JP3537437B2

JP3537437B2 - トロンビンインヒビター

Info

Publication number: JP3537437B2
Application number: JP52489694A
Authority: JP
Inventors: ヘンベルガー、ユルゲン; ソーヤー、ロイ; ヴォルフ、ザビーネ; ドット、ヨハネス
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-03
Publication date: 2004-06-14
Anticipated expiration: 2019-06-14
Also published as: EP0652900B1; UA43831C2; CZ287794B6; NO318017B1; DK0652900T3; KR100335536B1; EP0652900A1; RU95105983A; TW369541B; US5583111A; PL179215B1; CA2139652A1; KR950702579A; CA2139652C; NO950075L; ES2167364T3; JPH07508765A; GB9309509D0; HU226243B1; HUT70215A

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景本発明は新規のトロンビンインヒビター、とくに、ヒ
ル組織およびヒル分泌物に由来するトロンビンインヒビ
ターに関する。トロンビンは、フィブリン凝固の形成を触媒し、した
がって血液凝固を阻害する。さらに、トロンビンは、例
えば血小板凝集の直接的活性化や内皮細胞によって血小
板活性化因子（PAF）の合成を刺激することによる炎症
性応答の活性化などいくつかの他の生物調整的役割を有
する。すなわち、トロンビンは、例えば心臓血管系疾患
などの血栓症関連障害において中心的役割を担ってい
る。このようなことから、新規あるいは改良トロンビンイ
ンヒビターおよび抗凝血剤の不断の探求に大きな関心が
寄せられている。よく知られたトロンビンインヒビターの例としては、
ヘパリンおよびヒルジンがある。ヘパリンは、抗トロンビンIIIの抗凝血活性を促進す
る。これは、トロンビン活性が血栓の形成または拡大の
原因となっている静脈血栓塞栓症などの治療に広く用い
られている。これは抗トロンビンIIIが減少している場
合、例えばネフローゼまたは汎発性血管内血液凝固症候
群（DIC）を伴う血栓症の場合の治療には有効ではな
い。さらに、ヘパリンは、出血および栓球減少症を含む
多くの望ましくない副作用をもたらす。ヒルジンはトロンビンに特異的であることが知られた
よく特徴づけされた公知のポリペプチドであり、Hirudo
medicinalis種のヒルの唾液腺抽出物および他の組織か
ら分離することができる。ヒルジンおよびその誘導体は
また、組み替え技術によっても得られる。ポリペプチド
は比較的低分子量の7000Dを有し、65個のアミノ酸から
なる。ヒルジンのアミノ酸配列は、Dodtら（FEBS Lette
rs、165、180−184、1984）によって初めて決定され
た。三つの主要なヒルジン変種（HV1、HV2、HV3）が医
用ヒルのHirudo medicinalisから見出だされ、これらは
全アミノ酸位置の約10％が異なっているのみである。最
も顕著な違いは、分子のＮ末端の最初の二位置に見られ
る。すなわち、ヒルジン変種１（HV1）ではVal−Valで
あり、ヒルジン変種２（HV2）ではIle−Thrである。こ
れらの相違は、あまり重要ではなく、機能にもヒルジン
−トロンビン相互作用の特異性にも影響しない。ヒルジ
ンは天然凝固阻害剤である。これは静脈血栓症、血管シ
ャント閉塞トロンビン誘導汎発性血管内凝固の予防に効
果を示すが、しかし出血時間を延長する。系統発生学的には、医用ヒルのHirudo medicinalisは
ヒル科Hirudinidaeの亜科Hirudininaeに属する（R.T.Sa
wyer、「Leech Biology and Behaviour」、Oxford Univ
ersity Press、Vol.2、688、1986）。より進化したヒル
種はHirudinaria manillensisであり、これは同じ科Hir
udinidaeの亜科Hirudinariinaeに属する。意外にも、PC
T特許出願WO90/05143に記述されるように、関連するが
明らかに異なるヒルジンの同種型が最近Hirudinaria ma
nillensisに見出だされた。この同種型は、Hirudo medi
cinalisからのヒルジンと較べるとアミノ酸位置の約40
％が異なっている。上記の二種、すなわちHirudo medic
inalisおよびHirudinaria manillensisは、ヒル目Arhyn
chobdellida（「顎ヒル類」）に属する。Arhynchobdell
ida目に加えて、もう一つの主要なヒル目はRhynchobdel
lida（「吻ヒル類」）である（R.T.Sawyer、「Leech Bi
ology and Behaviour」、Oxford University Press、Vo
l.2、651、1986）。唾液腺タンパク質に関して最もよく
研究されたRhynchobdellida目のヒルは、Haementeria g
hilianii（「アマゾンヒル」）である。意外にもこの種は抗トロンビンを含まないことが立証
された（Budzynskiら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、168、
259−265、1981）。代わりに、Haementeria ghilianii
はヘメンチンと呼ばれるフィブリノーゲン溶解酵素（US
特許4390630）および血液凝固因子Xaの阻害剤（C.Condr
aら、Thromb.Haemost.、61、437−441、1986）を含む。この発見および続いての研究に基づいて、抗トロンビ
ン様活性はArhynchobdellida目のヒルに限定されること
が一般に認められていて、一方、抗トロンビン様活性は
Rhynchobdellida目には欠損していると近年は考えられ
ている。上記のような進展にもかかわらず、ヘパリンおよびヒ
ルジン以外の、凝固形成阻害、トロンビン誘導血小板活
性化または内皮細胞活性化において増強された効用を有
し、商業的にも有用な量の生産が可能な抗凝固剤および
抗トロンビン剤が今も要求されている。発明の概要驚いたことに、抗トロンビン様活性を有する化合物を
Rhynchobdellida目、好ましくはTheromyzon属、最も好
ましくはTheromyzon tessulatum種のヒルの組織および
分泌物から分離できることが見出だされた。Theromyzon
tessulatum種は水鳥の鼻孔から血を吸うという変わっ
たライフスタイルを有することから、時に「鳥ヒル」と
呼ばれる。したがって、本発明の目的は、Rhynchobdellida目、
好ましくはTheromyzon tessulatum種のヒルをトロンビ
ン阻害化合物の調製のために使用することである。トロンビン阻害活性はこれらのヒルの水溶性成分から
なる抽出物を測定することで決定できることが見出ださ
れた。したがって、本発明の目的は、Rhynchobdellida
目またはTheromyzon属またはTheromyzon tessulatum種
のヒルの組織または分泌物からその水溶性成分を含むト
ロンビン阻害活性を有する抽出物を調製することであ
る。活性のトロンビンインヒビターは該抽出物から分離す
ることができた。すなわち、本発明の目的は上記および
請求の範囲に定義した抽出物から得られるトロンビン阻
害活性を有するポリペプチドとして同定され得る本質的
に精製されたトロンビンインヒビターを提供することで
あって、これは頭部から三分の一の凍結および凍結乾燥
したヒルを水／アセトンを用いて均質化して得た抽出物
をトロンビン特異性アフィニティークロマトグラフィー
にかけて、次いで少なくとも一つのゲル濾過ステップお
よび少なくとも一つの逆相HPLCステップで精製すること
によってなされる。トロンビンインヒビターは好ましくは、分子量がそれ
ぞれ約3kD、約9kDおよび約14kDの活性ポリペプチド断片
を含む。これらの活性ポリペプチドは、オリジナルまた
は前駆トロンビンインヒビターの分解産物とみなされ
る。本発明によるトロンビンインヒビターは、公知の抗ト
ロンビン剤、とくにヒルジンとは分子量および等電点お
よびＮ末端アミノ酸配列が異なり、他のトロンビンイン
ヒビターとは限定された相同性（40％以下）しか示さな
いことから新規である。したがって、本発明のさらなる目的は該抽出物からト
ロンビン阻害活性を有し、分子量が約3kDである少なく
とも一つのポリペプチドからなるトロンビンインヒビタ
ーを分離することである。加えて、本発明の目的は、トロンビン阻害活性を有
し、分子量が約9kDであり、Ｎ末端アミノ酸配列を有する少くとも一つのポリペプチドからなるトロンビ
ンインヒビターを提供することである。加えて、本発明の目的は、トロンビン阻害活性を有
し、分子量が約14kDであり、Ｎ末端アミノ酸配列を有する少なくとも一つのポリペプチドからなるトロン
ビンインヒビターを提供することである。本発明において、「約３（９、14）kD」とは、±1k
D、好ましくは0.5kDの最大偏差を含むことを意味する。
さらに、本発明の目的にはまた、主要な生物学的性質を
保存するアミノ酸交換が起きた上記および下記の該配列
が含まれる。これにはまた、変種、フラグメント、サブ
ユニット、天然発生的突然変異体および無作為に生じる
人為的突然変異体が含まれる。また、開示されたペプチ
ドから誘導される融合タンパク質などのハイブリドタン
パク質が含まれる。加えて、本発明は、Rhynchobdellida目、好ましくはT
heromyzon tessulatum種のヒルの組織または分泌物を均
質化して、その水溶性成分からなる画分を調製すること
によって上記および請求の範囲に定義された抽出物を調
製する方法に関する。さらに、本発明の目的は、トロンビン特異性アフィニ
ティークロマトグラフィーおよび少なくとも一つのさら
なる標準クロマトグラフィーステップを用いて該抽出物
を精製することによって請求項４〜７に記載のポリペプ
チドを調製する方法を提供することである。本発明のトロンビンインヒビターは、抗凝固性および
抗血栓性の性質を有する。したがって、これは凝固系が
関与する全ての臨床状態で用いられる。これらの使用に
は、血栓症、卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症、四肢動
脈の障害、肺血栓症、髄質動脈血栓症またはその他の血
栓症の治療が含まれる。さらに、トロンビンインヒビタ
ーは、動静脈シャントの患者または冠状バイパス手術を
受けている患者のために使用し得る。本発明のポリペプ
チドはまた、血栓症または動脈再閉塞の予防のための抗
凝固剤として、血液または血液製品の保存のため、およ
び体外血液または血漿循環のために用い得る。本発明によるトロンビンインヒビター（ポリペプチ
ド）は、基本的にはヒルジンに匹敵する生物学的活性を
示す。トロンビンとの結合親和性（阻害定数）は、今日
最強のトロンビンインヒビターとして知られるヒルジン
よりも僅か上回りさえする。このように、本発明のさらなる目的は、とくに血栓症
関連障害のインビボ治療のためおよび体外血液における
血小板凝集および血液凝固の阻害のための医薬物として
の使用のための上記および請求の範囲に定義したポリペ
プチドを提供することである。最後に、本発明によってさらに、上記に定義したトロ
ンビンインヒビターまたはポリペプチド、および薬剤学
的に容認し得る担体からなる上記のような血栓症関連障
害の治療のための薬剤組成物が提供される。図面の簡単な説明図面の詳細は実施例１〜10の中で説明される。第１図は、アフィニティーカラムからの抗トロンビン
の溶出プロフィールを示す説明図である（実施例３）。第２図は、T.tessulatumに由来する抗トロンビンのバ
イオゲルP4上でのゲル濾過分析を示す説明図である（実
施例４）。第３図は、アフィニティーステップからの陽性画分の
分析用RP−HPLCを示す説明図である（実施例５）。第４図は、アフィニティーステップからの陽性画分の
調製用RP−HPLCを示す説明図である（実施例５）。第５図は、HPLC上でのヒルジンと本発明によるインヒ
ビターとの比較を示す説明図である（実施例６）。第６図は、RP−HPLCからの活性ピーク２の再クロマト
グラフィーを示す説明図である（実施例７）。第７図は、RP−HPLCからの活性ピーク２のマススペク
トルを示す説明図である（実施例７）。第８図は、RP−HPLCからの活性ピーク２のIEFトレー
スを示す説明図である（実施例７）。第９図は、RP−HPLCからの活性ピーク４の再クロマト
グラフィーを示す説明図である（実施例９）。第10図は、RP−HPLCからの活性ピーク４のマススペク
トルを示す説明図である（実施例９）。発明の詳細な説明本発明によるトロンビンインヒビターは、Rhynchobde
llida目、好ましくはTheromyzon属のヒルの組織または
分泌物から分離および精製することができる。Theromyz
on属のヒルからのトロンビンインヒビターはいずれも同
様の活性を有し、相違はごく僅かである。Theromyzon属
の適当な種の例は、T.binannulatum、T.cooperi、T.qar
jaewi、T.maculosum、T.mollissimum、T.pallens、T.pr
opinquum、T.rude、T.sexoculatumおよび、とくにT.tes
sulatumである。好ましくは、ヒルの唾液腺が本発明の材料として用い
られる。しかし、唾液腺の調製は容易ではなく、かなり
の材料ロスが避けられないことから、ヒルの頭部または
頭部から三分の一を材料として用いることも可能であ
る。通常、本方法の最初のステップは、通常アセトンまた
はアセトン／水混合物中で行う均質化に先だってヒル組
織を好ましくは実質的な凍結および／または凍結乾燥す
ることである。しかし、非水溶性成分を除去するために
他の極性有機溶媒を用いることもできる。さらに好まし
くは、ステップ１によって得られる抽出物をアフィニテ
ィークロマトグラフィーの前に遠心分離して不要な細胞
砕片を除去する。アフィニティークロマトグラフィーに
は「トロンビン活性部位」を備えたカラムを使用するこ
とが好ましい。ここで「トロンビン活性部位」とは、カ
ラムにトロンビン部位が存在してそこにトロンビンイン
ヒビターが吸着できることをいう。トロンビン活性部位
の例としては、固定化天然または脱活性化トロンビン、
さらにトロンビン由来ペプチド、擬ポリペプチドまたは
他のトロンビン誘導体があげられる。本発明によると、
トロンビンまたは該トロンビン誘導体は、活性ゲルマト
リックスに、好ましくは該ゲルマトリックスのアズラク
トン基と公知の方法で反応させることによって固定化さ
れる。とくに記載がなければ、アフィニティークロマト
グラフィーは標準法によって行った。好ましくは、ゲル濾過法をアフィニティークロマトグ
ラフィーとともに用いる。本発明によるゲルマトリックスは、約5kDの排除限界
を有し、したがって、約1kD〜5kDの範囲の分画が可能で
ある。分離された抗トロンビン抽出物をさらなる精製のため
にさらに逆相HPLCに供することが好ましい。上記したよ
うなポリペプチド断片は、分離された抽出物をRP−HPLC
によって精製することによって得られる。適当な逆相材
料の例としては、C2−C8脂肪族置換体によって修飾され
たシリカゲルがある。しかし、本発明によるポリペプチ
ドは、他のよく知られたクロマトグラフィー手法によっ
て精製することもできる。HPLC精製の詳細は実施例にお
いて示される。抽出物および精製ステップの特定画分中のトロンビン
インヒビターの活性は、凝固時間の延長（F.Markward
t、Meth.Enz.、19、924−932、1970）によって、または
酢酸トシル−グリシル−プロリル−アルギニン−４−ニ
トロアニリド（クロモジムTH、ベーリンガーマンハイ
ム）などのトロンビン特異性色原性物質の切断の減少
（H.U.Bergmeyer、Meth.Enz.Anal.、第三版、Vol.5、36
5−394、1988）によって、インビトロで測定される。上記したように、本発明のポリペプチドは、薬剤組成
物および配合物において薬剤学的に有効な化合物として
適している。本発明による薬剤調製物は、ヒルジンまたはヘパリン
などの抗凝固剤またはプラスミノーゲン活性化因子やヘ
メンチンなどの血栓溶解剤などの追加の有効成分を適宜
含むことができる。本発明による新規のポリペプチドおよびトロンビンイ
ンヒビターは、任意の非毒性有機または無機酸と薬剤学
的に容認し得る塩を形成することができる。無機酸は例
えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸または燐酸、およびオル
ト燐酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの
酸金属塩がある。有機酸の例としては、モノ、ジおよび
トリカルボン酸、例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピ
ルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル
酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マ
レイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキ
シ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、およ
びメタンスルホン酸などのスルホン酸がある。カルボキ
シ末端アミノ酸部の塩には、任意の適当なな無機または
有機塩基とで形成された非毒性カルボン酸塩が含まれ
る。これらの塩には例えば、ナトリウムおよびカリウム
などのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムな
どのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むIII A群の
軽金属、および有機一級、二級およびトリアルキルアミ
ンなどの三級アミン、例えばトリエチルアミン、プロカ
イン、ジベンジルアミン、１−エチレンアミン、Ｎ、
Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチ
ルアミンおよびＮ−アルキルピペリジンなどが含まれ
る。ここでいう「薬剤学的に容認し得る担体」とは、活性
化合物または患者との間で望ましくない反応を起こさな
い不活性、非毒性固体または液体の充填剤、希釈剤また
はカプセル用材料を意味する。適当な、好ましくは液体
の担体は、当業者に広く公知のもので、例えば滅菌水、
生理的食塩水、液体デキストロース、糖溶液、エタノー
ル、グリコールおよび石油、動物油、植物油または合成
油などのオイル、例えばピーナツ油、大豆油および鉱油
などがある。本発明による調製物は、従来の非毒性の薬剤学的に容
認し得る担体、希釈剤、アジュバントおよび非経腸投与
に典型的な基剤を含む単位用量として投与することがで
きる。ここでいう「非経腸」には、皮下、静脈内、関節内お
よび気管内注射および注入点滴などが含まれる。また、
経口投与および局所適用などの他の投与も適している。
非経腸組成物および配合物は、最も好ましくは、ボーラ
スのかたちであるいは定常輸液として公知の方法で静脈
内投与される。経口投与用の錠剤およびカプセルは、従来の賦形剤、
例えば結合剤、充填剤、希釈剤、錠化剤、潤滑剤、崩壊
剤および湿潤剤を含む。錠剤は当業者に広く公知の方法
によって被覆してもよい。経口用液体調製物は、水性または油性の懸濁液、溶
液、乳濁液、シロップまたはエリキシルのかたちでもよ
く、または水または他の適当な基剤で還元して使用する
乾燥物にしてもよい。そのような液体調製物は、懸濁
剤、乳化剤、非水性基剤および保存剤などの従来の添加
剤を含むことができる。局所適用には、水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁
液、ゼリーまたは好ましくはエマルジョン軟膏のかたち
が用いられる。本発明による単位用量は、本発明のタンパク質の一日
必要量、または必要総量を複数分割したものを用いるこ
とができる。任意の対象体（ヒトを含む哺乳動物）への
治療的に容認し得る最適投薬量および投与回数は、種々
の因子、例えば用いる特定の有効成分の活性、年齢、体
重、一般的健康状態、性別、食餌、投与時間およびルー
ト、クリアランス回数、投与の目的、すなわち治療また
は予防か、および治療対象の血栓症の性質、抗血小板ま
たは抗凝固活性などによって異なる。したがって、患者治療（インビボ）における抗凝固剤
として有効な組成物および配合物においては、本発明の
ペプチドの薬剤学的に有効な日用量は約0.01〜100mg/kg
体重、好ましくは0.1〜10mg/kg体重である。適用型によ
って、単一用量は0.5〜10mgのトロンビンインヒビター
を含むことができる。体外血液において抗凝固効果を得
るためには、本発明のペプチドの薬剤学的有効量は、0.
2〜150mg/L、好ましくは１〜20mg/L体外血液である。さらにまた、本発明の目的は、装置表面を実質的に耐
血栓性にするために上記および請求の範囲に定義した固
定化ポリペプチドで被覆した、体液と接触して使用する
インプラント用または体外用の医用装置を提供すること
である。本発明のポリペプチドを医用装置に固定化して
その表面を生物適合性および耐血栓性にする。そのよう
な装置には血小板凝集を概して引き起こしがちな湿潤表
面を有するものがあり、これは血液や他の体液と接触し
て使用するインプラント用および体外用装置において不
都合である。プラスチック材料および合成繊維から通常
つくられるそのような装置の例としては、義肢、義眼、
人工臓器、縫糸、人工脈管節、カテーテル、透析器、血
液輸送用チューブおよび容器がある。本発明はさらに以下の実施例によって説明されるが、
これらは説明を目的としたもので本発明の範囲を限定す
るものではない。［実施例１］ T.tessulatumにおける抗トロンビンの存在の立証 Theromyzon tessulatumの頭10個を等張生理的食塩水
を用いて均質化した。均質化物を短時間遠心分離して粒
状物を除去して、上清を次の抗トロンビンアッセイおよ
び他の必要な血液学的試験を行うために保存した。抗トロンビン活性を推定するために、20μｌの上記の
抽出物を10μｌのトロンビン（1U）と混合した。この混
合物に100μｌの0.5mg/mlのフィブリノーゲン溶液を加
えて、さらに混合して、37℃で１分間インキュベートし
た。このアッセイのさらなる詳細については、R.T.Sawyer
ら（Comp.Haematol.Int.、１、35−41、1991）による記
載がある。表１はTheromyzon tessulatumからの粗抽出
物を用いた凝固パラメータのインビトロ阻害作用を要約
したものである。上記データから、Theromyzon tessulatumの頭部領域
はトロンビン凝固時間を有意に延長する一つまたはそれ
以上の水溶性因子を含むことがわかる。［実施例２］トロンビンおよびX a因子阻害のための色素原（chromog
enic）性アッセイａ）トロンビン阻害 20μｌのトロンビン溶液（5NIH−Ｕトロンビン/mlの
0.05％PEG6000を含む250mM燐酸塩緩衝液、pH6.5）を880
μｌのトロンビンアッセイ用緩衝液（100mMトリス−HC
l、200mM NaCl、0.05％PEG、pH8.3）とともに光度計セ
ル中で室温で５分間予備インキュベートした。反応を10
0μｌの基質溶液（4mgのクロモチームTH（ベーリンガー
マンハイム、ドイツ）の5ml水溶液）を添加することに
よって開始して、吸収を405nmで25℃で30秒間隔で５分
間読みとった。阻害活性の測定のために、10〜200μｌの試料または
標準としてのヒルジンを20μｌのトロンビン溶液と混合
して、アッセイ用緩衝液で全量を900μｌにした。この
混合物を室温で５分間予備インキュベートして、100μ
ｌの基質溶液を加えることによって反応を開始した。ｂ）X a因子活性の阻害 20μｌのX a因子溶液（10U/0.5mlを水で2.0mlに希釈
したもの）を880μｌのX a因子アッセイ用緩衝液（100m
Mトリス−HCl、200mM NaCl、0.05％PEG、pH8.3）ととも
に光度計セル中で室温で５分間予備インキュベートし
た。反応を100μｌの基質溶液（3.5mgのクロモチームＸ
（ベーリンガーマンハイム社製）の5ml水溶液）を添加
することによって開始して、吸収を405nmで25℃で30秒
間隔で５分間読みとった。阻害活性の測定のために、10〜200μｌの試料を20μ
ｌのX a因子溶液と混合して、アッセイ用緩衝液で全量
を900μｌにした。この混合物を室温で５分間予備イン
キュベートして、100μｌの基質溶液を加えることによ
って反応を開始した。［実施例３］ Theromyzon tessulatumからのトロンビンインヒビター
の精製ステップ１ 1000秒間給餌したTheromyzon tessulatumの頭から三
分の一を直ちに−70℃で凍結させて凍結乾燥した。この
材料に、35mlの40％アセトンを加えて、懸濁物をultra
−torax中で３回それぞれ10秒間均質化した。超音波処
理機で２分間処理した後に、さらに均質化ステップを繰
り返した（30秒間）。均質化物を6000rpmで15分間遠心
分離して、得られる上清を保存した（S1）。ペレット１にさらに35mlの40％アセトンを加えて、２
回目の均質化を行った（１×10秒、超音波処理２分間、
１×30秒）。均質化物を再び6000rpmで15分間遠心分離
した。上清２を保存しておいた上清１に加えて、合わせ
た上清に80％（v/v）アセトンを加えた。 pHを酢酸を用いて4.0に調整して、得られる懸濁液を6
000rpmで20分間遠心分離した。ペレット３を廃棄した。
上清３をロータリーエバポレーター（Speed Vac）によ
って４倍に濃縮した。アセトンを除去した抽出物は、実施例１による凝固試
験および実施例２による色原性試験において抗トロンビ
ン活性陽性であった。ステップ２アセトン除去抽出物を緩衝液交換のためにPD−10カラ
ム（ファルマシア社製）に供した。カラムをアフィニテ
ィー緩衝液（20mMトリスHCl、50mM NaCl、pH7.4）で平
衡にして、2.5mlのステップ１からの抽出液をカラムに
供した。溶出液の抗トロンビン活性を試験した。トロンビンアフィニティーカラムは以下のようにして
調製した。 400mgの乾燥Azlacton Tentacle Fractoゲルマトリッ
クス（E.Merck、Darmstadt、ドイツ）を7mlのカップリ
ング用緩衝液（50mM燐酸塩、150mM NaCl、pH7.5）中に
室温で２時間懸濁した。懸濁物を遠心分離およびカップ
リング緩衝液中での再懸濁によって２回洗浄した。5000
NIH−Ｕのウシトロンビン（シグマ社製）を1mlの水に溶
解して、pHを7.5に調整した。このトロンビン溶液をPD
−10ゲル濾過によってカップリング用緩衝液と平衡にし
た。平衡化したトロンビン溶液に、硫酸ナトリウムを最
終濃度1Mになるように加えた。トロンビンタンパク質を
直ちに活性化したゲルマトリックスにピペットで移し
て、緩やかに混合しながら４℃で３時間カップリングを
行った。洗浄をそれぞれ５容量のカップリング用緩衝液
で３回行った。マトリックスの脱活性のために、1.5ml
のエタノールアミンを加えて、緩やかに振盪しながら４
℃で一晩放置した。マトリックスを５容量の酢酸塩緩衝
液（100mM酢酸ナトリウム、500mM NaCl、pH4.0）で２回
洗浄した。最終の平衡化を５容量のアフィニティー緩衝
液で２回洗浄することによって行った。 PD−10カラムからの活性溶出液を、アフィニティーカ
ラムに蠕動（persistaltic）ポンプを用いて載せた（10
ml/時）。非結合画分を集めて、カラムを12mlのアフィ
ニティー緩衝液で洗浄した（洗浄液１）。溶出を6mlの
酢酸塩緩衝液（pH4.0）で行って、各0.5ml容量のフラク
ションを集めた。このカラムからの溶出プロフィールを
第１図に示す。最初の溶出に続いて、6mlの酢酸塩緩衝液（pH3.0）を
用いて第２ステップを行った。各1.5mlのフラクション
を集めた。カラムを25mlのアフィニティー緩衝液を用い
て再平衡化した。抽出およびアフィニティーステップの結果を表２に要
約して示す。［実施例４］ Theromyzon tessulatumからの活性トロンビンインヒビ
ターのゲル濾過分析活性材料を25ml容量のバイオゲルP4ゲル濾過カラム
（バイオラド社製）に供した。溶出を20mMトリス塩酸、
50mM NaCl、pH7.4を用いて流速4ml/時で行った。各1ml
のフラクションを用いて抗トロンビン活性を試験した。 P4ゲルマトリックスは、5000Dの排除限界を有し、100
0〜5000Dの分子量の範囲を分画することができる。驚い
たことに、抗トロンビン活性は分画容量中に溶出され、
すなわち5000D以下の見かけの分子量を有することが見
出だされた（第２図）。この挙動は同一条件で排除容量
中に現れるヒルジン（分子量7000D）と対照的である。P
4カラムの検量線から、Theromyzon tessulatumからの抗
トロンビン活性画分の分子量は約3000Dと算出された。［実施例５］ Theromyzon tessulatumからの精製トロンビンインヒビ
ターの逆相HPLC 実施例３によるアフィニティークロマトグラフィース
テップ後に得られた活性溶出液を、さらにRP−HPLCによ
って分析した。20μｌの試料を、HPLCカラム（LiChrosp
her300RP−18、５μｍ、E.Merck、Darmstadt、ドイツ）
に注入して、次のようなアセトニトリル勾配を用いて流
速1.0ml/分で溶出した。緩衝液A:0.1％トリフルオル酢酸水溶液緩衝液B:0.08％トリフルオル酢酸アセトニトリル溶液勾配:0〜２分、10％Ｂ 2〜３分、注入 3〜28分、60％Ｂ第３図は、220nmで記録された典型的な分析クロマト
グラフィー溶出図を示す。トロンビン阻害活性はピーク
２およびピーク４に見出だされた。分析用HPLCからの情
報は、次いで同一の条件下で行う調製用分離のために使
用した。調製のための精製をアフィニティークロマトグラフィ
ーからの試料500μｌを用いて行った（第４図）。それ
ぞれのピークを集めて、プールして、ロータリーエバポ
レーターSpeed Vacを用いて濃縮した。乾燥した画分を
水で再構成して、抗トロンビン活性を実施例２に記述の
凝固時間および色素原性（chromogenic）試験によって
アッセイした。両試験系において主要活性がピーク２およびピーク４
において見出だされた。いくらかの活性がピーク５にお
いても見出だされたが、これはおそらくピーク５へのピ
ーク４の夾雑のためと考えられる。クロマトグラムの他
のいずれのピークについてもトロンビンインヒビター活
性は全く認められなかった。ピーク２および４の活性の
合計は、全活性の約93％であった。［実施例６］本発明のトロンビンインヒビターとヒルジンとのHPLC上
での比較本発明によるインヒビターがヒルジンからの分子とは
基本的に異なることをさらに示すために、次のような実
験を行った。実施例５によってHPLC後に得られた活性ピ
ーク２を、同様のタンパク質濃度の精製ヒルジンに加え
て、混合物をアセトニトリル勾配（40〜70％）のRP−HP
LCに供した。抗トロンビン活性を含む二つのピークが見
出だされた（第５図）。比較溶出から、それぞれ第一の
インヒビターを注入した場合には第５図に示したような
それぞれのピークが現れた。第５図から、本発明による抗トロンビンはヒルジンの
抗トロンビンとはきわめて異なる位置に溶出されること
が明らかである。同様のことが実施例５によるHPLC分離
後の活性ピーク４においても認められた。［実施例７］抗トロンビン活性を有するピーク２のさらなる特徴付け純度 RP−HPLCからのプールした活性ピーク２を、第３図と
同様の条件下で再クロマトグラフした。第６図に示すよ
うに、少量の夾雑物が主要活性ピークから分離された
が、二回目のRP−HPLC後は均一の調製物が得られた（こ
の画分の毛管電気泳動を示す第８図も参照されたい）。トロンビン阻害 RP−HPLCからのピーク２は、実施例２による凝固試験
（トロンビン時間＞600秒/5μｌ）および色素原性（chr
omogenic）抗トロンビン試験において活性を示した。後
者の試験における活性は3.2IU/250μｌであった。ピー
ク２のX a因子阻害活性は、実施例２に記述のアッセイ
によって検出されなかった。すなわち、抗トロンビン活
性の＜＜１％の最大抗X a因子活性であった。したがっ
て、ここに開示されたインヒビターはトロンビンにきわ
めて特異的であることが結論づけられる。活性部位滴定トロンビンに対するインヒビター定数を、本発明によ
るインヒビターによって標準化したトロンビン溶液を分
光蛍光光度計で滴定することによって決定した。本方法
の詳細についてはG.W.Jamesonら（Biochem.J.、131、10
7−117、1973）による記述がある。簡略に述べると、まず蛍光物質Tos−Gly−Pro−Arg−
AMCを50μＭの濃度で滴定実験に用いた。アッセイを、1
00mMトリス塩酸、200mM NaCl、0.05％PEG6000（pH7.8）
中で25℃で行った。20pM活性部位滴定ヒトα−トロンビ
ンを、インヒビターとともに0.2−５×E₀で10分間イン
キュベートして、基質を加えた後に定常速度を測定し
た。反応動力学定数を、非線型回帰分析プログラムGraF
it（R.J.Leatherbarrow、Erithacus Software、Staine
s、UK、1980）を用いて決定した。K_iは178フェムトモル
であることが見出だされた。分子量活性ピーク２の分子量を、MALDI−TOF法（Kratos）を
用いるレーザーディソープション質量分析によって決定
した。0.5μｌの試料をマトリックスの役目をするアセ
トニトリル中の２、３μｌのジヒドロキシ安息香酸と混
合した。混合物を銀製試料ホルダー上で冷気乾燥して、
分析機中に置いた。得られるマススペクトルを、分子量
の知られた標準タンパク質を用いて検量した。ピークは
分子量約9000Dに対応した（第７図）。等電点インヒビターの等電点を、IEFモード（Applied Biosy
stems社製）における毛管電気泳動によって測定した。
第８図に見られるように、インヒビターピークは、標準
タンパク質と比較して4.9のpIを示した。［実施例８］抗トロンビン活性を有するピーク２の配列データ次のようなＮ末端配列を、ベックマンペプチド配列分
析機で標準エドマン分解化学によってRP−HPLC（実施例
５）からのピーク２について得た。［実施例９］抗トロンビン活性を有するピーク４のさらなる特徴付け純度 RP−HPLCからのプールした活性ピーク４を、同じ条件
下で再クロマトグラフした。第９図に示すように、いく
らかの夾雑物が主要活性ピークから分離されたが、二回
目のRP−HPLC後は均一の調製物が得られた。トロンビン阻害 RP−HPLCからのピーク４は、実施例２による凝固試験
（トロンビン時間＞600秒/5μｌ）および色原性抗トロ
ンビン試験において活性を示した。後者の試験の活性は
1.3IU/250μｌであった。ピーク４のX a因子阻害活性
は、実施例２に記述のアッセイの結果、抗トロンビン活
性の＜＜１％の最大抗X a因子活性を示し、検出されな
かった。したがって、ここに開示されたインヒビターは
トロンビンにきわめて特異的であることが結論づけられ
る。活性部位滴定トロンビンに対するインヒビター定数を、本発明によ
るインヒビターによって標準化したトロンビン溶液を分
光蛍光光度計で滴定することによって決定した。本方法
の詳細については実施例７を参照されたい。K_iは240フ
ェムトモルであった。分子量活性ピーク４の分子量を、MALDI−TOF法（Kratos）を
用いるレーザーディソープション質量分析によって実施
例７に記述のようにして決定した。得られるマススペク
トルを、分子量の知られた標準タンパク質を用いて検量
した。ピークは分子量約14kDに対応した（第10図）。［実施例10］抗トロンビン活性を有するピーク４の配列データ次のようなＮ末端配列を、ベックマンペプチド配列分
析機で標準エドマン分解化学によってRP−HPLC（実施例
５）からのピーク４について得た。［実施例11］上記の実施例１〜５に記述の手法を用いて、抗トロン
ビン活性を有するポリペプチドを次のTheromyzon属に属
する種から分離することができた。 T.binannulatum T.cooperi T.qarjaewi T.maculosum T.sexoculatum

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 1/16 Ｃ０７Ｋ 1/20 1/20 1/22 1/22 1/34 1/34 7/08 ＺＮＡ 7/08 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/64 (72)発明者ソーヤー、ロイイギリス国エスエー19 ６ティーアールディフェードノースランデイロトラップゴーウェライオン（番地なし) (72)発明者ヴォルフ、ザビーネドイツ連邦共和国 64853 オツベルク１アムヴェンデルスベルク 17 (72)発明者ドット、ヨハネスドイツ連邦共和国 45665 レクリンクハウゼンリープフラウエンシュトラーセ 16 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 1/00 - 19/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Rhynchobdellida目のTheromyzon属に属す
るヒルの組織、または分泌物から抽出される、トロンビ
ン阻害活性を有する、水溶性成分を含んでなる抽出物。
【請求項２】前記Theromyzon属に属するヒルは、Therom
yzon tessulatum種のヒルであることを特徴とする、請
求項１に記載の抽出物。
【請求項３】Theromyzon tessulatum種のヒルに由来
し、トロンビン阻害活性を有する、精製された水溶性ポ
リペプチドまたは該水溶性ポリペプチド組成物であっ
て、該精製された水溶性ポリペプチドは、請求項１に記載の
抽出物から採取可能な、トロンビン阻害活性を具えた、
約3kDの分子量を有する、少なくとも一つのポリペプチ
ドからなり、該分子量約3kDのポリペプチドは、凍結ならびに凍結乾
燥された、該ヒルの頭部三分の一を、水／アセトンを用
いて、均質化して得られる抽出物を、トロンビン特異性
アフィニティークロマトグラフィーと、次いで、少なく
とも一つのゲル濾過工程ならびに少なくとも一つの逆相
HPLC工程とによって、精製することにより取得可能であ
ることを特徴とする、精製ポリペプチドまたはポリペプ
チド組成物。
【請求項４】Theromyzon tessulatum種のヒルに由来
し、トロンビン阻害活性を有する、精製された水溶性ポ
リペプチドまたは該水溶性ポリペプチド組成物であっ
て、該精製された水溶性ポリペプチドは、請求項１に記載の
抽出物から採取可能な、トロンビン阻害活性を具えた、
約9kDの分子量、そのＮ末端アミノ酸配列： Glu Asp Asp Asn Pro Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Gl
y Glu を有する、少なくとも一つのポリペプチドからなり、該分子量約9kDのポリペプチドは、凍結ならびに凍結乾
燥された、該ヒルの頭部三分の一を、水／アセトンを用
いて、均質化して得られる抽出物を、トロンビン特異性
アフィニティークロマトグラフィーと、次いで、少なく
とも一つのゲル濾過工程ならびに少なくとも一つの逆相
HPLC工程とによって、精製することにより取得可能であ
ることを特徴とする、精製ポリペプチドまたはポリペプ
チド組成物。
【請求項５】Theromyzon tessulatum種のヒルに由来
し、トロンビン阻害活性を有する、精製された水溶性ポ
リペプチドまたは該水溶性ポリペプチド組成物であっ
て、該精製された水溶性ポリペプチドは、請求項１に記載の
抽出物から採取可能な、トロンビン阻害活性を具えた、
約14kDの分子量、そのＮ末端アミノ酸配列： Ser Glu Leu Gly Gln Ser Cys Ser Lys Glu Asn Pro Cy
s Pro Ser Asn Met Lys Cys Asn Arg Glu Thr Phe Lys を有する、少なくとも一つのポリペプチドからなり、該分子量約14kDのポリペプチドは、凍結ならびに凍結乾
燥された、該ヒルの頭部三分の一を、水／アセトンを用
いて、均質化して得られる抽出物を、トロンビン特異性
アフィニティークロマトグラフィーと、次いで、少なく
とも一つのゲル濾過工程ならびに少なくとも一つの逆相
HPLC工程とによって、精製することにより取得可能であ
ることを特徴とする、精製ポリペプチドまたはポリペプ
チド組成物。
【請求項６】請求項１または２に記載の抽出物を調製す
る方法であって、少なくとも、前記ヒルの組織または分泌物を均質化する
工程と、抽出によって、該水溶性成分を含んでなる画分を調製す
る工程とを含んでいることを特徴とする、抽出物の調製
方法。
【請求項７】請求項３〜５のいずれか一項に記載の精製
ポリペプチドを調製する方法であって、凍結ならびに凍結乾燥された、該Theromyzon tessulat
um種のヒルの頭部三分の一を均質化して得られる抽出物
を、トロンビン特異性アフィニティークロマトグラフィ
ーと、次いで、少なくとも一つの標準的なクロマトグラ
フィー工程とによって、精製する工程を含んでなること
を特徴とする、精製ポリペプチドの調製方法。
【請求項８】医薬物としての使用用途の、請求項３〜５
のいずれか一項に記載の精製ポリペプチドまたはポリペ
プチド組成物。
【請求項９】血栓症関連疾患に対する、インビボ治療用
トロンビン・インヒビターとしての使用用途の、請求項
８に記載の精製ポリペプチドまたはポリペプチド組成
物。
【請求項１０】体外血液における血小板凝集を阻害する
ための、トロンビン・インヒビターとしての使用用途
の、請求項８に記載の精製ポリペプチドまたはポリペプ
チド組成物。
【請求項１１】請求項３〜５、および８〜10のいずれか
一項に記載の精製ポリペプチドまたはポリペプチド組成
物、ならびに、その薬剤学的に容認される担体とを含ん
でなる、血栓症関連疾患治療用の医薬組成物。
【請求項１２】請求項３〜５のいずれか一項に記載の精
製ポリペプチドまたはポリペプチド組成物を使用する方
法であって、該ポリペプチドをトロンビン・インヒビターとして利用
する、血栓症関連疾患のインピボ治療用医薬組成物の調
製用途であることを特徴とする、方法。
【請求項１３】請求項３〜５のいずれか一項に記載の精
製ポリペプチドまたはポリペプチド組成物を使用する方
法であって、該ポリペプチドをトロンビン・インヒビターとして利用
する、体外血液における血小板凝集を阻害するための医
薬組成物の調製用途であることを特徴とする、方法。
【請求項１４】トロンビン阻害化合物の調製のために、
Theromyzon属に属するヒルを使用する方法であって、該ヒルの組織または分泌物を均質化する工程、その水溶性成分を含んでなる画分を調製する工程、該画分を、トロンビン特異性アフィニティークロマトグ
ラフィーと、次いで、少なくとも一つのゲル濾過工程な
らびに少なくとも一つの逆相HPLC工程とによって、精製
して、前記トロンビン阻害化合物を本質的に精製された
形態で取得する工程とを含んでなることを特徴とする、
方法。