JPH02138199A

JPH02138199A - 免疫抑制因子ｉ及び２，その製造法及びそれを有効成分とする免疫抑制剤

Info

Publication number: JPH02138199A
Application number: JP63292086A
Authority: JP
Inventors: Saburo Sone; 三郎曽根; Masanobu Munakata; 正信棟方; Akito Nakamura; 明人中村; Shigeki Kosho; 重樹古庄; Kazumaro Seto; 勢渡　和麿
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1988-11-18
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1990-05-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はヒト急性白血病細胞から新たに単球性白血病細
胞株を樹立し、それを分化刺激することにより得たＬ　
Ａ　Ｋ　（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ
　Ｋ１１ｌｅｒ）誘導を抑制する新規な免疫抑制因子Ｉ
及び■、その製造法およびそれを有効成分とする免疫抑
制剤に関する。

〔従来の技術１発明が解決しようとする課題〕ＬＡＫ療
法は極めて治療効果の高い癌治療法であるが、ＬＡＫ活
性の制御についてはほとんど研究されていない。

本発明者らは先にヒト由来の正常単球系細胞または正常
肺胞マクロファージをＬＰＳ　（リポポリサッカライド
）等の分化あるいは機能活性化物質で刺激して培養する
と、ＬＡＫ−３Ｆ（リンフ才力イン活性化キラー細胞誘
導抑制因子１分子量６８、０００±５，０００　）を産
生ずることを見出した（特願昭６３−２４７５０９　）
。しかし、ヒト由来の正常単球系細胞または正常肺胞マ
クロファージを大量に採取、培養するには健常人からの
大量の血液から分画分取あるいは肺洗浄液を必要とし、
大量生産は極めて困難な現状であった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記のような課題を解決すべくヒト単球
系細胞株（無限増殖可能な細胞）の樹立を試みて成功し
、ＴＵＨ−１細胞（微工研寄託番号；　ＦＥＲＭ　　Ｐ
−１０３８６）と命名した。ＴＵＨ１細胞を薬剤無添加
あるいはＴＰＡ（１２−０テトラデカノイルフォルボー
ル−１３−アセテート）。

デキサメサゾン、ツニカマイシン、レチノイン酸。

ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）の如く単球の分化あ
るいは機能を活性化する物質で１〜３日培養した後、ダ
ラム陰性菌またはダラム陽性菌より得られるエンドトキ
シンで４〜２４時間処理することにより培養液上清中に
、ヒト末梢血由来リンパ球またはマウス肺臓由来リンパ
球のＴ　Ｉ、−２によるＬＡＫ誘導を抑制する免疫抑制
因子Ｉ及び■が得られることを見出した。本発明の免疫
抑制因子■及び■は、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＴＮＦ抗体、
抗ＩＬ−１α抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＬＴ抗体。

抗Ｃ，Ｍ−Ｃ３Ｆ抗体等で中和されないことから、本物
質は新規な生理活性物質であることが判明した。また、
ヒト正常単球系細胞またはヒト正常肺胞マクロファージ
から得られるＬＡＫ−３Ｆ（特願昭６３−２４７５０９
　）とは分子量（ゲル濾過法）が異なり、ＴＵＨ−１細
胞由来の免疫抑制因子Ｉは分子量４０，０００±５．０
００等電点６．８０±０．５であり、免疫抑制因子■は
分子量１０，０００±５，０００である。

次に、ＴＵＨ−１細胞の由来及び表面マーカーについて
述べる。ＴＵＨ−１細胞は急性単球性白血病患者の末梢
単核芽球を起源とする。単球系に特徴的なＮａＦ感受性
非特異的エステラーゼ（αｎａｐｈｔｙｌ　ａｃｅｔａ
ｔｅ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　）は陽性である。クラスター
を通常形成し、分化誘導物質を添加することによってプ
ラスチック面への付着が起こる。フローサイトメトリー
を用いた細胞表現型（表面マーカー）はＯＫＭ１＋、Ｏ
ＫＭ５±、０ＫＩａｌ＋０ＫＴＩＯ−、Ｌｅｕ　　５ｂ
　−、Ｌｅｕ　　４±。

Ｌｅｕ　　３ａ±、Ｌｅｕ　　２ａ−、Ｌｅｕ　　ｆｌ
ａｔ：。

Ｌｅｕ　　７−である。

ＴＵＨ−１細胞を培養して上記免疫抑制因子Ｉ及びＩＩ
を製造する方法について以下に説明する。

培地としては、例えばＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０，Ｈａ
　ｍ’ｓＦ　１２　：　ＲＰＭＩ　　１６４０　　（１
：　１）培地等が用いられ、培地中には０〜１５％牛脂
児血清を添加する。

培養温度は３７〜３８°Ｃが好ましく、さらにＧｏ２５
％飽和水蒸気中で培養（炭素ガス恒温機中）することが
好ましい。ＰＭＡ等の分化誘導物質を添加しなくてもリ
ポポリサッカライドの刺激のみで免疫抑制因子Ｉ及びＩ
ＩをＴＵＨ−１細胞は生産するが、さらに生産を高める
には、ＰＭＡ、デキサメサゾン、ツニカマイシン、レチ
ノイン酸、ＤＭＳＯ等の単球の分化あるいは機能を活性
化する物質で１〜３日間培養した後、細胞を回収し、新
鮮な培地（リポポリサッカライド二０．１〜１０μｇ／
ｒｒｄｌ）に接種して４〜２４時間培養し、細胞を濾過
あるいは遠心分離等で除き培養上清を回収する。この培
養上清中に本発明の免疫抑制因子■及び■が生産されて
いる。

培養上清からの上記物質の回収、精製は、例えば当該上
清を透析、限外濾過、ゲル濾過２笠電点クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロ
マトグラフィー、等を単独でもしくは適宜組合せること
によって行なうことができる。

より具体的には、例えば次のような方法によって回収、
精製することができる。まず、培養液を遠心分離（３，
０００〜５，０００　ｒｐｍ　、　１０〜１５分間）し
て培養上清を採取し、該上清を限外濾過装置（アミコン
ホローファイバーＰ−１０，ミリポアイマーシブルＣＸ
−１０，アミコンダイアフローメンブランＹＭ−１０等
）で濃縮し、０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０，１２
Ｍ塩化ナトリウム含有）に透析した後、架橋デキストラ
ンゲル濾過カラムに添加して０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７、Ｏ，１２Ｍ塩化ナトリウム含有）で溶出し、ヒト
末梢血由来リンパ球またはマウス肺臓由来リンパ球のＩ
　Ｌ−２によるＬ　Ａ　Ｋ　ＢＢ導（誘導されたＬＡＫ
による標的細胞傷害活性を指標とする）を抑制する免疫
抑制活性分画を二分画（分子量４０．０００±１０，０
００及びｉｏ、ｏｏｏ±１０．０００）得る。培養上清
が１２以下の場合は、上記の架橋デキストランゲル濾過
カラムの操作を省略して直接次の高速ゲル濾過クロマト
グラフィーで免疫抑制因子Ｉ及びＩＩを分取することが
できる。それぞれの分画を別々に限外濾過装置を用いて
濃縮した後、高速液体ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｔ
ＳＫ・Ｇ３０００ＳＷ等）に添加し、０．０５Ｍ燐酸緩
衝液（ｐＨ７゜０．０３Ｍ塩化ナトリウム含有）で溶出
して免疫抑制活性分画として分子量４０，０００±５，
０００　　（免疫抑制因子Ｉ）と分子量１０．０００±
５，０００　　（免疫抑制因子■）をそれぞれ得る。限
外濾過装置で濃縮後、アンフオライン等電点カラム電気
泳動装置で泳動（アンフオライン１％、　ｐＨ３，５〜
１０．９００　Ｖ、　４０４８時間）を行ない、免疫抑
制活性分画として等電点６．８±０．５（免疫抑制因子
■）を得る。さらに高度の精製を必要とする場合にはイ
オン交換クロマトグラフィーやＣｏｎＡアフィニティー
クロマトグラフィーを用いて免疫抑制因子Ｉ及びＩＩを
単離することができる。

この様にして製造し、採取、精製した本発明の免疫抑制
因子Ｉ及び■の理化学的性質は以下の如くである。

（１）分子量ゲル濾過の分子篩法（Ｔ　Ｓ　Ｋ　、　Ｇ３０００Ｓ　
Ｗ。

セファデックスＧ−２００等）によると、ＴＵＨ−１細
胞由来の免疫抑制因子■の相対分子量は４０．０００±
５，０００　、免疫抑制因子ＩＩの相対分子量は１０．
０００±５．０００である。

（２）等電点アンフオラインを用いたカラム等電点電気泳動法による
と、免疫抑制因子Ｉの等電点は６．８±０．５である。

（３）熱安定性７０°Ｃ２３０分間加熱処理により失活する。

（４）酸素に対する安定性プロテアーゼ処理で失活する。

（５）各種リンフ才力インに対する抗体による中杭ヒＩ
−ＴＮＦ抗体、抗ヒトＩＬ−１α抗体、抗ヒトＩＬ−１
β抗体、抗ヒトＬＴ抗体、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＧＭ−Ｃ
３Ｆ抗体によってＬ　Ａ　Ｋ誘導を抑制する活性は、免
疫抑制因子■及び■ともに失活しなかった。従って、免
疫抑制因子■及び■はヒトＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−
１β、ＬＴ。

ＴＧＦβ、ＧＭ−Ｃ３Ｆではないと判定される。

（６）細胞傷害活性免疫抑制因子Ｉ及び■はＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１゜Ｔ　
ＣＦ　（Ｔｕｍｏｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ｆａｃｔｏ
ｒ）の様にＡ３７５Ｌ９２９細胞等に直接の細胞傷害活
性を有しない。

従って、免疫抑制因子Ｉ及び■はＴＣＰではない。

（７）抗ウィルス活性免疫抑制因子Ｉ及び■はＩＦＮα、β、Ｔの様に抗ウィ
ルス活性を有しない。従って、免疫抑制因子Ｉ及び■は
ＩＦＮα、β、Ｔではない。

以下に本発明の免疫抑制因子のリンフ才力イン活性化キ
ラー細胞（ＬＡＫ）誘導抑制作用を示す。

１、ヒトＬＡＫ誘導抑制作用（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）ヒ
トリンパ球をヒトＩ　Ｌ−２存在下で培養することによ
りＬＡＫを誘導し、標的細胞にＳ　Ｉ　ｃｒ標識Ｄａｕ
ｄｉ細胞を用い、”Ｃｒの放出量でＬＡＫ活性を測定し
た。ＩＬ−２の存在下でリンパ球を培養する際に免疫抑
制因子Ｉ及びＩＩを添加し、ＬＡＫ活性が低下する度合
をＬ　Ａ　Ｋ　ｇＢ導抑制活性とした。

リンパ球は通常ヒト末梢血から分離したＭＮＣ（ｍｏｎ
ｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ　）を用い、ＭＮＣ中の単
球を除く目的でプラスチックシャーレ等で２時間培養し
、非付着性細胞をリンパ球として用いた。リンパ球とヒ
トｒｌＬ−２ならびにサンプル液を９６穴マイクロウエ
ルプレートに分注する。培地は５％ＦＢＳ添加ＲＰ　Ｍ
　ｌ−１６４０を用いる。１六当りリンパ球（０，５〜
２．０Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｆｆ１）　１００μｌ　
。

ｒ−ｈ　ＴＬ−２５０ｕｌ、サンプル５０μｌを分注す
る。リンパ球数はＥ／Ｔ比（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／　Ｔａ
ｒｇｅｔｒａｔｉｏ　）によって変える。３７°Ｃ炭酸
ガス（５％）インキュベーター中で４日間培養し、ＬＡ
Ｋ誘導を行なう。９６穴マイクロウエルプレートを１１
０００ｒｐ。

５分間遠心した後、上清を除去して培地１００μ２を添
加する。”Ｃｒで標識したＤａｕｄ　ｉ細胞を１穴当り
（培地１００μｆ中）　１　ｘｉｏ’　ｃｅｌｌｓづつ
分注後、５００　ｒｐｍ　、　　５分間遠心して細胞を
沈降させリンパ球と接触させる。３７°Ｃ炭酸ガスイン
キュベーター中で４時間培養する。９６穴マイクロウエ
ルプレートを１１００Ｏｒｐ　、　　５分間遠心した後
、上清１００μｌを静かに吸いとり、放射活性をＴカウ
ンターにより測定する。

ＬＡＫ活性は次式により算出する。

ＬＡＫ活性（％５ｐｅｃｉｆｉｃ　１ｙｓｉｓ）　＝２
最終濃度ＩＮの塩酸を添加することで行なった。

ＬＡＫ誘導抑制活性（％）− ″′サンプルの代りに培地５０μ２を添加５０％ＬＡＫ
誘導抑制活性を示すのに必要な生物活性を１単位とした
。

２、マウスＬＡＫ誘導抑制作用リンパ球の給源としては肺臓細胞のｎｙｌｏｎ　ｗｏｏ
ｌ非付着性細胞を用いた。ＬＡＫ誘導法はヒトの場合と
同じで、ｒ−ｈＩＬ−２を用いた。標的細胞としてはＰ
８１５．ＥＬ４等を用いた。

ＬＡＫ誘導抑制活性算出法はヒトの場合と同じである。

本発明で得られた免疫抑制因子を医薬として使用するに
は、ＬＡＫ誘導抑制作用及び免疫抑制効果を発現するの
に適した剤形で投与する。通常の投与方法としては、免
疫抑制因子を生理食塩水無菌注射用等張液等に溶解した
状態で静脈、皮下または筋注射などにより患者に投与す
ることができる。その場合は、安定化剤としてヒト血清
アルブミン、マンニトール等の添加が有効である。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に述べるが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例ＩＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地（１０％牛脂児血清含有）
で継代培養後、遠心分離（１５００ｒｐｍ　、　１０分
）して得たＴＵＨ−１細胞２Ｘ１０１′細胞を新鮮なＲ
ＰＭＩ１６４０培地（２％牛脂児血清含有）　５００　
ｍｌに大腸菌由来のりポポリサッカライド１μｇ７ｍｌ
を添加した培地に接種し、スピナーフラスコで３７°Ｃ
９１９時間。

５％ＣＯ２恒温培養機中で撹拌培養（３０ｒｐｍ）　シ
た。

培養後、遠心分離により細胞を除き、次いでメンブラン
フィルタ−（孔径０．４５μｍ）で濾過滅菌して耗免疫
抑制因子含有液５００ｍ１を得た。限外濾過膜（分画分
子量１万以上、ミリポア・イマーシプルＣＸｌ０）で２
　ｍｌまで濃縮した。次に、０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
１１７．０．０３Ｍ塩化ナトリウム含を）で平衡化した
Ｔ　Ｓ　Ｋ　−Ｇ３０００Ｓ　Ｗカラム（φ２．１５Ｘ
６０ｃｍ、高速液体ゲル濾過カラム）に１　ｍｉづつ計
２回注入し、平衡化に使用したと同じ緩衝液で１．４ｍ
１１分で溶出した。４．２ｍｌづつ分画分取し、リンパ
球のＩＬ−２によるＬＡＫ誘導を抑制する免疫抑制活性
を指標にして免疫抑制因子Ｉ　（分画Ｎｏ、３４〜３８
９分子量４０，０００±５，０００　）と免疫抑制因子
■（分画Ｎｏ、４４〜４６９分子量１０，０００±５，
０００　）の二分画を得た。（第１図参照）。免疫抑制
因子Ｉ分画を限外濾過膜で６　ｍｌに濃縮後、アンフオ
ライン・カラム等電点電気泳動装置にかけ、４８時間、
９００Ｖ、２°Ｃで電気泳動を行なった。ＬＡＫ誘導を
抑制する免疫抑制活性を指標にして等電点６．８±０．
５の免疫抑制因子■を得た。この時点での比活性は２Ｘ
１０’単位／■蛋白であった。

〔発明の効果〕

本発明によれば、新たに樹立されたヒト単球系細胞株Ｔ
ＵＨ−１の培養系で新規な免疫抑制因子Ｉ及び■が効率
よく得られる。本発明のＴ　ＩＪ　Ｈ１細胞由来の免疫
抑制因子Ｉ及び■はＬＡＫ誘導抑制作用および免疫抑制
効果を有し、医薬として利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＴ　Ｓ　Ｋ　−Ｇ３０００Ｓ
　Ｗの高速液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示
す。回申の矢印は分子■マーカーとして用いたＢＡ（牛
血清アルブミン、分子量６７．０００）　、　ＯＡ（卵
白アルブミン、分子量４３，０００）　、　　ＲＮ　（
リボヌクレアーゼＡ２分子量１３，７００）　、　　Ｉ
　Ｌ−１β（組換え体ヒトインターロイキンβ７分子ｉ
ｔｌ’７，３００）を示す。黒丸実線（・　　　・）は
免疫抑制活性（リンパ球のＩＬ−２によるＬ　Ａ　Ｋ　
Ｈｚ導化を抑制する活性：％コントロール）を示す。ま
た、横軸は分画番号（１分画は４．２ｍ１）を示す。第２図は実施例１における免疫抑制因子Ｉのアンフオラ
イン・カラム等電点電気泳動の溶出パターンを示す。黒
丸実線（・　　　・）は免疫抑制活性（％コントロール
）を、破線（−−−−−）はｐｉ勾配を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）分子量が４０，０００±５，０００及び１０，０
００±５，０００であるＬＡＫ誘導抑制活性を有する免
疫抑制因子 I 及びII。
（２）ヒト急性白血病細胞から新たに樹立したＴＵＨ−
１細胞を培養し刺激物質を作用させ免疫抑制因子 I 及
びIIを生成させ、採取することを特徴とする分子量が４
０，０００±５，０００と１０，０００±５，０００で
あるＬＡＫ誘導抑制活性を有する免疫抑制因子 I 及び
IIの製造法。
（３）刺激物質が単球の分化あるいはマクロファージの
機能を活性化する物質である請求項２記載の方法。
（４）分子量が４０，０００±５，０００及び１０，０
００±５，０００であるＬＡＫ誘導抑制活性を有する免
疫抑制因子 I 及びIIをそれぞれ単独あるいは混合して
有効成分とする免疫抑制剤。