PL200384B1 - Polipeptyd blokujący adhezję płytek krwi, sposób jego otrzymywania, zastosowanie i zawierający go preparat farmaceutyczny - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest naturalnie wyst epuj ace bia lko, wyizolowane ze sliny pijawki lekar- skiej Hirudo medicinalis. Wiaze si e ono silnie z kolagenem, przez co dzia la jako inhibitor naturalnej adhezji p lytek krwi do kolagenu. Bia lko posiada ciezar cz asteczkowy oko lo 12000, punkt izoelektrycz- ny w zakresie kwa snym oraz zawiera szesc cystein. Bia lko to zosta lo zsekwencjonowane. Gen klono- wano z biblioteki cDNA H.medicinalis. Ujawniono procedury otrzymywania takich polipeptydów techni- kami rekombinacyjnymi. Rekombinowane i naturalnie wyst epuj ace bia lka s a silnymi inhibitorami za- le znego od kolagenu wi azania p lytek krwi, tak wi ec s a przydatne w terapii ró znych stanów zwi azanych z ciezkimi chorobami oraz chorobami uk ladu kr azenia. Ponadto bia lko mo ze by c stosowane do po- krywania naturalnych lub sztucznych powierzchni kolagenowych celem uczynienia ich nieadhezyjnymi wzgl edem komórek oraz zapobiegania aktywacji komórek. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest naturalnie występujący polipeptyd, który wyizolowano ze śliny pijawki lekarskiej Hirudo medicinalis. Wiąże się on silnie z kolagenem, przez co działa jako inhibitor o

naturalnej adhezji płytek krwi do kolagenu. Polipeptyd ma ciężar cząsteczkowy około 12 000 · 10 u, punkt izoelektryczny w zakresie kwaśnym oraz zawiera sześć cystein. Zostało on zsekwencjonowany. Gen klonowano z biblioteki cDNA Hirudo medicinalis. Ujawniono procedury otrzymywania takich polipeptydów technikami rekombinacyjnymi. Rekombinowane i naturalnie występujące polipeptydy są silnymi inhibitorami zależnego od kolagenu wiązania płytek krwi, tak więc, są przydatne w terapii różnych stanów związanych z ciężkimi chorobami oraz chorobami układu krążenia. Ponadto, polipeptyd może być stosowany do pokrywania sztucznych powierzchni kolagenowych celem uczynienia ich nieadhezyjnymi względem komórek oraz zapobiegania aktywacji komórek.

W procesie hemostazy lub krzepnięcia, płytki krwi przywierają do macierzy pozakomórkowej uszkodzonego naczynia, pokrywając uszkodzony obszar. Możliwość zapobiegania temu istotnemu etapowi wstępnemu w stanach patogenezy krzepnięcia oraz zamykania tętnicy powinna mieć istotne znaczenie terapeutyczne w prewencji chorób zakrzepowych.

Uważa się, że kolagen jest komponentem powierzchniowym o najwyższej tendencji do tworzenia zakrzepów. Wykazano, że jest on silnym stymulatorem adhezji płytek krwi, agregacji oraz uwalniania ich granuli, co prowadzi do angażowania (Ruggeri ZM et al., Seminars in Hematology, 1994, 31, 229-39) w wymienionym regionie dodatkowych płytek krwi, które tworzą agregaty lub skrzepliny. W początkowym kontakcie płytek krwi z powierzchnią naczynia uczestniczy, wiązany przez kolagen, czynnik von Willebrandta (vWF) oraz specyficzny receptor vWF na płytkach krwi - kompleks glikoproteiny lb-V-IX. Ponadto, ADP, epinefryna oraz czynniki krzepnięcia w układzie krążenia prowadzą do dalszego procesu aktywacji płytek, zaś równocześnie wzrost aktywności trombiny sprzyja tworzeniu się usieciowanych skrzepów fibrynowych. Agregacje płytka-płytka wzmagają ten proces, którego główną siłą napędową stanowi fibrynogen pośredniczący w łączeniu komórek poprzez receptory glikoproteiny llb/llla.

Ta normalna reakcja fizjologiczna ma istotne znaczenie w przebiegu procesów patologicznych, gdzie płytki krwi przywierają do kolagenu eksponowanego w przypadkach sklerotycznych zmian chorobowych (Van der Rest M. et al.; FASEB Journal, 1991, 5, 2814-23), rozpoczynając zamykanie naczyń krwionośnych. W zależności od ulokowania oraz rozmiaru okluzji wynikiem procesu, mogą być poważne komplikacje, takie jak: zawał mięśnia sercowego, udar, zapalenie lub zator tętnicy płucnej.

Heparyna jest najszerzej znanym obecnie środkiem o bezpośrednim działaniu przeciwzakrzepowym, który blokuje aktywność trombiny, przez co zapobiega tworzeniu zakrzepów bogatych w fibrynę. W interwencjach przeciwzakrzepowych jest to najczęściej obecnie używany lek. Heparynę szeroko używa się przy wskazaniach, takich jak, niestabilna dusznica bolesna, oraz ostry zawał mięśnia sercowego. Jednak pomimo jej szerokiego zastosowania wciąż nie zostało rozwiązanych kilka istotnych problemów. Są to konieczność stosowania dożylnego, konieczność obecności kofaktora, którym jest przeciwtrombina-lll, obniżone powinowactwo względem trombiny związanej w skrzepie, inaktywacja przez kilka białek surowicy, okazjonalna indukcja małopłytkowatości oraz jej biologiczna heterogeniczność. Konsekwencją tego jest fakt, że dotychczas kliniczne zastosowanie heparyny nie jest zbyt szerokie.

Pomimo ostatnich osiągnięć w zakresie heparyny o niskiej masie cząsteczkowej, które pozwoliły na opracowanie odmiany do aplikacji podskórnych, jej terapeutyczne zalety w porównaniu do standardowej heparyny są raczej umiarkowane. Niestety, te same problemy dotyczą innych substancji przeciwtrombinowych o bezpośrednim działaniu, jak np. hirudyna, hirulog i warfarin. Okazało się, że jednym z głównych problemów jest najprawdopodobniej wzmożona produkcja trombiny w warunkach podawania środków przeciwzakrzepowych (Rao, AK, et al., Circulation, 1996, 94, 389-2395).

Inne, ostatnio opracowane strategie koncentrują się więc na wymuszanym przez czynnik Xa procesie aktywacji protrombiny. Zaprojektowanie odpowiednich inhibitorów, których celem jest ten czynnik wciąż pozostaje wielkim wyzwaniem. Podsumowując, można stwierdzić, że omawiany typ interwencji terapeutycznej nie został opanowany w wystarczającym zakresie.

Inny zestaw terapeutyków prezentowany jest przez interwencje związane z rozpuszczaniem skrzeplin. Ten typ leczenia koncentruje się na badaniach stafylokinazy, streptokinazy, aktywatora plazminogenu typu urokinazy, aktywatora plazminogenu typu tkankowego oraz kompleksu anizolowanego plazminogenu ze streptokinazą. Różnica w czasie koniecznym do spowodowania reperfuzji znaczPL 200 384 B1 nie różni się dla każdego z wymienionych środków rozpuszczających skrzepliny (trombolitycznych). Jednak dane charakteryzujące całkowity spadek śmiertelności są takie same dla wszystkich wymienionych środków. Ponadto, częstymi komplikacjami jest ponowne zamykanie tętnicy lub krwawienie. Efekt ten wywołany może być stosunkowo niską specyficznością w stosunku do fibryny oraz krótkim czasie półtrwania tych związków w surowicy. Obecnie, w celu rozwiązania tych problemów terapii trombolitycznej, bada się różne sposoby postępowania w przypadku różnych aplikacji oraz kombinacje różnych formuł fibrynolitycznych. Osiągnięcia, których oczekuje się są jednak raczej umiarkowane.

Ostatnio, pojawiła się nowa grupa pacjentów, u których wskutek angioplastyki, aterektomii, transplantacji naczyń lub stentu ścian naczyniowych obserwuje się problemy takie jak ostre przypadki zakrzepowego zamykania tętnicy oraz późne nawroty zwężenia. Możliwe interwencje terapeutyczne obejmują podanie środków przeciw-płytkom krwi, środków przeciw zakrzepowych lub też strategie rozpuszczania zakrzepów. Różne inne środki, takie jak: tiklopidyna, działają jako antagoniści ADP lub jonoforu wapnia A-23187. Szczególnie bezpośredni wpływ na funkcję płytek krwi ma aspiryna, którą zaleca się stosować w celu zapobiegania lub minimalizacji agregacji płytek krwi. Nowa substancja adhezyjna przeciw-płytkom krwi według wynalazku może także pomóc pokonać wymienione komplikacje kliniczne w przypadku zastosowania podczas zabiegu chirurgicznego.

Inna komplikacja związana z omawianym tematem dotyczy przypadku kontaktu krwi ze sztuczną powierzchnią, kiedy to występuje wzmożona tendencja indukowania przebiegu procesów krzepnięcia poprzez aktywację płytek krwi i/lub indukcję koagulacji. Efekty te spowodować mogą uszkodzenie przeszczepów naczyniowych, zastawek serca, stentów, cewników lub innych urządzeń lub materiałów pozostających w kontakcie z krwią. Zdolność polipeptydu ujawnionego w niniejszym opisie do tworzenia powierzchni, na których nie przebiegają procesy krzepnięcia może więc zostać wykorzystana poprzez immobilizację tego polipeptydu na opisanych powyżej materiałach i urządzeniach. Tego typu obróbka umożliwia otrzymanie wymienionych materiałów lub urządzeń, które cechuje biokompatybilność oraz odporność w stosunku do procesów krzepnięcia.

Tak więc, ze względu na ograniczenia związane z dostępnością środków przeciwzakrzepowych, wciąż konieczne jest opracowanie w tym zakresie nowych strategii oraz terapeutyków.

Omawiane w niniejszym opisie strategie, które ingerują bezpośrednio w adhezję płytek krwi indukowaną przez kolagen i/lub czynnik vWF, dostarczają potencjalnych możliwości przyszłych udoskonaleń w leczeniu schorzeń naczyniowo-sercowych.

Kilka nowych inhibitorów, które zapobiegają adhezji płytek krwi, stanowią monoklonalne przeciwciała których celem jest czynnik vWF. Sugeruje się także, że skuteczne w hamowaniu adhezji płytek krwi mogą być inhibitory glikoproteiny llb/llla.

Niektóre z tych inhibitorów, jak monoklonalne Ab c7E3, zostały już przebadane klinicznie. Inne, jak inhibitory KGD oraz RGDF, ciągle znajdują się w fazie badań. Jednakże specyficzność większości tych inhibitorów nie została zbadana w wystarczającym zakresie i możliwe spektrum efektów ubocznych, które mogą być indukowane przez wymienione inhibitory ciągle nie zostało jeszcze poznane i zasługuje na szczegółowe badania.

Bogatym źródłem dla skriningu nowych związków, które ingerują w adhezję płytek krwi indukowaną kolagenem, są występujące w przyrodzie zwierzęta ssące krew. W literaturze opisano kilka inhibitorów wyizolowanych z preparatów naturalnych: białko o masie 65 kDa nazwane calina (calin) wyizolowano z Hirudo medicinalis (opis patentowy US 5 587 360, WO 92/07005) (Munro R., et al. Blood coagulation and Fibrynolysis, 1991, 2, 179-184) oraz białko o masie 16 kDa (LAPP) wyizolowane z gruczołów ślinowych pijawki Haementeria officinalis (opis USA 5 324 715). Oba białka opisane zostały jako inhibitory agregacji podczas statycznych badań kolagenozależnej agregacji płytek krwi.

Pomimo dowiedzionej aktywności in vitro, LAPP okazało się nieaktywne w kilku dobrze udokumentowanych modelach in vivo (Schaeffer LW et al.; Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 1593-1601 oraz Connoly TM et al., thromb. Haemostas., 1993, 69, 589). Miękki kleszcz Ornithodoros moubata także posiada białko działające przeciw płytkom krwi - moubatyna (moubatin), które zapobiega stymulowanej przez kolagen agregacji płytek krwi (Waxman, L. et al., J. Biol. Chem. 1993, 268, 5445-49). Inny inhibitor agregacji płytek krwi z ssącej krew pluskwy ujawniony został przez Noeske-Jungbluta C. Et al. w opisie patentowym WO 9309137. Smith et al. wyizolował białko o masie 50 kDa z jadu węża oraz białko o masie 19 kDa ze śliny ssącej krew pluskwy Triatoma pallidipennis. Jak stwierdzono, białko zawiera czynnik, który specyficznie hamuje indukowaną przez kolagen agregację płytek krwi. Białko o masie 19 kDa, nazwane pallydypiną (pallidipin), hamuje w surowicy agregację płytek krwi, w której pośredniczy kolagen. Nie stwierdzono hamowania agregacji stymulowanej przez inne efektory (ADP,

PL 200 384 B1 trombina, mimetyczny tromboksan A2 U46619, estry forbolu (Merck lndex 12 wyd. 7487)). Pallydypina nie wywiera żadnego wpływu na adhezję płytek krwi do kolagenu, hamuje jednak uwalnianie z płytek krwi ATP. Odwracalnie oddziaływuje z płytkami krwi, przy czym cel oddziaływania na płytkach krwi może być ten sam co w wypadku kolagenu. Precyzyjny mechanizm działania oraz korzyści terapeutyczne działania tego białka znajdują się aktualnie w fazie badań. Gan et al. opisali echistatynę (echistatin) jako inhibitor wiązania do receptora fibrynogenu GP lla/lllb (J. Biol. Chem. 1988, 263, 19827-32).

Pomimo tych porywających postępów ciągle występuje potrzeba opracowania nowych antykoagulantów oraz substancji przeciw trombinowych o zwiększonej efektywności hamowania narastania skrzepów, aktywacji płytek indukowanej czynnikiem vWF lub aktywacji komórek śródbłonka, które mogłyby być używane w farmaceutyce a jednocześnie możliwe byłoby ich otrzymywanie w ilościach koniecznych do komercjalizacji.

Ponieważ żadne z opisanych dotychczas białek nie zostało dotychczas opracowane w postaci związku o idealnym profilu terapeutycznym, autorzy niniejszego wynalazku, korzystając z nowej strategii skriningowej, postanowili opracować nowe bardziej odpowiednie białko tego typu.

Wynalazek ujawnia wyizolowany z H. meddicinalis inhibitor, który ingeruje bezpośrednio w oddziaływanie kolagen-płytka krwi, w wyniku czego hamuje aktywację płytki krwi oraz wczesne wzajemne oddziaływanie płytka krwi-płytka krwi.

Dotychczas w literaturze nie podano pozytywnego przykładu, który wskazywałby, że używając strategii skriningu, który wyklucza inhibitory agregacji oraz białka lityczne ze źródła jakim są naturalnie występujące związki można zidentyfikować nowe związki lub mechanizmy anty-adhezyjne. Pomimo tego, w wynalazku zastosowano tę właśnie strategię. Ponieważ wiadomo, że co najmniej sześć różnych powierzchniowych glikoprotein płytek krwi zaangażowanych jest w adhezję kolagenu a ponadto udowodniono, że kilka związków wywodzących się z płytek krwi, takich jakich jak, czynnik von Willebrtanda, fibronektyna i trombospondyna pośrednio uczestniczy w adhezji kolagen - płytka krwi, szansa identyfikacji nowych inhibitorów adhezji nie była duża.

Pomimo tego, kierując się faktem, że nie można wykluczyć wszystkich opisanych oraz nieopisanych inhibitorów skorelowanych z czynnikiem vWF oraz związków działających bezpośrednio na receptory płytek krwi, omawianą strategię zastosowano do skriningu śliny Hirudo medicinalis. Wyniki badań niespodziewanie doprowadziły do nowego polipeptydu o działaniu przeciwadhezyjnym względem płytek, któremu nadano nazwę saratyna (saratin). Peptyd ten można wyodrębnić z tkanek i wydzielin dobrze zbadanej i opisanej pijawki gatunku Hirudo medicinalis.

Istotą wynalazku jest aktywny polipeptyd (saratyna), wyizolowany z pijawki Hirudo medicinalis. Polipeptyd wyodrębniono ze śliny, stosując kombinację dializy ciśnieniowej oraz co najmniej jednego etapu chromatograficznego. takiego jak chromatografia z anionowym wymieniaczem jonowym oraz co najmniej jednego etapu wysokosprawnej chromatografii z odwróconymi fazami (RP-HPLC). Etap dializy ciśnieniowej okazał się być absolutnie krytyczny dla uzyskania saratyny ze śliny, ponieważ wysokie stężenie śliny pomaga uniknąć strat bioaktywnej saratyny, które w innych wypadkach są znaczące. Wyizolowana saratyna silnie wiąże się z kilkoma kolagenami oraz blokuje, w sposób zależny od dawki, adhezję płytek krwi na powierzchniach pokrytych takim kolagenem.

W celu optymalizacji kaskady skriningowej zmodyfikowano obecnie dostępne techniki tak, by możliwe było rozróżnienie adhezji płytek krwi oraz agregacji płytek krwi: zdolność płytek krwi do przepływu opóźnionego lub przepływu z zatrzymaniem (stop flow) przez włókna, udział płytek krwi w tworzeniu skrzepu in vitro, adhezja do złoża szklanego, lub przepływ pełnej krwi przez filtr i adhezja płytek krwi z bogatej w płytki krwi antykoagulowanej surowicy do filtrów zbudowanych z włókien szklanych lub kolagenu w warunkach regulowanego gradientu ciśnienia.

Polipeptyd (nazwany saratyną) charakteryzuje się sekwencją aminokwasów opisaną jako SEQ. ID. NO. 2, która obejmuje 103 aminokwasy, co teoretycznie daje względną masę cząsteczkową około 12068 daltonów ± 1 kDa. Saratyna wykazuje unikalną strukturę pierwszorzędową o braku podobieństwa do jakiejkolwiek z opisanych wcześniej sekwencji. Jest ona bogata jest w kwas asparaginowy oraz kwas glutaminowy, których wpływ uwidacznia się w niskiej wartości punktu izoelektrycznego cząsteczki, który wynosi pH 3,7 ± 0,5 (pomiar IEF-PAGE).

Analiza SDS-PAGE wykazuje silne przesunięcie pasma polipeptydu podczas elektroforezy w wypadku redukcji przeprowadzonej przed elektroforezą, co wskazuje na modyfikacje potranslacyjne. Sekwencjonowanie polipeptydu ujawnia sześć cząsteczek cysteiny, które mogą wnosić wkład w modyfikacje potranslacyjne białka. Spektrometria masowa saratyny (technika elektrospray) pozwala

PL 200 384 B1 na wyznaczenie jej rzeczywistej masy cząsteczkowej, która wynosi 12061, co wskazuje, że w tworzeniu drugorzędowej struktury natywnego białka uczestniczy do trzech wiązań disulfidowych.

Inhibitor adhezji według wynalazku nie został dotąd opisany, na co wskazuje fakt, że różni się on od znanych inhibitorów agregacji wyizolowanych z pijawek, w szczególności różni się on od caliny (Calin) oraz LAPP pod względem ciężaru cząsteczkowego, punktu izoelektrycznego oraz sekwencji aminokwasów oraz aktywności biologicznej.

Istotą wynalazku jest także wyodrębniony DNA, zawierający polinukleotyd kodujący, wywodzący się od pijawki, inhibitor adhezji płytek krwi, który ma sekwencję aminokwasów zdefiniowaną dla wymienionego polipeptydu. Sekwencja nukleotydu reprezentująca klon cDNA przedstawiona została jako SEQ. ID. NO. 1. Pozycje 1-63 sekwencji nukleotydu reprezentują podstawową wiodącą sekwencję 21 aminokwasów; pozycje 64-372 obejmują otwartą ramkę odczytu kodującą polipeptyd o 103 resztach aminokwasowych o sekwencji aminokwasów jak pokazano dla dojrzałego białka w postaci SEQ. ID. NO. 2.

Istotą wynalazku jest także rekombinowany wektor, który zawiera syntetyczny gen kodujący, wywodzący się od pijawki, inhibitor adhezji płytek krwi oraz komórkę gospodarza, zawierającą wymieniony rekombinowany wektor. Metody otrzymywania i wyodrębniania białek ulegających ekspresji opierają się na technikach etykietowania (ang. lag technologies) lub tez zostały adaptowane ze schematów opracowanych dla saratyny występującej naturalnie. W zależności od konkretnego protokołu doświadczenia używanego dla ekspresji pozakomórkowej lub wewnątrzkomórkowej komórek drożdży, komórek insektów, komórek nerek dziecięcych chomików oraz komórek E. Coli, które transformuje się odpowiednimi wektorami posługując się znanymi technikami, należy zaadaptować etapy wyodrębniania rekombinowanego białka z supernatantów lub sedymentów. Dobrą ekspresję stwierdzono u E. coli używanej jako komórki gospodarza, gdzie włączano ekspresję periplazmatyczną poprzez insercję wiodącej sekwencji pelB. Wyodrębnianie produktów z Escherichia coli (E. coli) (ok. 5 mg/l) przeprowadzano, stosując osmolizę oraz wirowanie. W równoległym eksperymencie stosowano Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (> 10 mg/l bulionu hodowlanego) z wektorem zaadaptowanym z alternatywnych drożdży. Wydzielony materiał izolowano przez wirowanie. Oczyszczanie przeprowadzano metodą filtracji z przepływem krzyżowym oraz chromatografii z wymieniaczem jonowym. W innych układach ekspresyjnych z zastosowaniem komórek COS lub CHO ilość ulegającego ekspresji produktu wynosiła około 750 ng/ml. Analiza elektroforetyczna i chromatograficzna potwierdza, że oczyszczony rekombinowany materiał był czysty i homogeniczny oraz, że był on identyczny z saratyną wywodzącą się ze śliny, czego dowodzi sekwencjonowanie aminokwasów oraz oznaczenie masy cząsteczkowej.

Istotą wynalazku są także sposoby otrzymywania aktywnego polipeptydu z czystej śliny pijawki oraz pomiaru aktywności względem płytek krwi metodami oznaczeń statycznych i dynamicznych oraz zastosowanie tych sposobów w celu wyodrębniania rekombinowanego polipeptydu.

Techniki otrzymywania saratyny opisano w przykładach 6, 7, 8 i 13. Jednakże metody ekspresji, których można używać nie ograniczają się do wymienionych w przykładów. W celu ekspresji saratyny używać można na przykład transgenicznych myszy lub innych organizmów w tym także ssaków.

Polipeptydy według wynalazku obejmują warianty, które zachowują aktywność ujawnianych sekwencji, w tym fragmentów i podjednostek, wariantów występujących naturalnie, wariantów alleli, losowo generowanych sztucznych mutantów oraz wariantów sekwencji otrzymywanych w sposób zamierzony np. przez addycję, które prowadzą do zachowania aktywności. Termin „fragment” lub „podjednostka” odnosi się do dowolnej części sekwencji, która zawiera mniej aminokwasów niż pełna sekwencja polipeptydu np. cząstkowa sekwencja z wykluczeniem części N- i/lub C-terminalnej pełnego polipeptydu.

Ponadto, wynalazek obejmuje także białka hybrydowe takie jak białka fuzyjne lub białka, które otrzymuje się w wyniku ekspresji w wektorze ekspresji genów wielokrotnych, oraz posiadający specyficzną aktywność ujawnianego białka polipeptyd, który połączony jest z drugim polipeptydem za pomocą wiązania peptydowego. Uwzględnia się przy tym wyraźnie inne warianty białek według wynalazku, szczególnie warianty, które różnią się od wyodrębnionego białka jedynie ze względu na podstawienie aminokwasów w zakresie zachowawczym. Tego typu podstawienie aminokwasów w zakresie zachowawczym zdefiniowane zostało przez Taylora et al. J. Mol. Biol. 1986, 188, 233.

Wynalazek obejmuje także metody zastosowania saratyny w celu zapobiegania lub opóźniania aktywacji przez hamowanie oddziaływań między kolagenem a płytkami krwi. Wymienione białko stosowane może być w prewencji, profilaktyce, terapii oraz lecznictwie chorób zakrzepowych. Inaczej niż wszystkie poprzednio opisane białka, które oddziaływają z różnymi białkami powierzchniowymi na

PL 200 384 B1 płytkach krwi, polipeptyd według wynalazku posiada unikalny mechanizm działania. Wiąże się on ściśle z powierzchnią kolagenu, a jeden mechanizm działania polega na pokrywaniu specyficznych miejsc kolagenu, które w wyniku tego procesu stają się niedostępne dla oddziaływań z płytkami krwi oraz wiązania płytek krwi. Istotna zaleta tego typu nowego mechanizmu sprowadza się do tego, że płytki krwi podczas stosowania tego polipeptydu nie ulegają zmianom funkcjonalnym, czego wynikiem jest fakt, że w wyniku leczenia nie powinno obserwować się tendencji do krwawienia.

Innym, ważnym obszarem zastosowania jest działanie saratyny na różne powierzchnie w celu uczynienia ich nieadhezyjnymi w stosunku do płytek krwi, przez co otrzymuje się urządzenia kompatybilne względem krwi.

Jak zauważono powyżej, polipeptydy według wynalazku mogą być stosowane w farmaceutyce w postaci kompozycji i kombinacji farmaceutycznych.

Preparaty farmaceutyczne według wynalazku opcjonalnie mogą obejmować dodatkowe składniki aktywne jak aspirynę, anty-koagulanty, takie jak, hirudyna lub heparyna lub środki rozpuszczające skrzepimy, takie jak, aktywator plazminogenu lub streptokinazę.

Nowy polipeptyd według wynalazku, z dowolnym nietoksycznym, organicznym lub nieorganicznym kwasem, tworzyć może sól, która stosowana może być w farmaceutyce. Takimi kwasami są na przykład: kwas solny, bromowodorowy, siarkowy lub fosforowy oraz sole metali takie jak jednowodorofosforan sodowy oraz wodorosiarczan potasowy. Przykładami kwasów organicznych są kwasy karboksylowe mono, di i trikarboksylowe, takie jak: kwas octowy, glikolowy, mlekowy, pirogronowy, malonowy, bursztynowy, glutarowy, fumarowy, jabłkowy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, maleinowy, hydroksymaleinowy, benzoesowy, hydroksybenzoesowy, fenylooctowy, cynamonowy, salicylowy oraz kwasy sulfonowe takie jak kwas metanosulfonowy. Sole terminalnej grupy karboksylowej aminokwasu obejmują nietoksyczne sole kwasów karboksylowych tworzone z odpowiednimi zasadami nieorganicznymi lub organicznymi. Solami takimi są na przykład: sole metali alkalicznych, takich jak sód i potas, sole metali ziem alkalicznych, takie jak, wapń i magnez, lekkie metale grupy IIIA w tym glinu, oraz sole organicznych amin pierwszo-, drugo- i trzeciorzędowych, takich jak: trialkiloamin w tym trietyloamina, prokaina, dibenzyloamina, 1-etenoamina, N,N'-dibenzyloetylenodiamina, dihydroabietyloamina oraz N-alkilopiperydyna.

Termin „nośnik, który może być używany w farmaceutyce” oznacza niereaktywny, nie toksyczny stały lub płynny wypełniacz, rozpuszczalnik lub materiał do wytworzenia kapsułek, który nie wchodzi w reakcje ze związkiem aktywnym lub organizmem pacjenta. Odpowiednie, korzystne nośniki są dobrze znane i opisane znanym stanem techniki. Są to sterylna woda, solanka, wodny roztwór dekstrozy, roztwory cukru, etanol, glikole i oleje, w tym oleje z ropy naftowej, oleje roślinne i zwierzęce, oleje syntetyczne na przykład olej z orzeszków ziemnych, olej sojowy i olej mineralny.

Preparaty według wynalazku mogą być aplikowane jako dawki jednostkowe, zawierające typowe nietoksyczne nośniki, rozcieńczalniki, środki wspomagające i zaróbki, które mogą być stosowane w farmaceutyce i są typowe dla zastosowań pozajelitowych.

Termin „pozajelitowe” oznacza w tym wypadku iniekcję podskórną, dotchawiczą, iniekcję do stawu, oraz techniki infuzyjne. Odpowiednie są także inne aplikacje, takie jak, aplikacja doustna oraz miejscowa. Kompozycje pozajelitowe najkorzystniej podawane są dożylnie albo w postaci jednej dawki leku lub jako ciągła infuzja, przy czym stosujecie znane procedury.

Tabletki i kapsułki do aplikacji doustnych zawierają typowe zaróbki takie jak środki wiążące, wypełniacze, rozcieńczalniki, środki ułatwiające formowanie tabletek, środki smarujące, środki rozdrabniające oraz zwilżające. Tabletki mogą być powlekane przy zastosowaniu metod, które są opisane znanym stanem techniki.

Płynne preparaty do stosowania doustnego mogą występować w postaci wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, syropów lub eliksirów lub mogą być aplikowane w formie suchego produktu, który przed zastosowaniem zarabia się wodą lub inną odpowiednią zaróbką. Tego typu płynne preparaty mogą zawierać typowe dodatki jak środki do otrzymywania zawiesin, emulgatory, nie-wodne zaróbki oraz środki konserwujące.

Aplikacje do zastosowań miejscowych występować mogą w postaci wodnych lub olejowych zawiesin, roztworów, emulsji, żelów lub korzystnie maści emulsyjnych.

Jednostkowe dawki według wynalazku mogą obejmować całą dzienną dawkę polipeptydu według wynalazku lub też mniejsze dawki, które w sumie składają się na konieczną dawkę. Optymalne terapeutycznie dopuszczalne dawkowanie oraz szybkość dawkowania dla określonych pacjentów (ssaków w tym ludzi) zależy jednak od różnych czynników, takich jak: aktywności konkretnie używaPL 200 384 B1 nego związku, od wieku, masy ciała, ogólnego stanu zdrowia, płci, diety, czasu i sposobu podania, szybkości wydalania, aktywności enzymatycznej (jednostek/mg białka), rodzaju stosowanego leczenia, tzn. terapii lub profilaktyki oraz charakteru choroby zakrzepowej, która podlega terapii, aktywności względem płytek krwi lub aktywności przeciwkoagulacyjnej.

l tak, stosowana u leczonych pacjentów (in vivo), farmaceutycznie efektywna dawka polipeptydu dzienna według wynalazku, w postaci preparatów oraz kombinacji o działaniu przeciwzakrzepowym zawiera się między około 0,01 oraz 100 mg/kg masy ciała (w stosunku do specyficznej aktywności 100 kU/mg), korzystnie między 0,1 a 10 mg/kg masy ciała. W zależności od formy aplikacji pojedyncza dawka zawierać może między 0,5 a 10 mg inhibitora trombiny. Farmakologicznie efektywna ilość peptydu według wynalazku, pozwalająca na osiągnięcia efektu przeciwkoagulacyjnego we krwi pozaustrojowej, zawiera się w granicach między 0,2 a 150 mg/l, korzystnie między 1 a 20 mg/l krwi pozaustrojowej.

Istotą wynalazku jest także, przeznaczone do zastosowania w kontakcie z płynami ustrojowymi, pozaustrojowe urządzenie medyczne lub urządzenie medyczne do implantacji, którego powierzchnię pokrywa się, w warunkach ex vivo, immobilizowanym polipeptydem w celu uzyskania powierzchni na których nie przebiegają procesy krzepnięcia, jak zdefiniowano powyżej oraz zastrzeżono. Polipeptyd według wynalazku immobilizuje się na urządzeniu medycznym w taki sposób, aby jego powierzchnię uczynić biokompatybilną oraz oporną względem krzepnięcia. Tego typu aplikacje wykazują właściwości powierzchniowe, które w typowym wypadku wywołują agregację płytek krwi. Efekt ten jest niekorzystny w aspekcie ich przewidywanego zastosowania w urządzeniach pozaustrojowych oraz urządzeniach implantacji, pozostających w kontakcie z krwią lub innymi płynami ustrojowymi. Przykładami takich urządzeń, które zwykle wykonane są z tworzyw sztucznych, syntetycznych włókien, są: protezy, sztuczne organy, soczewki oczne, szwy, sztuczne fragmenty naczyń, cewniki, dializatory, probówki oraz naczynia do przenoszenia krwi.

Tylne matowienie torebki soczewki (posterior capsule opacification - PCO) jest typową komplikacją usunięcia zaćmy, która występuje pomimo zastosowania współczesnych technik chirurgicznych oraz nowoczesnych soczewek. PCO wywoływane jest przez rozrost oraz migrację komórek śródbłonka soczewki wzdłuż tyłu torebki soczewki, co prowadzi do ograniczenia ostrości widzenia. W celu ograniczenia PCO proponowano działanie bodźcami fizycznymi jak również zastosowanie soczewek chemicznie modyfikowanych. W celu ograniczenia PCO stosowano także pokrywanie soczewek heparyną oraz krople heparynowe do miejscowego stosowania, co wskazuje, że w tworzeniu PCO uczestniczą mechanizmy zakrzepowe.

Wykazano, że w aspekcie przeciwdziałania tworzeniu się zakrzepów, saratyna w stosunku do heparyny posiada istotną zaletę. Tak więc, inną istotą wynalazku jest zastosowanie saratyny do pokrywania sztucznych powierzchni, dzięki czemu obniża się podatność na krzepliwość soczewkowego materiału używanego w refraktywnym przodzie lub tylnej komorze implantów soczewkowych, które implantuje się do oka chirurgicznie. To zastosowanie rozwiązuje problem stymulowanego wzrostu komórek. W połączeniu z innymi lekami, które na przykład wywołują śmierć komórki, pokrycie saratyną, w warunkach ex vivo, pomaga całkowicie rozwiązać problem tylnego matowienia torebki soczewki.

W świetle powyższego, istotą wynalazku jest polipeptyd wyizolowany z H. medicinalis, mający ciężar cząsteczkowy około 12000 ± 1 · 10³ u i wykazujący biologiczną aktywność inhibitora kolagenozależnej adhezji płytek krwi, który jest przynajmniej w 80% identyczny do sekwencji aminokwasowej SEQ ID. NO. 2 na całej swej długości, a zwłaszcza polipeptyd mający punkt izoelektryczny przy pH 3.7 ± 0.5 i korzystnie posiadający sześć cząsteczek cysteiny zdolnych do tworzenia mostków -S-S-.

Polipeptyd według wynalazku korzystnie składa się z sekwencji aminokwasowej SEQ ID. NO. 2.

Istotą wynalazku jest również wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd według wynalazku mający sekwencję DNA SEQ ID NO. 2.

Korzystne jest, aby taki polinukleotyd zawierał sekwencję DNA, która jest przynajmniej w 80% identyczna do sekwencji SEQ ID. NO. 2 na całej swej długości.

Istotą wynalazku jest ponadto wektor ekspresji zawierający sekwencję DNA określoną dla opisanego powyżej polinukleotydu.

Istotą wynalazku jest także sposób otrzymywania polipeptydu, który charakteryzuje się tym, że obejmuje etapy hodowli komórki gospodarza w warunkach odpowiednich dla wytwarzania opisanego powyżej polipeptydu i zawierającego komórkę gospodarza zawierającą opisany powyżej wektor ekspresji oraz otrzymywania polipeptydu z supernatanta lub pozostałości komórkowej po hodowli.

PL 200 384 B1

Istotą wynalazku jest także przeciwciało immunospecyficzne wobec polipeptydu wybranego z sekwencji SEQ ID. NO. 2.

Istotą wynalazku jest ponadto preparat farmaceutyczny, zawierający zdefiniowany powyżej polipeptyd oraz dodatkowo, jeżeli stosowne, nośnik lub zaróbkę, które mogą być stosowane w farmaceutyce.

Preparat ten może być korzystnie stosowany do terapii procesów zakrzepowych z zatorami i korzystnie zawierać dodatkowe substancje aktywne wybrane spośród aspiryny, heparyny lub streptokinazy lub ich kombinacji.

Kolejną istotą wynalazku jest zastosowanie opisanego powyżej polipeptydu według wynalazku do otrzymywania leku do terapii chorób związanych z zakrzepami zatorowymi.

Wreszcie, istotą wynalazku są zastosowania polipeptydu według wynalazków, warunkach ex vivo, do pokrywania sztucznych powierzchni w celach medycznych, modyfikowania soczewek doocznych dla obniżenia tendencji tworzenia się zakrzepów na materiale soczewki, kontaktu z powierzchnią soczewek oraz do kowalencyjnego wiązania dla modyfikowania materiału soczewek.

Szczegóły podano w opisie przykładów 1-10 oraz na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia rozdział składników śliny, eluowanie saratyny zaznaczono symbolem „*”, przy czym, fig. 1a przedstawia krzywą rozdziału śliny po wymianie jonowej DEAE, frakcje saratyny zbierano w zakresie piku 3 (przykład 2), fig. 1b przedstawia zebrane frakcje poddane ponownej chromatografii na MONO Q HR5/5, próbki zbierano w zakresie ostatniej części głównego piku - jak pokazuje słupek (przykład 2), fig. 1c przedstawia ostatni etap chromatografii zebranych po MONO Q HR5/5 frakcji zawierających saratynę na semipreparatywnym RP-HPLC, aktywną saratynę uzyskano z zakresu głównego piku (pik 3), fig. 2 przedstawia frakcje SDS-PAGE zbierane po RP-HPLC. Frakcje zawierające saratynę zaznaczono symbolem „*” (Przykłady 2 i 3), fig. 3 przedstawia wektor ekspresji E. coli dla saratyny (przykład 7), fig. 4 przedstawia plazmid bakulodonora coli dla saratyny (przykład 8), fig. 5 przedstawia obraz pełnej krwi na sztucznej powierzchni kolagenowej. Adhezję płytek krwi wizualizowano przez wybarwianie. Jako inhibitor stosowano saratynę (Białko #607) - przykład 9, fig. 6 przedstawia hamowanie adhezji płytek krwi na szkiełkach nakrywkowych, pokrytych kolagenem typu III, w warunkach ścinania, porównanie śliny i saratyny - przykład 9, fig. 7 przedstawia hamowanie adhezji wiązania płytek krwi do szkiełek nakrywkowych, pokrytych kolagenem typu III w warunkach ścinania w zależności od stężenia saratyny - przykład 9, a fig. 8 przedstawia wektor ekspresji drożdży dla saratyny (przykład 13).

P r z y k ł a d 1 Skrining inhibitorów adhezji

Funkcjonalną podstawą skriningu komponentów śliny była adhezja płytek krwi do kolagenu. Ponadto, w celu wykluczenia cech funkcjonalnych, które nie łączą się z inhibitorami adhezji, stosowano dodatkowo cztery dostępne testy do oznaczania różnego działania leków przeciwzakrzepowych, takie jak: test AZOCOLL, test aktywności amidazy, test wiązania zależnego od czynnika vWillebranda oraz test na agregację płytek krwi. Większość tych testów jest standardowymi testami, jedynie test na agregację płytek krwi musiał zostać zmodyfikowany, tak by spełniać wymagania obecnych badań. W skrócie: 96-studzienkowe płytki (Nunc) pokryto kolagenem Horm (Nycomed), stosując zakwaszony kolagen o stężeniu 20 ng/ml i inkubowano przez noc. Po trzykrotnym przemyciu PBS pozostałą powierzchnię płytek zablokowano 1% BSA. Płytki krwi izolowano na świeżo z ludzkiej krwi pobranej na cytrynian i dodawano równocześnie z frakcjami uzyskiwanymi z poszczególnych kolumn. W przypadku kiedy było to konieczne, przeprowadzano preaktywację płytek krwi, inkubując płytki przed użyciem TBS w obecności dwuwartościowych jonów magnezu. W celu porównywania aktywności hamowania, jako standard używano surową ślinę, którą standaryzowano do całkowitego stężenia białka 200 ng/ml. Hamowanie płytek krwi okazało się być wysoce odporne w stosunku zmian bufora oraz zwiększonych stężeń soli. Ponieważ wszystkie próbki poddano obróbce przez chromatografię na wymieniaczu jonowym, bezpośrednie badania frakcji w testach hamowania okazały się skomplikowane i niemiarodajne. Stąd też, wszystkie próbki przed badaniami poddano etapowi zatężania „Centricon”, który równocześnie obniża siłę jonową oraz ustala stężenie.

P r z y k ł a d 2 Oczyszczanie naturalnego inhibitora

Ślina używana w wynalazku pobrana została z H. medicinalis. Zawiera ona jak wiadomo wiele bioaktywnych białek takich jak hirudyna, inhibitory elastazy, kolagenaz oraz inhibitory agregacji płytek krwi, takie jak: calina (Munro, R. Et al.; Blood coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184) oraz LAPP (Schaffer LW. Et al.; Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 1593-1601). Poza tymi opisanymi już białkami, większość z około 80 białek wykrytych metodą SDS-PAGE, to białka dotychczas nieopisane. W celu przeprowadzenia skriningu nowych białek, które uczestniczą bezpośrednio w oddziaływaniach

PL 200 384 B1 płytek krwi z kolagenem stosowano strategię opisaną w przykładzie 1; w wynalazku używano frakcjonowanej śliny.

Krytycznym problemem okazało się wydzielanie inhibitora adhezji z surowej śliny, głównie ze względu na nieodwracalny spadek aktywności hamowania adhezji w pierwszym etapie chromatograficznym. Sytuacji nie polepszał również dodatek 12% etanolu i dwuwartościowych kationów, rekomendowany przez Munro R. et al. Wysokie stężenie soli w ślinie w połączeniu z niskim, całkowitym stężeniem białka (190-250 μΙ/ml) wymagało wstępnego zatężania lub zmiany buforu. Stąd też przetestowano kilka strategii wzbogacania, zatężania lub zmiany buforu. Tradycyjna dializa prowadzi do całkowitego spadku aktywności. Zastosowanie większości innych standardowych technik, takich jak, użycie wymieniaczy jonowych, kolumn powinowactwa, chromatografii typu size exclusion (SEC) (spadek nie zależał od żywicy umieszczonej w kolumnie), również zakończyła się niepowodzeniem, niezależnie od charakteru techniki rozdziału lub używanego buforu i dodatków. Niespodziewanie sukcesem zakończyła się ciśnieniowa dializa 500 ml śliny. Metoda ta pozwoliła zatężyć białka śliny (około 30-40 razy), przy czym równocześnie umożliwiła ona pozbycie się niepożądanych składników buforu. Niespodziewanie, surowa ślina poddana takiemu procesowi okazuje się być idealnym materiałem wyjściowym do dalszego oczyszczania. Otrzymywanie ze śliny bioaktywnych komponentów przeciwadhezyjnych nie jest już więc w takiej sytuacji problemem. Ponieważ zastosowanie wymieniaczy jonowych lub kolumn powinowactwa okazało się być krokiem nieefektywnym, do oczyszczania zastosowano słabe anionowe wymieniacze jonowe, takie jak, DEAE-Fastflow lub EMD-DEAE-Fractogel. Jako dodatek przetestowano 12% etanol oraz kationy dwuwartościowe, jednakże wyniki okazały się niezależne od tych dodatków. Dalsza optymalizacja pozwala wyznaczyć następującą sekwencję procedur: kolumna DEAE, kolumna Mono Q oraz ostatni etap chromatografia z odwróconymi fazami RP18. Optymalizację warunków chromatograficznych przeprowadzono na systemie chromatograficznym BiaCore z zastosowaniem kolumn analitycznych, oferowanych przez firmę Pharmacia. W tabeli 1a, b, c przedstawiono gradienty stosowane w wypadku kolumny DEAE, kolumny Mono Q oraz RP-18. Rozdziały opracowane na BiaCore przeskalowano do większych ilości stosując techniki FPLC. Optymalne warunki przeliczano bezpośrednio do skali semipreparatywnej w oparciu o instrukcję producenta, z wyjątkiem etapu z kolumną RP-18, który prowadzono techniką Biacore, w takim celu by obniżyć straty oczyszczanego materiału. Odzyskiwanie oczyszczonego białka po ostatnim etapie chromatograficznym RP przeprowadzano metodą szybkiego wirowania próżniowego. Próbki z ostatniego etapu RP zbierano i analizowano metodą SDS-PAGE (fig. 2). Następnie, z próbek tych ponownie sporządzano zawiesinę w PBS i przeprowadzano testy analityczne i testy funkcjonalne. Typowa wydajność saratyny w stosunku do nieprzerobionej śliny wynosiła około 750 μg/l.

P r z y k ł a d 3 Charakterystyka biochemiczna

Oczyszczanie saratyny, jak opisano w przykładzie 1, prowadzi w zasadzie do czystego białka o ciężarze cząsteczkowym, który wyznaczony w redukcyjnych warunkach SDS-PAGE wynosi około 21 kDa (fig. 2). Pełna sekwencja aminokwasów opisana została przez bezpośrednie sekwencjonowanie pierwszych 48 aminokwasów oczyszczonego białka, pełne sekwencjonowanie wykonano przez sekwencjonowanie kilku wewnętrznych peptydów uzyskanych metodą degradacji enzymatycznej. Pełną sekwencję podaje SEQ. ID. NO. 2.

Polipeptyd składa się ze 103 aminokwasów, dla których obliczony ciężar cząsteczkowy wynosi 12067,9. Rzeczywisty ciężar cząsteczkowy wyznaczony metodą spektrometrii ESI wynosi 12061,9. Różnica między teoretycznym ciężarem cząsteczkowym oraz ciężarem cząsteczkowym wyznaczonym wykazuje, że wszystkie sześć cystein obecnych w saratynie zaangażowanych jest w tworzenie mostków S-S. Fakt ten potwierdza występowanie silnej zmiany w mobilności białka poddanego chromatografii SDS-PAGE w warunkach redukcyjnych w porównaniu do warunków nie-redukcyjnych. Ponadto, polipeptyd bogaty jest w aminokwasy, takie jak, Glu i Asp. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego z zastosowaniem techniki IEF-PAGE (Immobiline) daje wartość punktu izoelektrycznego pH 3,7 ± 0,5. W badaniach porównawczych jako wzorzec zastosowano oczyszczone białko pijawki, które porównywano pod względem właściwości fizykochemicznych z rekombinowaną saratyną otrzymaną z ekspresji bakulo, drożdży oraz E. coli. Wszystkie trzy białka okazały się być identyczne ze względu na swoje właściwości.

Charakterystyka polipeptydów metodą SDS-PAGE, wybarwionych błękitem Coomassiego (rys. 2) lub srebrem i/lub analiza Western-blot wykazuje, że polipeptyd jest homologiczny i występuje w postaci nieglikolizowanej.

PL 200 384 B1

P r z y k ł a d 4 Otrzymywanie m-RNA oraz synteza cDNA

RNA otrzymywano z pijawki lekarskiej Hirudo medicinalis stosując metodę z tiocyjanianem guanidyny. m-RNA oczyszczano od całej puli RNA stosując zestaw „Oligotex mRNA kit” (QIAGEN).

cDNA syntezowano z zastosowaniem zestawu „Marathon cDNA Amplification kit (CLONTECH). Zgodnie z instrukcją dostawcy sekwencję kodująca saratynę wstępnie amplifikowano z zastosowaniem oligonukleotydowych primerów PCR. Po syntezie cDNA do obu końców cDNA przyłączono (ligacja) uniwersalny adaptor. Sekwencje uniwersalnego adaptora oraz uniwersalnych primerów AP1 lub AP2 wybierano według instrukcji dostawcy wymienionego zestawu.

P r z y k ł a d 5 Amplifikacja oraz izolowanie genu saratyny metodą PCR

Zdegenerowane primery syntezowano bezpośrednio w oparciu o N-terminalną część aminokwasowej sekwencji saratyny, którą przetłumaczono na sekwencję nukleotydową.

Primer01 i Primer02 zaprojektowane zostały tak, aby hybrydyzowały specyficznie do końca 5' cDNA saratyny. Projektowanie primera oparto na eksperymentalnie wyznaczonej aminokwasowej sekwencji ośmiu N-terminalnych aminokwasów oczyszczonego białka saratyny, którą to sekwencję przetłumaczono na sekwencję nukleotydową. Dwa primery primerd oraz primer02 syntezowano tak, by degenerację utrzymać na możliwie jak najniższym poziomie oraz by na krytycznym końcu 3' dostarczyć primerów dokładnie pasujących na odcinku 8 par zasad do sekwencji cDNA saratyny. Celem tego jest zapewnienie efektywnej i specyficznej amplifikacji wzorcowego cDNA. Według zdegenerowanego alfabetu DNA (kod IUPAC) R = A lub G; M = A lub C; Y = C lub T oraz N = A lub G lub C lub T.

Reakcję 3'-RACE PCR przeprowadzono, stosując mieszaninę primeru01 i primeru02 oraz uniwersalnego primeru AP1 lub AP2. Produkty PCR klonowano z zastosowaniem wektora klonującego pCR2.1 lub wektora pCR Script SK(+) oraz sekwencjonowano. Po zsekwencjonowaniu kilku otrzymanych fragmentów 3'-RACE PCR otrzymano sekwencję genu saratyny, z pominięciem nieprzetłumaczonego regionu 5', sekwencji peptydu sygnałowego oraz sekwencji kodującej pierwsze 8 aminokwasów z N-terminalnej części dojrzałego białka. W celu uzyskania brakującej informacji dotyczącej sekwencji cDNA saratyny przeprowadzono eksperyment 5'-RACE z użyciem specyficznego primera genu ze środkowej części cDNA saratyny oraz jednego z uniwersalnych primerów AP1 lub AP2. Po sekwencjonowaniu kilku z otrzymanych po PCR fragmentów 5'-RACE opisano pełną sekwencję genu saratyny. Przez amplifikację genu saratyny metodą PCR z zastosowaniem specyficznych wobec genu, nie-degenaratywnych primerów 3'-terminalnej i 5'-terminalnej części genu saratyny uzyskano gen saratyny o pełnej długości.

Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono używając ponad 15 różnych klonów PCR. Stwierdzono jednak jedynie jedną, istotną zmianę, która skutkowała zmianą sekwencji aminokwasów jedynie w jednym z klonów. Jest bardzo prawdopodobne, że zmianę tą wywołuje PCR. Stwierdzono także pięć innych uśpionych zmian (silent change), które nie wywołują zmian sekwencji aminokwasów. Jest rzeczą nieprawdopodobną, by zmiany te wywoływane były przez PCR, ponieważ występowanie tych samych zmian stwierdzono w innych klonach.

Gen saratyny ORF składa się z 372 bp i zawiera sygnałową sekwencję 21 aminokwasów oraz 103 aminokwasową sekwencję kodującą dojrzałe białko. Stwierdzono, że sekwencja aminokwasowa dedukowana z klonu PCR jest identyczna z sekwencją białka uzyskanego z naturalnej śliny.

P r z y k ł a d 6 Ekspresja w komórkach COS oraz wykrywanie białka ulegającego ekspresji

Celem ekspresji genu saratyny, w komórkach ssaków, takich jak COS lub CHO gen saratyny, odcinano od wektora pCR Script SK(+), stosując Xhol+Xbal oraz klonowano do wektora ekspresji komórki ssaka pCI-neo (Promega). Wybór pCI-neo podyktowany był faktem, że zawiera on promotor do ekspresji in vitro T7 i T3 oraz gen odporny na neomycynę do selekcji G418; może być ponadto używany zarówno w komórkach COS jak i CHO.

Ponadto, obok sekwencji sygnałowej oraz sekwencji dojrzałego białka, insercja na końcu 5' zawierała sekwencję Koz., której celem była efektywna translacja na końcu 3' (część C-terminalna) histag MRGS(H)6, obecność której wynikała z konieczności wykrywania ekspresji białka oraz jego oczyszczania i zatężania. Konstrukcję plazmidu nazwano pNC-31.

Do transfekcji komórek COS został użyty plazmid DNA pNC-31. Komórki COS w fazie wzrostu logarytmicznego przemywano dwukrotnie PBS oraz rozpuszczano w PBS przy stężeniu 1x10⁷/ml. Następnie dodawano 12 ng plazmidu DNA (poniżej 50 μΙ w H₂O lub buforze TE) w 0,7-0,8 ml zawiesiny komórek COS oraz mieszano w kuwecie do elektroporacji. Elektroporację prowadzono przy 1,9kv, 25 μFD przez 10 minut oraz transferowano na płytki 90 mm. Po dodaniu 8 ml środka DMEM, zawierającego 10% FCS oraz antybiotyków, hodowlę komórek kontynuowano przez 3 dni. Supernatanty oraz

PL 200 384 B1 komórki używano w procesie dalszej izolacji białka oraz jego detekcji. Ulegające ekspresji białko wykrywano metodą western blotting, stosując przeciwciało przeciw MRGS(H)6. Oczyszczanie prowadzono, używając środków chelatujących, jak NTA lub kwas imidooctowy immobilizowanych na macierzy kolumny i modyfikowanych jonami metali takimi jak Co, Ni lub Cu.

P r z y k ł a d 7 Konstruowanie wektora ekspresji E. coli oraz jego ekspresja

Ze względu na zastosowanie różnych kodonów w różnych układach biologicznych, pewne kodony u E. coli używane są bardzo rzadko. Celem umożliwienia ekspresji wersji zoptymalizowanej u E. coli gen z zastosowaniem standardowych procedur musi zostać przekonwertowany do kodonu E. coli.

Ekspresję u E. coli przeprowadzono stosując zmodyfikowaną wersję plazmidu pASK75, który zawiera region promotora tet. (Skerra, A., et al., Gene, 1994, 151, 131-135). W skrócie: modyfikację przeprowadzano przez klonowanie nowego linkera pomiędzy miejscami Xbal oraz Hind III (fig. 3). Nowy linker zawiera wiodącą sekwencję ompA, inne miejsce wielokrotnego klonowania oraz zamiast sterp-tag -6xHis-tag.

W celu skonstruowania wektora ekspresji dla saratyny konieczne jest wprowadzenie metodą PCR miejsc restrykcyjnych 5' Cla l oraz 3' Eco47lll.

Stąd użyto primerów 5' - primer03 oraz 3' - primer04. Produkt PCR najpierw klonowano do systemu wektorowego PCR II (lnvitrogen) i sekwencjonowano. W drugim etapie gen saratyny klonowano do zmodyfikowanego wektora pASK75, wykorzystując miejsca restrykcyjne 5'Cla l oraz Hind III.

Po ekspresji oraz wykazaniu aktywności otrzymanej w ten sposób rekombinowanej saratyny w drugiej reakcji PCR usuwano etykietę His-tag, a kodon startowy genu saratyny zespalano bezpośrednio z wiodącą sekwencją omp A. Primery reakcji PCR 5' primer05 oraz 3' - primer06 podane zostały w listingu sekwencji.

Jako przykład ekspresji u E. coli transformowano do wydolnych komórek W3110 wektor ekspresji pRG72 (fig. 3), który zawiera gen strukturalny saratyny zespolony z wiodącą sekwencją omp A. Komórki indukowano po tym jak ich faza wzrostu osiągnęła fazę zwolnionego wzrostu. Godzinę po tym można było wyraźnie wykryć saratynę.

P r z y k ł a d 8 Konstruowanie baculoplazmidu donorowego oraz jego ekspresja

W celu ekspresji saratyny w systemach ekspresyjnych bakulowirusa używano system ekspresyjny bakulowirusa Bac-To-Bac™ (Gibco Life Technologies). W celu otrzymania systemu selekcyjnego wiodącą sekwencję melityny (melitin) pszczoły zespalano z genem saratyny, a w celu wprowadzenia miejsc restrykcyjnych 5' BamHI oraz 3' Kpnl przeprowadzano pojedynczą reakcję PCR stosując 5' - primer07 oraz 3' - primer08. Odpowiedni produkt PCR klonowano do wektora PCR II Vector (lnvitrogen) oraz sekwencjonowano. Następnie, białko fuzyjne melityna-saratyna klonowano do wektora pFastBac, wykorzystując miejsca restrykcyjne 5' BamHI oraz 3' Kpnl, w wyniku czego powstawał pTD13 (fig. 4). Generowanie rekombinowanych bakulowirusów oraz ekspresję saratyny przeprowadzano używając systemu ekspresyjnego Bac-To-Bac. Plazmid donora pTD13 transformowano do wydolnych komórek DH10Bac, które zawierały bakmid z miejscem docelowym mini-affTn7 oraz plazmidem pomocniczym. Element mini-Tn7 na plazmidzie donora ca, w obecności białek transpozycyjnych, dostarczanych przez plazmid pomocniczy, transponuje się do miejsca docelowego mini-a/tTn7 na bakmidzie. Kolonie zawierające rekombinowane bakmidy identyfikowano poprzez niszczenie genu lacZ. Minipreparaty DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym otrzymywano z wybranych klonów E. coli zawierających rekombinowany bakmid. To właśnie DNA używano później do transfekcji komórek insektów. Dokładny opis procedury zamieszczony został w instrukcji do zestawu do ekspresji.

P r z y k ł a d 9 Adhezja płytek krwi do kolagenu w warunkach przepływowych (oznaczenie dynamiczne)

W oznaczeniu adhezji płytek krwi, celem oznaczenia aktywności adhezyjnej płytek krwi, do szkiełek nakrywkowych pokrytych kolagenem w warunkach silnego przepływu ścinającego (symulującego naczyniowe warunki in vivo) pełna krew człowieka poddawana jest perfuzji przez równoległą komorę z przepływem, według metody opisanej przez Sakariassena et al. (Meth. Enz., 1988, 169, 3770). Na czyste szklane szkiełka nakrywkowe (18 mm x 18 mm) natryskuje się pistoletem natryskowym do retuszu ludzki kolagen typu III z łożyska (Sigma) rozpuszczony w kwasie octowym 50 mmol/l. Szkiełka nakrywkowe przechowuje się przez noc w PBS w temperaturze 4°C.

Świeżą, pełną krew ludzką (antykoagulowaną niskocząsteczkową heparyną; 20 U/ml) przed użyciem wstępnie ogrzewano do temperatury 37°C przez 10 minut. Preparaty polipeptydów według wynalazku pipetowano na szkiełka nakrywkowe (30 μΙ na szkiełko) oraz inkubowano przez 10 minut w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, a następnie umieszczano w komorze do perfuzji.

PL 200 384 B1

Krew poddawano perfuzji w temperaturze 37°C przez 5 minut w warunkach przepływu ścinającego 1300 s¹).

Następnie szkiełka nakrywkowe usuwano, przemywano PBS oraz przez 30 minut utwardzano w 0,25% aldehydzie glutarowym, po czym wybarwiano używając May-Grunwald Giemsa. Rysunek fig. 9 przedstawia typowy przykład. Na powierzchni, której nie poddano obróbce, występują duże obszary pokryte wybarwionymi płytkami krwi. Analogiczne powierzchnie, które poddano wcześniej działaniu saratyny wykazują znacznie obniżone (o 80%) wiązanie płytek krwi. Adhezję płytek wyrażano w postaci ilościowej przez obserwację w mikroskopie optycznym, jak pokazano na rysunku fig. 5 (powiększenie 1000x), przy czym mikroskop połączono z komputerowym analizatorem obrazu (Leica). Wyniki przedstawiono w procentach powierzchni pokrytej płytkami krwi oraz agregatami płytek krwi.

Przeprowadzono porównanie aktywności hamowania śliny w stosunku do oczyszczonego polipeptydu (fig. 6). Adhezja płytek krwi na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem typu III w warunkach ścinającego przepływu 1300 s w obecności surowej śliny (#616) w stosunku do kontroli spada (hamowanie) do ok. 48%. Oczyszczony polipeptyd (#607; saratyna) obniża, przy standaryzowanych stężeniach białka, odkładanie się płytek krwi o ok. 81%. Wraz ze wzrostem stężenia, hamowanie powodowane przez saratynę rośnie w sposób zależny od stężenia, co pokazano na rysunku fig. 7.

P r z y k ł a d 10 Immunizacja przeciwciał

Natychmiast po otrzymaniu pierwszej próbki, wysoko oczyszczonego, naturalnego polipeptydu rozpoczęto immunizację zwierząt. Immunizowaną surowicę otrzymano od królika, co dostarczyło precyzyjnie mianowane reagenty do dalszego skriningu. Dodatkowe surowice odpornościowe stały się dostępne z chwilą kiedy dostępna stała się sekwencja aminokwasowa pełnego polipeptydu. Syntezowano wówczas trzy syntetyczne peptydy (sekwencję aminokwasów 83-103, 13-30, 58-69) połączone z KLH standardową procedurą a następnie użyto je do immunizacji. Otrzymano trzy surowice skierowane przeciw N-terminalnej części peptydu oraz dwie surowice skierowane przeciw peptydom C-terminalnym. Posiadając precyzyjnie mianowane surowice immunologiczne możliwe stało się ustawienie i zastosowanie techniki Elisa do monitoringu i ilościowego oznaczania polipeptydu oczyszczonego naturalnie oraz polipeptydu rekombinowanego. Stąd też, zajmujący wiele czasu i raczej pracochłonny test do określania hamowania płytek krwi, mógł zostać zastąpiony i stosowano go jedynie celem potwierdzenia zdolności hamowania końcowych preparatów oczyszczonego białka.

P r z y k ł a d 11 Test immunologiczny do oznaczania wiązania saratyny

Do pokrycia 96-studzienkowych płytek mikrotitracyjnych (Nunc) używano zakwaszonego kolagenu Horm (Nycomed). Płytki pokrywano przez noc 50 ąl roztworu kolagenu (20 jnl/ml). Przed testowaniem, w celu uniknięcia niespecyficznej adhezji, płytki przemywano trzykrotnie PBS oraz inkubowano 1% roztworem BSA. W szeregowym rozcieńczaniu dodawano 50 ąl saratyny i inkubowano przez jedną godzinę. Przed zastosowaniem do detekcji przeciwciała przeciw saratynie płytki trzykrotnie przemywano. Po dodatkowym, jednym etapie inkubowania, nadmiar przeciwciała usuwano a do detekcji używano drugie przeciwciało znakowane biotyną. Odczyt prowadzono przy 490 nm podczas barwnej reakcji katalizowanej przez streptawidynę-POD, stosując jako substraty tabletki ODB (Dako).

P r z y k ł a d 12 Test konkurencyjny do skriningu inhibitorów

Rekombinowana etykietowana saratyna (His-tag), otrzymana jak opisano w przykładzie 7, porównana została ze względu na wiązanie kolagenu z natywną nieetykietowaną saratyną. Płytki pokryte zakwaszonym kolagenem Horm (Nycomed) przygotowywano jak opisano w przykładzie 11. Detekcję przeprowadzano stosując królicze przeciwciała przeciw saratynie. Etykietowana i nieetykietowana saratyna wykazuje identyczne właściwości wiązania. Alternatywnie, nieetykietowaną saratynę modyfikowano przez biotynowanie (Pierce bitynylation kit) oraz porównywano z niemodyfikowaną saratyna. Własności wiążące względem kolagenu były identyczne. Następnie, przeprowadzano eksperymenty z zastosowaniem biotynowanej saratyny, która konkurowała z niemodyfikowaną saratyna, peptydami, saratyną pochodzącą ze śliny, pełną śliną lub przeciwciałami przeciw saratynie. Wiązanie tych różnych konkurencyjnych reagentów do kolagenu testowano przez określanie wiązania biotynowanej saratyny, stosując koniugat sterptawidyna-POD oraz prowadząc detekcję przy pomocy reakcji ODBsubstrat. Wymieniony test, zawierający biotynowaną saratynę, zwykle stosowano do określania stężenia saratyny w ślinie (750 ąg/l), mapowania epitopów przeciwciał przeciw saratynie, oznaczania bioaktywnej saratyny, zmutowanej saratyny. W celu badania aktywności saratyny blokującej oraz nieblokującej używano przeciwciał ze specyficznymi peptydami saratyny.

PL 200 384 B1

P r z y k ł a d 13 Wektor ekspresji drożdży oraz ekspresja

Jako typowy przykład ekspresji drożdży stosowano ekspresyjny układ z wieloma kopiami pichia (lnvitrogen). Konstrukcja wektora ekspresji drożdży pokazana została na rysunku fig. 8. Celem konstrukcji wektora ekspresji drożdży dla saratyny stosowano metodę amplifikacji PCR, podczas której generowano końce restrykcyjne w (5' EcoR l, 3Not l) kompatybilne z ligacjami do odpowiedniego wektora (pPIC9K). Następujące to 5'-primer09 oraz 3'-primer10.

Przed transformowaniem Pichia spheroplasts wektor ekspresji linearyzowano Sal l. W celu zapewnienia integracji genu saratyny skrining kolonii prowadzono w kierunku His+ Mut+-dodatnich mutantów. Typowe warunki wzrostu to 28-30°C, aż do gęstości optycznej OD 2-6. Indukcję ekspresji prowadzono po ponownym sporządzeniu z odwirowanych komórek zawiesiny w pożywce oraz dodaniu metanolu aż do uzyskania końcowego stężenia 0,5%, utrzymując te warunki przez dłuższy okres wynoszący zwykle 24 godziny. Po typowym okresie 6 dni fermentacji produkt odzyskiwano z supernatantu oraz analizowano metodami SDS-PAGE oraz ELISA.

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Polipeptyd wyizolowany z H. medicinalis, mający ciężar cząsteczkowy około 12000 ± 1 · 10³ u i wykazujący biologiczną aktywność inhibitora kolageno-zależnej adhezji płytek krwi, który jest przynajmniej w 80% identyczny do sekwencji aminokwasowej SEQ ID. NO. 2 na całej swej długości.
2. 2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że ma punkt izoelektryczny przy pH 3,7 ± 0,5.
3. 3. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że posiada sześć cząsteczek cysteiny zdolnych do tworzenia mostków -S-S-.
4. 4. Polipeptyd według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że składa się z sekwencji aminokwasowej SEQ ID. NO. 2.
5. 5. Wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 mający sekwencję DNA SEQ ID NO. 2.
6. 6. Polinukleotyd według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA, która jest przynajmniej w 80% identyczna do sekwencji SEQ ID. NO. 2 na całej swej długości.
7. 7. Wektor ekspresji zawierający sekwencję DNA zdefiniowaną w zastrz. 5 albo 6.
8. 8. Sposób otrzymywania polipeptydu, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowli komórki gospodarza w warunkach odpowiednich dla wytwarzania polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 i zawierającego komórkę gospodarza zawierającą wektor ekspresji zdefiniowany w zastrz. 7 oraz otrzymywania polipeptydu z supernatanta lub pozostałości komórkowej po hodowli.
9. 9. Przeciwciało immunospecyficzne wobec polipeptydu wybranego z sekwencji SEQ ID. NO. 2.
10. 10. Preparat farmaceutyczny zawierający polipeptyd zdefiniowany w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 oraz dodatkowo, jeżeli stosowne, nośnik lub zaróbkę, które mogą być stosowane w farmaceutyce.
11. 11. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 10 do terapii procesów zakrzepowych z zatorami.
12. 12. Preparat farmaceutyczny według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że zawiera dodatkowe substancje aktywne, wybrane spośród aspiryny, heparyny lub streptokinazy lub ich kombinacji.
13. 13. Zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 do otrzymywania leku do terapii chorób związanych z zakrzepami zatorowymi.
14. 14. Zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 do pokrywania, w warunkach ex vivo, sztucznych powierzchni w celach medycznych.
15. 15. Zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 do modyfikowania, w warunkach ex vivo, soczewek doocznych dla obniżenia tendencji tworzenia się zakrzepów na materiale soczewki.
16. 16. Zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 do kontaktu, w warunkach ex vivo, z powierzchnią soczewek.
17. 17. Zastosowanie polipeptydu zdefiniowanego w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 do kowalencyjnego wiązania, w warunkach ex vivo, dla modyfikowania materiału soczewek.