JP6431552B2 - Ｔａｆｉおよびｐａｉ−１の二重標的化 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）およびトロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）の二重阻害により、脳卒中および血栓塞栓症などの血栓性障害の治療および予防に関する。二重阻害は、両方の標的に結合する二重特異性抗体誘導体によって媒介され得る。

背景
現在では、急性心血管病の発症後、閉塞された血管を再疎通するために、利用可能な唯一の治療手段は、高用量のプラスミノーゲン活性化因子の全身送達である。プラスミノーゲン活性化因子は、発症後すぐに投与された場合に有効であるが、頭蓋内出血および神経毒性などの衰弱性副作用を引き起こす。また、高用量のプラスミノーゲン活性化因子を投与しても、再疎通率が低く且つ再閉塞率が高いため、血流の正常回復が保証できない（Saver JL. et al. (2011) J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 333-343）。したがって、当技術分野では、例えば、線維素溶解または血栓溶解を促進することによって、閉塞した血管を有効に治療する方法が必要である。

血栓溶解失敗の原因の１つは、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）などの循環線維素溶解阻害剤が存在するためである（Fernandez-Cadenas I et al. (2007) J Thromb Haemost. 5, 1862-1868）。（Rijken DC & Lijnen HR (2009) J Thromb Haemost. 7, 4-13に記載したように）両方の分子は、異なるメカニズムによって、線維素溶解に重要な酵素であるプラスミンの組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）媒介形成を遅らせる。４〜１５μｇ／ｍｌの血漿濃度を有する５６ｋＤａの酵素前駆体であるＴＡＦＩは、単独でもしくはトロンボモジュリンまたはプラスミンと併用する場合、トロンビンによって、ＴＡＦＩａに活性化されることができる。ＴＡＦＩａは、カルボキシペプチダーゼ活性を有するため、プラスミノーゲンからプラスミンへのｔＰＡ媒介活性化において補因子として機能する部分分解線維素に露出したＣ末端のＬｙｓ残基を切断することができる。ＰＡＩ−１（５〜５０ｎｇ／ｍｌの血漿濃度および２００ｎｇ／ｍｌの血小板内濃度を有する４５ｋＤａの糖タンパク質）は、ｔＰＡの主要な阻害剤であり、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）のスーパーファミリーに属している。活性型のＰＡＩ−１は、ｔＰＡと１：１の化学量論共有結合複合体を形成し、セリンプロテアーゼの触媒三連構造を変形することによって、ｔＰＡの活性を不可逆的に中和することができる。

ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１の線維素溶解を阻害する相補的な役割を考えると、線維素溶解を促進する手法の１つは、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１を二重阻害することである。ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１を同時に標的にすることは、いくつかの研究に試みられている。しかしながら、結果として、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１の二重阻害は、単一阻害に比べて、血栓溶解を改善したことを矛盾なく示すことができなかった。一研究では、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１並びに第３分子α_２−ＡＰの相補的な役割は、ＴＡＦＩ、ＰＡＩ−１および／またはα_２−ＡＰの阻害剤の存在下または不存在下で、ｔＰＡ誘発血栓溶解アッセイによって特徴付けられた（Mutch NJ. et al. (2007) J Thromb Haemost. 5, 812-817）。血栓の種類に応じて、アッセイは、３つの分子がすべて機能すること、またはα_２−ＡＰおよびＴＡＦＩが大幅に貢献し、ＰＡＩ−１が軽微に貢献することを示した。同様に、マウスのシングルノックアウトおよびダブルノックアウト研究によって、特定のアッセイにおいて血栓溶解作用は、ＴＡＦＩの阻害によるものではなく、ＰＡＩ−１の阻害によるものであることを示唆した（Vercauteren E et al. (2012) J Thromb Haemost. 10, 2555-2562）。

特に、二重特異性抗体誘導体（ダイアボディ）に基づく二重標的化ストラトジーは、有望であることが示されている。ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１と結合するモノクローナル抗体に基づく二重特異性抗体Ｔ１２Ｄ１１×３３Ｈ１Ｆ７は、その成分であるモノクローナル抗体（ＭＡ）を単独に試験したときに観察された効果よりも高い線維素溶解の刺激効果を示した。また、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する新たなモノクローナル抗体は、特別な特徴を示している。ＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５およびＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６の両方は、マウスＴＡＦＩおよびラットＴＡＦＩを阻害するが、各々のＭＡが異なるメカニズムで機能する。具体的には、前者は、ＴＡＦＩａを不安定化し、後者は、ＴＡＦＩのプラスミン媒介活性化を弱め、ＴＡＦＩａと線維素との相互作用を干渉する（Hillmayer K et al. J (2008) Thromb Haemost. 6, 1892-1899; Vercauteren E et al. (2011) Blood 117, 4615-4622; Semeraro F, et al. (2013) J Thromb Haemost. 11, 2137-2147）。ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７およびＭＡ−ＭＰ２Ｄ２は、ｔＰＡによる切断によって活性型ＰＡＩ−１を基質型ＰＡＩ−１に変換することにより、マウスＰＡＩ−１およびラットＰＡＩ−１を阻害する（Debrock S. & Declerck PJ. (1997) Biochim Biophys Acta. 1337, 257-266; Van De Craen B. et al. (2011) Thromb Res. 128, 68-76）。インビボ研究は、上記の抗体が血栓塞栓誘発後のマウスの生存率および麻痺速度に対して有益な作用を有することを示した（上記に引用されたVercauteren(2011)、上記に引用されたVan De Craen）。最近、対応するヒト抗原を識別するＭＡ抗体ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７およびＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６を採用して、二重特異性抗体誘導体Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７を作り出し、このダイアボディの強い線維素溶解促進作用をインビトロで実証した（Wyseure T et al. (2013) J Thromb Haemost. 11, 2069-2071）。しかしながら、今までの二重標的化研究は、インビボで、特定の血栓性障害を治療するための阻害剤または二重特異性抗体の役割を決定的に実証していない。また、今までの研究は、プラスミノーゲン活性化因子の代わりに、線維素溶解または血栓溶解の阻害剤に基づいて、血栓性障害を治療することが可能である証拠を提供していない。

発明の概要
本明細書は、脳卒中および血栓塞栓症などの血栓性障害を治療するために使用されるダイアボディＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７を開示する。Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７は、血栓障害の発症前または発症後に投与されてもよく、ｔＰＡなどのプラスミノーゲン活性化因子の存在または不存在下で投与されてもよい。

本開示は、患者の急性血栓性障害を治療するために使用される二重特異性抗体誘導体に関する。この二重特異性抗体誘導体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む。この二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害の発症後に投与される。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体のアミノ酸配列は、開示された配列番号１〜１８を有するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、心筋梗塞（ＭＩ）、肺塞栓症、末梢動脈疾患、肝臓および／または腎臓の血栓症、またはカテーテル閉塞のうち、少なくとも一方の急性血栓性障害に使用されるものである。例えば、急性血栓性障害は、ＡＩＳであってもよく、ＭＣＡＯであってもよい。

特定の実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害症状の発症後０〜１５時間の間に投与される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害症状の発症後３時間までに投与される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害症状の発症後４．５時間までに投与される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害症状の発症後１２時間までに投与される。

二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡなしで投与されてもよい。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害の発症後９０分までに、例えば発症後０〜９０分の間に、ｔＰＡなしで投与される。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡと共に投与される。例えば、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡを投与した１時間後に投与されてもよい。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、線維素豊富な凝血塊の存在によって特徴付けられる急性血栓性障害に使用されるものである。急性血栓障害は、血小板豊富な凝血塊の存在によって特徴付けられてもよい。

特定の実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、ヒト化抗体である。
本開示のさらなる局面は患者の急性血栓性障害の治療に使用される二重特異性抗体誘導体に関する。この二重特異性抗体誘導体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合し、配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合し、配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む第２標的ドメインとを含む。この二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害の発症後に投与される。いくつかの実施形態において、患者の急性血栓性障害の治療に使用される二重特異性抗体誘導体は、配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって表される第１ドメインと、配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって表される第２ドメインとを含む。この二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害の発症後に投与される。

本開示のさらに別の局面は、患者の急性血栓性障害を治療するために使用される二重特異性抗体誘導体に関する。この二重特異性抗体誘導体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む。この二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害の発症後に、ｔＰＡなしで投与される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡなしで投与され、急性血栓性障害の発症後９０分以内の期間中に投与される。

本発明の一局面は、患者の急性血栓性障害を治療または予防するために、二重特異性抗体の使用に関する。この抗体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む。

本開示の実施形態は、二重特異性抗体を含む。この二重特異性抗体において、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合する第１標的ドメインは、配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含み、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合する第２標的ドメインは、配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む。

本開示の実施形態の二重特異性抗体は、ヒト化抗体である。
特定の実施形態において、これらの二重特異性抗体は、急性血栓性障害に起因する脳病変の治療または予防に使用される。

特定の実施形態において、急性血栓性障害は、急性末梢動脈閉塞、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）、および深部静脈血栓塞栓症、肺塞栓症などの血栓塞栓症からなる群から選択される。

特定の実施形態において、二重特異性抗体は、患者の急性血栓性障害を治療または予防するために、ｔＰＡと併用して使用される。

他の実施形態において、二重特異性抗体は、急性血栓性障害に起因する脳病変の治療または予防に使用される。治療は、二重特異性抗体の投与前、投与中または投与後に、ｔＰＡの投与なしで行われる。

特定の実施形態において、急性血栓性障害は、血小板豊富な凝血塊の存在によって特徴付けられる。

本発明の別の局面は、患者の急性血栓性障害を治療または予防するための方法に関する。方法は、ＴＡＦＩおよびＰＡＩに対する二重特異性抗体を投与する工程を含む。この抗体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む。

本発明の方法は、既存の治療法に比べて、いくつかの利点を有する。
本発明の方法は、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対するダイアボディを使用するため、ｔＰＡに比べて、頭蓋内出血および神経毒性を引き起こすリスクが少ない。本発明のダイアボディは、脳病変を患っている患者の病変サイズを減少するために使用される。脳病変は、脳卒中、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）および／または中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）などの血栓性障害によって引起され得る。

投与後短時間（約１５分）の活性を有するｔＰＡと比べて、ダイアボディは、はるかに長い時間に亘って、標的と結合することができる。

高用量のｔＰＡは、プラスミンの不要な酵素活性をもたらすことができるが、高用量のダイアボディの使用は、より安全である。ＰＡＩ−１またはＴＡＦＩと結合しない抗体は、副作用を有しない。

ｔＰＡに比べて、ダイアボディは、出血時間を減少することができる。従って、本発明のダイアボディは、頭蓋内出血などの望ましくない出血の危険性を低減する利点を有する。

ＣＤＲグラフト化ｓｃＦｖの発現レベルを示す図である。図１Ａは、ｓｃＦｖ−４Ｄ５の骨組みに位置するＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５（円囲み）のＣＤＲモデル構造を示している。図１Ｂは、抗Ｈｉｓ標識したポリクローナル抗体を介して検出された、ＣＤＲグラフト化ｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５を含有するペリプラズム抽出物（レーン１）、対照物としてのｓｃＦｖ−Ｔ１２Ｄ１１（レーン２）、ｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−Ｔ１２Ｄ１１（レーン３）およびｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５ＤＭ（レーン４）を示す免疫ブロットである。 二重特異性阻害剤Ｄｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５×３３Ｈ１Ｆ７（Ｄｂ）、Ｄｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５×３３Ｈ１Ｆ７（ＣＤＲグラフト化Ｄｂ）、ｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５（ｓｃＤｂ）およびｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５（ＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂ）を示す概略図である。図中、ＰＨは、抗ＰＡＩ−１抗体の可変領域重鎖を表し、ＰＬは、抗ＰＡＩ−１抗体の可変領域軽鎖を表し、ＴＨは、抗ＴＡＦＩ抗体の可変領域重鎖を表し、ＴＬは、抗ＴＡＦＩ抗体の可変領域軽鎖を表し、ＴＨ′は、抗ＴＡＦＩ抗体のヒト化可変領域重鎖を表し、ＴＬ′は、抗ＴＡＦＩ抗体のヒト化可変領域軽鎖を表す。 インビトロ凝血塊溶解中に、血漿安定性および線維素溶解促進作用を示す図である。図３Ａは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイに従って、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１と同時に結合する残基結合能力を測定することによって決定された安定性を表すグラフである。１０μｇ／ｍｌの（ｓｃ）Ｄｂバリアント（Ｄｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５×３３Ｈ１Ｆ７（Ｄｂ）、Ｄｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５×３３Ｈ１Ｆ７（ＣＤＲグラフト化Ｄｂ）、ｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５（ｓｃＤｂ）およびｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５（ＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂ））は、クエン酸添加のラット血漿中において、３７℃でインキュベートされた。Ｄｂ対照物は、Ｄｂ−Ｔ１２Ｄ１１×３３Ｈ１Ｆ７であった。０時間、１時間および３時間で、一定の分量を分析し、結合タンパク質は、０時間に比べて相対的に発現された（残基結合％、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３〜９）。図３Ｂは、グラフラット血漿における凝血塊溶解の間に、ＴＡＦＩよりも８倍モル過剰の（ｓｃ）Ｄｂバリアントの安定性（血漿中３７℃で３時間後の残基結合％、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３〜９）およびＴＡＦＩよりも４倍モル過剰のＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５に対して相対溶解として表された線維素溶解特性（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）を示している。 ヒトの血液（Ａ）および内毒血症マウス（Ｂ）の血液を使用した血栓弾性測定によるＭＡ（ＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６およびＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７の単体または複合添加物）およびＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７の線維素溶解促進作用を示す図である。グラフ（Ａ）およびグラフ（Ｂ）は、ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７、ＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６、ＭＡの複合添加物またはダイアボディの存在下で、溶解度（ΔＬ４５％、平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６−１２）および相対的なΔＡＵＣ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３〜６）をそれぞれ示している。統計的有意性は、星印で表される（「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を表す）。 トロンボプラスチンの全身投与によって誘発された血栓塞栓症モデルにおけるＭＡのインビボ評価を示す図である。グラフは、生理食塩水、５ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６または１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７と共に注射された線維素の肺における含有量を表す（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５〜７）。基準線のレベルは、血栓塞栓症の誘発をしていないマウスから肺を単離することによって得られた（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５）。統計的有意性は、星印で表される（「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を表す）。 内毒血症マウスを使用して血栓塞栓症モデルにおけるＭＡおよびＤｂのインビボ評価を示す図である。グラフ（Ａ）およびグラフ（Ｂ）は、媒介物（vehicle）、１０ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７、５ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６、５ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６＋１０ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７と共に注射された線維素の内毒血症マウスの肺における含有量、および、媒介物、１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７、１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６、１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６＋１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７、０．８ｍｇ／ｋｇのＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７と共に注射された線維素の内毒血症マウスの肺における含有量をそれぞれ表す（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５−１０）。基準線のレベルは、血栓塞栓症の誘発をしていないマウスから肺を単離することによって得られた（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝５）。統計的有意性は、媒介物に対して表される（「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を表す）。 一過性機械的なＭＣＡＯのマウスモデルにおけるＭＡのインビボ評価を示す図である。図７Ａおよび７Ｄは、病変サイズ（ｍｍ^３）を示し、図７Ｂおよび７Ｅは、Bedersonスコア（０〜５）を示し、図７Ｃおよび７Ｆは、握力検査スコア（０〜５）を示し、図７Ｇは、測定された脳の同側における線維素原の含有量（反対側に対して倍増）を示している。図７Ａ〜７Ｃの数値は、媒介物（ＰＢＳ）、陰性対照物ＩｇＧ、６ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６、および２５ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６を用いて処置したマウスに閉塞の発生から２４時間後に測定された（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝８〜１２）。図７Ｄ〜７Ｆの数値は、媒介物（ＰＢＳ）、陰性対照物ＩｇＧ、および６ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７を用いて処置したマウスに閉塞の発生から２４時間後に測定された（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝１４〜１６）。図７Ｇの数値は、媒介物（ＰＢＳ）、陰性対照物ＩｇＧ、６ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７、および２５ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６を用いて処置したマウスに閉塞の発生から２４時間後に測定された（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４〜５）。統計的有意性は、以下のように表される。具体的に、「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を表す（ＭＡ対照物は、ＭＡ−Ｔ３０Ｅ５である）。 一過性機械的なＭＣＡＯのマウスモデルにおけるＭＡおよびＤｂのインビボ評価を示す図である。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、媒介物（ＰＢＳ）、陰性対照物ＩｇＧ、１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７、１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６、１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６＋１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７または０．８ｍｇ／ｋｇのＤｂを用いて処置したマウスに閉塞の発生から２４時間後に測定された病変サイズ（ｍｍ^３）、Bedersonスコア（０〜５）および握力検査スコア（０〜５）をそれぞれ示している（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝１０〜１２）。図８Ｄは、媒介物（ＰＢＳ）、陰性対照物ＩｇＧ、１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６＋１ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７または０．８ｍｇ／ｋｇのＤｂを用いて処置したマウスに閉塞の発生から２４時間後に測定された脳の同側における線維素原の含有量（反対側に対して倍増）を示している（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３〜４）。統計的有意性は、以下のように表される。具体的に、「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を表す（ＭＡ対照物は、ＭＡ−ＮＢ２７Ｂ３である）。 トロンビン誘発性ＭＣＡＯのマウスモデルの血栓溶解治療に、単一の治療薬または補助剤として使用されたダイアボディのインビボ評価を示す図である。グラフＡ、グラフＢおよびグラフＣは、ＰＢＳ、ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ダイアボディ（０．８ｍｇ／ｋｇのＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７）および併用治療剤（０．８ｍｇ／ｋｇのダイアボディ＋１０ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ）を用いて処置したマウスの血栓発症後の２４時間に測定された病変サイズ（ｍｍ^３）、血管造影スコア（０〜２）および脳血流量（ＣＢＦ）の減少％をそれぞれ示している（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６〜８）。統計的有意性は、ＰＢＳに対して表される（「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を表す）。図９Ｄ、図９Ｅおよび図９Ｆは、トロンビン誘発した閉塞後の追加時点を示されている。具体的に、図９Ｄ、図９Ｅおよび図９Ｆは、閉塞後の２０分（ｎ＝６〜８）、９０分（ｎ＝９〜１０）および２４０分（ｎ＝７〜９）に、媒介物、ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｄｂ（０．８ｍｇ／ｋｇ）またはＤｂ（０．８ｍｇ／ｋｇ）とｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせを用いて処置したマウスに閉塞の発生から２４時間後に測定された病変体積（ｍｍ^３）（上方パネル）および代表的なＴ２重み付き画像を示している。点線は、脳卒中病変を表す。データは、平均値±ＳＥＭとして表される。「＊」は、Ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「ｎｓ」は、非有意を表す。ｔＰＡは、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子を表し、Ｄｂは、ダイアボディを表す。 ＦｅＣｌ_３誘発性ＭＣＡＯのマウスモデルにおけるダイアボディのインビボ評価を示す図である。グラフＡ、グラフＢ、グラフＣおよびグラフＤは、ＰＢＳ、１０ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ、１．６ｍｇ／ｋｇおよび３．６ｍｇ／ｋｇのダイアボディ（Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７）を用いて処置したマウスにおいて、閉塞から１時間後の脳血流量（ＣＢＦ）の差、病変サイズ（ｍｍ^３）、血管造影スコア（０〜２）および閉塞から２４時間後のＣＢＦ減少％をそれぞれ示している（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝８〜１５）。統計的有意性は、ＰＢＳに対して表される（「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００１を表す）。 ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対して、一連のｓｃＤｂのインビトロ発現およびインビボ発現を示す図である。グラフＡは、インビトロ発現において、一連のｓｃＤｂおよびそのバリアントを分泌タンパク質として示し、グラフＢは、インビトロ血漿中安定性において、３７℃で馴化培地に７２時間まで培養した一連のｓｃＤｂおよびそのバリアントの残基結合（％）を示し、グラフＣは、インビボ発現において、ＤＮＡ筋肉注射および電気穿孔後の一連のｓｃＤｂおよびそのバリアントの特性を示している。 媒介物（ＰＢＳ）、１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのｔＰＡ、０．８ ｍｇ／ｋｇおよび３．６ｍｇ／ｋｇのダイアボディ、およびＤｂ（０．８ｍｇ／ｋｇ）＋ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスの尾部出血および６０分間までの累積出血を示す図である。図１２Ａおよび１２Ｂは、出血時間およびヘモグロビンレベルにおけるｔＰＡおよび／またはダイアボディの作用を示している。図１３Ａは、マウスの尾部出血の初期停止が観察されるまでの時間（分）を示し、図１３Ｂは、ヘモグロビン（ｇ／ｄＬ）として測定された６０分間までの累積出血（ヘモグロビン損失）を示す（中央値、ｎ＝９〜１６匹マウス／群、「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、Ｐ＜０．０１を表し、「＊＊＊」は、Ｐ＜０．００５を表す）。ｔＰＡは、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子を表し、Ｄｂは、ダイアボディを表す。 静脈注射後のダイアボディの全身薬物動態を示す図である。グラフは、０ ．８ｍｇ／ｋｇのダイアボディを６匹のマウスにＩＶ注射した後の時間（分）に対して描かれた血漿濃度（μｇ／ｍｌ、平均値±ＳＥＭ）を示す（赤い矢印は、循環半減期＝１２１分であることを示す）。ダイアボディ ＮＭＤＡ誘発した興奮毒性の有無にもかかわらず、皮質神経細胞死に対するダイアボディ（Ｄｂ）の効果評価を示す図である。図１４Ａにおいて、皮質神経細胞は、神経細胞死測定の前に、単独のＮＭＤＡ（完全殺死条件（ＦＫ）として、５００μｍｏｌ／Ｌ）またはダイアボディ（０．５〜５０μｇ／ｍｌ）もしくはそれらの組み合わせに２４時間さらされ、図１４Ｂにおいて、皮質神経細胞は、神経細胞死測定の前に、単独のＮＭＤＡ（５００μｍｏｌ／Ｌ（完全殺死、ＦＫ）または１２．５μｍｏｌ／Ｌ）、Ｄｂ（５μｇ／ｍｌ）またはｒｔＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）もしくはそれらの組み合わせに２４時間さらされる（Ｎ＝２独立培地、ｎ＝２〜４、「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「ｎｓ」は、非有意を表す）。ｔＰＡは、組換え組織型プラスミノーゲン活性化因子を表し、Ｄｂは、ダイアボディを表し、ＮＭＤＡは、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸を表す。

詳細な説明
本発明は、血栓性障害の治療に使用される二重特異性抗体誘導体に関する。二重特異性抗体誘導体は、二重標的化ストラトジーに従って、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１を標的し、両方のタンパク質を阻害する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７として知られているダイアボディ（diabody）であり、急性血栓性障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害の発症後に投与される。特定の実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害または慢性血栓性障害のいずれかである血栓性障害を発症するリスクのある患者に投与される。

二重特異性抗体誘導体またはその一部の例示的な配列（配列番号１〜１８）は、本明細書に記載されている。また、本開示の二重特異性抗体誘導体は、本明細書に記載の例示的な配列と同一、実質的に同一、同族または類似であってもよい。

「配列同一性」とは、比較ウィンドウまたは指定領域において最大の一致を得るために、２つのアミノ酸を整列して、当該技術分野で公知の配列比較アルゴリズムを用いてまたは手動整列および目視検査によって比較する場合に、２つのアミノ酸の配列または部分配列が同一であるまたは特定の割合で同様のアミノ酸残基（例えば、６０％または６５％の同一性、好ましくは７０％〜９５％の同一性、より好ましくは、＞９５％の同一性）を有することを意味する。特定の実施形態において、上記の同一性は、長さが少なくとも約５〜１０個のアミノ酸である領域に存在する。

本発明の文脈において、特定の「指定領域」は、本発明のＣＤＲ領域を指す。これらのＣＤＲ領域は、参照抗体の機能的特性を維持する場合、１つ以上のサブ部位が１つ以上のＣＤＲに存在してもよいが、一般的に保存性領域（参照配列に比べて、１００％の配列同一性を有する）である。典型的な実施形態において、ＣＤＲ領域が５個のアミノ酸から約２０個のアミノ酸に変化するため、修飾ＣＤＲの抗体配列は、ＣＤＲ領域に位置する参照配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％または９５％の配列同一性を有する。

ＣＤＲ領域外の可変重鎖または軽鎖の配列は、抗体の機能を維持することができる限り、厳しく制限されてもよい。したがって、３つのＣＤＲ配列のうち、１つ、２つまたはすべてのＣＤＲ配列が対応するＣＤＲの参照配列と１個のアミノ酸で異なる場合またはすべてのＣＤＲ領域が参照配列のＣＤＲ領域と同一である場合、可変鎖は、可変鎖の参照配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有してもよい。

特定の位置で異なっているアミノ酸を他の１９個のアミノ酸のいずれかに変更することができ、いわゆる「保存的置換」にすることができる。

タンパク質の立体構造または機能を変更することなく、タンパク質にこのような「保存的アミノ酸置換」をしばしば行うことができることは、タンパク質化学において定着した原則である。このような変更は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびロイシン（Ｌ）のいずれかを用いて他の任意の疎水性アミノ酸を置換すること、アスパラギン酸（Ｄ）を用いてグルタミン酸（Ｅ）を置換することまたはその逆、グルタミン（Ｑ）を用いてアスパラギン（Ｎ）を置換することまたはその逆、セリン（Ｓ）を用いてトレオニン（Ｔ）を置換することまたはその逆、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）およびフェニルアラニン（Ｆ）のいずれかを用いて他の任意の芳香族アミノ酸を置換することまたはその逆を含む。また、特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造においてその役割に応じて、他の置換を保存的置換として考えることもできる。例えば、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）が相互置換できると同様に、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば相互置換することができる。比較的疎水性のメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシンおよびイソロイシンを用いて置換することができ、場合によってバリンを用いて置換することができる。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸残基の有意な性質が電荷であって且つ２つのアミノ酸残基間のｐＫの違いが重要ではない位置において、しばしば相互置換可能である。「二重特異性抗体」(bispecific antibody)は、２つの異なる抗原と同時に結合できる抗体に基づいた構造物を指す。本発明の文脈において、二重特異性抗体は、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１と特異的に結合する抗体を意味する。

「ダイアボディ」(diabody)は、二重特異性抗体の特定種類である。このような抗体において、一方の抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）に位置する他方の抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続されている。同一の鎖に位置する２つのドメイン間にペアリングを形成できない程の短いリンカ（linker）を使用することによって、２つのドメインは、余儀なく別の鎖上の相補ドメインとペアリングし、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディにおいて、抗原結合部位が互いに逆方向に指向する。

一般的に、これらは、ｓｃＦｖ構造物の複合体である。異なる構成も可能である。可能な構成とは、２つのポリペプチドの複合体を意味し、すなわち、抗ＴＡＦＩ抗体のＶＨ領域および抗ＰＩＡ−１抗体のＶＬ領域を有する融合タンパク質と、抗ＴＡＦＩ抗体のＶＬ領域および抗ＰＩＡ−１抗体のＶＨ領域を有する融合タンパク質との複合体を意味する。別の例として、単一のペプチド鎖に位置する２つのＶＨ領域および２つのＶＬ領域を有するタンデムｓｃＦｖが挙げられる。また、ｓｃＦｖのリンカペプチドが２つの可変領域が折畳めない程短い（約５個のアミノ酸）である場合、ｓｃＦｖは、余儀なく二量体化される。

「標的ドメイン」は、１つの抗原と特異的な抗原結合するために必要な二重特異性抗体の部分（抗原結合領域）を意味する。

「線維素溶解」は、凝血塊中の線維素の分解を意味する。
「血栓溶解」は、特に凝血塊を形成する線維素の糸および他の構成要素を崩壊することによって、凝血塊の分解を意味する。

「ＴＡＦＩ」（トロンビン活性化可能な線溶阻害剤）は、カルボキシペプチダーゼＢ２（ＣＰＢ２）、カルボキシペプチダーゼＵ（ＣＰＵ）または血漿カルボキシペプチダーゼＢ（ｐＣＰＢ）とも知られている。ＴＡＦＩは、プラスミノーゲンの結合および活性化に重要である線維素Ｃ末端の残基を除去することによって、線維素溶解を低減する酵素である。

「ＰＡＩ−１」（プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１）は、内皮プラスミノーゲン活性化因子阻害剤またはセルピンＥ１とも知られている。ＰＡＩ−１は、プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕＰＡ）を阻害するセリンプロテアーゼ阻害剤である。

血栓は、生存期間中、心臓血管系において血液の成分から形成された凝血塊を意味する。血栓は、閉塞物であってもよく、または閉塞なしで血管または心臓壁に付着された付着物であってもよい。血栓の例示として、線維素の沈着によって形成された線維素凝血塊および主に血小板からなる白い凝血塊または薄色凝血塊が挙げられる。

「ｔＰＡ」（組織プラスミノーゲン活性化因子）は、野生型タンパク質を意味するが、レテプラーゼまたはテネクテプラーゼとして知られている改変タンパク質を含む。

「血栓症」は、血栓が血管内に形成されたことによって特徴付けられた病気であり、凝固性亢進、内皮損傷／機能不全、並びに血行停止および血行乱れを含む血液動態変化（合わせて、Virchowの三主徴として知られている）のうち、１つ以上の異常に起因したものであると考えられる。血栓症は、血栓の形成部位で血管の閉塞を引き起こす可能性があり、または形成部位から離れた部位で血管の閉塞（すなわち、塞栓症）を引き起こす可能性がある。両方の場合、血管の閉塞は、血管によって組織に供給される酸素の供給を中断し、低酸素症、無酸素症および心筋梗塞をもたらす。したがって、深部静脈血栓症、肺塞栓症および動脈血栓症を含む多くの病気は、血栓症から由来する。これらの病気は、心臓発作および脳卒中などを引き起こす。

「血栓性障害」は、本明細書に使用される場合、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、肺塞栓症（ＰＥ）、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）、網膜中心動脈閉塞（ＣＲＡＯ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、および（脳卒中、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）および急性末梢動脈閉塞（ＡＰＡＯ）などの）血栓性神経障害を含むが、これらに限定されない。

また、血栓性障害は、対象者神経系の正常な機能または解剖学的構造に直接にまたは間接に影響を与える血栓性神経疾患、障害または病気、例えば、脳血管不全症、脳卒中および（糖尿病性またはその他の）網膜虚血症などの脳虚血症または脳梗塞、緑内障、網膜変性症、多発性硬化症、虚血性視神経症、再灌流による急性脳虚血、周産期低酸素性虚血性傷害、または（硬膜外出血、硬膜下出血、くも膜下出血および脳内出血を含むがこれらに限定されない）任意種類の頭蓋内出血を含むが、これらに限定されない。

特定の実施形態において、血栓性障害は、遺伝的な病気である。特定の実施形態において、血栓性障害は、後天的な病気である。血栓性障害は、急性、慢性および／または再発的である。特定の実施形態において、血栓性障害は、急性であり、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、心筋梗塞（ＭＩ）、肺塞栓症、末梢動脈疾患、肝臓および／または腎臓血栓症、またはカテーテル閉塞症のうち、少なくとも一方である。血栓性障害は、例えば、脳卒中または虚血性脳卒中によって、脳梗塞を引き起こす脳血管系の閉塞性症候群であってもよい。いくつかの実施形態において、急性血栓性障害は、ＡＩＳである。特定の実施形態において、急性血栓性障害は、ＭＣＡＯである。

血栓性障害の治療に使用された二重特異性抗体誘導体
二重特異性抗体誘導体は、２つのＩｇＧから由来する場合、二重特異性を達成するために、凝血塊に効率的に進入することができる現在利用可能な最小の構成を表す。二重特異性は、同一の時間、同一の位置および同一の濃度でＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１を阻害するため、類似の薬物動態プロファイルおよび生体分布をもたらす。いくつかの実施形態において、血栓性障害の治療に使用された二重特異性抗体誘導体は、モノクローナル抗体（ＭＡ）に基づいている。例えば、ＴＡＦＩを標的にするＭＡの例示として、ＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５およびＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６［６，７］（上記に引用されたHillmayer; 上記に引用されたVercauteren (2011)）が挙げられ、ＰＡＩ−１を標的とするＭＡの例示として、ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７およびＭＡ−ＭＰ２Ｄ２（上記に引用されたDe BrockおよびVan De Craen）が挙げられる。二重特異性抗体誘導体の１つの例示として、ＤｂＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７（Wyseure T et al. (2013) J Thromb Haemost. 11, 2069-2071）が挙げられる。特定の実施形態において、二重特異性抗体誘導体の効力は、いずれかのＭＡを単独で投与する時の効力を超える。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合し、アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合し、アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む。

例えば、二重特異性抗体誘導体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合し、配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合し、配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む第２標的ドメインとを含む。

特定の実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって表される第１ドメインと、配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって表される第２ドメインとを含む。

配列番号１７は、Ｎ末端側で配列番号１３を有する配列と、Ｃ末端側で配列番号１６を有する配列とを含む。

配列番号１８は、Ｎ末端側で配列番号１５を有する配列と、Ｃ末端側で配列番号１４を有する配列とを含む。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体中のアミノ酸配列は、開示された配列番号１〜１８を有するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。例えば、配列番号２を有する配列において、（「Ｘ」でマークされた）２番目のアミノ酸残基は、ＶａｌまたはＩｌｅであってもよい。これに対応して、配列番号１３を有する配列において、（「Ｘ」でマークされた）５１番目のアミノ酸残基は、ＶａｌまたはＩｌｅであってもよい。特定の実施形態において、標的に対する二重特異性抗体誘導体の結合特性を著しく影響しないように、二重特異性抗体誘導体のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を変更してもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸残基の変更は、二重特異性抗体誘導体の安定性に影響を及ぼす可能性がある。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、本明細書に開示されたように、例えばヒト化抗体である。

本明細書に開示された二重特異性抗体は、ｔＰＡに比べて神経毒性が少なく、脳病変に罹患している患者の病変サイズを減少すために使用されることができる。脳病変は、脳卒中、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）および／または中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）などの血栓性障害によって引き起こされ得る。血栓性障害に罹患している患者の血栓炎症は、二重特異性抗体によって低減されることができる。

血栓溶解治療の危険な副作用は、例えば頭蓋内出血による出血リスクの増加である。本明細書に記載の二重特異性抗体は、ｔＰＡに比べて、出血リスク試験用の動物モデルにおいて出血を延長しなかったため、出血または出血リスクを低減または最小化するために使用されることができる。また、このような二重特異性抗体は、半減期が比較的短いため、この二重特異性抗体で治療した患者の頭蓋内出血などの副作用を最小限に抑えることができる。

脳卒中、急性虚血性脳卒中（ＡＩＳ）および／または中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）などの血栓性障害のさらなる後遺症は、神経損傷である。いくつかの実施形態において、本明細書に開示された二重特異性抗体は、運動損傷、知覚損傷および／または認知損傷などの神経損傷を治療するために使用されることができる。四肢の屈曲、横押しおよび握力などにおける損傷および／または制限は、本明細書に開示された二重特異性抗体で治療することができる。

投与
血栓溶解治療のタイミングが重要である。例えば、急性心筋梗塞、急性虚血性脳卒中または急性大規模肺塞栓症などの急性血栓性障害の場合、一般的に、血栓を崩壊させるために、脳卒中発症後１５時間以内に、脳卒中症状の発症後できるだけ早く、例えば０〜６時間または４．５時間に、ｔＰＡを投与する。同様に、いくつかの実施形態において、本明細書に開示された二重特異性抗体誘導体は、血栓性障害症状の発症後０〜１５時間の間に投与される。血栓性障害は、例えば、脳卒中、ＡＩＳまたはＭＣＡＯなどの急性血栓性障害であってもよい。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、血栓性障害症状の発症後０．５時間、１時間、１．５時間、３時間、４時間、４．５時間、またはそれ以上の時間に投与され、例えば、症状の発症後４．５時間に投与される。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、血栓性障害症状の発症後１２時間に投与される。二重特異性抗体誘導体は、静脈投与されてもよく、または凝血塊に直接投与されてもよい。

現在までに、ｔＰＡのようなプラスミノーゲン活性化因子は、米国ＦＤＡにより承認された唯一の血栓溶解剤であり、主に急性血栓性障害を治療するための第１選択肢である。しかしながら、一部の患者がｔＰＡ治療に反応しないため、さらなる介入治療薬が必要である。したがって、いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡなどのプラスミノーゲン活性化因子と共に投与される。併用療法として、二重特異性抗体誘導体は、例えばｔＰＡと同時に投与されてもよい。また、二重特異性抗体誘導体は、最初にｔＰＡを投与した後に、投与されてもよい。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡ投与後の１時間に投与される。患者は、１時間以内にｔＰＡに反応しない場合、さらなる介入治療薬として、二重特異性抗体誘導体を投与してもよい。

本開示の驚くべき且つ予想外の発見は、二重特異性抗体誘導体は、閉塞後９０分までに投与される場合、ｔＰＡが存在してもしなくても、同等な効力を有することである。さらに、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡよりも優れた血栓溶解作用を有する。したがって、本明細書に開示された二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡのようなプラスミノーゲン活性化因子の代わりに、血栓溶解剤として使用されてもよい。本開示の一局面は、急性血栓性障害を治療するために、本明細書に開示された二重特異性抗体誘導体の使用に関する。この場合、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡなしで投与される。特定の実施形態において、急性血栓性障害は、線維素豊富な凝血塊の存在により特徴付けられる。いくつかの実施形態において、急性血栓性障害は、血小板豊富な凝血塊の存在により特徴付けられる。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害の発症後最大９０分までに、例えば発症後０〜９０分の間に、ｔＰＡなしで投与される。したがって、二重特異性抗体誘導体は、急性血栓性障害発症後の０分、１０分、１５分、２０分、３０分、４０分、４５分、５０分、６０分、７０分、８０分または９０分に投与されてもよい。

いくつかの実施形態において、急性血栓性障害の治療が急性血栓性障害の発症の少なくとも９０分後に行われた場合、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡと共に投与される。二重特異性抗体誘導体とｔＰＡとの合剤は、発症後９０分に投与されてもよく、または発症後２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、またはそれ以上の時間に投与されてもよい。特定の実施形態において、ダイアボディの投与は、有害な神経毒性作用を引き起こさない。ｔＰＡと併用して投与される場合、二重特異性抗体誘導体は、ｔＰＡを単独で使用する時に観察された副作用を増強することなく、ｔＰＡによる血栓溶解作用を増強することができる。また、本明細書に開示された二重特異性抗体誘導体は、アスピリン、クロピドグレルおよびジピリダモールなどの抗血小板治療薬、ヘパリン、ワルファリンおよびダビガトランなどの抗凝血治療薬、および／または血管再建術、頸動脈内膜切除術、頸動脈血管形成術、動脈内血栓溶解療法、および脳虚血（ＭＥＲＣＩ）塞栓の機械除去などの外科介入と併用することができる。

本発明のダイアボディは、ボーラスとして投与されてもよく、長時間にわたって投与されてもよい。

患者に投与されるダイアボディの総量は、０．１、０．５、１ｍｇ／ｋｇ体重から、２または５ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲にすることができる。

抗体の過剰量の投与が有害な副作用を有しないため、患者の体重にかかわらず、総用量１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、８０ｍｇまたは１００ｍｇのダイアボディを投与してもよい。

予防
血栓性障害は、特に高齢者集団および／または過去に血栓性障害を患った患者において多発である。血栓性障害は、急性血栓性障害であってもよく、慢性血栓性障害であってもよい。ＡＩＳおよび／またはＭＣＡＯなどの脳卒中の追加の危険因子は、高齢、アルコールの摂取、アテローム性動脈硬化症、心房細動、経口避妊薬の使用、糖尿病、不良飲食、脳卒中の家族歴、線維筋性異形成、高血圧、高コレステロール、（遺伝性または後天性の）血液凝固亢進、炎症、低出生体重、偏頭痛、肥満症、卵円孔開存、運動不足、閉経後ホルモン治療、脳卒中前歴、特定の人種／民族、鎌状赤血球症、睡眠時無呼吸、一過性脳虚血発作、喫煙などを含む。肺塞栓症を頻繁に誘発する深部静脈血栓症（ＤＶＴ）などの静脈血栓症の危険因子は、高齢、大手術、整形外科手術、癌、運動抑制、妊娠、抗リン脂質症候群、外傷、足軽傷、静脈血栓症前歴、経口避妊薬の使用、ホルモン補充療法、中心静脈カテーテル、炎症性疾患または自己免疫疾患、ネフローゼ症候群、肥満症、感染症、ＨＩＶ、真性多血症、および化学療法、ならびに遺伝性危険因子を含むがこれらに限定されない。遺伝性危険因子としては、抗トロンビン欠乏症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、第Ｖ因子ライデン、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ、異常線維素原血症、非Ｏ血液型を含むがこれらに限定されない。追加の危険因子としては、低レベルのプロテインＳ、活性化プロテインＣ抵抗性、高レベルの第ＶＩＩＩ因子、高ホモシステイン血症、および／または高レベルの線維素原、第ＩＸ因子および／または第ＸＩ因子を含むがこれらに限定されない。

本開示のさらなる局面は、急性または慢性血栓性障害を発症する危険性のある患者に使用される二重特異性抗体に関する。この二重特異性抗体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合し、アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合し、アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む。二重特異性抗体誘導体は、急性または慢性血栓性障害の発症前に投与される。特定の実施形態において、急性または慢性血栓疾患は、血栓塞栓症である。

例えば、二重特異性抗体誘導体は、トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合し、配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む第１標的ドメインと、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合し、配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む第２標的ドメインとを含む。

特定の実施形態において、二重特異性抗体誘導体は、配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって表される第１ドメインと、配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列によって表される第２ドメインとを含む。

いくつかの実施形態において、二重特異性抗体誘導体中のアミノ酸配列は、開示された配列番号１〜１８を有するアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。例えば、配列番号２を有するアミノ酸配列において、（「Ｘ」でマークされた）２番目のアミノ酸残基は、ＶａｌまたはＩｌｅであってもよい。これに対応して、配列番号１３を有するアミノ酸配列において、（「Ｘ」でマークされた）５１番目のアミノ酸残基は、ＶａｌまたはＩｌｅであってもよい。

参照による援用
本明細書に記載されたすべての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が具体的に且つ個別に参照により組み込まれたように、その全体が参照として本明細書に援用される。矛盾する場合、定義を含む本願は、優先する。

等価物
本明細書において、本発明の特定の実施形態を議論してきたが、これらの実施形態は、例示的なものであり、限定的なものではない。本発明の多くの変形は、本明細書および添付の特許請求の範囲を検討することによって、当業者にとって明らかになるであろう。本発明の範囲は、明細書、変形例およびその等価物と共に、特許請求の範囲を参照することによって決定されるべきである。

実施例
一般的な開示を提供したが、以下の実施例は、一般的な開示を説明するために役立つ。これらの具体的な実施例は、本開示の特定の局面および実施形態を例示するために含まれ、いかなる点で限定する意図をしていない。また、実施例に記載された一般的な原理は、一般的に本開示の他の局面または他の実施形態に適用可能である。

抗体エンジニアリングにより、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する不安定な二重特異性阻害剤（Ｄｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５×３３Ｈ１Ｆ７）の発現および効力の改善
Ａ．ＣＤＲグラフト化による安定な可変ドメインの設計
ｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５が過去の研究において産生されたが、細菌によって産生されたものではないため、対応のＤｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５×３３Ｈ１Ｆ７が不安定であり、凝血塊を溶解する作用が低いことが分かった。したがって、相補性決定領域（ＣＤＲ）を安定なｓｃＦｖ−４Ｄ５骨格（図１Ａ）にグラフト化することによって、ＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５の可変ドメインを最適化した（Jung S. & Pluckthun A. (1997) Protein Eng. 10, 959-966）。この論文は、ＣＤＲグラフト化に使用された４Ｄ５ヒト化抗体を開示した。２つの手法で行われた。具体的には、（ｉ）ｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５およびｓｃＦｖ−４Ｄ５の構造整列に基づくストラトジー（structure alignment-based strategy）を用いて、ｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５ＤＭを産生した（Marc Demaeyer教授との共同研究）。（ｉｉ）証例に基づくストラトジー（evidence-based strategy）を用いて、ｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５を産生した（Ewert S. et al. (2004) Methods. 34, 184-199）。後者の手法は、ｓｃＦｖ−Ｔ１２Ｄ１１（de Develter et al. 2008 J Thromb Haemost. 6, 1884-1889に開示されたｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−Ｔ１２Ｄ１１を産出する抗ＴＡＦＩ抗体）の安定な骨格上で行われた。ウエスタンブロット解析は、単独のｓｃＦｖ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５が正しく発現および分泌される（図１Ｂ、レーン１）ことを明らかにした。したがって、これらのＣＤＲグラフト化した可変ドメインは、対応する（ｓｃ）Ｄｂ構造物に使用された。

Ｂ．ＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５およびＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７から二重特異性抗体に基づく阻害剤の産出
ＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５およびＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７から、４つの二重特異性阻害剤、すなわち、Ｄｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５×３３Ｈ１Ｆ７（Ｄｂ）、Ｄｂ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５×３３Ｈ１Ｆ７（ＣＤＲグラフト化Ｄｂ）、ｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５（ＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５の可変ドメイン間に追加の可撓性リンカを備えたｓｃＤｂ）、およびｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５（ＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂ）を作り出した（図２を参照）。ＣＤＲグラフト化によって、ＤｂおよびｓｃＤｂの細菌および真核細胞による発現は、それぞれ増加した（ＣＤＲグラフト化Ｄｂの場合、Ｄｂに比べて、約１．５ｍｇ／Ｌの培地では２倍に増加した。ＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂの場合、ｓｃＤｂに比べて、１１±１ｍｇ／Ｌの培地では１０倍に増加した）。

Ｃ．二重特異性阻害剤の阻害特性
機能アッセイによって確認されたように、Ｄｂ、ＣＤＲグラフト化Ｄｂ、およびＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂは、親抗体の阻害特性を保留した。ｓｃＤｂの産出が不足のため、その阻害特性を評価することができなかった。

Ｄ．クエン酸処理ラット血漿中のダイアボディの安定性および線維素溶解促進特性
すべての構造物のうち、ＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂのみは、ダイアボディの対照物Ｄｂ−Ｔ１２Ｄ１１×３３Ｈ１Ｆ７と同様の安定性を示した（３７℃で３時間後、８８±１３％の残基結合活性、図３Ａ）。また、ＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂは、ＭＡ−ＲＴ３６Ａ３Ｆ５に比べて、０．８１±０．２３という相対的な線維素溶解促進作用を有するため、最も強力な構造物であった（図３Ｂ）。ＰＡＩ−１の基準血漿濃度が低いため、血漿に基づくアッセイにおいて、ＰＡＩ−１阻害部分の作用寄与を評価することができなかった。

結論として、ラットのＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する不安定な二重特異性抗体に基づく阻害剤の血漿安定性を高めるための努力は、７倍に増加した安定性および線維素溶解促進作用を発揮するＣＤＲグラフト化ｓｃＤｂをもたらした。この抗体の誘導体をマウスＴＡＦＩおよびマウスＰＡＩ−１と交差反応することによって、マウスおよびラットのインビボ評価を可能にした。

ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する新規二重特異性阻害剤の線維素溶解促進特性のインビトロ評価
Ａ．Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７の産出
各々の親抗体（ＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６とＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７）の阻害能力を保留した安定なｓｃＦｖの成功産出に基づいて、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７を産出した。図２の左下に示すように、このダイアボディは、２つのポリペプチド鎖を含む。１つ目は、抗ＴＡＦＩ抗体のＶＨ鎖と抗ＰＡＩ−１抗体のＶＬ鎖との融合タンパク質である。２つ目は、抗ＴＡＦＩ抗体のＶＬ鎖と抗ＰＡＩ−１抗体のＶＨ鎖との融合タンパク質である。

Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７の産出レベルは、１Ｌの培地で約２ｍｇであった。

Ｂ．ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する阻害作用の特徴付け
機能アッセイによって確認されるように、ヒトおよびマウスのＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する親抗体の阻害特性は、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７に保留された。また、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７は、ヒト血漿、マウス血漿およびラット血漿に３７℃で８時間インキュベーションされた後、安定であった。

Ｃ．全血における血栓粘弾性解析によるＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７の作用
ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１の阻害による線維素溶解促進作用を評価するために、４つのＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７をヒト全血にインキュベートし、その作用を血栓粘弾性測定法（thromboelastometry）によって解析した（Wyseure T. et al. (2013) J. Thromb. Haemost. 11, 2069-2071）。両方のＭＡの複合添加およびダイアボディの添加は、線維素溶解を非常に有意義な程度（Ｐ＜０．００１）に促進した。一方、単一のＭＡの添加は、わずかな効果しか引き起こさなかった（図４Ａ）。

また、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７の作用は、マウスからの全血においても評価された。ＰＡＩ−１の濃度がマウス血液において非常に低いため（ヒト血液の血清濃度２６７±１１４ｎｇ／ｍｌに対し、マウス血液の血清濃度が３．０±０．３ｎｇ／ｍｌであった。平均値±ＳＤ、ｎ＝４）、マウス血液の血栓粘弾性解析は、ＰＡＩ−１に反応しなかった。マウス血液中のＰＡＩ−１濃度を増加するために、血栓粘弾性解析用の血液を採取する前に、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することによって、実験的内毒血症を誘発した。両方のＭＡの複合添加およびダイアボディの添加は、線維素溶解を非常に有意義な程度（Ｐ＜０．０５）に促進した。一方、単一ＭＡの添加は、有意義な効果を引き起こさなかった（図４Ｂ）。

したがって、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７は、強いインビトロ線維素溶解促進特性を示している。

ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する二重特異性阻害剤の線維素溶解促進特性のインビボ評価
１．全身血栓誘発後、ＴＡＦＩ／ＰＡＩ−１の二重阻害による補完効果
すべての循環抗原を標的とする用量のＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６またはＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７で前処理したマウスは、トロンボプラスチンの全身投与によって、血栓塞栓症に罹病させた。肺内の線維素の沈着のみが、ＴＡＦＩ阻害剤（図５）の投与によって、基準線レベルに低減された。ＰＡＩ−１の濃度がマウスにおいて非常に低いため、ＰＡＩ−１の阻害効果が検出されなかった。

このモデルにおいてＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１の同時阻害を評価するために、内毒血症を誘発することによって、血漿中のＰＡＩ−１濃度を上昇させた。ＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６（５ｍｇ／ｋｇ）によるＴＡＦＩ阻害によってまたはＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７（１０ｍｇ／ｋｇ）によるＰＡＩ−１阻害によって、肺内の線維素の沈着が低減された。しかしながら、これらの低減は、最大値に達していなかった。ＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６（５ｍｇ／ｋｇ）およびＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を投与した後、肺内の線維素濃度が基準線に戻った（図６Ａ）。ＭＡの投与量を１ｍｇ／ｋｇに減少したときに、この最大の効果が無くなった（図６Ｂ）。ダイアボディ（０．８ｍｇ／ｋｇのＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７、すなわち、各々１ｍｇ／ｋｇのＭＡの組み合わせによって達成したＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１を標的にする用量と同様の用量）で処理することによって、肺から線維素除去の最大効果が得られた。

実証されたように、ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１の同時阻害は、血栓塞栓症モデルから線維素の除去において、相加効果をもたらした。Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７を使用する場合、最も効果的である。

２．急性虚血性脳卒中のマウスモデルにおけるＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７の効果
ｉ．モノフィラメント媒介ＭＣＡＯ
一過性閉塞は、モノフィラメントをＭＣＡに入れることによって達成された。このモデルは、脳虚血／再灌流損傷に対するＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１の阻害効果を評価するために使用された。一般的に、このモデルは、測定可能な神経／運動欠陥を有する未処理マウスに大きな病変体積を引き起こす。脳卒中の前臨床評価に最も重要なのは、病変サイズに加えて、神経パラメータを評価することである。興味深いことに、このモデルにおいて、ｔＰＡは、局所脳虚血後、神経損傷を悪化させることによって有害な作用を有することが明確に記載されている（Wang YF, et al. (1998) Nat Med. 4, 228-231）。２５ｍｇ／ｋｇのＭＡ−ＴＣＫ２６Ｄ６または６ｍｇ／ｋｇのＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７による治療は、閉塞後の２４時間に、脳病変を減少し（図７Ａおよび７Ｄ）、神経および運動の同時回復を引き起こした（図７Ｂ〜Ｃおよび７Ｅ〜Ｆ）。また、処理されたマウスは、対照マウス（図７Ｇ）に比べて、脳の同側の線維素（原）の含量がより少なった。対照物としてのＩｇＧは、図７ではＭＡ−Ｔ３０Ｅ５であり、図８ではＭＡ−ＮＢ２７Ｂ３であった。１ｍｇ／ｋｇのいずれか１つの親抗体による治療は、閉塞後の２４時間に、神経および運動の回復を引き起こさなかった（図８Ａ〜Ｃ）。しかしながら、抗体の併用投与は、脳病変を実質的に１．９倍に減少した（図８Ａ）。さらに、同様用量のダイアボディは、病変サイズを同様に減少（２．３倍）した上、神経および運動スコアを同時に改善した（図８Ａ〜Ｃ）。病変サイズは、媒介物の場合、７６±１１ｍｍ^３であり、対照物ＩｇＧの場合、８１±１１ｍｍ^３であり、ＭＡと併用する場合、４３±８ｍｍ^３であり、ダイアボディの場合、３５±８ｍｍ^３であった。さらに、ウエスタンブロット解析は、親抗体またはダイアボディの併用が、再灌流損傷によって誘発された大規模な線維素沈着を少なくとも２倍に効果的に減少したことを明らかにした（図８Ｄ、ｐ＜０．０５、ｎ＝３〜４匹マウス／群）。

ｉｉ．トロンビン媒介ＭＣＡＯ
トロンビン注射により得られた血栓塞栓性脳卒中モデルは、使用された。このモデルは、血栓に線維素が豊富であるため、ｔＰＡによる血栓溶解を受けやすい。ダイアボディの効力は、現行の血栓溶解剤としてのｔＰＡと比較した。ｔＰＡの循環半減期が短いため（約５分）、血栓溶解の臨床手順を模擬するために、最初にｔＰＡ容積の１０％をボーラスとして投与し、残りの９０％を４０分間以内に点滴により投与した（Chandler WL et al. (1997) Circulation. 96, 761-768）。閉塞の２４時間後、媒介物グループ（血管造影中央値スコア＝２、図９Ｂ）を含むすべてのグループに、動脈内腔の完全再疎通が見られた。同一時点のスペックル造影は、媒介物グループ（図９Ｃ）の閉塞の遠位端に位置するＭＣＡ領域において、４０％の組織灌流の減少を示した。興味深いことに、単独のダイアボディまたはｔＰＡは、脳灌流を著しく増加しなかったが、ダイアボディおよびｔＰＡの併用は、脳灌流を実質的に回復した（図９Ｃ、媒介物に対してｐ＜０．０５、ｎ＝６〜８匹マウス／群）。ｔＰＡの投与によって、病変体積が減少されたが、この減少は、統計的に有意ではなかった（図９Ａ、２６±１２ｍｍ^３に対して３７±１３ｍｍ^３であり、ｐ＝０．２０３、ｎ＝６〜８匹マウス／群）。これとは対照物的に、閉塞後２０分でダイアボディの早期投与（０．８ｍｇ／ｋｇ）は、ｔＰＡの同時投与に関係なく、２４時間後病変体積を実質的に縮小した（図９Ａ、ダイアボディの場合、１５±４ｍｍ^３であり、ダイアボディ＋ｔＰＡの場合、１５±８ｍｍ^３である。媒介物に対する各々のｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５、ｎ＝６〜８匹マウス／群）。図９Ａおよび９Ｄは、同様の条件を示している。また、処置は、臨床により関連する時点、例えば閉塞後の９０分（中間時点）に引き延ばされ（Hacke W. et al. (2004) Lancet 363, 768-774）、閉塞後の２４時間で、すべての治療群において完全再疎通が観察された（血管造影中央値スコア＝２）。中間時点まで引き延ばしたダイアボディの投与またはｔＰＡの投与は、病変体積に有益な効果を示した（図９Ｅ、媒介物の２５±３ｍｍ^３に比べて、ｔＰＡは、２４±３ｍｍ^３であり、Ｄｂは、２１±４ｍｍ^３である。ｎ＝９〜１０匹マウス／群）。しかしながら、同一の処理時点で、ｔＰＡ点滴の前に、ダイアボディの投与は、病変体積を有意に減少した（図９Ｅ、１５±２ｍｍ３（Ｄｂ＋ｔＰＡ）、媒介物に対してｐ＜０．０５、ｎ＝１０匹マウス／群）。

閉塞後の２４０分（遅い時点、図９Ｆ）で投与した場合、いずれの処置は、このモデルの病変サイズに影響を与えなかった。

脳卒中発症後の９０分およびその以降、ｔＰＡ処置は、常に有益な結果を得られなかった。その原因は、おそらく凝血塊の安定性が増加する（すなわち、凝血塊が収縮する）ため、血栓溶解に対する抵抗、ｔＰＡにより漸進的に損傷した脳に与えた神経毒性作用および／または出血性形質転換の危険性増加を引き起こす。本実施例において、閉塞後の９０分のｔＰＡ処置またはダイアボディ処置のいずれも、病変体積を減少なかった。しかしながら、ダイアボディおよびｔＰＡの併用処置は、病変体積を有意に減少した。このことは、現行の血栓溶解処置にダイアボディを追加することによる潜在的な臨床有益性を支持した。閉塞の後４時間という遅い処置時点で、ｔＰＡ単独でまたはダイアボディとの併用による処置の後に、病変体積の増加傾向が観察された（図９Ｆ）。インビトロ神経毒性データ（図１４）によって、ダイアボディは、インビボ有害作用を有しなかった。

ｉｉｉ．ＦｅＣｌ_３媒介ＭＣＡＯ
血小板豊富な凝血塊は、ｔＰＡによる処置に対してより抵抗性がある（Kim EY et al. (2006) Neurology 67, 1846-1848）。したがって、ＦｅＣｌ_３により誘発した血小板豊富なＭＣＡＯモデルを使用して、臨床に関連する問題を模擬した。予想の通りに、ｔＰＡは、（ｉ）閉塞後の１時間にＣＢＦの増加（レーザドップラ追跡、図１０Ａ）、（ｉｉ）閉塞後の２４時間に血管造影スコアの改善（図１０Ｃ）、（ｉｉｉ）閉塞後の２４時間に病変体積の減少、または（ｉｖ）閉塞後の２４時間に脳灌流の増加（スペックル造影、図１０Ｄ）には、効果がなかった。１．６ｍｇ／ｋｇのダイアボディの投与は、閉塞後の１時間にＣＢＦを著しく増加し（図１０Ａ、媒介物に対してｐ＜０．０５、ｎ＝８〜１５匹マウス／群）且つ閉塞後の２４時間に血管造影スコアを著しく増加したが（図１０Ｃ、媒介物に対してｐ＜０．０５、ｎ＝８〜１５匹マウス／群）、脳灌流または病変体積を改善しなかった（図１０Ｂおよび１０Ｄ）。これとは対照物的に、３．６ｍｇｍｇ／ｋｇのダイアボディの投与は、閉塞後の１時間にＣＢＦを著しく増加（図１０Ａ、媒介物に対してｐ＜０．０５、ｎ＝８〜１５匹マウス／群）した。これによって、閉塞後の２４時間に、血管造影スコアを著しく増加し（図１０Ｃ、ｐ＜０．０５、ｎ＝８〜１５匹マウス／群）、病変体積を縮小し（図１０Ｂ、媒介物に対してｐ＜０．０５、ｎ＝８〜１５匹マウス／群）、および脳灌流を増加した（図１０Ｄ、媒介物に対してｐ＜０．０５、ｎ＝８〜１４匹マウス／群）。

結論として、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７として命名された強力な線維素溶解促進剤は、一連の脳卒中マウスモデルにおいて、ロバストなインビボ性能を示した。

ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する二重特異性阻害剤のインビボ発現
ｓｃＤｂは、真核細胞中で効率的に産生することができるため、インビボで発現された。ＴＡＦＩおよびＰＡＩ−１に対する以下の構造物、具体的にｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５、ｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７およびｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×ＭＰ２Ｄ２は、産生され、ｐｃＤＮＡ３．１にクローンされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるインビトロ発現レベルは、０．６〜１．１μｇ／ｍｌの範囲（図１１Ａ）に変動した。また、ｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５にＣＤＲグラフト化することによって、ｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５をさらに最適化した。これによって、（３７℃３時間のインキュベーションの後）、発現レベルを１０倍に増加し、血漿安定性を７倍に増加した。マウスにおいて、遺伝子導入後３日目のｓｃＤｂ−３３Ｈ１Ｆ７×ＲＴ３６Ａ３Ｆ５−４Ｄ５および遺伝子導入後６日目のｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７の血漿濃度ピーク値は、各々５８４±７９ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝６）および１８８±１９ｎｇ／ｍｌ（ｎ＝４）であり、ｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×ＭＰ２Ｄ２の発現は、検出されなかった（図１１Ｃ）。得られた血漿濃度が薬理評価に低すぎるため、循環半減期を延長するようにこれらのｓｃＤｂの薬物動態を変更した。この目的のために、親和性を改変したアルブミン結合ドメイン（Jonsson A et al. (2008) Protein Eng Des Sel. 21, 515-527）を３７℃で三日のインキュベーション後（図１１Ｂ）、血漿中で安定な構造物ｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７およびｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×ＭＰ２Ｄ２のＣ末端に融合した。アルブミン結合構造物は、ｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７×ＡＢＤＨとｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×ＭＰ２Ｄ２×ＡＢＤＨとして命名した。残念ながら、これらの構造物のインビトロ発現の２倍〜４倍の減少は、観察された（図１１Ａ）。しかしながら、ｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７のアルブミン結合変種のインビボ発現濃度は、９日目に２倍に増加（２８７±２８ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝５）し、ｓｃＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×ＭＰ２Ｄ２のアルブミン結合変種の発現は、検出されなかった（図１１Ｃ）。

出血および薬物動態の評価
ｔＰＡのＩＶ注射による効果を比較するために、２つの異なる用量、すなわち、ヒトの臨床治療に使用される用量（１ｍｇ／ｋｇ）と同等の用量および一般的にマウスに使用される用量（１０ｍｇ／ｋｇ）と同等の用量で、追加の尾部出血実験を行った。０．８ｍｇ／ｋｇおよび３．６ｍｇ／ｋｇのダイアボディ（Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７）を注射した。尾部インキュベーションの６０分後、最大３．６ｍｇ／ｋｇまでのダイアボディのＩＶ投与は、尾部出血時間またはヘモグロビン累積損失を改変しなかったことに対し、両用量のｔＰＡは、尾部出血時間を延長し、ヘモグロビン損失を増加した（図１２Ａおよび図１２Ｂ、ｎ＝９〜１６匹マウス／群）。トロンビン媒介ＭＣＡＯモデルに試験した治療計画であったダイアボディ（０．８ｍｇ／ｋｇ）とｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）との同時投与は、ｔＰＡの単独投与に比べて、尾部出血時間およびヘモグロビン損失をさらに増加しなかった。

また、機械性または血栓性ＭＣＡＯ脳卒中モデルのいずれかからは、処置後の脳出血が観察されなかった。

マウスにＩＶ投与されたダイアボディの循環半減期は、１２１分（図１３）であり、ボーラス注入を急性処置として可能にした。

材料と方法
ダイアボディ（Ｄｂ）および一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）の産出
抗体の誘導体は、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞株の可変ドメイン（Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ）をクローニングすることによって作製された。（周辺質分泌から）細菌および（細胞外分泌から）真核細胞を産生するために、ＤｂまたはｓｃＤｂを含むＤＮＡ断片をそれぞれ設計した。ＤＮＡ断片は、合成方法により作製され、大腸菌ＲＶ３０８からＤｂを産出するために、ｐＳＫＩＤ２にクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いてｓｃＤｂを産出するために、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。Ｎｉ^＋＋カラムを用いて、Ｈｉｓ_６で標記した抗体の誘導体を精製し、インビボ評価の前に、陰イオン交換クロマトグラフィーによって、内毒素を除去した。

（ｓｃ）Ｄｂの定量
ＰＡＩ−１およびＴＡＦＩに対する同時結合に基づいて、ＥＬＩＳＡによって（ｓｃ）Ｄｂを定量化した。簡単に言えば、マウスＰＡＩ−１で被覆した微量定量プレートを用いて、（ｓｃ）Ｄｂを結合し、その後、マウスＴＡＦＩと共にインキュベーションを行い、続いて、ＴＡＦＩに対するＭＡ−ＴＣＫ３２Ｇ１２−ＨＲＰを加え、発色基質としてのｏ−フェニレンジアミンを用いて顕色した後、検出を行った。

ＴＡＦＩの中和アッセイ
ＴＡＦＩに対する抗体誘導体の阻害能力は、発色アッセイを用いて残存ＴＡＦＩａの活性を測定することによって定量化され、親モノクローナル抗体（ＭＡ）の阻害特性と比較した。ＴＡＦＩは、ＭＡの動作メカニズムに応じて、トロンビン／トロンボモジュリンまたはプラスミンにより活性化される前または後に、ＴＡＦＩに対して０．０６〜８倍範囲のモル比濃度のＭＡまたはｓｃ（Ｄｂ）と共にインキュベートされた。残留ＴＡＦＩａ活性は、基質としてヒプリル−アルギニンを使用し、比色反応によって、決定された。

ＰＡＩ−１の中和アッセイ
活性ＰＡＩ−１に対する抗体誘導体の阻害能力は、プラスミノーゲン結合発色法を用いて定量化され、親ＭＡの阻害特性と比較した。ＰＡＩ−１は、ＰＡＩ−１に対して０．０６〜３２倍範囲のモル比濃度のＭＡまたはｓｃ（Ｄｂ）と共に、（室温で２時間）予備インキュベートされた。引き続きｔＰＡと共に（３７℃で１５分）インキュベーションした後、プラスミノーゲンを加え、プラスミンへの変換量が発色基質によって定量された。

インビトロ血漿の凝血塊溶解アッセイ
蓄積されたラットのクエン酸血漿は、ＭＡまたはｓｃ（Ｄｂ）と共に、（３７℃で１０分）予備インキュベートされた後、ＣａＣｌ_２およびｔ−ＰＡを加えた。その後、微量定量プレート読み取り器を用いて、濁度（ＯＤ_{４０５ｎｍ}）を測定することによって、凝血塊の溶解を経時的に監視した。線維素溶解の度合いは、１８０分の時間フレームに亘る曲線下方の面積として表記された。取得されたデータは、（ｓｃ（Ｄｂ）の結合部位の数と同様に、それぞれの抗原と等価する数の結合部位に相当する濃度の）ＭＡの存在下で得られた値に正規化した。

回転型血栓粘弾性測定法（Rotational Thromboelastometry）
４人の健康ドナーからまたは（実験開始の６時間前に、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって健康にしたまたは内毒素を除去した）マウスからのクエン酸化全血は、（それぞれの抗原と等価する数の結合部位を生成する濃度の）ＭＡまたはＤｂと共に、予備インキュベートされた。凝固およびその後の線維素溶解は、トロンボプラスチン、ＣａＣｌ_２およびｔＰＡによって引き起こした。ヒト血液の場合、線維素の溶解は、初期凝固後４５分の振幅の減少と最大振幅との比率して、決定された（Ｌ（％）＝［（Ａ_ｍａｘ−Ａ_４５）／Ａ_ｍａｘ］×１００）。各実験では、溶解の基準線（Ｌ_ＷＯ）は、ＭＡまたはＤｂを含まない同様の血液試料を用いて測定した（Ｌ_ＷＯは、１２％を超えることがなかった）。その後、特定の阻害剤で強化した溶解は、ΔＬ（％）＝Ｌ_阻害剤−Ｌ_ＷＯとして決定した。マウス血液の場合、特定の阻害剤で強化した線溶は、（凝固時間〜凝固時間＋１２０分の間に）生理食塩水（ＡＵＣ_ｗｏ）の曲線下面積（ＡＵＣ）および処置条件（ＡＵＣ_阻害剤）の曲線下面積（ＡＵＣ）の差分と、生理食塩水（ＡＵＣ_ｗｏ）の曲線下面積（ＡＵＣ）との比率とし、て決定された（相対ΔＡＵＣ＝［（ＡＵＣｗｏ−ＡＵＣ_阻害剤）／ＡＵＣ_ｗｏ］×１００）。

インビボモデル
血栓塞栓症モデル
ＭＡ、ダイアボディまたは生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）は、一晩絶食させられた未麻酔ＳＷＩＳＳマウス（実験開始の３時間前に、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって健康にしたまたは内毒素を除去した）に静脈（ＩＶ）注射した。５分後、トロンボプラスチンをＩＶ注射することによって、血栓塞栓症を誘発した。マウスをペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与）により麻酔し、血栓誘発後の１５分に、１０ ＩＵ／ｍｌのヘパリンで肺を灌流した。その後、肺を単離し、均質化した。その後、（左肺）から洗い出したホモジネートを２μＭのマイクロプラスミンと共にインキュベートすることによって、線維素を可溶化線維素分解物に変換した。これらの線維素分解物は、マウス線維素原と交差反応するＥＬＩＳＡを用いて、定量化される。肺内の線維素含有量は、線維素原当量濃度（μｇ／ｍｌ）で表した。

トロンビン媒介ＭＣＡＯモデルおよびＦｅＣｌ_３媒介ＭＣＡＯモデル
（２％イソフルラン／酸素混合物の吸入によって）麻酔されたＳＷＩＳＳマウスは、脳定位装置上に配置され、頭蓋骨切除術によって右中大脳動脈（ＭＣＡ）を露出させた。レーザドップラ流速計測法によって確認されたように、現場での閉塞は、ＭＣＡにネズミ科α−トロンビンを微量注入することによって（Orset C et al. (2007) Stroke. 38, 2771-2778）、または２０％のＦｅＣｌ_３で飽和した濾紙を適用することによって（Karatas H et al. (2011) J Cereb Blood Flow Metab. 231, 1452-1460）、実行された。血栓発症後１５分に、ＤｂまたはＰＢＳ（媒介物）を静脈注射した。５分後、尾静脈カテーテルを介して、ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水を投与した（１０％をボーラスとして投与し、残りの９０％を４０分の間に点滴した）。最初の閉塞後の２４時間に、頭蓋骨をスペックル造影装置に露出させることによって、脳同側の血流および反対側の血流をマッピングした（Moor FLPI-2、Moor機器）。反対側に比べて、脳同側血流の減少は、観察された。脳病変体積は、Ｔ２重み付きＭＲＩによって決定され、ＭＣＡの血管造影スコアは、ＭＲ血管造影によって決定された（０＝閉塞、１＝部分的な再疎通、２＝完全再疎通）。Ｔ２^＊重み付きＭＲＩを使用して、出血の発生を排除した。

トロンビン媒介モデルの異なる処置時間点を評価するために、閉塞後特定の時間点で、すなわち、初期時点（１５分）、中期時点（９０分）または後期時点（２４０分）で、尾静脈カテーテルを介して、ダイアボディ（Ｄｂ）または媒介物（ＰＢＳ）を静脈注射した。ダイアボディまたは媒介物投与後の５分に、ｔＰＡ（１０ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水を静脈投与した（１０％をボーラスとして投与し、残りの９０％を４０分の間に点滴した）。脳病変体積は、Ｔ２重み付きＭＲＩによって決定され、ＭＣＡの血管造影スコアは、ＭＲ血管造影によって決定された（０＝閉塞、１＝部分的な再疎通、２＝完全再疎通）。Ｔ２^＊重み付きＭＲＩを使用して、出血の発生を排除した。

モノフィラメント媒介ＭＣＡＯモデル
（２％イソフルラン／酸素混合物の吸入によって）麻酔されたＣ５７ＢＬ／６マウスの頸正中皮膚を切開した後、近位の総頸動脈および外頸動脈を結紮した。右内頸動脈から、標準化シリコンゴムにより被覆した６．０のナイロンモノフィラメントを挿入することによって、右ＭＣＡの端部開口を閉塞した。閉塞してから６０分後、管腔内モノフィラメントを取り出し、５分間灌流後、ＭＡまたはＰＢＳを静脈注射した。最初の閉塞の２４時間後、マウスの神経機能および運動機能をそれぞれ評価するために、改良Bederson検査および握力検査を行った。その後、マウスを安楽死させ、脳を回収して、（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド染色によって）病変体積を決定した。

神経学的検査
（ＭＣＡＯモデル）閉塞後の２４時間に、マウス全体の神経機能および運動機能を評価するために、マウスに改良Bederson検査および握力検査をそれぞれ実行した。改良Bederson検査は、以下のスコアシステム、すなわち、０＝不足、１＝前肢屈曲、２＝横方向プッシュの抵抗減少、３＝単方向旋回、４＝縦方向回転、５＝動き無しを使用している。

平坦面上の高さ４０ｃｍである２本の垂直支持体の間に取り付けられた木棒（直径３ｍｍ、長さ４０ｃｍ）に、マウスを配置して、握力検査を行った。実験は、マウスを支持体の間の棒の中間に配置して、以下のシステム、すなわち、マウスが落ちる場合、０点、マウスが２本の前足によって木棒に懸垂する場合、１点、マウスが２本の前足によって木棒に懸垂し且つ木棒の上に登るように試みる場合、２点、２本の前足の他に、１本または２本の後ろ足によって木棒に懸垂する場合、３点、すべての４本の足によって木棒に懸垂し且つ尾を木棒に木棒に巻き付ける場合、４点、（マウスが支持体のうち一方に到達することによって）逃げる場合、５点を付けることによって、評価した。評価は、盲検で行われた。

病変の定量化
（ＭＣＡＯモデル）閉塞後の２４時間に、マウスを安楽死させた。脳を直ちに回収し、マウス脳切片マトリックスを用いて、厚さ２ｍｍの冠状切片にスライスした。脳出血の有無は、目視で評価した。ＰＢＳに溶解した２％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（Sigma-Aldrich社、St. Louis, MO）を用いて、切片を染色することによって、健康組織を染色されない梗塞から識別する。Nikon（登録商標）Ｄ７０デジタルカメラを用いて、染色された切片を撮影した。梗塞領域（白）は、Image J software（国立衛生研究所、Bethesda, MD）を使用して盲目的に測定した。

タンパク質抽出およびウエスタンブロット解析
ホルマリン固定のＴＴＣ染色脳切片から、皮質および大脳基底核を含む虚血組織を切離し、前述のように、０．１％のＳＤＳおよび０．２５％のプロテアーゼ阻害剤の混合物（Roche）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（２５ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ＝７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０）を微調整したＲＩＰＡ緩衝液に均質化した。３９個のサンプルは、ＣＬＩ１２ミキサーを用いて均質化し、４℃で２０分間インキュベートし、その後、氷上で超音波処理した。次いで、４℃で組織溶解物を１５，０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清液を以下のようにウエスタンブロット解析に供した。３０μｇの総タンパク質を装入し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に移した。ブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳、５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標））−２０で１時間ブロッキングした後、膜を抗線維素原ポリクローナル抗体（ＡＰ００７６６ＰＵ−Ｎ、Acris社、１：５００倍希釈）または抗アクチンＭＡ（ＭＡＢ１５０１、Millipore社、１：５００倍希釈）と共にそれぞれ４℃で一晩または１時間インキュベートした。次いで、膜を洗浄して、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（線維素原）（Jackson ImmunoResearch、１：１４０００倍希釈）または抗マウスＩｇＧ（アクチン）（Dako、１：２０００倍希釈）と共に室温で６０分間インキュベートした。SuperSignal West Pico化学発光基質（Thermo Scientific社）を用いて、ブロットを顕色し、ＬＡＳ−４０００ミニ撮像装置（GE Healthcare社）を用いて、信号を検出した。

尾部出血アッセイ
前述のように、マウス尾静脈の出血時間は、尾部切断アッセイを用いて決定した。近位尾静脈注射を介して、ＰＢＳ、ダイアボディ、ｔＰＡを単独投与としてまたはｔＰＡ投与の５分前にダイアボディを共投与として、マウスに投与した。注射後５分に、尾部先端から３ｍｍの部分を切断し、切断尾部を直ちに３７℃で０．９％の等張食塩水に浸漬した。出血時間は、出血の初期停止（すなわち、３０秒以内に再出血しない）まで監視された。実験は、治療に対して盲目に行った。尾部切断後の６０分間にわたって、累積ヘモグロビン損失を測定した。遠心分離（２０００×ｇで１０分間）の後、血液細胞を１ｍＬの等張食塩水に再懸濁し、Cell-Dyn 3500R計数器（Abbott, Diegem, Belgium）を用いて、ヘモグロビン含量を測定した。

循環半減期の決定
尾静脈注射を介して、Ｄｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７（０．８ｍｇ／ｋｇ）をマウス（ｎ＝６）に投与した。実験前に、血液は、０．３８％のクエン酸三ナトリウム（＝プレサンプル）から回収した。注射後、血液は、５分、４５分、３時間、６時間および２４時間のいくつかの時点で、０．３８％のクエン酸三ナトリウムから回収した。対応する血漿サンプル中のダイアボディ濃度は、ＥＬＩＳＡに従って、ＰＡＩ−１およびＴＡＦＩと同時結合するダイアボディに基づいて決定された。ポリスチレン微量定量プレートをウェルに入れ、ＰＢＳに溶解した２００μｌの組換えマウスＰＡＩ−１（４μｇ／ｍｌ、ｐＨ＝７．４）と共に、４℃で７２時間インキュベートし、ウェルを空にし、１％（ｍ／ｖ）ウシ血清アルブミンを追加したＰＢＳを用いて、２時間処理した。洗浄後、血漿サンプルの連続２倍希釈液（１８０μｌ）をウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。その後、ウェルを洗浄し、１７０μｌのマウスＴＡＦＩ（０．１μｇ／ｍｌ）と共に室温で２時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、（ＴＡＦＩに対する）１６０μｌのＨＲＰ結合ＭＡ−ＴＣＫ３２Ｇ１２をプレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。すべての洗浄は、Ｔｗｅｅｎ８０（０．００２％）を含有するＰＢＳ中で行い、希釈は、Ｔｗｅｅｎ８０（０．００２％）およびウシ血清アルブミン（０．１％ｍ／ｖ）を含有するＰＢＳ中で行った。ＥＬＩＳＡ顕色は、３００μｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンおよび０．０１％の過酸化水素を含有する０．１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸：０．２ｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム緩衝液１５０μＬ（ｐＨ＝５．０）を用いて行った。室温で３０分後、５０μｌのＨ_２ＳＯ_４（４ｍｏｌ／Ｌ）を用いて、ペルオキシダーゼ反応を停止した。４９２ｎｍで吸光度を測定した。キャリブレーターとしてＤｂ−ＴＣＫ２６Ｄ６×３３Ｈ１Ｆ７を使用した。

インビボ電気穿孔法による遺伝子導入
（２％イソフルラン／酸素混合物の吸入によって）麻酔されたＳＷＩＳＳマウスは、事前に採血した。プラスミドＤＮＡ（ｓｃＤｂを含むｐｃＤＮＡ３．１）注射の３時間前に、両方の大腿四頭筋にヒアルロニダーゼを注射し、その後、電気穿孔した。ＤＮＡ注射後１５日までの発現レベル（ｃｆｒ．３．２）を決定するために、後眼窩穿刺によってマウスを失血させることによって、クエン酸血漿を準備した。

神経毒性
神経細胞培地は、スイスマウス胚（胎生期１４日）から用意された。皮質を切開し、ＤＭＥＭに分散し、ポリ−Ｄ−リジン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびラミニン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）でコーティングした２４−ウェルプレートにプレーティングした。５％ウシ胎児血清、５％ウマ血清（両方ともInvitrogen社、Cergy Pontoise, France）および２ｍＭのグルタミンを補充したＤＭＥＭに、細胞を培養した。培養物を、加湿した５％ＣＯ_２雰囲気に３７℃で保持した。グリア増殖を抑制するために、インビトロ培養（ＤＩＶ）３日後に、シトシンβ−Ｄ−アラビノシド（１０μＭ）を皮質培養物に添加した。

１２〜１３ＤＩＶに、１０μＭのグリシンを補充した無血清ＤＭＥＭ中のＮＭＤＡ（１０μＭ）に２４時間曝露することによって、興奮毒性を誘発した。ＮＭＤＡは、単独でまたはｒｔＰＡ（２０μｇ／ｍｌ）および／またはダイアボディ（５μｇ／ｍｌ）と共に適用された。１２〜１３ＤＩＶに、ダイアボディは、対照物として、ＮＭＤＡを含まず、いくつかの濃度で（０．５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）神経細胞培養物に添加した。２４時間後、損傷を受けた細胞から入浴培地（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性を測定することによって、神経細胞死を定量した。最大の神経細胞死（完全殺死、ＦＫ）に対応するＬＤＨ濃度は、５００μＭのＮＭＤＡに暴露したシスター培地において決定された。背景のＬＤＨ濃度は、対照洗浄物を受けたシスター培地で決定された。実験値からＬＤＨ_ｍｉｎを減じてから、ＬＤＨ_ｍａｘ−ＬＤＨ_ｍｉｎに正規化して、神経細胞死の割合で結果を示した。

統計分析
すべての定量データは、平均値および平均値標準誤差（ＳＥＭ）として提供された。時間に対してプロットした血漿濃度を非線形フィッティングすること（グラフパッドプリズムバーション５、グラフパッドソフトウェア、San Diego, CA, USA）によって、ダイアボディの循環半減期を取得した。統計分析は、グラフパッドプリズムバーション５（グラフパッドソフトウェア）を用いて行った。（Export toolから得られた）血栓粘弾性測定法からの曲線は、グラフパッドプリズム５に統合された。異なる処置グループからの血管造影スコアを比較するために、カイ二乗検定を実施した。グラブス検定を行うことによって、外れ値を除外した。統計分析の前に、D'Agostino and Pearson正規性検定を用いて、データ分布を確認した。Bonferroni多重比較検定と共に一元配置分散分析（One-way ANOVA）を用いて、ＦｅＣｌ_３誘発ＭＣＡＯ後の病変容積およびスペックル造影データを統計的に比較した。独立スチューデントｔ検定を用いて、機械的ｔＭＣＡＯ後の病変体積を統計的に比較した。Dunn多重比較検定と共に、Kruskal−Wallis分散分析（ANOVA）を用いて、（ｉ）溶解、ΔＬおよび相対ΔＡＵＣの血栓粘弾性測定パラメータ、（ｉｉ）静脈血栓塞栓症モデルにおける肺線維素原等価物、（ｉｉｉ）ＩＩａ誘発性ＭＣＡＯモデルにおける病変容積およびスペック造影データ、（ｉｖ）ＦｅＣｌ_３誘発性ＭＣＡＯモデルにおけるレーザドップラデータ、および（ｖ）尾部出血時間およびヘモグロビン含量を統計的に比較した。神経／運動データ、機械ｔＭＣＡＯ後の線維素原濃度、およびインビトロ神経毒性データを統計分析するために、Mann-Whitney検定を実施した。０．０５未満のＰ値が有意であると見なした。

出願に開示された配列
下線付き部分は、ＣＤＲ配列を示す。配列番号１７および１８のＮ末端に位置するＭｅｔおよびＡｌａ残基は、ｐｅｌＢシグナルペプチドからのものである。太字は、合成リンカーおよび標記物を表す。

Claims (11)

1. 患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品であって、二重特異性抗体を含み、
   前記抗体は、
   ａ）トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第１標的ドメインと、
   ｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に特異的に結合し、アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む、患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
2. ａ）トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合する前記第１標的ドメインは、配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含み、および
   アミノ酸配列の配列番号１を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号２を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号３を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号４を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号５を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号６を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、
   ｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合する前記第２標的ドメインは、配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含み、および
   アミノ酸配列の配列番号７を有するＣＤＲ１Ｈ、配列番号８を有するＣＤＲ２Ｈ、配列番号９を有するＣＤＲ３Ｈ、配列番号１０を有するＣＤＲ１Ｌ、配列番号１１を有するＣＤＲ２Ｌ、および配列番号１２を有するＣＤＲ３Ｌにより表される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む第２標的ドメインとを含む、請求項１に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
3. ａ）トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合する前記第１標的ドメインは、配列番号１３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含み、
   ｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合する前記第２標的ドメインは、配列番号１５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む、請求項１または２に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
4. ａ）トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合する前記第１標的ドメインは、配列番号１３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含み、
   ｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合する前記第２標的ドメインは、配列番号１５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
5. ａ）トロンビン活性化可能な線溶阻害剤（ＴＡＦＩ）に結合する前記第１標的ドメインは、配列番号１３と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１４と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含み、
   ｂ）プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）に結合する前記第２標的ドメインは、配列番号１５と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＨ領域と、配列番号１６と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列により表されるＶＬ領域とを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
6. 前記二重特異性抗体は、ヒト化抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
7. 急性血栓性障害に起因する脳病変を治療または予防するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬品。
8. 前記急性血栓性障害は、急性末梢動脈閉塞、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）、および深部静脈血栓塞栓症、肺塞栓症などの血栓塞栓症からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
9. ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
10. 前記治療または予防は、前記二重特異性抗体の投与前、投与中または投与後に、ｔＰＡの投与なしで行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。
11. 前記急性血栓障害は、血小板豊富な凝血塊の出現によって特徴付けられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の患者の急性血栓性障害を治療または予防するための医薬品。