JP2014231523A - 神経障害または神経変性障害の処置 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)
(i)配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3に記載のアミノ酸配列、または
(ii)配列番号3に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは80%、さらに好ましくは90%、もっとも好ましくは95%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(iii)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ES−X3−C−X2−WNS−X2−L−X4−Y−X4−PXA−X2−LGLGXHNYCRNP−X4−KPWCXVXK−X6−EXC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるプラスミノーゲン活性化因子関連クリングル(PARK)モチーフと少なくとも90%の同一性、好ましくは少なくとも95%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(iv)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ESR−X2−C−X2−WNS−X2−LXR−X2−Y−X3−MPXAFN−LGLGXHNYCRNPNXAXKPWCXVXK−X3−F−X2−ESC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるDARKモチーフと少なくとも92%の同一性、好ましくは少なくとも95%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、セリンプロテアーゼ活性を示さないクリングルタンパク質またはペプチド、あるいは
(b)NMDA受容体サブユニットNR1のN末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片(抗ATD−NR1抗体)であって、前記抗体または前記その断片の結合が前記NR1サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、前記NR1は好ましくは
(i)配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を有する、
(ii)配列番号6もしくは7のヌクレオチド配列によりコードされる、
(iii)ハイブリダイゼーションが5×SSPE、5×デンハート液および0.5%SDS中55〜60℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号6もしくは7の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片
からなる群より選択される、使用に関する。
CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ESR−X2−C−X2−WNS−X2−LXR−X2−Y−X3−MPXAFN−LGLGXHNYCRNPNXAXKPWCXVXK−X3−F−X2−ESC−X2−PXC(Xは任意のアミノ酸を示す)と少なくとも90%の同一性、好ましくは少なくとも95%または100%の同一性のアミノ酸配列を有するペプチドとして定義される。
surgery−associated lethality)をもたらす。この血栓症モデルでは、t−PAの効力およびt−PA処置についての時間ウィンドウは、ヒト臨床状況に類似している。要約して言えば、この動物モデルは脳卒中治療の前臨床評価によく適している。
(a)前記血栓溶解薬、特にプラスミノーゲン活性化因子を、脳卒中の発症から3時間超、好ましくは4.5時間超、好ましくは6時間超およびさらに9時間または12時間超後に患者に投与することが可能であるという特徴;
(b)処置のための血栓溶解薬、特にt−PAの用量は、前記血栓溶解薬を用いた単独療法に推奨される用量と比較して、増加することが可能であるという特徴;
(c)血栓溶解処置を、現在血栓溶解療法が望ましくない患者、すなわち可能な処置が提供される3時間前よりも早く、さらに好ましくは4.5時間前よりも早く脳卒中に罹った患者、または出血のリスクが増大している患者において適用することが可能であるという特徴;
のうちの1つまたは複数を含む。
(a)配列番号3に記載のアミノ酸配列(DSPAクリングル)、または
(b)配列番号3に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは80%、さらに好ましくは90%、もっとも好ましくは95%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(c)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ESR−X2−C−X2−WNS−X2−LXR−X2−Y−X3−MPXAFN−LGLGXHNYCRNPNXAXKPWCXVXK−X3−F−X2−ESC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるDARKモチーフと少なくとも92%の同一性、好ましくは少なくとも95%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列
を含み、
セリンプロテアーゼ活性を示さず、ただし、t−PAもしくはウロキナーゼのクリングルドメインではなく、自殺基質に共有結合したDSPAアルファ1タンパク質でもt−PAでもない、タンパク質またはペプチドに関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
神経障害または神経変性障害、特に脳卒中の処置のための医薬品の製造のためのタンパク質またはペプチドの使用であって、該タンパク質またはペプチドは、
(a)
(i)配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3に記載のアミノ酸配列、または
(ii)配列番号3に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは80%、さらに好ましくは90%、もっとも好ましくは95%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(iii)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ES−X3−C−X2−WNS−X2−L−X4−Y−X4−PXA−X2−LGLGXHNYCRNP−X4−KPWCXVXK−X6−EXC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるプラスミノーゲン活性化因子関連クリングル(PARK)モチーフと少なくとも90%の同一性、好ましくは少なくとも95%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(iv)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ESR−X2−C−X2−WNS−X2−LXR−X2−Y−X3−MPXAFN−LGLGXHNYCRNPNXAXKPWCXVXK−X3−F−X2−ESC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるDARKモチーフと少なくとも92%の同一性、好ましくは少なくとも95%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、セリンプロテアーゼ活性を示さないクリングルタンパク質またはペプチド、あるいは
(b)NMDA受容体サブユニットNR1のN末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片(抗ATD−NR1抗体)であって、該抗体または該その断片の結合は、該NR1サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、該NR1は好ましくは、
(i)配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を有する、
(ii)配列番号6もしくは7のヌクレオチド配列によりコードされる、
(iii)ハイブリダイゼーションが5×SSPE、5×デンハート液および0.5%SDS中55〜60℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号6もしくは7の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片
からなる群より選択される、使用。
(項目2)
血栓溶解薬、好ましくはプラスミノーゲン活性化因子を含む医薬品と組み合わせた、項目1に記載の使用。
(項目3)
血栓溶解薬を使用する療法が、
(a)該血栓溶解薬、特にプラスミノーゲン活性化因子を、脳卒中の発症から3時間超、好ましくは4.5時間超、好ましくは6時間超およびさらに9時間または12時間超後に患者に投与できるという特徴、
(b)該処置のための該血栓溶解薬、特にt−PAの用量を、該血栓溶解薬を用いた単独療法のために推奨される用量と比較して増加できるという特徴、
(c)該血栓溶解処置を、現在血栓溶解療法に適格ではない患者、すなわち、可能な処置が提供される3時間よりも前に、さらに好ましくは4.5時間よりも前に脳卒中に罹った患者、または出血のリスクが増大している患者において適用できるという特徴
のうちの1つまたは複数を含む、項目2に記載の使用。
(項目4)
前記血栓溶解薬が、プラスミノーゲン活性化因子、さらに好ましくは組換えt−PA(rt−PA、たとえば、アルテプラーゼ)または、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのt−PAの改変体、ウロキナーゼ、またはDSPAアルファ1、DSPAアルファ2、DSPAベータもしくはDSPAガンマなどのDSPA改変体である、項目2または3に記載の使用。
(項目5)
項目1(a)に記載のタンパク質またはペプチドが、不活化プラスミノーゲン活性化因子、好ましくは組換えt−PA(rt−PA、たとえば、アルテプラーゼ)または、パミテプラーゼ、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼもしくはモンテプラーゼなどのt−PAの改変体、ウロキナーゼ、またはDSPAアルファ2、DSPAベータもしくはDSPAガンマなどのDSPA改変体からなる群より選択される不活化プラスミノーゲン活性化因子である、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目6)
項目1(a)に記載のタンパク質またはペプチドが、好ましくは自殺基質に、さらに好ましくはD−フェニル−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン(PPACK)に連結されている不活化DSPAアルファ1である、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目7)
項目1(a)に記載のタンパク質またはペプチドが、フィンガードメイン(F)または上皮増殖因子ドメイン(EGF)などの、プラスミノーゲン活性化因子において見出され、好ましくはt−PAまたはデスモテプラーゼ由来である、追加のドメインのうちの1つまたは複数を含む、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目8)
項目1(a)に記載のタンパク質またはペプチドが、クリングルドメインまたはその断片のみからなる、前述の項目のいずれか一項に記載の使用。
(項目9)
(a)配列番号3に記載のアミノ酸配列(DSPAクリングル)、または
(b)配列番号3に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは80%、さらに好ましくは90%、もっとも好ましくは95%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(c)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ESR−X2−C−X2−WNS−X2−LXR−X2−Y−X3−MPXAFN−LGLGXHNYCRNPNXAXKPWCXVXK−X3−F−X2−ESC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるDARKモチーフと少なくとも92%の同一性、好ましくは少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる単離されたクリングルタンパク質またはペプチドであって、セリンプロテアーゼ活性を示さず、t−PAもしくはウロキナーゼのクリングルドメインではなく、自殺基質に共有結合したDSPAアルファ1タンパク質でもt−PAでもない、タンパク質またはペプチド。
(項目10)
NMDA受容体サブユニットNR1のN末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片(抗ATD−NR1抗体)であって、該抗体または該その断片の結合は、該NR1サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、該NR1は好ましくは、
(a)配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を有する、
(b)配列番号6もしくは7のヌクレオチド配列によりコードされる、
(c)ハイブリダイゼーションが5×SSPE、5×デンハート液および0.5%SDS中55〜60℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号6もしくは7の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片。
(項目11)
神経保護薬としてのタンパク質またはペプチドの使用であって、該タンパク質またはペプチドは、
(a)
(i)配列番号1、配列番号2もしくは配列番号3に記載のアミノ酸配列、または
(ii)配列番号3に記載のアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性、好ましくは80%、さらに好ましくは90%、もっとも好ましくは95%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(v)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ES−X3−C−X2−WNS−X2−L−X4−Y−X4−PXA−X2−LGLGXHNYCRNP−X4−KPWCXVXK−X6−EXC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるプラスミノーゲン活性化因子関連クリングル(PARK)モチーフと少なくとも90%の同一性、好ましくは少なくとも95%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列、または
(vi)配列「CY−X3−G−X2−YRGTXS−X2−ESR−X2−C−X2−WNS−X2−LXR−X2−Y−X3−MPXAFN−LGLGXHNYCRNPNXAXKPWCXVXK−X3−F−X2−ESC−X2−PXC」(Xは任意のアミノ酸を示す)により定義されるDARKモチーフと少なくとも92%の同一性、好ましくは少なくとも95%もしくは100%の同一性を有するアミノ酸配列
を含むかまたはそれからなる、セリンプロテアーゼ活性を示さないクリングルタンパク質またはペプチド、あるいは
(b)NMDA受容体サブユニットNR1のN末端ドメインに結合する単離された抗体またはその断片(抗ATD−NR1抗体)であって、該抗体または該その断片の結合は、該NR1サブユニットの細胞外ドメインまたは断片の切断を妨げ、該NR1は好ましくは、
(i)配列番号4もしくは5のアミノ酸配列を有する、
(ii)配列番号6もしくは7のヌクレオチド配列によりコードされる、
(iii)ハイブリダイゼーションが5×SSPE、5×デンハート液および0.5%SDS中55〜60℃で終夜実施される高いストリンジェンシーの条件下で配列番号6もしくは7の核酸分子の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸分子である、
単離された抗体またはその断片、
からなる群より選択される、使用。
(項目12)
(a)項目1(a)に記載のタンパク質もしくはペプチド、および、または
(b)項目10に記載の単離された抗体もしくは抗原結合部分
からなる群より選択され、血栓溶解薬を伴なうか、もしくはそれを伴なわず、1つまたは複数の薬学的に許容されるキャリアもしくは賦形剤をさらに含みうる、薬学的組成物。
(項目13)
神経障害もしくは神経変性障害、特に脳卒中を処置する方法であって、前述の項目のいずれかに記載の治療量の血栓薬、好ましくはプラスミノーゲン活性化因子、さらに好ましくはt−PAと一緒に、もしくはそれなしで、項目1(a)に記載の治療的有効量の単離されたタンパク質もしくはペプチド、または項目10に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合部分を投与することを含む、方法。
NR1抗体の種類はモノクローナル抗体である。
(A.PARKドメインを含有するタンパク質によるt−PA神経毒性の阻害)
(材料および方法)
PARKドメイン(DSPAアルファ1、cDSPA、レテプラーゼ、DSPAアルファ2、DSPAベータおよびアルテプラーゼのクリングル2(K2))を含むいくつかのタンパク質のアルテプラーゼトランスBBB輸送を阻害する能力を、下に概略される材料および方法を使用して実証した。
(2.1 前記モデルの確立)
脳毛細血管機能を研究するためのインビトロシステムを提供するために、フィルターの一方の側で脳毛細血管内皮細胞を、もう一方の側でグリア細胞を培養することにより、インビボ状況をかなりの程度まで模倣する共培養物を開発した(図5)。内皮細胞をフィルター上の上部区画で培養し、グリア細胞を6ウェルプレートのプラスティック上の下部区画で維持した。これらの条件下では、内皮細胞はすべての内皮マーカー(第VIII因子関連抗原、非血栓形成性表面、プロスタサイクリンの産生、アンギオテンシン変換酵素活性)ならびに血管脳関門の特徴(接着結合の存在、飲小胞の欠乏、モノアミン酸化酵素活性、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ活性およびP糖タンパク質)を保持していることが知られている。
ウシ脳内皮細胞を、10%(v/v)熱不活化ウシ血清および10%(v/v)ウマ血清(Hyclone Laboratories、Logan、UT、USA)、2mMグルタミン、50μg/mLゲンタマイシンならびに塩基性線維芽細胞増殖因子(1ng/mL、隔日に添加される)を補充したDMEMにおいて培養された脳毛細血管から単離した。3継代で凍結された内皮細胞のサブクローンを、60mm径ゼラチンコートペトリ皿上で再培養し、コンフルエンスまで増殖させた。
培養プレートインサート(Millicell PC 3μmポアサイズ)を、Bornstein(1958年)の方法に従って調製されたラット尾部コラーゲンを用いて上辺でコーティングした。
コーティングしたフィルターを、共培養のため、グリア細胞を含有する6ウェル皿に置いた。共培養培地は、脳毛細血管内皮細胞用の培地と同じであった。コンフルエントな内皮細胞をトリプシン処理し、4×105細胞/mlの濃度でフィルターの上辺に蒔いた。これらの条件下で、内皮細胞は12日以内にコンフルエント単層を形成した。実験はコンフルエンスの5日後に実施した。
(4.1 毒性試験)
スクロースを、BBBの完全性に対する試験化合物の考えうる効果の評価を可能にする傍細胞(paracellular)マーカーとして使用した。この小親水性分子は、低い脳透過を示し、その内皮透過性係数は内皮細胞単層完全性の尺度である。
rt−PAの移行は、スクロースについて4.1下に記載された通りに決定した。
(フィルター研究)
このステップでは、フィルターによる輸送制限の可能性を排除するために、アルテプラーゼがフィルターを通過する能力を試験した。アルテプラーゼを、完全性試験で決定された非毒性濃度で適用した。
DSPA関連分子であるレテプラーゼおよびクリングル2(アルテプラーゼ)を、プラスミノーゲンベースの酵素電気泳動アッセイおよびスペクトロザイムアッセイによる定量化を用いて評価される、アルテプラーゼ透過に影響を与えるその能力について等モル濃度で調べた。
スクロースのみを用いて、およびアルテプラーゼのみを用いて、またはアルテプラーゼをDSPA関連分子のレテプラーゼもしくはK2(アルテプラーゼ)と組み合わせて用いて得られた内皮透過性係数は、以下の表1に要約する。
コラーゲンコートフィルターを通るアルテプラーゼ(0.3μM)の輸送は120分の期間にわたり調べた。
アルテプラーゼ単独での、ならびにDSPA関連分子(DSPAα1、cDSPA、DSPAα2)、レテプラーゼおよびK2(アルテプラーゼ)と共インキュベーションでの移行は120分の期間にわたり調べた。等モル濃度(0.3μM)を使用した。
PARKドメインを含むタンパク質の阻害効果は下に概説される動物モデルにも示された。
雄性Sprague Dawleyラット(270〜330g)を、12明時間/12暗時間サイクルで恒温室に収容し、餌と水を自由に与えた。実験は、実験動物の管理と使用についてのフランス(act no.87 to 848;Ministere de
l’Agriculture et de la Foret)と欧州共同体評議会(Directives of November 24、1986年、86/609/EEC)指針に従って実施した。
ラットを、イソフルラン(5%、0.8 l/分で、酸素/N2O(1:3)中で維持2%)を用いて麻酔した。体温を37±0.5℃に維持した。注入ピペット(内径0.32mmおよび15mm/μlで較正されている;Hecht Assistent、Germany)は、右側線条体(ブレグマに対し3.5側方と5.5腹側)に定位的に埋めこんだ。NMDA(50nmol)を容積1μlで注入し、前記ピペットを3分後にはずした。第一組の実験では、アルテプラーゼ(1mg/kg)、デスモテプラーゼ(1mg/kg)、アルテプラーゼとデスモテプラーゼ(それぞれ1mg/kg)、アルテプラーゼビヒクル(L−Arg 35mg/kg、リン酸10mg/kgおよびポリソルベート80、0.2%)またはデスモテプラーゼビヒクル(グリシン4mg/kgおよびマンニトール10.64mg/kg)の静脈内注射により15分後に興奮毒性処置を相補した。第二組の実験では、アルテプラーゼ(3μg)、デスモテプラーゼ(3μg)、アルテプラーゼとDSPA(それぞれ3μg)またはそれに対応するビヒクルと一緒に、NMDAを線条体に共注入した(すべて容積1μlで)。
24時間後、ラットを安楽死させ、全脳を取り出しイソペンタンにおいて凍結させた。体積分析では、20ごとに1冠状切片(20μm)をチオニンを用いて染色し、全病変にわたって分析した。目的の領域はラットの定位的アトラス(stereotaxic atlas)を使用して決定した(PaxinosおよびWatson)。画像分析システム(BIOCOM RAG 200、Paris、France)を使用して非染色領域により与えられる病変を測定した。
これらの結果により、PARKドメインを含む様々なタンパク質のアルテプラーゼトランスBBB輸送を阻害する能力が明らかにされている。
(材料および方法)
組換えATD/ロイシン−イソロイシン−バリン結合タンパク質(LIVBP)様ドメインの作製:t−PAとの相互作用のドメインとして同定された、NR1のアミノ末端ドメインに対応するアミノ酸19〜371をコードするNR1−1aサブユニットの領域を、以前記載された通りに、完全長ラットNR1−1a cDNAから増幅した(Fernandez−Monrealら、2004年)。rATD−ND1と命名された組換えタンパク質を、製造業者(Qiagen、France)により記載されたように、ニッケル親和性マトリックス上で、イソプロピル1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド誘導細菌培養物(Escherichia coli、M15株)の封入体から精製した。
NMDAに24時間および50μmol/L NMDAに1時間曝露することにより37℃で誘導した。NMDAへの曝露は、単独で、またはrt−PA(20μg/mL)および/もしくはαATD−NR1もしくは対照Ig(0.01mg/ml)と組み合わせて実施した。どちらの場合も、神経細胞死は、位相差顕微鏡を使用して24時間後に評価し、損傷細胞からバス培地(bathing medium)への乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出の測定により定量化した。
血漿精製マウストロンビンのMCAへのインサイチュー注入により、マウスにおいて局所虚血を誘導した(Orsetら、2007年)。トロンビン注入直後、レーザードップラーフローメトリーにより測定される脳血流速度(CBV)の劇的低下(80%の平均低下)により血餅形成が証明された(図12Bおよび12D)。低灌流は、rt−PAが静脈内に投与されるのでなければ(早期でも後期でも)、安定的に確立され、rt−PA注入後の25分以内にCBVは、ベースライン値の60〜70%まで回復した(図12Bおよび12D、n=10、p<0.001)。24時間後、処置とは無関係に、すべてのマウスが皮質に限定される脳梗塞(チオニン染色)を示した。早期rt−PA誘導血栓溶解(血餅発症の20分後に開始)は虚血性脳損傷の程度を著しく減少し、平均病変体積は18.94mm3±1.85(n=10)であり、非処置動物(26.22mm3±2.47;n=10;図12A)と比べて27.76%(p<0.01)のrt−PA保護効果を実証した。
実施例1に記載の結果は、NMDA受容体のNR1サブユニットのアミノ末端ドメインに対する抗体は急性虚血脳卒中において有益であるという考えに概念証明を与えた。しかし、能動免疫は急性障害を処置する手段としては実行可能ではないので、本発明者らは、rATD−NR1ワクチン接種されたマウス由来の精製された血清免疫グロブリンに基づいて、受動免疫(抗体ベースの免疫治療)の戦略を開発した。本発明者らは先ず、免疫ブロッティングにより、精製されたポリクローナル抗ATD−NR1抗体は免疫原性ペプチドを認識することができることを確かめた。前記抗ATD−NR1抗体は、ヒスチジンタグ(図13A;37kDa)またはFcタグ(データは示されていない)のどちらかと結合した2種類のrATD−NR1を独立して認識することができた。同様に、抗ATD−NR1抗体は、NMDARのNR1サブユニットの予想される分子量に一致して、ヒト脳組織中の約120kDaのタンパク質と相互作用することが見出された(図13B)。フロイントアジュバンド混合物注入マウスから精製された対照抗体は、陽性染色を示さなかった(図13A)。
次に、抗ATD−NR1抗体の治療的価値(受動免疫)をインビボで調べた。先ず、NMDA(10nmol)を対照物または精製抗体の単回静脈注射と一緒に線条体に投与することにより、興奮毒性病変をマウスに誘導した。対照動物では、NMDAは17±2mm3の興奮毒性病変をもたらし、抗ATD−NR1抗体処置マウスでは、病変(9±1mm3)はサイズが47.06%減少した(各群でn=8、p<0.01;図20)。このように、抗ATD−NR1抗体の単回静脈注射により、興奮毒性のこのモデルでは内因性t−PAの有害な影響を防ぐことができる。したがって、次に、抗ATD−NR1抗体(0.8mg/ml、静脈内、単回ボーラス;群あたりn=8〜10)を、マウスの血栓塞栓性脳卒中のモデルにおいて試験した。抗体(対照または抗ATD−NR1)の共投与は、再灌流を誘導する早期rt−PA注入の能力を変えなかったことに注目するのが重要である(図16B)。早期rt−PA誘導血栓溶解は虚血性病変の体積を31.53%減少させた(図16A)。同様に、抗ATD−NR1抗体の早期(発作の20分後)送達は、著しい脳保護を与えた(対照と比べて44%の保護、n=10、p<0.001)。この効果は、抗体がrt−PA誘導再灌流と組み合わされた場合に改善されなかった(図16A)。血餅形成の4時間後に実施された場合には、rt−PA処置はなお、早期灌流実験の場合と同じくらい効率的にCBVを回復した(図16D)(血餅形成後、初期CBFの80%対rt−PA処置、後85%、n=9、p<0.01)。しかし、脳病変はこれらの条件下では劇的に悪化した(血餅形成4時間後のrt−PA注入動物での33.03mm3と比べてPBS注入マウスでは24.90mm3、n=10、p<0.0025;図16C)。この有害な影響は、rt−PAが抗ATD−NR1抗体の単回ボーラスと共投与された場合には観察されなかった。むしろ、対照実験(生理食塩水のみ)およびrt−PA処置と比べて、それぞれ病変体積の50.52%および62.7%の減少が観察された(n=8、p<0.005)。興味深いことに、抗ATD−NR1抗体単独の遅延注入も高度に保護的であった(対照動物と比べた場合−41%、n=10、p<0.002)。全体として、これらのデータは、NMDARシグナル伝達および神経毒に対するt−PAの増強効果を標的にする、ATD−NR1に対する抗体の単回静脈内注射の2つの重要な可能性を示している。そのような注射は、それだけで治療的価値があり、第二に、rt−PAによる血栓溶解の治療ウィンドウも延長することができる。
freezing)タスク(n=10)(これは不安、記憶および学習過程の包括的認知評価を可能にすると見なされている)において評価した。偽動物と比べて、虚血性マウスは、フリージングの増加(+214%、p<0.025)を示し、これは、αATD−NR1抗体の静脈内投与により劇的に減少する影響である(−170%;p<0.05)(図19)。
虚血性脳損傷ならびにt−PAの有益な効果または有害な影響は、血液脳関門(BBB)と高度に関係しているために、エバンズブルー(EB)血管外溢出およびマトリックスメタロプロテイナーゼ活性化(MMP−2およびMMP−9)を上記条件下で評価した。予想通りに、rt−PAは、MMP−9の活性を誘導し、エバンズブルーの脳実質への血管外溢出を増強することができることが見出された。血餅形成後rt−PAを投与するのが遅くなるに従って、MMP−9活性(図17Bおよび17C)とEBの血管外溢出(図17A)に対するその効果はそれだけ強くなった。虚血性病変に対するその効果と一致して、抗ATD−NR1抗体単独の早期投与も後期投与も脳卒中により誘導されるBBB溢出の程度を著しく減少させた(対照血餅動物と比べた場合、血餅形成20分後、−63%および血餅発症4時間後、−68%、n=3、p<0.05;図17A)。さらに、抗ATD−NR1免疫療法は、BBBの完全性に対するrt−PAの損傷的影響を効率的に低下させた(対照動物と比べた場合、血餅形成20分後28%低下、血餅発症4時間後42%、n=3、p<0.05;図17)。同様に重要なことに、MMP−9は、BBBに対するrt−PAの効果における計器(instrumental)となるが、rt−PAが共投与されるされないにかかわらず、抗ATD−NR1抗体の存在下で活性の低下を示した(図17B)。これらの所見は、前記抗体が、内因性t−PA(虚血に応答して神経細胞から放出される)から、ならびに外因性rt−PAからBBBの完全性を保護し、第二に、この保護はMMP−9の活性の妨害を伴うという結論を与える。
急性期処置の結果の長期追跡調査は、もっとも高度に臨床的関連性がある。したがって、血餅発症の4時間後に抗ATD−NR1抗体の単回注入を用いて処置された動物のMRIベースの長期追跡調査が、3ヶ月の期間にわたって行われた。T2 MRI分析により、前に観察されたチオニン染色のパターンが明白に確認され、これは、虚血を誘導した24時間後にはすでに目に見えており、手術後少なくとも15日間維持された前記抗体の脳保護効果を証明する(対照動物と比べた場合X%の減少、n=3、p<X;図18a、b)。さらに、ADCシークエンスにより、抗ATD−NR1抗体を用いて処置された虚血性動物においてあらゆる時点での浮腫の非存在が明らかにされた(図18a、18b)。
血栓塞栓性脳卒中のマウスモデルにおける血餅発症後の早期(20分後)または後期(4時間後)に適用された場合、抗ATD−NR1抗体の単回静脈注射は、劇的な神経保護を引き起こすのに十分である。注目すべきは、本発明は、rt−PA処置の利益の時間依存性消失を示している点である。早期のrt−PA誘導再灌流は、この薬物の臨床使用において観察されるように、利益をもたらすが、遅延rt−PA誘導再灌流(血餅形成の4時間後)は、再灌流レベルは匹敵するけれども、有害な結果にさえ関連している。この否定的結果は、抗ATD−NR1抗体の共投与により解決され、このことは、神経保護効果を回復させ、さらにこれによってrt−PA誘導血栓溶解が治療利益を与えることができる時間ウィンドウを延長する。
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