CN105339010A - 使用因子xii抑制剂和c1-抑制剂的联合疗法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于治疗表面接触激活系统障碍的方法和组合物，所述方法包含施用至少一种C1-抑制剂(C1-INH)和至少一种因子XII(FXII)抑制剂。

Description

使用因子XII抑制剂和C1-抑制剂的联合疗法
本申请涉及至少一种C1-抑制剂(C1酯酶抑制剂或C1-INH)和至少一种因子XII抑制剂在治疗表面接触激活系统障碍中的用途。还提供了包含至少一种C1-INH和至少一种因子XII抑制剂的组合物。
存在两种用于凝固的汇聚途径，它们由血管系统的“外在”(血管壁)或“内在”(血液产生)的成分触发。所述“内在”或表面接触激活途径在因子XII(FXII,Hageman因子)接触牵涉高分子量激肽原和血浆激肽释放酶的反应中的带负电荷的表面时被启动。因子XII是丝氨酸蛋白酶，且一旦被激活(FXIIa)，则它以正反馈反应(直接或通过激活前激肽释放酶)进一步激活循环FXII。FXIIa还激活因子XI，且血液凝固在反应级联中进行，所述反应级联牵涉在生成凝血酶的过程中达到顶点的限制性蛋白水解激活另外的因子，这将血浆纤维蛋白原转化成纤维蛋白并且活化血小板。
尽管FXII是内在途径中的启动因子，但是FXII缺乏与自发性或与损伤相关的出血并发症的增加无关(Ratnoff&Colopy,JClinInvest34,602-13(1955))。实际上，FXII缺乏的人甚至在大型外科手术过程中也不会存在异常出血(Colman,R.W.HemostasisandThrombosis.BasicPrinciples&ClinicalPractice(eds.Colman等人)103-122(LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,2001))。
在一些在先的报告中，FXII缺乏与静脉血栓形成风险增加相关(Kuhli等人,Am.J.Opthalmol.137,459-464(2004):Halbmayer等人,WienerMed.Wochschr.143,43-50(1993).)。支持这一理念的研究和病例报告涉及FXII缺乏的先证者(indexcase)JohnHageman，他死于肺栓塞。然而，这一推定受到近期对几个病例报告的再评价的挑战，所述的几个病例报告与具有血栓形成的FXII缺乏关联(Girolami等人,J.Thromb.Thrombolysis17,139-143(2004))。在近期的病例中，作者鉴定了伴随先天性或获得性血栓前风险因素与FXII缺乏的组合，其可能导致独立于FXII的血栓形成事件。使用充分表征的患者(Koster等人,Br.J.Haematol.87,422-424(1994))和FXII-缺乏家族(Zeerleder等人,Thromb.Haemost.82,1240-1246(1999))的大量流行病学研究表明FXII缺乏与血栓形成前风险性之间无相关性。
更近期以来，Kleinschnitz等人报道了FXII在脑缺血中的病理性血栓形成中的作用(Kleinschnitz等人,J.Exp.Med.203:513-8(2006))。并且在FXII-缺乏小鼠中的研究表明FXII通过稳定新近生成的血栓牵涉病理性动脉血栓形成。参见US2008/0254039和WO2006/066878。
C1-抑制剂(C1-INH)是丝氨酸蛋白酶抑制剂并且是内源性表面接触激活系统的生理学抑制剂。它抑制几个与补体、激肽释放酶-激肽和凝固系统相关的蛋白酶，包括FXII。基于其在调节经典型补体途径中的关键作用和牵涉再灌注损伤中补体介导的炎症，已经研究了在中风后施用C1-INH对神经缺陷和心肌梗死区域的作用。发现C1-INH在脑缺血小鼠模型中具有强效的神经保护特性(参见，例如DeSimoni等人,J.Cereb.BloodFlowMetab.23(2)：232-239(2003))。此外，C1-INH也是经批准用于具有遗传性血管水肿(HAE)的患者的疗法。
血栓(血块)形成是对减少失血的损伤的生理学响应。血管壁损伤触发突然的血小板粘附和聚集，随后激活血浆凝固系统并且形成包含纤维蛋白的血栓，它封闭了损伤部位(即血管壁中的损伤)。这些事件限制了病理条件下的创伤后的失血，还可以封闭患病血管，导致缺血和/或患病组织和器官梗死。随后，对血流阻塞或崩溃的继发性炎症和/或其它生理响应可以进一步损伤组织或器官。与表面接触激活途径(例如激肽-激肽释放酶或补体系统的那些)相关的其它疾病和障碍同样可以导致致命性的器官和组织损伤。
尽管进行了这些初步研究，但是仍然需要对表面接触激活系统的障碍例如血栓形成的改善治疗，且特别是可以提供改善的效能和/或能够使用较低剂量的昂贵治疗剂的治疗方法。在该方面，发明人已经发现，可以通过施用至少一种FXII抑制剂(例如rHA-Infestin-4)和至少一种C1-INH(例如)以协同作用方式增强治疗表面接触激活系统障碍和防护表面接触激活系统障碍例如动脉血栓形成。
因此，本文公开了联合疗法，其包含至少一种C1-抑制剂(C1酯酶抑制剂或C1-INH)和至少一种因子XII抑制剂(FXII抑制剂)在治疗表面接触激活系统障碍中的应用，其中所述FXII抑制剂不是C1-INH。表面接触激活系统障碍可以选自血栓形成病症、间质性肺病症、纤维增生性病症、特发性肺纤维化、神经炎症性疾病、与激肽形成相关的病症、补体激活系统障碍和缺血性再灌注损伤(IRI)的障碍，且疗法可以包含施用有效量的至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-抑制剂C1-INH。
在一些实施方案中，所述至少一种FXII抑制剂可以包含野生型Infestin-4多肽序列(SEQIDNO：1)或包含SEQIDNO：1的N-末端2-13位氨基酸以外的1-5个氨基酸突变和/或与SEQIDNO：1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性并且保留来自SEQIDNO：1的6个保守半胱氨酸残基的Infestin-4序列。在一些实施方案中，所述至少一种FXII抑制剂可以包含野生型SPINK-1多肽序列(SEQIDNO：2)或野生型SPINK-1多肽序列，其中N-末端2-13位氨基酸已经被SEQIDNO：1的N-末端2-13位氨基酸替代；且任选地进一步被修饰以包含1-5个另外的氨基酸突变，这些突变增加了所述多肽序列与SEQIDNO：1序列的同源性；和/或与SEQIDNO：2具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同源性并且保留来自SEQIDNO：2的6个保守半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述至少一种FXII抑制剂可以包含抗-FXII抗体。在一些实施方案中，所述至少一种FXII抑制剂可以直接或通过连接体连接至融合配偶体(例如延长半衰期的多肽)。
在不同的实施方案中，所述至少一种C1-INH是血浆衍生的C1-抑制剂和/或重组C1-抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种C1-INH与天然存在的人蛋白质相同或是其功能变体。在一些实施方案中，所述至少一种C1-INH是血浆衍生的人C1酯酶抑制剂和/或重组人C1酯酶抑制剂。
在不同的实施方案中，以预防方式施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH或在患者发生表面接触激活系统障碍之后施用它们。可以同时施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH，可以首先施用所述FXII抑制剂或可以首先施用所述C1-INH。可以将所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH施用1次或多次(例如反复施用以治疗慢性病，如在表面接触激活系统障碍发生过程中或之后反复预防性治疗或反复治疗)。
在一些实施方案中，提供药盒，其包含至少一种FXII抑制剂、至少一种C1-INH、使用该药盒治疗表面接触激活系统障碍的说明书和任选的至少另一种治疗活性化合物或药物，其中将所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH提供在单独的容器中或将它们彼此在单一容器中混合，且其中所述FXII抑制剂不是C！-INH。
附图简述
图1显示使用因子XII抑制剂(rHA-Infestin-4)、C1-INH或两者的组合治疗后的大鼠中FeCl3-诱发的动脉血栓形成模型中的动脉闭塞时程以及闭塞率。
图2显示使用因子XII抑制剂(rHA-Infestin-4)或C1-INH单独或组合形式治疗后的大鼠中FeCl3-诱发的动脉血栓形成模型中的闭塞率。
实施方案的详细描述
本申请的实施方案涉及包含将至少一种因子XII(FXII)抑制剂和至少一种C1酯酶抑制剂(C1-INH)施用于患者以治疗表面接触激活系统障碍的方法。在一些实施方案中，该组合与作为单一疗法施用的任一成分相比提供协同作用。在一些实施方案中，该组合的协同作用使得对于所述组合物的任一或两种成分能够使用减少的剂量，能够降低治疗成本和潜在副作用的风险，例如对任一或两种成分的免疫应答。此外，联合疗法可以与基于通过所述组合治疗的疾病的病理生理学的多种途径发生相互作用，从而能够提供对于更广泛患者人群的更有效的治疗。
定义
在本申请中，单数(例如“一种(a)”或“该(the)”)的应用包括复数，另有特别描述的除外。在本申请中，“或”的应用是指“和/或”，另有描述的除外。此外，对于术语“包括”和其它形式例如“包括”和“包括的”的应用没有限制。本文所述的任意范围应当被理解为包括终点和终点之间的所有值。
标题部分仅用于组织化目的且不视为限制所述主题。为所有目的，本申请中引述的所有对比文件或对比文件的部分包括、但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文以其完整的形式被并入本文参考。如果作为参考并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的本发明存在一定程度的矛盾，则本说明书将替代任何存在矛盾的材料。
本文所用的“FXII抑制剂”是指因子XII(活化前)和活化的因子XII(FXIIa)的任一或两者的抑制剂，而术语“C1抑制剂”、“C1酯酶抑制剂”和“C1-INH”是指结合并且抑制C1复合物中的蛋白质的丝氨酸蛋白酶抑制剂，从而预防循环蛋白酶活化和/或抑制与补体系统、激肽释放酶-激肽系统和/或凝固系统相关的活化蛋白酶。C1-INH可以是来源于血浆的(即血浆衍生的)、重组的或它们两者的组合。C1-INH可以与天然存在的人蛋白质相同或是其功能变体。FXII抑制剂和C1-INHs包括野生型抑制剂的功能变体和片段。功能变体或片段是保留野生型分子抑制FXII或C1活性能力的至少50％(例如50、60、70、80、90、95、99或100％或其间的任意百分比)的分子。
本文所用的“表面接触激活系统障碍”是指在病理生理学方面牵涉、影响和/或改变凝固系统、补体系统和激肽释放酶-激肽系统的一种或多种的活性水平的障碍，其中它们均牵涉或来源于表面接触激活途径。表面接触激活系统障碍包括血栓形成病症、与激肽形成相关的病症、补体激活系统障碍、间质性肺病症、神经炎症性疾病或缺血性再灌注损伤(IRI)，它们均与表面接触激活系统的病理活性相关。
本文所用的术语“治疗”涵盖预防、抑制、消除、延迟障碍或疾病的至少一种征候、症状或方面发作、减缓、减轻、降低其严重性或改善它们。治疗无需完全消除症状，即它涵盖、但并不等同于“治愈”或“愈合”。在一些实施方案中，可以治疗患者以预防障碍，即给已知处于发生表面接触激活系统障碍的风险中的受试者(例如，具有一种或多种上述障碍的一种或多种的一种或多种患病倾向性因素的受试者)施用疗法，或者，在那些其中可能复发的障碍中，在原始事件之后施用疗法，例如在经历原始事件的患者中抑制第二种事件。例如，治疗血栓形成病症可以包括预防血栓形成、生长或栓塞。在一些实施方案中，“治疗”还可以包括改善障碍或疾病作用。术语“改善”和“改进作用”是指改善产生一种或多种患者功能损伤的障碍或疾病的一些方面。例如，治疗中风可以包括预防中风、改善中风的作用或减轻中风的严重性(正如例如根据组织损伤程度或神经功能丧失所确定的)。
本文所用的“患者”是任意的人或动物，其具有、已经具有或可能发生表面接触激活途径障碍并且可以得益于施用至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH。施用FXII抑制剂和/或C1-INH可以通过将药物或治疗剂递送给患者的任意已知方法进行，包括、但不限于胃肠外施用(例如硬膜下、皮下、静脉内、动脉内、肌内、鞘内、鼻内、器官内、吸入和/或腹膜内注射)、口服和/或直肠施用以及通过滴注施用、喷涂和/或输注技术。在一些实施方案中，所述施用可以通过静脉内或皮下进行。
本文所用的“抗体”包括包含功能性抗原结合部位的任意多肽，包括免疫球蛋白和抗原结合部分或其片段。功能性抗原结合部分或片段是保留全长抗体结合并且抑制抗原能力的至少50％(例如50、60、70、80、90、95、99或100％或其间的任意百分比)的分子。术语抗体包括、但不限于多克隆、单克隆、单一特异性、多特异性、非特异性、人源化、完全人类、camelized、单链、嵌合、合成、重组、杂种、突变、反向突变和CDR-移植的抗体。该术语还包括抗体片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、VHH(也称作纳米体)和保留抗原结合功能的其它抗体片段或变体，包括双特异性或多特异性抗体。抗体可以具有任意的同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。本文所用的“抗原”是能够被抗体结合的靶分子。本文所用的术语“抗原结合部位”是指能够结合抗原的部分或全体或与之互补的抗体部分。
本文所用的“协同”作用是指施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂之后观察到的大于从作为单一疗法施用C1-INH和作为单一疗法施用的FXII抑制剂中观察到的治疗作用总和的治疗作用。例如，协同作用可以包括在对处于血栓形成风险中或患有血栓形成情况的患者施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂之后超过从单一疗法总和中观察到的血流增加和/或血栓形成发生率降低。同样，在治疗表面接触激活系统障碍的患者中协同作用的另一个实例可以包括在组织损伤的量或功能丧失水平(例如神经功能丧失)方面的减少超过从C1-INH和FXII抑制剂单一疗法作用的加和中预期的减少。
I.表面接触激活系统障碍
在一些实施方案中，公开了至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH并且其可以用于治疗表面接触激活系统障碍的方法中。所述方法可以包含对有此需要的患者施用至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH。因此，本发明还提供一种或多种药物组合物，其包含在药学上可接受的赋形剂或载体中的至少一种FXII抑制剂和/或至少一种C1-INH，用于治疗表面接触激活系统障碍。类似地，本发明还提供包含至少一种FXII抑制剂和/或至少一种C1-INH的一种或多种药物组合物在制备用于治疗表面接触激活系统障碍的药剂中的用途。所述至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH可以单独使用或还可以施用另外的治疗活性化合物。
使用本文公开的方法和组合物治疗的“血栓形成病症”是以形成阻塞或减少血流的血栓(血块)为特征的任意障碍/疾病。血栓可以保留在它所形成的局部，或可以分离以阻塞下游区的血流(血栓栓塞)。在一些实施方案中，血栓形成可以发生在体内的任意部位(包括心脏和脑)的静脉内(静脉血栓形成)或动脉内(动脉血栓形成)。当血栓形成发生在冠状动脉循环中时，它称作冠状动脉血栓形成。当血栓形成发生在脑循环中时，它称作脑血栓形成。
血栓形成病症可以包括静脉、动脉或毛细管血栓形成、在心脏中的血栓形成、慢性和/或急性血栓栓塞(例如肺栓塞、房性肌纤维震颤诱发的血栓形成后的脑血栓栓塞(例如心房颤动中的中风预防(SPAF))、作为人或动物受试者血液接触人造表面结果的血栓形成(例如在具有人工心瓣更换、支架、经皮冠状动脉介入疗法(PCI)、体外膜式氧合(ECMO)或进行心肺旁路手术(CPB手术)的患者中)。血栓可以导致中风、心肌梗死、深静脉血栓形成(DVT)、门静脉血栓形成、血栓栓塞、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、大脑静脉窦血栓形成、巴-希二氏综合征、培基特-施罗特二氏病或无症状性脑缺血(SBI)。
使用本文公开的方法和组合物治疗的神经炎症性疾病可以包括脊髓损伤(SCI)、中风、外伤性脑损伤(TBI)、继发性脑水肿、中枢神经系统水肿、多发性硬化(MS)、横贯性脊髓炎或视神经脊髓炎(德维克病)。
使用本文公开的方法和组合物治疗的与激肽形成相关的病症可以包括遗传性血管水肿(HAE)、继发性脑水肿、中枢神经系统水肿、低血压性休克、弥漫性血管内凝血(DIC)或脓毒症。
使用本文公开的方法和组合物治疗的间质性肺病症可以包括纤维增生病症或特发性肺病症，例如特发性肺纤维化。
本文所用的术语"缺血性再灌注损伤"(IRI)是指因血流恢复至预先经历缺血事件造成的血流缺乏的组织或器官区域导致的损伤。例如，IRI可以因天然事件(例如心肌梗死后的血流恢复)、创伤或一种或多种外科手术或是血流恢复至已经经历供血减少的组织或器官的其它治疗干预导致。这类外科手术可以包括，例如，冠状动脉旁路移植手术、冠状动脉血管成形术、器官移植手术、选择性外科手术、重建外科手术、血管外科手术、心脏外科手术、创伤外科手术、粉碎性或压伤手术、癌症手术、矫形外科手术、移植或微创伤手术。在一些实施方案中，所述外科手术可以包括插入装置以递送药理学活性物质，例如血栓溶解剂或血管扩张药或插入装置以便以机械方式除去完整的或部分的阻塞，例如血管阻塞。
缺血性组织的再灌注可以导致局部、全身和/或远端响应的一种或多种，由此可能导致泛发性的微血管功能障碍和/或改变的组织屏障功能。炎症应答还可以导致全身性炎性反应综合征(SIRS)或多器官功能紊乱综合征(MODS)。局部IRI是指病理生理学过程，例如血栓形成过程、血栓栓子过程、炎症过程、细胞损伤、补体激活和/或在原发性局部缺血部位上水肿形成，而本文可以互换使用的远端IRI或远距离IRI是指侵袭非局部缺血器官和组织的器官或组织的病理生理学过程。在一些实施方案中，远端IRI侵袭一种或多种器官例如肺、心脏、脑、肾、肠、胰腺、肝或四肢/肢体或可以在没有治疗的存在下导致多器官功能不全综合征(MODS)或全身性炎性反应综合征(SIRS)。
一旦血栓形成，则血管中的血流可能减少或被阻断，导致周围组织或相应器官局部缺血。如果血流无法恢复，则连接血管的组织可以受损或被破坏(称作“梗死”)。根据血栓位置的不同，血栓形成病症以不同名称命名。因此，在不同的实施方案中，公开了治疗血栓形成或因特定部位上的血栓导致的病症的方法，以及包含至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH的组合物及其在那些方法中的用途。
中风是可能因血栓或血栓形成/沉积/血栓栓塞导致的一种病症的实例，并且在一些实施方案中，可以使用本文公开的组合物和组合治疗。
中风(也称作脑血管意外(CVA)或脑梗死)牵涉因血流缺乏导致的脑功能衰减，与原因无关。当中风因对脑部分的血流缺乏导致时(例如归因于阻断血流的血栓)，它称作缺血性发作。对于缺血性发作存在3种主要的致病原因：血栓形成(局部血块形成阻塞血管)、栓塞(体内另外区域血块形成阻塞血管)和全身血流灌注过少(广泛性供血减少，例如休克中)。血栓形成和/或栓塞可以发生在动脉、静脉、小动脉、微静脉和/或毛细血管中。术语“缺血性发作”包括因脑任意区域中局部形成的血栓导致的中风(即“血栓性脑卒中”)，无论是大血管(例如颈内动脉、脊椎血管、大脑动脉环)、小血管、毛细血管还是窦(例如脑静脉窦血栓形成)，以及在脑内部或外部另外区域上形成血块且然后寄居在脑内血管中时导致的中风(“栓塞性卒中”)。缺血性发作还包括短暂性缺血发作(也称作“微型发作”)。在短暂性缺血发作中，神经机能障碍是因缺血性事件导致的短暂性的，但与其它类型的中风相反，不包括组织损伤(梗死)，且症状是可逆的。在一些实施方案中，本公开文本提供用于治疗缺血性发作的方法和组合物。
中风还可以因出血过程导致，即出血性中风。出血(例如颅内出血)一般归因于颅骨穹窿内任意部位的血管破裂或异常血管结构，两者形式最终均导致对脑组织造成损伤。一些出血可以发生在局部缺血区域内部("出血性转变")。出血性中风可以是轴内出血(脑内部的血液)或轴外出血(颅骨内部、但脑外部的血液)。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以用于治疗出血性中风。
中风后，再灌注可以导致可能进一步加剧组织损伤程度的炎症和/或其它级联活化。再灌注和炎症可以激活各种级联，包括凝固、激肽释放酶-激肽和补体途径。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以用于治疗中风的这些继发性方面(例如缺陷性发作或出血性中风的继发性方面)。
心肌梗死是可以由血栓导致的另一种病症。心肌梗死一般是指心脏组织死亡。例如，心肌梗死可以因冠状动脉循环中、通常是冠状动脉中的血栓导致。因此，在一个实施方案中，本发明提供用于治疗因血栓导致的心肌梗死的方法和组合物。
不同组织/部位的其它血栓形成病症包括深静脉血栓形成(DVT)、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、巴-希二氏综合征(肝静脉或下腔静脉阻塞)、基特-施罗特二氏病(上肢静脉阻塞)、肝动脉血栓形成(肝移植并发症)和处于这类情况风险中的患者的其它血管血栓形成事件(例如矫形外科手术后、癌症患者、外科手术患者、固定患者)。因此，这些实施方案中公开了用于治疗这些组织/部位的一种或多种的血栓形成病症的方法和组合物。
如果血栓分离为游离的(即栓塞)，则它可以阻断任意上述组织/器官部位中的血流。血栓栓塞的常见部位是肺(称作“肺栓塞”)。动脉栓子还闭塞四肢中的血管。因此，在一些实施方案中，公开了用于治疗血栓栓塞例如肺栓塞或动脉栓塞的方法和组合物。
多个小栓子还可以在牵涉遍在于凝固因子的过量消耗的病症中的血管中形成。这种称作弥漫性血管内凝血(DIC)的病症导致多组织出血和缺血性坏死。因此，在一些实施方案中，公开了用于治疗弥漫性血管内凝血的方法和组合物以及用于治疗弥漫性血管内凝血的组合物。
许多病症的任意种可以导致或促成血栓形成。例如，血栓形成可以因血液组成异常(例如高凝性或血栓形成倾向)、血管壁品质异常(内皮细胞损伤或动脉粥样硬化)和/或血流性质异常(淤滞、紊流)导致。
血栓形成的易感因素的实例包括动脉粥样硬化、存在心脏血管假体装置(例如支架或人工心瓣更换物)、存在心脏瓣膜疾病、其中血流暂时接触外表面的医疗操作(例如CPB、ECMO、BVAD、经皮冠状动脉介入疗法)、心房颤动(可以导致左心房或左心耳中的血液停滞)、癌症、抗磷脂抗体、肝素诱发的血小板减少症、感染、应用口服避孕药、长期不活动(例如归因于手术、肥胖、心力衰竭、瘫痪、持久航班或怀孕)、组织损伤(例如归因于创伤或手术)和/或遗传缺陷(例如因子V莱顿突变、凝血酶原20210基因突变、蛋白质C、蛋白质S、蛋白质Z或抗凝血酶缺乏)。血栓形成的结果是在手术操作过程例如经皮冠状动脉介入疗法中插入导管。其它易感因素包括血栓形成家族史、血栓形成的一次或多次先前发作、50岁前的血栓形成或在非典型部位上的血栓形成。
临床分析可利用于检测缺陷，例如对活化蛋白C(APC)的因子V抗性和各种蛋白质缺乏。例如，可以使用血管造影术、超声检查MRI或CT扫描证实存在血栓。在一些分析中，检测血栓，而在其它分析中，梗死区域表示血栓是否存在。
适合于使用本文公开的方法和组合物治疗的其它病症包括预期防止中枢神经系统继发性水肿形成和/或减小其大小的施用。继发性水肿可以包含因流体局部或异常蓄积例如脑实质内蓄积导致的脑或脊髓容量增加。继发性水肿是继发性梗死生长和随后神经学损伤的常见原因。例如，本文公开的方法和组合物可以用于治疗处于发生中枢神经系统继发性水肿风险中的或已经发生中枢神经系统继发性水肿的患者，所述中枢神经系统继发性水肿因脑或脊髓损伤或因疾病例如中风导致。
在一些实施方案中，治疗预防血栓形成或限制/抑制其大小的生长。在一个实施方案中，治疗限制梗死的最终大小(例如体积)。在一个实施方案中，治疗预防或限制梗死后的再灌注程度。在一些实施方案中，治疗与一种或多种另外的活性剂组合施用，所述另外的活性剂裂解或者以其他方式除去栓子(例如tPA，纤溶酶)，而本文公开的联合疗法防止栓子再形成或生长。
在一个实施方案中，治疗导致被血栓减少或阻断血流的组织中的功能改善和/或恢复。在一个实施方案中，治疗导致血栓部位上的血流改善，例如，正如通过超声多普勒检查法、激光多普勒血流测定仪、MRI(例如测定示踪物的洗入、洗出动力学)、应变计体积描记术、阻抗体积描记术、光电体积描记法、热对流探头和/或其它用于测定血流的适合的技术所测定的。在一个实施方案中，治疗减轻或防止中风后的神经学损伤，正如使用标准临床神经学或心理学措施测定的。
可以将所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH一起或单独施用。在一个实施方案中，可以在单一静脉内施用过程中一起施用C1-INH和FXII抑制剂。在另一个实施方案中，首先施用FXII抑制剂，然后施用C1-INH。在一些实施方案中，直接或在施用FXII抑制剂之后约5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180分钟或更长时间(或在它们之间的任意时间点)施用C1-INH。在其它实施方案中，首先施用C1-INH，然后施用FXII抑制剂。在一些实施方案中，直接或在施用C1INH之后约5、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180分钟或更长时间(或在它们之间的任意时间点)施用FXII抑制剂。
使用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂的治疗可以以预防方式进行，以便预防表面接触激活系统障碍，例如预防血栓形成事件。还可以在表面接触激活系统障碍发作之后即刻或发作之后的一些时间点时施用治疗。例如，可以在血栓形成或IRI病症后的再灌注开始之后(例如预防继发性局部缺血或炎症损害)或在表面接触激活系统障碍(即损伤)例如血栓形成发作之后至多约48小时或至多约240小时直接施用治疗。例如，可以根据临床征候/症状和/或诊断成像或体外测定结果检测血栓形成和其它障碍发作。
在一些实施方案中，治疗在表面接触激活系统障碍急性发作之后即刻或发作之后少于约6小时开始(例如血栓形成、中风或IRI病症中的再灌注后少于约6小时)。在一些实施方案中，治疗在随后至多约48或至多约240小时开始。在一些实施方案中，治疗在血栓形成或表面接触激活系统障碍的其它急性发作之后即刻或发作之后约5、10、20、30、40或50分钟或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72、96、120或240小时(或它们之间的任意时间点)施用。在甚至6小时之后且甚至约48或240小时之后的治疗可以具有有益性。在一些实施方案中，在最初损伤发生后尽快地施用治疗，且优选在损伤后少于1小时、少于6小时或少于48小时。在一些实施方案中，治疗在最初损伤后不晚于约240小时或损伤后不超过约48小时或损伤后不超过约6小时或损伤后不超过约1小时进行。
在一些实施方案中，施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂可以在最初损伤后(例如血栓形成闭塞后)的再灌注开始之后即刻或之后至多约10天进行。在一些实施方案中，在再灌注开始后尽快地施用治疗，且优选在再灌注开始后少于1小时、少于6小时或少于48小时。在一些实施方案中，治疗在再灌注开始后即刻或开始后约5、10、20、30、40或50分钟或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、72、96、120或240小时(或它们之间的任意时间点)施用。在一些实施方案中，治疗在再灌注开始后不晚于约240小时或再灌注开始后不超过约48小时或再灌注开始后不超过约6小时或再灌注开始后不超过约1小时进行。
在一些实施方案中，施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂可以以预防方式进行，以便预防处于表面接触激活系统障碍风险中的患者的最初损伤(例如预防处于血栓形成风险中的患者的血栓形成)。预防性治疗可以以单剂量或重复剂量进行，例如每隔10分钟、每隔30分钟、每隔1小时、每隔6小时、每隔12小时、每隔24小时、每隔36小时、每隔48小时、每隔72小时、每隔96小时、每隔120小时、每隔240小时、每隔1周、每隔2周、每隔1个月或双月或它们之间的任意时间期限1次剂量。可以将周期性剂量施用持续一组时间期限，例如治疗过程期限内。例如，进行一些医学操作的患者可能处于增加的血栓形成风险中。具有血栓形成事件风险的操作实例包括牵涉体外血液循环的操作、侵入性诊断程序或包括移植在内的外科手术。
在一些实施方案中，在一些操作过程中施用治疗以便降低可能导致组织或器官损伤的血栓形成风险，或施用治疗以便治疗在这些操作过程中发生的血栓形成事件，例如外科手术过程中和其它侵入性诊断操作过程中或体外循环过程中。在一些实施方案中，治疗在为降低血栓形成风险或治疗这些操作之后出现的血栓形成事件的一些操作之后施用，例如在手术之后、在再灌注操作开始之后、在溶栓之后或体外血液循环之后。在操作之后施用可以以单剂量或多剂量进行，例如1、2、3、4、5或以上次剂量。可以将重复剂量每隔半小时、每隔1小时、每隔6小时、每隔12小时、每隔24小时、每隔36小时、每隔48小时、每隔72小时、每隔96小时、每隔120小时或每隔240小时、每隔1周、每隔2周、每隔1个月或双月(或它们之间的任意时间期限)施用1次，直到施用方案完成为止。
在一些实施方案中，施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂可以以反复进行，以便治疗处于表面接触激活系统障碍风险中的患者(例如治疗慢性病)。这类治疗可以以单剂量或多剂量进行，例如以反复方式分2、3、4、5或以上次剂量，例如每隔12小时、每隔24小时、每隔48小时、每隔72小时、每隔96小时、每隔120小时、每隔240小时、每隔1周、每隔2周、每隔1个月、双月或它们之间的任意时间期限1次剂量。
施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂(例如针对需要治疗的患者)可以以单剂量或重复施用和以任意各种生理学可接受的盐形式和/或与作为药物组合物的组成部分的可接受的药用载体和/或添加剂一起来进行。因此，在一些实施方案中，如下施用所述至少一种C1-INH和所述至少一种FXII抑制剂：(i)1次，各自作为单独注射或输注，或在单一组合的注射剂或输注液中；(ii)以各成分的多剂量或组合产品的多剂量形式，例如分2、3、4、5或以上次剂量，各自作为注射剂或输注液；或(iii)作为输注或涂布形式。输注/涂布可以在一定时间期限内施用，优选在30分钟－2周或30分钟－1周或30分钟－6天或30分钟－5天或30分钟－4天或30分钟－3天或30分钟－2天或30分钟－1天或30分钟－12小时或30分钟－6小时期限(或它们之间的任意时间期限)内。在病症牵涉血栓和/或IRI损伤的一个实施方案中，施用可以以双剂量进行，在最初创伤后、但在再灌注开始前1次；和在最初损伤后的再灌注开始之后1次。在一些实施方案中，施用可以预防中枢神经系统继发性水肿形成和/或减小其大小，例如在具有或已经具有脑或脊髓损伤或及疾病的患者中。
可以以治疗有效量将包含至少一种C1-INH的组合物和包含至少一种FXII抑制剂的组合物施用于患者。一般地，治疗有效量可以根据受试者年龄、一般状况和性别以及受试者的医学病症的严重性的不同而改变。剂量可以由临床医师决定和如果必要进行调整以适合于观察到的治疗效果。
所述至少一种C1-INH的治疗有效剂量可以取决于许多因素，例如，所用抑制剂的类型、适应证、施用制剂或模式，且可以在针对每种相应适应证的临床前期和临床试验中确定。例如，剂量可以在约0.01IU/kg-5000IU/kg体重或约0.01-1000IU/kg或约5-500IU/kg或约10-200IU/kg或约20-100IU/kg的范围。在不同的实施方案中，C1-INH的剂量约为0.01、0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000IU/kg体重(或它们之间的任意值)。还可以使用以适当的速率连续释放C1-INH的储库形式。用于C1-INH施用的示例性治疗范围还公开在美国专利US5,939,389中，将该文献的公开内容以完整的方式并入。
所述至少一种FXII抑制剂的治疗有效剂量可以取决于许多因素，例如，适应证、施用制剂或模式，且可以在针对每种相应适应证的临床前期和临床试验中确定。例如，在一个实施方案中，FXII抑制剂的剂量可约为0.01、0.1、1、50、100、200、500或1000mg/kg体重或它们之间的任意剂量或约0.01-1000mg/kg、约0.1-1000、约1-1000mg/kg、约1-500mg/kg、约10-200mg/kg、约10-100mg/kg、约50-500mg/kg、约50-200mg/kg或约100-200mg/kg或它们之间的任意剂量。在一些实施方案中，所述FXII抑制剂是rHA-Infestin-4。在一些实施方案中，当使用rHA-Infestin-4时，所述剂量可以在约0.01-1000mg/kg体重或约1-1000mg/kg或约1-500mg/kg或约50-500mg/kg的范围。
在一些实施方案中，所述FXII抑制剂可以是抗-FXII抗体。在那些牵涉抗-FXII抗体的治疗有效剂量的实施方案中，治疗有效剂量是在需要治疗的患者或受试者中带来积极治疗效果的剂量。治疗有效剂量可以在约0.001－100mg/kg体重或约0.01－100mg/kg、约0.01－50mg/kg、约0.1－30mg/kg、约0.1－10mg/kg、约0.1－5mg/kg、约0.1－2mg/kg或约0.1－1mg/kg的范围或它们之间的任意剂量范围。例如，治疗有效剂量可以是将受试者的FXIIa活性抑制至少约50％或至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％(或它们之间的任意百分比)的剂量。
所施用的药物组合物可以包含至少一种C1-INH和/或至少一种FXII抑制剂作为单一活性化合物或可以以与一种或多种另外的化合物、组合物或生物材料组合的方式递送它们。另外的化合物的实例包括维生素、抗生素和预期除去或抑制脑中的血块形成的化合物(例如肝素、乙酰水杨酸、氯吡格雷或双嘧达莫)。
在一些实施方案中，使用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂治疗表面接触激活系统障碍可以增强作为单一疗法施用时C1-INH或因子XII抑制剂的治疗效果。在一些实施方案中，使用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂治疗表面接触激活系统障碍可以产生累加效果，例如与从两种单一疗法的总和中观察到的等效的效果。在一些实施方案中，该组合以协同作用方式增强从两种单一疗法总和中观察到的效果。在一些实施方案中，C1-INH和FXII抑制剂的应用能够降低浓度剂量或减少任一或两种成分的施用方案的频率，同时实现与使用较高剂量浓度或更频繁施用作为单一疗法施用的任一成分所观察到的治疗效果相差无几或更高的治疗效果。
例如，如果使用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂，例如降低一种或多种血管内的血栓形成事件发生率，则可以在治疗前后测量闭塞的血管横断面直径或部分或完全闭塞的血管数量的百分比。可以使用本领域公知的任意标准方法测量闭塞率，例如使用超声多普勒检查法、激光多普勒血流测定仪、MRI(例如用于示踪物的洗入、洗出动力学)、应变计体积描记术、阻抗体积描记术、光电体积描记法、热对流探头和/或其它用于测定血流的适合的技术或使用标准临床神经学或心理学措施。可以将使用联合疗法的减少(例如作为闭塞的血管横百分比或部分或完全闭塞的采样血管的百分比测定的)与相差无几的患者或仅使用C1-INH或FXII抑制剂的相同患者中闭塞百分比减少进行比较。在一些实施方案中，使用联合疗法的闭塞率减少是累加性的(例如约相当于从单个治疗总和中观察到的减少)。
在一些实施方案中，当使用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂疗法时观察导的闭塞减少是协同性的(例如高于从单一疗法效果总和中观察导的减少)。在一些实施方案中，该组合可以将使用单独的C1-INH疗法观察到的减少上升至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％(或它们之间的任意百分比)，或甚至可以导致完全减少，即未观察到闭塞。联合疗法中C1-INH剂量的浓度可以影响观察到的百分比减少。在一些实施方案中，联合疗法可以将使用单独的FXII抑制剂疗法观察到的减少上升至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、150％、175％、200％、225％、250％、275％或300％(或它们之间的任意百分比)，或甚至可以导致完全减少，即未观察到闭塞。联合疗法中FXII抑制剂剂量的浓度可以影响观察到的百分比减少。
在一些实施方案中，以一定浓度施用所述至少一种FXII抑制剂和/或所述至少一种C1INH，所述浓度产生表面接触激活系统障碍的至少一种症状减轻，基本上相当于所述FXII抑制剂和所述C1INH各自在单独施用时的累加效果。
或者，在一些实施方案中，以一定浓度施用所述至少一种FXII抑制剂和/或所述至少一种C1INH，所述浓度产生表面接触激活系统障碍的至少一种症状减轻，其高于所述FXII抑制剂和所述C1INH各自在单独施用时的累加效果。
在一些实施方案中，施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂产生双倍于或三倍于C1-INH自身在血栓形成后施用时观察到的血管闭塞百分比减少。在一些实施方案中，施用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂产生双倍于或三倍于FXII抑制剂自身在血栓形成后施用时观察到的血管闭塞百分比减少。
在一些实施方案中，可以通过测定组织损伤和/或继发性水肿程度(例如梗死、中风或IRI后)监测使用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂对表面接触激活途径障碍治疗的效果。用于测定组织损伤(例如中风后的组织损伤或梗死后的心脏组织损伤)程度的方法可以包括，例如CT扫描、MRI、超声和/或动脉造影术。在一些实施方案中，所述组织损伤是脑组织，且组织损伤程度可以使用对脑功能的临床神经血评价确定。在一些实施方案中，与无任何治疗的存在下组织损伤和/或水肿相比，使用至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂治疗后组织损伤和/或继发性水肿的程度被减轻了与使用各单一疗法的总和中观察到的基本上相当的量。在一些实施方案中，组织损伤和/或继发性水肿的程度被减轻了大于使用各单一疗法的总和中观察到的量。
在一些实施方案中，与单一疗法中所用的最佳浓度相比，以减少的剂量施用所述至少一种C1-INH和至少一种FXII抑制剂。在这些实施方案中，联合疗法的累加或协同作用能够使用降低的浓度，同时维持治疗效果，由此降低与治疗剂相关的成本和/或不良反应风险(例如免疫应答)。
在本公开的方法的一些实施方案中，应当根据建立的用于临床提供的治疗标准治疗患者。在不同的实施方案中，其中所述患者是中风患者，应当使用MRI(如果可能)或其它方法检查患者，无论脑损伤是缺血性的还是出血性的。
II.因子XII抑制剂
如上所述，术语“因子XII”和“FXII”各自指的是因子XII(例如肽的酶原或前体形式)和活化的因子XII(FXIIa)中的任一种或它们两者。因此，“FXII抑制剂”可以包括FXII和FXIIa(也称作αFXIIa)(包括FXIIa裂解产物FXIIaα和FXIIaβ(也称作FXIIf))中的任一种或两者的抑制剂。此外，抗-FXII抗体包括结合并且抑制FXII和FXIIa的任一种或两者的抗体。术语“FXII抑制剂”的含义还包括与延长半衰期的多肽连接的FXII抑制剂，在一些实施方案中，包括连接体。可以使用的FXII抑制剂的实例包括rHA-Infestin-4、SPINK-1、抗-FXII抗体，包括保留抑制FXII活性的能力的这些蛋白质的修饰形式/片段。在一个实施方案中，所述FXII抑制剂是SPINK-1或修饰的SPINK-1，且所述C1-INH是在一个实施方案中，所述FXII抑制剂是Infestin-4或修饰的Infestin-4，且所述C1-INH是在一个实施方案中，所述FXII抑制剂是抗-FXII抗体，且所述C1-INH是
在一些实施方案中，所述FXII抑制剂是FXII的直接抑制剂。术语“直接”抑制剂是指通过接触(例如结合)FXII(或FXIIa)起作用的抑制剂，即所述FXII抑制剂结合FXII和/或FXIIa并且抑制其活性和/或活化。相反，间接抑制剂可以在不接触FXII(或FXIIa)蛋白质的情况下起作用。例如，反义RNA可以用于减少FXII基因表达或小分子可以通过与下游FXIIa反应配偶体如因子XI发生相互作用抑制FXIIa的作用；它们不与FXII蛋白发生直接相互作用。因此，与直接抑制剂相反，间接抑制剂对来自FXII蛋白的上游或下游起作用。直接抑制剂的一些实例在下文中提供。在一些实施方案中，所述FXII抑制剂是非内源性的抑制剂；即它们不是天然存在于人体或动物体中的抑制剂。
C1-INH还是一种弱的FXII抑制剂。然而，用于联合疗法的FXII抑制剂是非C1-INH的抑制剂。
在一个实施方案中，所述FXII抑制剂是特异性FXII抑制剂，优选特异性FXIIa抑制剂。
特异性FXII抑制剂是指抑制血浆丝氨酸蛋白酶或其它非FXII和/或FXIIa的内源性蛋白质的抑制剂，如果以1:1的摩尔比使用，则抑制程度小于或等于25％。换句话说：在所述抑制剂以相应血浆丝氨酸蛋白酶与所述抑制剂的1:1的摩尔比使用时，特异性FXII/FXIIa抑制剂抑制小于或等于25％的非FXII和/或FXIIa的血浆丝氨酸蛋白酶。优选地，如果以1:1的摩尔比使用，则所述FXII抑制剂抑制小于或等于20％、优选小于或等于15％、优选小于或等于10％、优选小于或等于5％、优选小于或等于1％的非FXII和/或FXIIa的丝氨酸蛋白酶。例如，特异性FXIImAb将血浆丝氨酸蛋白酶FXIa抑制仅5％，其中FXIa与所述mAb的摩尔比为1:1，而相同的FXIImAb将FXIIa抑制至少80％、优选至少90％。
在本发明的一个实施方案中，如果将相应血浆丝氨酸蛋白酶与所述抑制剂以1:1的摩尔比使用，则另一种血浆丝氨酸蛋白酶被抑制50％以上。
在本发明的另一个实施方案中，如果将相应血浆丝氨酸蛋白酶与所述抑制剂以1:1的摩尔比使用，则另外两种血浆丝氨酸蛋白酶被抑制50％以上。
在另一个实施方案中，所述FXII抑制剂是人FXII抑制剂，包括人源化单克隆抗体，优选完全人类单克隆抗体。
本文所用的“同源性”是指相同或构成保守取代的氨基酸的百分比量。可以使用序列对比程序例如GAP(Deveraux等人,1984、NucleicAcidsResearch12,387-395)测定同源性，将该文献并入本文。按照这种方式，可以通过将缺口插入这种序列对比，比较与本文引述的那些类似或基本上不同长度的序列，例如，通过GAP使用的对比算法确定这类缺口。
A.Infestin-4
在一个实施方案中，本申请提供包含结构域4(称作“Infestin-4”)的FXII抑制剂。Infestins是一类来源于吸血昆虫的中肠的丝氨酸蛋白酶抑制剂，所述吸血昆虫是Triatomainfestans，即已知导致Chagas病的寄生虫克鲁斯锥虫的主要载体(CamposITN等人32InsectBiochem.Mol.Bio.991-997、2002；CamposITN等人577FEBSLett.512-516、2004；WO2008/098720.)。这种昆虫使用这些抑制剂防止摄取的血液凝固。Infestin基因编码产生可以抑制凝固途径中的不同因子的蛋白质的4种结构域。特别地，结构域4编码为FXIIa强抑制剂的蛋白质(Infestin-4)。已经在小鼠中施用Infestin-4，不会导致出血并发症(WO2008/098720；Hagedorn等人,Circulation2010；121:1510-17.)。
在不同的实施方案中，FXII抑制剂包含Infestin-4。本文所用的术语“Infestin-4”涵盖保留抑制FXII能力的野生型肽的变体或片段。在一些实施方案中，选择抑制FXIIa能力的Infestin-4。在一些实施方案中，Infestin-4包含Infestin-4的变体，其中该变体包含Infestin结构域4，和任选地Infestin结构域1、2和/或3。在一个实施方案中，Infestin-4是(His)6-标记的Infestin-4构建体。在另一个实施方案中，Infestin-4是包含融合配偶体(例如延长半衰期的多肽(例如白蛋白、IgG的Fc结构域或PEG)，其结合infestin-4)的融合蛋白。在一些实施方案中，连接体使融合配偶体连接至Infestin-4。在不同的实施方案中，Infestin-4是Hagedorn等人,Circulation2010；117:1153-60中所述的rHA-Infestin-4蛋白。在一个实施方案中，组合物包含与Hagedorn等人所述的rHA-Infestin-4蛋白通过柔性连接体结合的白蛋白。在一些实施方案中，使用FXII的另外的Infestin-4抑制剂，其实例描述在WO2008/098720和Hagedorn等人,Circulation2010；117:1153-60中，将这两篇文献完整地并入参考。
野生型Infestin-4序列的实例以SEQIDNO：1:EVRNPCACFRNYVPVCGSDGKTYGNPCMLNCAAQTKVPGLKLVHEGRC呈现。
本文所用的术语Infestin-4的“变体”是指具有一个或多个氨酸突变的多肽，其中将“突变”定义为对野生型Infestin-4序列(SEQIDNO：1)的取代、缺失或添加。术语“Infestin-4”涵盖这些Infestin-4变体。术语Infestin-4的“变体”还包括野生型或突变Infestin-4序列的片段。在不同的实施方案中，野生型Infestin-4序列的一种或多种突变基本上不改变多肽的抑制FXII的功能性能力。在一些实施方案中，一种或多种突变不会完全或不会基本上除去多肽抑制FXII的能力(例如变体保留至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或以上的野生型Infestin-4的抑制能力)。这类变体的另外的实例在下文中提供。
在一个实施方案中，Infestin-4变体包含来自野生型Infestin-4序列的氨基末端的氨基酸序列VRNPCACFRNYV(SEQIDNO：20，其为SEQIDNO：1的2-13位残基)。在一些实施方案中，与野生型Infestin-4序列相比，变体可以包含SEQIDNO：1的2-13位残基，且还包含SEQIDNO：1的2-13位残基以外的至少一个且任选地至多5个氨基酸突变。在一些实施方案中，该变体保留来自野生型Infestin-4序列的6个保守半胱氨酸残基和/或与野生型Infestin-4序列的至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施方案中，Infestin-4变体包含野生型Infestin-4序列的保守N-末端区2-13位氨基酸和这些保守N-末端氨基酸以外的至少1个且任选地至多5个氨基酸突变，导致与野生型Infestin-4序列的差异。本文所用的术语Infestin变体的“N-末端氨基酸以外”是指沿着该变体多肽链的任意氨基酸，它们不是包含SEQIDNO：20：VRNPCACFRNYV序列的氨基酸连续串，为来自SEQIDNO：1的2-13位氨基酸。
在另一个实施方案中，Infestin-4变体包含6个保守半胱氨酸残基和/或与野生型Infestin-4序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一个实施方案中，6个保守半胱氨酸残基是野生型Infestin-4序列SEQIDNO：1的6、8、16、27、31和48位上的氨基酸。在一个实施方案中，所述变体包含48位的最终保守半胱氨酸。在其它实施方案中，半胱氨酸残基的确切位置和彼此的相对位置可以从野生型Infestin-4序列的6、8、16、27、31和48位改变，这归因于Infestin-4变体中的插入或缺失。但是，在这些实施方案中，Infestin-4变体包含所有6个半胱氨酸和/或可以与野生型Infestin-4序列共有70％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或它们之间的任意百分比的同源性。在一些实施方案中，Infestin-4变体保留来自SEQIDNO：1的2-13位氨基酸和6个半胱氨酸残基，且可以与野生型序列共有70％、75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或它们之间的任意百分比的同源性。
在一些实施方案中，Infestin-4变体包含SEQIDNO：21：DSLGREVRNPCA。在一些实施方案中，该序列被添加在片段或全长野生型Infestin-4序列的N-末端上或接近N-末端上并且衍生自人蛋白质SPINK-1。
在一些实施方案中，Infestin-4变体包含野生型Infestin-4或变体Infestin-4与人白蛋白(也称作“HA”)之间的融合构建体。在一些实施方案中，HA是重组蛋白(称作“rHA”)。在一些实施方案中，Infestin-4和HA蛋白直接或通过连接多肽连接。
在一个实施方案中，所述FXII抑制剂包含野生型Infestin-4多肽序列变体，其中该变体包含SEQIDNO：1的N-末端2-13位氨基酸；N-末端氨基酸以外的至少1个且任选地至多5个氨基酸突变；6个保守半胱氨酸残基；和/或与野生型Infestin-4序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。
在不同的实施方案中，提供保留抑制FXII能力的Infestin-4变体。例如，可以通过体外和/或体内表征评价功能性抑制活性，包括测试FXII酶活性抑制的直接测定、延长凝固时间(例如激活部分促凝血酶原激酶时间，aPTT)、找到凝固内在途径的临床凝血检验或评价凝固的体内方法。
Infestin-4变体的其它实例是如下所述的SPINK-1突变体。
B.SPINK-1突变体
在不同的实施方案中，所述至少一种FXII抑制剂可以包含与Infestin-4具有高度相似性的人蛋白质。与Infestin-4具有高度相似性的人蛋白质的一个实例是SPINK-1，即在胰腺中表达的Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂(也称作胰腺分泌的胰蛋白酶抑制剂，PSTI)。Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族是已知丝氨酸蛋白酶抑制剂的众多家族之一。已经描述了来自不同种类的许多类似蛋白质(LaskowskiM和KatoI,49Ann.Rev.Biochem.593-626、1980.)。
野生型SPINK-1序列的一个实例以SEQIDNO：2DSLGREAKCYNELNGCTKIYDPVCGTDGNTYPNECVLCFENRKRQTSILIQKSGPC呈现。
在不同的实施方案中，野生型SPINK-1序列(例如SEQIDNO：2)用作FXII抑制剂。术语“SPINK-1”也涵盖基本上保留抑制FXII能力的SPINK-1的功能性变体和片段，并且在一些实施方案中，这些SPINK-1变体用作FXII抑制剂。例如，可以生成野生型序列的不同变体，以便增加SPINK-1序列与Infestin-4的同源。在一个实施方案中，使SPINK-1突变以包含SEQIDNO：1的N-末端2-13位氨基酸。
在一个实施方案中，变体SPINK-1包含野生型Infestin-4序列的N-末端部分(例如SEQIDNO：1的2-13位氨基酸)和N末端氨基酸以外的任选的至少1、2、3、4或5个另外氨基酸突变，它们可增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性。在另一个实施方案中，变体SPINK-1包含6个保守半胱氨酸残基且与野生型SPINK-1序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性，且任选地被突变以增加所述变体与野生型Infestin-4序列的同源性。在一些实施方案中，SPINK-1变体还包含野生型Infestin-4序列的N-末端部分(例如SEQIDNO：1的2-13位氨基酸)。
突变可以包含取代、缺失和/或添加。为“N-末端氨基酸以外”的突变是指沿着所述变体的多肽链的任意氨基酸中的一种或多种突变，所述氨基酸不是包含序列VRNPCACFRNYV(SEQIDNO：20)的氨基酸的连续串，即SEQIDNO：1的2-13位氨基酸。术语“变体”包括SPINK-1或突变的SPINK-1序列的片段。
在一些实施方案中，SPINK-1的6个保守半胱氨酸残基可以是野生型SPINK-1序列(例如SEQIDNO：2)的9、16、24、35、38和56位上的氨基酸。在一个实施方案中，所述变体包含野生型SPINK-1序列的最终的半胱氨酸(即SEQIDNO：2的56位上的半胱氨酸)。在一些实施方案中，6个半胱氨酸未突变，但半胱氨酸的确切位置和彼此相对的位置可以从野生型SPINK-1序列的9、16、24、35、38和56位改变，这归因于在SPINK-1变体的另外区域的插入和/或缺失。但是，在这些实施方案中，SPINK-1变体包含所有6个半胱氨酸。
在一些实施方案中，SPINK-1的6个半胱氨酸未突变，但SPINK-1被突变成包含野生型Infestin-4序列的N-末端部分(例如SEQIDNO：1的2-13位氨基酸)和/或与野生型SPINK-1序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性，和/或包括SPINK-1序列中N-末端氨基酸以外的1、2、3、4或5个突变。例如，SPINK-1变体可以包含SEQIDNO：1的N-末端2-13位氨基酸；N-末端氨基酸以外的至少1个且至多5个氨基酸突变，其增加所述变体与野生型Infestin-4序列的同源性；来自野生型SPINK-1序列的6个保守半胱氨酸残基；和/或与野生型SPINK-1序列至少70％,至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。
在一些实施方案中，SPINK-1变体基本上保留其抑制FXII的能力(例如所述变体保留野生型SPINK-1的抑制活性的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或以上)。
可以用于本文公开的方法的SPINK-1变体的实例包括：K1:DSLGREVRNPCACFRNYVPVCGTDGNTYPNECVLCFENRKRQTSILIQKSGPC；K2:DSLGREVRNPCACFRNYVPVCGTDGNTYGNECMLCAENRKRQTSILIQKEGPC；和K3:DSLGREVRNPCACFRNYVPVCGTDGNTYGNECMLNCAENRKRQTSILIQKEGPC(分别为SEQIDNOS：3、4和5)。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代可以在相对于K1的N-末端以外形成，以便增加与Infestin-4的同源性。在SPINK-1变体K3的情况中，5个氨基酸取代增加与Infestin-4的同源性。在一些实施方案中，SPINK-1变体可以与野生型SPINK-1序列共有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或它们之间的任意百分比)的同源性。
C.FXII抗体
在不同的实施方案中，所述FXII抑制剂是抗-FXII抗体，其结合FXII并且抑制或减少FXII活化和/或活性。术语“抗-因子XII抗体”涵盖全长抗体及其功能性片段(例如抗原结合片段，例如Fab、F(ab)2、Fv和scFv)。该术语还涵盖多克隆和单克隆抗体和具有任意同种型例如IgM、IgD、IgA、IgG和IgE的抗体及其任意的亚类，例如IgG1。抗体可以来自哺乳动物种类，例如人、小鼠、大鼠、家兔、山羊、仓鼠或猴子。在一些实施方案中，所述抗体可以是人源化或CDR-移植的。在一些实施方案中，所述抗体可以被突变或修饰以改变免疫原性、半衰期和/或传递与治疗抗体相关的其它有利特性。在一个实施方案中，所述抗体是抗-FXII抗体，其结合FXII重链或轻链上的表位，例如中和表位。在一些实施方案中，所述抗体与多肽、核酸或小分子缀合。“抗-FXII抗体”还包括结合和/或抑制FXII和活化蛋白(FXIIa)(包括FXIIaα和FXIIaβ裂解片段)的酶原的任一种或两者的抗体。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合FXIIa或FXIIa的α或β链片段。
在一些实施方案中，抗-FXII抗体可以结合并且抑制FXIIa活化和/或活性。例如，WO2006/066878和Ravon等人,Blood86：4134-43(1995)中已经描述了抗-FXII抗体，其公开内容以完整的形式并入本文。其它人因子XII的单克隆抗体(mAbs)包括由Pixley等人(JBiolChem1987；262、10140-45)描述的B7C9mAb；Small等人(Blood1985；65:202-10)描述的mAb；由Nuijens等人(J.Biol.Chem.1989；264:12941-49)描述的单克隆抗体F1和F3；WO89/11865中所述针对FXII轻链的B6F5、C6B7和D2E10单克隆抗体；WO90/08835中所述的相比对于FXII选择性地结合FXIIa-β的单克隆抗体；和WO91/17258中所述的抗-FXII抗体OT-2，这些文献的公开内容以完整的形式并入本文。
另外的抗-因子XII单克隆抗体描述在WO2013/014092A1中，将内容以完整的形式并入本文参考。在一些实施方案中，所述抗体可以具有高于对于未活化人FXII2倍以上的对于人因子XIIa-β的亲和力，且能够抑制人因子XIIa的胺裂解酶活性。
在一些实施方案中，抗-FXII抗体包含表1中呈现的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列。在一些实施方案中，抗-FXII抗体包含表1中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3和/或包含VCDR1、VCDR2和VCDR3。如WO2013/014092A1中所述的抗体3F7是这类抗体的实例。
表1.
在一些实施方案中，所述抗体具有如下特征的一种或多种：(a)结合人FXII；(b)包含与SEQIDNO：6序列85％以上相同、例如90％、95％、98％或99％以上相同的重链可变(VH)区；(c)包含与SEQIDNO：7序列85％以上相同、例如90％、95％、98％或99％以上相同的轻链可变(VL)区；(d)包含与SEQIDNO：8序列至少80％相同、例如85％、90％、95％、98％或99％以上相同的重链CDR1和/或与SEQIDNO：9至少60％相同、例如70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％以上相同的重链CDR2和/或与SEQIDNO：11序列至少80％相同、例如85％、90％、95％、98％或99％以上相同的重链CDR3；(e)包含与SEQIDNO：13至少50％相同、例如60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％以上相同的轻链CDR1和/或与SEQIDNO：14的轻链CDR2至少50％相同、例如60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％以上相同和/或与轻链CDR3至少50％相同，例如与序列A-X1-W-X2-X3-X4-X5-R-X6-X7(SEQIDNO：16)60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％以上相同；其中X1可以为A或S，X5可以为L或V，且另外的Xn’可以是任意的氨基酸；(f)结合人因子XIIa-β，其KD优于10-8M；(g)与Infestin-4竞争性结合人因子XIIa-β；或(h)是人IgG或其功能变体，优选人IgG4或其功能变体。
在一些实施方案中，抗-FXII抗体是结合人FXII/FXIIa的IgG抗体并且包含：(a)包含如SEQIDNO：8中列出的重链CDR1、如SEQIDNO：10中列出的重链CDR2和如SEQIDNO：12中列出的重链CDR3的VH区；和/或(b)包含如SEQIDNO：13中列出的轻链CDR1、如SEQIDNO：14中列出的轻链CDR2和如SEQIDNO：16中列出的轻链CDR3的VL区。重链CDR2可以包含序列GIX1X2X3X4X5X6TVYADSVKG(SEQIDNO：10)，其中X1是R、N或D，X2是P、V、I或M；X3是S、P或A；X4是G、L、V或T；X5可以是任意的氨基酸，优选X5是G、Y、Q、K、R、N或M；且X6是T、G或S。重链CDR3可以包含序列ALPRSGYLX1X2X3X4YYYYALDV(SEQIDNO：12)，其中X1是I、M或V；X2是S或K；X3是P、K、T或H；且X4是H、N、G或Q。轻链CDR3可以包含序列AX1WX2X3X4X5RX6X7(SEQIDNO：16)，其中X1是A或S；X2是D、Y、E、T、W、E或S；X3是A、N、I、L、V、P、Q或E；X4是S、D、P、E、Q或R；X5是L或V；X6是G、L或K；且X7是V、A、D、T、M或G。
在其它实施方案中，抗-FXII抗体是结合人FXII/FXIIa的IgG抗体片段并且包含：(a)包含如SEQIDNO：8中列出的重链CDR1、如SEQIDNO：9中列出的重链CDR2和如SEQIDNO：11中列出的重链CDR3的VH区；和/或(b)包含如SEQIDNO：13中列出的轻链CDR1、如SEQIDNO：14中列出的轻链CDR2和如SEQIDNO：15中列出的轻链CDR3的VL区。
在不同的实施方案中，抗-FXII抗体是亲和力成熟的嵌合CDR移植或人源化抗体或其功能性抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗-FXII抗体选自亲和力成熟的(相对于3F7)抗体VR115、VR112、VR24、VR110和VR119(这些抗体的HCDR1-3和LCDR1-3的SEQIDNos如下表2中所示)。
表2.
mAb HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
3F7 8 9 11 13 14 15
VR119 8 10 11 13 14 15
VR112 8 10 11 13 14 15
VR115 8 10 11 13 14 15
VR24 8 9 11 17 14 15
VR110 8 10 11 13 14 15
如上所述，SEQIDNO：10是简并序列。VR119包含SEQIDNO：10，其中X1是N，X2是V，X3是P；X4是L，X5Y；且X6是G。VR112包含SEQIDNO：10，其中X1是N，X2是V，X3是P，X4是V，X5是Q，且X6是G。VR115包含SEQIDNO：10，其中X1是D，X2是I，X3是P，X4是T，X5是K，且X6是G。VR110包含SEQIDNO：10，其中X1是D，X2是M，X3是P，X4是T，X5是K，且X6是G。VR24包含独特的LCDR1：SGSSEMTVHHYVY(SEQIDNO：17)。
在牵涉抗体CDRs的实施方案中，根据KABAT编号系统定义CDR(Kabat等人,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版.U.S.DepartmentofHealthandHumanservices,NIH,Bethesda,MD.(1991))。
在一些实施方案中，所述抗体是抗-FXII单克隆抗体或其抗原结合片段，当以1:0.2的摩尔比使用FXIIa-α与抗体时，其在体外FXIIa胺裂解酶活性测定(WO2013/014092)中将人FXIIa-α抑制40％以上、50％以上或60％以上。在一些实施方案中，当以1:0.5的摩尔比使用FXIIa-α与抗体时，所述抗体或其抗原结合片段将人FXIIa-α抑制80％以上、85％以上或90％以上。在一个实施方案中，当以1:0.5的摩尔比使用FXIIa-α时，所述抗体实现了对人FXIIa-α的完全或接近完全(例如95％、96％、97％、98％、99％或以上)的抑制。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段对人FXIIa具有与抗体3F7至少近似相差无几的亲和力。
D.连接至HLEPs的FXII抑制剂
本申请的另一个方面提供连接至融合配偶体例如延长半衰期的多肽类(HLEPs)或分子例如PEG的FXII抑制剂。在一个实施方案中，FXII抑制剂是小蛋白质。因此，可以预期快速肾清除率(正如对其它小蛋白质观察到的)(参见WerleM和Bernkop-SchnurchA,AminoAcids2006；30:351-367)。解决多肽化合物的短血浆半衰期的一种方式在于将其反复注射或通过连续输注注射。另一种方法在于增加多肽自身的血浆半衰期。例如，在一个实施方案中，FXII抑制剂连接至延长半衰期的蛋白质。
“延长半衰期的多肽”是可以增加FXII抑制剂在患者或动物体内半衰期的多肽融合配偶体。实例包括白蛋白和免疫球蛋白及其片段，例如Fc结构域或衍生物，它们可以与FXII抑制剂直接或通过可裂解的或不能裂解的连接体融合。Ballance等人(WO2001/79271)描述了融合多肽类，其包含与人血清白蛋白融合的众多不同治疗多肽类。
术语“白蛋白”和“血清白蛋白”涵盖人白蛋白(HA)及其变体(其完全成熟形式在本文中公开(SEQIDNO：19))以及来自其它物种的白蛋白及其变体。本文所用的“白蛋白”是指具有一种或多种白蛋白功能活性(例如生物活性)的白蛋白多肽或氨基酸序列或白蛋白变体。在一些实施方案中，白蛋白用于稳定或延长FXII抑制剂的治疗活性。白蛋白可以衍生自任意脊椎动物，尤其是任意的哺乳动物，例如人、猴子、牛、绵羊或猪。还可以使用非哺乳动物白蛋白，其包括但不限于来自小鸡和鲑鱼的白蛋白。白蛋白连接的多肽的白蛋白部分可以来自不同动物的非治疗多肽部分。参见WO2008/098720的白蛋白融合蛋白的实例，该文献以完整的形式并入本文参考。
在一个实施方案中，白蛋白变体是至少10、20、40、50、60或至少70个氨基酸长度(或它们之间的任意长度)或可以包括来自人(HA)白蛋白序列(例如SEQIDNO：19)的15、20、25、30、50或以上个连续氨基酸(或它们之间的任意数值)或可以包括HA的部分或全部特异性结构域。白蛋白变体可以包括氨基酸取代、缺失或添加，它们可以是保守的或非保守的取代，其中这类改变不会基本上改变活性位点或活性结构域，其赋予延长半衰期多肽类的治疗活性。这些变体可以共有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或它们之间的任意百分比)的同源性。
在一些实施方案中，白蛋白变体是片段并且可以包含至少一种白蛋白的完整结构域和/或那些结构域的片段，例如结构域1(SEQIDNO：19的1-194位氨基酸)、2(SEQIDNO：19的195-387位氨基酸)、3(SEQIDNO19的388-585位氨基酸)、1+2(SEQIDNO：19的1-387位氨基酸)、2+3(SEQIDNO：19的195-585位氨基酸)或1+3(SEQIDNO：19的1-194位氨基酸+388-585位氨基酸)。每个结构域自身由称作SEQIDNO：19的1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585位残基的两个同源亚结构域构成，其中柔性亚结构域间连接区包含残基Lys106－Glu119、Glu292－Val315和Glu492－Ala511。因此，在一些实施方案中，白蛋白变体包含白蛋白的至少一种完整亚结构域。
在一些实施方案中，在结构或进化方面与白蛋白相关的其它蛋白质(“白蛋白家族蛋白”)可以用作HLEPs，包括、但不限于甲胎蛋白(WO2005/024044；Beattie和Dugaiczyk,20Gene415-422、1982)、afamin(Lichenstein等人269J.Biol.Chem.18149-18154、1994)和维生素D结合蛋白(Cooke和David,76J.Clin.Invest.2420-2424,1985)。编码这些蛋白质的基因代表与人、小鼠和大鼠中的相同染色体区具有结构和功能相似性作图的多基因簇。白蛋白家族成员的结构相似性表明它们可以用作HLEPs。例如，已经请求保护延长体内连接的治疗多肽的半衰期的甲胎蛋白(WO2005/024044)。因此，在一些实施方案中，这些能够稳定或延长治疗活性的蛋白质或其变体可以用作连接至FXII或FXIIa的HLEPs，并且可以来源于任意的脊椎动物，尤其是任意的哺乳动物，例如人、猴子、牛、绵羊或猪，或非哺乳动物，包括、但不限于雌禽或鲑鱼。在一些实施方案中，变体可以包含10个或以上的氨基酸长度或可以包含衍生它们的相应蛋白质序列的约15、20、25、30、50个或以上的连续氨基酸或可以包括相应蛋白质的部分或全部特异性结构域。白蛋白家族成员融合蛋白可以包括天然存在的多态变体。
在一些实施方案中，单-或多-(例如2-4个)聚乙二醇(PEG)部分可以用作融合配偶体，且可以在体内延长半衰期。聚乙二醇化可以通过任意可利用的聚乙二醇化反应进行。用于制备聚乙二醇化蛋白质产品的示例性方法一般可以包括：(a)使多肽与聚乙二醇(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)在这样的条件下反应，其中蛋白质变成连接至一个或多个PEG基团；和(b)得到反应产物。存在多种PEG连接方法。参见，例如，EP0401384；Malik等人,Exp.Hematol.,20:1028-1035(1992)；Francis,FocusonGrowth因子,3(2):4-10(1992)；EP0154316；EP0401384；WO92/16221；WO95/34326；美国专利US5,252,714，将它们以其完整的形式并入本文参考。
在一些实施方案中，免疫球蛋白(Ig)可以用作HLEP。术语“免疫球蛋白”涵盖其功能性片段和变体，例如Fc区或一个或多个Ig恒定结构域。在一些实施方案中，Ig包含免疫球蛋白恒定结构域的Fc区或部分。恒定区可以是IgM、IgG、IgD、IgA或IgE免疫球蛋白的恒定区。在一些实施方案中，治疗多肽部分通过抗体的铰链区或可裂解的肽连接体连接至Ig。几篇专利和专利申请描述了治疗蛋白与免疫球蛋白恒定区的融合体以便延长治疗蛋白的体内半衰期(US2004/0087778、WO2005/001025、WO2005/063808、WO2003/076567、WO2005/000892、WO2004/101740、US6,403,077)，所述文献并入本文参考。因此，在一些实施方案中，免疫球蛋白区(例如Fc结构域、免疫球蛋白的Fc片段及其变体)用作HLEPs。在一些实施方案中，FXII抑制剂可以与免疫球蛋白恒定区的Fc结构域融合或与其的部分融合，成为HLEPs。在一些实施方案中，将这些融合蛋白制备成在原核或真核宿主细胞例如细菌、酵母、植物、动物(包括昆虫)或人细胞系或转基因动物中表达的重组分子(WO2008/098720，并入本文参考)。
SPINK突变体-Fc融合蛋白的实例SPINK-K2-Fc融合蛋白描述在WO2008/098720中。
E.连接体
在不同的实施方案中，插入肽连接体可以被导入治疗多肽和HLEP之间。在一个实施方案中，可裂解的连接体被导入，特别地条件是HLEP具有干扰治疗多肽的特异性活性的潜能，例如通过位阻。在一些实施方案中，所述连接体是可以被牵涉凝固的酶裂解的，例如内在、外在或通常的凝固途径的凝固蛋白酶。内在途径的凝固蛋白酶包括在表面接触激活途径中的蛋白酶，例如FXIIa、FXIa或FIXa。在一个实施方案中，所述连接体可被FXIIa裂解。外在途径的蛋白酶包括组织因子途径中的蛋白酶，例如，FVIIa。通常途径的蛋白酶包括牵涉纤维蛋白原转化成纤维蛋白的蛋白酶，例如，FXa、FIIa和FXIIIa。
III.C1抑制剂
术语“C1抑制剂”、“C1酯酶抑制剂”和“C1-INH”是指丝氨酸蛋白酶抑制剂及其功能片段，它们结合并且抑制C1复合物中的蛋白质，从而防止循环蛋白酶活化和/或抑制与补体系统、激肽释放酶-激肽系统和/或凝固系统相关的活化蛋白酶。C1-INH可以是来源于血浆的(即血浆衍生的)、重组的或两者的组合。被C1-INH抑制的凝固蛋白酶包括因子XIa和因子XIIa。C1-INHs可以是来源于血浆的、重组的或两者的组合。C1-INH的实例包括血浆衍生的CINRYZETM(Viropharma)、重组RUCONESTTM或RHUCINTM(均来自Pharming)和血浆衍生的(CSLBehring)。
本文所用的C1-INH可以包含来自人或动物的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂或其活性片段或可以包含提供类似功能特性的重组肽类、合成肽类、肽模拟物或肽片段。例如，例如可以使用巴氏消毒和纳米过滤后的人血浆衍生的C1-INH。WO2007/073186中提供了人C1-INH的氨基酸序列的实例(参见WO2007/073186中的SEQIDNO：1)。对于有关C1-抑制剂的结构和功能方面的进一步公开内容，参见美国专利US4,915,945；美国专利US5,939,389；美国专利US6,248,365；美国专利US7,053,176；和WO2007/073186，上述文献以其完整的形式并入本文参考。
在不同的实施方案中，用于本文公开的方法和组合物的C1-抑制剂可以根据本领域技术人员公知的方法生产，例如以生产重组C1-INH。例如，用于为治疗目的生产C1-抑制剂的方法公开在美国专利US4,915,945中，其公开内容以完整的形式并入本文。或者，在一些实施方案中，可以使用本领域公知的技术从天然组织来源中采集和浓缩C1-INH。在一些实施方案中，重组技术可以用于在转基因动物或细胞系中生产C1-INH，例如重组人C1-INH。包含C1-抑制剂的商购产品是，例如血浆衍生的CINRYZETM(Viropharma)、重组RUCONESTTM或RHUCINTM(均来自Pharming)和血浆衍生的(CSLBehring)。被标明用于治疗遗传性血管水肿和先天性缺乏。可以通过已知方法制备重组C1-INH。
在一些实施方案中，一种或多种血浆衍生的C1-INH(例如人血浆衍生的C1-INH)用于本文公开的组合物和方法中。在一些实施方案中，使用一种或多种重组C1-INH(例如重组人C1-INH)。在一些实施方案中，使用一种或多种血浆衍生的C1-INH(优选人血浆衍生的C1-INH)和一种或多种重组C1-INH(优选重组人C1-INH)的组合。
IV.药物组合物
在本发明的任意不同方面，所述FXII抑制剂和/或C1-INH可以具有大于80％或大于95％、96％、97％、98％或99％的纯度。在一个实施方案中，所述FXII抑制剂和/或C1-INH相对于污染的大分子例如其它蛋白质和核酸可以具有大于99.9％的药学纯的状态，并且可以不含病原体和热原体。
在一些实施方案中，药物组合物可以包含至少一种添加剂，例如填充剂、填料、缓冲剂、稳定剂或赋形剂。例如，在如下文献中描述了一些示例性的药物制剂技术：2005Physicians’DeskReference,ThomsonHealthcare:Montvale,NJ,2004；Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版,Gennado等人,Eds.LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000；Kibbe等人HandbookofPharmaceuticalExcipients,(第3版,PharmaceuticalPress),2000.)。药用添加剂包括，例如甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干燥脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。在一些实施方案中，所述药物组合物还可以包含pH缓冲试剂和湿润剂或乳化剂。在另外的实施方案中，所述组合物可以包含防腐剂和/或稳定剂。可以将药物组合物配制成冻干或稳定的可溶形式。可以通过本领域公知的各种方法冻干多肽类。
在一些实施方案中，制备用于治疗表面接触激活系统障碍的包含至少一种C1-INH的药物组合物其和/或包含至少一种FXII抑制剂的药物组合物。例如，如果提供粉末或冻干形式的C1-INH或FXII抑制剂(例如通过冷冻干燥)并且期望药物水溶液，则可以通过与药物制剂的水性成分混合溶解粉末，并且使用适合的技术搅拌，例如涡旋或温和搅拌。或者，如果期望药物水溶液且所述C1-INH或FXII抑制剂已经是水性形式，则可以在施用前直接合并所述成分。在一些实施方案中，提供冻干形式的C1-INH并且与水性FXII抑制剂组合物合并，然后施用于患者。在其它实施方案中，提供冻干形式的FXII抑制剂并且与水性C1-INH组合物合并，然后施用。在再其它实施方案中，提供冻干形式的C1-INH和FXII抑制剂并且与水性药物成分合并(例如另外的活性成分或无活性成分，例如填充剂、稳定剂、溶剂或载体)，然后施用。在其它实施方案中，提供水性形式的C1-INH和FXII抑制剂，并且可以单独施用它们，或可以将它们合并，然后施用于患者。
药物组合物的制剂可以根据预期的施用途径和其它参数的不同而改变(参见，例如Rowe等人,HandbookofPharmaceuticalExcipients,第4版,APhAPublications,2003)。在一些实施方案中，所述药物组合物可以是冻干饼状物或粉末。可以将冻干组合物重构用于通过静脉内注射施用，例如使用无菌注射用水USP。在其它实施方案中，所述组合物可以是无菌、无致热原的溶液。在其它实施方案中，所述组合物以粉末形式、丸剂或片剂递送。
可以将所述FXII抑制剂和/或所述C1-INH的制剂通过任意药学上适合的施用方式递送给患者。例如，可以通过全身、例如通过胃肠外施用所述组合物。胃肠外制剂可以通过静脉内或皮下以快速浓注形式或作为输注液、根据已知方法施用。用于胃肠外应用众所周知的优选液体载体包括无菌水、盐水、葡萄糖水溶液、糖溶液、乙醇、二醇类和油。对于全身应用，可以配制用于静脉管线或动脉管线的治疗蛋白。可以通过输注或快速浓注连续施用所述制剂。
用于口服或直肠施用的片剂和胶囊可以包含常规的赋形剂，例如粘合剂、填充剂、润滑剂或湿润剂等。口服或直肠液体制剂可以是水或油混悬液、溶液、乳剂、糖浆剂、酏剂等形式，或可以制成在使用前用水或其它媒介物重构的干燥产品。这类液体制剂可以包含常规的添加剂，例如助悬剂、乳化剂、非水媒介物和防腐剂。一些制剂包括缓释系统，例如贴剂。
还公开了用于治疗表面接触激活系统障碍的药盒。在一些实施方案中，所述药盒包含：(a)至少一种FXII抑制剂；(b)至少一种C1-INH，它们可以被包装在单独的容器中或一起混入一个容器；(c)用于治疗表面接触激活系统障碍的说明书；和任选的(d)至少另一种治疗活性成分。
药盒的成分可以包含在一个或不同容器中，例如一个或多个小瓶。所述至少一种FXII抑制剂可以是液体或固体形式(例如冻干后)。如果是液体形式，则所述至少一种FXII抑制剂可以包含添加剂，例如稳定剂和/或防腐剂，例如脯氨酸、甘氨酸或蔗糖或其它添加剂。同样，所述至少一种C1-INH可以是液体或固体形式(例如冻干后)。如果是液体形式，则C1-INH可以包含添加剂，例如稳定剂和/或防腐剂，例如脯氨酸、甘氨酸或蔗糖或其它添加剂。
在一些实施方案中，所述药盒可以包含另外的化合物，例如在施用所述至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH之前、与之同时或在其之后施用的治疗活性化合物或药物这类化合物的实例包括维生素、抗生素、抗病毒药等。在其它实施方案中，所述药盒中可以包括预以除去或抑制血块形成的化合物(例如组织型纤溶酶原激活物(tPA)、乙酰水杨酸、氯吡格雷或双嘧达莫)。
在不同的实施方案中，药盒的说明书可以包括使用该药盒成分治疗表面接触激活系统障碍的指导。该说明书还可以包含有关如何制备(例如在冷冻干燥蛋白质的情况中稀释或重构)所述至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH的信息。该说明书还可以包括有关施用剂量和/或施用频率的指导。
实施例
下列实施例用于示例、但绝不以任何方式限定本公开文本。
实施例1：通过rHA-Infestin-4和的联合和静脉内治疗在大鼠的FeCl3-诱发的动脉血栓形成中的协同抗血栓形成作用
在大鼠动脉血栓形成模型中评价使用因子XII抑制剂rHA-Infestin-4和C1-抑制剂(INH)的联合治疗作用。
治疗组如表3中所示：
表3：治疗组
1N/A＝不适用
得自CharlesRiverLaboratories的雌性CD-大鼠(7-8周)在深度麻醉状态下在t＝-5min时接受如表3中列出的单一i.v.注射治疗溶液。此后，将治疗对血栓形成阻塞的作用定量。通过将超声流量探头置于暴露的颈动脉周围来测定基线血流量。为了启动血栓形成，在t＝0min时将用35％氯化铁溶液饱和的2.5mm(1×2.5mm)滤纸贴片放置在来自流量探头的颈动脉下游上。3分钟后，取出滤纸，并且监测血流量60分钟或直到血管的血栓形成阻塞为止(即血流停止)。
图1呈现了动脉闭塞的时程以及FeCl3施用后的闭塞率。表4呈现了每个治疗组中的闭塞率(即其中观察到完全闭塞的动物数量)。
表4：治疗后的闭塞率
如表4中所示，3分钟颈动脉氯化铁损害导致10/11(91％)等渗盐水治疗的大鼠出现血栓形成阻塞(表4)。这些血管闭塞发生在32分钟内(图1)。用4mg/kgrHA-Infestin-4预治疗导致11只大鼠组中的动脉血栓形成得到部分预防(55％闭塞率)。20IU/kgC1-INH的剂量无效(即82％闭塞率)，而与4mg/kgrHA-Infestin-4组合导致动脉血栓形成基本上得到防护(20％闭塞率)。图2图示比较了每个治疗组的闭塞血管的百分比(即闭塞率)。
本研究证实如果rHA-Infestin-4(4mg/kg)与20IU/kgC1-INH联用，则可以以协同作用方式增强对动脉血栓形成的防护。
实施例2：多发性硬化鼠EAE模型
在鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)动物模型中评价使用至少一种因子XII抑制剂和至少一种C1-INH的联合治疗作用(Stüve等人,ArchNeurol.2010；67:1307-15.)。治疗组包括盐水对照组、用至少一种因子XII抑制剂治疗的组、用至少一种C1-INH治疗的组和用至少一种因子XII抑制剂和至少一种C1-INH治疗的组，任选地与用一种或多种皮质类固醇、干扰素或格拉默醋酸盐治疗的组比较。C1-INH是(CSLBehring)，且FXII抑制剂是rHA-Infestin-4或抗-FXIIa抗体3F7。
通过用200μgMOG35-55对10-12周龄雌性C57Bl/6免疫接种诱发EAE。C57Bl/6MOG35-55小鼠模型常用于治疗化合物的临床前期验证(Krishnamoorthy&Wekerle,Eur.J.Immunol2009；39:2031-35.)。在该模型中EAE的过程与MS的原发性渐进形式类似，因为一旦诱发，则该病无法缓和。给完全弗氏佐剂(CFA)补充MOG，得到1mg/ml乳剂，并且在深度麻醉小鼠的胁腹侧的2个不同部位经皮下注射2x100μl。
通过在50天时间期限内每日静脉内注射施用治疗。每日由双盲研究人员使用如下评分系统监测不同治疗组中EAE的过程：0级，无异常；1级，跛行尾尖；2级，跛行尾；3级，中度后肢虚弱；4级，完全后肢虚弱；5级，轻度轻瘫；6级，轻截瘫；7级，重度轻截瘫或截瘫；8级，四肢轻瘫；9级，四肢麻痹或濒临死亡前的状态；10级，死亡。比较50天监测期内的评分，观察横跨不同治疗组中的任何改变、累加或协同作用。50天后，处死小鼠，采集组织样品并且通过组织学评价EAE进展。
实施例3：骨骼缺血大鼠模型
在骨骼缺血大鼠模型中评价使用至少一种因子XII抑制剂和至少一种C1-INH的联合治疗作用。治疗组包括盐水对照组、用至少一种因子XII抑制剂治疗的组、用至少一种C1-INH治疗的组和用至少一种因子XII抑制剂和至少一种C1-INH治疗的组。C1-INH是(CSLBehring)，且FXII抑制剂是是rHA-Infestin-4。
麻醉雄性Wistar大鼠，并且用电动剃毛器从两后肢上完全除去肢体毛皮。将大鼠保持在加热垫上以维持体温在37℃。在麻醉诱导过后30分钟，通过夹紧股动脉将单侧后肢局部缺血诱导3小时。3小时缺血后，给肢体再灌注24小时。
免疫荧光用于定量来自闭塞和再灌注肌肉的组织样品中补体系统的不同成分和纤维蛋白/纤维蛋白原、硫酸类肝素、缓激肽受体B1和缓激肽受体B2的沉积量。用PBS洗涤组织样品，干燥印迹并且包埋在干冰上的基质(OCT,Tissuetek)中。将样品与初级抗体一起在4℃温育过夜，然后与二次抗体一起在室温温育1小时。对不同样品中的免疫荧光水平定量，观察横跨不同治疗组的任何改变、累加或协同作用。另外，根据组织样品计算组织湿/干比，以便在用于评价对肌肉活力的作用的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物,Sigma,St.Louis,USA)测定法中评价对骨骼IRI过程中水肿形成的作用。
实施例4：遗传性血管水肿的小鼠模型
在遗传性血管水肿(HAE)小鼠模型中评价使用至少一种因子XII抑制剂和至少一种C1-INH的联合治疗作用。治疗组包括盐水对照组、用至少一种因子XII抑制剂治疗的组、用至少一种C1-INH治疗的组和用至少一种因子XII抑制剂和至少一种C1-INH治疗的组，任选地与用Kunitz结构域血浆激肽释放酶抑制剂(DX88)治疗的组比较。C1-INH是(CSLBehring)，且FXII抑制剂是rHA-Infestin-4或抗-FXIIa抗体3F7。
得到小鼠，其中生理性C1-INH未被表达(Han等人,J.Clin.Invest.109:1057-1063(2002))，并且测试其HAE症状。给小鼠施用治疗，然后在施用后将伊文思蓝染料(在100μlPBS中30mg/kg；SigmaChemicalCo.,St.Louis,Missouri,USA)注入尾静脉。在注射染料后30分钟取组织样品。通过对染料从脉管系统外渗的程度定量来测定血管通透性，观察横跨不同治疗组的任何改变、累加或协同作用。或者，其它C1-INH-缺乏小鼠(Oschatz等人,Immunity34:258-268(2011))可以用于效能研究。此外，在用研究药物治疗后，可以局部或通过静脉内施加不同的引发水肿的刺激物，然后评价水肿形成或通过静脉内施用示踪物监测的血管通透性增加。
上述实施例预以示例、但绝不以任何方式限定本公开文本。所公开的组合物和方法的其它实施方案对于本领域技术人员而言从本说明书的考量和本文公开的组合物和方法的实施中显而易见。

Claims (26)

1.组合物，包含有效量的至少一种因子XII(FXII)抑制剂和至少一种C1-抑制剂(C1-INH)，该组合物用于治疗选自血栓形成病症、间质性肺病症、纤维增生病症、特发性肺纤维化、神经炎症性疾病、与激肽形成相关的病症,补体激活系统障碍和缺血性再灌注损伤(IRI)的表面接触激活系统障碍，其中所述FXII抑制剂不是C1INH。
2.组合物，包含有效量的至少一种因子XII(FXII)抑制剂和至少一种C1-抑制剂(C1-INH)，该组合物用于治疗选自血栓形成病症、间质性肺病症、纤维增生性病症、特发性肺纤维化、神经炎症性疾病、与激肽形成相关的病症、补体激活系统障碍和缺血性再灌注损伤(IRI)的障碍，其中所述FXII抑制剂不是C1INH。
3.权利要求1或2所用的组合物，其中所述障碍是血栓形成病症和静脉、动脉或毛细管血栓、心脏中的血栓形成、慢性或急性血栓栓塞、血液接触人造表面过程中或之后的血栓、脊髓损伤、外伤性脑损伤、继发性脑水肿或中枢神经系统水肿。
4.权利要求3所用的组合物，其中所述血栓形成病症是静脉、动脉或毛细管血栓，并且是中风、心肌梗死、深静脉血栓形成(DVT)、门静脉血栓形成、血栓栓塞、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、大脑静脉窦血栓形成、巴-希二氏综合征、培基特-施罗特二氏病或无症状性脑缺血。
5.权利要求1或2所用的组合物，其中所述病症是与激肽形成相关的病症，并且是遗传性血管水肿(HAE)、继发性脑水肿、中枢神经系统水肿、低血压性休克或血液接触人造表面过程中或之后的水肿。
6.权利要求1或2所用的组合物，其中所述病症是神经炎症性疾病，并且是脊髓损伤、外伤性脑损伤、多发性硬化、横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎(德维克病)、继发性脑水肿或中枢神经系统水肿。
7.权利要求1或2所用的组合物，其中所述病症是局部或远端IRI，特别是影响肺、心脏、脑、肾、肠、胰腺、肝或四肢的远端IRI；或在无治疗的存在下导致多器官功能不全综合征(MODS)或全身性炎性反应综合征(SIRS)。
8.权利要求1或2所用的组合物，其中所述病症是因外科手术、特别是血管外科手术、心脏外科手术、神经外科手术、创伤外科手术、癌症外科手术、矫形外科手术、移植、微创伤手术或插入用于递送药理学活性物质或机械方式除去完全或部分阻塞的装置导致的IRI。
9.权利要求1-8任一项所用的组合物，其中所述至少一种FXII抑制剂包含：
(i)野生型Infestin-4多肽序列(SEQIDNO:1)或包含如下的多肽序列：
(a)为包含SEQIDNO:1的N-末端2-13位氨基酸以外的1-5个氨基酸突变而修饰的SEQIDNO:1；和/或
(b)与SEQIDNO:1具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同源性和保留来自SEQIDNO:1的6个保守半胱氨酸残基；
(ii)野生型SPINK-1多肽序列(SEQIDNO:2)或包含如下的多肽序列：
(a)用SEQIDNO:1的N-末端2-13位氨基酸替代N-末端2-13位氨基酸而突变的和任选为包含增加多肽序列与SEQIDNO:1的序列的同源性的1-5个另外的氨基酸突变而修饰的SEQIDNO:2；和/或
(b)与SEQIDNO:2具有至少70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同源性和保留来自SEQIDNO:2的6个保守半胱氨酸残基；
(iii)SPINK-1突变体K1、K2或K3(SEQIDNOS:3、4或5)之一；和/或
(iv)抗-FXII抗体。
10.权利要求9所用的组合物，其中所述抗-FXII抗体包含：
(i)(a)VH区，其包含如SEQIDNO:8中列出的重链CDR1、如SEQIDNO:10中列出的重链CDR2和如SEQIDNO:12中列出的重链CDR3；和/或
(b)VL区，其包含如SEQIDNO:13中列出的轻链CDR1、如SEQIDNO:14中列出的轻链CDR2和如SEQIDNO:16中列出的轻链CDR3；或
(ii)(a)VH区，其包含如SEQIDNO:8中列出的重链CDR1、如SEQIDNO:9中列出的重链CDR2和如SEQIDNO:11中列出的重链CDR3；和/或
(b)VL区，其包含如SEQIDNO:13中列出的轻链CDR1、如SEQIDNO:14中列出的轻链CDR2和如SEQIDNO:15中列出的轻链CDR3；或
(iii)包含SEQIDNO:6的VH区和包含SEQIDNO:7的VL区。
11.权利要求9-10任一项的方法，其中所述抗-FXII抗体是IgG抗体。
12.权利要求1-9任一项所用的组合物，其中所述至少一种FXII抑制剂与包含PEG或增加半衰期的多肽的融合配偶体连接，所述增加半衰期的多肽选自白蛋白、afamin、甲胎蛋白、维生素D结合蛋白、人白蛋白、免疫球蛋白和IgG的Fc。
13.权利要求12所用的组合物，其中增加半衰期的多肽通过连接体连接至FXII抑制剂。
14.权利要求12-13任一项所用的组合物，其中所述至少一种FXII抑制剂是融合蛋白，该融合蛋白包含通过连接肽连接至FXII抑制剂的人白蛋白。
15.权利要求1-14任一项所用的组合物，其中在患者发生表面接触激活系统障碍后施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH。
16.权利要求1-15任一项所用的组合物，其中以如下方式施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH：(i)作为注射剂或输注液以单剂量；(ii)各自作为注射剂或输注液以多剂量；或(iii)作为连续输注或施用。
17.权利要求16所用的组合物，其中通过静脉内施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH。
18.权利要求1-17任一项所用的组合物，其中同时施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH；
或其中依次施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH，其中首先施用所述FXII抑制剂或首先施用所述C1-INH。
19.权利要求18所用的组合物，其中在所述至少一种FXII抑制剂之后即刻施用所述至少一种C1-INH或所述至少一种FXII抑制剂后至多约10分钟施用所述至少一种C1-INH；
或其中在所述至少一种C1-INH之后即刻施用所述至少一种FXII抑制剂或所述至少一种C1-INH之后至多约10分钟施用所述至少一种FXII抑制剂。
20.权利要求1-19任一项所用的组合物，其中所述至少一种FXII抑制剂的施用浓度为约0.01－约1000mg/kg体重或约1－约500mg/kg；和/或所述至少一种C1-INH的施用浓度为约0.01IU/kg－约5000IU/kg体重或约5－约500IU/kg。
21.权利要求1-20任一项所用的组合物，其中在表面接触激活系统障碍开始发作或发作后即刻或之后至多1小时、6小时、12小时、1天、3天、5天或10天施用所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH。
22.权利要求21所用的组合物，其中将所述至少一种FXII抑制剂和所述至少一种C1-INH施用至少2次、至少3次或至少5次。
23.权利要求1-22任一项所用的组合物，其中所述至少一种C1-INH是血浆衍生的C1-抑制剂和/或重组C1-抑制剂，特别地所述至少一种C1-INH与天然存在的人蛋白质相同或是其功能变体。
24.权利要求23所用的组合物，其中所述至少一种C1-INH是血浆衍生的人C1酯酶抑制剂和/或重组人C1酯酶抑制剂。
25.用于治疗表面接触激活障碍的药盒，包含：
(a)至少一种FXII抑制剂；
(b)至少一种C1-INH；
(c)使用所述药盒治疗表面接触激活系统障碍的说明书；和
(d)任选的至少另外的一种治疗活性化合物或药物，
其中将至少一种FXII抑制剂和至少一种C1-INH配置在单独的容器中或将它们彼此混合在单一容器中，且其中所述FXII抑制剂不是C1-INH。
26.权利要求25的药盒，其中所述另一种治疗活性化合物或药物是肝素、乙酰水杨酸、氯吡格雷或双嘧达莫。
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