CN109157654A

CN109157654A - Tmx1的用途

Info

Publication number: CN109157654A
Application number: CN201811314417.XA
Authority: CN
Inventors: 武艺; 周俊松; 赵珍珍; 孙凯飞
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2019-01-08
Anticipated expiration: 2038-11-06
Also published as: CN109157654B

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及TMX1的用途。本发明提供了细胞外负性调控分子TMX1对血小板功能的调节作用，研究表明，rTMX1兼有抑制血小板活化和凝血途径的双重作用，其适合于各种血栓性疾病的预防和治疗。另一方面，TMX1的抑制剂或突变体能够促进血小板的凝集，具有促凝血的作用,可以作为新的治疗出血性疾病的措施。并且，TMX1的作用部位是细胞外，因而没有干扰正常细胞功能的副作用。

Description

TMX1的用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及TMX1的用途。

背景技术

血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆解脱落下来的小块胞质。血小板的主要功能是凝血和止血，修补破损的血管。但血小板的大量聚集也是血栓性疾病血栓形成的重要原因。

血小板功能失常则止血功能出现障碍。当血管破损时，血小板应激发生聚集，成为血小板凝块；接着血小板产生的凝血酶促进纤维蛋白产生，互相交织的纤维蛋白使血小板凝块与血细胞缠结成血凝块；同时血小板的突起伸入纤维蛋白网内，随着血小板微丝(肌动蛋白)和肌球蛋白的收缩，使血凝块收缩，血栓变得更坚实；伴随着血栓的形成，血小板释放多种活性物质以激活周围血小板，促进血管收缩，促纤维蛋白形成等多种方式加强止血效果。促进凝血的药物主要包括：凝血因子、凝血酶等。

大量的血栓形成是导致临床上常见的致命性危重血栓性疾病的主要原因，如急性冠脉血栓形成导致的心肌梗塞、脑动脉血栓形成导致的脑中风、深静脉血栓所致的肺栓塞等。此外，微循环血栓形成导致的弥散性血管内凝血(DIC)，多继发于严重细菌感染、创伤、产科和血管病急症、癌症、非细菌性血栓性心脑膜炎、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤、脑血管畸形，和免疫性疾病等，多由于这些疾病状态下凝血系统活化所致，而形成微循环的血栓形成，造成心、脑、肝、肾等重要脏器的缺血、缺氧及功能衰竭。可见动脉、静脉及微血管血栓性疾病是严重危害人类生命和健康的重要临床问题。血栓形成是由血小板活化和凝血系统激活两个重要环节组成。国内外已经研究和开发出的抗血栓药物包括：抗凝血药物肝素、华法林、Fondaparinux、水蛭素等，以及抗血小板药物磷酸二酯酶抑制剂、阿西匹林、ADP受体抑制剂、GPIIb/IIIa受体抑制剂等。但是即使目前这些药物在临床上已经广泛应用，全球每年因心脑血管疾病死亡人数仍居高不下。

蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族是一类在内质网中起作用的巯基-二硫键氧化还原酶，其活性位点的两个半胱氨酸残基可催化底物二硫键的形成、异构及还原，从而调控特定的功能。跨膜型二硫键异构酶TMX1(transmembrane thiol isomerase，TMX1)是PDI家族的一员，此前有报道称能够用于治疗肝脏损伤，在血小板功能调节方面尚无报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供TMX1的用途，TMX1可用于预防和治疗血栓性疾病和弥散性血管内凝血。

本发明提供了TMX1在制备调节血小板功能的药物中的应用。

本发明所述TMX1对血小板功能的所述调节作用包括：

抑制血小板聚集率、抑制ATP释放、抑制血小板整合素GPIIb-IIIa的活化、抑制血小板颗粒内容物，抑制内皮损伤部位血小板的集聚和纤维蛋白沉积。

本发明研究表明，随血小板活化，TMX1表达增加；重组rTMX1蛋白能够抑制由convulxin或thrombin诱导的血小板聚集和ATP释放；而重组rTMX1蛋白能够逆转TMX1^-/-小鼠血小板聚集的增强；重组rTMX1蛋白能够恢复TMX1^-/-小鼠血小板JON/A结合的增加和P选择素表达的增加。

本发明还提供了TMX1在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。

所述血栓性疾病包括心肌梗死，脑动脉血栓性疾病，冠脉支架和搭桥等血管成形术的围手术期操作，糖尿病血栓性并发症，抗磷脂综合征，静脉血栓及肺栓塞，细菌性心脏瓣膜血栓性病变，弥漫性血管内凝血，凝血因子治疗诱发的血栓形成事件等。

所述能够调节血小板功能的TMX1为：TMX1蛋白、TMX1蛋白类似物、或过表达TMX1的载体。

一些实施例中，本发明所述TMX1为包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质或表达该蛋白质的DNA分子。

SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质为人源TMX1。

所示包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质为包含人源TMX1的蛋白质分子，具体为含有TMX1的融合蛋白，例如，为了提高TMX1的生物利用度，将TMX1与白蛋白的融合蛋白，或TMX1与Fc的融合蛋白。

本发明还提供了一种抗血栓的药物，其包括TXM1或其类似物。

所述TMX1的类似物在SEQ ID NO:2的氨基酸序列中缺失、添加、替换一个或多个氨基酸残基的且具有TXM1活性的蛋白质。

或者，所述TMX1的类似物为含有TMX1的融合蛋白，例如，为了提高TMX1的生物利用度，将TMX1与白蛋白的融合蛋白，或TMX1与Fc的融合蛋白。

本发明还提供了一种抗血栓的方法，其为给予本发明所述的抗血栓药物。

本发明还提供了包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的TMX1突变体。

本发明所述TMX1突变体为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的人源TMX1的CPAC-基序中至少一个氨基酸残基发生替换形成的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了TMX1突变体和/或TMX1抑制剂在制备调节血小板功能的药物中的应用。

本发明所述TMX1突变体和/或TMX1抑制剂对血小板功能的所述调节作用包括：

提高血小板聚集功能、促进ATP释放、促进血小板整合素GPIIb-IIIa的活化、促进血小板颗粒内容物，促进内皮损伤部位血小板的集聚和纤维蛋白沉积。

TMX1敲除导致小鼠convulixin或thrombin诱导下的血小板的聚集增加和ATP释放增加；TMX1^-/-小鼠血小板JON/A结合和P选择素表达增加；且TMX1敲除促进纤维蛋白沉积和血小板集聚，且能够缩短小鼠的止血时间；而给予TMX1^-/-小鼠rTMX1则能够逆转血小板和或纤维蛋白的沉积的增加。

本发明还提供了TMX1突变体和/或TMX1抑制剂在制备促进止血的药物中的应用。

本发明中，所述TMX1突变体包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

所述TMX1抑制剂为TMX1的敲除质粒或RNAi分子。

本发明还提供了一种促进止血的药物，其包含TMX1突变体和/或TMX1抑制剂。

本发明还提供了一种促进凝血的方法，该方法为给予本发明提供的促进凝血的药物。

本发明提供了细胞外负性调控分子TMX1对血小板功能的调节作用，研究表明，rTMX1兼有抑制血小板活化和凝血途径的双重作用，其适合于各种血栓性疾病的预防和治疗。另一方面，TMX1的抑制剂或突变体能够促进血小板的凝集，具有促凝血的作用,可以作为新的治疗出血性疾病的措施。并且，TMX1的作用部位是细胞外，因而没有干扰正常细胞功能的副作用。

附图说明

图1示TMX1在血小板表面表达，并随着血小板的活化而表达增加；其中，图1-a示典型的柱状图；图1-b示对应的结果；

图2示重组野生型TMX1(rTMX1)抑制convulxin诱导的血小板聚集；其中，图2-a示典型的柱状图；图2-b示对应的结果；

图3示重组野生型TMX1(rTMX1)抑制thrombin诱导的血小板聚集和ATP释放；其中，图3-a示典型的聚集和ATP释放图线；图3-b示对应的聚集结果；图3-c示ATP释放对应的结果；

图4示TMX1突变体(TMX1 Ex-oo)增加convulxin诱导的血小板聚集；其中，图4-a示典型的聚集曲线；图4-b示对应的结果；

图5示Convulxin诱导野生型小鼠(TMX1^+/+)和TMX1敲除小鼠(TMX1^-/-)血小板的聚集；图5-a示典型的聚集曲线；图5-b示对应的结果；

图6示Convulxin诱导野生型小鼠(TMX1^+/+)和TMX1敲除小鼠(TMX1^-/-)的ATP释放；图6-a示典型的聚集曲线；图6-b示对应的结果；

图7示rTMX1能够恢复TMX1^-/-小鼠血小板聚集的增强；图7-a示典型的聚集曲线；图7-b示对应的结果；

图8示rTMX1能够恢复TMX1^-/-小鼠血小板JON/A结合的增加；图8-a示典型的聚集曲线；图8-b示对应的结果；

图9示rTMX1能够恢复TMX1^-/-小鼠血小板P选择素表达的增加；图9-a示典型的聚集曲线；图9-b示对应的结果；

图10示TMX1^+/+和TMX1^-/-小鼠颈动脉损伤模型的血小板血栓的形成；

图11示小鼠的单位面积的荧光值统计；

图12示小鼠的尾巴出血时间；

图13示TMX1的缺乏促进血栓形成过程中血小板聚集和纤维蛋白沉积；其中，图13-a示抗CD41抗体的荧光值中位数反应血栓动态曲线；图13-b示抗纤维蛋白抗体的荧光值中位数反应血栓动态曲线；

图14示rTMX1抑制血栓形成过程中血小板聚集和纤维蛋白沉积；其中，图14-a示抗CD41抗体的荧光值中位数反应血栓动态曲线；图14-b示抗纤维蛋白抗体的荧光值中位数反应血栓动态曲线；

图15示质粒构建信息。

具体实施方式

本发明提供了TMX1的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 rTMX1的制备

①GST-TMX1 protein制备

GST标签的TMX1胞外片段的构建方法包括：

以野生型TMX1 cDNA序列为模板，使用限制性内切酶切割产物，酶切后的PCR产物连接到克隆载体上，并进行转化，挑出单克隆进行测序鉴定，并用测序成功的质粒转化入E.coli BL21，转化后的感受态加入200μl不含抗生素的LB液体培养基，在37℃,150rpm的条件下培养60分钟。

培养完成后，挑取单个细菌克隆，加入含有5ml LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素的15ml离心管中，在37℃,250rpm的条件下培养过夜。

培养好的菌液继续在LB培养基中培养至OD值为0.5。加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)以诱导重组蛋白的表达，诱导条件为37℃,250rpm，5小时。

诱导完成后，离心收集菌体，加入含5mM DTT的细菌裂解液裂解细菌，使用超声处理细菌裂解液。处理后的细菌裂解液用谷胱甘肽亲和纯化柱进行纯化，并用磷酸盐缓冲液(PBS)透析过夜。得到野生型TMX1胞外片段，命名为TMX1Ex-ss。使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，并使用考马斯亮蓝染色(Coomassie blue staning)检测蛋白纯度。构建的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

②GST-free TMX1 protein制备

PreScission Protease是一种大肠杆菌中重组表达的带GST标签的蛋白酶，能在低温条件下特异性地识别八肽序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro或核心五肽序列Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸残基之间进行酶切，进而剪切，适用于GST标签蛋白的在柱酶切。取GST标签的TMX1蛋白的细菌裂解液过柱，使其结合于纯化柱，并用2U/ml的等柱体积的Prescission酶与beads孵育过夜进行酶切，酶切过夜后的上清即为去除GST标签后的TMX1胞外片段，即为rTMX1。

实施例2 TMX1敲除质粒的构建

TMX1敲除质粒由EUCOMM构建，并导入ES细胞中，ES细胞克隆号为:EPD0510_2_E08,载体编号为：PPGT0099_Z_1_F08，质粒构建信息如图15所示。

实施例3 TMX1突变体的构建(Ex-oo)

TMX1突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，制备方法：

根据野生型TMX1的序列，使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，将TMX1蛋白分子中催化活性结构域(CPAC基序)中的2个半胱氨酸Cys/SH(s)全部突变为丝氨酸Ser/OH(o)，将此cDNA克隆构建到上文所使用的大肠杆菌蛋白表达系统中，经诱导表达，亲和纯化，得到突变型TMX1蛋白，命名为TMX1 Ex-oo。

功效验证

1、血小板表面的TMX1野生型胞外片段抑制人血小板的聚集，而突变胞外片段促进血小板聚集。

(A)TMX1在血小板表面表达，并随着血小板的活化而表达增加；用1U/ml thrombin活化人血小板，然后用抗TMX1抗体B01P进行流式细胞术检测TMX1的表达。典型的柱状图(图1-a)；对应的结果(图1-b)，x轴代表平均荧光强度(MFI)；MFI±SEM，每组n＝5，***P<0.001，t检验。

(B)重组野生型TMX1(rTMX1)抑制convulxin诱导的血小板聚集(图2)。在刺激之前，将人血小板与rTMX1预孵育5分钟。典型的聚集图线(图2-a)和对应的结果(图2-b)；平均值±SEM，每组n＝4，**P<0.01，***P<0.001，t检验。

(C)重组野生型TMX1(rTMX1)抑制thrombin诱导的血小板聚集和ATP释放(图3)。在刺激之前，将人血小板与rTMX1预孵育5分钟。典型的聚集和ATP释放图线(图3-a)和对应的结果(图3-b～图3-c)；平均值±SEM，每组n＝4，**P<0.01，***P<0.001，t检验。

(D)TMX1突变体(TMX1 Ex-oo)增加convulxin诱导的血小板聚集。典型的聚集曲线(图4-a)和对应的结果(图4-b)；平均值±SEM，每组n＝4，**P<0.01，***P<0.001，t检验。

2、TMX1的缺乏可增强小鼠的血小板功能和血栓形成，以及缩短出血时间。

(A、B)Convulxin诱导野生型小鼠(TMX1^+/+)和TMX1敲除小鼠(TMX1^-/-)血小板的聚集(图5)和ATP释放(图6)。典型的聚集和ATP释放曲线和对应的结果；平均值±SEM，n＝4，*P<0.05，**P<0.01，t检验。

(C)与TMX1^+/+同窝小鼠相比，rTMX1能够恢复TMX1^-/-小鼠血小板聚集的增强，在血小板活化5分钟前加入的2μM rTMX1进而进行检测。典型的聚集(图7-a)和对应的数据(图7-b，平均值±SEM，n＝5(TMX1^+/+，TMX1^-/-)，n＝4(TMX1^-/-和rTMX1)。***，P<0.001，t检验。

(D、E)与野生型(TMX1^+/+)同窝小鼠相比，rTMX1能够恢复TMX1^-/-小鼠血小板JON/A结合的增加(图8)和P选择素(图9)表达的增加。2μM rTMX1蛋白与血小板孵育5min，再用40ng/ml convulxin活化血小板，进而通过流式检测JON/A的结合和P-选择素的表达(n＝4)。左图，代表柱状图；右图，对应的结果；平均值±SEM，***P<0.001，t检验。该结果说明，TMX1能够抑制内皮损伤部位血小板的集聚、抑制血小板颗粒内容物。

(F)利用FeCl₃诱导的肠系膜动脉损伤模型，检测TMX1^+/+和TMX1^-/-的血小板血栓的形成。从小鼠颈静脉注射Alexa Fluor 488标记的抗CD41抗体，然后用FeCl₃进行颈动脉损伤，分别在3、7、12和20分钟拍摄图像(图10)。虚线标注的为血管壁，比例尺＝200μm。图像是100×放大。血管平均直径：TMX1^+/+小鼠：94.34±3.199μm，TMX1^-/-小鼠：93.71±5.713μm(P＝NS).

(G)FeCl₃诱导的肠系膜动脉损伤模型中，TMX1^+/+(n＝13，4只小鼠)和TMX1^-/-(n＝13，3只小鼠)小鼠的单位面积的荧光值统计(图11，FI/μm²)；平均值±SEM，**P<0.01，***P<0.001，t检验。

(H)TMX1^+/+和TMX1^-/-小鼠的尾巴出血时间(图12)。

使用5％水合氯醛溶液对小鼠进行麻醉，在距小鼠尾巴末端3mm处剪断尾巴，将剪断后的尾巴浸入盛有生理盐水的15ml离心管中，待尾巴伤口处出现红色血流时开始计时，红色血流消失时停止计时，此时间间隔记为出血时间。出血时间上限设为15min。图中显示为21只TMX1^+/+小鼠，19只TMX1-/-小鼠，平均值±SEM，t检验。

3、在小鼠血管壁损伤后，TMX1的缺乏促进血栓形成过程中血小板聚集和纤维蛋白沉积。

用激光诱导野生型小鼠和TMX1敲除小鼠提睾肌动脉血栓形成，经颈静脉注射Alexa Fluor 488标记的抗CD41 F(ab)2抗体(结合血小板表面β3亚基)和AlexaFluor 647标记抗fibrin抗体。

抗CD41抗体(图13-a)和抗纤维蛋白抗体(图13-b)的荧光值中位数反应血栓动态曲线。用曲线下面积进行数据分析，以及Mann-Whitney rank-sum检验,仅展示有显著差异；*P<0.05；***P<0.001。以上数据分别从3只野生小鼠28个血栓和4只TMX1敲除小鼠35个血栓中得出。该结果说明TMX1能够抑制血小板整合素GPIIb-IIIa的活化。

4、在小鼠血管壁损伤后，rTMX1抑制血栓形成过程中血小板聚集和纤维蛋白沉积。

经颈静脉插管注射重组人TMX1胞外片段(150μg/ml)5分钟(对照组注射牛铁蛋白BSA)后，再注射AlexaFluor 488标记抗小鼠CD41单克隆抗体(Purified F(ab’)2 Ratanti-mouse CD41,BD Pharmingen)用来识别血小板血栓，同时注射Alexa Fluor 647标记抗fibrin单克隆抗体用来识别形成的纤维蛋白。显微镜下游离出小鼠提睾肌，用Ablate^TM(3I)微点激光器(Photonics Instruments)诱导动脉血管壁损伤。用荧光显微镜(ZEISS，Examiner D1)和高灵敏度CCD数字录像机Photometrics(Cool SNAP HQ²)获取损伤处血小板和纤维蛋白的荧光信号，记录5分钟(50幅/秒)，应用Slide Book 5.5软件(IntelligentImaging Innovations)分析图像，计算28处损伤部位血小板和纤维蛋白的荧光值中位数作为反映血栓形成的动态曲线，并对曲线下面积(AUC)作统计学分析(Wilcoxon–Mann–Whitney test for non-parametric comparison)。如图14所示，重组人TMX1胞外片段(rTMX1)明显抑制小鼠体内血小板积聚和纤维蛋白形成，提示TMX1在动脉血栓形成的起始阶段发挥重要的负向调控作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> TMX1的用途

<130> MP1824216

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Arg Ser Asn Val Arg Val Ile Thr Asp Glu Asn Trp Arg Glu Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gly Asp Trp Met Ile Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Ser Pro Ala

20 25 30

Ser Gln Asn Leu Gln Pro Glu Trp Glu Ser Phe Ala Glu Trp Gly Glu

35 40 45

Asp Leu Glu Val Asn Ile Ala Lys Val Asp Val Thr Glu Gln Pro Gly

50 55 60

Leu Ser Gly Arg Phe Ile Ile Thr Ala Leu Pro Thr Ile Tyr His Cys

65 70 75 80

Lys Asp Gly Glu Phe Arg Arg Tyr Gln Gly Pro Arg Thr Lys Lys Asp

85 90 95

Phe Ile Asn Phe Ile Ser Asp Lys Glu Trp Lys Ser Ile Glu Pro Val

100 105 110

Ser Ser Trp Phe Gly Pro Gly Ser Val Leu Met Ser Ser Met Ser Ala

115 120 125

Leu Phe Gln Leu Ser Met Trp Ile Arg Thr Cys His Asn Tyr Phe Ile

130 135 140

Glu Asp Leu Gly Leu Pro Val Trp Gly Ser

145 150

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Arg Ser Asn Val Arg Val Ile Thr Asp Glu Asn Trp Arg Glu Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gly Asp Trp Met Ile Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Pro Ala

20 25 30

Cys Gln Asn Leu Gln Pro Glu Trp Glu Ser Phe Ala Glu Trp Gly Glu

35 40 45

Asp Leu Glu Val Asn Ile Ala Lys Val Asp Val Thr Glu Gln Pro Gly

50 55 60

Leu Ser Gly Arg Phe Ile Ile Thr Ala Leu Pro Thr Ile Tyr His Cys

65 70 75 80

Lys Asp Gly Glu Phe Arg Arg Tyr Gln Gly Pro Arg Thr Lys Lys Asp

85 90 95

Phe Ile Asn Phe Ile Ser Asp Lys Glu Trp Lys Ser Ile Glu Pro Val

100 105 110

Ser Ser Trp Phe Gly Pro Gly Ser Val Leu Met Ser Ser Met Ser Ala

115 120 125

Leu Phe Gln Leu Ser Met Trp Ile Arg Thr Cys His Asn Tyr Phe Ile

130 135 140

Glu Asp Leu Gly Leu Pro Val Trp Gly Ser

145 150

Claims

1.TMX1在制备调节血小板功能的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调节包括：

3.TMX1在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述TMX1为包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质或表达该蛋白质的DNA分子。

5.一种抗血栓的药物，其特征在于，包括TXM1或其类似物。

6.包含如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的TMX1突变体。

7.TMX1突变体和/或TMX1抑制剂在制备调节血小板功能的药物中的应用。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述调节包括：

9.TMX1突变体和/或TMX1抑制剂在制备促进凝血的药物中的应用。

10.根据权利要求8～10任一项所述的应用，其特征在于，

所述TMX1突变体包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

11.一种促进凝血的药物，其特征在于，包含TMX1突变体和/或TMX1抑制剂。