurelui.
Varianta preferată a invenției este o proteină menționată în SEQ ID NOJ, exprimată în E.coli tulpina E 15.
Asp-Pallidipin prezintă activitate farmacologică și poate, din acest motiv, să fie utilizat ca un preparat farmaceutic. Asp-Pallidipin poate fi utilizat într-o compoziție farmaceutică cuprinzând Asp-Pallidipin în asociație cu un diluant sau purtător acceptabil farmaceutic. în mod suplimentar, invenția cuprinde o compoziție farmaceutică cuprinzând Asp-Pallidipin activ farmaceutic, conform invenției, și o sare acceptabilă farmaceutic sau un purtător acceptabil farmaceutic.
în particular, Asp-Pallidipin inhibă agregarea plachetelor, indusă de colagen, și inhibă adeziunea celulelor tumorale, preferabil a celulelor tumorale metastatice, la colagen.
Asp-Pallidipin inhibă agregarea plachetelor. Sistemul de testare este descris în exemple. Asp-Pallidipin inhibă semnificativ agregarea plachetelor la o concentrație de la 0,5 la 50pg proteină. Asp-Pallidipin cel mai preferat, proteina din SEQ ID NOJ, are un IC50 de 50 nmol/L de proteină înalt purificată, conform cu exemplele. Asp-Pallidipin inhibă agregarea plachetelor la concentrații de la 5 nmol%L la aproximativ 1000 nmol/L.
Rezultatele sistemelor de testare in vitro indică faptul că proteinele conform invenției pot fi utilizate ca un medicament sau pot fi utilizate pentru tratament medical. Rezultatele testelor in vitro pot fi corelate cu sistemul in vivo, deoarece este un sistem stabilit în domeniu R.J.Shebuski și colab. (1990), Thrombosis and Haemostatis, 64:576-581.
Asp-Pallidipin poate fi administrat prin injecții intraperitoneale care pot fi făcute zilnic sau de două, sau trei ori pe săptămână. Când animalele primesc injecții zilnic pentru a realiza o concentrație sanguină de 100 nmol/L, agregarea plachetelor lor este redusă. Nu se înregistrează nici un efect secundar serios. în aceste condiții, Asp-Pallidipin cauzează această inhibiție a agregării plachetelor la șoareci, la dozaje zilnice care realizează concentrația în sânge de la aproximativ 10 nmol/L la 1000 nmol/L.
Din acest motiv, Asp-Pallidipin este folositor pentru tratamentul leziunilor provocate de ateroscleroză sau tromboză, sau pentru a preveni reocluzia după tratamentul infarctului miocardic. Asp-Pallidipin poate fi utilizat ca un agent antiaterosclerotic sau antitrombotic la mamifere, incluzând omul, de exemplu, pentru a trata leziunile aterosclerotice, datorate, de exemplu, rupturii plăcilor aterosclerotice sau leziunile datorate perturbării sau îndepărtării endoteliului, de exemplu, în septicemie sau transplanturi, sau pentru a trata angina instabilă.
Poate fi, de asemenea, utilizat pentru a preveni reocluzia după tratamentul infarctului
RO 117971 Β1
240 miocardic, prin fibrinoliză sau prin angioplastie (PTCA). Dacă se aplică terapia fibrinolictică (cu streptokinază, t-PA sau alți activatori ai plasmalogenului), pentru a trata infarctul miocardic, Asp-Pallidipin poate fi utilizat ca un agent adjuvant pentru a preveni reocluzia vaselor sanguine. Tratamentul infarctului miocardic cu un cateter cu balon (PTCA) rănește, de asemenea, peretele vasului, și aceasta poate duce la formarea unui nou cheag. Acest lucru poate fi prevenit prin administrarea Asp-Pallidipin în timpul procedurii și după procedură. Asp-Pallidipin poate fi utilizat în angioplastie coronariană, precum și în alte aplicații ale angioplastiei.
Astfel, prezenta invenție cuprinde:
a) utilizarea proteinei pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul aterosclerozei sau trombozei, sau pentru prevenirea reocluziei după tratamentul infarctului miocardic (astfel, proteinele sunt folositoare ca medicamente profilactic eficiente pentru tratarea pacienților cunoscuți a fi expuși la riscul dezvoltării unei maladii sau stări);
b) tratamentul aterosclerozei sau trombozei, sau pentru prevenirea reocluziei după tratamentul infarctului miocardic, care cuprinde administrarea unei cantități eficiente pentru supresarea bolii de proteină conform invenției, la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament.
c) o compoziție farmaceutică pentru tratamentul aterosclerozei sau trombozei, sau pentru prevenirea infarctului miocardic, care cuprinde proteina și un purtător sau un diluant acceptabil farmaceutic.
Pentru aceste indicații, doza adecvată va varia, desigur, depinzând, de exemplu, de compusul conform invenției, utilizat, de gazdă, de modul de administrare și de natura și severitatea stării care este tratată. Totuși, în general, la animale s-au obținut rezultate satisfăcătoare, la dozaje zilnice, pentru a realiza o concentrație în sânge de la 10 la 1000 nmol/L, preferabil la un dozaj zilnic de la 30 la 300 nmol/L.
Proteinele conform invenției pot fi administrate pe orice cale convențională, în particular în mod enteral sau parenteral, de exemplu sub forma unor soluții sau suspensii injectabile. Se preferă injectarea intraperitoneală.
Proteina din SEQ ID NO: 1 este compusul preferat.
Prezenta invenție furnizează compoziții farmaceutice cuprinzând compuși conform invenției în asociație cu cel puțin un purtător sau diluant farmaceutic. Astfel de compoziții se pot fabrica într-o manieră convențională. Vezi Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980).
Proteinele conform invenției inhibă, de asemenea, adeziunea celulelor metastatice tumorale la colagen. Sistemul de testare este descris în exemple. Proteinele determină inhibarea semnificativă a adeziunii celulelor tumorale metastatice la colagen, la o concentrație de 1 la 100 gg proteină.
Testul celei mai preferate proteine, proteina din SEQ ID NO:1, arată o valoare a IC50 de 100 nmol/L de proteină înalt purificată, conform exemplelor 2 și 15. Proteinele conform invenției determină inhibarea adeziunii celulelor tumorale metastatice la colagen, la concentrații de la 10 la 2000 nmol/L.
Rezultatele sistemelor de testare in vitro indică faptul că proteinele conform invenției pot fi utilizate ca un medicament sau pot fi utilizate pentru tratament medical. Rezultatele testelor pot fi transferate de la sistemul in vitro la sistemul in vivo, deoarece este un sistem stabilit în domeniu, Chan și colab. (1990), Science, 2:1600-1602.
Proteinele pot fi administrate în timpul sau după intervenții chirurgicale ale tumorilor primare, pentru a preveni formarea metastazei de către celulele tumorale detașate, care pot intra în circulația sanguină în timpul operației. Aceste efecte anti-metastatice pot fi demonstrate pe un model de animal “experimental” și “spontan”, așa cum este descris de către Chan și colab. (1990), Science, 2:1600-1602.
245
250
255
260
265
270
275
280
285
RO 117971 Β1
Proteinele conform invenției se pot administra prin injecții intraperitoneale care se fac zilnic sau de două până la trei ori pe săptămână. Când animalele primesc zilnic injecții pentru a realiza o concentrație în sânge de 200 nmol/L, ele prezintă o adeziune redusă.a celulelor tumorale metastatice, măsurată prin numărarea centrelor de celule metastatice stabile. Nu s-au consemnat efecte secundare serioase în aceste condiții.
Proteinele conform invenției arată această inhibiție a adeziunii celulelor tumorale metastatice la colagen, la șoareci, în dozaje zilnice, pentru a realiza o concentrație în sânge de la 20 la 2000 nmol/L, preferabil, concentrații de la 60 la 600 nmol/L.
Proteinele conform invenției sunt, din acest motiv, utilizate pentru tratamentul cancerului, mai ales al cancerului cu celule tumorale metastatice, cel mai preferabil al cancerului cu celule tumorale înalt metastatice.
Astfel, invenția se referă la:
a) utilizarea proteinei conform invenției pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul cancerului cu celule tumorale metastatice (proteinele sunt astfel folositoare pentru medicamente profilactic eficiente, administrate înaintea, de exemplu, unei îndepărtări chirurgicale a tumorilor);
b) tratamentul cancerului cu celule tumorale metastatice, care cuprinde administrarea unei cantități eficiente pentru supresarea bolii de proteină conform invenției, la un pacient care are nevoie de un astfel de tratament;
c) o compoziție farmaceutică pentru tratamentul cancerului cu celule tumorale metastatice, care cuprinde o proteină și un purtător sau un diluant acceptabil farmaceutic.
Pentru aceste indicații dozajele adecvate vor varia, desigur, depinzând, de exemplu, de compusul conform invenției, utilizat, de gazdă, de modul de administrare și de natura și severitatea stării care este tratată. Totuși, în general, rezultate satisfăcătoare la animale s-au obținut la dozaje zilnice, pentru a realiza concentrații în sânge de la 20 la 2000 nmol/L, preferabil, la dozaje zilnice de la 60 la 600 nmol/L.
Proteinele conform invenției se pot administra pe orice cale convențională, în particular enteral și parenteral, de exemplu, sub forma unor soluții sau suspensii injectabile.
Proteina din SEQ ID NO:1 este compusul preferat.
Prezenta invenție furnizează compoziții farmaceutice cuprinzând compuși conform invenției în asociație cu cel puțin un purtător sau diluant farmaceutic. Astfel de compoziții se pot fabrica într-o manieră convențională. Vezi Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed, Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980).
Un alt aspect al acestei invenții se referă la secvențe ADN, vectori conținând aceste secvențe, celule conținând vectorii menționați, metode de producere, în mod recombinant, a proteinelor și a anticorpilor proteinelor conform invenției. De asemenea, se referă la secvențe de ADN izolat și/sau recombinante (de exemplu, genomic sau ADNc) ce codifică o proteină ce inhibă agregarea indusă de colagen, a plachetelor umane. Invenția se referă, de asemenea, la proteine produse recombinant, de exemplu, având secvențele menționate mai sus.
Prin termenul “izolat” se înțelege că inhibitorul conform invenției, sau altă entitate, este prezent într-o formă separată de (purificată de) componentele cu care el este produs recombinant și sintetic. Toate gradele de astfel de izolare sau purificare sunt incluse generic. Preferate sunt gradele de izolare sau purificare prin care inhibitorul este utilizat în scopuri farmaceutice. De exemplu, astfel de grade de izolare (de exemplu, activități sau purități) pot fi obținute în mod uzual prin tehnici cromatografice cum sunt cele utilizate în exemple. Purificări ulterioare, de exemplu, până la omogenitate pot fi realizate în mod uzual utilizând metode convenționale, cum sunt cele descrise în textele următoare:
RO 117971 Β1
Metode de enzimologie, volumul 182, ghid pentru purificarea proteinelor, ed Murray
P. Deutscher, Academic Press 1990;
Aplicații ale purificării proteinelor - O înțelegere practică, ed. E.L.V. Harris and
S.Angel, IRL-Press 1990;
Purificarea proteinelor, principii și practică, Robert Scopes, Springer-Verlag 1982; 340
Și
Purificarea proteinelor, principii, metode de înaltă rezoluție și aplicații, ed.J.-C.Janson and L.Ryden, VCH publishers 1989.
Puritatea se poate determina prin oricare dintre metodele de rutină, de exemplu electroforeză în gel de poliacrilamidă, HPLC analitic etc. Inhibitorul purificat poate fi utilizat 345 pentru a determina secvența de aminoacizi a proteinei conform metodelor care sunt în întregime de rutină pentru o persoană în domeniu. Hewick, R.M. și colab. (1981) J.Biol. Chem. 256, 7990-7997.
Secvența de aminoacizi a inhibitorului conform prezentei invenții poate fi utilizată pentru a determina secvența “sondelor” adecvate pentru ADN, care pot fi utilizate pentru 350 găsirea de noi inhibitori, de exemplu, la alte specii. Astfel de “sonde” pot fi ușor sintetizate, de exemplu, utilizând un sintetizator automat de ADN, iar monitorizarea băncilor de ADN genomic sau ADNc este o rutină pentru o persoană din domeniu WO 90/07861.
Din acest motiv, prezenta invenție include, de asemenea, o secvență de ADN corespunzând (codificând) atât secvența de ADN (gena) pentru Asp-Pallidipin, când este 355 izolată din mediul înconjurător, de exemplu, în soluție sau într-un vector, cât și mutante ale acestora. Metode de producere a mutantelor este de asemenea o rutină pentru o persoană din domeniu, așa cum sunt metodele de ecranare pentru testarea, eficacității unor astfel de proteine, de exemplu, așa cum este descris aici.
Muntantele adecvate sunt cele care au cel puțin o fracțiune, de exemplu, cel puțin 360 5%, preferabil cel puțin 50%, mai preferabil cel puțin 90% din activitatea biologică a inhibitorului, de exemplu, inhibiția agregării plachetelor, indusă de colagen, așa cum se descrie aici.
Invenția mai cuprinde o metodă de purificare, în care purificarea cuprinde următoarele etape consecutive:
(i) purificarea prin cromatografie de schimb de cationi; 365 (ii) purificarea prin schimb de anioni și (iii) purificarea prin excludere pe baza mărimii.
în exemplele care urmează, toate temperaturile sunt date în grade Celsius și, dacă nu se specifică altfel, toate părțile și procentajele sunt per greutate.
Toate dezvăluirile tuturor cererilor, brevetelor și publicațiilor citate mai sus și mai jos, 370 dacă este cazul, incluzând EP 942500224.6, înregistrat în 2 septembrie 1994, sunt încorporate aici drept referință.
Exemplul 1. Construirea unui vector de expresie
Pentru construirea unui vector conform invenției, care codifică Asp-Pallidipin, se utilizează următorii primeri sens și antisens: p3: 375
5'-GCGATATCGCGACGAAGAATGCAACTCATG-3' (Nrul) (SEQ ID NO:4): și p4:
5'-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC-3' (BamHI (SEQ ID NO:5) se folosesc. 380
PCR este pentru 8 cicluri de câte 2 min la 94°C, 1 min și 30 s la 42°C și 2 min și 30 s la 72°C, utilizând p3 și p4, ca perechi de primer și 1 μρ DNA matriță. După purificare în gel și digestie cu Nrul și SamH1, fragmentul este subclonat în pSB/pho. Plasmida este preparată prin digestie cu Xmal, urmată de tratamentul pe fasole Mung pentru a tăia capătul 5' și de digestie SamH1. 385
RO 117971 Β1
Acest “construct” este verificat prin secvențierea ADN complet a fragmentelor inserate, utilizând metoda dideoxi pentru catenele terminale (F.Sanger și colab. (1977), Proc. Nat’l. Acad.Sci. USA 74:5463-5467) și o secvențare a ansamblului cu [35S]dATP_ Transformarea E.coli competente cu “constructul de expresie al Pallidipin sau plasmida goală (transformare mimetică) este realizată utilizând metode standard (J.Sambrook și colab. (1989) Molecular Cloning: Manual de Laborator, cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Exemplul 2. Expresia și extracția Asp-Pallidipin
Plasmidele pSB/pho(derivat de la pSB94, vezi J.Daum și colab. (1989) Eur.J. Biochem 185:347-354), culturi de E15 peste noapte (S.J.Hayashi și colab. (1964) J.Biol. Chem. 239:3091-3106) se diluează la 8% (v/v) într-un mediu cu puțin fosfat și se cresc timp de 6 h la 37°C (A.Becker și colab. (1994), Protein Expression and Purification 5:50-56. Bacteriile se recoltează după inducție prin centrifugare și se resuspendă într-un volum 1/10 de 50 mmol/L de Tris-HCI (pH 8,0(/100 mmol/L NaCI. Acest preparat este înghețat, dezghețat și centrifugat, astfel rezultând o primă fracțiune de supernatant (SN1). Precipitatele bacteriene se resuspendă și se reechilibrează timp de 10 min la temperatura camerei, în zaharoză 0,5 mol/L, înainte de centrifugare. Supernatantul (SN2) se păstrează pentru analiză, în timp ce precipitatul se resuspendă în apă rece ca gheața, la care se adaugă 1 mmol/L PMSF (fenilmetilsulfonil fluorură) și se incubează timp de 10 min pe gheață. După acest șoc osmotic, celulele se centrifughează, și supernatantul (SN3) se colectează. Precipitatul conținând fracțiunea citoplasmatică (CF) se resuspendă în 50 mmoli/L Tris-HCI (pH 8,0)/100 mmol/L,NaCI.
Exemplul 3. Purificarea Asp-Pallidipin recombinant
Fracțiunea de supernatant conținând cea mai mare parte de Asp-Pallidipin recombinant (SNI) este ajustată la pH 4,0 cu acid acetic și se aplică pe o coloană cu schimbător de cationi (Mono S, Pharmacia) utilizând un sistem FPLC. După spălare cu un gradient de 0 la 500 mmoli/L NaCI în acetat de sodiu pH 4,0, eluția Asp-Pallidipin se realizează cu 20 mmoli/L NaPi, pH 7,0. Fracțiunile de eluție conținând Asp-Pallidipin, așa cum reiese prin electroforeză în gel de poliacrilamidă SDS (PAGE) și prin imunomarcare, sunt reunite, ajustate la pH 8,0 și aplicate pe o coloană cu schimbător de anioni (Fractogel-EMD-TMAE 650, Merck). Eluția Asp-Pallidipin se realizează cu un gradient de 0 la 1 mol/mL NaCI în 20 mmoli/L acetat de sodiu pH 8,4. Pentru purificarea finală, fracțiunile de eluție conținând Asp-Pallidipin sunt reunite, concentrate în Seed-Vac(Bachofer) și supuse cromatografiei de excluziune, pe baza mărimii, utilizând Superose 12 (Pharmacia).
Exemplul 4. Testul de agregare a plachetelor
Testul este realizat în mod esențial așa cum s-a descris în publicația lui C.NoeskeJungblut (C.Noeske-Jungblut(1994) J.Biol.Chem. 269:5050-5053). Pe scurt, se colectează sânge uman într-un volum 1/16 de 71 mmol/L acid citric/85 mmol/L citrat trisodic/111 mmol/L glucoză. Plasma bogată în plachete se obține prin centrifugare la 135 g timp de 20 min. AspPallidipin se incubează cu 500 μ\ de plasmă bogată în plachete timp de 1 min la 37°C, înainte de adiția a 2 ^g/ml colagen. Agregarea este monitorizată utilizând un agregometru Micron și valoarea maximă este determinată IC50 are o valoare de aproximativ 50 nM. O diferență semnificativă între compușii cu sau fără Asp în prima poziție nu poate fi remarcată.
Se determină activitatea biologică și randamentul Asp-Pallidipin purificat din spațiul periplasmic al E.coli. Plasma bogată în plachete se incubează cu Asp-Pallidipin și cu probe de control. Agregarea este indusă prin adăugarea de colagen. Tipul “sălbatic” de Pallidipin purificat din salivă este utilizat drept control pozitiv. Alte “constructe”, pot fi utilizate drept probe de control, arătând avantajul Asp-Pallidipin conform invenției, iar probele de control arată randamente diferite (tabelul 2).
RO 117971 Β1
435
Tabelul 2
| Specia | Randament |
| Pallidipin recombinant | 461 μg |
| Arginil-Pallidipin recombinant | 298 μg |
| Aspartil-Pallidipin recombinant | 864 pg |
440
Exemplul 5. Adeziunea celulelor tumorale în colagen este scăzută în prezența proteinei conform invenției
Proteina conform invenției inhibă adeziunea celulelor tumorale la o matrice de colagen. De aceea, celulele tumorale migratoare pot fi împiedicate parțial sau complet să se stabilească în organe sau vase de sânge, atunci când proteina conform invenției este în sângele sau plasma pacientului.
Celulele MTLn3 (celule tumorale mamare de șobolan) sunt marcate cu 51Cr. O placă cu godeuri se acoperă cu colagen (tipul III) la 4°C, peste noapte. Celulele marcate în număr de 2 x 104 într-un mediu, cu 500 μΙ DMEM F12,20 mmoli/L Hepes, 1 mmol/L bicarbonat, 1% BSA se incubează mai întâi cu 0,2,5 sau respectiv 10 μΙ proteină conform invenției (“Superose Pool”, 0,5 mg proteină/ml) timp de 10 min, la 37°C. După aceea, godeurile se spală, și celulele aderente se îndepărtează cu 1 mol/L aOH. Se măsoară apoi radioactivitatea celulelor aderente.
445
450
Tabelul 3
| Cantitate de inhibitor adăugată μΙ | atașarea celulelor (cpm) |
| 0 | 2215 |
| 2 | 2071 |
| 5 | 1608 |
| 10 | 1081 |
455
460
Aproximativ 100 μg de inhibitor purificat conform cu exemplele se adaugă la 0,5 ml adjuvant complet al lui Freund, și emulsia este injectată la un iepure. După două săptămâni, se efectuează o a doua injecție consistând din 80 pg de inhibitor purificat și 0,5 ml adjuvant incomplet al lui Freund. După injectare, se iau câteva mostre de ser, pentru a verifica 465 producerea specifică de anticorpi. Acestea sunt testate prin inhibare Western 20, ng din inhibitorul purificat se aplică pe un gel de poliacrilamidă SDS 12,5%, și electroforeză, marcarea și detectarea se realizează conform cu metodele standard descrise de E.Harlowe, D.Lane (1988) Antibodies a laboratory manual, Cold Spring Harbov Laboratory (diluția serului de testare 1:1500, Ig conjugată cu peroxidază de capră anti-iepure ca al doilea 470 anticorp, detectarea cu ECL-kit de la Amersham Internațional, Amersham, UK). Marcarea arată faptul că antiserul reacționează în mod specific cu inhibitorul purificat.
Exemplele anterioare se pot repeta cu succes, similar, prin substituirea reactanților și/sau condițiilor de operare conform invenției descrise în general sau în mod specific pentru cele utilizate în exemplele anterioare. 475
Din descrierea anterioară, o persoană în domeniu își poate da seama ușor de caracteristicile esențiale ale acestei invenții și, fără a se îndepărta de la spiritul și scopul acesteia, poate face numeroase schimbări și modificări ale invenției pentru a o adapta la utilizări și condiții variate.
RO 117971 Β1
LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚII GENERALE (i) SOLICITANT:
(A) NUME: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT (B) STRADĂ: MUELLERSTRASSE 172-178 (C) ORAȘ: BERLIN (E) ȚARĂ: GERMANIA (F) COD POȘTAL (ZIP): 13353 (G) TELEFON: (030)-468-2085 (H) TELEFAX: (030)-468-2085 (ii) TITLUL INVENȚIEI: PROCEDEU PENTRU FABRICAREA UNUI INHIBITOR AL AGREGĂRII PLACHETELOR INDUSTĂ DE COLAGEN NUMIT PALLIDIPIN (iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 5 (iv) FORMA DE COMPUTER:
(A) TIPUL MEDIUMULUI: Dischetă(floppy disk) (B) COMPUTER: IBM PC compatibil (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentĂn Release# 1.0, versiunea “1.30(EPO) (v) DATA CURENTĂ A CERERII:
NUMĂRUL CERERII: EP 94250224.6 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO:1:
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 172 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENĂ: una (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ: proteină (iii) IPOTETIC: NU (v) TIPUL DE FRAGMENT: N-terminal (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID ΝΟ.Ί:
Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser 15 10 1520
Tle Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly Pro Lys Glu Gin Val Cys Arg Glu
30 3540
Tvr Lys Thr Thr Lvs Asn Ser Asp Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr
50 5560
Lys Thr Gly Gly Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Pro Lys Ser Gly
70 7580
Gly Lys Gly Gin Phe Ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly Gly Lys Lys Lys
90 95100
Ile His Val Glu Thr Ser Val Ile Ala Thr Asp Tyr Lys Asn Tyr Ala Leu Leu Gin Ser
105 110 115120
Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly Ile Ala Asp Asp Val Leu Leu Leu Gin Thr Lys Lys Glu
125 130 135140
Gly Val Asp Pro Gly Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Asn Trp Ser Leu Asp Asp Trp
145 150 155 160
Phe Ser Arg Ser Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys
165170
RO 117971 Β1
530 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO : 2:
(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 171 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENĂ: una (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ: proteină (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 2:
Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser
5 10 1520
Ile Pro His Val Tyr Val Thr His Ser Arg Asn Gly Pro Lys Glu Gin Val Cys Arg Glu
30 '3540
Tyr Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp Gly Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr Lys 45 50 5560
Thr Gly Gly Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Pro Lys Ser Gly Val
70 7580
Lys Gly Gin Phe Ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly Gly Lys Lys Lys Ile 85 90 95100
His Val Glu Thr Ser Val He Ala Thr Asp Tyr Lys Asn Tyr Ala Leu Leu Gin Ser Cys 105 110 115120
Thr Lys Thr Glu Ser Gly He Ala Asp Asp Val Leu Leu Leu Gin Thr Lys Lys Glu Gly 125 130 135140
Val Asp Pro Gly Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Asn Trp Ser Leu Asp Asp Trp Phe
145 150 155160
Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys
165170
535
540
545
550
555
560
565
RO 117971 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERISITICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME- 172 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENĂ: una (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ:proteină (iii) IPOTETIC: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 3:
Asp Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser 15 10 1520 lle Pro His Val TyT Val Thr His Ser Arg Asn Gly Pro Lys Glu Gin Val Cys Arg Glu
30 3540
Tyr Lys Thr Thr Lys Asn Ser Asp Gly Thr Thr Thr Thr Thr Leu Val Thr Ser Asp Tyr
50 5560
Lys Thr Gly Gly Lys Pro Tyr His Ser Glu Leu Lys Cys Thr Asn Thr Gin Lys Ser Gly
70 7580
Gly Lys Gly Gin Phe Ser Val Glu Cys Glu Val Pro Asn Gly Asn Gly Gly Lys Lys Lys
90 95100 lle His Val Glu Thr Ser Val lle Ala Thr Asp Tyr Lys Asn Tyr Ala Leu Leu Gin Ser
105 110 115120
Cys Thr Lys Thr Glu Ser Gly lle Ala Asp Asp Val Leu Leu Leu Gin Thr Lys Lys Glu
125 130 135140
Gly Val Asp Pro Gly Val Thr Ser Val Leu Lys Ser Val Asn Trp Ser Leu Asp Asp Trp
145 150 155160
Phe Ser Arg Ser Lys Val Asn Cys Asp Asn Met Lys
165170
RO 117971 Β1
605 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 4:
Ci) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 31 perechi de baze (Β) ΤΓΡ: acid nucleic (C) CATENĂ: una (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ: alt acid nucleic (A) DESCRIERE: / dese = primer de sens (iii) IPOTETIC. NU (iv) ANTI-SENS: NU (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI SEQ ID NO: 4:
GCGATATCGC GACGAAGAAT GCGAACTCAT G
610
615
620 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 5:
625 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI.
(A) LUNGIME: 34 perechi de baze (Β) TIP: acid nucleic (C) CATENĂ: una (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL DE MOLECULĂ: alt acid nucleic (A) DESCRIERE: /desc= primer de antisens (iii) IPOTETIC. NU (iv) ANT1-SENSE: DA (xi) DESCRIEREA SECVENȚELSEQ ID NO: 5:
GCGATAGGAT CCAAGCTTAT TACTTCATGT TATC
Claims (5)
- Revendicări6451. Procedeu de obținere a unei proteine Asp-Pallidipin, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde următoarele etape:a) transfectarea a cel puțin unei bacterii cu un vector adecvat, în care vectorul cuprinde o înlănțuire operabilă între:(i) o primă moleculă de ADN sau ADNc care codifică pentru Asp-Pallidipin recombinant, 650 (ii) o a doua moleculă de ADN care codifică o secvență peptidică semnal adecvată, și (iii) un promotor adecvat,RO 117971 Β1 prin care, în ceea ce privește expresia și transportul în periplasmă, preproteina cuprinzând peptidă semnal și Asp-Pallidipin este clivată astfel încât aminoacidul acid aspartic să fie în poziția +1 a secvenței de aminoacizi Asp-Pallidipin matur;b) exprimarea preproteinei cuprinzând Asp-Pallidipin și secvența peptidică semnal;c) transportul asp-Pallidipin din citoplasmă bacteriei în periplasmă, urmată de clivare la acest nivel a preproteinei de cel puțin o protează în cursul transportului producând Asp-Pallidipin matur;d) izolarea Asp-Pallidipin prin extracția periplasmei;e) purificarea Asp-Pallidipin.
- 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că purificarea proteinei Asp-Pallidipin cuprinde următoarele etape consecutive:(i) purificarea prin cromatografie de schimb cationic, (ii) purificare prin schimb anionic, și (iii) purificarea prin excludere în funcție de mărime.
- 3. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că molecula de ADN care codifică secvența semnal, codifică secvența semnal a fosfatazei alcaline.
- 4. Proteină Asp-Pallidipin recombinantă, caracterizată prin aceea că Asp-Pallidipin inhibă agregarea plachetelor, indusă de colagen, a plachetelor de la mamifere, și în care Asp-Pallidipin cuprinde o proteină selectată din grupul proteinelor Pallidipin și aminoacidului acid aspartic, acidul aspartic fiind legat printr-o legătură peptidică la capătul N-terminal al Pallidipin, și în care Asp-Pallidipin este selectată din următoarele secvențe de aminoacizi:a) secvența indicată în:aa) SEQ IN NO:1, bb) SEQ IN NO;2, cc) SEQ IN NO:3, saub) o variantă alelică sau mutații ale secvențelor în oricare dintre SEQ IN NO:1 la 3, această variație alelică sau mutație având activitatea proteinei mature, cu excepția acelor secvențe care nu au acid aspartic legat printr-o legătură peptidică cu capătul N-terminal al Pallidipin, sauc) o proteină conform cu oricare dintre SEQ IN NO:1 la 3 și o variantă alelică sau o mutație menționată la b), având o modificare post-translațională, care nu afectează în mod substanțial activitatea proteinei mature.
- 5. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde proteina Asp-Pallidipin definită în revendicarea 4, împreună cu un diluant sau purtător acceptabil farmaceutic, și care este administrată ca medicament pentru tratamentul bolilor arterosclerotice sau trombotice, pentru prevenirea reocluziei după tratamentul infarctului miocardic, sau pentru tratamentul cancerului cu celule tumorale metastazice.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94250224 | 1994-09-12 | ||
| PCT/EP1995/003573 WO1996008563A1 (en) | 1994-09-12 | 1995-09-11 | Process for manufacture of a modified collagen-induced platelet aggregation inhibitor pallidipin |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO117971B1 true RO117971B1 (ro) | 2002-11-29 |
Family
ID=8217517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO97-00444A RO117971B1 (ro) | 1994-09-12 | 1995-09-11 | Procedeu de obtinere a unei proteine asp pallidipin recombinanta, proteina obtinuta si compozitie farmaceutica cu aceasta |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5882887A (ro) |
| EP (1) | EP0781334A1 (ro) |
| JP (1) | JPH10505502A (ro) |
| CN (1) | CN1075836C (ro) |
| AU (1) | AU701643B2 (ro) |
| BG (1) | BG63276B1 (ro) |
| BR (1) | BR9508910A (ro) |
| CA (1) | CA2199719A1 (ro) |
| CZ (1) | CZ76297A3 (ro) |
| FI (1) | FI971013A7 (ro) |
| HU (1) | HU222398B1 (ro) |
| IL (1) | IL115272A0 (ro) |
| MX (1) | MX9701720A (ro) |
| NO (1) | NO971110L (ro) |
| NZ (1) | NZ293261A (ro) |
| PL (1) | PL184617B1 (ro) |
| RO (1) | RO117971B1 (ro) |
| RU (1) | RU2186110C2 (ro) |
| SI (1) | SI9520093A (ro) |
| SK (1) | SK29297A3 (ro) |
| WO (1) | WO1996008563A1 (ro) |
| ZA (1) | ZA957649B (ro) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL200384B1 (pl) * | 1999-03-18 | 2008-12-31 | Merck Patent Gmbh | Polipeptyd blokujący adhezję płytek krwi, sposób jego otrzymywania, zastosowanie i zawierający go preparat farmaceutyczny |
| JP2008525000A (ja) * | 2004-12-28 | 2008-07-17 | アレス トレーディング エス．エー． | 統合失調症及び関連障害を治療するための組成物及び方法 |
| US20110034396A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-10 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting cell migration and treatment of inflammatory conditions |
| CA2623565A1 (en) * | 2005-09-28 | 2007-04-05 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
| TWI391143B (zh) * | 2005-11-04 | 2013-04-01 | Otsuka Pharma Co Ltd | 血小板凝集抑制劑組成物 |
| US9617302B2 (en) * | 2011-06-14 | 2017-04-11 | National Taiwan University | Peptide compounds for inhibition of platelet aggregation |
| FR2979346B1 (fr) | 2011-08-23 | 2013-09-27 | Univ Joseph Fourier | Nanocorps anti-vcam-1 |
| SG11201404741VA (en) | 2012-02-07 | 2014-09-26 | Global Bio Therapeutics Usa Inc | Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof |
| ES2797625T3 (es) | 2012-09-07 | 2020-12-03 | Inst Nat Sante Rech Med | Péptidos inhibitorios derivados del receptor desencadenante expresado en células mieloides-1 (TREM-1) y del transcrito similar a TREM 1 (TLT-1) y sus usos |
| CN105813579B (zh) | 2013-08-08 | 2019-05-07 | 全球生物疗法有限公司 | 用于微创手术过程的夹具装置和其应用 |
| FR3058143B1 (fr) | 2016-10-27 | 2021-03-12 | Univ Grenoble Alpes | Nanocorps anti-tau |
| US20240366681A1 (en) | 2021-08-13 | 2024-11-07 | Triovance Holding Llc | A skin substitute composition and methods of producing and using the same |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FI896261A7 (fi) * | 1987-06-24 | 1989-12-22 | Novo Nordisk As | Menetelmä proteiinin tai polypeptidin valmistamiseksi, polypeptidiä ko odaava DNA-sekvenssi, DNA-sekvenssin sisältämä mikro-organismi sekä po lypeptidi ja sen käyttö farmaseuttisena valmisteena |
| US5756454A (en) * | 1991-09-05 | 1998-05-26 | Schering Aktiengesellschaft | Collagen-induced platelet aggregation inhibitor |
| DE69226580T2 (de) * | 1991-09-05 | 1999-03-04 | Schering Ag, 13353 Berlin | Hemmstoff der Kollagen-induzierten Plättchenaggregation |
| US5705362A (en) * | 1992-05-25 | 1998-01-06 | Gist-Brocades, N.V. | Modified signal sequences |
-
1995
- 1995-09-11 RO RO97-00444A patent/RO117971B1/ro unknown
- 1995-09-11 RU RU97105821/13A patent/RU2186110C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-09-11 AU AU35657/95A patent/AU701643B2/en not_active Ceased
- 1995-09-11 US US08/793,294 patent/US5882887A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-11 CA CA002199719A patent/CA2199719A1/en not_active Abandoned
- 1995-09-11 NZ NZ293261A patent/NZ293261A/en unknown
- 1995-09-11 SK SK292-97A patent/SK29297A3/sk unknown
- 1995-09-11 CZ CZ97762A patent/CZ76297A3/cs unknown
- 1995-09-11 BR BR9508910A patent/BR9508910A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-09-11 SI SI9520093A patent/SI9520093A/sl unknown
- 1995-09-11 JP JP8509898A patent/JPH10505502A/ja not_active Ceased
- 1995-09-11 MX MX9701720A patent/MX9701720A/es unknown
- 1995-09-11 WO PCT/EP1995/003573 patent/WO1996008563A1/en not_active Ceased
- 1995-09-11 CN CN95195002A patent/CN1075836C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-11 HU HU9701823A patent/HU222398B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-09-11 PL PL95319078A patent/PL184617B1/pl unknown
- 1995-09-11 EP EP95932714A patent/EP0781334A1/en not_active Withdrawn
- 1995-09-12 ZA ZA957649A patent/ZA957649B/xx unknown
- 1995-09-12 IL IL11527295A patent/IL115272A0/xx unknown
-
1997
- 1997-02-12 BG BG101226A patent/BG63276B1/bg unknown
- 1997-03-11 FI FI971013A patent/FI971013A7/fi unknown
- 1997-03-11 NO NO971110A patent/NO971110L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU222398B1 (hu) | 2003-06-28 |
| ZA957649B (en) | 1996-04-15 |
| NZ293261A (en) | 1998-11-25 |
| CA2199719A1 (en) | 1996-03-21 |
| BG101226A (bg) | 1998-10-30 |
| SI9520093A (en) | 1997-08-31 |
| CN1075836C (zh) | 2001-12-05 |
| NO971110D0 (no) | 1997-03-11 |
| RU2186110C2 (ru) | 2002-07-27 |
| WO1996008563A1 (en) | 1996-03-21 |
| CN1159828A (zh) | 1997-09-17 |
| EP0781334A1 (en) | 1997-07-02 |
| PL184617B1 (pl) | 2002-11-29 |
| PL319078A1 (en) | 1997-07-21 |
| MX9701720A (es) | 1997-06-28 |
| SK29297A3 (en) | 1997-10-08 |
| NO971110L (no) | 1997-05-07 |
| AU701643B2 (en) | 1999-02-04 |
| HUT76972A (hu) | 1998-01-28 |
| AU3565795A (en) | 1996-03-29 |
| CZ76297A3 (cs) | 1998-01-14 |
| IL115272A0 (en) | 1995-12-31 |
| US5882887A (en) | 1999-03-16 |
| FI971013A0 (fi) | 1997-03-11 |
| FI971013A7 (fi) | 1997-03-11 |
| JPH10505502A (ja) | 1998-06-02 |
| BG63276B1 (bg) | 2001-08-31 |
| BR9508910A (pt) | 1997-10-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ehlers et al. | Spontaneous solubilization of membrane-bound human testis angiotensin-converting enzyme expressed in Chinese hamster ovary cells. | |
| US5726147A (en) | Human mutant tissue factor compositions useful as tissue factor antagonists | |
| JP3051995B2 (ja) | 酸化抵抗性トロンボモジュリン類縁体 | |
| US5256766A (en) | Recombinant thrombin receptor and related pharmaceuticals | |
| CZ305602B6 (cs) | Polypeptidická proteáza štěpící von Willebrandův faktor (vWF), nukleová kyselina kódující tento polypeptid a použití tohoto polypeptidu | |
| JP2989853B2 (ja) | ポリペプチド、その製造方法、ｄｎａ塩基配列及び形質転換細胞宿主 | |
| CZ384896A3 (en) | NOVEL MUTANT PROTEINS hIL-4 AS ANTAGONISTS OR PARTIAL ANTAGONISTS OF HUMAN INTERLEUKIN 4 | |
| KR20110114587A (ko) | 세린 프로테아제 유도체 및 혈액응고 장애의 치료 또는 예방의 용도 | |
| EP0538459A1 (en) | Phospholipid-targeted thrombolytic agents | |
| US5935815A (en) | Process for micro biological production of proteins | |
| US5882887A (en) | Process for manufacture of a modified collagen-induced platelet aggregation inhibitor pallidipin | |
| KR100232683B1 (ko) | 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집 억제제 | |
| MXPA97001720A (en) | Process for the manufacture of a modified palidipine, inhibitor of platelet aggregation induced by colag | |
| AU711586B2 (en) | Mocarhagin, a cobra venom protease, and therapeutic uses thereof | |
| JPH04503761A (ja) | Ｐａｉ―２の変異体 | |
| US5663142A (en) | Protein S deletion variants deficient in C4BP binding activity, but having APC cofactor activity, compositions and therapeutic methods | |
| US11072643B2 (en) | Fusion protein | |
| WO1995009913A1 (en) | Human monocyte/macrophage derived metalloproteinase inhibitor | |
| WO1995009913A9 (en) | Human monocyte/macrophage derived metalloproteinase inhibitor | |
| KR100458362B1 (ko) | 한국산 칠점사로부터 유래된 단백질 및 그의 제조방법 | |
| Przysiecki et al. | Characterization of recombinant antistasin secreted by Saccharomyces cerevisiae | |
| US20090170760A1 (en) | Anti-Cancer Agent Comprising Protein C Inhibitor | |
| AU2002366874A1 (en) | Modified tridegins, production and use thereof as transglutaminase inhibitors |