JPH11209399A

JPH11209399A - 高比重リポ蛋白質を有効成分とする医薬組成物

Info

Publication number: JPH11209399A
Application number: JP10146860A
Authority: JP
Inventors: Yoji Ishida; 陽司石田; Hiroki Shigematsu; 弘樹重松; Kazuo Yano; 和雄矢野
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-05-28
Publication date: 1999-08-03

Abstract

(57)【要約】【解決手段】巨核球胞体突起形成活性を有する高比重
リポ蛋白質が、下記の性質を有する医薬組成物。（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で亜鉛キ
レーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。【効果】即効的、且つ効率的な血小板産生能を示し、
血小板減少症治療剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高比重リポ蛋白質を有
効成分とする医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】造血組織は生体内の中で最も活発に新生
と崩壊を繰り返している組織の一つである。多数の血球
成分が日々産生され、傍らでは機能を果たした血球は死
滅していく。このような激しい細胞の交換にもかかわら
ず、各血球は過不足がなく、恒常性が保たれている。こ
うした血球数の調節は、造血細胞の増殖、分化、成熟に
多数の造血因子が作用することにより行われていると考
えられる。即ち、赤血球を増加させる因子としてはＥＰ
Ｏ⁽¹⁾が、白血球を増加させる因子としてはコロニー刺
激因子⁽²⁾が、血小板を増加させる因子としてはトロン
ボポエチンが作用していると考えられている。

【０００３】血小板は血液幹細胞から巨核球前駆細胞を
へて分化、成熟した巨核球より血中に放出されることは
知られているが、この血小板の産生過程において特異的
に作用する因子はこれまで知られてなかった。１９９４
年に血小板減少症動物からｍｐｌリガンドが精製され、
ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏの検討からトロン
ボポエチン＝ｍｐｌリガンドと考えられるようになった
⁽³⁾⁽⁴⁾。

【０００４】すなわちｍｐｌリガンドは、巨核球前駆細
胞数を増加させる巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−Ｃ
ＳＦ）活性及び巨核球を成熟させる巨核球増幅因子（Ｍ
ｅｇ−ＰＯＴ）活性を単独で有することが明らかにされ
た。しかし生体内で成熟した巨核球からの血小板の放出
にｍｐｌリガンドが直接作用しているという証拠はな
い。成熟巨核球からの血小板の放出を反映すると思われ
るｉｎｖｉｔｒｏの系として、精製巨核球の胞体突起
形成能を観察する方法が知られているが⁽⁵⁾、ｍｐｌリ
ガンドが単独で胞体突起形成を促進するという報告はこ
れまでになく、最近ではｍｐｌリガンドは巨核球胞体突
起形成活性を有さないと考えられるようになった⁽⁶⁾。

【０００５】従来、巨核球胞体突起形成活性を有する因
子としては、ＩＬ−６とＥＰＯが知られているが、その
活性は弱く、巨核球に特異的に作用する因子ではないこ
とが知られている⁽⁷⁾。

【０００６】高比重リポ蛋白質は血中に存在する血清リ
ポ蛋白質の一種で、脂質（リン脂質、遊離コレステロー
ル、コレステロールエステル、トリグリセリド）と蛋白
質とで構成される。主な構成蛋白質はアポリポプロテイ
ンＡ−Ｉで全蛋白質の約７０％、次にアポリポプロテイ
ンＡ−ＩＩが約２０％を占める⁽⁸⁾。また高比重リポ蛋
白質の作用としては、末梢組織に蓄積された余剰のコレ
ステロールを抜き出し、肝臓に運んで処理するコレステ
ロールの逆転送経路に関与し、動脈硬化防御機構におい
て重要な役割を演じていると考えられている⁽⁹⁾。

【０００７】さらに最近では、ステロイドホルモン合成
の材料となるコレステロールを副腎に供給する作用があ
ることが示されている⁽¹⁰⁾。しかし高比重リポ蛋白質が
血小板造血に与える影響に関してはこれまで全く報告が
ない。

【０００８】一方、アンチトロンビンＩＩＩは、通常血
漿中に約１５０ｍｇ／Ｌ存在する糖蛋白質で、広くトリ
プシン型セリンプロテアーゼを阻害する活性を有し、ト
ロンビンやＸa 因子等の凝固因子セリンプロテアーゼの
活性を阻害することで、血液凝固の制御因子として重要
であることが知られている。またＣ１インヒビターは、
血漿中に２５０ｍｇ／Ｌ存在する糖蛋白質で、生理機能
としては、補体系のプロテアーゼであるＣ１ｒとＣ１ｓ
の制御だけでなく、ＸＩＩａ因子や血漿カリクレインの
制御因子として重要である⁽¹¹⁾。このようにアンチトロ
ンビンＩＩＩ及びＣ１インヒビターは、血液凝固の制御
因子として知られてはいるが、その血小板造血に与える
影響に関してはこれまで全く報告がない。

【０００９】〔（１）平嶋邦猛，臨床透析，５，８９
１，１９８９（２）Ｄｏｎａｈｕｅ，Ｒ．Ｅ．ｅｔａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１，１８２０，１９８８
（３）ＦｒｅｄｅｒｉｃＪ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３６９，５３３，１９９４（４）Ｋａｕｓｈａ
ｎｓｋｙＫ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６９，
５６８，１９９４（５）長澤俊郎，血栓止血誌，６，２
７，１９９５（６）Ｎａｇａｈｉｓａ，Ｈ．ｅｔａ
ｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８７，１３０９，１９９６（７）Ｅ
ｍｉ，Ａｎ．ｅｔａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２２，１４９，１９９４
（８）血漿リポタンパク，講談社，１９８３（９）最新
内科学大系，第３６巻，動脈硬化と脈管疾患，中山書
店，１９９１（１０）Ｒｉｇｏｔｔｉ，Ａ．，ｅｔａ
ｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，３３５４５，１９９６
（１１）松田道生，止血・血栓・線溶，中外医学社，１
９９４〕

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】上述したようにｍｐｌ
リガンドは巨核球の増殖及び成熟を促進するため血小板
産生剤の候補の１つとして挙げられるが、ヒトに対する
血小板産生剤としてどれほど有効であるかは不明であ
る。化学療法後あるいは骨髄移植後等の血小板減少症を
改善する良い薬剤が無い現在では、ｍｐｌリガンド以外
の新たな血小板産生を促進させる因子の開発が待ち望ま
れている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】血小板産生過程は大きく
分けて、次の３段階からなることが知られている。すな
わち第１段階が巨核球前駆細胞の増殖、第２段階が巨核
球の成熟、第３段階が成熟巨核球から血小板の放出であ
る。本発明者らは血小板造血の第１段階から第２段階ま
ではｍｐｌリガンドが作用し、第３段階には血漿中の未
知の因子が作用すると予想した。したがって、血小板産
生の第３段階に作用する因子は、第１、２段階に作用す
るｍｐｌリガンドよりもヒトに投与してから血小板数が
増加するまでの期間が短く、医薬品として有望であると
考えた。

【００１２】そこで特異的に且つ強力に巨核球からの血
小板放出を促進する作用を有する新規な血小板産生因子
を見いだすべく鋭意研究を重ねた。その結果、ゲル濾
過、亜鉛キレーティングカラムクロマト及び超遠心を行
うことにより、血小板産生の第３段階に作用する高比重
リポ蛋白質を取得することに成功した。さらにマウスに
該画分を投与することにより血小板が増加することを確
認した。さらに該画分の血小板産生作用を発揮させる物
質を特定すべく、該画分を脱脂し、ゲル濾過、イオン交
換カラムクロマト、ヘパリンカラムクロマト、ゲル濾過
と精製を進めた。

【００１３】その結果、アンチトロンビンＩＩＩとＣ１
インヒビター、又はそれらのホモログタンパク質と考え
られる物質が、該画分の血小板産生活性において重要な
因子であることがわかった。さらに活性が弱い市販の高
比重リポ蛋白質とアンチトロンビンＩＩＩ、Ｃ１インヒ
ビターをインキュベーションすることにより、血小板産
生活性が劇的に上昇することを明らかにした。このアン
チトロンビンＩＩＩ及びＣ１インヒビターを含む高比重
リポ蛋白質は、これまで知られていない画分である。

【００１４】本発明は、これらの知見に基づいて完成さ
れたものである。すなわち本発明は、巨核球胞体突起形
成活性を有する高比重リポ蛋白質を有効成分とする医薬
組成物である。高比重リポ蛋白質は、通常比重がｄ＝
１．２１以下で、分子量はおよそ１５０ｋｄ〜３６０ｋ
ｄ、その主な構成蛋白質はアポリポプロテインＡ−Ｉ及
びアポリポプロテインＡ−ＩＩであるリポ蛋白質であ
り、他の血清リポ蛋白質とは比重、分子量、及び構成蛋
白質によって区別することが可能である。またこの比重
は通常ｄ＝１．０６３〜１．２１の範囲になると言われ
ている（血漿リポタンパク，講談社，１９８３）。

【００１５】本発明の医薬組成物において、有効成分で
ある高比重リポ蛋白質は、巨核球胞体突起形成活性を有
するものであれば特に限定されず、好ましくは亜鉛キレ
ーティングゲルに非吸着の高比重リポ蛋白質、さらに好
ましくはアンチトロンビンＩＩＩ含有の高比重リポ蛋白
質が挙げられる。さらには、Ｃ１インヒビター含有の高
比重リポ蛋白質及び、アンチトロンビンＩＩＩとＣ１イ
ンヒビター含有の高比重リポ蛋白質が好ましい例として
挙げられる。

【００１６】この亜鉛キレーティングゲルに非吸着の高
比重リポ蛋白質、アンチトロンビンＩＩＩ及びＣ１イン
ヒビター含有の高比重リポ蛋白質は、従来知られていな
い画分であり、特にこの画分の巨核球胞体突起形成活性
を有する高比重リポ蛋白質が血小板産生に関与する作用
を有することについては全く知られていなかった。また
本発明の医薬組成物は、下記の性質を有することを特徴
とする巨核球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白
質を有効成分とする医薬組成物が好ましい例として挙げ
られる。

【００１７】（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４
の１０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条
件下で亜鉛キレーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。

【００１８】さらに好ましい例として下記の性質を有す
ることを特徴とする巨核球胞体突起形成活性を有する高
比重リポ蛋白質を有効成分とする医薬組成物が挙げられ
る。（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で亜鉛キ
レーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。（ｆ）構成蛋白質としてアンチトロンビンＩＩＩを含
む。（ｇ）構成蛋白質としてＣ１インヒビターを含む。

【００１９】また本発明の高比重リポ蛋白質は、巨核球
胞体突起形成活性を有する限り、従来公知の方法、即ち
超遠心法等のように高比重リポ蛋白質を製造する際に通
常用いられる方法で製造したものであっても特に限定は
されないが、下記の原料及び製造方法により取得され得
る高比重リポ蛋白質であることが好ましい。

【００２０】本発明の巨核球胞体突起形成活性を有する
高比重リポ蛋白質を製造するに際して用いる原料として
は、本発明の巨核球胞体突起形成活性を有する高比重リ
ポ蛋白質が含有されるものであれば特に限定されない
が、例えば哺乳動物の血液、好ましくはヒト血液が挙げ
られる。血液としては、全血であっても許容されるが、
通常は、血漿または血清が好ましく、特に血漿が好まし
い例として挙げられる。

【００２１】上記の血液を採取する哺乳動物、好ましく
はヒトは、血小板が減少した個体、例えば、再生不良性
貧血患者（ＡＡ）や、特発性血小板減少性紫斑病患者
（ＩＴＰ）であってもよいが、正常の個体、健常人を用
いることも好ましい。また各種の血液成分を取得した残
余の血液を原料として利用することも好ましい。

【００２２】通常前記原料は、精製の最初の段階におい
て、熱処理及び酸処理することが好ましい。原料が血漿
の場合、熱処理により不純物を沈殿除去することがで
き、酸処理により巨核球からの血小板放出を抑制する物
質を失活させることができ、さらに不純物を沈殿除去す
ることが可能である。熱処理は、不純物を沈殿させるこ
とができ、本発明の活性を失活させない条件であれば特
に限定はされないが、６０℃で１０分間の熱処理が好ま
しい。

【００２３】また酸処理は、種々の塩濃度やｐＨで適当
な時間行なうことが可能であるが、低塩濃度でｐＨ４．
５程度が好ましい。例えばｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液に２４〜３６時間、透析する方法が挙げ
られる。熱処理と酸処理の順番がどちらが先でも可能で
あるが、好ましくは原料を熱処理した後に遠心分離によ
り上清を採取し、それを酸処理した後に遠心分離により
上清を採取する。得られた上清はｐＨ７．０−８．０の
適当な緩衝液、例えば、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に透析す
ることが好ましい。

【００２４】前記熱、酸処理原料からの本発明の高比重
リポ蛋白質の分離・精製方法としては、ゲル濾過、亜鉛
キレーティングゲル、超遠心を用いることが好ましく、
これらを用いることにより効率よく本発明の巨核球胞体
突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質を精製できる。
これらの使用する順番は特には問わないが、亜鉛キレー
ティングゲルを用いることが特に好ましい。また通常、
ゲル濾過、亜鉛キレーティングゲル、超遠心の順番で使
用するほうが操作上好ましい。

【００２５】ゲル濾過による精製工程は、原料、好まし
くは、熱、酸処理原料をｐＨ７．０−８．０の適当な緩
衝液、例えば、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ
７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条件下で適当なゲ
ルを用いてゲル濾過する方法である。ゲル濾過に用いる
ゲルとしては、セルロース、アガロース、デキストラ
ン、ポリアクリルアミド等、一般にゲル濾過に用いられ
る材質であれば特に限定はしない。分画分子量範囲は、
分子量４０万程度を分画できるものが好ましい。例えば
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（スウェーデン、ファルマシ
ア社）やＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲ（スウェ
ーデン、ファルマシア社）が挙げられる。

【００２６】亜鉛キレーティングゲルによる精製工程
は、原料、好ましくは、熱、酸処理原料をｐＨ７．０−
８．０の適当な緩衝液、例えば、１５０ｍＭの塩化ナト
リウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液
条件下で亜鉛キレーティングゲルに接触せしめ、非吸着
物を採取する方法である。亜鉛キレーティングゲルは、
金属とキレートを形成する物質、例えばイミノジ酢酸を
共有結合させたゲルに亜鉛をキレートさせて用いると好
適である。

【００２７】ゲルの材質は、セルロース、アガロース、
デキストラン、ポリアクリルアミド等、一般的に用いら
れる材質であれば特に限定しない。キレートさせる亜鉛
イオンの量は特に限定しないが、ゲル１ｍｌ当たり１０
〜３０μｍｏｌｅが好ましい。イミノジ酢酸を共有結合
させたゲルとしては、ＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅＨＰ（スウェーデン、ファルマシア社）等が
市販されており、これを利用すると簡便である。

【００２８】イミノジ酢酸を共有結合させたゲルに亜鉛
イオンをキレートさせる方法は、適当な濃度の亜鉛イオ
ンを含む溶液をゲルに接触させる方法が挙げられる。例
えば、ゲル体積の４倍量の１０ｍＭの硫酸亜鉛溶液中で
ゲルを撹拌する方法、好ましくはゲルを適当なカラムに
詰めて、ゲル体積の４倍量の１０ｍＭの硫酸亜鉛溶液を
流す方法が挙げられる。亜鉛キレーティングゲルを使用
する際は、バッチ法により非吸着物を採取してもよい
が、カラムクロマトグラフィーとなすと、操作、効率に
おいて好ましく、本発明品は非吸着画分に分画される。

【００２９】超遠心による精製工程は、熱、酸処理原料
を適当な比重に調製し、例えば、塩化ナトリウム及び臭
化カリウムを添加することにより比重をｄ＝１．２１に
調製し、適当な条件、例えば１２℃、１００，０００ｇ
で４８時間超遠心する方法である。超遠心の際に用いる
機器は、温度コントロールが可能で、１００，０００ｇ
をかけられるものであれば特に限定はしない。例えば遠
心機はＬ８−８０Ｍ型（米国、ベックマン）、ローター
はＳＷ２８型（米国、ベックマン）が挙げられる。

【００３０】ゲル濾過、亜鉛キレーティングゲル、超遠
心による精製工程の好ましい例を示すと、熱、酸処理原
料にｐＨ７．０−８．０の適当な緩衝液、例えば、１５
０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下でゲル濾過し、巨核球胞体突起
形成活性を有する画分を採取し、該画分にｐＨ７．０−
８．０の適当な緩衝液、例えば、１５０ｍＭの塩化ナト
リウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液
条件下で亜鉛キレーティングゲルを接触せしめ、非吸着
物を適当な比重に調製し、例えば、塩化ナトリウム及び
臭化カリウムにより比重をｄ＝１．２１に調製し、適当
な条件、例えば１２℃、１００，０００ｇで４８時間超
遠心し、液面に分画される該高比重リポ蛋白質を採取す
る方法である。

【００３１】試料の緩衝液組成を変える場合は、透析法
を用いるが、使用する透析膜は再生セルロースやセルロ
ースエステル等一般に用いられる材質なら特定はしな
い。分画分子量は１００００以下の物を使用するのが好
ましい。透析に際しては、透析する試料の１００倍以上
の透析外液に対して８時間以上透析することが好まし
く、透析外液は最低１回は変えるほうが良い。試料の濃
縮には低分子塩類を除去できる限外濾過膜等を用いるこ
とができるが、その材質はポリスルホンやポリアクリロ
ニトリル等一般に蛋白の濃縮に用いられる材質なら特定
はしない。分画分子量は１００００以下の物を使用する
のが好ましい。

【００３２】また本発明の製造方法においては、通常使
用される方法、例えば、担体による吸着法、塩析法、電
気泳動法、およびイオン交換、ゲル濾過、適当なリガン
ドへのアフィニティーを応用した各種のクロマトグラフ
ィー法等を単独で、または組み合わせて使用できる。す
なわち、これらの公知の方法において、巨核球胞体突起
形成活性を有する画分を追究することにより精製するこ
とができる。

【００３３】クロマトグラフィー法として、好ましく
は、カルボキシメチル（ＣＭ）基を結合させた担体を用
いるＣＭカラムクロマトグラフィー、第４級アミノエチ
ル基（Ｑ）を結合させた担体を用いるＱカラムクロマト
グラフィー、架橋したデキストランゲル等の粒子を用い
るゲル濾過カラムクロマトグラフィー、フェニル基やブ
チル基を結合させた担体を用いる疎水性カラムクロマト
グラフィー、銅イオンやニッケルイオンを結合させたキ
レーティングカラムクロマトグラフィー、ブルー色素
（１−ａｍｉｎｏ−４−［［４−［［４−ｃｈｌｏｒｏ
−６−［（２−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］
−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ］ａｍｉｎ
ｏ］−３−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−
９，１０−ｄｉｈｙｄｒｏ−９，１０−ｄｉｏｘｏ−２
−ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）
等、該発明の高比重リポ蛋白質に親和性がある物質を結
合させた担体を用いるアフィニティーカラムクロマトグ
ラフィーを使用できる。

【００３４】本発明の製造方法においては、上記の精製
工程の順番は特に限定されないが、特に好ましい具体的
な製造例を挙げると以下の通りである。原料として血
漿、好ましくはヒトの血漿を用い、６０℃で１０分間熱
処理して得られた上清をさらにｐＨ４．５の適当な緩衝
液、例えば１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液に透析す
る。沈殿を除去した後にｐＨ７．０ー８．０の適当な緩
衝液、例えば１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．
４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に透析する。次に同緩
衝液で平衡化した適当なゲル濾過カラム例えばＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲ（スウェーデン、ファルマ
シア社）を用いて分子量分画する。

【００３５】巨核球胞体突起形成活性を有する画分を、
そのままｐＨ７．０−８．０の適当な緩衝液、例えば１
５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化した亜鉛イオンキレーティン
グゲル、例えば亜鉛イオンをキレーティングさせたＣｈ
ｅｌａｔｉｎｇＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ（スウェー
デン、ファルマシア社）カラムにアプライし、同緩衝液
で十分にカラムを洗浄して非吸着画分を得る。

【００３６】非吸着画分を限外濾過膜等により適当な濃
度、好ましくは２−１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、塩化ナ
トリウム及び臭化カリウムを添加して比重をｄ＝１．２
１に調製し、適当な条件、例えば１２℃、１００，００
０ｇで４８時間超遠心する。液面に浮上してきた黄色の
高比重リポ蛋白質をピペットを用いて採取し、ｐＨ７．
０−８．０の適当な緩衝液、例えば１５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液
に透析する。

【００３７】このようにして得られる巨核球胞体突起形
成活性を有する高比重リポ蛋白質は、血小板産生能を有
するものである。生体由来であることから判断できる通
り、本発明の高比重リポ蛋白質は、毒性が少ないことが
確認される。例えばマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを
５日間連続皮下投与した場合に、死亡することもなく、
また特別な副作用も認められなかった。

【００３８】本発明によれば、巨核球胞体突起形成活性
を有する高比重リポ蛋白質を脱脂し、さらに精製を進め
るとアンチトロンビンＩＩＩ又はそのホモログ蛋白質、
及びＣ１インヒビター又はそのホモログ蛋白質が単離さ
れた。公知の高比重リポ蛋白質は、通常、巨核球胞体突
起形成活性を有さないか、又は少なくとも殆どその活性
を有さないことが多いと推測される。

【００３９】このアンチトロンビンＩＩＩ（又はそのホ
モログ蛋白質）、及び／又はＣ１インヒビター（又はそ
のホモログ蛋白質）と、巨核球胞体突起形成活性を有さ
ない、又極めて活性の低い公知の高比重リポ蛋白質と
を、混合してインキュベーションすることにより、巨核
球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質を製造す
ることができる。アンチトロンビンＩＩＩとＣ１インヒ
ビターは、巨核球胞体突起形成活性を有する高比重リポ
蛋白質を、例えば、体積比３：２の冷エタノール−エー
テル溶液で脱脂する。

【００４０】得られた蛋白画分を１ｍＭのコール酸ナト
リウム、６．７ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ７．４の４０
ｍＭのリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液条件下でゲル
濾過し、巨核球胞体突起形成活性を有する画分を採取
し、６Ｍの尿素を含むｐＨ７．５の２０ｍＭのＴｒｉｓ
塩酸緩衝液条件下で陰イオン交換カラムクロマトで分画
し、巨核球胞体突起形成活性を有する画分をｐＨ７．４
の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条件下でヘパリンカラム
クロマトで分画し、巨核球胞体突起形成活性を有する画
分を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１
０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条件下でゲル濾過することに
より２本の蛋白ピークとして精製できるが、市販のアン
チトロンビンＩＩＩやＣ１インヒビターを添加混合する
こともできる。

【００４１】こうして製造された巨核球胞体突起形成活
性を有する高比重リポ蛋白質は、これまで知られていな
い新規組成物であると信じられ、また少なくとも、血小
板産生増多剤を典型的な例とする医薬組成物としての用
途については従来全く知られていなかった。また、本発
明により、Ｃ１インヒビターは単独でも巨核球胞体突起
形成活性を有することが確認されたが、このＣ１インヒ
ビターはもとともヒト由来成分であり、しかもヒトの血
中濃度が２５０ｍｇ／Ｌと高いことから判断できるよう
にヒトに投与しても毒性が少ない医薬組成物となり得、
上述のマウスの実験によっても証明される。

【００４２】該高比重リポ蛋白質及びＣ１インヒビター
は、巨核球の胞体突起形成を促進する研究用試薬とし
て、また該高比重リポ蛋白質及びＣ１インヒビター単独
で、あるいは有効量の該高比重リポ蛋白質及びＣ１イン
ヒビターに、薬学上許容される担体、例えば希釈液、賦
形剤、増粘剤、ｐＨ調製剤等を添加して適当な剤形と
し、医薬組成物として使用することができる。すなわち
本発明は有効量の前記高比重リポ蛋白質、Ｃ１インヒビ
ター及び薬学上許容される担体を含有することを特徴と
する医薬組成物である。

【００４３】本発明の医薬組成物は、例えば、血小板産
生を促進するための薬剤として有用である。すなわち、
ある種の血小板減少症、例えば抗癌剤投与後の血小板減
少症、放射線治療後の血小板減少症、造血因子欠損によ
る血小板減少症、再生不良性貧血の血小板減少症、骨髄
異形成症侯群の血小板減少症、自己免疫疾患の血小板減
少症等の治療及び予防に有用である。

【００４４】本発明の医薬組成物は、特に好ましくは注
射剤として用いることができる。例えば、注射用蒸留
水、ブドウ糖、ショ糖、グリセリン、塩化ナトリウム、
リン酸ナトリウム等の希釈液、増粘剤、等張剤、ｐＨ調
整剤等を加えることができる。本発明の高比重リポ蛋白
質及びＣ１インヒビターの成人１回当りの投与量は、年
齢、性別、体重、症状などによって異なるが、一般に１
μｇ〜１ｇであり、１日当り１回または必要に応じて数
回投与することができる。

【００４５】本発明をより詳細に記述するために、参考
例及び実施例により説明するが、本発明はこれらの実施
例に限定されるものではない。

【参考例】巨核球胞体突起形成活性の測定法マウス骨髄細胞をｍｐｌリガンド存在下で培養すること
により誘導した巨核球を用いて、巨核球からの血小板放
出を反映すると考えられる巨核球胞体突起形成活性を測
定する。

【００４６】以下のＩＭＤＭ液（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓｍ
ｏｄｅｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤａｌｌｂｅｃｃｏ’
ｓｍｅｄｉｕｍ）は粉末ＩＭＤＭ（１リットル用）
（米国、ギブコ社）に重曹３．０２４ｇを加え、１リッ
トルにメスアップし、更に５０ＩＵ／ｍｌペニシリン及
び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（いずれも米国、
フローラボラトリーズ社）を加えて調製したものであ
る。

【００４７】また、巨核球誘導培地として１０μｇ／ｍ
ｌウシ由来インシュリン（ギブコ社）、５μｇ／ｍｌウ
シ由来ホロタイプトランスフェリン（ギブコ社）、
０．３ｎｇ／ｍｌのヒト組換え型ｍｐｌリガンド（英
国、ペプロテック社）を含むＩＭＤＭ液を、巨核球胞体
突起形成培地として、１０μｇ／ｍｌウシ由来インシュ
リン（ギブコ社）、５μｇ／ｍｌウシ由来ホロタイプ
トランスフェリン（ギブコ社）、１０ｎｇ／ｍｌヒト組
換え型ＩＬ−６（米国、アップステートバイオテクノロ
ジー社）、２０μＭ硫酸亜鉛を含むＩＭＤＭ液を用い
る。

【００４８】６〜１０週齢のｄｄＹマウス（雄）８匹の
大腿骨を採取し、その両端を切断し、ｐＨ７．４の１ｍ
Ｍエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（ＥＤＴＡ）を
含むカルシウム、マグネシウム不含ハンクス液（米国、
シグマ社）２０ｍｌをいれたプラスチック注射器（２２
Ｇ針）を用いて、１００ｍｍプラスチックディッシュ中
に、骨髄を押し出す。

【００４９】ピペッティングにより細胞を分散した後、
１５ｍｌのチューブに移し、１００ｇで２０分間遠心す
る。沈殿性の細胞を１０ｍｌのＩＭＤＭに分散し、３５
０ｇで５分間遠心し、再び、沈殿性の細胞を１０ｍｌの
ＩＭＤＭに分散し、３５０ｇ、５分間遠心する。沈殿性
の細胞を５×１０⁶／ｍｌになるように巨核球誘導培地
に分散する。約４０ｍｌの骨髄細胞分散液が取得でき、
８個の２５ｃｍ²培養用フラスコ（米国、ベクトンディ
ッキンソン社）に５ｍｌずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ
₂の条件下で２日間培養する。

【００５０】細胞を数回のピペッティングにより分散し
た後、４本の１５ｍｌチューブに１０ｍｌずつ分注し、
１時間静置する。上部の８．５ｍｌを吸い出し、下部の
１．５ｍｌを取得し、数回のピペッティングをし、細胞
を分散する。２本の１５ｍｌチューブに下から１．５ｍ
ｌの１６％ＢＳＡを含むカルシウム、マグネシウム不含
ハンクス液（シグマ社）、３ｍｌの４％ＢＳＡを含むカ
ルシウム、マグネシウム不含ハンクス液、１．５ｍｌの
２％ＢＳＡを含むカルシウム、マグネシウム不含ハンク
ス液を重層した液に、３ｍｌの細胞分散液を重層し１時
間静置する。上部７ｍｌを吸い出し、下部２ｍｌを取得
する。

【００５１】各１５ｍｌチューブに８ｍｌのＩＭＤＭを
加え、６０ｇで５分間の遠心を行い、細胞を洗浄する。
顕微鏡観察により２０μｍ以上の大きさを持つ細胞を巨
核球として、沈殿中の巨核球数を測定し、３０００巨核
球／ｍｌになるように胞体突起形成培地に分散し、培養
用９６穴プレート（日本国、住友ベークライト社）に１
００μｌずつ分注する。

【００５２】測定すべき試料溶液（適宜の濃度に希釈す
る場合もある）を各穴当たり２０μｌ添加して２０％添
加群とする。また添加量を振るために試料溶液を各々５
μｌ、１μｌの添加群（それぞれ５％添加群、１％添加
群）を設ける。さらに、試料無添加のコントロール群を
設ける。なお、高比重リポ蛋白質を脱脂して得られた試
料及びそれを分画して得られた試料の活性を測定する場
合は、１ｍｇ／ｍｌのヘパリンを試料に添加した後に、
その試料を各穴に添加した。

【００５３】これらの添加群やコントロール群を、３７
℃、５％ＣＯ₂の条件下で２日間培養した後、顕微鏡下
で観察し、胞体突起形成を起こした巨核球の数を測定す
る。巨核球胞体突起形成活性の強さはコントロール群で
の胞体突起形成巨核球数を１００％としてその比率で表
す。

【００５４】実施例１ヒト血漿からの高比重リポ蛋白
質の精製ヒト血液に１０分の１量の３．８％クエン酸ナトリウム
水溶液を加え、１，０００ｇで２０分間遠心した後に得
られた上清を血漿とした。血漿３５０ｍｌを５００ｍｌ
のガラス製三角フラスコに入れ、湯浴で６０℃、１０分
間熱処理した。直ちに氷冷した後に、１２，０００ｇで
２０分間遠心して得られた上清をｐＨ４．５の１０ｍＭ
の酢酸ナトリウム緩衝液に透析した。透析終了後、１
２，０００ｇで２０分間遠心して得られた上清をさらに
１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭ
のＨＥＰＥＳ緩衝液に透析したものを前処理液とした。

【００５５】前処理液を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを
含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分平
衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−２００ＨＲ（スウェ
ーデン、ファルマシア社）カラム（直径１０ｃｍ×高さ
８４ｃｍ）に添加し、同緩衝液で展開した。操作はすべ
て４℃、流速は試料添加時８ｍｌ／分、展開時１３ｍｌ
／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。巨核球胞体突
起形成活性を有する精製開始後約２２０分から２７５分
までの溶出液、約７２０ｍｌを集め、粗精製品１とし
た。図１にゲル濾過カラムクロマトグラフィーの結果の
一例を示した。

【００５６】水で平衡化したＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅＨＰ（スウェーデン、ファルマシア
社）カラム（直径５ｃｍ×高さ５ｃｍ）に１０ｍＭの硫
酸亜鉛溶液を４００ｍｌ流した後、４００ｍｌの水で洗
浄することによりゲルに結合していない余分な亜鉛イオ
ンを除去した。さらに１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含
むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平
衡化した後、３６０ｍｌの粗精製品１を添加した。

【００５７】カラムに約２４０ｍｌの同緩衝液を流すこ
とにより、非吸着物を溶出した後、約４００ｍｌの５０
０ｍＭ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の５０ｍＭのエ
チレンジアミン四酢酸ナトリウム溶液で吸着物を溶出し
た。操作はすべて４℃、流速は６．２ｍｌ／分、検出は
２８０ｎｍの吸収で行った。巨核球胞体突起形成活性を
有する精製開始後約１６分から８８分までの溶出液、約
４５０ｍｌを集めた。残りの粗精製品１、３６０ｍｌに
ついても同様の操作を行ない、得られた約９００ｍｌの
溶出液を粗精製品２とした。図２に亜鉛キレーティング
カラムクロマトグラフィーの結果の一例を示した。

【００５８】粗精製品２を限外濾過中空糸ＳＩＰ−００
１３（日本国、旭化成工業社）で約２５ｍｌまで濃縮し
た後、１５３ｇ／ｌの塩化ナトリウムと３５４ｇ／ｌの
臭化カリウムからなる高比重水溶液を約４５ｍｌ加えて
比重をｄ＝１．２１に調製した。この溶液を２本の遠心
チューブに分け、ＳＷ２８型ローター（米国、ベックマ
ン）を用いて、１２℃、１００，０００ｇで４８時間超
遠心した。黄色の高比重リポ蛋白質は液面に浮上するの
で、超遠心終了後それぞれの遠心チューブの液面から２
０ｍｌをピペットを用いて注意深く採取した。

【００５９】この採取した分画、合せて４０ｍｌを透析
チューブに入れ、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐ
Ｈ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中にて透析し、
精製標品として得た。各精製工程における蛋白質の回収
率を下記の表１に示した。なお、各試料の蛋白質量は、
２８０ｎｍにおける紫外吸光係数Ａ２８０，１％＝１０
と仮定して算出した。

【００６０】

【表１】

【００６１】実施例２本発明の高比重リポ蛋白質の
分子量測定該精製標品について、分子量を以下の方法に従って測定
した。１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｄ
ｅｘ２００ＨＲ１０／３０（スウェーデン、ファ
ルマシア社）に１ｍｌの精製標品を添加し、同緩衝液で
展開した。操作はすべて室温、流速は０．５ｍｌ／分、
検出は２８０ｎｍの吸収で行った。なお分子量標準蛋白
質としてＬＭＷＫｉｔとＨＭＷＫｉｔのチログロ
ブリン（６６９ｋｄ）、フェリチン（４４０ｋｄ）、
カタラーゼ（２３２ｋｄ）、牛血清アルブミン（６
７ｋｄ）、（スウェーデン、ファルマシア社）を用い
た。

【００６２】分子量測定の結果を図３に示した。本発明
の高比重リポ蛋白質は、分子量３００ｋｄ±１００ｋｄ
をピークとして溶出された。したがって本発明の高比重
リポ蛋白質は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ
７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過
カラムクロマトで分子量３００ｋｄ±１００ｋｄに分画
されることがわかった。

【００６３】実施例３本発明の高比重リポ蛋白質を
構成する主蛋白質のアミノ酸配列分析１５μｇの該精製標品をマルチゲル１５／２５（日本
国、第一化学社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥした。なお
泳動緩衝液は２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、
０．１％ＳＤＳを用い、４０ｍＡの定電流で６０分間泳
動した。泳動後ゲル中の蛋白をポリビニリデンジフルオ
リド膜（米国、パーキンエルマー社）に転写した。

【００６４】なお転写用緩衝液は、１０％のメタノール
を含むｐＨ１１．０の１０ｍＭの３シクロヘキシアルミ
ノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液を用い、氷冷
下１００Ｖの定電圧で６０分間転写した。転写後、膜を
０．１％ポンソーＳで染色し、２８ｋｄのメインバンド
を切りだし、ペプチドシークエンサー解析機にてＮ末ア
ミノ酸配列を決定した。ペプチドシークエンサー解析機
は、ｍｏｄｅｌ４９２（米国、パーキンエルマー社）
を使用し、付属の取り扱い説明書に従って解析した。

【００６５】解析の結果、２８ｋｄ蛋白のＮ末はＡｓｐ
−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−のアミノ酸配列を有し、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋを検索した結果、この配列は高比重リポ蛋白質
の主構成蛋白であるアポリポプロテインＡーＩと一致し
た。この結果と該精製標品の分子量が３００ｋｄ±１０
０ｋｄであること、及び比重がｄ＝１．２１以下に分画
されることから該精製標品は高比重リポ蛋白質であるこ
とが確認された。

【００６６】実施例４本発明の高比重リポ蛋白質の
巨核球胞体突起形成活性該精製標品について、参考例に示した巨核球胞体突起形
成活性の測定法に従って測定した結果を図４に示した。
ヒトの血漿から精製した該高比重リポ蛋白質はコントロ
ールに比べ濃度依存的に巨核球の胞体突起形成を促進
し、その活性の強さは最大３００％を越えた。

【００６７】一方巨核球胞体突起形成活性を有する既知
因子のヒト組換え型ＩＬ−６（米国、アップステートバ
イオテクノロジー社）およびヒト組換え型ＥＰＯ（独
国、ベーリンガーマンハイム社）は最大でもその活性は
１５０％以下であり、本発明の高比重リポ蛋白質よりも
弱かった。ヒト組換え型ｍｐｌリガンドには、巨核球胞
体突起形成活性は認められなかった。

【００６８】本発明の高比重リポ蛋白質は、コントロー
ルに比べた巨核球胞体突起形成活性が少なくとも２００
％以上、好ましくは３００％以上の数値となりえる物質
であると判断される。

【００６９】実施例５本発明の高比重リポ蛋白質の
血小板産生能該精製標品について、血小板産生能を以下の方法に従っ
て検討した。６週齢のオスのｄｄｙマウス（日本国、日
本ＳＬＣ）に１３６ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ
７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に透析した該
精製標品と、コントロールとして同緩衝液に溶かしたヒ
ト血清アルブミン（日本国、日本赤十字社）をそれぞれ
７匹ずつ５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙと１３．３ｍｇ／ｋｇ
／ｄａｙ投与した。なお投与方法は皮下投与で、１日２
回にわけて５日間連続投与した。試料投与の前日、投与
開始後１、２、３、５、７、９日目に約７０μｌを眼底
採血し、ＣｏｕｌｔｅｒＴー５４０（米国、コールタ
ー社）により血小板数を測定した。

【００７０】試験結果として、試料投与の前日の血小板
数を１００％としたときの血小板数の変化を図５に示し
た。コントロール投与群は試験期間中ほとんど血小板数
の変化は認められなかったのに対し、該精製標品投与群
は投与後１日目から約２０％血小板数の増加が観察さ
れ、それは９日目まで継続した。なお、ｍｐｌリガンド
は投与開始後４日目程度からようやく血小板増加作用が
みられる（ＫｉｊｉＫ．ｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣ
ｅｌｌｓ，１４，６５１，１９９６）ので、本発明の高
比重リポ蛋白質は、ｍｐｌリガンドよりも早い血小板産
生効果が期待できる。また巨核球数の増加及び成熟を促
進するｍｐｌリガンドと本発明の高比重リポ蛋白質を併
用することにより、さらに強力な血小板産生効果を得ら
れることが予想される。

【００７１】実施例６本発明の高比重リポ蛋白質の
活性成分の同定本発明の高比重リポ蛋白質は、多種の蛋白質及び脂質に
より構成されているので、該精製標品について、以下の
方法に従って活性成分の同定を行った。該精製標品１２
０ｍｌを限外濾過中空糸ＳＩＰ−００１３（日本国、旭
化成工業社）で約１２ｍｌまで濃縮した後、体積比３：
２の冷エタノール・エーテル溶液５００ｍｌを加え、氷
中で１時間放置した。５，０００ｇで１０分間遠心して
得られた沈殿に、体積比３：２の冷エタノール・エーテ
ル溶液５００ｍｌを加え、氷中で１時間放置した。

【００７２】５，０００ｇで１０分間遠心して得られた
沈殿に、２０ｍｌの冷エーテルを加え、沈殿を洗浄した
後に５，０００ｇで１０分間遠心した。沈殿に窒素ガス
を吹きかけ乾燥させた後に１０ｍｌの６０ｍＭの塩化ナ
トリウム、６．７ｍＭのＥＤＴＡ、６Ｍの尿素を含むｐ
Ｈ７．４の４０ｍＭのリン酸カリウム−ナトリウム緩衝
液に溶解した。この溶液を１ｍＭのコール酸ナトリウ
ム、６．７ｍＭのＥＤＴＡ、を含むｐＨ７．４の４０ｍ
Ｍのリン酸カリウム−ナトリウム緩衝液に十分透析し、
脱脂画分とした。

【００７３】脱脂画分を１ｍＭのコール酸ナトリウム、
６．７ｍＭのＥＤＴＡ、を含むｐＨ７．４の４０ｍＭの
リン酸カリウム−ナトリウム緩衝液で十分平衡化したＳ
ｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（スウェーデン、ファルマシ
ア社）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ６０ｃｍ）に添加
し、同緩衝液で展開した。操作はすべて室温、流速は
０．５ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。巨
核球胞体突起形成活性を有する精製開始後約２８０分か
ら３５０分までの溶出液、約３５ｍｌを集め、ゲル濾過
カラムクロマト活性画分とした。図６にゲル濾過カラム
クロマトグラフィーの結果の一例を示した。

【００７４】ゲル濾過カラムクロマト活性画分を６Ｍの
尿素を含むｐＨ７．５の２０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液
で平衡化したｍｏｎｏＱ１６／１０カラム（スウェーデ
ン、ファルマシア社）に添加した。カラムに約４０ｍｌ
の同緩衝液を流すことにより、非吸着物を溶出した後、
２００ｍｌの０Ｍから０．３Ｍまでの塩化ナトリウムに
よる直線濃度勾配により吸着物を溶出した。操作はすべ
て室温、流速は５ｍｌ／分、検出は２８０ｎｍの吸収で
行った。巨核球胞体突起形成活性を有する塩化ナトリウ
ムによる溶出開始後約２５分から３１分までの溶出液、
約３０ｍｌを集め、イオン交換カラムクロマト活性画分
とした。図７にイオン交換カラムクロマトグラフィーの
結果の一例を示した。

【００７５】９ｍｌのイオン交換カラムクロマト画分を
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液に透析した
後、同緩衝液で十分に平衡化したＴＳＫｇｅｌＨｅｐ
ａｒｉｎ−５ＰＷ（日本国、東ソー、直径７．５ｍｍ×
高さ７．３ｃｍ）に添加した。カラムに１０ｍｌのｐＨ
７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を流すことによ
り、非吸着物を溶出した後、２０ｍｌの０Ｍから２Ｍま
での塩化ナトリウムによる直線濃度勾配により吸着物を
溶出した。操作はすべて室温、流速は０．５ｍｌ／分、
検出は２８０ｎｍの吸収で行った。

【００７６】巨核球胞体突起形成活性を有する精製開始
後約５４分から５５．５分までの溶出液、約０．７５ｍ
ｌを集め、ヘパリンカラムクロマト活性画分とした。図
８にヘパリンカラムクロマトグラフィーの結果の一例を
示した。０．５ｍｌのヘパリンカラムクロマト活性画分
を１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０
ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で十分に平衡化したＳｕｐｅｒ
ｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０（スウェーデン、フ
ァルマシア社）に添加し、同緩衝液で展開した。

【００７７】操作はすべて室温、流速は０．５ｍｌ／
分、検出は２８０ｎｍの吸収で行った。精製開始後約２
３分と２８分に蛋白質のメインピークが認められ、共に
巨核球胞体突起形成活性が認められた。精製開始後２１
分から２４分までと２７分から３０分までをそれぞれ集
め、ゲル濾過カラムクロマト活性画分１、ゲル濾過カラ
ムクロマト活性画分２とした。図９にゲル濾過カラムク
ロマトの結果の一例を示した。各精製工程における蛋白
質の回収率を下記の表２に示した。なお、各試料の蛋白
質量は、２８０ｎｍにおける紫外吸光係数Ａ２８０，１
％＝１０と仮定して算出した。

【００７８】

【表２】

【００７９】１μｌのゲル濾過カラムクロマト活性画分
１とゲル濾過カラムクロマト活性画分２を還元条件下
（５％メルカプトエタノール添加）及び非還元条件下で
ＰｈａｓｔＧｅｌＧｒａｄｉｅｎｔ８−２５（スウ
ェーデン、ファルマシア社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ
した。泳動装置はＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（スウェーデ
ン、ファルマシア社）を用い、添付の説明書に従って泳
動及び銀染色した。なお分子量マーカーとしてＬＭＷ
ＫｉｔＥ（ホスホリラーゼｂ９４ｋｄ、アルブミン６
７ｋｄ、オブアルブミン４３ｋｄ、カーボニックアンヒ
ドラーゼＢ３０ｋｄ、トリプシンインヒビター２０．１
ｋｄ、α−ラクトアルブミン１４．４ｋｄ）（スウェー
デン、ファルマシア社）を用いた。

【００８０】電気泳動の結果を図１０に示した。還元条
件下及び非還元条件下共に、ゲル濾過カラムクロマト活
性画分１は、分子量約１１０ｋｄの単一バンドが認めら
れ、ゲル濾過カラムクロマト活性画分２は、分子量約７
０ｋｄの単一バンドが認められた。約２μｇのゲル濾過
カラムクロマト活性画分１と約１μｇのゲル濾過カラム
クロマト活性画分２をペプチドシークエンサー解析機に
かけて、Ｎ末アミノ酸配列を決定した。ペプチドシーク
エンサー解析機は、ｍｏｄｅｌ４９２（米国、パーキン
エルマー社）を使用し、付属の取り扱い説明書に従って
解析した。

【００８１】解析の結果、１１０ｋｄ蛋白のＮ末はＡｓ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ
−Ｘ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−のアミノ酸配列
を有し、ＧｅｎＢａｎｋを検索した結果、Ｃ１インヒビ
ターのＮ末アミノ酸配列と一致した。このことと分子か
ら１１０ｋｄ蛋白はＣ１インヒビター、またはそのホモ
ログ蛋白質であると推測された。

【００８２】また７０ｋｄ蛋白のＮ末はＨｉｓ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｘ−Ｔｈ
ｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐ
ｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−のアミノ酸配列を有し、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋを検索した結果、アンチトロンビンＩＩＩのＮ
末アミノ酸配列と一致した。このことと分子量及びヘパ
リンに結合する性質から７０ｋｄ蛋白はアンチトロンビ
ンＩＩＩ、またはそのホモログ蛋白質であると推測され
た。

【００８３】実施例７Ｃ１インヒビターとアンチト
ロンビンＩＩＩの巨核球胞体突起形成活性高比重リポ蛋白質、Ｃ１インヒビター及びアンチトロン
ビンＩＩＩについて、参考例に示した巨核球胞体突起形
成活性の測定法に従って測定した結果を図１１に示し
た。市販品のＣ１インヒビター（米国、カルビオケム
社）は約２００％の活性を示した。

【００８４】一方市販品のアンチトロンビンＩＩＩ（米
国、シグマ社）はわずか１５０％の活性しか示さなかっ
た。またヒトの血漿から精製した本発明の高比重リポ蛋
白質は、約４００％以上の活性を示したが、市販の高比
重リポ蛋白質（米国、バイオメディカルテクノロジー
社）は約１５０％の活性しか示さなかった。しかし、こ
の低活性の市販の高比重リポ蛋白質とアンチトロンビン
ＩＩＩを３７℃で２時間インキュベーションすることに
よりアンチトロンビンＩＩＩ−高比重リポ蛋白質の混合
物を作製し、この混合物の活性を測定すると本発明の高
比重リポ蛋白質と同程度の活性を示すことがわかった。

【００８５】一方、同様に市販のＣ１インヒビターと市
販の高比重リポ蛋白質とインキュべションして調製した
Ｃ１インヒビター−高比重リポ蛋白質の混合物はＣ１イ
ンヒビター単独と同程度の活性を示した。アンチトロン
ビンＩＩＩ−Ｃ１インヒビター−高比重リポ蛋白質混合
物は、４００％以上の活性を示した。なお、アンチトロ
ンビンＩＩＩあるいはＣ１インヒビターと高比重リポ蛋
白質の混合物は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐ
Ｈ７．４の１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液条件下、３７℃で
２時間インキュベーションすることにより作製した。

【００８６】以上より、本発明の高比重リポ蛋白質はア
ンチトロンビンＩＩＩとＣ１インヒビターを含有する高
比重リポ蛋白質であり、アンチトロンビンＩＩＩとＣ１
インヒビターの両者、または各々、特にアンチトロンビ
ンＩＩＩを含むと、強く血小板増加作用を発揮すること
がわかった。

【００８７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15

【００８８】配列番号：２配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Pro X Ala Thr Ser Ser X X Gln Asp Pro Glu Ser Leu Gln 1 5 10 15 Asp Arg Gly

【００８９】配列番号：３配列の長さ：１８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 His Gly Ser Pro Val Asp Ile X Thr Ala Lys X Arg Asp Ile Pro 1 5 10 15 Met Gln

【図面の簡単な説明】

【図１】熱、酸処理により得られた高比重リポ蛋白質前
処理液のゲル濾過カラムクロマトグラムである。

【図２】粗精製品１の亜鉛キレーティングカラムクロマ
トを行ったときのクロマトグラムである。

【図３】精製標品のゲル濾過カラムクロマトグラムであ
る。

【図４】精製標品の巨核球胞体突起形成活性を示したグ
ラフである。

【図５】精製標品の血小板産生能を示したグラフであ
る。

【図６】脱脂画分のゲル濾過カラムクロマトグラムであ
る。

【図７】ゲル濾過カラムクロマト活性画分のイオン交換
カラムクロマトグラムである。

【図８】イオン交換カラムクロマト活性画分のヘパリン
カラムクロマトグラムである。

【図９】ヘパリンカラムクロマト活性画分のゲル濾過カ
ラムクロマトグラムである。

【図１０】ゲル濾過カラムクロマト活性画分１及び２の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。

【図１１】Ｃ１インヒビターとアンチトロンビンＩＩＩ
の巨核球胞体突起形成活性を示したグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】巨核球胞体突起形成活性を有する高比重
リポ蛋白質を有効成分とする医薬組成物。
【請求項２】亜鉛キレーティングゲルに非吸着性の巨
核球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質を有効
成分とする医薬組成物。
【請求項３】アンチトロンビンＩＩＩを含有する巨核
球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質を有効成
分とする医薬組成物。
【請求項４】巨核球胞体突起形成活性を有する高比重
リポ蛋白質が、下記の性質を有することを特徴とする請
求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で亜鉛キ
レーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。
【請求項５】巨核球胞体突起形成活性を有する高比重
リポ蛋白質が、ヒトの血液を、６０℃で１０分間加熱し
沈殿を除去して上清を調製し、該上清をｐＨ４．５の１
０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液にて透析し沈殿を除去し
て上清を取得し、この上清を１５０ｍＭの食塩を含むｐ
Ｈ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液にて透析した
後、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液条件下でゲル濾過し、巨核球胞体突起形
成活性を有する画分を採取し、該画分を、１５０ｍＭの
食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条
件下で亜鉛キレーティングゲルに接触せしめ、該ゲルに
吸着しない画分を採取し、さらに該画分を比重１．２１
に調製した後に超遠心分離し、液面に浮上した黄色の画
分を採取することにより取得され得る巨核球胞体突起形
成活性を有する高比重リポ蛋白質であることを特徴とす
る請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】Ｃ１インヒビターを有効成分とする医薬
組成物。
【請求項７】下記の性質を有することを特徴とする巨
核球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質を有効
成分とする医薬組成物。（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で亜鉛キ
レーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。（ｆ）構成蛋白質としてアンチトロンビンＩＩＩを含
む。（ｇ）構成蛋白質としてＣ１インヒビターを含む。
【請求項８】医薬組成物が、血小板減少症治療剤であ
ることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の医
薬組成物。
【請求項９】下記の性質を有することを特徴とする巨
核球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質。（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で亜鉛キ
レーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。
【請求項１０】下記の性質を有することを特徴とする
巨核球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質。
（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で亜鉛キ
レーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。（ｆ）構成蛋白質としてアンチトロンビンＩＩＩを含
む。
【請求項１１】下記の性質を有することを特徴とする
巨核球胞体突起形成活性を有する高比重リポ蛋白質。（ａ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液条件下で亜鉛キ
レーティングゲルに吸着しない。（ｂ）１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭの
ＨＥＰＥＳ緩衝液条件下のゲル濾過で分子量３００ｋｄ
±１００ｋｄをピークとして分画される。（ｃ）比重がｄ＝１．２１以下に分画される。（ｄ）構成蛋白質としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含
む。（ｅ）血小板産生能を有する。（ｆ）構成蛋白質としてアンチトロンビンＩＩＩを含
む。（ｇ）構成蛋白質としてＣ１インヒビターを含む。
【請求項１２】ヒトの血液を、６０℃で１０分間加熱
し沈殿を除去して上清を調製し、該上清をｐＨ４．５の
１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液にて透析し沈殿を除去
して上清を取得し、この上清を１５０ｍＭの食塩を含む
ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液にて透析した
後、１５０ｍＭの食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液条件下でゲル濾過し、巨核球胞体突起形
成活性を有する画分を採取し、該画分を、１５０ｍＭの
食塩を含むｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液条
件下で亜鉛キレーティングゲルに接触せしめ、該ゲルに
吸着しない画分を採取し、さらに該画分を比重１．２１
に調製した後に超遠心分離し、液面に浮上した黄色の画
分を採取することにより取得され得る請求項９〜１１の
いずれかに記載の巨核球胞体突起形成活性を有する高比
重リポ蛋白質。