NO318017B1 - Ekstrakt med trombininhibitoraktivitet, polypeptid erholdt fra ekstrakten, fremgangsmater for fremstilling av henholdsvis ekstrakten og polypeptider, farmasoytiske preparater og anvendelse av polypeptidet for fremstilling av preparatene, samt anvendelse av blodigler for fremstilling av trombininhibitorer - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye trombininhibitorer og særlig trorabininhibitorer avledet fra blodiglevev og blod-iglesekresjoner, fremgangsmåter for fremstilling av inhibitorene, farmasøytiske preparater som omfatter dem, samt anvendelser av inhibitorene for fremstilling av preparatene og anvendelse av blodigler for fremstilling av inhibitorene.

Trombin katalyserer dannelsen av fibrinlevringer og inhiberer derfor koaguleringen av blod. Dessuten har trombin flere andre bioregulatorroller, slik som den direkte aktivering av blodplateaggregasjon og aktiveringen av betennelsesrespons ved å stimulere syntesen av blodplateaktiverende faktor (PAF) ved hjelp av endotelceller. Det betyr at trombin spiller en sentral rolle i tromboserelaterte sykdomstilstander, slik som f.eks. kardiovaskulær sykdom. Følgelig er det stor interesse for en stadig leting etter nye eller forbedrede henholdsvis trombininhibitorer og andre koagulanter.

Eksempler på velkjente trombininhibitorer er heparin og hirudin.

Heparin akselererer antikoagulantaktiviteten til antitrombin III. Det er utstrakt brukt til å behandle slike tilstander som venetromboembolisme, hvor trombinaktivitet er ansvarlig for utviklingen eller ekspansjonen av en trombe. Det er ikke ef-fektivt for terapi i de tilfeller hvor antitrombin III er redus-ert, f.eks. i tilfellene med trombose forbundet med nefrose eller disseminert intravaskulær koagulasjonssyndrom (DIC). Dessuten gir heparin mange uønskede bivirkninger, inkludert blødning og trom-bocytopeni.

Hirudin er et velkjent og godt karakterisert polypeptid som er kjent for å være spesifikt for trombin, og som kan isoleres fra ekstrakter fra spyttkjertelen og andre vev hos blodigler av arten Hirudo medicinalis. Hirudin og dets derivater lar seg også erholde ved rekombinante teknikker. Polypeptidet har en for-holdsvis lav molekylvekt på 7000 D og består av 65 aminosyrer. Aminosyresekvensen til hirudin ble først bestemt av Dodt et al.

(FEBS Letters, 165, 180-184, 1984). Tre hovedvarianter av hirudin (HVI, HV2, HV3) er blitt funnet i den medisinske blodigle Hirudo medicinalis og atskiller seg bare i ca. 10 % av alle aminosyre-

stillingene. Den mest merkbare forskjell er i de to første still-ingene i den N-terminale ende av molekylet: Val-Val i hirudinvariant 1 (HVI) og Ile-Thr i hirudinvariant 2 (HV2). Disse for-skjellene er av mindre betydningsfull art og påvirker verken funksjonen eller spesifisiteten til hirudin-trombininteraksjon. Hirudin er en sterk naturlig inhibitor for koagulasjon. Det har vist virkningsfullhet når det gjelder å forhindre venetrombose, vaskulær anastomoseokklusjon og trombinindusert, disseminert, intravaskulær koagulasjon, men gir imidlertid forlengede blødningstider.

Fylogenetisk er den medisinske blodigle Hirudo medicinalis et medlem av underfamilien Hirudininae i blodiglefamilien Hirudinidae (R.T. Sawyer: "Leech Biology and Behaviour", Oxford University Press, vol. 2, s. 688, 1986). En evolusjonsmessig mer avansert blodigleart er Hirudinaria manillensis, som tilhører underfamilien Hirudinariinae i den samme familie Hirudinidae. Uventet ble en beslektet, men klart helt forskjellig isoform av hirudin nylig oppdaget i Hirudinaria manillensis, som beskrevet i PCT patentsøknad WO 90/05143. Denne isoformen atskiller seg med nesten 40 % av aminosyrestillingene sammenlignet med hirudin fra Hirudo medicinalis. De to artene nevnt ovenfor, nemlig Hirudo medicinalis og Hirudinaria manillensis, tilhører blodigleordenen Arhynchobdellida ("blodigler med kjeve"). I tillegg til ordenen Arhynchobdellida er det en annen hovedorden av blodigler, dvs. Rhynchobdellida ("blodigler med snabel") (R.T. Sawyer: "Leech Biology and Behaviour", Oxford University Press, vol. 2, s. 651, 1986). Det best studerte medlem av ordenen Rhynchobdellida med hensyn til spyttproteiner er "amazonblodiglen", Haementeria ghilianii.

Det er blitt vist at denne arten inneholder en fibrino-lytisk aktivitet i den oppløselige fraksjonen fra de fremre eller bakre spyttkjertler (Budzynski et al.: Proe. Soc. Exp. Biol. Med., 168, 259-265, 1981). Haementeria ghilianii inneholder et fibrinogenolytisk enzym kalt hementin (US patentskrift nr. 4 390 630) , samt en inhibitor for blodkoagulasjonsfaktor Xa (C. Condra et al.: Thromb. Haemost., 61, 437-441, 1986).

Basert på denne oppdagelsen og senere arbeid er det blitt generelt akseptert at antitrombinlignende aktivitet er begrenset til blodigler av ordenen Arhynchobdellida, mens antitrombinlignende aktivitet for tiden menes å mangle i ordenen Rhynchobdellida.

Til tross for de ovenfor omtalte utviklinger foreligger det stadig et behov for å tilføre ytterligere henholdsvis antikoagulanter og antitrombiner i tillegg til heparin og hirudin som har forøkt virkningsfullhet ved inhiberingen av blo-dlevringsdannelse, trombinindusert blodplateaktivering eller endotelcelleaktivering, og som kan fremstilles i kommersielt passende mengder.

Oppsummering av oppfinnelsen

Overraskende er det blitt funnet at forbindelser med antitrombinlignende aktivitet kan isoleres fra vev og sekresjoner fra blodigler av ordenen Rhynchobdellida, fortrinnsvis av familien Theromyzon, og helst av arten Theromyzon tessulatum, som noen ganger kalles "fugleblodiglen" fordi denne arten har en eksepsjonelt spesialisert livsform ved at den suger blod fra nesebor hos fugler som lever ved vann.

Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å anvende blodigler av ordenen Rhynchobdellida, fortrinnsvis arten Theromyzon tessulatum, til fremstilling av trombininhibitorforbindelser.

Det er blitt funnet at trombininhibitoraktivitet kan måles i ekstrakter som omfatter vannoppløselige bestanddeler fra disse blodiglene. Det er derfor et formål ved denne oppfinnelsen å fremstille en ekstrakt med trombininhibitoraktivitet fra vev eller sekresjoner fra blodigler av ordenen Rhynchobdellida eller familien Theromyzon, eller arten Theromyzon tessulatum, som inneholder vannoppløselige bestanddeler derav.

En aktiv trombininhibitor vil kunne isoleres fra ekstraktene. Det er således et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en i det vesentlige renset trombininhibitor som kan identifiseres som polypeptider med trombininhibitoraktivitet som lar seg erholde fra en ekstrakt, som definert ovenfor og i kravene, ved rensing av ekstrakten erholdt ved homogenisering av den fremre tredjedelen av nedfryste og lyofiliserte blodigler med vann/aceton, ved hjelp av trombin-speaifikk affinitetskromatografi, etterfulgt av minst ett gel-filtreringstrinn og minst ett reversfase-HPLC-trinn.

Trombininhibitoren omfatter fortrinnsvis aktive polypeptidfragmenter med molekylvekter på ca. henholdsvis 3 kD, omtrent 9 kD og omtrent 14 kD. Disse aktive polypeptidene kan eventuelt betraktes som nedbrytningsprodukter av en opphavs-eller forløpertrombininhibitor.

Trombininhibitoren ifølge foreliggende oppfinnelse er ny, ettersom den atskiller seg fra kjente antitrombiner, spesielt fra hirudin, i molekylvekt samt i det isoelektriske punkt og de N-terminale aminosyresekvensene som oppviste begrenset homologi (under 40 %) med andre trombininhibitorer.

Det er derfor et ytterligere formål ved denne oppfinnelsen å isolere fra ekstrakten en trombininhibitor som omfatter minst ett polypeptid med trombininhibitoraktivitet og en molekylvekt på ca. 3 kD.

I tillegg er det et formål ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe en trombininhibitor som omfatter minst ett polypeptid med trombininhibitoraktivitet og en molekylvekt på ca. 9 kD og den N-terminale aminosyresekvens:

Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.

I tillegg er det et formål ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe en trombininhibitor som omfatter minst ett polypeptid med trombininhibitoraktivitet og en molekylvekt på ca.

14 kD og den N-terminale aminosyresekvens:

Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

Ifølge oppfinnelsen omfatter uttrykket "ca. 3 (9, 14) kD" et maksimalt avvik på pluss/minus 1 kD, fortrinnsvis på 0,5 kD. Dessuten er det et formål ved oppfinnelsen å inkludere også sekvensene ovenfor og nedenunder hvor det har inntrådt utbyttinger av aminosyrer som konserverer de viktigste biolog-iske egenskapene. Dette omfatter også variasjoner, fragmenter, underenheter, naturlig forekommende mutasjoner og tilfeldig frembrakte, kunstige mutanter. Også inkludert er slike hybrid-proteiner som fusjonsproteiner som avledes fra de beskrevne peptider.

Oppfinnelsen vedrører i tillegg en fremgangsmåte for å fremstille en ekstrakt som definert ovenfor og i kravene, ved homogenisering av vev eller sekresjoner fra blodigler av ordenen Rhynchobdellida, fortrinnsvis av arten Theromyzon tessulatum, og fremstille en fraksjon som omfatter vannopp-løselige bestanddeler derav.

Dessuten er det et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge kravene 4-7 ved å rense ekstrakten ved hjelp av trombinspesifikk affinitetskromatografi og minst ett ytterligere standardkromatografitrinn.

Trombininhibitoren ifølge oppfinnelsen har anti-koagulasjons- og antitromboseegenskaper. Den kan derfor anvendes i alle kliniske tilstander hvor koagulasjonssysternet er påvirket. Disse anvendelsene omfatter behandling av trombose, slag, myokardinfarkt, dyp venetrombose, obstruksjon av arterier i lemmer, lungetrombose, retinal arterietrombose eller hvilke som helst andre trombosetUstander. Dessuten kan trombininhibitoren (e) anvendes til pasienter med arteriovenøse anas-tomoser eller som gjennomgår koronar-"bypass"-kirurgi. Polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen kan også anvendes som antikoagulasjonsmidler med profylakse av trombose eller arterielle reokklusjoner, til konserveringen av blod eller blodprodukter, og til utenomkroppslige blod- eller plasmasirkulasjoner. Trombininhibitoren (polypeptidene) ifølge oppfinnelsen oppviser en biologisk aktivitet som i prinsippet er sammenlignbar med hirudin. Bindingsaffiniteten til trombin (inhibitorkonstant) er til og med litt forøkt sammenlignet med hirudin, som er kjent som den hittil sterkeste trombininhibitor. Det er således et tilleggsformål ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe polypeptidene definert ovenfor og i kravene for anvendelse som et medikament, særlig for behandlingen in vivo av tromboserelaterte sykdomstilstander, og for å inhibere blodplateaggregasjon og blodlevringer i utenomkroppslig blod.

Endelig er det videre tilveiebrakt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat som omfatter henholdsvis en trombininhibitor eller et polypeptid som definert ovenfor, og en farmasøytisk akseptabel bærer for behandling av tromboserelaterte sykdommer som nevnt ovenfor.

Kort beskrivelse av figurene

Detaljer vedrørende figurene er forklart i eksemplene 1-10. Figur 1 viser elueringsprofil for antitrombin fra affinitetskolonne (eksempel 3). Figur 2 viser gelfiltreringsanalyse av antitrombin avledet fra T. tessulatum på Biogel P4 (eksempel 4). Figur 3 viser analytisk RP-HPLC av positive fraksjoner fra affinitetstrinn (eksempel 5). Figur 4 viser preparativ RP-HPLC av positive fraksjoner fra affinitetstrinn (eksempel 5). Figur 5 viser sammenligning av hirudin og inhibitor ifølge denne oppfinnelsen på HPLC (eksempel 6). Figur 6 viser rekromatografi av aktiv topp 2 fra RP-HPLC (eksempel 7). Figur 7 viser massespektrum av aktiv topp 2 fra RP-HPLC (eksempel 7). Figur 8 viser IEF-spor for aktiv topp 2 fra RP-HPLC (eksempel 7). Figur 9 viser rekromatografi av aktiv topp 4 fra RP-HPLC (eksempel 9). Figur 10 viser massespektrum av aktiv topp 4 fra RP-HPLC (eksempel 9).

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Trombininhibitoren(e) ifølge denne oppfinnelsen kan isoleres og renses fra vev eller sekresjoner fra blodigler tilhørende ordenen Rhynchobdellida, fortrinnsvis av familien Theromyzon, Fra blodigler tilhørende familien Theromyzon kan det oppnås trombininhibitorer med lignende aktivitet og bare små forskjeller. Eksempler på egnede arter av familien Theromyzon er T. binannulatum, T. cooperi, T. garjaewi, T. maculosum, T. mollissimum, T. pallens, T. propinquum, T. rude, T.

sexoculatum og særlig T. tessulatum.

Fortrinnsvis anvendes spyttkjertlene hos blodiglene

som kilde ifølge oppfinnelsen. Ettersom det imidlertid krever anstrengelser å preparere spyttkjertlene, og det ikke kan for-hindres et betydelig tap av materiale, er det også mulig å

bruke hodene eller den fremre tredjedel av blodiglene som kilde.

Vanligvis omfatter det første trinnet i fremgangsmåten fortrinnsvis skikkelig nedfrysing og/eller frysetørking av blodiglevevet før homogenisering, som vanligvis utføres i aceton eller blandinger av aceton og vann. Andre polare, organiske oppløsningsmidler kan imidlertid anvendes for å fjerne ikke-vannoppløselige komponenter. Det er videre foretrukket at ekstrakten oppnådd ved hjelp av trinn 1 underkastes sentrifugering før affinitetskromatografi for å fjerne uønskede cellerester. Det er foretrukket at det ved affinitets-kromatografien anvendes en kolonne forsynt med "trombinaktive seter". Uttrykket "trombinaktive seter" betegner slik det her er brukt, tilstedeværelsen av trombinseter på kolonnen, hvortil en trombininhibitor kan feste seg. Eksempler på trombinaktive seter er immobilisert, naturlig forekommende eller desaktivert trombin som også omfatter trombinavledede peptider, peptidomimetika eller andre trombinderivater. Ifølge oppfinnelsen immobiliseres trombin eller trombinderivatene på en aktiv gelmatriks, fortrinnsvis ved å omsette med en azlaktongruppe i gelmatriksen i henhold til kjente metoder. Ellers ble affinitetskromatografi gjort ved hjelp av standardteknikker.

Det er foretrukket at gelfiltreringsfremgangsmåten anvendes sammen med affinitetskromatografi. Gelmatriksen'ifølge oppfinnelsen har en utelukkelsesgrense på ca. 5 kD og muliggjør derfor fraksjonering i området omtrent 1 kD og 5 kD.

Det er foretrukket at de isolerte antitrombinekstrak-tene videre underkastes reversfase-HPLC for ytterligere rensing. Polypeptidfragmenter som her beskrevet lar seg erholde ved rensing av de isolerte ekstraktene ved hjelp av RP-HPLC. Eksempler på egnede reversfasematerialer er silikageler modif-isert med C2-C18-alifatiske substituenter. Polypeptidene ifølge denne oppfinnelsen kan imidlertid renses ved hjelp av andre velkjente kromatografiske fremgangsmåter. Detaljer ved-rørende HPLC-rensingen er gitt i eksemplene.

Trombininhibitors aktivitet i ekstraktene og i de spesifikke fraksjonene fra rensetrinnene kan måles in vitro ved forlengelse av levringstid {F. Markwardt: Meth. Enz., 19, 924-932, 1970), eller ved reduksjon av spaltingen av et trombinspesifikt kromogent substrat, slik som tosyl-glysyl-prolyl-arginin-4-nitroanilidacetat (Chromozym TH, Boehringer, Mannheim), som beskrevet (H.U. Bergmeyer: Meth. Enz. Anal., 3. Utg., vol. 5, 365-394, 1988).

Som angitt ovenfor, er polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse egnet som farmasøytisk effektive forbindelser i farmasøytiske preparater og blandinger.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen

kan eventuelt omfatte ytterligere aktive bestanddeler som antikoagulasjonsmidler, slik som hirudin eller heparin, eller trombolytiske midler, slik som plasminogenaktivator eller hementin.

De nye polypeptidene og trombininhibitorene ifølge oppfinnelsen kan danne farmasøytisk akseptable salter med hvilken som helst ikke-toksisk, organisk eller uorganisk syre. Uorganiske syrer er f.eks. saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre eller fosforsyre, og syremetallsalter, slik som natriummono-hydrogenortofosfat og kaliumhydrogensulfat. Eksempler på organiske syrer er mono-, di- og trikarboksylsyrene, slik som eddiksyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, malonsyre, ravsyre, glutarsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, askorbinsyre, maleinsyre, hydroksymaleinsyre, benzosyre, hydroksybenzosyre, fenyleddiksyre, kanelsyre, salisylsyre og sulfonsyrer, slik som metansulfonsyre. Salter av den karboks-yterminale aminosyrerest omfatter de ikke-toksiske karboksyl-syresaltene dannet med hvilke som helst egnede uorganiske eller organiske baser. Disse saltene omfatter f.eks. alkalimetaller, slik som natrium og kalium, jordalkalimetaller, slik som kalsium og magnesium, lettmetaller fra gruppe HIA, inkludert aluminium, og organiske primære, sekundære og tertiære aminer, slik som trialkylaminer, inkludert trietylamin, prokain, dibenzyl-amin, 1-etenamin, N,N'-dibenzyletylendiamin,

dihydroabietylarain og N-alkylpiperidin.

Slik det her er brukt, betyr uttrykket "farmasøytisk akseptabel bærer" et inert, ikke-toksisk, fast eller flytende fyll-, fortynnings- eller innkapslingsmateriale, som ikke på ugunstig måte reagerer med den aktive forbindelse eller med pasienten. Egnede, fortrinnsvis flytende bærere er velkjente innen teknikken, slik som sterilt vann, saltoppløsning, vandig dekstrose, sukkeroppløsninger, etanol, glykoler og oljer, inkludert dem av petroleum-, animalsk, vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, f.eks. peanøttolje, soyabønneolje og mineralolje.

Preparatene ifølge oppfinnelsen kan administreres

som endoser inneholdende vanlige ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable bærere, fortynningsmidler, adjuvanser og vehikler som er typiske for parenteral administrering.

Uttrykket "parenteral" omfatter her subkutane, intra-venøse, intraartikulære og intratrakeale injeksjons- og infu-sjonsteknikker. Også slike andre administreringer som oral administrering og topisk applikasjon er egnet. Parenterale preparater og blandinger administreres helst intravenøst enten i en bolusform eller som en konstant innsprøyting i henhold til kjente fremgangsmåter. Tabletter og kapsler for oral administrering inneholder slike vanlige eksipienser som bindemidler, fyllstoffer, fortynningsmidler, tabletteringsmidler, smøremidler, desintegrasjonsmidler og fuktemidler. Tablettene kan være belagte i henhold til fremgangsmåter som er velkjente innen teknikken. Orale flytende preparater kan være i form av vann- eller oljesuspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, siruper eller eliksirer, eller kan være presentert som et tørt produkt for rekondisjonering med vann eller en annen egnet vehikkel før bruk. Slike flytende preparater kan inneholde vanlige additiver som oppslemmingsmidler, emulgeringsmidler, ikke-vandige vehikler og preserveringsmidler.

Topiske applikasjoner kan være i form av vann- eller oljesuspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, geler eller fortrinnsvis emulsjonssalver.

Endoser ifølge oppfinnelsen kan inneholde daglig på-krevde mengder av proteinet ifølge oppfinnelsen eller faktorer derav, som til sammen kan utgjøre den ønskede dose. Den opti-male terapeutisk akseptable dosering og dosemengde pr. tidsenhet for en bestemt pasient {pattedyr, inkludert mennesker) avhenger av mange forskjellige faktorer, slik som aktiviteten av det bestemte aktive materiale som anvendes, alderen, kroppsvekten, den generelle helsetilstand, kjønnet, kosten, administreringstiden og -veien, utskillingshastigheten, formålet ved behandlingen, dvs. terapi eller profylakse, og typen av trombosesykdommen som skal behandles, antiblodplate- eller antikoagulasjonsaktiviteten.

I preparater og blandinger som kan anvendes som anti-koaguleringsmidler hos en behandlet pasient {in vivo) er derfor en farmasøytisk effektiv, daglig dose av peptidene ifølge denne oppfinnelsen mellom ca. 0,01 og 100 mg/kg kroppsvekt, fortrinnsvis mellom 0,1 og 10 mg/kg kroppsvekt. Alt etter applikasjonsformen kan en enkeltdose inneholde mellom 0,5 og 10 mg av trombininhibitoren. For å oppnå en antikoagulasjonseffekt i utenomkroppslig blod er en farmasøytisk effektiv mengde av peptidene ifølge oppfinnelsen mellom 0,2 og 150 mg/ 1, fortrinnsvis mellom 1 mg og 20 mg/l utenomkroppslig blod.

Det er også et formål ved denne oppfinnelsen å tilveiebringe en implanterbar eller utenomkroppslig, medisinsk anordning for anvendelse i kontakt med kroppsvæsker for å gjøre anordningsoverflaten i det vesentlige tromberesistent, belagt med et immobilisert polypeptid som definert ovenfor og i kravene. Polypeptidet ifølge oppfinnelsen er immobilisert på en medisinsk anordning for å gjøre overflaten biologisk forenlig og tromberesistent. Slike anordninger har noen ganger fuktbare overflater som vanligvis induserer blodplateaggregasjon, som er en ulempe ved deres påtenkte anvendelser i implanterbare og utenomkroppslige anordninger i kontakt med blod eller andre kroppsvæsker. Eksempler på slike anordninger som vanligvis lages av plastmaterialer og syntetiske fibrer, er proteser, kunstige organer, suturer, kunstige blodåresegmenter, katetre, dialysatorer, rør og kar som bærer blod.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli nærmere illustrert under henvisning til de følgende eksempler som er for illustrasjonsformål.

Eksempel 1

Demonstrasjon av tilstedeværelsen av antitrombin i

r. tessulatum

Ti hoder av Theromyzon tessulatum ble homogenisert i isoton saltoppløsning. Homogenatet ble kortvarig sentrifugert for å fjerne partikkelstoff, og supernatanten ble beholdt for å utføre den følgende antitrombinanalyse sammen med andre hematologiske tester som angitt.

For estimering av antitrombinaktivitet ble 20 fil av den ovenfor nevnte ekstrakt blandet med 10 fil trombin (1 U) . Til denne blandingen ble 100 fil av en 0,5 mg/ml fibrinogenoppløsning tilsatt, videre ble det blandet og inkubert ved 37 °C i 1 minutt.

Nærmere detaljer vedrørende denne analysen er blitt beskrevet av R.T. Sawyer et al. (Comp. Haematol. Int., 1,

35-41, 1991). Den følgende tabell oppsummerer inhiberingen in vi tro av blodlevringsparametere med urensede ekstrakter fra Theromyzon tessulatum:

Det kan ses av dataene ovenfor at hodeområdet til Theromyzon tessulatum inneholder en vannoppløselig faktor eller vannoppløselige faktorer som signifikant forlenger trombinlevringstiden.

Eksempel 2

Kromogen analyse med hensyn på trombin- og faktor Xa- inhibering

a) Trombininhibering

20 fil trombinoppløsning (5 NIH-U trombin/ml 250 mM

fosfatbuffer inneholdende 0,05 % PEG 6000, pH 6,5) ble forinkubert med 880 fil trombinanalysebuf f er (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05 % PEG, pH 8,3) i en fotometerkyvette i 5 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 100 fil substratoppløsning (4 mg Chromozym TH fra Boehringer, Mannheim, Tyskland, oppløst i 5 ml H20) , og absorpsjonen ble avlest ved 405 nm i 5 minutter med 30 sekunders intervaller ved 25 °C.

For måling av inhiberingsaktivitet ble 10-200 fil prøve eller hirudin som standard blandet med 20 fil trombinoppløsning og ble fylt opp til 900 fil totalvolum med analysebuf f er. Denne blandingen ble forinkubert i 5 minutter ved romtemperatur, og reaksjonen ble startet ved tilsetning av 100 fil

substratoppløsning.

b) Inhibering av faktor Xa- aktivitet

20 fil oppløsning av faktor Xa (10 U/0,5 ml fortynnet

til 2,0 ml med H20) ble forinkubert med 880 fil faktor Xa-analysebuffer (100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05 % PEG, pH 8,3) i en fotometerkyvette i 5 minutter ved romtemperatur. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 100 fil substratoppløsning (3,5 mg Chromozym X fra Boehringer, Mannheim, Tyskland, oppløst i 5 ml H20) og absorpsjonen avlest ved 405 nm i 5 minutter med 30 sekunders intervaller ved 25 °C.

For måling av inhiberingsaktivitet ble 10-200 fil prøve blandet med 20 fil faktor Xa-oppløsning og ble fylt opp til 900 fil totalvolum med analysebuffer. Denne blandingen ble forinkubert i 5 minutter ved romtemperatur, og reaksjonen ble startet ved tilsetning av 100 fil substratoppløsning.

Eksempel 3

Rensing av trombininhibitor fra Theromyzon tessulatum

Trinn 1

Den fremre tredjedel av Theromyzon tessulatum foret i 1000 sekunder ble umiddelbart nedfryst ved -70 °C og lyofilisert. Til dette materialet ble 35 ml 40 % aceton tilsatt, og suspensjonen ble homogenisert i en ultratorax 3x i 10 sekunder hver. Behandling i 2 minutter i en sonikator ble etterfulgt av et ytterligere homogeniseringstrinn (3 0 sekunder). Homogenatet ble sentrifugert i 15 minutter ved 6000 rpm og den resulterende supernatant tatt vare på (Sl).

Til pelleten 1 ble det tilsatt ytterligere 35 ml 40 % aceton, og en andre homogenisering ble utført (1 x 10 sekunder, 2 minutter sonikering, 1 x 30 sekunder). Homogenatet ble på nytt sentrifugert i 15 minutter ved 6000 rpm.

Supernatant 2 ble tilsatt til supernatant 1 som var tatt vare på, og til de blandede supernatanter ble det tilsatt 80 % aceton (vol/vol).

pH-verdien ble regulert til 4,0 med eddiksyre og den resulterende suspensjon sentrifugert ved 6000 rpm i 20 minutter. Pellet 3 ble kassert. Supernatant 3 ble konsentrert fire ganger ved hjelp av en rotasjonsinndamper (Speed Vac).

Den acetonfrie ekstrakt ble testet positiv med hensyn på antitrombinaktivitet i blodlevringsanalysen ifølge eksempel 1, samt i den kromogene analyse ifølge eksempel 2.

Trinn 2

Den acetonfrie ekstrakt ble tilført en PD-10-kolonne (Pharmacia) for bufferbytte. Kolonnen ble ekvilibrert med affinitetsbuffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4), og 2,5 ml av ekstrakten fra trinn 1 ble tilført kolonnen. Eluatet ble testet med hensyn på antitrombinaktivitet.

Trombinaffinitetskolonnen ble preparert på følgende måte:

4 00 mg tørr "Azlacton Tentacle Fractogel"-matriks

(E. Merck, Darmstadt, Tyskland) ble oppslemmet i 7 ml koblingsbuffer (50 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,5) i 2 timer

ved romtemperatur. Suspensjonen ble vasket to ganger ved hjelp av sentrifugering og resuspensjon i koblingsbuffer. 5000 NIH-U bovint trombin (Sigma) ble oppløst i 1 ml H20 og pH-verdien regulert til 7,5. Denne trombinoppløsningen ble ekvilibrert til koblingsbuffer ved hjelp av PD-10-gelfiltrering. Til den ekvilibrerte trombinoppløsning ble det tilsatt natriumsulfat for å nå en sluttkonsentrasjon på 1 M. Trombinprotein ble øye-blikkelig pipettert til den aktiverte gelmatriks, og kobling fikk skje i 3 timer ved 4 °C med forsiktig blanding. Vasking ble gjort tre ganger med 5 volumdeler koblingsbuffer hver gang. For desaktivering av matriksen ble 1,5 ml etanolamin tilsatt, og den fikk stå over natten ved 4 °C med forsiktig risting. Matriksen ble vasket to ganger med 5 volumdeler acetatbuffer (100 mM Na-acetat, 500 mM NaCl, pH 4,0). Sluttekvilibrering ble gjort ved å vaske to ganger med 5 volumdeler affinitetsbuffer.

Aktive eluater fra PD-10-kolonnen ble fylt på affini-tetskolonnen ved hjelp av en peristaltisk pumpe (pumpehastig-het 10 ml/time). Den ubundne fraksjon ble samlet opp og kolonnen vasket med 12 ml affinitetsbuffer (vask 1). Eluering ble utført med 6 ml acetatbuffer, pH 4,0, og fraksjoner å

0,5 ml volum ble samlet opp. Elueringsprofilen fra denne kolonnen er vist i figur 1.

Første eluering ble etterfulgt av et andre trinn

under anvendelse av 6 ml acetatbuffer, pH 3,0. Fraksjoner å

1,5 ml ble samlet opp. Kolonnen ble reekvilibrert med 25 ml affinitetsbuffer.

Resultatene av ekstraksjonen og affinitetstrinnet er oppsummert i den følgende tabell 2:

Tabell 2: Resultater av affinitetsrensing av trombininhibitor fra Theromyzon tessulatum (affi. = affinitetskromatografi)

Eksempel 4

Gelfiltreringsanalyse av aktiv trombininhibitor fra Theromyzon tessulatum

Aktivt materiale ble tilført en Biogel P4-gelfilt-reringskolonne (Biorad) som hadde et volum på 25 ml. Eluering ble gjort med 20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4, ved en gjennomstrømningshastighet på 4 ml/time. Fraksjonene fra 1 ml ble testet med hensyn på deres antitrombinaktivitet.

P4-gelmatriksen har en utestengningsgrense på 5000 D

og muliggjør fraksjonering i molekylvektområdet 1000-5000 D. Overraskende ble det funnet at antitrombinaktivitet eluerer i fraksjoneringsvolumet, dvs. at det har en tilsynelatende mole-

kylvekt under 5000 D (figur 2). Denne oppførselen er i motsetning til hirudin (molekylvekt 7000 D), som kommer til syne i utelukkelsesvolumet under de samme betingelser. Fra kalibrering av P4-kolonnen ble det beregnet en molekylvekt på omtrent 3000 D for antitrombinaktiviteten fra Theromyzon tessulatum.

Eksempel 5

Reversfase- HPLC av renset trombininhibitor fra Theromyzon tessulatum

Aktive eluater etter affinitetskromatografitrinnet ifølge eksempel 3 ble ytterligere analysert ved hjelp av RP-HPLC. 20 fil prøve ble injisert på en HPLC-kolonne (LiChrospher 300 RP-18, 5 /im: E. Merck, Darmstadt, Tyskland) og eluert med den følgende acetonitrilgradient ved 1,0 ml/minutt:

Buffer A: 0,1 % trifluoreddiksyre i H20

Buffer B: 0,08 % trifluoreddiksyre i acetonitril Gradient: 0-2 min 10 % B

2- 3 min injisering

3- 28 min 60 % B.

Figur 3 viser et typisk analytisk kromatografisk spor målt ved 22 0 nm. Trombininhiberingsaktivitet ble funnet i toppene merket som topp 2 og topp 4. Informasjonen fra analyt-iske HPLC-kjøringer ble deretter brukt til å utføre preparative separasjoner under de samme betingelser.

Preparative rensinger ble kjørt med aliquoter å

500 [ il prøve fra affinitetskromatografi (figur 4) . Enkelt-stående topper ble samlet opp, slått sammen og konsentrert ved rotasjonsinndamping i en Speed Vac. Tørkede fraksjoner ble rekondisjonert i H20 og analysert med hensyn på antitrombinaktivitet i blodlevringstidteten, samt i den kromogene analyse beskrevet i eksempel 2.

Hovedaktivitetene i begge testsystemene ble funnet i toppene 2 og 4, med noen aktivitet også i topp 5, som mest sannsynlig gjenspeiler forurensning fra topp 4 i topp 5-materialet. Alle andre topper i kromatogrammet oppviste ikke noen trombininhiberingsaktivitet i det hele tatt. Summen av aktivitet i toppene 2 og 4 utgjorde omtrent 93 % av den totale aktivitet.

Eksempel 6

Sammenligning av trombininhibitor ifølge foreliggende oppfinnelse med hirudin på HPLC

For ytterligere å demonstrere at inhibitoren ifølge denne oppfinnelsen er et fundamentalt forskjellig molekyl fra hirudin ble det følgende forsøk utført. Til den aktive topp 2 etter HPLC ifølge eksempel 5 ble det tilsatt en lignende proteinkonsentrasjon av renset hirudin, og blandingen ble underkastet RP-HPLC i en acetonitrilgradient (40-70 %). Det ble funnet to topper som inneholder antitrombinaktivitet

(figur 5). Fra sammenligningsforsøk hvor de enkelte inhibi-torer er blitt injisert, kunne fastsettelsen av topper gjøres som angitt i figur 5.

Fra figur 5 er det klart at antitrombinet ifølge

denne oppfinnelsen eluerer i en stilling som er svært forskjellig fra hirudinets. Det samme kunne demonstreres for den aktive topp 4 etter HPLC-separasjon ifølge eksempel 5.

Eksempel 7

Ytterligere karakterisering av topp 2 med antitrombinaktivitet

Renhet

Sammenslått aktiv topp 2 fra RP-HPLC ble underkastet rekromatografi under de samme betingelser som i figur 3. Som vist i figur 6, kunne en liten mengde forurensende materiale' fortsatt skilles fra den viktigste aktive topp, noe som resulterte i et homogent preparat etter den andre RP-HPLC (se også figur 8, som viser kapillarelektroforese av denne fraksjonen).

Trombininhibering

Topp 2 fra RP-HPLC var aktiv i blodlevringsanalysen (trombintid > 600 sekunder/5 ( il) , samt i den kromogene anti-trombintest ifølge eksempel 2. Aktivitet i den sistnevnte analyse var 3,2 IU/250 fil. Faktor Xa-inhiberingsaktivitet kunne ikke påvises i topp 2 under anvendelse av analysen beskrevet i eksempel 2, noe som gjenspeiler en maksimal anti-FXa-aktivitet på << 1 % av antitrombinaktiviteten. Det konklu-deres derfor med at den her beskrevne inhibitor er svært spesifikk for trombin.

Titrering av aktivt sete

Inhibitorkonstanten mot trombin ble bestemt ved hjelp av spektrofluorometrisk titrering av standardisert trombin-oppløsning med inhibitoren ifølge denne oppfinnelsen. Detaljer vedrørende metoden er blitt beskrevet annetsteds av G.W. Jameson et al. (Biochem. J., 131, 107-117, 1973).

I korte trekk ble det fluorogene substrat Tos-Gly-Pro-~"Arg-AMC brukt ved en konsentrasjon på 50 /*M i titrerings-forsøkene. Analyser ble utført i 100 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0,05 % PEG 6000, pH 7,8, ved 25 °C. En konsentrasjon på 20 pM aktivsetetitrert human-a-trombin ble inkubert med inhibitoren ved 0,2-5 x E0 i 10 minutter, og det ble målt stabile hastig-heter etter tilsetning av substrat. Kinetikkonstantene ble bestemt ved å bruke det ikke-lineære regresjonsanalyseprogram GraFit (R.J. Leatherbarrow, Erithacus Software, Staines, UK, 1980) . K-i ble funnet å være 178 femtomolar.

Molekylvekt

Molekylvekten til aktiv topp 2 ble bestemt ved hjelp av laserdesorpsjonsmassespektrometri under anvendelse av MALDI-TOF-metoden (Kratos). 0,5 ^1 prøve ble blandet med noen få [ il dihydroksybenzosyre i acetonitril, som tjener som matriks. Blandingen ble tørket under kald luft på en sølv-prøveholder og plassert i instrumentet. Det resulterende massespektrum ble kalibrert med standardproteiner med kjent molekylvekt. Toppen tilsvarte en molekylvekt på ca. 9000 D (figur 7).

Isoelektrisk fokusering

Det isoelektriske punkt til inhibitoren ble målt ved hjelp av kapillarelektroforese i IEF-innstillingen (Applied Biosystems). Som det kan ses av figur 8, fremkom inhibitor-toppen ved en pl på 4,9 sammenlignet med standardproteiner.

Eksempel 8

Sekvensdata for topp 2 med antitrombinaktivitet

Den følgende N-terminale sekvens ble oppnådd med topp 2 fra RP-HPLC (eksempel 5) ved hjelp av standard Edman-ned-

brytningskjemi på et Beckraan peptidsekvenseringsapparat:

Glu Asp Asp ASn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.

Eksempel 9

Ytterligere karakterisering av topp 4 med antitrombinaktivitet

Renhet

Sammenslått aktiv topp 4 fra RP-HPLC ble underkastet rekromatografi under de samme betingelser. Som vist i figur 4, kunne fortsatt noe forurensende materiale skilles fra den viktigste aktive topp, noe som resulterte i et homogent preparat etter den andre RP-HPLC.

Trombininhibering

Topp 4 fra RP-HPLC var aktiv i blodlevringsanalysen (trombintid > 600 sekunder/5 ( il) , samt i den kromogene anti-trombintest ifølge eksempel 2. Aktivitet i den sistnevnte analyse var 1,3 IU/250 fil. Faktor Xa-inhiberingsaktivitet kunne ikke påvises i topp 2 under anvendelse av analysen beskrevet i eksempel 2, noe som gjenspeiler en maksimal anti-FXa-aktivitet på << 1 % av antitrombinaktiviteten. Det konklu-deres derfor med at inhibitoren som her er beskrevet, er svært spesifikk for trombin.

Titrering av aktivt sete

Inhibitorkonstanten mot trombin ble bestemt ved hjelp av spektrofluorometrisk titrering av standardisert trombin-oppløsning med inhibitoren ifølge denne oppfinnelsen. For detaljer, se eksempel 7. Ki ble funnet å være 240 femtomolar.

Molekylvekt

Molekylvekten til aktiv topp 4 ble bestemt ved hjelp av laserdesorpsjonsmassespektrometri under anvendelse av MALDI-TOF-metoden (Kratos), som beskrevet i eksempel 7. Det resulterende massespektrum ble kalibrert med standardproteiner med kjent molekylvekt. Toppen tilsvarte en molekylvekt på ca.

14 kD (figur 10).

Eksempel 10

Sekvensdata for topp 4 med antitrombinaktivitet

Den følgende N-terminale sekvens ble oppnådd med topp

4 fra HPLC (eksempel 5) ved hjelp av standard Edman-nedbryt-ningskjemi på et Beckman peptidsekvenseringsapparat: Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Gly Thr Phe Lys.

Eksempel 11

Ved å bruke den samme fremgangsmåten som beskrevet i eksemplene 1-5, kunne polypeptider med antitrombinaktivitet også isoleres fra de følgende Theromyzon-arter:

T. binannulatum,

T. cooperi,

T. garjaewi,

T. maculosum,

T. sexoculatum.

Claims (16)

1. Ekstrakt med trombininhibitoraktivitet, karakterisert ved at den er fra vev eller sekresjoner fra blodigler av ordenen Rhynchobdellida som inneholder vannoppløselige komponenter derav."

2. Ekstrakt ifølge krav 1, karakterisert ved at den er fra blodigler av familien Theromyzon.

3. Ekstrakt ifølge krav 2, karakterisert ved at den er fra blodigler av arten Theromyzon tessulatum.

4. I det vesentlige rent polypeptid, karakterisert ved at det har trombininhibitoraktivitet som lar seg erholde fra en ekstrakt ifølge kravene 1-3 ved rensing av ekstrakten erholdt ved homogenisering av den fremre tredjedel av nedfryste og lyofiliserte blodigler med vann/aceton, ved hjelp av trombinspesifikk affinitetskromatografi, etterfulgt av minst ett gelfilt-reringstrinn og minst ett reversfase-HPLC-trinn.

5. Polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at det består av minst ett polypeptid med trombininhibitoraktivitet og en molekylvekt på ca.

3 kD.

6. Polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at det består av minst ett polypeptid med trombininhibitoraktivitet, en molekylvekt på ca. 9 kD og den N-terminale aminosyresekvens: Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gly Glu.

7. Polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at det består av minst ett polypeptid med trombininhibitoraktivitet, en molekylvekt på ca. 14 kD og den N-terminale aminosyresekvens: Ser Glu Leu Gly Gin Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cys Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en ekstrakt ifølge kravene 1-3, karakterisert ved at vev eller sekresjoner fra blodigler av ordenen Rhynchobdellida, fortrinnsvis av arten Theromyzon tessulatum, homogeniseres, og det fremstilles en fraksjon som omfatter vannoppløselige komponenter derav.

9. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ifølge kravene 4-7, karakterisert ved at en ekstrakt fremstilt ifølge krav 8 renses ved hjelp av trombinspesifikk affinitetskromatografi og minst ett ytterligere standard kromatografitrinn.

10. Polypeptid ifølge kravene 4-7, karakterisert ved at det skal anvendes som et medikament.

11. Polypeptid ifølge krav 10, karakterisert ved at det skal anvendes som trombininhibitor for behandling in vivo av tromboserelatert sykdom.

12. Polypeptid ifølge krav 10, karakterisert ved at det skal anvendes som trombininhibitor for å inhibere blodplateaggregasjon i utenomkroppslig blod.

13. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid ifølge henholdsvis kravene 4-7 og 10-12, og en farma-søytisk akseptabel bærer.

14. Anvendelse av et polypeptid ifølge kravene 4-7 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling in vivo av tromboserelatert sykdom.

15. Anvendelse av et polypeptid ifølge kravene 4-7 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av blodplateaggregasjon i utenomkroppslig blod.

16. Anvendelse av blodigler av ordenen Rhynchobdellida, fortrinnsvis arten Theromyzon tessulatum, for fremstilling av trombininhibitorforbindelser.