TWI485157B - 用於抑制血小板凝集之胜肽化合物 - Google Patents
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Description
本發明提供一種胜肽化合物與其醫藥組合物,其可運用於抑制血小板凝集與預防/治療血栓相關疾病。具體而言該胜肽化合物為一五胜肽或六胜肽。
適當的血小板附著、活化與凝集,對於維持正常止血與動脈血栓相關疾病(例如:中風和心肌梗塞)之間的平衡來說是非常重要的。血管受傷後基質膠原蛋白的暴露將提供血小板附著的受質,並且觸發血小板活化,這樣的活化使更多的血小板附著至受傷的血管壁,進而開始形成血栓。在血管內產生血栓時,血小板的附著與凝集佔有關鍵的角色。血塊的形成通常是由組織受傷後引起之血小板附著/凝集和血液凝固梯級反應所造成的,其會使得癒合中的傷口血流減緩或停止流血。然而在一些病狀中,循環系統中血塊的形成超出理想範圍,而成為了導致病態結果的致病因子。不健康血管中血流的不順暢,或是循環系統中損傷的血管上皮細胞和其他循環細胞釋放的媒介物,都可能使得血小板活化附著在血管受傷部位,並更進一步引發更多的血小板堆積在形成中的血栓上。血栓可以變大到足以阻塞動脈血管。靜脈血栓也可能會在靜脈中血液流動緩慢或靜止的地方形成。靜脈血栓很容易解
離小部分形成所謂的栓子,其會在循環系統中漂流並阻塞其他部位的血管,例如:肺動脈。因此動脈血栓致病的原因為原位阻斷(local blockade),而靜脈血栓主要則為遠位阻斷(distant blockade)或栓塞(embolization)。相關的病症包括:靜脈栓塞(venous thrombosis)、血栓性靜脈炎(thrombophlebitis)、動脈栓塞(arterial embolism)、冠狀動脈與大腦動脈栓塞(coronary and cerebral arterial thrombosis)、不穩定型心絞痛(unstable angina)、心肌梗塞(myocardial infarction)、中風(stroke)、腦栓塞(cerebral embolism)、腎栓塞(renal embolism)及肺栓塞(pulmonary embolism)。
許多吸附性蛋白與不同的受體皆和血小板附著活化及凝集的複雜程序有關。循環的血小板會在接觸到血小板破裂(plaque rupture)後產生的動脈粥狀硬化傷口(atherosclerotic lesion),或是受到病態血管中的紊流剪應力的影響而變得具有黏性並形成阻塞性的血栓。細胞黏合素α2β1(醣蛋白Ia/IIa;glycoprotein(GP)Ia/IIa)和GPVI為血小板兩個主要的膠原蛋白受體,並擔任調節血小板附著和凝集的中介角色。在高紊流剪應力的狀況下,GPIb-V-IX複合體被認為是藉由與溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)結合而作用的間接膠原蛋白受體。
蛇毒液中含有許多生物成份,其可藉由不同的機制包括:影響血小板功能或凝血因子,或破壞內皮細胞來影響止血。美國第6,284,475號專利利用此特性並提供在患者中診斷及/或監測可能
由抗磷脂抗體症候群(antiphospholipid antibody syndrome)導致之易生成血栓疾病的方法;前提為在患者的血液樣本中抗凝血藥物蛋白(磷脂結合蛋白,較佳為磷脂結合蛋白V(annexin-V))與磷脂質的結合,受到抗磷脂質抗體的抑制。由αβ異二聚體構成之C類凝集素樣蛋白(C-type lectin-like proteins,CLPs)為蛇毒液中一重要家族。CLP常聚合在一起形成大分子,並與特定的血小板受體如GPIb、α2β1或/和GPVI作用來活化或抑制血小板功能。卡渥幸(Convulxin,CVX)一種來自南美響尾蛇(Crotalus durissus terrificus
)毒液中的多聚體蛋白質,會藉著與GPVI和GPIb結合引起血小板活化。卡渥幸與GPVI之間的分子交互作用,已藉由X光結晶繞射法檢驗過,卡渥幸上假定的GPVI結合位也已被研究過(Batuwangala T,Leduc M,Gibbins JM,et al.Structure of the snake-venom toxin convulxin
,Acta crystallographica 2004 Jan;60(Pt 1):46-53
)。自馬來亞蝮蛇(Calloselasma rhodostoma
)毒液純化而得的aggretin(艾格瑞汀)(又稱為羅多希汀rhodocytin),已被研究顯示會與α2β1、GPIb以及CLEC-2結合。近來已有關於艾格瑞汀的結晶構造的研究,且其結合位也已被提出(Hooley E,Papagrigoriou E,Navdaev A,et al.The crystal structure of the platelet activator aggretin reveals a novel(alphabeta)2 dirneric structure.Biochemistry 2008 Jul 29;47(30):7831-7;Watson AA,Eble JA,O'Callaghan CA.Crystal structure of rhodocytin,a ligand for the platelet-activating receptor CLEC-2.Protein Sci 2008 Sep;17(9):1611-6
)。另一方面,艾格奇斯汀(agkistin)(自百步蛇(Agkistrodon acutus
)毒液純化而得),藉由與血小板GPIb的專一性結合抑制血小板凝集。籌瓦格賴瑞斯(trowaglerix,Tro),(一自瓦氏蝮蛇(Topidolaemus waglerix
)毒液純化而得之CLP),其會藉由GPVI專一地活化血小板。前人研究顯示籌瓦格賴瑞斯在活體外能造成GPVI的分解,並且能在生物體外終止膠原蛋白引起之血小板凝集。儘管已確定CLPs與其受質結合後的結構,並在分子層級上開始了解可能的受質結合位;但是對於這些結合受質,線性的結合模體也是一個非常有用的特徵。
然而,雖然已確定CLPs與其受質結合後的結構,但是在分子層級上仍需要更多受質結合位的資訊,以開發能有效抑制血小板凝集及抗血栓能力、並且不會造成出血的可用藥物。
本發明最先發現蛇毒C型類凝集素(CLPs)片段做為血小板醣蛋白之反應區係位於C端。鑑於此一發現,本發明發展出來自這些C型類凝集素C端之五胜肽和六胜肽,它可以抑制血小板凝集,特別是由膠原蛋白所引起的血小板凝集,並有抗血栓活性,但不會有出血的傾向。此結果顯示這些胜肽可作為預防和治療血栓性疾病的潛在藥物。
除非特別說明,”a”或”an”表示”一或多個”。
此處所使用的“天然胺基酸”是指任何二十種初級的、天然發生的胺基酸,其典型的形成胜肽鍊、多肽鍊與蛋白質。下表為天然產生之二十種胺基酸之列表。
此處所使用的“合成胜肽”是指一本發明之化合物符合此處所提及之配方或經過化學修飾的胺基酸,包括但不限於鹽、其衍生產物(如醯胺)和其取代物。此處胜肽的定義是依照Schroder & Lubke之"The Peptides",科學出版社,1965年,其中,按照傳統的表式方法,N-端在左側而C-端在右側。當一胺基酸殘基具有同分異構體的形式,除另有註明外,否則其同時包含具有胺基酸L型異構體的形式及D-異構體的形式。此處之胺基酸通常以標準的三個字母的代碼表示。胺基酸的D-異構體以字首“D”或“d”表示。同樣地,L-異構體以字首“L”或“l”表示。除非另有說明,此處胜肽之表示是根據通常慣例,胺基酸序列從左至右:N-端至C-端。
此處所使用之“保守性置換”是以一具有相同淨電子電荷和大致相同的大小和形狀之胺基酸替換另一個胺基酸。當其側鏈之總碳數與異質原子之數目差不超過四時,具有脂肪或取代脂肪族側鏈之胺基酸其大小大約相同,當其側鏈之分枝數目差異不超過一時,其約具有相同的形狀。胺基酸之側鏈具有苯基或取代苯基的群組被認為約具有相同之大小與形狀。下面列出的是五組胺基
酸。在一多肽鍊中將一胺基酸取代為另一同組之胺基酸則得到保守性置換:第一組:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸和具有C1-C4脂肪的或C1-C4羥基取代脂肪族的側鏈(直鏈或單分枝的)的非天然胺基酸。第二組:谷胺酸、天門冬胺酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族側鏈(不分枝或一個分枝)的非天然胺基酸。第三組:賴胺酸、鳥胺酸、精胺酸和具有胺或胍基取代的C1-C4的脂肪族側鏈(不分枝或一個分枝)的非天然胺基酸。第四組:穀胺醯胺、天門冬醯胺和具有醯胺取代的C1-C4脂肪族側鏈(不分枝或一個分枝)的非天然胺基酸。第五組:苯丙胺酸、苯基甘胺酸、酪胺酸和色胺酸。
此處使用的“高度保守性置換”是將一胺基酸以另一側鏈上具有相同官能基團且幾乎相同大小和形狀之胺基酸置換。當側鏈之總碳數與雜原子鍵之數目差不超過二時,具有脂肪的或取代脂肪族側鏈之胺基酸其大小大約相同,當其側鏈之分枝數相同時,其約具有相同的形狀。高度保守性置換的例子包括亮胺酸置換纈胺酸,絲胺酸置換蘇胺酸,穀胺酸置換天門冬胺酸,苯丙胺酸置換苯甘胺酸。
本文中所使用的”對象”係指任何動物包括但不限於人類和其他靈長類動物,囓齒類動物(如小鼠、大鼠、天竺鼠);兔形目(例如,兔);牛亞科(如牛);羊(例如,綿羊);羊亞科(例如,山羊);豬類(如豬);馬科動物(如馬);犬科(如狗);貓科動物(如貓);家禽(例如,雞、火雞、鴨、鵝、其他家禽
鳥類等),以及野性的或野生的動物,包括但不限於如有蹄類動物(如鹿)、熊、兔形目、囓齒動物與鳥類等。此用語不限於一特定的年齡或性別,因此,無論是成人、新生兒以及胎兒之對象,不論男性還是女性皆包含在此用語中。“需要治療”之對象為患有疾病和/或症狀能夠經由血小板凝集抑製劑或抗血栓劑實現有益的治療和/或預防的結果之受試者。一個有益的結果包括降低症狀的嚴重性或延遲發病的症狀、延長壽命和/或更快速或更完整的疾病或症狀的解除。
本文中所使用的”藥學上可接受的”係指化合物、材料、組合物和/或劑型在深思熟慮之醫療決定的範圍內,適用於接觸人類和動物的組織而無嚴重毒性、刺激性、過敏性反應或其他併發症,與正在接受治療的醫療條件之利益風險比相稱。
本文中所使用的”藥學上可接受的鹽”,是指將母化合物修飾成酸或鹼及其鹽而得之衍生化合物。
本文中所使用的”有效劑量”或“足量”之本發明之合成胜肽醯胺係指如本文所述能達到藥學上有效於抑制、預防或治療一特定疾病、障礙、症狀或副作用症狀之劑量。
本文中之”治療”係指降低一特定疾病、障礙、症狀或副作用症狀之頻率、程度、嚴重性和/或持續時間。
”預防”一詞係指抑制或避免一特定疾病、障礙、症狀或副作用之症狀。
本發明發現蛇毒之C型類凝集素、卡渥幸(CVX)、艾格瑞汀(Agg)、艾格奇斯汀(Agk)與籌瓦格賴瑞斯(Tro)和血小板糖蛋白的結合位點,位於C-端且這些C型類凝集素之結合位序列有超過50%的相似性。卡渥幸、艾格瑞汀、艾格奇斯汀與籌瓦格賴瑞斯之α-次單元體與卡渥幸之β-次單元體列於下表。
在一態樣中,本發明提供一種胜肽化合物,包含一式X2
-Trp-X3
-X4
-X5
或X1
-X2
-Trp-X3
-X4
之胺基酸序列或其醫藥上可接受鹽,其中X1
係選自由Arg(R)、Lys(K)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Asn(N)及Gln(Q)所組成之群組;X2
係選自由Lys(K)、dLys(dK)、Arg
(R)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Gln(Q)、Asn(N)、Glu(E)及Asp(D)所組成之群組;X3
係選自由Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Met(M)、Asn(N)、Gln(Q)、Glu(E)及Asp(D)所組成之群組;X4
係選自由Tyr(Y)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Gln(Q)及Asn(N)所組成之群組;且X5
係選自由Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)、Met(M)、Lys(K)及Arg(R)所組成之群組。
在另一態樣中,本發明提供一種胜肽化合物,包含一式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
之胺基酸序列或其醫藥上可接受鹽,其中X1
係選自由His(H)、Arg(R)、Lys(K)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Asn(N)及Gln(Q)所組成之群組;X2
係選自由Lys(K)、dLys(dK)、Arg(R)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Gln(Q)、Asn(N)、Glu(E)及Asp(D)所組成之群組;X3
係選自由Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Met(M)、Asn(N)、Gln(Q)、Glu(E)及Asp(D)所組成之群組;X4
係選自由Tyr(Y)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Gln(Q)及Asn(N)所組成之群組;
且X5
係選自由Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)、Met(M)、Lys(K)及Arg(R)所組成之群組。
依據本發明,式X2
-Trp-X3
-X4
-X5
或X1
-X2
-Trp-X3
-X4
之五胜肽與式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
之六胜肽係依據蛇毒之C型類凝集素之序列所合成。
依據本發明,X1
係選自由His,Arg、Lys、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thy、Cys、Asn和Gln所組成之群組;X2
係選自由Lys、d-Lys、Arg、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Gln、Asn、Glu和Asp所組成之群組;X3
係選自由Phe、Tyr、Trp、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thy、Cys、Met、Asn、Gln、Glu和Asp所組成之群組;X4
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Gln、Asn和dAsn所組成之群組;且X5
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Phe、Tyr、Trp、Met、Lys和Arg所組成之群組。較佳地,X1
係選自由His、Arg、Cys、Asn及Thr所組成之群組;X2
係選自由Val、Lys、d-Lys、Cys、Thr、Gln及Glu所組成之群組;X3
係選自由Phe、Val、Met、Asn、Ala、Glu及Leu所組成之群組;X4
係選自由Tyr、Val、Asn、d-Asn及Ser所組成之群組;且X5
係選自由Ala、Tyr、Val、Met、Tyr和Arg所組成之群組。
在本發明之實施例中,式X2
-Trp-X3
-X4
-X5
之五胜肽係選自由Lys-Trp-Met-Asn-Val(SEQ ID NO:7)、Lys-Trp-Val-Asn-Tyr(SEQ
ID NO:8)及Lys-Trp-Phe-Val-Ala(SEQ ID NO:9)所組成之群組。式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
之五胜肽係選自由Arg-Lys-Trp-Phe-Val(SEQ ID NO:10)、Arg-Lys-Trp-Val-Asn(SEQ ID NO:11)及Cys-Lys-Trp-Met-Asn(SEQ ID NO:12)所組成之群組。式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
之六胜肽係選自由Arg-Lys-Trp-Phe-Val-Ala(SEQ ID NO:13)、Arg-Lys-Trp-Val-Asn-Tyr(SEQ ID NO:14)、Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val(SEQ ID NO:15)、Cys-Trp-Asn-Lys-Met-Val(SEQ ID NO:16)、Cys-Lys-Ala-Met-Asn-Val(SEQ ID NO:17)、Cys-Lys-Trp-Ala-Asn-Val(SEQ ID NO:18)、Cys-Lys-Ala-Ala-Asn-Val(SEQ ID NO:19)、Cys-dLys-TrpMet-dAsn-Val(SEQ ID NO:20)、Arg-Thr-Trp-Glu-Asn-Val(SEQ ID NO:21)、Asn-Gln-Trp-Leu-Ser-Ala(SEQ ID NO:22)、Thr-Glu-Trp-Leu-Asn-Met(SEQ ID NO:23)及Asn-Gln-Trp-Leu-Ser-Arg(SEQ ID NO:24)所組成之群組。
在本發明之其他實施例中,式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
之六胜肽可進一步包含一或多個胺基酸連接在X1
及/或X5
旁邊。較佳地,其包含約1至10個胺基酸連接在X1
及/或X5
旁邊。更佳地,約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸。更加地,其包含約1或2個胺基酸連接在X1
旁邊且1、2、3或4個胺基酸連接在X5
旁邊。
在更進一步之實施例中,本發明之胜肽化合物包含一式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
、A1
-A2
-X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
或X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
-B3
-B4
之胺基酸序列,其中A1
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;A2
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組;B1
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;B2
係選自由Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組;B3
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;且B4
係選自由Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組。例如,式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
包含一序列為Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val-Ala-Cys(SEQ ID NO:26)之胺基酸序列。式X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
-B3
-B4
包含一序列為Gly-Phe-Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val-Ala-Cys(SEQ ID NO:25)或Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val-Ala-Cys-Ala-Gln(SEQ ID NO:27)之胺基酸序列。式A1
-A2
-X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
包含一序列為Leu-Phe-His-Val-Trp-Asp-Tyr-Tyr-Asp-Arg(SEQ ID NO:28)或Leu-Phe-His-Val-Trp-Asp-Tyr-Thr-Asp-Arg(SEQ ID NO:29)之胺基酸序列。
在另一個更進一步之實施例中,本發明之胜肽化合物包含一式A1
-A2
-X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
-B3
-B4
之胺基酸序列,其中A1
係不存在或選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;A2
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組;B1
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;B2
係選自由Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組;B3
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;且B4
係選自由Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組。例如,式A1
-A2
-X1
-X2
-Trp-X3
-X4
-X5
-B1
-B2
-B3
-B4
之胜肽包含一序列為Gly-Phe-Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val-Ala-Cys-Ala-Gln(SEQ ID NO:30)之胺基酸序列。
依據本發明,各個A1
係不存在或選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;A2
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組;各個B1
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;各個B2
係選自由Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組;各個B3
係選自由Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp及Pro所組成之群組;及各個B4
係選自由Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn及Gln所組成之群組。
依據本發明,此處所述之胺基酸殘基除非另有說明,否則皆包含L-異構體形式與D-異構體形式。除了甘胺酸外,天然胺基酸
包含一不對稱碳原子(chiral carbon atom)。除非另有說明,此處所述之具有光學活性之胺基酸為L-組態。在具有R取代基之碳原子上的立體化學係D-或L-組態。按照慣例,此處胜肽結構的表示法為胺基端在鍊的左側而羧基端在鍊的右側。
依據本發明,本發明之胜肽化合物可以被修飾成最佳化之胜肽。較佳地,本發明之胜肽為環形(cyclic)或偽環形(pseudocyclic)之胜肽形式。本發明之胜肽可以經由將胺基酸殘基側鍊環化於骨架上以取代醯胺鍵使構形固定。此環化策略可允許製備一具有多種長度並包含一構形固定於胜肽上重要的序列之線狀胜肽,例如Arg-Lys-Trp-Phe-Val、Arg-Lys-Trp-Val-Asn、Lys-Trp-Phe-Val-Ala、Lys-Trp-Val-Asn-Tyr、Cys-Lys-Val-Met-Asn、Lys-Trp-Met-Asn-Val和Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val等。結合多種胜肽長度與局部性的構形固定可以使胜肽具有高血小板凝集抑制活性。線狀胜肽通常為有彈性的分子且熵限制在達成有生產力的具生物活性的異構物。基於此理由,許多學者已描述使用不同類型之構形的與拓樸的限制以減少自由度的優點。環型或偽環型胜肽可以經由氧化天然發生之半胱胺酸殘基而得到一雙硫鍵結的結構而形成環狀。為了製備環狀或偽環狀胜肽,最常見的技術係為運用具有正交保護的官能基之胺基酸,如此有些係在其他存在下可選擇的移除。所屬領域的技術人員能夠使用這些技術以製備胜肽溶液,其中胺基端係環化於羧基端以形成一環。其他形成環狀或為環狀胜肽之手段包含側鍊-至-側醯胺鍵或側鍊-至-骨架之連結。
本發明之胜肽化合物也包含醫藥上可接受之鹽類與這些胜肽的衍生物。醫藥上可接受之鹽類的例子包含但不限於鹼性殘基之無機的或有機酸的鹽類,例如胺類;酸性殘基之鹼性的或有機的鹽類,例如羧酸與其類似物。醫藥上可接受之鹽類包含常見的無毒性鹽類或母化合物形成之四級銨鹽,例如從無毒性之無機的或有機的酸類而來。例如,此常見的無毒的鹽類包含那些從無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磺胺酸、磷酸、硝酸與其類似物而衍生而來;以及經由有機酸如醋酸、丙酸、丁二酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、亞甲基雙羥萘酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯乙酸、穀胺酸、苯甲酸、水楊酸、對胺基苯磺酸、2-乙醯氧基苯甲酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羥乙磺酸與其類似物製備之鹽類。這些生理上可接受之鹽係經由本技術領域習知之方法所製備,如經由將游離胺鹼(free amine bases)溶於在醇類水溶液中之過多的酸或用一鹼金屬鹼如一氫氧化合物或一胺中和一游離羧酸。
依據本發明,此胜肽之衍生物具有如阻擋基團(特別係在C端上之醯胺化,但包含,例如在C端、N端以及任何帶電荷之側鏈上之阻擋基團)之修飾,此基團可以經由例如醯胺化、酯化以及其他本技術領域中所熟知之方法而被加入。阻擋基團之實例如NH2
、低級烷基或烷氧基(C1
-C6
)、低級烷羰基、低級烯基、低級炔基、甲醯基、低級芳香基、芳醯基、芳氧基-羰基、芳烷基氧基-羰基、低級烷基氧基羰基、苯基、苯甲醯基、聚乙二醇、硝基、-CN、
醣類、還原的羧化物(例如醛類與醇類)、醯肼、高級烷基醯化(例如脂肪酸醯化)、生物素化與螢光標記。在所有例子中,”低級”表示碳鏈具有1-6個碳原子。發明所屬技術領域中具通常知識者對於使用這些修飾的方法是熟習的(見Richard C.Larock,"Comprehensive Organic Transformations",2nd Edition,published by Wiley-VCH.1999.)。
此些胜肽或其鹽類或其衍生物可以經由標準化學胜肽合成技術而被化學合成。例如,他們可以經由固相合成法(如BOC或FMOC)、液相合成法或經由其他合適之技術包含結合前述之方法而合成。已被建立並廣泛使用之BOC與FMOC法被描述於Merrifield,J.Am.Chem.Soc.88:2149(1963);Meienhofer,Hormonal Proteins and Peptides,C.H.Li,Ed.,Academic Press,1983,pp.48-267;and Barany and Merrifield,in The Peptides,E.Gross and J.Meienhofer,Eds.,Academic Press,New York,1980,pp.3-285.Methods of solid phase peptide synthesis are described in Merrifield,R.B.,Science,232:341(1986);Carpino,L.A.and Han,G.Y.,J.Org.Chem.,37:3404(1972);與Gauspohl,H.et al.
,Synthesis,5:315(1992))中。這些文章的教示在此完整的納入本發明之參考文獻。
本發明之胜肽或其醫藥上可接受之鹽類或衍生物可以抑制血小板之凝集(特別係膠原蛋白所引起之血小板凝集)且具有抗血栓形成的活性但不具有出血性的傾向,所以他們係抑制或治療血栓疾病的潛力藥劑。
在另一態樣中,本發明提供一醫藥組合物,包含一本發明之胜肽化合物與一醫藥上可接受之賦形劑或載體。
本發明之胜肽化合物可以被納入醫藥組合物中。此醫藥組合物可以包含一有效劑量之在醫藥上可接受的賦形劑或載體中之本胜肽。常規用於醫藥組合物的賦形劑與/或載體通常係惰性的且大量製備。
本發明之組合物可以被當成單劑(單獨)使用或與一第二活性組合使用。在一實施例中,該第二活性劑為一血小板凝集抑制劑。這些額外的藥劑可以包含任一個或數個下列藥劑(包含其全體):標準的肝素、低分子量肝素、阿斯匹靈、梯可匹定(ticlopidine)、克洛平格(clopidogrel)、艾柏希曼博(abciximab)、提洛費班(tirofiban)或依非巴特黛(eptifibatide)。
依據本領域技術人員所熟習的常規醫藥技術,本發明之醫藥組合物可以被複合(compounded)。生理上可接受之載體、賦形劑與穩定劑被描述如Remington's Pharmaceutical Sciences,20.sup.th Ed.Mack Publishing Co.(2000)。載體可依照施用需求之製備而提供多種不同形式。本發明之胜肽化合物與組合物可全身或局部施予。此處使用的術語-全身係包含皮下注射、靜脈內注射、肌肉內注射、胸腔內注射、玻璃體內注射、灌流、吸入、經皮吸收、口服、直腸吸收與手術中灌注。以下為本發明之組合物的一些例子。
就口服給藥來說,賦形劑或載體配方可能含有惰性慣常的成分或載體如檸檬酸鈉或磷酸二鈣與(a)結合劑,例如,羧甲基纖維素、藻朊酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶(Polyvinylpyrrolidone)、蔗糖與阿拉伯膠、(b)吸濕劑(Humectant),例如,甘油、(c)崩解劑,例如,瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些複雜的矽酸鹽與碳酸鈉、(d)潤濕劑(wetting agents),例如,十六碳醇與單硬脂酸甘油酯、(e)吸附劑,例如,高嶺土與皂土、(f)填充物,例如,乳糖、澱粉、醣類、蔗糖、葡萄糖、甘露醇與矽酸和(g)潤滑劑,例如,硬脂酸鎂、滑石(粉)、硬脂酸鈣、固態聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉或其混合物。這些與其他合適之醫藥上可接受之賦形劑被描述於Remington's Pharmaceutical Sciences and in Handbook of Pharmaceutical Excipients,3.sup.rd edition,Ed.Arthur H.Kibbe(American Pharmaceutical Association,Washington,D.C.1999中。
對於腸外給藥,溶於芝麻油或花生油、丙二醇水溶液或無菌水溶液中之本發明之胜肽化合物溶液係可被施用的。這些水溶液如果有必要應適當予以緩衝且液態稀釋液首先經由足夠的食鹽水與葡萄糖使得溶液具等滲透壓。這些特定的水溶液特別適合用於靜脈注射、肌肉注射、皮下和腹腔注射。在這方面,在此所使用的無菌水溶液介質係經由本技術領域所習知之標準技術所製備而易於使用。在靜脈給藥中,該化合物可以溶於適當的靜脈給藥載體包含生理相容的物質,如無菌的與生理條件pH值相當之氯化
鈉,如食鹽水。注射用懸浮液也可能依照適當的液體載體、懸浮劑與其類似物所製備。
對於局部給藥,乳霜、凝膠、軟膏或氣溶膠藥膏為典型的使用一油質的基質,如包含固定油或碳氫化合物如白凡士林(white petrolatum)或礦物油或一吸收劑基質如包含一或多個無水吸收劑物質例如無水羊毛脂所製備。隨著基質的形成,活性物質依照所需之濃度添加入。
乳霜通常包含一油相(內相),包含典型的固定油、碳氫化合物與其類似物如蠟、凡士林、礦物油和其類似物與一水相(連續相),包含水與任何水溶性物質如添加鹽。此二相係經由使用乳化劑如一表面活性劑例如十二烷基硫酸鈉;親水膠體如阿拉伯膠的黏土、矽酸鎂鋁與其類似物所安定的。當乳狀形成時,活性物質依照所需之濃度添加入。
凝膠,如前所述,係包含選自一油質的基質、水或一乳狀懸浮基質。加入基質之凝膠劑係形成該基質之基礎並增加其黏性至半固態。凝膠劑之例子如羥丙基纖維素、丙烯酸聚合物與其類似物。活性物質依照所需之濃度於凝膠劑加入步驟加入配方中。
對於直腸投遞,合適之醫藥組合物如局部製劑、栓劑或灌腸劑。栓劑係由脂肪乳劑或懸浮劑所製備的。
在另一方面,本發明提供一種抑制血小板凝集之方法,包含施予需要此治療之對象一有效量之本發明之胜肽化合物或醫藥組合物。較佳地,該血小板凝集係為膠原蛋白所引起的。
在進一方面,本發明提供一種用於預防與/或治療血栓相關疾病之方法,包含施予需要此治療之對象一有效量之本發明之胜肽化合物或醫藥組合物。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物提供抗血拴形成劑之功效,其係經由其與GPVI交互作用之能力而展現抑制血小板凝集與抗血拴形成之活性。再者,本發明之胜肽化合物與醫藥組合物不會造成出血。本發明之胜肽化合物與醫藥組合物可以用於預防或治療與血小板凝集和/或血小板活化相關之疾病或症狀。依此,他們可以用於預防或治療血栓與其相關疾病如靜脈栓塞、已證實的周邊動脈血管疾病、血栓性靜脈炎、動脈栓塞、冠狀動脈與大腦動脈栓塞、不穩定型心絞痛、心肌梗塞、中風、腦栓塞、腎栓塞、肺栓塞及其他但不限於由手術介入造成之栓塞或血栓相關之苦難。本發明進一步提供在冠狀血管成型術、冠狀動脈血管支架放置、冠狀動脈血管造形術、冠狀動脈血栓手術、頸動脈血栓手術或由血小板凝集併發症相關之動脈粥狀硬化、發炎、血液暴露至人工裝置時發生的栓塞或血栓之預防方法。本發明進一步提供預防敗血症(Platelets Amplify Inflammation in Arthritis via Collagen-Dependent Microparticle Production Eric Boilard et al.Science 327,580(2010)
)、腫瘤轉移(Platelet glycoprotein VI facilitates experimental lung metastasis in syngenic mouse models.S.JAIN,S.RUSSELL,J.WARE.Thromb Haemost.2009 Oct;7(10):1713-7
)與發炎性關節炎(Platelets:linking hemostasis and cancer.Jain S,Harris J,Ware J.Arterioscler Thromb Vasc Biol.2010 Dec;30(12):2362-7
)之方法。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係為有效之抗血栓形成藥劑且有效於治療或預防不穩定型心絞痛、冠狀動脈血管造形術與心肌梗塞。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於治療或預防動脈粥狀硬化之初級動脈血栓併發症如血栓型腦中風、週邊血管疾病與心肌梗塞但不會引起血栓溶解。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於治療或預防由介入治療動脈粥狀硬化疾病如血管造形術、動脈內膜切除術、擴張支架置入、冠狀動脈與其他血管移植手術所引起之動脈血栓併發症。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於治療或預防由手術或藥物傷害引起之動脈血栓併發症如手術或意外創傷、重建手術包含皮瓣移植與”縮減”手術如縮乳手術後之組織殘料回收。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於預防在體內由機械所誘導之血小板活化,例如,由體外循環(cardiopulmonary bypass)所產生之暫時血小板失活(阻止微血栓栓塞)。本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於預防在體外由機械所誘導之血小板活化,
例如,本化合物係有效於保存血液製劑如血小板濃厚液;阻止瘻管阻塞如腎臟透析與血漿分離術與血管受損/發炎所形成之血栓如血管炎、動脈炎、絲球體性腎炎與器官移植排斥。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於瀰漫性血栓/血小板消耗的成份(diffuse thrombotic/platelet consumption componen)之疾病如血管內瀰漫性凝血反應(disseminated intravascular coagulation)、血栓性血小板減少紫斑症(hrombotic thrombocytopenic purpura)、溶血性尿毒症候群(hemolytic uremic syndrome)、肝素引起血小板低下(heparin-induced thrombocytopenia)與子癇前症/子癇症(pre-eclampsia/eclampsia)。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於治療或預防靜脈栓塞如深部靜脈血栓(deep vein thrombosis);靜脈阻塞性疾病(veno-occlusive disease);血液的症狀如血小板過多症(thrombocythemia)與紅血球增多症(polycythemia);偏頭痛(migraine)。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於治療一哺乳動物以緩和動脈粥狀硬化與動脈硬化的病理效應、急性心肌梗塞、慢性穩定型心絞痛、不穩定型心絞痛、短暫性腦缺血發作與中風、週邊血管疾病、動脈血栓、子癇前症、栓塞症、血管成形術、頸動脈內膜切除術與血管移植吻合術後之再生狹窄或心血管閉合。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於治療慢性或急性的高凝集力狀態,如瀰漫性血管內凝血作用(DIC)、敗血症、手術
或感染性休克、手術後與產後創傷、心肺繞道手術、不當輸血、胎盤早期剝離、血栓性血小板減少紫斑(TTP)、蛇毒與免疫疾病係對此治療有反應的。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於治療經由人造裝置與血液接觸所引起之血小板活化和/或凝集相關之疾病或症狀。在一實施例中,該人造裝置係一體側的人工肺臟(paracorporeal artificial lung)與一體外循環維生系統(extracorporeal membrane oxygenation device)。在另一實施例中,該人造裝置係一體內植入式人工心臟。在又一實施例中,該人造裝置係一分離機(apheresis instrument),用以移除或分離一血液中特定成分且將剩餘之血液成分輸回給捐贈者。在另一實施例中,該人造裝置係一血液透析儀。
本發明之胜肽化合物係有效於在體外抑制血液或血液產品之血小板凝集反應,例如用於儲存或用於生物體之外(ex vivo)之操作如用於診斷或研究之用途。在該應用中,該化合物係給予血液或血液產物。
在其他較佳實施例中,本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係有效於預防或治療栓塞疾病之療輔助治療如在控制不穩定型心絞痛期間之冠狀動脈栓塞、冠狀動脈血管造形術與急性心肌梗塞如周圍血栓溶解(perithrombolysis)。本發明之胜肽化合物與醫藥組合物係與其他抗血小板的和/或抗凝血藥一起施予,例如肝素、阿司匹林、得利達蒙(dipyridamole)、西洛他唑(Cilostazol)、醣蛋白IIb/IIIa接受器拮抗劑(GP IIb/IIIa antagonists)或凝血酶抑制劑。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物之其他應用包含預防在血栓溶解術治療期間與之後之血小板血栓形成、血栓性栓塞症和再栓塞與預防冠狀動脈與其他動脈再成形術和冠狀動脈繞道手術後之血小板血栓形成、血栓性栓塞症和再栓塞。
本發明之胜肽化合物與醫藥組合物可以經由任何合適之路徑,局部地或全身性地,施予,包含例如經由腸胃外的施予。腸胃外的施予可以包含如肌肉注射、靜脈注射、皮下注射或腹膜內的注射。局部的施予可以包含如乳霜、凝膠、軟膏或氣溶膠藥膏。呼吸系統施予可以包含如吸入或鼻噴劑。
胜肽化合物與組合物施予之量係取決於嚴重的程度與疾病或症狀之種類、所需治療的量與醫藥配方之釋放特性。它也取決於對象之健康狀況、大小、體重、年齡、性別與對藥物之耐受性。典型地,本胜肽或組合物係施予一足夠時間以達成所需的治療效果。在此處所引用之出版物已合併進文獻中。
本發明已詳細描述,並在此提及其具體的實施例,在不偏離本發明之精神與範圍下所做之改變與修改對熟習此技藝的人係顯而易見的。
以下將以具體實驗實施例說明並深入闡述本發明的不同面向,且並不應將其視作對於本發明應用範圍的限制。在以下實施
例中將使用下列材料與方法:
籌瓦格賴瑞斯如前人所述自瓦氏蝮蛇毒液中純化出(Chang CH,Chung CH,Kuo HL,et al.The highly specific platelet glycoprotein(GP)VI agonist trowaglerix impaired collagen-induced platelet aggregation ex vivo through matrix metalloproteinase-dependent GPVI shedding.J Thromb Haemost 2008 Apr;6(4):669-76
)。肝素係購自Novo Nordisk A/S(Bagsvaerd,Denmark)。前列腺素E1(PGE1)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、引朵甲阿辛(indomethacin)以及乙二胺四乙酸(ethylenediamine-tetra-acetic acid(EDTA))係購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA)。溴化氰(CNBr)係購自Hayashi Pure Chemical Ltd.(Osaka,Japan)。抗GPIb單株抗體AP1由Dr.Robert Montgomery提供(The Blood Center of Southeastern Wisconsin,Milwaukee,WI,USA)。抗GPVI單株抗體6B12由B.Boylan提供(The Blood Center,Milwaukee,WI,USA)。抗α2β1單株抗體(MAB1998)係購自Chemicon(Temecula,CA,USA)。FITC連接羊抗小鼠IgG係購自Santa Cruz Biotechnology,Inc.(CA,USA)。
以重疊延伸聚合酶連鎖反應(overlap extension PCR)放大具有編碼CVX之α、β部分之C端、符合讀框融合的特定DNA片段,並將該片段插入pET31b(+)表現載體。兩個供pGEX-2T系統使用之合成引子被設計成具有黏端、NdeI切位以及XhoI切位。使用T4 DNA黏合酶將經過限制酶NdeI和XhoI酶切處理後純化之PCR產物,與經NdeI和XhoI酶切處理之pET31b(+)載體之大片段黏合,完成建構後以定序方式做確認。可以在Protein Engineering線上獲得相關補充資料。細菌表現載體被轉形入大腸桿菌BL21(DE3)細胞中。在0.1毫莫耳之異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、37℃的條件下完成蛇類CLPs片段的表現。收集細胞以及離心後,以含5毫莫耳二硫蘇糖醇以及1克/公升溶菌酶之PBS(150毫莫耳NaCl,10毫莫耳Na2
HPO4
,pH 7.4)重新懸浮細胞。
在冰上放置45分鐘後使用Sonifier II均質機(Branson Ultrasonic,Carouge-Geneva,Switzerland)將細胞打破,最大速不超過每十秒三次脈衝,同時避免起泡。加入Triton X-100至超音波處理後之溶液,使Triton X-100最終濃度為1%,將溶液在4℃環境下輕微震盪1小時。接著將均質液在4℃下以14000每分鐘轉數離心30分鐘,以離心將溶液中未溶解之微粒去除,再將上清液加至HIS-Select Nickel Affinity Gel(SIGMA),以洗脫緩衝液將蛇類CLP沖提出,再以20%還原性和非還原性十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)跑膠分析。
CVX α和β之C端突變是以QuikChange Site-Directed Mutagenesis system(Stratagene,USA)完成的。將質體模板DNA(約0.5皮莫耳)加入PCR混合液,包括25微升之1倍突變緩衝液(20毫莫耳濃度之Tris,pH 7.5;8毫莫耳濃度之氯化鎂;40微克/毫升之BSA);12-20皮莫耳之各引子(其中一個必須包含一5-prime phosphate)、250微莫耳之dNTP、2.5單位之Taq
DNA聚合酶、2.5單位之Taq
延長因子(Stratagene)。PCR相關參數為:1循環之94℃ 4分鐘,50℃ 2分鐘及72℃ 2分鐘,接下來為5-10循環之94℃ 1分鐘,54℃ 2分鐘及72℃ 1分鐘。以10單位Dpn
I和2.5單位Pfu
DNA聚合酶處理親本模板DNA以及包含新合成DNA之線性突變誘發引子。這將使得在活體內被甲基化的親本與雜和DNA受到Dpn
I酶切,以及線性PCR產物上由Taq
DNA聚合酶聚合的鹼基被Pfu
DNA聚合酶移除。在37℃反應30分鐘後再移至72℃反應30分鐘。將突變緩衝液(1倍,115微升,其中含0.5毫莫耳濃度之ATP)加入經Dpn
I酶切和Pfu
DNA聚合酶處理之PCR產物。將溶液混合均勻後取出10微升至一新的微離心管中,並加入2-4單位之T4 DNA黏合酶。於37℃進行黏合反應60分鐘以上。將反應完之溶液轉形入勝任大腸桿菌中。
經烷基化之籌瓦格賴瑞斯次單元體之分離是依據前人描述的
步驟進行(Chang CH,Chung CH,Kuo HL,et al.The highly specific platelet glycoprotein(GP)VI agonist trowaglerix impaired collagen-induced platelet aggregation ex vivo through matrix metalloproteinase-dependent GPVI shedding.J Thromb Haemost 2008 Apr;6(4):669-76
)。將分離後的次單元體溶解在70%甲酸中並在室溫下與CNBr作用隔夜。以真空乾燥法將甲酸與CNBr移除。將經CNBr水解之S砒啶乙基化的籌瓦格賴瑞斯片段以裝置C8管柱(3.9x150釐米,Waters)之反向高效液相層析儀使用0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid(TFA))中之乙腈梯度來分離。
數條根據蛇類毒液CLPs序列,包括:艾格瑞汀(Agg)、卡渥幸(CVX)、籌瓦格賴瑞斯Tro)和艾格奇斯汀(Agk)(Chen YL,Tsai KW,Chang T,et al.Glycoprotein Ib-binding protein from the venom of Deinagkistrodon acutus--cDNA sequence,functional characterization,and three-dimensional modeling.Thrombosis and haemostasis 2000 Jan;83(1):119-26;Chung CH,Au LC,Huang TF.Molecular cloning and sequence analysis of aggretin,a collagen-like platelet aggregation inducer.Biochemical and biophysical research communications 1999 Oct 5;263(3):723-7
)之胜肽是由MDBio,Inc合成。連結FITC之六胜肽係購自MDBio,Inc。蛇類毒液CLPs已被廣泛地用來研究血小板受體,部分CLPs之結晶構造也已被研
究。根據CLPs上推測的結合位,我們合成了數個CLPs之C端的六胜肽或十胜肽,並檢驗它們對於血小板功能的影響。
血液採集自健康、在兩周內未服用任何藥物之人類自願者,並以檸檬酸右旋葡萄糖(acid citrate dextrose)或3.8%檸檬酸鈉(9:1,體積百分濃度)作為抗凝劑。在室溫下以100g離心9分鐘後得到富血小板之血漿(PRP),依據先前描述之實驗步驟(Mustard JF,Perry DW,Ardlie NG,et al.Preparation of suspensions of washed platelets from humans.British journal of haematology 1972 Feb;22(2):193-204
).Platelet aggregation was measured with an aggregometer(Payton Scientific,Buffalo,NY,USA)製備血小板懸浮液。在37℃、900每分鐘轉數連續攪拌下以血小板凝集儀(aggregometer)(Payton Scientific,Buffalo,NY,USA)測量血小板的凝集。在加入血小板聚集促效劑5分鐘後,持續觀察血小板凝集的程度,光穿透度的增加代表血小板逐漸凝集。
在受測樣本加入後6分鐘,加入引朵甲阿辛(50 μM)和EDTA(2 mM)終止由膠原蛋白引起之血小板的血栓素B2形成。在加入誘發劑前3分鐘預先將六胜肽與血小板混勻作用。以14000每
分鐘轉數離心兩分鐘後,再以TxB2
酵素免疫分析(EIA)kit(Amersham Pharmacia,Sweden)測定上清液中血栓素B2
(一血栓素A2
的穩定代謝產物)的含量。
以流式細胞儀測量血小板表面P選擇素的表現。以上述方法製備流洗過的血小板,並將其濃度調整至3×108
血小板/毫升。以100奈克/毫升雅瑞(Aggrastat)預先處理流洗過的血小板以免血小板聚集,再加入5微克/毫升膠原蛋白,5分鐘後加入抗CD62P-FITC放置15分鐘。以流式細胞儀分析處理過的血小板。在加入膠原蛋白前3分鐘預先將六胜肽與血小板混勻作用。
胞內游離態鈣離子的濃度是根據Pollock和Rink的方法(Pollock WK,Rink TJ.Thrombin and ionomycin can raise platelet cytosolic Ca2
+to micromolar levels by discharge of internal Ca2
+stores:studies using fura-2.Biochemical and biophysical research communications 1986 Aug 29;139(1):308-14
),以螢光探針(Fura-2/A)測定。載有Fura-2/AM之血小板,其製備同上述流洗血小板之方式,除了沖洗液(Tyrode solution)須不含鈣離子,並於第一次沖洗時讓血小板吸收Fura-2/AM(5微莫耳濃度)30分鐘。在鈣離子1毫莫耳濃度的環境中,以Hitachi螢光分光光度計量測螢光強度的改變(激發光波長為339奈米,發射光波長為500
奈米),以測量載有Fura-2之血小板(3×108
/毫升)的胞內鈣離子濃度。由Grynkiewicz等人(Grynkiewicz G,Poen ie M,Tsien RY.A new generation of Ca2
+indicators with greatly improved fluorescence properties.J Biol Chem 1985 Mar 25;260(6):3440-50
)所述之公式計算胞內鈣離子的濃度。
將流洗過、含2微莫耳濃度PGE1的血小板(3×108
血小板/毫升)與籌瓦格賴瑞斯α次單元體之六胜肽(100微克/毫升)在室溫下混合作用30分鐘。混合作用後在室溫下以初級抗GPIb抗體、α2β1細胞黏合素、αIIbβ3或GPVI單株抗體(10微克/毫升)標記血小板,作用15分鐘。流洗標記好的血小板,然後再將其與次級FITC連接山羊抗小鼠IgG於室溫作用15分鐘,再立即以FACS Calibur(Becton Dickinson,USA)分析,激發光和發射之波長分別為488奈米及525奈米。蒐集10,000顆細胞之螢光訊號來計算單一細胞之平均螢光強度。除此之外,我們使用FITC-六胜肽作為探針來評估六胜肽之直接結合。將流洗過、含2微莫耳濃度PGE1之血小板(3×108
血小板/毫升)與不同濃度之FITC-六胜肽或FITC-BSA(以作為負控制組)在室溫下混合作用15分鐘再立即以FACS分析。
以靜脈注射PBS或六胜肽(30微克/公斤)至雄性ICR小鼠(25-30克)體內,接著在注射5分鐘後收集血液。使用Sysmex細胞計數器(Chuo-Ku Kobe,Japan)計算全血樣本中血小板的數目。立刻以200g離心5分鐘來準備PRP。調整PRP中的血小板數目至3×108
/毫升,在血小板凝集儀(aggregometer)上進行血小板凝集試驗。
腸繫膜微血管中血小板栓塞的形成是根據前人技術(Chang MC,Lin HK,Peng HC,et al.Antithrombotic effect of crotalin,a platelet membrane glycoprotein Ib antagonist from venom of Crotalus atrox.Blood 1998 Mar 1;91(5):1582
-9)經修改後進行的。簡言之,經腹膜內注射戊基比巴妥鈉(50毫克/公斤)麻醉雄性ICR小鼠(12-14克),再將螢光鈉素(12.5毫克/公斤)以靜脈注射方式注入小鼠尾巴支靜脈中。取出小腸後,將包含微血管床之腸繫膜放置在透明塑膠板上以供顯微鏡觀察。為了避免腸繫膜乾掉,持續以溫熱(37℃)之等張生理食鹽水潤濕。選擇照亮直徑約30-40微米之小靜脈來產生微血栓。落射光顯微鏡系統中,照明(光波長大於520奈米)落在焦平面的範圍,其直徑約為50微米。在操作完成後(10分鐘),以靜脈注射方式將PBS(控制組)、阿斯匹靈(150毫克/公斤)或六胜肽(30毫克/公斤)注射至小鼠尾巴其他支靜脈中。施用這些藥物的五分鐘後,以濾鏡光開始照明並記
錄阻塞的時間(血流停止的時間)。
血流時間的量測是以Dejana等人所描述的方法(Dejana E,Villa S,de Gaetano G.Bleeding time in rats:a comparison of different experimental conditions.Thrombosis and haemostasis 1982 Aug 24;48(1):108-11
)經稍微修改後進行。以靜脈注射方式將PBS或六胜肽(30毫克/公斤)注入小鼠(ICR,雄性,25-30克)尾巴靜脈中。注射五分鐘後切下自末端算起2毫米之尾巴。將尾巴立刻置入含生理食鹽水的離心管當中,並保持37℃以量測血流時間
所有的數值皆以平均值±平均標準差來呈現。群組間的差異視情況以單因子變數分析(one-way ANOVA)和Newman-Keuls多重比較測定評估。P值小於0.05(P<0.05)時被視為具有顯著差異。
預先以CVX α或β之C端(CVX α之C端104-135
:CSLLKKE TGFRKWFVASCIGKIPFVCKFPPQC(SEQ ID NO:31),CVX β之C端94-125
:EEFECLISRTFDNQWLSAPCSDTYSFVCKFE A(SEQ ID NO:32),50微克/毫升)處理顯著降低膠原蛋白引起之血小板凝集(圖1A)。因為膠原蛋白會與受體(細胞黏合素α2β1和GPVI)
作用,因此CLPs片段與這些受體間的專一性和結合親和力可能會有差異。籌瓦格賴瑞斯(一種GPVI之促效劑),和瑞斯特黴素(ristocetin)(一種GPIb之間接促效劑),也被當作血小板凝集促效劑來測試CVX α、β之C端的抑制效果(Chang CH,Chung CH,Kuo HL,et al.The highly specific platelet glycoprotein(GP)VI agonist trowaglerix impaired collagen-induced platelet aggregation ex vivo through matrix metalloproteinase-dependent GPVI shedding.J Thromb Haemost 2008 Apr;6(4):669-76;Sweeney JD,Labuzetta JW,Bernstein ZP,et al.Ristocetin-induced platelet aggregate for-mation and adherence to the probe of an impedance aggrego-meter.Am J Clin Pathol 1990 Apr;93(4):548
-51)。對於籌瓦格賴瑞斯引起之血小板凝集,CVX α和β次單元體之C端皆表現濃度依賴且強烈的抑制效果(10-90%抑制效果)(圖1B)。有趣的是50微克/毫升的CVX α和β次單元體之C端可終止膠原蛋白引起之血小板凝集,對於瑞斯特黴素引起之血小板活化卻只有約20%的抑制效果(資料未呈現)。這些結果顯示CVX α和β次單元體之C端可能負責結合CVX與GPVI或細胞黏合素α2β1。
為研究血小板上CVX α或β之C端的目標位置,使血小板與CVX α或β之C端以及不同的抗體混合作用,以檢驗其結合反應。
抗細胞黏合素α2β1單株抗體、MAB1998、一抗GPIb之抗體以及AP1的結合並未受到CVX α或β之C端的影響(圖2A、B)。相反地,CVX α或β之C端顯著地抑制抗GPVI抗體(6B12)與血小板的結合(圖2C)。這些結果顯示CVX α或β之C端的結合目標為GPVI。
特定胺基酸對於CVX α和β C端抑制效果之貢獻已被研究。同源基因C端間的序列比對,顯示保守胺基酸兩旁的區域為高序列變異性的區域。這些區域可能造成對GPVI結合的專一性。以定點突變技術測試這些關鍵胺基酸的參與程度。位址1的突變幾乎完全破壞CVX α或β之C端對於膠原蛋白引起之血小板凝集的抑制效果(α次單元體,W116A和β次單元體,W108A),而位址2的突變卻無影響(α次單元體,F117A和β次單元體,L109A)(圖3A)。使用籌瓦格賴瑞斯作為GPVI專一的誘發劑來測試這些胺基酸的重要性。實驗結果與膠原蛋白處理組相似(圖3B)。因此CVX α或β之C端主要透過GPVI來達到抑制效果,而且色胺酸對於其結合能力有關鍵的影響。
根據上述結果,蛇類毒液CLPs上之受器結合位可能具專一性且位於C端上。此外先前研究證實籌瓦格賴瑞斯(一種屬於蛇類
毒液C型凝集素之高分子量異形二聚體多聚體),會專一地透過GPVI訊息傳導路徑活化血小板,並引起具功能活性之αIIbβ3的外露以及血小板聚集(Chang CH,Chung CH,Kuo HL,et al.The highly specific platelet glycoprotein(GP)VI agonist trowaglerix impaired collagen-induced platelet aggre-gation ex vivo through matrix metalloproteinase-dependent GPVI shedding.J Thromb Haemost 2008 Apr;6(4):669-76
)。由逆相高效液相層析(圖4A)得到的籌瓦格賴瑞斯之α次單元體,也被發現對於膠原蛋白引起之血小板凝集有顯著的抑制效果(圖4B)。為研究籌瓦格賴瑞斯的小片段是否也具有抑制效果,以CNBr將籌瓦格賴瑞斯降解為片段。籌瓦格賴瑞斯的片段對膠原蛋白引起之血小板凝集也具有抑制效果(資料未呈現)。因此以ABI模式477A蛋白質定序儀(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)進行艾德曼降解法,來為α次單元體經CNBr截切之片段上的胺基酸序列定序。這些序列與幾個蛇類毒液CLPs相似,但是仍然具有一些特殊的差異(圖5)。
蛇類毒液CLPs已被廣泛用於血小板受器的研究,一些彼等之結晶構造也已被研究(Clemetson KJ,Lu Q,Clemetson JM.Snake C-type lectin-like proteins and platelet receptors.Patho-physiology of haemostasis and thrombosis 2005;34(4-5):150-5;Batuwaugala T,Leduc M,Gibbins JM,et al.Structure of the snake-venom toxin convulxin.Acta crystallographica 2004 Jan;60(Pt 1):46-53
)。依據推斷的CLPs結合位上的胺基酸序列,合成數個CLPs之C端的胜肽(如表2)。並測試其中幾個,以檢驗彼等對於血小板功能的影響結果,如表1所示。
一開始利用數個CLPs的六胜肽包括籌瓦格賴瑞斯、卡渥幸、艾格瑞汀和艾格奇斯汀研究彼等對於膠原蛋白引發之血小板凝集的影響。如圖6所示,籌瓦格賴瑞斯α次單元體上之六胜肽(Troα6:100微克/毫升,128.2微莫耳濃度)對於膠原蛋白引發之血小板凝集具有最強的抑制效果(近50%抑制效果),至於其他六胜肽的效果則約15-30%。因為較佳的抑制效果,選擇此六胜肽(CKWMNV)被選來進行更深入的研究。因此以突變六胜肽上胺基酸的方式,探討哪一個胺基酸對於其抑制能力有關鍵的影響。特定胺基酸的突變(W116A)(圖7A)減弱六胜肽的抑制能力,顯示六胜肽上的該胺基酸(色胺酸)對於其抑制能力的表現
具有關鍵的影響。延長合成的胜肽(Troα 10,GFCKWMNVAC)對於膠原蛋白引起之血小板凝集也表現60%的抑制效果。然而籌瓦格賴瑞斯α次單元體之混合型胜肽幾乎未表現抑制效果。其他經修飾過的十胜肽(S1、S2或S1+2)也被用於研究彼等對於膠原蛋白引起之血小板凝集的影響。圖7B所示為Troα10與衍生自籌瓦格賴瑞斯α並經過修飾的十胜肽(100微克/毫升),對於膠原蛋白引起之血小板凝集的影響。流洗過的血小板先於37℃與十胜肽(α10),六胜肽(α6),d-式六胜肽(d-α6),修飾過之十胜肽(S1、S2或S1+2)預先作用3分鐘再加入膠原蛋白引發血小板聚集。實驗結果以抑制效果的百分比表示。數據以平均值+SEM(n>3)呈現。亦利用其他血小板促效劑評估六胜肽的抑制效果是否具專一性。如圖8所示,Troα6專一地抑制膠原蛋白引起之血小板凝集,但是對於由ADP或是凝血酶(thrombin)引起的血小板凝集卻沒有良好的效果。再者,此六胜肽對於由瑞斯特黴素或革蘭氏陽性殺菌素(gramicetin,一種GPIb促效劑)引起之血小板凝集反應提供較差的抑制效果。在人類的富血小板之血漿(RPR)中,此六胜肽於200微克/毫升(256.4微莫耳濃度)也表現類似的抑制效果。因此Troα6可能會與膠原蛋白受器(α2β1或GPVI)交互作用並導致抑制血小板凝集的效果。表3所示為六胜肽(Troα6)和十胜肽(Troα10)在活體外對於膠原蛋白引起之血小板凝集的效果。經PBS(CTL)、六胜肽(30毫克/公斤)或十胜肽(10毫克/公斤)處理之小鼠,其富血小板之血漿(RPR)在加入膠原蛋
白(3微克/毫升)後開始凝集反應。實驗結果以抑制效果的百分比來表示。
貯藏在血小板α顆粒中的P選擇素是血小板活化的標記。Troα6以濃度依賴的方式抑制由膠原蛋白引起的血小板中P選擇素的表現(圖9A)。血小板凝集素A2
的形成是血小板活化的標記,而血小板凝集素B2
是其穩定的代謝產物,被用作定量血小板凝集素A2
的指標。流洗過的人類血小板中,因應膠原蛋白處理而產生的血小板凝集素B2
濃度為101.00±11.99奈克/毫升。Troα6以濃度依賴的方式抑制由膠原蛋白引起的血小板凝集素B2
的形成(在128.2微莫耳濃度有15.93±5.81%的抑制效果,在684.6微莫耳濃度有55.23±12.42%的抑制效果)(圖9B)
以流式細胞儀分析FITC-六胜肽與流洗過的血小板的結合,而非專一性結合則是使用FITC-BSA作為探針來進行。如圖10A所示,FITC-六胜肽以濃度依賴的方式與血小板結合,並於濃度為100微克/毫升(128.2微莫耳濃度)時幾乎達到飽和。因而研究Troα6
對於膜上GPIa/IIa、GPIb與GPVI之結合的影響。分別以抗αIIbβ3抗體(7E3)、抗GPIb單株抗體(AP1)、抗α2β1細胞黏合素單株抗體(MAB1998)以及抗GPVI單株抗體(6B12)測試經PBS或Troα6(100微克/毫升)處理之血小板,彼等之間的結合以細胞數目對應螢光強度的直方圖來表示。六胜肽Troα6顯著地抑制GPVI單株抗體(6B12)與血小板間的結合。相反地,六胜肽的處理對於抗αIIbβ3單株抗體(7E3)、抗α2β1細胞黏合素單株抗體(MAB1998)或抗GPIb單株抗體(AP1)與血小板的結合較無影響(圖10B)。
十胜肽對於血小板膜上GPIa/IIa,GPIb以及GPVI的表現的影響。將流洗過的血小板與PBS(細線)或十胜肽(粗線,300微克/毫升)預先處理,再以抗GPIa/IIa單株抗體(6F1)、抗GPIb(6D1)單株抗體、抗GPVI(326E12)單株抗體測試。血小板離心後,使用FITC連結抗IgG抗體進行流式細胞儀分析(圖10C)。在流式細胞儀分析當中,我們發現六胜肽/十胜肽專一地抑制抗GPVI單株抗體的結合,但不會抑制抗α2β1細胞黏合素單株抗體的結合(圖10B-C)。因此我們認為六胜肽/十胜肽藉由與膠原蛋白受器GPVI交互作用抑制膠原蛋白引起之血小板凝集。
Troα6在活體內是否也具有抗血栓效果是接下來要研究的。首先檢測由經Troα6處理之小鼠中得到的PRP對於膠原蛋白的反應性。自預先處理六胜肽(30毫克/公斤)五分鐘之小鼠中取得PRP,此PRP中因膠原蛋白引起之血小板凝集反應顯著地受到抑制(圖11A,抑制程度的%:46.76±4.73,樣本數=11)。然而在處理六胜肽後五分鐘血小板的數目並未改變(11.18±0.30比控制組的11.41±0.19 x 108
/毫升)。另外,檢驗Troα6在活體中的抗血栓效果。觀察在預先接受螢光素鈉處理之小鼠的接受照射的腸繫膜小靜脈中血栓的形成。Troα6(30毫克/公斤)的施打延遲富血小板之血栓的形成,並將阻塞時間自111.1±5.1秒(控制組,樣本數=17)顯著延長至315.9±21.9秒(樣本數=20)。另一方面當劑量為250毫克/公斤時,阿斯匹靈也會延遲阻塞時間至298.7±29.6秒(樣本數=15,表4)。這些資料顯示,在小鼠活體內或活體外施打六胜肽至靜脈中皆具有抗血栓效果。
該六胜肽延遲阻塞時間的程度與阿斯匹靈(250毫克/公斤)的程度相近,然而六胜肽使用的劑量卻低於阿斯匹靈(表4)。再者,六胜肽並未顯著延長流血時間,表示該六胜肽可能優先抑制血栓形成,而對於流血時間只有輕微影響。直至目前為止,除了抗GPVI抗體外,極少有關GPVI抑制劑的報導。本研究中我們率先揭示籌瓦格賴瑞斯α次單元體的以GPVI為標的的合成胜肽,並為發展用於預防動脈血栓的專一、小分子的血小板GPVI拮抗劑提供一新穎的骨架。藉著電腦模擬的幫助,這些胜肽的優化正在進行中。另外Troα10(10毫克/公斤)也顯著地將阻塞時(從153.0±13.5秒(控制組,樣本數=13)延長至294.5±25.4秒(樣本數=19)(表5)。另一方面在劑量為250毫克/公斤時,阿斯匹靈也增加阻塞時間至298.7±29.6秒(樣本數=15)。這些資料顯示在小鼠活體內或活體外,施打六胜肽或十胜肽至靜脈中皆具有抗血栓效果。
我們使用專一的鈣離子探針Fura-2/AM,檢驗十胜肽對於以膠原蛋白活化之血小板中鈣離子濃度([Ca2+
]i)提升的影響。我們發現十胜肽以濃度依賴的方式,抑制膠原蛋白激發之鈣離子濃度上升(圖12)。
圖1顯示重組卡渥幸之C端對血小板聚集的抑製作用。將流洗過的血小板先與不同濃度之重組卡渥幸α或β次單元體之C端在37℃下培養3分鐘,之後加入(A)膠原蛋白(2μ
g/ml)或(B)籌瓦格賴瑞斯(10 ng/ml)以誘導血小板凝集。結果以抑制百分比顯示。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。
圖2顯示卡渥幸(CVX)-α或β之C端對AP1、MAB1998或6B12抗體結合至血小板的影響。將血小板(3 x 107
細胞)與不同濃度之卡渥幸(CVX)-α、β之C端(細線)或磷酸鹽緩沖液(灰線)培養30分鐘,之後與(A)MAB1998、(B)AP1或(C)6B12抗體培養,經過兩次沖洗並與二級抗體培養後,經由流式細胞儀分析血小板。此代表了三次相似之結果。
圖3顯示重組或突變之卡渥幸α、β次單元體C-端對於膠原蛋白或籌瓦格賴瑞斯所引發之血小板凝集之抑制影響。將流洗過的血小板與野生型或其突變型之卡渥幸α、β次單元體C-端(50 μg/ml)於37℃培養3分鐘,接著加入(A)膠原蛋白(2μ
g/ml)或(B)籌瓦格賴瑞斯(10 ng/ml)以刺激血小板凝集。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。
圖4顯示籌瓦格賴瑞斯α、β次單元體之分群與其對於膠原蛋白所引起之凝集的影響。(A)將還原的與烷基化的籌瓦格賴瑞斯在逆相液相層析儀(reserve-phase HPLC)C8管柱上分群。α與β分群分別於20與22分鐘時汲取出。(B)將流洗過的血小板與籌瓦格賴瑞斯之α與β次單元體於37℃先培養3分鐘,接著加入膠原蛋白(2μ
g/ml)以刺激血小板凝集。結果以抑制百分比顯示。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。
圖5顯示籌瓦格賴瑞斯α次單元體序列與其他蛇毒C型類凝集素功能區(C-type lectin-like domain,CLPs)之比對。籌瓦格賴瑞斯α次單元體之溴化氰(CNBr)切位片段之部分胺基酸序列已經由Edman切割法(Edman degradation)定出序列。空格為尚未定出序列之胺基酸。所有序列皆相同之殘基以陰影標示。籌瓦格賴瑞斯與其他蛋白之相似百分比顯示在右下方(約44-46%)。序列係由下列來源所獲得的:卡渥幸(Leduc M,Bon C.Cloning of subunits of convulxin,a collagen-like platelet-aggregating protein from Crotalus durissus terrificus venom.Biochem J 1998 Jul 15;333(Pt 2):389-93)
,艾古斯汀(Wang WJ,Ling QD,Liau MY,et al.A tetrameric glycoprotein Ib-binding protein,agglucetin,from Formosan pit viper:structure and interaction with human platelets.Thrombosis and haemostasis 2003 Sep;90(3):465-75
)與歐博艾格瑞君A(alboaggregin A)(Kowalska MA,Tan L,Holt JC,et al.Alboaggregins A and B.Structure and interaction with human platelets.Thrombosis and haemostasis 1998 Mar;79(3):609-13
)。
圖6顯示蛇蛋白C型類凝集素之六胜肽對於膠原蛋白所引起之凝集的影響。將流洗過的血小板與不同之卡渥幸α(CVXα6)、β(CVXβ6)、籌瓦格賴瑞斯α(Troα6)、艾格瑞汀α(Aggα6)、β(Aggβ6)、艾格奇斯汀α(Agkα6),β(Agkβ6)之六胜肽(100μ
g/ml)於
37℃培養3分鐘,接著加入膠原蛋白(2μ
g/ml)以刺激血小板凝集。結果以抑制百分比顯示。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。
圖7顯示籌瓦格賴瑞斯α與其突變體之六胜肽對於膠原蛋白所引起之凝集的影響。(A)將流洗過的血小板與六胜肽、其突變體、不規則的六胜肽或經延長的十胜肽(Troα10)(100μ
g/ml)於37℃培養3分鐘,接著加入膠原蛋白(2μ
g/ml)以刺激血小板凝集。(B)經由籌瓦格賴瑞斯α所得之經修飾的十胜肽(100 μg/ml)對於膠原蛋白所引起之凝集的影響。將流洗過的血小板與十胜肽(α10)、六胜肽(α6)、d型六胜肽(d-α6)、經修飾的十胜肽(S1,S2 or S1+2)於37℃培養3分鐘,接著加入膠原蛋白以刺激血小板凝集。結果以抑制百分比顯示。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。
圖8顯示籌瓦格賴瑞斯α之六胜肽對於膠原蛋白、二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶所引起之凝集與瑞斯特黴素(ristocetin)或革蘭氏陽性殺菌素(gramicetin)所引起之凝集的影響。(A)富含血小板之血漿(Platelet-rich plasma,PRP)與六胜肽(200μ
g/ml)於37℃培養3分鐘,接著加入膠原蛋白(2μ
g/ml)或二磷酸腺苷(20μ
M)以刺激血小板凝集。(B)將流洗過的血小板與六胜肽(100μ
g/ml)於37℃培養3分鐘,接著加入膠原蛋白(2μ
g/ml)、凝血酶(0.05 U/ml)、瑞斯特黴素(1 mg/ml)或革蘭氏陽性殺菌素(1μ
g/ml)以刺激血小板聚合/凝集。結果以抑制百分比顯示。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。
圖9顯示籌瓦格賴瑞斯α之六胜肽對膠原蛋白活化之血小板之P選擇素(P-Selectin)之表現與血小板凝集素B2(thromboxane B2)之形成的影響。(A)將流洗過的血小板與引朵美洒辛(indomethacin)(Indo,10μ
M)或不同濃度之六胜肽培養3分鐘,接著使用膠原蛋白(5μ
g/ml)活化並使用異硫氰酸熒光素(FITC)共軛的抗CD62單株抗體(Ctl)以流式細胞儀分析。結果表示為P選擇素之表現與對照組(Ctl)比較的倍數。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。(B)將血小板先與引朵美洒辛(10μ
M)或不同濃度之六胜肽培養3分鐘再加入膠原蛋白(5μ
g/ml)。數據係以平均±標準差(n≧3)呈現。
圖10顯示在人類血小板中六胜肽(Troα6)的結合標的。(A)以流式細胞儀分析異硫氰酸熒光素-六胜肽結合至血小板之結果。特異性結合之計算為總結合數(經由異硫氰酸熒光素-六胜肽探測)減去非特異性結合數(經由異硫氰酸熒光素-牛血清白蛋白探測)。(B)將流洗過的血小板與磷酸鹽緩沖液(灰色)或六胜肽(細線條)培養,並使用抗-αIIbβ3(7E3,a)、抗-GPIb(AP1,b)、抗-α2β1(MAB1998,c)或抗-GPVI(6B12,d)單株抗體偵測。(C)將流洗過的血小板與磷酸鹽緩沖液(細線條)或十胜肽(粗線條,300 μg/ml)培養,接著使用抗-GPIa/IIa(6F1)、抗-GPIb(6D1)或抗-GPVI(326E12)單株抗體偵測。離心後,使用流式細胞儀分析經異硫氰酸熒光素共軛的抗-IgG
單株抗體標定之血小板。結果以細胞數與螢光強度之直方圖表示。此實驗至少重複三次但僅顯示代表性圖式。
圖11顯示六胜肽(Troα6)在體外(ex vivo)(A)與體內尾取血(tail bleeding in vivo)(B)對膠原蛋白所引起之血小板凝集的影響。(A)將從磷酸鹽緩沖液(CTL)或六胜肽(Troα,30 mg/kg)處理之老鼠準備之富含血小板之血漿加入膠原蛋白(3μ
g/ml)以起始其凝集反應。此實驗代表了至少六次相似之實驗。(B)在靜脈注射CTL、六胜肽(Troα,30 mg/kg)、替羅非班(tirofiban)(0.4 mg/kg)或阿司匹靈(250 mg/kg)後五分鐘測量出血時間。出血時間長於十分鐘表示為>10 min。平均出血時間如(一)之顯示。每一種不同的符號代表各別老鼠之出血時間。
圖12顯示合成之胜肽在人類血小板中之結合標的。(A)以流式細胞儀分析經由異硫氰酸熒光素-六胜肽結合之血小板。特異性結合之計算為總結合數(經由異硫氰酸熒光素-六胜肽探測)減去非特異性結合數(經由異硫氰酸熒光素-牛血清白蛋白探測)。(B)將流洗過的血小板與磷酸鹽緩沖液(灰色)或六胜肽(細線條)培養,並使用抗-αIIbβ3(7E3,a)、抗-GPIb(AP1,b)、抗-α2β1(MAB1998,c)或抗-GPVI(6B12,d)單株抗體偵測。(C)將流洗過的血小板與磷酸鹽緩沖液(細線條)或十胜肽(粗線條)培養,並使用抗-α2β1(6F1)、抗-GPIb(6D1)或抗-GPVI(326E12)單株抗體偵測。離心後,以流式細
胞儀分析經異硫氰酸熒光素共軛的抗-IgG單株抗體標定之血小板。結果以細胞數與螢光強度之直方圖表示。此實驗至少重複三次但僅顯示代表性圖式。
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<220>
<223> CVX-β 6
<400> 22
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Agg--β 6
<400> 23
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Agk--β 6
<400> 24
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tro-α 10
<400> 25
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tro-α環8
<400> 26
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tro-α環10
<400> 27
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tro-α衍生物
<400> 28
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tro-α衍生物
<400> 29
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tro-α環12
<400> 30
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組的CVX α C端104-135
<400> 31
<210> 32
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組的CVX β C端94-125
<400> 32
Claims (14)
- 一種胜肽化合物,其係由一式X1 -X2 -Trp-X3 -X4 -X5 或式A1 -A2 -X1 -X2 -Trp-X3 -X4 -X5 -B1 -B2 之胺基酸序列或彼等之醫藥上可接受鹽類所組成,其中該式X1 -X2 -Trp-X3 -X4 -X5 之胺基酸序列係Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val(SEQ ID NO:15)且該式A1 -A2 -X1 -X2 -Trp-X3 -X4 -X5 -B1 -B2 之胺基酸序列係Gly-Phe-Cys-Lys-Trp-Met-Asn-Val-Ala-Cys(SEQ ID NO:25)。
- 根據申請專利範圍第1項所述之化合物,其係為環形(cyclic)或偽環形(pseudocyclic)之胜肽形式。
- 一種醫藥組合物,包含一根據申請專利範圍第1項所述之胜肽化合物及醫藥上可接受之賦形劑或載劑。
- 根據申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物,其進一步包含一第二活性成分。
- 根據申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物,該第二活性成分為一血小板凝集抑制劑。
- 根據申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物,其中該第二活性成分為肝素(heparin)、阿斯匹靈(aspirin)、梯可匹定(ticlopidine)、克洛平格(clopidogrel)、艾柏希曼 博(abciximab)、提洛費班(tirofiban)、依非巴特(eptifibatide)、黛皮靈曼模(dipyridamole)或西樂斯塔佐(cilostazol)或其混合物。
- 根據申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物,其可經由系統性或局部給藥。
- 根據申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物,其可經由靜脈內注射(intravenous)、肌肉內注射(intramuscular)、胸腔內注射(intrasternal injection)、玻璃體內注射(intravitreal injection)、靜脈注射(infusion)、吸入(inhalation)、經皮吸收(transdermal administration)、口服(oral administration)、直腸吸收(rectal administration)及手術中灌注使用。
- 一種根據申請專利範圍第1項所述之胜肽化合物或根據申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物在製備用於抑制血小板凝集的藥物的用途。
- 根據申請專利範圍第9項所述之用途,該血小板凝集為膠原蛋白引起之凝集。
- 根據申請專利範圍第9項所述之用途,該血小板凝集為與GPVI交互作用所引起。
- 一種根據申請專利範圍第1項所述之胜肽化合物或根據申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物在製備用於預防或治療血栓相關疾病的藥物的用途。
- 根據申請專利範圍第12項所述之用途,該血栓相關疾病為血栓(thrombosis)、周邊動脈血管疾病(established peripheral arterial disease)、血栓性靜脈炎(thrombophlebitis)、靜脈栓塞(venous thrombosis)、動脈栓塞(arterial embolism)、冠狀動脈與大腦動脈栓塞(coronary and cerebral arterial thrombosis)、不穩定型心絞痛(unstable angina)、心肌梗塞(myocardial infarction)、中風(stroke)、腦栓塞(cerebral embolism)、腎栓塞(renal embolism)、肺栓塞(pulmonary embolism)與其他但不限定由手術介入造成之栓塞或血栓相關疾病。
- 根據申請專利範圍第12項所述之用途,該藥物係用於預防在包括於冠狀血管成型術(percutaneous coronary interventions)、冠狀動脈血管支架放置(placement of coronary stents)、冠狀動脈血管造形術(coronary angioplasty)、冠狀動脈血栓手術(coronary endarectomy)、頸動脈血栓手術(carotid endarectomy)時發生的栓塞或血栓、或動脈硬化(atherosclerosis)、發炎(inflammation)、血液暴露人為裝置(exposure of blood to artificial devices)或藥物引起的血小板凝集併發症(platelet-aggregation complications)。
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TW101121679A TWI485157B (zh) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 用於抑制血小板凝集之胜肽化合物 |
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TW201350500A TW201350500A (zh) | 2013-12-16 |
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TW101121679A TWI485157B (zh) | 2012-06-15 | 2012-06-15 | 用於抑制血小板凝集之胜肽化合物 |
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Families Citing this family (1)
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CN113429457B (zh) * | 2021-06-16 | 2022-07-26 | 昆明医科大学第一附属医院 | 一种抗血小板聚集的多肽及其应用 |
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2012
- 2012-06-15 TW TW101121679A patent/TWI485157B/zh not_active IP Right Cessation
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NCBI GenBank:.1, 2012-05-03 CHANG, C‐H., et al. "The highly specific platelet glycoprotein (GP) VI agonist trowaglerix impaired collagen‐induced platelet aggregation ex vivo through matrix metalloproteinase‐dependent GPVI shedding." Journal of Thrombosis and Haemostasis 6.4 (2008): 669-676 * |
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