PROTEINA PARA BLOQUEAR LA ADHESIÓN DE PLAQUETAS Sumario de la Invención Se describe una proteina que se encuentra en forma natural aislada a partir de la saliva de la sanguijuela medicinal Hirudo medicinalis, la cual se enlaza fuertemente al colágeno actuando de esta forma como un inhibidor de la adhesión natural de plaquetas al colágeno. La proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 12,000, un punto isoeléctrico ácido y contiene seis cisteinas. La proteina se secuencia y se clona el gen a partir de la biblioteca de ADNc de H. medicinalis . Se describen los procedimientos para producir tal polipéptido por técnicas recombinantes. Las proteinas recombinantes y las que se encuentran en forma natural son inhibidores potentes de la adhesión de plaquetas dependiente de colágeno y por lo tanto son útiles para el tratamiento terapéutico de varias condiciones relacionadas con enfermedad del corazón y enfermedades del sistema circulatorio. Adicionalmente la proteina es útil para recubrir las superficies de colágeno naturales y artificiales con el fin de llevarlas a ser no adhesivas para las células y prevenir la activación de las células. Campo de la Invención En la homeostasis o trombosis, las plaquetas se adhieren a la matriz celular-extracelular del vaso dañado y
REF: 132297 cubren la superficie del área dañada. El prevenir esta etapa inicial importante en la patogénesis de la trombosis y la oclusión arterial debe ser un beneficio terapéutico en un esfuerzo para prevenir las enfermedades trombóticas. El colágeno es considerado para ser el mayor componente superficial trombogénico y ha mostrado ser un estimulante fuerte para la adhesión de plaquetas, agregación y liberación de sus granulos llevando al recrudecimiento de (Ruggeri, Z.M. et al.; Seminars in Hematology, 1994, 31, 229-39) las plaquetas adicionales a esta área para formar agregados o un trombo. El contacto inicial de las plaquetas a la superficie del vaso está mediado por un factor von Willebrand de enlace de colágeno (vWF) y un receptor v F especifico en las plaquetas, el complejo Ib-V-IX de glicoproteinas. Además el ADP, la epinefrina y los factores de coagulación circulantes impulsan el proceso de activación adicional de las plaquetas mientras que simultáneamente un incremento en la actividad de la trombina contribuye a la formación del coágulo de fibrina reticulado. La agregación de plaqueta-plaqueta soporta este proceso y es impulsado principalmente por fibrinógeno como un mediador que forma un puente entre las células a través del receptor de glicoproteina Ilb/IIIa. Esta respuesta fisiológica normal es muy critica en el curso del proceso patológico donde las plaquetas se adhieren a los colágenos expuestos en las lesiones escleróticas (Van der Rest M. et al.; FASEB Journal, 1991, 5, 2814-23) e inicia a formar oclusiones. Dependiendo de la ubicación y grado de las complicaciones severas por oclusión tales como infarto al miocardio, ataque, inflamación o embolismo pulmonar pueden ser los resultados severos de este proceso . Como un agente antitrombótico que actúa directo la heparina, la cual bloquea la actividad de la trombina, previniendo de esta forma la formación de los trombos ricos en fibrina, es el fármaco actualmente más bien conocido usado en las intervenciones antitrombóticas. La heparina es usada ampliamente en indicaciones tales como: angina inestable e infarto al miocardio agudo. Sin embargo, a pesar del uso amplio permanecen sin ser resueltas varias desventajas severas tales como la aplicación intravenosa, el requerimiento para una anti-trombina-III como un cofactor, la afinidad reducida para trombina de enlace al coágulo, su inactivación por varias proteinas del plasma, la inducción ocasional de la trombocitopenia y su heterogeneidad biológica. Como una consecuencia, los resultados de usar la heparina en el marco clinico no han sido resueltos hasta ahora .
x El desarrollo reciente de la heparina de bajo peso molecular ha contribuido a una versión para la aplicación subcutánea, sin embargo el beneficio terapéutico sobre la heparina estándar ha sido minimo. Desafortunadamente lo 5 mismo aplica a las otras antitrombinas que actúan directamente tales como Hirudins, Hirulog y arfarina. Ha resultado que uno de los problemas principales parece estar relacionado con la producción incrementada de la trombina bajo el tratamiento antitrombótico (Rao, A.K. et al,
10 Circulation, 1996, 94, 389-2395) . Otras estrategias recientes han sido enfocadas por lo tanto al proceso de activación de protrombina, el cual se activa por el Factor Xa. El mayor reto es el diseño de los inhibidores apropiados dirigidos a este factor. En resumen,
15 puede por lo tanto argumentarse que el potencial terapéutico total de este tipo de intervención no ha sido comprendido aún. Otro panel de terapéuticos está representado por los regímenes tromboliticos y se ha enfocado en el
20 desarrollo de la estafiloquinasa, estreptoquinasa, uroqumasa tipo Activador de plasminógeno, tejido tipo Activador de Plasminógeno y complejo de activador de estreptoquinasa plasminógeno anisoilado. Las diferencias en tiempo necesarias para inducir la reperfusión es una
- *& *&*£ &- ^ iÑ diferencia remarcable para cada uno de estos agentes tromboliticos, sin embargo, la contribución en términos de reducir la mortalidad total es igual para todos los productos. Además la reoclusión o sangrado prolongado son complicaciones frecuentes. Esto puede ser debido a la especificidad relativamente baja para fibrina y la vida media corta del plasma de estos compuestos. Actualmente son probados varios regímenes de aplicación y combinaciones de diferentes principios fibrinoliticos con el fin de solucionar algunas de las desventajas actuales en la terapia tro bolitica. La mejora que se espera es, sin embargo, más bien pequeña. Recientemente un nuevo grupo de pacientes presentan problemas tales como oclusión trombótica aguda y restenosis tardia debido a los procedimientos tales como angioplastia, aterectomia, injerto arterial o masa de Stent de la pared del vaso. Las posibles intervenciones terapéuticas comprenden estrategias antiplaquetas, antitrombóticas y tromboliticas . Varios otros agentes tales como la ticlopdina que actúa como antagonista de ADP o el yonóforo de calcio A-23187 y especialmente Asprin tienen una influencia directa en la función de las plaquetas y se han sugerido o usado para prevenir o minimizar la agregación de plaquetas. La nueva sustancia de adhesión antiplaquetas de
^ ^- acuerdo con esta invención puede también ayudar a solucionar estas complicaciones clínicas cuando se aplica durante la cirugía . Otra complicación relacionada con este tópico se
5 origina si las superficies artificiales están en contacto con la sangre, entonces se incrementa su tendencia para inducir los eventos trombóticos por la activación de las plaquetas y/o inducción de coagulación. Estos efectos pueden provocar falla de los injertos vasculares, válvulas 0 cardiacas, masas de stent, catéteres o cualesquiera otro dispositivo o material de contacto sanguíneo. La capacidad de la proteina descrita en la presente para crear las superficies no trombogénicas puede por lo tanto ser además explotada por la inmovilización de esta proteina a los 5 materiales y dispositivos descritos anteriormente. Tal tratamiento puede llevar a tales materiales o dispositivos a ser biocompatibles y tromboresistentes . Debido a las limitaciones asociadas con los agentes antitrombóticos disponibles hay una necesidad real 0 para nuevas estrategias y terapéuticos alternativos. Antecedente de la Invención Un potencial para mejoras futuras en el tratamiento de los desórdenes cardiovasculares puede ser contribuido por los procedimientos como se describe en esta
invención, los cuales interfieren directamente con el colágeno y/o el factor de adhesión de plaquetas vWF. Varios inhibidores novedosos los cuales previenen la adhesión de las plaquetas son los anticuerpos monoclonales dirigidos al vWF. También se ha sugerido que los inhibidores de la glicoproteina Ilb/IIA pueden ser benéficos en la inhibición de la adhesión de las plaquetas. Algunos de estos inhibidores como el Ab c7E3 monoclonal se han probado ya clínicamente mientras que otros como los inhibidores de KGD y RGDF están todavia bajo estudio. Sin embargo, la especificidad de la mayoría de estos inhibidores nuevos no está muy bien estudiada, de esta forma el espectro de los efectos laterales que serán inducidos al usar los inhibidores está todavia abierto y requiere examinación cuidadosa. Una fuente rica para la investigación (screening) de compuestos nuevos que interfieren con la adhesión de plaquetas inducida por colágeno se da en la naturaleza a través de los animales que succionan la sangre. Se han aislado varios inhibidores a partir de la naturaleza como se describe en la literatura: Una proteina de 65 kD llamada Calina aislada a partir de Hirudo medicinalis (Patente de los Estados Unidos 5,587,360, WO 92/07005) (Munro, R., et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184) y
XX .-.--)..•---»áj una proteina de 16 kD (LAPP) aislada a partir de las glándulas salivales de la sanguijuela Haementeria officinalis (Patente de los Estados Unidos 5,324,715). Se han descrito ambas proteinas como inhibidores de agregación como se prueban por ensayos estáticos de agregación de plaquetas dependiente de colágeno. A pesar de probar la actividad in vitro la LAPP falla para actuar en varios modelos in vivo bien establecidos (Schaffer L.W. et al.; Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 1593-1601) y Connolly T.M. et al.; Thromb.
Haemostas., 1993, 69, 589). La garrapata suave, Orni thodoros mouba ta , también contiene una proteina antiplaquetas
(Moubatina) la cual es activa en prevenir la agregación de plaquetas estimulada por el colágeno (Waxman, L. et al.; J. Biol. Chem., 1993, 268, 5445-49). Otro inhibidor de la agregación de plaquetas a partir de un bicho de succión de sangre está descrito en WO 9309137 por Noeske-Jungblut C. et al.. Smith et al., ha aislado una proteina de 50 kDa a partir de veneno de vibora y una proteina de 19 kDa se aisla a partir de la saliva de Tria toma pallidipenni s, un bicho que succiona sangre. Se descubrió que la proteina contiene un factor que inhibe específicamente la agregación de plaquetas inducida por el colágeno. La proteina de 19 kDa nombrada pallidipina inhibe la agregación mediada por el colágeno de las plaquetas en el plasma. No se detecta la inhibición de la agregación estimulada por otros efectores (ADP, trombina, tromboxano A2 mimético U46619, éster forbol) . La pallidipina no tiene efecto en la adhesión de plaquetas al colágeno pero inhibe la liberación de ATP a partir de las plaquetas. Esta interactúa reversiblemente con las plaquetas y puede compartir con el colágeno un objetivo común con las mismas. El mecanismo preciso de acción y el beneficio terapéutico de esta proteina está bajo investigación. Gan et al., describe la equistatina como un inhibidor que se enlaza al receptor de fibrinógeno GP Ila/IIIb (J. Biol.. Chem. 1988, 263, 19827-32). A pesar de estos desarrollos excitantes, continúa existiendo la necesidad para suministrar anticoagulantes y antitrombina adicionales que tengan eficacia incrementada en la inhibición de la formación del coágulo, la activación de las plaquetas inducida por el vWF o la activación celular endotelial y que puedan ser usados farmacéuticamente y producidos en cantidades comercialmente factibles. Ya que ninguna de las proteinas conocidas descritas a la fecha ha desarrollado un compuesto con el perfil terapéutico ideal los inventores de la presente invención deciden ir adelante con una nueva estrategia de investigación con el fin de detectar más proteinas relevantes . Descripción de la Invención En esta invención se describe un inhibidor aislado a partir de H. Medicinalis, el cual actúa directamente en la 5 interacción del colágeno-plaqueta inhibiendo de esta forma la activación de la plaqueta y la interacción plaqueta- plaqueta temprana. Hasta ahora, no hay un ejemplo positivo en la literatura, el cual indique que por usar un procedimiento de
10 investigación que puede excluir los inhibidores de agregación asi como también las proteinas liticas a partir de una fuente de compuestos que se presentan en forma natural uno pueda identificar nuevos mecanismos o compuestos antiadhesivos. Sin embargo, esta estrategia se usa en esta
15 invención. Ya que las últimas seis diferentes glicoproteinas superficiales de plaquetas son conocidas por estar implicadas en la adhesión de colágeno y además varios compuestos derivados de plaquetas tales como el factor von Willebrand, la fibronectina y la trombospondina han mostrado
20 estar implicados como mediadores indirectos de la adhesión de colágeno-plaqueta, hay poco optimismo en el inicio de identificar nuevos inhibidores de adhesión. Sin embargo, se usa este procedimiento para investigar la saliva de Hirudo medicinali s sabiendo que no
-^as- te-¿í--g-^-i-t-----. -s-3^ todos los inhibidores relacionados documentados o vWF no conocidos asi como también los compuestos que actúan directamente en los receptores de plaquetas pueden ser excluidos. De esta forma el resultado de la investigación es una sorpresa: una nueva proteina llamada Saratina con actividad anti-adhesiva para las plaquetas que puede ser aislada a partir de tejidos y secreciones de la sanguijuela bien investigada de la especie Hirudo medi cinalis . La presente invención comprende el polipéptido activo Saratina aislado a partir de la sanguijuela Hirudo medi cinali s . Se aisla la proteina a partir de la saliva por una combinación de diálisis presurizada y por lo menos una etapa cromatográfica similar a la cromatografia de intercambio aniónica y por lo menos una etapa de cromatografia liquida de alta resolución de fase inversa
(RP-HPLC) . La etapa de diálisis presurizada resulta ser absolutamente critica durante la recuperación de la
Saratina a partir de la saliva, ya que la concentración fuerte de saliva ayuda a solucionar la de otra forma pérdida tremenda de Saratina bioactiva. La Saratina aislada se enlaza fuertemente a varios colágenos y bloquea la adhesión de las plaquetas al colágeno que recubre tales superficies en una forma dependiente a dosis. Con el fin de optimizar la investigación se han desarrollado técnicas actualmente disponibles en cascada para distinguir la adhesión de plaquetas y la agregación de plaquetas: la capacidad de las plaquetas para retardar o detener el flujo a través de las fibras, la contribución de las plaquetas para formación de coágulos in vitro, los laboratorios de adhesión de perlas de vidrio, o flujos de sangre entera a través del filtro y la adhesión de plaquetas de plasma rico en plaquetas anticoaguladas a filtros compuestos de fibras de vidrio o colágeno bajo un gradiente de presión regulado. La proteina (nombrada Saratina) se caracteriza por las secuencias de aminoácidos representadas en la secuencia (SEQ. ID. NO. 2) y está constituida a partir de 103 aminoácidos, los cuales forman un peso molecular relativo teórico de aproximadamente 12068 daltones + 1 kDa. La proteina exhibe una estructura primaria única sin similitud significativa a otras secuencias previamente descritas. La proteina es rica en ácido aspártico y ácido glutámico, lo cual contribuye al bajo punto isoeléctrico de pH 3.7 + 0.5 de la molécula como se mide por IEF-PAGE. El análisis SDS-PAGE demuestra un cambio fuerte en la movilidad ante la reducción de la proteina antes de la electroforesis, indicando modificaciones post traducción. Al secuenciar el polipéptido se han revelado seis moléculas de cisteina que pueden formar las modificaciones post traducción de la proteina. La espectrometría de masa de electroaspersión de la Saratina revela un peso molecular real de 12061 indicando que hasta tres enlaces disulfuro están implicados en la formación de la estructura secundaria de la forma nativa de la proteina. El inhibidor de adhesión de acuerdo con la presente invención es nuevo ya que difiere de los inhibidores de agregación conocidos aislados a partir de sanguijuelas especialmente a partir de Calina o LAPP en el peso molecular, punto isoeléctrico y secuencia de aminoácidos y actividades biológicas. La presente invención proporciona también ADN aislado que comprende un polinucleótido que codifica el inhibidor de adhesión de plaquetas derivado de la sanguijuela que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra para la proteina. La secuencia de nucleótidos que representa el clon de ADNc se muestra en la SEQ. ID. NO. 1. La posición 1-63 de la secuencia de nucleótidos representa una secuencia lider de 21 aminoácidos putativa y la posición 64-372 contiene una estructura de lectura abierta que codifica un polipéptido de 103 residuos de aminoácidos y una secuencia de aminoácidos como se muestra para la proteína madura en la SEQ ID. NO. 2.
La presente invención también se relaciona con los vectores recombinantes los cuales incluyen el gen sintético que codifica el inhibidor de adhesión de plaquetas derivado de la sanguijuela de la presente invención, y una célula 5 huésped que contiene los vectores recombinantes. Los métodos para recuperar y aislar las proteinas expresadas se han basado en las tecnologías de etiqueta o se han adaptado a partir del esquema de purificación desarrollado para la Saratina que se encuentra en forma natural. Dependiendo de
10 los protocolos individuales usados para la expresión extracelular o intracelular en las células de levadura, células de insectos, células de riñon de hámster bebé, y las células E. coli transformadas con los vectores apropiados las etapas para recuperar la proteina recombinante a partir
15 del sobrenadante o sedimentos tienen que ser adaptadas por las técnicas conocidas por el experto. Se descubre que la expresión excelente en E. coli como un huésped, donde se contribuye a la expresión periplasmática por inserción de una secuencia lider de pelB. Se logra la recuperación de los
20 productos a partir de Escheri chia coli (E. coli) (alrededor de 5 mg/l) después de la osmólisis y la centrifugación. Se usa Saccharomyces cerevi siae (S. cerevisiae) (>10 mg/l caldo de cultivo) con el vector adoptado de levaduras alternativo en un experimento paralelo. Se aisla el material secretado
&?Á. íMtt.
por centrifugación. Se logra la purificación por filtración de flujo cruzado y cromatografía de intercambio de iones. En otros procedimientos de expresión que usan tanto células COS o células CHO la expresión del producto es alrededor de 750 ng/ml. El material recombinante purificado prueba ser puro y homogéneo por análisis electroforético y cromatográfico e idéntico a la Saratina derivada de saliva como se demuestra por la secuenciación de aminoácidos y determinación de la masa molecular. La invención también comprende los métodos para purificar la prote na activa a partir de la saliva sin purificar de la sanguijuela y medir su actividad contra las plaquetas por métodos de ensayo estáticos y dinámicos así como también el uso de este método para aislar la proteína recombinante. Las técnicas para la producción de la Saratina, incluyen los Ejemplos 6, 7, 8 y 13 sin embargo los métodos de expresión a ser usados no están restringidos a estos ejemplos. Por ejemplo los ratones transgénicos, u otros organismos, que incluyen otros mamíferos, pueden también ser usados para expresar la Saratina. Las proteínas de la presente invención incluyen las variantes, las cuales conservan la actividad de las secuencias descritas, incluyendo los fragmentos o subunidades, variantes que se encuentran en forma natural, variantes alélicas, mutantes artificiales generados al azar y variaciones de la secuencia intencional tales como agregar lo que conserva la actividad. Los fragmentos o las subunidades se refieren a cualquier porción de la secuencia la cual contiene menos aminoácidos que la proteína completa, por ejemplo secuencias parciales que excluyen las porciones de las terminaciones N y/o C de la proteina completa. La invención además cubre las proteínas híbridas, tales como las proteínas de fusión o las proteinas que resultan de la expresión de genes múltiples dentro del vector de expresión, y pueden incluir un polipéptido que tiene la actividad específica de una proteína descrita enlazada por los enlaces peptidicos a un segundo polipéptido. Están incluidas notablemente otras variantes de las proteínas de la presente invención, especialmente cualesquiera variantes que difieren de la proteína aislada solamente por la substitución de aminoácidos conservativa. Tales substituciones de aminoácidos conservativa están definidas en Taylor et al., J. Mol. Biol., 1986, 188, 233. También están incluidos los métodos para usar las proteinas para prevenir o retrasar la activación de las plaquetas por la inhibición de las interacciones de colágeno-plaquetas. La proteina es útil en la prevención,
I ! profilaxis, terapia y tratamiento de las enfermedades trombóticas. Distinta a todas las proteínas descritas previamente, las cuales actúan en varias proteínas de superficie en las plaquetas, la proteina de esta invención tiene un mecanismo único de acción. Se enlaza fuertemente a la superficie del colágeno y se da un mecanismo de acción por el cubrimiento de lados de colágeno específicos no más disponibles para interacciones y enlace de las plaquetas. Este tipo de mecanismo nuevo tiene la gran ventaja, que las plaquetas están funcionalmente intactas durante la aplicación de la proteína, de tal forma que muy poca no incluso ninguna tendencia de sangrado se espera a partir de este tratamiento. Otra área importante de uso es el tratamiento de varias superficies con la proteina para llevarlas a ser no adhesivas a las plaquetas y por lo mismo crear dispositivos compatibles con la sangre. Como se indica anteriormente, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son adecuados como compuestos farmacéuticamente efectivos en las composiciones y combinaciones farmacéuticas. Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden comprender opcionalmente ingredientes activos adicionales como la Aspirina, anticoagulantes tales como hirudina o heparina o agentes trombolíticos tales como el activador de plasminógeno o estreptoquinasa. El polipéptido novedoso de acuerdo con la invención puede formar sales farmacéuticamente aceptables con cualquier ácido no tóxico, orgánico o inorgánico. Los ácidos inorgánicos son, por ejemplo, el ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico o fosfórico y las sales de metal ácido tales como ortofosfato de monohidrógeno de sodio y sulfato de hidrógeno de potasio. Los ejemplos para los ácidos orgánicos son los ácidos mono, di y tricarboxílicos tales como el ácido acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succinico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzoico, hidroxibenzoico, fenilacético, cinámico, salicílico y sulfónico tales como el ácido metansulfónico. Las sales de la porción aminoácido terminal carboxi incluyen las sales de ácido carboxilico no tóxicas formadas con cualesquiera bases inorgánicas u orgánicas. Estas sales incluyen, por ejemplo, los metales alcalinos tales como el sodio y el potasio, los metales alcalino térreos tales como el calcio y el magnesio, metales ligeros del Grupo IIIA que incluyen aluminio y aminas primarias, secundarias y terciarias orgánicas tales como las trialquilaminas, que incluyen trietilamina, procaina, dibencilamina, 1-etenamina, N,N' -dibenciletilen-
L? diamina, dihidroabietilamina y N-alquilpiperidina. Como se usa en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un agente de relleno sólido o liquido inerte, no tóxico, diluyente o material 5 encapsulante, que no reaccione adversamente con el compuesto activo o con el paciente. Los portadores adecuados, preferentemente líquidos son bien conocidos en la técnica tales como agua estéril, solución salina, dextrosa acuosa, soluciones de azúcar, etanol, glicoles y aceites, incluyendo
10 aquellos de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de frijol de soya y aceite mineral. Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden ser administradas como dosis de unidad que contienen
15 portadores, diluyentes, adyuvantes y vehiculos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales los cuales son típicos para administración parental. El término "parenteral" incluye en la presente técnicas de inyección e infusión subcutánea, intravenosa,
20 intra-articular e intratraqueal. También son adecuadas otras administraciones tales como la administración oral y la aplicación tópica. Las composiciones y las combinaciones parenterales son más preferentemente administradas intravenosamente tanto en una forma de bolo o como una
fusión constante de acuerdo con los procedimientos conocidos . Las tabletas y las cápsulas para la administración oral contienen los excipientes convencionales tales como los agentes de enlace, agentes de relleno, diluyentes, agentes de tableteado, lubricantes, desintegrantes y agentes de humectación. Las tabletas pueden ser recubiertas de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones liquidas orales pueden estar en la forma de suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden ser presentadas como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales como agentes de suspensión, agentes emulsificantes, vehículos no acuosos y conservadores . Las aplicaciones tópicas pueden estar en la forma de suspensiones acuosas o aceitosas, soluciones, emulsiones, gelatinas o preferentemente ungüentos de emulsión. Las dosis de unidad de acuerdo con la invención pueden contener cantidades requeridas diariamente de la proteína de acuerdo con la invención, o submúltiplos de la misma para formar la dosis deseada. La dosis terapéuticamente aceptable óptima y la proporción de dosis para un .paciente dado (mamíferos, incluyendo humanos) depende de una variedad de factores, tales como la actividad del material activo específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, sexo, dieta, tiempo y ruta de administración, proporción de resolución, el objeto del tratamiento, es decir, la terapia o profilaxis y la naturaleza de la enfermedad trombótica a ser tratada, actividad antiplaquetas o anticoagulante. Por lo tanto, en las composiciones y combinaciones útiles como antitrombóticos en un paciente tratado (in vivo) , una dosis farmacéutica efectiva diaria de los péptidos de esta invención está entre aproximadamente 0.01 y 100 mg/kg de peso corporal, preferentemente entre 0.1 y 10 mg/kg de peso corporal. De acuerdo con la forma de aplicación una dosis simple puede contener entre 0.5 y 10 mg del inhibidor de trombina. Para lograr un efecto anticoagulante en la sangre extracorpórea una cantidad farmacéuticamente efectiva de los péptidos inventivos está entre 0.2 y 150 mg/l, preferentemente entre 1 mg y 20 mg/l de sangre extracorpórea. Es también un objeto de esta invención proporcionar un dispositivo médico implantable o extracorpóreo para uso en contacto con los fluidos corporales con el fin de llevar la superficie del dispositivo a ser substancialmente tromborresistente, recubierta con un polipéptido inmovilizado como se define anteriormente y en las reivindicaciones. El polipéptido de acuerdo con la invención se inmoviliza en un dispositivo médico para llevar la superficie a ser biocompatible y tromborresistente. Tales dispositivos algunas veces tienen propiedades superficiales, las cuales inducen típicamente a la agregación de plaquetas, lo cual es una desventaja en sus usos propuestos en dispositivos implantables y extracorpóreos en contacto con la sangre u otros fluidos corporales. Los ejemplos para tales dispositivos que son comúnmente hechos a partir de los materiales plásticos y fibras sintéticas son las prótesis, órganos artificiales, lentes oculares, suturas, segmentos vasculares artificiales, catéteres, aparatos de diálisis, tubos y vasos que portan la sangre . La opacificación de cápsula posterior (OCP) es una complicación común después de la extracción con catéter, a pesar de las técnicas quirúrgicas modernas y las lentes, las cuales son usadas para este procedimiento. La OCP es provocada por la proliferación y migración de las células epiteliales de las lentes entre la cápsula posterior reduciendo de esta forma la agudeza visual. Los tratamientos físicos así como también las lentes modificadas químicamente se han propuesto para reducir la formación de la OCP. Se han usado las lentes de heparina que recubren o las gotas de ojos de heparina tópica para reducir la OPC, lo cual indica que están implicados los mecanismos trombogénicos en la formación de la OCP. Se ha mostrado que la Saratina tiene ventajas significativas sobre la heparina en prevenir y bloquear la trombogenicidad. Es por lo tanto otra característica de esta invención proporcionar un recubrimiento que comprende la Saratina, el cual reduce la trombogenicidad del material de la lente usado para implantes oculares de cámara anterior o posterior refractiva, los cuales pueden ser implantados quirúrgicamente en el ojo. Este tipo nuevo de recubrimiento evita los problemas provocados por el crecimiento celular estimulado. En combinación con otros medicamentos los cuales son por ejemplo conferir la muerte celular, el recubrimiento de Saratina ayuda a solucionar completamente la opacificación de la cápsula posterior. Breve descripción de las figuras Se explican los detalles de las Figuras en los ejemplos 1 a 10. Figura 1 La separación de los componentes de la saliva. Se marca la elusión de la Saratina por * a) muestra el perfil de separación de la saliva después del intercambio de aniones DEAE. Se han recolectado las fracciones de la Saratina a partir del pico 3 (Ejemplo 2) . b) Muestra la re-cromatografía de las fracciones agrupadas en Mono Q HR5/5. Se han recolectado las muestras a partir de la última parte del pico principal como se indica por la barra (Ejemplo 2) . c) Muestra la última etapa de cromatografía en
RP-HPLC analítica semi-preparativa de las fracciones positivas de Saratina recolectadas a partir de Mono Q HR5/5 (ejemplo 2) . Se recupera la Saratina activa a partir del pico principal (pico 3) . Figura 2 SDS-PAGE de las fracciones recolectadas a partir de la RP-HPLC. Se marcan las fracciones positivas de Saratina con * (Ejemplos 2 y 3) . Figura 3 El vector de expresión de E. coli para la Saratina
(Ejemplo 7) . Figura 4 Plásmido donador del báculo para la Saratina (Ejemplo 8) .
Figura 5 Se ha expuesto la sangre entera a una superficie de colágeno artificial y se ha visualizado la adhesión de las plaquetas por tinción. Se ha usado la Saratina cono un inhibidor (Proteína #607) Ejarpio 9. Porción de esfuerzo cortante: 1300 s-1 Sangre humana Colágeno del tipo III de placenta humana 30 µl/c?breobjetos Figura 6 La inhibición de la adhesión de plaquetas en el cubreobjetos recubierto con colágeno tipo III en condiciones shere. Comparación de la saliva y la Saratina. Ejemplo 9, Colágeno tipo III a partir de placenta humana Saliva # 6160.11 mg/ml: 30µl en cubreobjetos n=4 Proteína # 6070.11 mg/ l: 30µl en cubreobjetos n=2 Figura 7 Investigación de inhibidores de adhesión La Saratina exhibe inhibición dependiente a dosis de adhesión de enlace de plaquetas al colágeno tipo III recubierto en cubre cubreobjetos en condiciones shere. Ejemplo 9 Proteína # 607 Colágeno tipo III de planta humana Figura 8 Vector de expresión de levadura para la Saratina (Ejemplo 13) Descripción detal lada de la Invención
Ejarpio 1 La adhesión de plaquetas al colágeno ha sido el antecedente funcional para investigar los carrponentes de la saliva. Además cuatro pruebas adicionales disponibles para la evaluación de las varias acciones de los fármacos antitrombóticos tales como el ensayo AZOCOLL, ensayo de la actividad de la a idasa, ensayo de enlace dependiente a vWillebrand y el ensayo de agregación de plaquetas se han usado para excluir las propiedades funcionales las cuales idealmente no pueden estar enlazadas a un inhibidor de adhesión. Mientras que la mayoría de estos ensayos usados en la presente son ensayos estándar, el ensayo de adhesión de plaquetas no se ha modificado para adecuarse a las necesidades especificas de la presente. En breve: Se ha recubierto el colágeno de Horm (Nycomed) en placas de 96 pozos (Nunc) al usar el colágeno acidificado en una concentración de 20 µg/ml e incubando las placas durante la noche. Después de lavar las placas tres veces con PBS no se ha bloqueado la superficie residual de los pozos con BSA al 1%. Las plaquetas aisladas recientemente a partir de sangre citronilada humana se han agregado simultáneamente con fracciones derivadas de las etapas de la columna individual. Cuando se ha realizado la pre-activación requerida de las plaquetas al incubar las plaquetas antes de usar en TBS en la presencia de iones de magnesia bivalentes. La saliva sin purificar, estandarizada a una concentración de proteína total de 200 µg/ml, se ha usado como un estándar para comparar la actividad inhibitoria. El ensayo de inhibición de plaquetas ha resultado ser altamente susceptible a los cambios de amortiguador y concentraciones de sal elevadas. Ya que todas las muestras se han procesado por cromatografia de intercambio de iones la prueba directa de las fracciones en el ensayo de inhibición resulta ser complicado y no confiable. Por lo tanto todas las muestras a ser probadas han sido aplicadas a una etapa de concentración a base de Centricon la cual simultáneamente reduce la concentración iónica y soporta la concentración antes de la medición. Ejemplo Purificación de un inhibidor natural La invención usa saliva recolectada a partir de H. Medicmali s , la cual es conocida por contener un número de proteínas bioactivas tales como hirudina, inhibidores de elastasa, colagenasas e inhibidores de agregación de plaquetas tales como calin (Munro, R. et al.; Blood
Coagulation and Fibrinolysis, 1991, 2, 179-184) y LAPP
(Schaffer, L.W. et al.; Arterioscler. Thromb., 1993, 13,
1593-1601) . Además de las proteínas caracterizadas, la mayoría de las aproximadamente ochenta proteínas detectables por SDS-PAGE son todavía desconocidas. En la presente invención se usa la saliva fraccionada y la estrategia de investigación como se describe en el Ejemplo 1 con el fin de investigar las proteínas novedosas que interfieren directamente con la interacción del colágeno de plaquetas . La separación de la actividad del inhibidor de adhesión a partir de la saliva sin purificar resulta ser una tarea critica, principalmente debido a la pérdida irreversible de la mayoría de la actividad inhibitoria de adhesión en la primera etapa cromatográfica. Los aditivos tales como el etanol al 12% y los cationes divalentes como se recomienda por Munro, R. et al no mejoran la situación. Sin embargo, la concentración alta de sal de la saliva en combinación con la baja concentración de proteína total
(190-250 µg/ml) solicita una concentración inicial o etapa de intercambio de amortiguador. De esta forma se exploran varias estrategias para enriquecimiento, concentración o intercambio de amortiguador. La diálisis tradicional lleva a la pérdida completa de actividad. La mayoría de las otras técnicas estándar tales como intercambiadores de iones, columnas de afinidad, exclusión de tamaño (la pérdida es irrespectiva de la resina de la columna) falla independientemente de la naturaleza de la tecnología de separación o amortiguador y aditivos usados. Sorprendentemente esto resulta, en que la diálisis presurizada de 500 ml de saliva es un método exitoso para concentrar las proteinas de la saliva (aproximadamente 30-40 veces) y simultáneamente dar curso a los componentes de amortiguadores no deseados. Inesperadamente el material sin purificar de saliva procesado en esta forma es un material de partida ideal para purificación adicional y la recuperación de bioactividad de los componentes antiadhesivos de la saliva no es más un problema real. Ya que los intercambiadores de cationes o las columnas de afinidad resultan ser una etapa insuficiente en la purificación, se usa el intercambiador de aniones débiles tales como el DEAE-Fastflow o EMD-DEAE-Fractogel . Se han probado etanol al 12% y los cationes divalentes, sin embargo los resultados son similares con o sin estos aditivos. Además la optimización de las etapas cromatográficas lleva a una secuencia de la columna DEAE, Mono Q-column y como una etapa final una columna RP18 de fase inversa. La optimización de las condiciones cromatográficas se ha realizado en un sistema cromatográfico BiaCore usando las columnas analíticas disponibles a partir de Pharmacia. Los gradientes usados para operar la columna DEAE, Mono Q-column y las columnas RP18 se dan en las Figuras la, b, c. La separación a base de BiaCore se ha escalado al usar las técnicas FPLC. Las condiciones de corrida optimizadas se han convertido directamente en una escala semipreparativa de separación al seguir la instrucción del fabricante con la excepción de la etapa de la columna RP18, la cual se mantiene con la técnica BiaCore con el fin de minimizar la pérdida del material purificado. La recuperación de la proteína purificada a partir de la última etapa cromatágrafica RP se hace por centrifugación de vacío de velocidad. Las muestras recolectadas a partir de la etapa RP se han recolectado y analizado por SDS-PAGE (Figura 2) . Se han resuspendido subsecuentemente las muestras en PBS y se usan para realizar las pruebas analíticas asi como las funcionales. Tipicamente se recupera un rendimiento de aproximadamente 750 µg/1 de Saratina a partir de la saliva no procesada. Ejemplo 3 Caracterización bioquímica La purificación de la Saratina como se describe en el E emplo 1 lleva a una proteína esencialmente pura con un peso molecular aparente de alrededor de 21 kDa mostrado bajo condiciones reductoras en SDS-PAGE (Figura 2) . Se obtiene la secuencia de aminoácidos completa por secuenciación directa de los primeros 48 aminoácidos de la proteína purificada y se completa por la secuenciación de varios péptidos internos generados vía la degradación enzimática. Se describe la secuencia de la proteína completa en la SEQ ID. NO. 2. La proteína está compuesta de 103 aminoácidos con un peso molecular calculado de 12067.9 y un peso molecular real de 12061.9 como se deduce por la espectrometría de masa ESI. Estas diferencias en el peso molecular teórico y el medido indica que todas las seis cisteínas identificadas en la Saratina están implicadas en la formación de los puentes S-S. Este descubrimiento está soportado por la observación de un cambio fuerte en la movilidad de la proteína cuando se lleva a cromatografía en SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras. Adicionalmente la proteina es rica en ácidos ácidos tal como Glu y Asp. La técnica de enfoque isoeléctrico usando IEF-PAGE (Immobiline) revela un punto isoeléctrico de pH 3.7 + 0.5. En un estudio comparativo se usa en la presente la proteína de la sanguijuela purificada como una referencia y se compara con las propiedades fisicoquímicas de la Saratina recombinante derivada del báculo, levadura y expresión de E. coli. Todas las tres proteínas resultan a su vez idénticas en sus propiedades. La caracterización de la proteina por SDS-PAGE visualizada por tinción de Coomassie (Figura 2) o tinción con plata y/o análisis de manchado Western revela, que la proteina es homogénea y está en una forma no glicosilada. Ejemplo 4 Preparación del ARNm y síntesis del ADNc Se prepara el ARN a partir de la sanguijuela medicinal, Hirudo medicinalis; usando el método de tiocionato de guanidina. Se purifica el ARNm a partir del ARN total usando el "equipo de ARNm Oligotex" (QIAGEN) . Se sintetiza el ADNc usando el "equipo de amplificación del ADNc maratón" (CLONTECH) . La secuencia de ADN que codifica 5 la Saratina está amplificada inicialmente usando los cebadores de oligonucleótido de PCR de acuerdo con la instrucción del proveedor. Después de la sintesis del ADNc, se liga un adaptador universal a ambos extremos del ADNc. Se eligen las secuencias del adaptador universal y los
10 cebadores universales API o AP2 de acuerdo con las instrucciones del proveedor del equipo. Ejemplo 5 Amplificación y aislamiento del gen de la Saratina por PCR 15 Se han sintetizado los cebadores degenerados con base en la terminación N inmediata de la secuencia de aminoácidos de la Saratina traducida en forma inversa. Se han diseñado estos cebadores 01 y cebador 02 para hibridizar específicamente al extremo 5' del ADNc de la Saratina. El
20 diseño del cebador se basa en la secuencia de aminoácidos traducida inversa de los ocho aminoácidos N terminales experimentalmente determinados de la proteína Saratina purificada. Se sintetizan los dos cebadores el cebador 01 y el cebador 02 para mantener la degeneración tan baja como
sea posible y para dar los cebadores en el extremo 3' crítico un alargamiento de 8 pares de base de acoplación perfecta con la secuencia de ADNc de la Saratina con el fin de asegurar la amplificación eficiente y específica del ADNc 5 templado. De acuerdo conl alfabeto degenerado del ADN (código IUPAC) R=A o G; M=A o C; Y=C o T; y N=A o G o C o T. Se lleva a cabo la reacción de la PCR 3 '-RACE usando una mezcla del cebador 01 y el cebador 02 y un cebador universal API o AP2. se clonan los productos de la PCR en el vector de
10 clonación TA pCR2.1 o el vector pCR Script SK(+) y se secuencia. Después de que se obtienen varias secuencias de los fragmentos de la PCR 3 '-RACE, se obtiene la secuencia del gen de Saratina, con la excepción de la región 5' no traducida, la secuencia de péptido señal y la codificación
15 de secuencia para los primeros 8 aminoácidos a partir de la terminación N de la proteina madura. Con el fin de obtener esta información de secuencia de ADNc de Saratina faltante, se realiza un experimento 5 '-RACE usando un cebador específico del gen a partir del medio del ADNc de la
20 Saratina y uno de los cebadores API o AP2 universales. Después de la secuenciación varios de los fragmentos de RCP 5 '-RACE resultantes, se obtiene la secuencia del gen de Saratina completo. Al amplificar el gen de la Saratina por RCP usando los cebadores no degenerados, específicos de
^•««riift^ ? ^ genes a partir de tanto el extremo 3' y el extremo 5' del gen de la Saratina, se obtiene una longitud completa del gen de la Saratina. Se realiza la secuenciación del ADN con más de 15 clones de la PCR diferentes. Sin embargo se encuentra solamente un cambio significativo el cual provoca el cambio de secuencia de aminoácidos en solamente un clon. Es probable que este cambio sea provocado por la PCR. Se encuentran otros cinco cambios silenciosos, los cuales no provocan el cambio de la secuencia de aminoácidos. De esta forma es improbable que estos cambios sean provocados por la PCR, ya que se encuentran algunos cambios en diferentes clones . El gen de la Saratina ORF tiene 372 pb y contiene una secuencia de señal de 21 aminoácidos y una secuencia de 103 aminoácidos que codifica la proteína madura. Se encuentra que la secuencia de aminoácidos deducida a partir del clon de la PCR es idéntica a la secuencia obtenida por secuenciación de la proteína derivada de la saliva natural. Ejemplo 6 Expresión en las células COS y la detección de la proteína expresada Con el fin de expresar el gen de la Saratina en las células mamíferas tales como COS o CHO, se corta el gen de la Saratina a partir del vector pCR Script SK(+) usando Xhol + Xbal y se clona en un vector de expresión de una célula mamífera pCl-neo (Promega) . Se elige el pCl-neo ya que contiene el promotor T7 y T3 para expresión in vitro y el gen resistente a la neomicina para la selección G418, y puede ser usado en tanto las células COS y CHO. Además a la secuencia de señal y la secuencia de la proteina madura, el inserto contiene una secuencia Koz en el extremo 5' para traducción eficiente y el his-tag MRGS(H)6 en el extremo 3' (Terminal C) para detección de la expresión de proteínas, purificación y concentración. La construcción de plásmido es nombrada pNC-31. Se usa el ADN de plásmido pNC-31 para la transfección de las células COS. Las células COS que crecen en la fase log son lavadas dos veces con PBS y se disuelven en PBS en una concentración de lxl07/ml. Después se agrega 12 µg de ADN de plásmido (menos que 50 µl en H20 o amortiguador TE) en 0.7-0.8 ml de suspensión de células COS y se mezcla en una cuba de electroporación. Se realiza la electroporación en 1.9 kv, 25 µFD por 10 minutos y se transfiere a una placa de 90 mm. Después de agregar 8 ml de medio DMEM que contiene FCS al 10% y antibióticos las células crecen por tres días. Se han usado los sobrenadantes y las células para aislamiento adicional de la proteína y detección. Se detecta la proteína expresada por el método de manchado western usando el anticuerpo anti-MRGS (H) 6. se realiza la purificación usando quelantes tales como NTA o ácido acético imido inmovilizado en una matriz de columna y se modifica con iones metálicos tales como Co, Ni o Cu. Ejemplo 7 Construcción del vector de expresión de E.coli y expresión Debido al uso del codón variable en diferentes sistemas biológicos, algunos codones son usados muy raramente en E. coli. Con el fin de permitir la expresión se ha convertido una versión optimizada del gen de E. coli al codón de E. coli de acuerdo con los procedimientos estándar. Se realiza la expresión en E. coli usando una versión modificada del plásmido pASK75, el cual porta la región promotora tet. (Skerra, A., et al. Gene, 1994, 151, 131-135). En breve: Se hace la modificación por clonación de un nuevo enlazador entre los sitios Xbal y Hind III (Figura 3) . El nuevo enlazador contiene la secuencia lider ompA, otro sitio de clonación múltiple y 6xHis-tag en lugar de strep-tag. Para construir el vector de expresión para la Saratina es necesario introducir los sitios de restricción 5'Cla I y 3'Eco47lII por el método de PCR.
l ,_ $& _ , »- ^ , ... ^ * + ^m^sS ^esx Por lo tanto se ha usado el 5' cebador 03 y el 3 'cebador 04. Se clona primero el producto de la PCR en el sistema del vector PCR II (Invitrogen) y se secuencia. En una segunda etapa se clona el gen de Saratina en el vector pASK75 modificado usando los sitios de restricción 5'ClaI y 3'HindIII. Después de expresar y probar la actividad de esta Saratina recombinante en una segunda reacción de la PCR se elimina el His-tag y el codón de inicio del gen de Saratina se fusiona directamente a la secuencia lider omp A. el 5'cebador05 y el 3 'cebador 06 para esta reacción de RCP se dan en el listado de secuencia. Como un ejemplo para la expresión en E. coli el vector de expresión pRG72 (Figura 3) , el cual contiene el gen estructural de la Saratina fusionado a la secuencia lider omp A, se transforma en las células competentes W3110. Se han inducido las células después de que se han hecho crecer en la fase media log. 1 hora después de esto puede ser claramente detectada la sarastatina recombinante. Ejemplo 8 Construcción del plásmido donador de Báculo y expresión Para la expresión de la Saratma en el sistema de expresión del Baculovirus se usa el sistema de expresión de baculovirus Bac-To-Bac™ a partir de Glibco Life Technologies. Para dar un sistema de selección se fusiona la secuencia líder melitina Honeybee al gen de la Saratina y para introducir los sitios de restricción 5 'BamHl y 3 'Kpnl se realiza la reacción RCP sencilla usando el 5'-cebador07 y el 3 ' -cebadorOd . Se clona el producto de la PCR correspondiente en el vector PCR II (Invitrogen) y se secuencia. Después se clona la fusión Melitina-Saratina en el vector pFastBac usando los sitios de restricción 5 'BamHl y 3 'Kpnl resultando en pTD13 (Figura 4). Se realiza la generación de los baculovirus recombinantes y la expresión de la Saratina con el sistema de expresión Bac-To-Bac. Se transforma el plásmido donador pTD13 en las células competentes DHlOBac, las cuales contienen el "bacmid" con un sitio objetivo mini-attTn7 y el plásmido auxiliador. El elemento mini-Tn7 en el plásmido donador puede transponerse al sitio objetivo mini-attTn7 en el "bacmid" en la presencia de las proteinas de transposición proporcionadas por el plásmido auxiliador. Se identifican las colonias que contienen los "bacmid" recombinantes por alteración del gen lacZ. Se prepara el ADN mini-prep de alto peso molecular a partir de los clones de E. coli seleccionados que contienen el bacmid recombinante, y se usa entonces este ADN para transfectar las células de insectos. .Se incluyen las descripciones detalladas en el manual de instrucción del equipo de expresión. Ejemplo 9 Adhesión de plaquetas a colágeno bajo condiciones de flujo (ensayo dinámico) En el ensayo de adhesión de plaquetas, se realiza una perfusión la sangre humana entera a través de una cámara de flujo paralela para examinar la actividad adhesiva de las plaquetas a un cubreobjetos cubierto con colágeno bajo flujo cortante alto (estimulando en condiciones arteriales in vivo) como se describe originalmente por Sakariassen et al
(Meth. Enz., 1988, 169, 37-70). Se roela el colágeno placental humano tipo III (Sigma) , solubilizado en 50 mmol/ml de ácido acético en cubreobjetos de vidrio limpio (18 mm x 18 mm) con un aerógrafo. Se almacenan los cubreobjetos en PBS en 4°C durante la noche. Se precalienta la sangre humana entera fresca (anticoagulada con la heparina de peso molecular bajo; 20 U/ml) en 37°C por 10 minutos antes de ser usada. Se pipetean las preparaciones de las proteínas de acuerdo con esta invención en cubrebjetos (30 µl por un cubreobjeto) y se incuban por 10 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente antes de ser insertada en la cámara de perfusión. Se permite de la perfusión la sangre a través de la cámara (en 37 °C por 5 minutos en una proporción de esfuerzo cortante de 1300 s"1) . Subsecuentemente, se retiran los cubreobjetos, se lavan en PBS y se fijan en glutaraldehido al 0.25% por 30 min., y después de esto se tiñen con May-Grünwald Giemsa. La Figura 9 muestra un ejemplo típico. Se observa un cubrimiento extensivo con las plaquetas teñidas en la superficie de control no tratada. Una superficie comparable pretratada con Saratina muestra disminuir dramáticamente (por 80%) el enlace de las plaquetas. Se cuantifica la adhesión de las plaquetas con un microscopio de luz como se muestra en la Figura 5. (amplificación x 1000) acoplado a un analizador de imagen computarizado (Leica) . Se expresan los resultados como el porcentaje de la superficie cubierta con las plaquetas y los agregados de las plaquetas. Se ha comparado de la actividad inhibitoria de la saliva con proteína purificada como se demuestra en la Figura 6. La adhesión de plaquetas en el cubrebjetos recubierto con el colágeno tipo III en una proporción de esfuerzo cortante de 1300 s-1 con saliva sin purificar
(#616) produce una inhibición de aproximadamente 48% comparado con el control. La proteína purificada (#607; Saratma) demuestra una reducción en la deposición de plaquetas de aproximadamente 81% en concentraciones de
.. - ^^i proteina estandarizadas. La inhibición inducida por la Saratina se incrementa en una forma dependiente a dosis con concentraciones superiores de proteína purificada como se demuestra en la Figura 7. Ejemplo 10 Inmunización y anticuerpos Con el primer lote de proteina natural altamente purificada disponible, se ha iniciado la inmunización de los animales enseguida. Se incrementa el inmune suero en conejos y los reactivos de título alto están disponibles para investigación adicional. El antisuero adicional llega a ser disponible cuando la secuencia de péptidos de la proteina completa está disponible y se han sintetizado tres péptidos sintéticos (secuencia de aminoácidos 83-103, 13-30, 58-69) acoplado a KLH con un procedimiento enlazador estándar y se usa para inmunización. Se han establecido tres sueros dirigidos a un segmento de péptido N terminal y dos sueros específicos para los péptidos C terminales. Con los inmuno sueros de alto titulo disponibles ha sido posible establecer y usar la tecnología Elisa para monitorear y cuantificar la purificación de proteína purificada naturalmente así como también recombinante. De esta forma el consumo de tiempo y más aún el ensayo de inhibición de plaquetas intensivo en trabajo pueden ser reemplazados y se aplican solamente para confirmar el potencial inhibitorio de la proteína finalmente purificada . Ejemplo 11 Inmuno-ensayos para estimación de enlace de la Saratina Se ha usado el colágeno Horm ácido (Nycomed) para el recubrimiento de placas de microtítulo de 96 pozos
(Nunc) 50 µl de la solución de colágeno (20 µg/ml) para recubrir las placas durante la noche. Antes de la prueba se lavan tres veces las placas con PBS y se han incubado con una solución BSA (1%) con el fin de prevenir la adhesión no especifica, se ha agregado 50 µl de Saratina en una dilución en serie y se ha incubado por una hora. Se lavan las placas tres veces antes a la aplicación del anticuerpo anti- Saratina para detección. Después de una etapa de incubación adicional de una hora más se elimina el anticuerpo y un segundo anticuerpo marcado con biotina se ha usado para detección. Se realiza la lectura via la reacción de color catalizada por estreptavidina-POD con substratos tales como las tabletas ODB (Dako) medidos en 490 nm. Ejemplo 12 Ensayo de competición para investigar inhibidores Se ha comparado la Saratina con etiqueta recombinante (His-tag) como se describe en el Ejemplo 7 con
aB.asa-?fc-a _ j£i j . -?*t*?~uL¿ la Saratina no etiquetada nativa para enlace de colágeno. Se han preparado las placas recubiertas con colágeno Horm ácido (Nycomed) como se describe en el Ejemplo 11. Se realiza la detección con los anticuerpos anti-Saratina de conejo. Las Saratinas etiquetadas y no etiquetadas muestran propiedades de enlace idénticas. Alternativamente la versión de la Saratina no etiquetada se ha modificado por biotinilación (Pierce, equipo de biotinilación) y se compara con la Saratina no modificada. Son idénticas las propiedades de enlace al colágeno. Adicionalmente se han realizado experimentos adicionales usando la Saratina biotinilada para competencia cruzada con la Saratina no modificada, los péptidos, la Saratina derivada de la saliva, la saliva completa o anticuerpos dirigidos a la Saratina. Se ha probado el enlace de varios "competidores" del colágeno al estimar el enlace de la Saratina biotinilada usando un conjugado de estreptavidina-POD y la reacción de ODB-substrato para detección. Este ensayo que comprende la Saratma biotinilida es usado típicamente para la estimación de la concentración de la Saratina en la saliva (750 µg/1), representación en mapa de epitope de anticuerpos dirigidos a Saratina, evaluación de la Saratina bioactiva, Saratina mutada. Con el fin de explorar el potencial del bloqueo de ensayo así como también ningún bloqueo se ha usado el anticuerpo anti-Saratina originado con los péptidos de Saratina específicos. Ejemplo 13 Vector de expresión de levadura y expresión Se ha usado el sistema de expresión de multicopias pichia (Invitrogen) como un ejemplo típico para la expresión de levaduras. Se muestra en la Figura 8 la construcción del vector de expresión de levaduras. Para la generación del vector de expresión para la Saratina se ha usado el método de amplificación de PCR para generar los extremos de restricción (5'EcoR I 3 'Not I) compatible con la ligación en el vector apropiado (pPIC9K) . El siguiente 5'-cebador09 y el 3 ' -cebadorlO . Antes de transformar los esferoplastos Pichia se ha linealizado el vector de expresión con Sai I. Se han investigado las colonias para los mutantes His+ Mut+ positivos para asegurar la integración del gen de la Saratina. Las condiciones de crecimiento típicas son: 28-30°C, hasta una densidad óptica de OD2-6. Se realiza la inducción de expresión después de resuspender las células centrifugadas en medio y la adición de metanol hasta una concentración final de 0.5% y manteniendo esta condición por un periodo de tiempo prolongado, el cual típicamente puede ser 24 horas. Después de un periodo de fermentación típicos de 6 días se recupera el producto a partir del sobrenadante y se analiza por SDS-PAGE y ELISA. - -.---..-a=Mi-i,-,^^..-,----.--, ; l ~- ¿^*U»-- LISTADO DE SECUENCIA <110> Merck patent GMBH <120> Proteína para bloquear la adhesión de plaquetas <130> secuencia de la Saratina
<140> <141>
<160> 12 <170> Patentiln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 375 <212> ADN <213> Hirudo medicinalis
<220> <221> CDS <222> (64) .. (372) <400> 1 atgaagtatt tcttgatttc cttcctttgc ctcgcaagct tgctgatctc aactacttct 60 tea gaa gaa cgt gaa gat tgt tgg aeg ttt tac gcg aac aga aaa tat 10í
Glu Glu Arg Glu Asp Cys Trp Thr Phe Tyr Ala Asn Arg Lys Tyr 1 5 10 15 acá gac ttc gat aaa tet ttt aag aag tcc tet gat ctt gac gaa tgc 156 Thr Asp Phe Asp Lys Ser Phe Lys Lys Ser Ser Asp Leu Asp Glu Cys 20 25 30 aaa aaa acá tgt ttc aag aeg gag tac tgc tac ate gtt ttt gaa gac 204 Lys Lys Thr Cys Phe Lys Thr Glu Tyr Cys Tyr lie Val Phe Glu Asp 35 40 45 aeg gtc aac aag gaa tgt tac tac aat gtc gtt gat ggt gaa gag tta 252 Thr Val Asn Lys Glu Cys Tyr Tyr Asn Val Val Asp Gly Glu Glu Leu 50 55 60 gac caá gaa aaa ttt gtt gtc gac gaa aac ttc aeg gaa aat tat ttg 300 Asp Gln Glu Lys Phe Val Val Asp Glu Asn Phe Thr Glu Asn Tyr Leu 65 70 75 acá gac tgc gag ggt aaa gat gca ggt aat gcg gca ggt acá ggt gac 348 Thr Asp Cys Glu Gly Lys Asp Ala Gly Asn Ala Ala Gly Thr Gly Asp 80 85 90 95 gag tea gat gaa gtt gat gaa gat taa 375 Glu Ser Asp Glu Val Asp Glu Asp 100 <210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Hirudo medicinalis
<400> 2
at Glu Glu Arg Glu Asp Cys Trp Thr Phe Tyr Ala Asn Arg Lys Tyr Thr 1 5 10 15 Asp Phe Asp Lys Ser Phe Lys Lys Ser Ser Asp Leu Asp Glu Cys Lys 20 25 30
Lys Thr Cys Phe Lys Thr Glu Tyr Cys Tyr lie Val Phe Glu Asp Thr 35 40 45 Val Asn Lys Glu Cys Tyr Tyr Asn Val Val Asp Gly Glu Glu Leu Asp 50 55 60 Gln Glu Lys Phe Val Val Asp Glu Asn Phe Thr Glu Asn Tyr Leu Thr 65 70 75 80 Asp Cys Glu Gly Lys Asp Ala Gly Asn Ala Ala Gly Thr Gly Asp Glu 85 90 95 Ser Asp Glu Val Asp Glu Asp 100 <210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia arti ficial : cebador 01 degenerado <400> 3 gargarmgng argaytgttg gac 23 <210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia artificial: cebador 02 degenerado <400> 4 gargarmgng argaytgctg gac 23
<210> 5 <211 > 24 <212 > ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 03
<400> 5 gcatcgatgg aagaacgtga agac 24
<210> 6 <211 > 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 04 <400> 6 tagcgctttt gacgtcgtcg tea 23
<210> 7 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 05
<400> 7 gaagaatgca aggatgagga ttattg 26
<210> 8 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 06
<400> 8 aagcttctag tcttcgtcaa cttcgc 25
<210> 9
?¡* <211> 94 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 07 <400> 9 cggatccatg aaattcttag tcaacgttgc ccttgttttt atggtcgtat acatttctta 60 catctatgcg gaagaacgtg aagattgttg gact 94
<210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia arti ficial : cebador 08
<400> 10 ggtacctcac atatcttcat caac 24
<210> 11 <211 > 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial : cebador 09 <400> 11 gcatgcggcc gcctaatctt catcaacttc 30
<210> 12 <211 > 27 <212 > ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 10 <400> 12 gcatgaattc gaagaacgtg aagattg 27
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.